CN111500441A - 细胞培养装置以及细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞培养装置和细胞培养方法，可以捕捉并培养也包括未表达EpCAM的癌细胞在内的众多癌细胞。本发明涉及一种细胞培养装置，装置表面的至少一部分形成有亲水性聚合物层，且所述亲水性聚合物层吸附有纤维粘连蛋白，其中，所述亲水性聚合物层由选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成：〔a〕由下式(I)表示的聚合物：
式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数；〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉；〔c〕选自下式(I‑1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物：
式中，R1、R2和m与上述相同。
Description
技术领域
本发明涉及可以捕捉、培养血液和体液中的特定细胞(存在于血液/体液中的癌细胞等)的细胞培养装置以及细胞培养方法。
背景技术
如果可以捕捉/培养癌细胞等特定细胞，就可以期待对疾病等的机制阐明、基于此的新药开发、治疗方法的研究起作用。尤其是，已知如果产生癌细胞，不久后就会出现在血液/体液中，出现在血液中的癌细胞被称为血中循环肿瘤细胞(CTC)。于是，期待基于调查该血中循环肿瘤细胞的癌症的治疗效果的确认、预后寿命、给药前的抗癌剂的效果预测、使用癌细胞的基因解析的治疗方法的研究等。
然而，血中循环肿瘤细胞的数量非常少(数个～数百个/血液1mL)，存在难以捕捉癌细胞的问题。另外，还存在也难以培养、繁殖捕捉的细胞的问题。
例如，作为血中循环肿瘤细胞的捕捉技术，已知有称为细胞检测(Cell Search)***的技术，然而由于该技术是使用抗原抗体反应(用EpCAM抗体捕捉)的技术，因此仅可以捕捉表达EpCAM的癌细胞，在可捕捉的癌细胞的种类上存在限制，另外，在培养捕捉的癌细胞方面上也存在限制(参见专利文献1等)。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]日本专利特表2005-523981号公报
发明内容
[发明所要解决的问题]
本发明的目的在于解决上述问题，并提供一种细胞培养装置以及细胞培养方法，可以捕捉并培养也包括未表达EpCAM的癌细胞在内的众多癌细胞。
[解决问题的手段]
本发明涉及一种细胞培养装置，装置表面的至少一部分形成有亲水性聚合物层，且所述亲水性聚合物层吸附有纤维粘连蛋白，其中，所述亲水性聚合物层由选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成。
〔a〕由下式(I)表示的聚合物：
(式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基。m表示1～5，n表示重复数。)，
〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉，
〔c〕选自下述式(I-1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物：
(式中，R1、R2和m与上述相同。)
所述细胞培养装置中，所述亲水性聚合物层的厚度优选为10～800nm。
优选地，所述细胞培养装置为培养血液或体液中所含有的细胞的装置。
另外，本发明涉及一种细胞培养方法，在该方法中，使含有细胞的试样与吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层接触，捕捉并培养所述细胞，其中，所述亲水性聚合物层由选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成。
〔a〕由下式(I)表示的聚合物，
(式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基。m表示1～5，n表示重复数。)
〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉，
〔c〕选自下述式(I-1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物，
(式中，R1、R2和m与上述相同。)
优选地，所述细胞培养方法中，在使所述试样与所述亲水性聚合物层接触，将特定细胞粘附和/或吸附后，培养所述特定细胞。
优选地，所述细胞培养方法中，所述试样选自下述(1)、(2)和(3)中的至少1种。
(1)血液或体液，
(2)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞的试样，
(3)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞、再使之悬浮而得的试样。
优选地，所述分离和/或浓缩通过基于细胞尺寸的分离和/或离心分离进行。
优选地，通过使用分离液的所述离心分离，分离和/或浓缩所述特定细胞。
优选地，在所述分离和/或浓缩时，在所述试样中混合溶血剂。
优选地，在所述分离和/或浓缩时，使所述试样中的血细胞相互凝集。
优选地，所述细胞培养方法中，用液体培养基进行培养，每4天更换培养基1次以上。
[发明效果]
根据本发明，由于其为一种在装置表面的至少一部分形成有亲水性聚合物层且在所述亲水性聚合物层吸附有纤维粘连蛋白的细胞培养装置，所述亲水性聚合物层由选自所述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成，因此，可以捕捉和培养也包括未表达EpCAM的癌细胞在内的众多癌细胞。
附图说明
[图1]为在内表面形成有纤维粘连蛋白吸附亲水性聚合物层的细胞培养装置的示意图的一例。
[附图标记]
1：细胞培养装置
11：孔
21：亲水性聚合物层
31：纤维粘连蛋白
具体实施方式
本发明为一种细胞培养装置，装置表面的至少一部分形成有亲水性聚合物层，且所述亲水性聚合物层吸附有纤维粘连蛋白，所述亲水性聚合物层由选自所述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成。
由于不仅在细胞培养装置的表面的至少一部分形成亲水性聚合物层，而且使纤维粘连蛋白吸附于该亲水性聚合物层，因此可以显著提高亲水性聚合物的细胞(癌细胞等特定细胞等)的粘附(吸附)能力。因此，癌细胞等特定细胞的捕捉性大幅提高，同时血小板等的捕捉性降低，会取得在蛋白质多的状态下无论如何也无法发挥的特定细胞的选择性捕捉效果。另外，由于不仅在细胞培养装置的表面的至少一部分形成亲水性聚合物层，而且进一步使纤维粘连蛋白吸附于该亲水性聚合物层，因此可以适宜培养捕捉的细胞(特定细胞等)。
具体地说，血中循环肿瘤细胞(数个～数百个/血液1mL)等出现在体液中的肿瘤细胞(癌细胞等)的数量非常少，为了提供给检查，重要的是尽可能多地捕捉存在于采集的体液中的肿瘤细胞。本发明中，在亲水性聚合物层之外，进一步使促进肿瘤细胞的粘附(吸附)的纤维粘连蛋白吸附于该亲水性聚合物层的表面，因此通过使血液等体液与之接触，在亲水性聚合物层吸附/粘附更多的体液中的肿瘤细胞等。另外，/通过纤维粘连蛋白的存在，吸附/粘附的肿瘤细胞被促进分化、推进培养。然后，通过用该培养的细胞确认抗癌剂等的效力，可以在抗癌剂等的给药前，在体外确认抗癌剂等的效力，同时也有助于抗癌剂等的选定。进一步地，该培养的细胞可以用于癌细胞的增殖的机制阐明、新药(抗癌药、分子靶标药等)的开发。
以下，结合附图说明本发明的优选实施方式的一例。
图1的细胞培养装置1是出于捕捉和培养细胞的目的而使用的装置。作为细胞，可列举癌细胞(包括未表达EpCAM的癌细胞的任意癌细胞)等特定细胞等。作为癌细胞，可列举血中循环肿瘤细胞(CTC)等。
具有用于将含有细胞的溶液注入孔状凹部，进行细胞的捕捉，然后，进行细胞的培养的形状。孔11可为单孔，或者可为孔被配置为矩阵状的多孔(板)。另外，对孔部的形状没有特别限定，可列举圆形、椭圆形、四边形等多边形等形状的凹陷(凹部)等。进一步地，可为孔部的横壁与底部分离的构造。孔可以实施细胞(特定细胞等)的有无的确认(观察)、细胞数(特定细胞数等)的计测、细胞(特定细胞等)的培养、药的效力的确认和选定等。另外，若孔部的横壁分离，会有易于观察、计测、确认/选定等的情况，进一步地，容易取出培养的细胞等。
作为孔11的构成材料，可以是细胞的观察中透明性高的材料，可列举聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等丙烯酸(酯)类树脂(聚丙烯酸(酯)树脂)、环烯烃树脂(聚环烯烃)、碳酸酯树脂(聚碳酸酯)、苯乙烯树脂(聚苯乙烯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等聚酯树脂、聚二甲基硅氧烷以及玻璃(硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)等。亲水性聚合物的涂层中，优选构成材料的亲水性高者，优选聚丙烯酸(酯)树脂、钠钙玻璃。
孔11是非贯通孔，上部开口。从开口向孔11中注入含有细胞的溶液(试样(包含特定细胞的血液、体液等))。另外，在确认存在有癌细胞等特定细胞后，也可注入用于培养特定细胞的培养液。
孔11的开口的长度L(开口为矩形时的各边等)、直径R(开口为圆形时的直径等)、深度D没有特别限定。从加入溶液(试样)的角度考虑，深度D(高度)优选为3～25mm。图1中，孔11的内侧面大致垂直于孔11的表面和背面，但孔11可为内侧面倾斜、从开口向底面变窄的形状。另外，可为内侧面倾斜、从开口向底面变宽的形状。另外，底部可为平面，或者可为凹凸。凹型的凹陷中，细胞容易聚集，有利于培养。这是由于相比细胞以单个存在，细胞以多个块存在时互相发出某些信号，培养得到促进。
在多孔的情况下，可让多个孔能够分离。在具有多个孔的情况下，可以将它们分别用于细胞数(特定细胞数等)计测用孔和细胞(特定细胞等)培养用孔，例如，在通过计测用孔中确认有无癌细胞的存在之后，在确认存在的情况下，通过培养用孔培养癌细胞，可以通过该细胞确认药物的效力。
细胞培养装置1中，在装置的表面(孔11的表面)的至少一部分形成有亲水性聚合物层21，并且在该亲水性聚合物层21吸附有纤维粘连蛋白31。优选地，装置的表面中有孔11的是其内表面。图1示出在孔11的底面及侧面的一部分形成有亲水性聚合物层21，进一步在该亲水性聚合物层21吸附有纤维粘连蛋白31的示例。
在将血液、体液引入孔11内时，它们中所含的癌细胞等特定细胞被吸附/粘附于吸附有纤维粘连蛋白31的亲水性聚合物层21，同时血小板等血细胞的吸附受到抑制。因此，通过在引入血液、体液之后保持规定时间，然后洗涤，可以将特定细胞吸附/粘附于亲水性聚合物层21。然后，通过测定吸附/粘附的特定细胞的数量，判明血液、体液中的癌细胞数。进一步地，由于特定细胞吸附/粘附于还在亲水性聚合物层上吸附有纤维粘连蛋白的层上，因此可以高效地培养特定细胞。因此，通过使用培养的特定细胞，可期待癌症治疗效果的确认等。
亲水性聚合物层21(由亲水性聚合物形成的层)的膜厚优选为10～800nm，更优选为30～550nm。通过调整到上述范围内，可以获得良好的对蛋白质和细胞的低吸附性、对癌细胞的选择吸附性/粘附性。另外，可以高效地培养癌细胞。
形成亲水性聚合物层21的亲水性聚合物选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种。
〔a〕由下式(I)表示的聚合物：
(式中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基。m表示1～5，n表示重复数。)
〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉，
〔c〕选自下述式(I-1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物：
(式中，R1、R2和m与上述相同。)
式(I)、式(I-1)中，R2的烷基的碳数优选为1～10，更优选为1～5。其中，R2特别优选为甲基或乙基。m优选为1～3。n(重复单元数)优选为15～1000，更优选为30～500。
〔c〕的共聚物中，其它单体在不会损害亲水性聚合物的作用效果的范围内适当选择即可。例如，可列举苯乙烯等芳香族单体、醋酸乙烯酯、可以赋予温度响应性的N-异丙基丙烯酰胺等。
从对癌细胞的选择性吸附性/粘附性、癌细胞的培养性的角度考虑，亲水性聚合物的数均分子量(Mn)优选为8000～150000，更优选为10000～60000，进一步优选为12000～50000。另外，本说明书中，Mn可以基于根据凝胶渗透色谱法(GPC)(东曹株式会社制造的GPC-8000系列，检测器：差示折光计，柱子：东曹株式会社制造的TSKGEL SUPERMALTPOREHZ-M)获得的测定值，通过标准聚苯乙烯换算求得。
从使纤维粘连蛋白31吸附于亲水性聚合物层21上的角度考虑，适宜使用将纤维粘连蛋白浓度优选调整为0.5～500μg/ml(更优选调整为1～250μg/ml)的溶液、分散液等。通过调整为上述范围内的浓度，可以获得良好的对蛋白质和细胞的低吸附性、对癌细胞的选择性吸附性/粘附性、癌细胞的培养性。
细胞培养装置1例如可以通过附加在图1的内表面的形成有吸附有纤维粘连蛋白31的亲水性聚合物层21的孔11、具备多个孔11的多孔板、进一步根据需要的其它部件(部品)来制造。
具体地，在具有形成有亲水性聚合物层21的孔11的装置的情况下，可以通过公知的方法((1)向孔11的内部注入将亲水性聚合物溶解/分散在各种溶剂中的亲水性聚合物溶液/分散液，保持规定时间的方法，(2)将该亲水性聚合物溶液/分散液涂装(喷雾)于孔11的内表面的方法等)，在孔11的内表面的全部或一部分上涂布亲水性聚合物溶液/分散液，制造形成有由亲水性聚合物形成的聚合物层的孔11。
溶剂、注入方法、涂装(喷雾)方法等可以适用以往公知的材料和方法。
(1)、(2)的保持时间根据孔11的尺寸、导入的液体种类等适当设定即可，优选为5分钟～10个小时，更优选为10分钟～5个时间，进一步优选为15分钟～2个小时。保持后，可适当排出或者不排出多余的亲水性聚合物溶液/分散液，进行干燥。
然后，对使纤维粘连蛋白31吸附于所形成的亲水性聚合物层21的方法没有特别限定，可以适用公知方法。例如，可以通过公知方法使纤维粘连蛋白31的缓冲溶液(磷酸缓冲生理盐水PBS等)与亲水性聚合物层21接触，在规定温度下放置规定时间，根据需要进行洗涤的方法等使之吸附。温度、时间适当设定即可，例如可以在10～50℃、0.1～24个小时左右的条件下实施。
然后，通过将制得的吸附有纤维粘连蛋白31的亲水性聚合物层21形成为孔11的内表面的一部分，对其根据需要追加其它部件，可以制造细胞培养装置。
本发明的细胞培养方法为下述方法：使含有细胞的试样(含有特定细胞的血液或体液等)与亲水性聚合物层接触，捕捉并培养所述细胞的细胞培养方法，该亲水性聚合物层由选自所述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成。
如前所述，所述细胞培养装置会提高癌细胞等的捕捉性，同时会降低血小板等血细胞的捕捉性，获得癌细胞等的选择性捕捉效果，进一步可以高效地培养癌细胞等。因此，例如，通过使用该装置，在使血液或体液(含有细胞的试样)与吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层接触，将癌细胞等特定细胞粘附和/或吸附后，培养该特定细胞，调查培养的特定细胞，可以期待上述的癌症治疗效果的确认、抗癌剂等在体外的效力的确认、抗癌剂等的选定、新药的开发、对疾病的机制阐明等。
作为含有细胞的试样，可以适宜地使用(1)血液或体液(血液自身或体液自身)、(2)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞的试样、(3)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞、再使之悬浮而得的试样等。
所述(2)、(3)中，癌细胞等特定细胞的分离和/或浓缩可通过基于细胞尺寸的分离/浓缩、根据离心分离的分离/浓缩等实施。作为基于细胞尺寸的分离、浓缩，例如可列举使用过滤器等的方法等。
离心分离可以采用公知方法，例如可以通过公知的离心分离装置实施。离心分离中的离心力、离心分离的时间、温度可从血细胞、癌细胞等的分离性等的角度考虑进行适当设定。通过对采集的血液或体液实施离心分离，分离中间的单核球层，可以分离除去血小板、红细胞、多核的白细胞，可以制作提高了癌細胞等特定细胞的浓度的试样。
另外，在进行离心分离之前，可实施使血液或体液中的蛋白质浓度减少的其它处理。作为使血液或体液中的蛋白质浓度减少的其它处理方法，例如可列举稀释采集的血液或体液的方法。此处，作为稀释方法，有使用人血的pH(约7.4)磷酸缓冲生理盐水(PBS)等缓冲溶液或DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)等液体培养基的方法，具体地，通过在采集的血液或体液中添加缓冲溶液进行稀释，或者在液体培养基中添加采集的血液或体液进行稀释，可以使蛋白质浓度比采集的血液或体液少。
优选地，离心分离中，通过使用分离液的离心分离，分离和/或浓缩特定细胞。据此，可以适宜分离含有包含特定细胞(癌细胞等)等的单核球层、红细胞等的层等。然后，通过分离单核球层，将层中的特定细胞捕捉到吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层上，接着进行培养，可以适宜地培养特定细胞。
用于密度梯度离心法的分离液具有适于血液中的细胞的区分的比重，再调至为具有不会破坏细胞的渗透压和pH即可。作为介质，可以使用可用于密度梯度离心分离法的介质。分离液在20℃时的比重优选为1.076～1.078g/ml。另外，分离液的pH优选为4.5～7.5。
作为代表性介质(分离液)，可列举蔗糖、Ficoll(蔗糖和环氧氯丙烷的共聚物)、Percoll(具有聚乙烯基吡咯烷酮的覆膜的胶体状二氧化硅制品)。关于Ficoll，市售有Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia Biotech株式会社)、Histopaque-1077(西格玛奥德里奇日本(Sigma-Aldrich Japan)株式会社)、Lymphoprep(奈科明(Nycomed)公司，奥斯陆(挪威))等制品；关于Percoll，市售有Percoll(西格玛奥德里奇日本株式会社)等的制品。
所述(3)中，悬浮处理可以采用使用液体培养基的方法等。
所述(2)、(3)中，从可以除去试样中的红细胞的至少一部分的角度考虑，优选在特定细胞的分离和/或浓缩时在试样中混合(添加)溶血剂。溶血剂是一种物理或化学作用于红细胞，溶解红细胞的试剂。作为溶血剂，可以使用以往使用的溶血剂，例如可列举氯化铵、合成表面活性剂和乙醇。
优选地，所述(2)、(3)中，在特定细胞的分离和/或浓缩时在试样中使血细胞相互凝集。使血细胞相互凝集的方法只要是可以实现这样的凝集的方法即可，并无特别限定，其中，可以适宜使用利用抗原抗体反应的方法。具体地，可以适宜利用血细胞凝集反应等凝集反应法。
这样的凝集工序中，在血液或体液中，利用血细胞凝集反应，使细胞相互凝集，然后，在对制得的含有凝集物的试样实施离心分离处理后，除去含有血细胞的凝集物。因此，可以有效地将样品中高浓度残存的特定细胞(癌症细胞等)捕捉到亲水性聚合物层上。
血细胞相互的凝集中，例如可以采用混合(添加)使血细胞相互凝集的化合物的方法。具体地，可使用红细胞和白细胞凝集抗体试剂(红细胞和白细胞凝集抗体组合物)。在离心分离处理时，比重接近于癌细胞等特定细胞的一部分的白细胞的分离变差，然而在使用上述抗体组合物，利用抗原抗体反应，使红细胞与白细胞结合/凝集时，不仅特定细胞与比重不同于特定细胞的红细胞、血小板等的分离变良好，而且特定细胞与白细胞的分离也变良好，特定细胞的粘附/捕捉性提高。
所述细胞培养方法中，使含有细胞的试样与吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层接触、捕捉所述细胞的方法，可采用能让该试样与该亲水性聚合物层接触的任意方法。例如，在使用具有形成有亲水性聚合物层的孔的装置的情况下，可列举将试样注入孔的内部的方法等。接触后(注入后)，通过在规定条件下保持，可以将细胞捕捉(吸着、粘附)到该亲水性聚合物层上。该规定条件适当设定即可，例如在34～40℃温度下保持10分钟～15个小时即可。
所述细胞培养方法中，作为培养捕捉的细胞的方法，适当采用培养细胞的方法即可。例如，通过在捕捉有特定细胞等细胞的纤维粘连蛋白吸附亲水性聚合物层，添加液体培养基，在规定条件下保持，可以适当培养细胞。该规定条件适当设定即可，例如在34～40℃温度下保持1～10周即可。
优选地，所述细胞培养方法中，用液体培养基进行培养，每4天更换培养基1次以上。据此，可以适当地实施特定细胞等细胞的培养。
[实施例]
结合实施例，具体说明本发明，但本发明并非仅限于这些实施例。
(实施例1)
使用AIBN(偶氮二异丁腈)，将丙烯酸2-甲氧基乙酯在80℃温度下热聚合6个小时，制作聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(分子量Mn：约15000，Mw：约50000)。然后，制作所获得的聚丙烯酸2-甲氧基乙酯的2.5W/V％甲醇溶液。
在市售的PMMA制造的板(深度D(高度)：17.5mm)内，注入制得的聚丙烯酸2-甲氧基乙酯溶液(2.5W/V％)，在室温下放置30分钟后，用移液管吸取液体，进行干燥，据此制作亲水性聚合物层。
进一步，使涂布有聚丙烯酸2-甲氧基乙酯的部分(亲水性聚合物层)吸附纤维粘连蛋白。具体地，制作纤维粘连蛋白的PBS溶液(磷酸缓冲生理盐水)100μg/ml，在40℃温度下放置1小时，然后用PBS溶液洗涤，据此制作如图1所示的具有形成有纤维粘连蛋白吸附亲水性聚合物层的多孔板的细胞培养装置。
(实施例2)
除了变更为聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(分子量Mn：约30000，Mw：约95000)以外，其余与实施例1同样地进行，制作细胞培养装置。
(实施例3)
使用AIBN(偶氮二异丁腈)，将丙烯酸2-甲氧基乙酯在80℃温度下热聚合6个小时，制作聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(分子量Mn：约15000，Mw：约50000)。然后，制作所获得的聚丙烯酸2-甲氧基乙酯的0.25W/V％甲醇溶液。
在市售腔室玻片(Chamber slide)(2腔室型，为孔部侧面的腔室能够拆卸的类型，底面为玻璃基材(钠钙玻璃)，深度D(高度)为12mm)内，注入制得的聚丙烯酸2-甲氧基乙酯溶液(0.25W/V％)，在室温下放置5分钟，然后在40℃温度下真空干燥，据此制作亲水性聚合物层。
进一步，使涂布有聚丙烯酸2-甲氧基乙酯的部分(亲水性聚合物层)吸附纤维粘连蛋白。具体地，通过制作纤维粘连蛋白的PBS溶液(磷酸缓冲生理盐水)200μg/ml，在40℃温度下放置1个小时，然后用PBS溶液洗涤，据此制作如图1所示的形成有纤维粘连蛋白吸附亲水性聚合物层的细胞培养装置。
(实施例4)
除了变更为聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(分子量Mn：约30000，Mw：约95000)以外，其余与实施例3同样地进行，制作细胞培养装置。
(比较例1)
使用市售腔室玻片(2腔室型，为孔部侧面的腔室能够拆卸的类型，底面为玻璃基材(钠钙玻璃))。
(比较例2)
使纤维粘连蛋白吸附于市售腔室玻片(2腔室型，为孔部侧面的腔室能够拆卸的类型，底面为玻璃基材(钠钙玻璃))。具体地，通过制作纤维粘连蛋白的PBS溶液(磷酸缓冲生理盐水)200μg/ml，在40℃温度下放置1个小时，然后用PBS溶液洗涤，据此制作形成有纤维粘连蛋白吸附层的细胞培养装置。
按照下述方法评价实施例、比较例中制作的细胞培养装置。
〔亲水性聚合物层(涂布层)的膜厚〕
孔内表面的亲水性聚合物层的膜厚使用TEM，在加速电压15kV、1000倍的条件下测定(摄影)。
〔在全血中添加了癌细胞的加标(spike)血试验：粘附细胞数的计测〕
使进行了染色的来自人结肠癌的上皮细胞(HT-29)在全血中悬浮为100个/血液1mL(加标血)。向其中加入等量的液体培养基，进行稀释(稀释加标血)。接着，向15mL的离心分离管中，加入分离液(LymphoPrep：密度1.077±0.001g/mL)，并且加入上述稀释加标血，在800g、20分钟的条件下进行离心分离。然后，分离单核球层。向分离的单核球层中添加磷酸缓冲(PBS)溶液，再次进行离心分离，进行浓缩。在添加10％FBS(牛胎儿血清)的液体培养基(与最初的全血量相同的液量)中，使在离心分离后的最下层出现的块悬浮。使用该悬浮液，每孔中注入1mL，在37℃温度下使其粘附1个小时。然后，用PBS溶液洗涤未粘附的细胞。接着，用荧光显微镜，对粘附的癌细胞数进行计数。
另外，将比较例1的癌细胞粘附数设定为1.00，通过相对值进行比较。
〔在全血中添加了癌细胞的加标血试验：培养的细胞数的计测〕
使来自人结肠癌的上皮细胞(HT-29)(未染色)在全血中悬浮为100个/血液1mL(加标血)。向其中加入等量的液体培养基，进行稀释(稀释加标血)。接着，向15mL的离心分离管中，加入分离液(LymphoPrep：密度1.077±0.001g/mL)，并且加入上述稀释加标血，在800g、20分钟的条件下进行离心分离。然后，分离单核球层。向分离的单核球层中添加磷酸缓冲(PBS)溶液，再次进行离心分离，进行浓缩。在添加10％FBS(牛胎儿血清)的液体培养基(与最初的全血量相同的液量)中，使在离心分离后的最下层出现的块悬浮。使用该悬浮液，每孔中注入1mL，在37℃温度下使其粘附1个小时。然后，用PBS溶液洗涤未粘附的细胞。接着，添加液体培养基，在37℃温度下培养3周。此外，培养中，每2日更换1次液体培养基。培养结束后，用胰蛋白酶解离细胞，用血球计数板对细胞进行计数。
另外，将比较例1的培养癌细胞增加数设定为1.00，通过相对值进行比较。
[表1]
与比较例1相比，形成有吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层的实施例1～4中，癌细胞的粘附量大幅提高。这被推测为，由于在聚丙烯酸2-甲氧基乙酯层上吸附有与癌细胞的粘附相关的蛋白质的纤维粘连蛋白，因此癌细胞优先粘附。
与比较例1相比，形成有吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层的实施例1～4中，在癌细胞的培养中增加的细胞数大幅提高。这被推测为，由于在聚丙烯酸2-甲氧基乙酯层上吸附有与癌细胞的粘附/培养促进相关的蛋白质的纤维粘连蛋白，因此癌细胞的培养受到促进。
Claims (11)
1.一种细胞培养装置，其表面的至少一部分形成有亲水性聚合物层，且所述亲水性聚合物层吸附有纤维粘连蛋白，其中，
所述亲水性聚合物层由选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成：
〔a〕由下式(I)表示的聚合物：
式(I)中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数；
〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉；
〔c〕选自下式(I-1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物：
式(I-1)中，R1、R2和m与上述相同。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，所述亲水性聚合物层的厚度为10～800nm。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，所述细胞培养装置为培养血液或体液中所含有的细胞的装置。
4.一种细胞培养方法，在该方法中，使含有细胞的试样与吸附有纤维粘连蛋白的亲水性聚合物层接触，捕捉并培养所述细胞，其中，
所述亲水性聚合物层由选自下述〔a〕、〔b〕和〔c〕中的至少1种亲水性聚合物形成：
〔a〕由下式(I)表示的聚合物：
式(I)中，R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数；
〔b〕聚(甲基)丙烯酰吗啉；
〔c〕选自下式(I-1)表示的化合物和(甲基)丙烯酰吗啉中的至少1种亲水性单体与其它单体的共聚物：
式(I-1)中，R1、R2和m与上述相同。
5.根据权利要求4所述的细胞培养方法，其中，在使所述试样与所述亲水性聚合物层接触，将特定细胞粘附和/或吸附后，培养所述特定细胞。
6.根据权利要求4或5所述的细胞培养方法，其中，所述试样选自下述(1)、(2)和(3)中的至少1种：
(1)血液或体液；
(2)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞的试样；
(3)从血液或体液中分离和/或浓缩了血液或体液中的特定细胞、再使之悬浮而得的试样。
7.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其中，所述分离和/或浓缩通过基于细胞尺寸的分离和/或离心分离进行。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其中，通过使用分离液的所述离心分离，分离和/或浓缩所述特定细胞。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的细胞培养方法，其中，在所述分离和/或浓缩时，在所述试样中混合溶血剂。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的细胞培养方法，其中，在所述分离和/或浓缩时，使所述试样中的血细胞相互凝集。
11.根据权利要求6～10中任一项所述的细胞培养方法，其中，用液体培养基进行培养，每4天更换培养基1次以上。
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