WO2012114802A1 - L-システイン生産菌及びl-システインの製造法 - Google Patents
L-システイン生産菌及びl-システインの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2012114802A1 WO2012114802A1 PCT/JP2012/051084 JP2012051084W WO2012114802A1 WO 2012114802 A1 WO2012114802 A1 WO 2012114802A1 JP 2012051084 W JP2012051084 W JP 2012051084W WO 2012114802 A1 WO2012114802 A1 WO 2012114802A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cysteine
- gene
- bacterium
- pand
- protein
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01011—Aspartate 1-decarboxylase (4.1.1.11)
Definitions
- the present invention relates to a method for producing L-cysteine or a related substance, and more particularly to a bacterium suitable for producing L-cysteine or a related substance, and a method for producing L-cysteine or a related substance using the bacterium.
- L-cysteine and related substances are used in the pharmaceutical, cosmetic and food fields.
- L-cysteine has been obtained by extraction from keratin-containing substances such as hair, horns and feathers, or by microbial enzyme conversion using DL-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid as a precursor.
- mass production of L-cysteine by an immobilized enzyme method using a novel enzyme is also planned.
- production of L-cysteine by fermentation using microorganisms has also been attempted.
- Patent Document 1 a coryneform bacterium having an increased intracellular serine acetyltransferase activity (Patent Document 1) is known.
- Patent Document 2 a technique for enhancing L-cysteine production ability by retaining a mutant serine acetyltransferase in which feedback inhibition by L-cysteine is reduced is known (Patent Documents 2 to 4).
- Microorganisms whose L-cysteine production ability is enhanced by suppressing the L-cysteine decomposition system include cystathionine- ⁇ -lyase (Patent Document 2), tryptophanase (Patent Document 5), O-acetylserine sulfate. Coryneform bacteria or Escherichia bacteria in which the activity of hydrhydrase B (Patent Document 6) is reduced or deleted are known.
- Non-patent Document 1 the mar gene locus, the emr gene locus, the acr gene locus, the cmr gene locus, the mex gene, the bmr gene, or the qacA gene, which are genes encoding proteins suitable for excretion of substances that are toxic to cells (Patent Literature) 7), or a technique for enhancing L-cysteine production ability by increasing the expression of emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, or cusA gene (Patent Document 8).
- Escherichia coli in which the activity of a positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene is known as an L-cysteine-producing bacterium.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase (EC 4.1.1.11) is an enzyme that catalyzes the reaction of decarboxylating L-aspartate to produce ⁇ -alanine.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase is generally known to be translated as an inactive precursor protein and then processed at a specific site to become an active protein.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase is known to be competitively inhibited by L-cysteic acid (Non-patent Document 2), but it is not known whether it is inhibited by L-cysteine.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase can be a key enzyme for biosynthesis of acetyl CoA (Non-patent Document 3).
- Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
- acetyl-CoA biosynthesis can be rate-limiting in the production of L-cysteine.
- Non-patent Document 4 a method for producing L-glutamic acid using a medium containing pantothenic acid is known.
- JP 2002-233384 A Japanese Patent Laid-Open No. 11-155571 US Patent Application Publication No. 20050112731 US Pat. No. 6,218,168 JP 2003-169668 A JP-A-2005-245311 US Pat. No. 5,972,663 JP 2005-287333 A International pamphlet No. 01/27307 US Pat. No. 5,856,148 US Patent Application Publication No. 20050009162 International Publication No. 2004/111258
- the present invention has developed a novel technique for improving L-cysteine-producing ability of bacteria, and provides a method for producing L-cysteine-producing bacteria and L-cysteine or related substances, or a mixture thereof using the bacteria The task is to do.
- the present inventor has improved the ability to produce L-cysteine by modifying bacteria so that the activity of L-aspartate- ⁇ -decarboxylase is increased. I found out that I can. The present inventor further found that L-cysteine-producing ability can be improved by adding pantothenic acid to a medium used for L-cysteine production. Based on the above, the present invention has been completed.
- this invention can be illustrated as follows.
- a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae which has an ability to produce L-cysteine and has been modified so that L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased.
- the bacterium, wherein the expression level of the panD gene is increased by increasing the copy number of the panD gene or modifying the expression regulatory sequence of the same gene.
- the bacterium, wherein the panD gene is a DNA encoding the protein described in (A) or (B) below.
- A SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 , 54, 56, 58, or 60.
- B SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 , 54, 56, 58, or 60, comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions, and L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity
- a protein having [5] The bacterium, wherein the panD gene is the DNA described in (a) or (b) below.
- A SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, or 59, which contains the nucleotide sequence shown in 59.
- B SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, or 59, hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in FIG. 53, 55, 57, or 59, and L-aspartate- ⁇ -decarboxylase DNA encoding a protein having activity.
- the bacterium as described above, wherein the protein having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity further has the following feature (3): (3) 15th position valine, 16th position threonine, 20th position leucine, 22nd position tyrosine, 29th position aspartic acid, 42nd position glutamic acid, 51st position asparagine, 52nd position glycine, 54th position arginine, 60th position Isoleucine at position 72, asparagine at position 72, glycine at position 73, alanine at position 74, alanine at position 75, alanine at position 76, aspartic acid at position 83, and isoleucine at position 86.
- the bacterium having one or more of the following properties (1) to (3): (1) It has been modified to increase serine acetyltransferase activity. (2) The L-cysteine excretion system is strengthened. (3) Modified so that 3-phosphoglycerate dehydrogenase activity is increased. [9] The bacterium as described above, wherein the bacterium is an Escherichia bacterium. [10] The bacterium as described above, wherein the bacterium is Escherichia coli. [11] The bacterium, wherein the bacterium is a Pantoea bacterium. [12] Said bacterium, wherein said bacterium is Pantoea ananatis.
- a method for producing L-cysteine or a related substance, or a mixture thereof comprising culturing the bacterium in a medium and collecting L-cysteine or a related substance or a mixture thereof from the medium.
- the method wherein the medium contains pantothenic acid.
- Bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae having L-cysteine-producing ability are cultured in a medium containing pantothenic acid, and L-cysteine or a related substance or a mixture thereof is collected from the medium. , L-cysteine or a related substance, or a mixture thereof.
- the said method whose content of pantothenic acid in the said culture medium is 1 mg / L or more.
- the method as described above, wherein the related substance is L-cystine, a thiazolidine derivative, or L-methionine.
- Bacteria of the present invention belong to the family Enterobacteriaceae, which have L-cysteine-producing ability and have been modified to increase the activity of L-aspartate- ⁇ -decarboxylase. It is a bacterium.
- L-cysteine may be free L-cysteine or a salt thereof, or a mixture thereof.
- the salt include sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, and potassium salt.
- L-cysteine-producing ability means that, when a bacterium is cultured in a medium, L-cysteine or a related substance or a mixture thereof is produced in the medium or in the microbial cells, The ability to accumulate to the extent that it can be recovered.
- the bacterium having the ability to produce L-cysteine means a bacterium capable of producing a larger amount of L-cysteine or a related substance, or a mixture thereof than that of the wild strain or the parent strain and accumulating in the medium or in the microbial cells. .
- the bacterium having the ability to produce L-cysteine is preferably 0.05 g / L or more, more preferably 0.1 g / L or more, particularly preferably 0.2 g / L or more of L-cysteine or a related substance. Or a bacterium that can produce a mixture of these and accumulate in the medium.
- L-cysteine produced by bacteria may be partially converted to L-cystine by disulfide bonds in the medium.
- S-sulfocysteine may be produced by the reaction of L-cysteine and thiosulfuric acid contained in the medium (Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)).
- L-cysteine produced in bacterial cells may be condensed with a ketone or aldehyde present in the cells, such as pyruvic acid, to produce a thiazolidine derivative using hemithioketal as an intermediate (Japanese Patent No. 2992010). These thiazolidine derivatives and hemithioketals may exist as an equilibrium mixture.
- L-cysteine is used as a starting material for biosynthesis of ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, homocysteine, L-methionine, S-adenosylmethionine and the like. Therefore, in addition to the ability to produce L-cysteine, these compounds can be produced by using bacteria having the ability to produce compounds produced via these L-cysteines.
- the L-cysteine producing ability is not limited to the ability to accumulate only L-cysteine in the medium or in the microbial cells, but L-cysteine, L-cystine, derivatives of L-cysteine as described above (for example, S-sulfocysteine, thiazolidine derivatives, hemithioketals) or other compounds produced via L-cysteine as described above (for example, ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, homocysteine, L-methionine, S- Adenosylmethionine), or a mixture thereof, shall be included in the medium or in the fungus body.
- L-cystine, derivatives of L-cysteine as described above, and other compounds produced via L-cysteine as described above are collectively referred to as L-cysteine related substances.
- Bacteria having L-cysteine-producing ability may inherently have L-cysteine-producing ability.
- the following bacteria can be obtained by utilizing a mutation method or recombinant DNA technology. It may be modified so as to have cysteine-producing ability.
- the bacterium used in the present invention includes Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella
- the parent strain of the family Enterobacteriaceae used for modification it is desirable to use, in particular, Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria, Erwinia bacteria, Enterobacter bacteria, or Klebsiella bacteria.
- the Escherichia bacterium is not particularly limited. Specifically, Neidhardt et al. (Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1 In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology / Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC).
- Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli.
- Specific examples of Escherichia coli include Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) derived from the prototype wild-type K12 strain, Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), and the like.
- strains can be purchased from, for example, the American Type Culture Collection (address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
- Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans and Enterobacter aerogenes.
- a representative strain of the genus Enterobacter is Enterobacter agglomerans ATCC 12287. Specifically, the strains exemplified in European Patent Application Publication No. 952221 can be used.
- Pantoea examples include Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, Pantoea citrea.
- Pantoea Ananatis include Pantoea Ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614) and SC17 strain (FERM BP-11091).
- AJ13355 strain is a strain isolated from soil in Iwata City, Shizuoka Prefecture, as a strain that can grow on a medium containing L-glutamic acid and a carbon source at low pH.
- the SC17 strain is a strain selected from the AJ13355 strain as a low mucus production mutant (US Pat. No. 6,596,517).
- Pantoea Ananatis AJ13355 was established at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (current name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, zip code 305-8565, East of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. 1-chome, 1-address, 1-center, 6), deposited under the deposit number FERM P-16644, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 11, 1999 and given the deposit number FERM BP-6614 .
- Pantoea Ananatis SC17 was deposited on February 4, 2009 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Center (address zip code 305-8656, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki). The accession number FERM BP-11091 is assigned.
- the Pantoea ananatis AJ13355 strain was identified as Enterobacter agglomerans at the time of isolation and deposited as the Enterobacter agromerans AJ13355 strain. Has been.
- Examples of the genus Erwinia include Erwinia amylovora and Erwinia carotovora, and examples of the genus Klebsiella include Klebsiella planticola.
- Pantoea bacteria, Erbinia bacteria, Enterobacter bacteria are bacteria classified as ⁇ -proteobacteria, and are taxonomically closely related (J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43 ( 6) 355-361, International Journal Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067). Therefore, some bacteria belonging to the genus Enterobacter have been reclassified to Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa by DNA-DNA hybridization experiments and the like (International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989) ; 39 (3) .p.337-345).
- Enterobacter agglomerans have been reclassified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, or Pantoea stealty by 16S rRNA sequence analysis.
- Some bacteria belonging to the genus Ervinia have been reclassified as Pantoea ananas and Pantoea Stuarti (International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43 (1), p.162- 173).
- it may belong to any of the genus Enterobacter, Pantoea, Erwinia and the like.
- auxotrophy, analog resistance, metabolic control mutation and other properties imparted may be single or two or more.
- L-cysteine biosynthesis enzymes whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more.
- imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.
- An auxotrophic mutant strain capable of producing L-cysteine, an analog-resistant strain of L-cysteine, or a metabolically controlled mutant strain is obtained by subjecting a parent strain or a wild strain to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, -N'-Nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) or treatment with mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), etc., among the obtained mutant strains, auxotrophy, analog tolerance, or metabolism It can be obtained by selecting those that show regulatory mutations and have the ability to produce L-cysteine.
- normal mutation treatment that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, -N'-Nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) or treatment with mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), etc.
- L-cysteine-producing ability is imparted or enhanced, and L-cysteine-producing bacteria
- L-cysteine producing ability of bacteria is the production of compounds that are substrates of the pathway, such as enzymes of the L-cysteine biosynthetic pathway or L-serine. It can be improved by enhancing the activity of the enzyme involved. Examples of such an enzyme include serine acetyltransferase (SAT) and 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PGD). Enhancing the enzyme activity can be achieved by enhancing the expression of a gene encoding the target enzyme or enhancing the inactivity of the target enzyme, as described later.
- SAT serine acetyltransferase
- the enzyme activity is enhanced by allowing the bacterium to retain a mutant cysE gene encoding serine acetyltransferase in which this feedback inhibition is reduced or eliminated. be able to.
- 3-phosphoglycerate dehydrogenase is subject to feedback inhibition by serine, in particular, it is possible to cause bacteria to retain a mutant serA gene encoding a mutant 3-phosphoglycerate dehydrogenase in which this feedback inhibition is reduced or eliminated.
- the enzyme activity can be enhanced.
- a mutant SAT having resistance to feedback inhibition derived from Escherichia coli a mutant SAT in which the methionine residue at position 256 is replaced with a glutamic acid residue (JP-A-11-155571), the methionine residue at position 256 Mutant SAT (Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)) in which the group is replaced with an isoleucine residue, amino acid 273 from amino acid residue 97 Mutation in the region up to the residue, or mutant SAT having a deletion of the C-terminal region from the amino acid residue at position 227 (WO97 / 15673, US Pat. No.
- the gene encoding SAT is not limited to the Escherichia coli gene, and any gene encoding a protein having SAT activity can be used.
- an SAT isozyme derived from Arabidopsis that is not subject to feedback inhibition by L-cysteine is known, and a gene encoding this can also be used (FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459).
- the L-cysteine producing ability of bacteria can be improved by strengthening the L-cysteine excretion system.
- the L-cysteine excretion system can be enhanced by enhancing the expression of genes encoding proteins involved in L-cysteine excretion. Examples of proteins involved in L-cysteine excretion include YdeD protein encoded by ydeD gene, YfiK protein encoded by yfiK gene, and YeaS protein encoded by yearS gene. Therefore, the expression of the ydeD gene (Dassler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000)), yfiK gene (Japanese Patent Laid-Open No.
- a mutation that replaces the threonine residue at position 28 of the Yeas protein with asparagine a mutation that replaces the phenylalanine residue at position 137 with one of serine, glutamine, alanine, histidine, cysteine, and glycine, and / or Alternatively, a mutation in which the leucine residue at position 188 is substituted with glutamine is preferable (European Patent Application No. 2218729).
- the L-cysteine excretion system can be enhanced by enhancing the expression of genes encoding them.
- the mar locus, emr locus, acr locus, cmr locus, mex gene, bmr gene, or qacA gene which is a gene encoding a protein suitable for excretion of a substance toxic to cells
- emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, or cusA gene Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-287333
- L-cysteine production ability can be improved by enhancing the sulfate / thiosulfate transport system.
- the sulfate / thiosulfate transport system protein group is encoded by the cysPTWAM gene cluster (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-137369, EP1528108).
- the L-cysteine production ability of bacteria can be improved by reducing the activity of cysteine desulfhydrase that contributes to the degradation of L-cysteine.
- cystathionine- ⁇ -lyase encoded by the metC gene Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-155571, Chandra et. Al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069.
- Tryptophanase encoded by the tnaA gene Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-169668, Austin Newton et al., J. Biol. Chem.
- the L-cysteine-producing bacterium preferably has one or more of the following properties (1) to (3). (1) It has been modified to increase serine acetyltransferase activity. (2) The L-cysteine excretion system is strengthened. (3) Modified so that 3-phosphoglycerate dehydrogenase activity is increased.
- Escherichia coli JM15 strain (US Pat. No. 6,218,168) transformed with a plurality of cysE alleles encoding a feedback inhibition resistant serine acetyltransferase (SAT). No.
- Escherichia coli W3110 strain (US Pat. No.
- pACYC-DES is a plasmid obtained by inserting the three genes into pACYC184, and each gene is controlled by the PompA promoter.
- the ability to produce compounds such as ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, cystathionine, homocysteine, L-methionine, and S-adenosylmethionine that are biosynthesized using L-cysteine as a starting material is also in the biosynthetic pathway of the target compound. It can be imparted or enhanced by increasing the enzyme activity or reducing the activity of an enzyme that breaks down the biosynthetic pathway or an enzyme that degrades the target compound.
- the ability to produce ⁇ -glutamylcysteine can be enhanced by enhancing ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity and / or decreasing glutathione synthetase activity.
- the ability to produce glutathione can be imparted or enhanced by enhancing ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity and / or glutathione synthetase activity.
- the ability to produce ⁇ -glutamylcysteine or glutathione can also be enhanced by using a mutant ⁇ -glutamylcysteine synthetase that is resistant to feedback inhibition by glutathione.
- the production of glutathione is described in detail in a review by Li et al. (Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242).
- L-methionine can be imparted or enhanced by imparting L-threonine requirement or norleucine resistance (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471).
- the gene for the enzyme involved in L-threonine biosynthesis exists as the threonine operon (thrABC).
- thrABC threonine operon
- the ability to biosynthesize after L-homoserine was lost by deleting the thrBC moiety.
- L-threonine-requiring strains can be obtained.
- the S-adenosylmethionine synthetase activity is weakened and L-methionine producing ability is imparted or enhanced.
- S-adenosylmethionine synthetase is encoded by the metK gene.
- L-methionine-producing ability is achieved by enhancing the activities of enzymes involved in L-methionine biosynthesis such as methionine repressor deficiency, homoserine transsuccinylase, cystathionine ⁇ -synthase, and aspartokinase-homoserine dehydrogenase II. Can also be imparted or enhanced (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471). In E.
- the methionine repressor is encoded by the metJ gene
- the homoserine transsuccinylase is encoded by the metA gene
- the cystathionine ⁇ -synthase is encoded by the metB gene
- the aspartokinase-homoserine dehydrogenase II is encoded by the metL gene.
- the ability to produce L-methionine can also be imparted or enhanced by using a mutant homoserine transsuccinylase resistant to feedback inhibition by L-methionine (JP 2000-139471, US20090029424).
- L-methionine is biosynthesized using L-cysteine as an intermediate, L-methionine production ability can be improved by improving L-cysteine production ability (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471, US20080311632). . Therefore, in order to impart or enhance L-methionine producing ability, it is also effective to impart or enhance L-cysteine producing ability.
- L-methionine-producing bacteria include AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402) (UK Patent No. 2075055).
- E.218coli strains such as L-methionine analog 218 strains having resistance to norleucine (VKPM B-8125) (Russian Patent No. 2209248) and 73 strains (VKPM B-8126) (Russian Patent No. 2215782) Is mentioned.
- AJ13425 (FERM P-16808) (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139471) derived from E.coli ⁇ ⁇ ⁇ W3110 can also be used.
- AJ13425 lacks methionine repressor, weakens intracellular S-adenosylmethionine synthetase activity, intracellular homoserine transsuccinylase activity, cystathionine ⁇ -synthase activity, and aspartokinase-homoserine dehydrogenase II activity Is an enhanced L-threonine-requiring strain.
- cystathionine and homocysteine are intermediates in the L-methionine biosynthetic pathway, in order to enhance the production ability of these substances, it is effective to use a part of the above-described method for enhancing the production ability of L-methionine. It is.
- Specific methods for enhancing cystathionine-producing ability include a method using a methionine-requiring mutant (Japanese Patent Application No. 2003-010654), cysteine (or a biosynthetic raw material thereof) and / or homoserine (or a biosynthetic raw material) in a fermentation medium. Is known (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-168422). Since homocysteine uses cystathionine as a precursor, the above method for enhancing cystathionine production ability is also effective for enhancing homocysteine production ability.
- the ability to produce compounds such as S-adenosylmethionine biosynthesized using L-methionine as a starting material also enhances the enzyme activity of the biosynthetic pathway of the target compound or branches off from the biosynthetic pathway. It can be imparted or enhanced by reducing the activity of the enzyme of the pathway or the enzyme that degrades the target compound.
- the ability to produce S-adenosylmethionine can be imparted or enhanced by enhancing methionine adenosyltransferase activity (EP0647712, EP1457569) or enhancing the efflux factor MdfA encoded by the mdfA gene (US7410789). it can.
- the enzyme activity is reduced means that the target enzyme activity is reduced as compared to a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain, and the activity is completely lost. Including cases.
- the enzyme activity is preferably reduced to 75% or less, 50% or less, 25% or less, or 10% or less, for example, as compared to the unmodified strain, and it is particularly preferable that the activity is completely lost. Depending on the enzyme, it may be preferable not to completely lose the activity.
- the modification that reduces the enzyme activity can be achieved, for example, by reducing the expression of a gene encoding the target enzyme.
- Reduction of gene expression can be achieved, for example, by modifying expression control sequences such as gene promoters and SD sequences.
- the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more. Further, part or all of the expression regulatory sequence may be deleted.
- reduction of gene expression can also be achieved by expressing antisense RNA.
- the modification that reduces the enzyme activity can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome.
- the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted.
- the region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region.
- the longer region to be deleted can surely inactivate the gene.
- it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.
- Modifications that reduce enzyme activity include, for example, introducing an amino acid substitution (missense mutation) into the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), Alternatively, it can also be achieved by introducing a frameshift mutation that adds or deletes 1 to 2 bases (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 ( 1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)).
- modification that lowers the enzyme activity can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene encoding the target enzyme on the chromosome.
- the insertion site may be any region of the gene, but the longer the sequence to be inserted, the more reliably the gene can be inactivated.
- Other sequences are not particularly limited as long as they reduce or eliminate the function of the encoded protein, and examples include marker genes such as antibiotic resistance and genes useful for L-cysteine production.
- Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein. This can be achieved by replacing the gene on the chromosome with the deleted gene by transforming the bacterium with the recombinant DNA containing, and causing homologous recombination between the deleted gene and the gene on the chromosome. At this time, the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host. Even if the protein encoded by the deletion-type gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
- a method using linear DNA such as a method (see WO2005 / 010175), a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin, There are a method using a plasmid capable of conjugation transfer and a method using a suicide vector having no replication origin in the host (US Pat. No. 6,303,383, Japanese Patent Laid-Open No. 05-007491).
- modification that lowers the enzyme activity may be performed by, for example, mutation treatment.
- Mutation treatment includes UV irradiation or normal mutation treatment such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), methylmethanesulfonate (MMS), etc. Treatment with the mutagen used in the above.
- the decrease in enzyme activity can be confirmed by measuring the enzyme activity.
- Cysteine desulfhydrase activity can be measured by the technique described in JP-A-2002-233384.
- Confirmation that the transcription amount of the target gene has decreased can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with that of the unmodified strain.
- methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring spring Laboratory Laboratory, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
- the bacterium of the present invention has been modified to increase L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity.
- the bacterium of the present invention can be obtained by modifying a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae having the ability to produce L-cysteine as described above so that L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased.
- L-cysteine-producing ability may be imparted or enhanced after modification so that L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased.
- the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity refers to the activity of catalyzing the reaction of decarboxylating L-aspartic acid to produce ⁇ -alanine.
- a protein having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is referred to as L-aspartate- ⁇ -decarboxylase.
- An increase in L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is expected to increase the production of pantothenic acid biosynthesized with ⁇ -alanine as an intermediate metabolite.
- the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased means that the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased relative to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
- the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is not particularly limited as long as it is increased compared to the unmodified strain, but is preferably 150% or more, more preferably 200% or more, compared to the non-modified strain. Preferably, it is improved to 300% or more.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased only means that L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased in a strain originally having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity. Rather, conferring L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity to a strain that does not originally have L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity. As a result, as long as the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased, the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase inherent in the bacterium is weakened and / or deleted, and a suitable L-aspartate- ⁇ -decarboxylase may be introduced.
- Modifications that increase L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity can be achieved, for example, by enhancing the expression of a gene encoding L-aspartate- ⁇ -decarboxylase.
- Enhance gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.
- Increase in gene copy number can be achieved by introducing the target gene into the chromosome.
- Introduction of a gene into a chromosome can be performed using, for example, homologous recombination.
- multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies on the chromosome as a target.
- sequences in which a large number of copies exist on a chromosome include repetitive DNA sequences (repetitive DNA), inverted repeats existing at both ends of a transposon, and the like, but are not limited thereto.
- the chromosome may be linked in tandem beside the L-aspartate- ⁇ -decarboxylase gene present on the chromosome, or may be redundantly integrated on an unnecessary gene on the chromosome.
- Such gene transfer can be accomplished using a temperature sensitive vector or using an integration vector.
- Mu, Tn10, or Tn5 can be used as the transposon.
- the introduction of the gene into the chromosome can be confirmed by Southern hybridization using a part of the gene as a probe.
- An increase in the copy number of the gene can also be achieved by introducing a vector containing the target gene into the host bacterium.
- a DNA fragment containing a target gene is linked to a vector that functions in the host bacterium to construct an expression vector for the target gene, and the host bacterium is transformed with the expression vector to increase the copy number of the target gene.
- the vector a vector capable of autonomous replication in a host bacterial cell can be used.
- the vector is preferably a multicopy vector.
- the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene.
- vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli cells include pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, pBR322, pSTV29 (all available from Takara Bio Inc.), pMW219 (Nippon Gene), pTrc99A (Pharmacia) ), PPROK vector (Clontech), pKK233-2 (Clontech), pET vector (Novagen), pQE vector (Qiagen), wide host range vector RSF1010 and the like.
- enhancement of gene expression can be achieved by improving gene transcription efficiency.
- Improvement of gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing a promoter of a gene on a chromosome with a stronger promoter.
- strong promoter is meant a promoter that improves transcription of the gene over the native wild-type promoter.
- a stronger promoter for example, a known high expression promoter such as T7 promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, PL promoter and the like can be used.
- a highly active promoter of a conventional promoter may be obtained by using various reporter genes.
- the activity of the promoter can be increased by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
- Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotickpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.,. 1, 105-128 (1995)).
- enhancement of gene expression can be achieved by improving gene translation efficiency.
- Improvement of gene translation efficiency can be achieved, for example, by replacing the SD sequence (also referred to as ribosome binding site (RBS)) of the gene on the chromosome with a stronger SD sequence.
- SD sequence also referred to as ribosome binding site (RBS)
- RBS ribosome binding site
- a stronger SD sequence is meant an SD sequence in which the translation of mRNA is improved over the originally existing wild-type SD sequence.
- RBS of gene 10 derived from phage T7 can be mentioned (Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).
- a site that affects gene expression such as a promoter, an SD sequence, and a spacer region between the RBS and the start codon is also collectively referred to as an “expression control region”.
- the expression regulatory region can be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. These expression regulatory regions can be modified by, for example, a method using a temperature sensitive vector or a Red driven integration method (WO2005 / 010175).
- enhancement of gene expression can be achieved by amplifying a regulator that increases the expression of the target gene, or by deleting or weakening a regulator that decreases the expression of the target gene.
- the regulator include those belonging to the LysR family and the like, and can be found using a database EcoCyc (http://ecocyc.org/) or the like.
- the regulator may be modified using as an index the increase in the transcription amount of the target gene or the increase in the amount of the target protein.
- the methods for enhancing gene expression as described above may be used alone or in any combination.
- Modifications that increase L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity can also be achieved, for example, by enhancing the inactivity of L-aspartate- ⁇ -decarboxylase.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase with enhanced inactivity can be obtained, for example, by searching for various bacteria.
- a highly active form may be obtained by introducing a mutation into conventional L-aspartate- ⁇ -decarboxylase.
- the enhancement of inactivity may be used alone or in any combination with the above-described method for enhancing gene expression.
- the method of transformation is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
- a method of increasing the DNA permeability by treating recipient cells with calcium chloride (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol ., 53, 159 (1970)) and methods for introducing competent cells from proliferating cells and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)) can be used.
- DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, can be placed in a protoplast or spheroplast state that readily incorporates recombinant DNA into recombinant DNA.
- Introduction method (Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. , Nature, 274, 3981978 (1978); Hinnen, A., ickHicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity should be measured by the method described in Non-Patent Document 4 (Dusch N. et al., Appl Environ Microbiol. 1999 Apr; 65 (4): 1530-9.). Can do.
- Confirmation that the amount of transcription of the target gene has increased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with a wild strain or an unmodified strain.
- methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
- the method for enhancing gene expression and enzyme inactivity as described above is not limited to L-aspartate- ⁇ -decarboxylase or a gene encoding the same, and encodes any enzyme such as SAT or the like. The same applies to genes and the like.
- L-aspartate- ⁇ -decarboxylase is usually encoded by the panD gene.
- a protein encoded by the panD gene is also referred to as a PanD protein.
- the panD gene of Escherichia coli K12 MG1655 strain corresponds to a complementary sequence of positions 146314 to 146694 in the genome sequence registered as GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990) in the NCBI database.
- the panD gene of Escherichia coli K12 MG1655 strain is synonymous with ECK0130 and JW0127.
- the nucleotide sequence of the panD gene of the MG1655 strain and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
- nucleotide sequence of the panD gene of Pantoea ananatis SC17 strain and the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
- the base sequence of the panD gene of Corynebacterium glutamicum 2256 strain and the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
- the nucleotide sequence of the panD gene of Bacillus subtilis 168 strain and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
- the panD gene that has been modified to increase L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is L- As long as it encodes a protein having aspartate- ⁇ -decarboxylase activity, it may be a variant of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 13.
- a variant of the panD gene can be searched by BLAST or the like with reference to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 13 (http://blast.genome.jp/).
- the variant of panD gene contains the homologue of the same gene.
- homologue of the same gene for example, a synthesis prepared based on the base sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 13, using a chromosome of a microorganism such as a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae or a coryneform bacterium as a template Examples thereof include genes that can be amplified by PCR using oligonucleotides.
- panD gene homolog of bacteria other than the above examples include the following panD gene of bacteria.
- the BLAST identity (%) between the PanD protein of Escherichia coli K12 strain (SEQ ID NO: 8) and the PanD protein encoded by the panD gene homologue of each bacterium is shown.
- the nucleotide sequences of these genes and the amino acid sequences encoded by them are shown in SEQ ID NOs: 15-60.
- the panD gene may be a variant of these homologues as long as it encodes a protein having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity.
- Arthrobacter aurescens ATCC BAA-1386 Bacteroides fragilis ATCC 25285 (44) Bacteroides vulgatus ATCC 8482 (48) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (43) Chlorobium tepidum ATCC 49652 (47) Citrobacter koseri ATCC BAA-895 (96) Clavibacter michiganensis NCPPB 382 (51) Corynebacterium jeikeium NCTC 11915 (48) Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406 (44) Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894 (90) Flavobacterium johnsoniae ATCC 17061 (45) Flavobacterium psychrophilum ATCC 49511 (44) Klebsiella pneumoniae subsp.
- panD gene encodes a protein having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity
- the amino acid sequence of the PanD protein as described above, for example, SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 , 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, or 60.
- It may be a gene encoding a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at a position.
- the “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, More preferably, it means 1 to 5.
- amino acid substitutions, deletions, insertions or additions described above are conservative mutations in which the function of the protein is maintained normally.
- a typical conservative mutation is a conservative substitution.
- Conservative substitution means, for example, when a substitution site is an aromatic amino acid, between Phe, Trp, and Tyr, and when a substitution site is a hydrophobic amino acid, between Leu, Ile, and Val, a polar amino acid Is an amino acid having a hydroxyl group between Gln and Asn, in the case of a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, and in the case of an acidic amino acid, between Asp and Glu. In some cases, it is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
- substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
- amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences in microorganisms from which genes are derived, or differences in species. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences in microorganisms from which genes are derived, or differences in species. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences in microorganisms from which genes are derived, or differences in species. Also included by
- the gene having a conservative mutation as described above is the entire amino acid sequence of the PanD protein as described above, for example, SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 80% or more, preferably 90% or more, based on the entire amino acid sequence shown in 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, or 60 More preferably 95% or higher, more preferably 97% or higher, particularly preferably 99% or higher, and a gene encoding a protein having L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity. Also good.
- “homology” may refer to “identity”.
- the panD gene is a probe that can be prepared from a known gene sequence, such as SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37. , 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, or 59, and hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in the figure, L-aspartate- ⁇ -decarboxylase It may be DNA encoding a protein having activity.
- stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
- highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more DNAs having homology.
- DNAs with lower homology are not hybridized with each other, or normal Southern hybridization washing conditions of 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C. Wash once, more preferably 2-3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS The conditions to do are mentioned.
- the probe may be a part of a gene complementary sequence.
- a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
- hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
- the description regarding the said gene or protein variant is applied similarly to enzymes, such as serine acetyltransferase and 3-phosphoglycerate dehydrogenase, and YdeD protein, and the gene which codes them.
- glycine at position 24 and serine at position 25 are conserved.
- the PanD protein is divided into an ⁇ subunit and a ⁇ subunit, and glycine at position 24 and serine at position 25 are the splitting sites. These amino acid residues were commonly conserved in all types of PanD proteins in the alignment (FIG. 1).
- 9th lysine, 11th histidine, 57th threonine, and 58th tyrosine are conserved. These amino acid residues are presumed to be pockets from the three-dimensional structure, and are thought to contribute to L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity. These amino acid residues were commonly conserved in all types of PanD proteins in the alignment (FIG. 1).
- residues selected from: isoleucine at position 72, asparagine at position 72, glycine at position 73, alanine at position 74, alanine at position 75, alanine at position 76, aspartic acid at position 83, and isoleucine at position 86 are preferably conserved, more preferably all these residues are conserved. These amino acid residues were almost conserved in the alignment (FIG. 1).
- Each amino acid residue means an amino acid residue corresponding to each position in SEQ ID NO: 8. That is, the position of each amino acid residue indicates a relative position, and the position may be moved back and forth by amino acid deletion, insertion, addition, or the like.
- the “serine residue at position 25” means a serine residue corresponding to position 25 in SEQ ID NO: 8, and when one amino acid residue on the N-terminal side from position 25 is deleted, It is assumed that the 24th serine residue from the N-terminal (including the methionion residue encoded by the start codon) is “25th serine residue”.
- the 26th serine residue from the N-terminal is the “25th serine residue”.
- the serine residue at position 25 is conserved” means that the amino acid residue corresponding to position 25 in SEQ ID NO: 8 is serine in the PanD protein. The same applies to other amino acid residues.
- L-cysteine of the present invention or a related substance thereof, or a mixture thereof
- the bacterium of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, and L-cysteine or a related substance thereof is cultured from the medium.
- L-cysteine-related substances include S-sulfocysteine, thiazolidine derivatives, hemithioketals corresponding to the thiazolidine derivatives, L-methionine, S-adenosylmethionine, and the like.
- Examples of the medium to be used include a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required.
- Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysate, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
- Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
- inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
- organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
- sulfur sources include inorganic sulfur compounds such as sulfates, sulfites, hyposulfites, thiosulfates, and sulfides.
- an organic trace nutrient source it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract.
- a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract.
- potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added in small amounts as necessary.
- Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 30 to 90 hours, and the culture temperature is preferably controlled at 25 ° C. to 37 ° C. and the pH during culture is preferably controlled at 5 to 8.
- an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
- L-cysteine from the culture, its related substances, or a mixture thereof can be carried out by combining the usual ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
- L-cysteine obtained as described above can be used for the production of L-cysteine derivatives.
- L-cysteine derivatives include methylcysteine, ethylcysteine, carbocysteine, sulfocysteine, acetylcysteine and the like.
- the thiazolidine derivative of L-cysteine when the thiazolidine derivative of L-cysteine accumulates in the medium, the thiazolidine derivative is collected from the medium, and the reaction equilibrium between the thiazolidine derivative and L-cysteine is shifted to the L-cysteine side. Can be manufactured. Further, when S-sulfocysteine accumulates in the medium, it can be converted to L-cysteine by reduction using a reducing agent such as dithiothreitol.
- pantothenic acid may be added to the medium, L-cysteine or a related substance, or these Mixtures can be produced. That is, in a further aspect of the method of the present invention (hereinafter also referred to as the second method of the present invention), a bacterium having L-cysteine-producing ability is cultured in a medium containing pantothenic acid and L- A method for producing L-cysteine or a related substance, or a mixture thereof, characterized by collecting cysteine or a related substance or a mixture thereof.
- the bacterium having L-cysteine producing ability used in the second method of the present invention may or may not be modified to increase L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity. That is, L-cysteine-producing bacteria may be modified so that L-aspartate- ⁇ -decarboxylase activity is increased, and pantothenic acid may be added to the medium.
- the pantothenic acid content in the medium is preferably 1 mg / L or more, more preferably 2 mg / L or more, still more preferably 5 mg / L or more, particularly preferably 10 mg / L or more. preferable.
- the upper limit of the pantothenic acid content is not particularly limited, but may be, for example, 10 g / L or less, or 1 g / L or less.
- Pantothenic acid may be a free form, may be pantothenate, and may be any mixture thereof.
- the pantothenate is not particularly limited, and examples thereof include calcium salts and sodium salts.
- Pantothenic acid may be contained in the medium during the entire culture period, or may be contained in the medium only during a part of the culture period.
- the method of the present invention comprises a step of growing an L-cysteine-producing bacterium and a step of producing and accumulating L-cysteine
- pantothenic acid may be contained in the medium at least in the step of producing and accumulating L-cysteine.
- pantothenic acid may or may not be contained in the medium.
- pantothenic acid may be contained in the medium during the entire period, or may be contained in the medium only during a part of the period.
- pantothenic acid content does not have to be in the above range during the entire period of production and accumulation of L-cysteine, and pantothenic acid is added to the medium so that the content is in the above range at the beginning of the same stage.
- the pantothenic acid content may be reduced with the passage of culture time. Further, pantothenic acid may be additionally added continuously or intermittently.
- the same medium components and similar culture conditions as those of the above-described method using the bacterium of the present invention can be used.
- cysteine means L-cysteine.
- panD gene expression plasmid carrying various panD genes was constructed according to the following procedure.
- PanD (Cg) -FW CCAAGCTTATGGCATTCCAATAGTCAGG: SEQ ID NO: 1
- panD (Cg) -RV CGAAGCTTGGGAAAAAGACGGCTCTACC: SEQ ID NO: 2
- panD An about 900 bp panD (Cg) gene fragment containing about 300 bp upstream to about 200 bp downstream of the gene was amplified.
- the primer is designed to have a restriction enzyme HindIII site at the 5 ′ end. PCR is performed using Pyrobest polymerase (Takara Bio Inc.) with the standard composition described in the protocol.
- the reaction conditions are 94 ° C-5 minutes, 98 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 1 minute. 30 cycles were used.
- the obtained fragment was treated with HindIII, inserted into the HindIII site of pSTV29 (Takara), and subcloning was performed to confirm that the sequence was correct.
- panD (Ec) -FW ATGATTCGCACGATGCTGCAGG: SEQ ID NO: 3
- panD (Ec) -RV TAAGCAACCTGTACCGGAATCG: SEQ ID NO: 4
- PCR was performed under the same conditions as described above. After digesting pMW218 with SmaI, insert the obtained fragment in the same direction as the lacZ gene on the vector to obtain plasmid pMW218-panD (Ec) (kanamycin resistance marker) in which the panD gene of E. coli MG1655 strain was cloned did.
- the cloned panD gene is expressed at the read-through of the lac promoter on the vector.
- panD (Pa) -FW (GTAAAGGCTGCAGGTCGTATTTTTGGCTGT: SEQ ID NO: 5)
- panD (Pa) -RW (GTTCTATATCGCGGTCTACTTCCTGATTCA: SEQ ID NO: 6)
- a panD (Pa) gene fragment was obtained by the PCR used. PCR is performed using Pyrobest polymerase (Takara Bio Inc.) with the standard composition described in the protocol. The reaction conditions are 94 ° C-1 min, then 94 ° C for 30 sec, 60 ° C for 30 sec, 72 ° C for 1 min. 30 cycles were set.
- the obtained fragment was inserted in the same direction as the lacZ gene on the vector, and the plasmid pSTV29-panD (Pa) (chloramphenicol resistance marker) in which the panD gene of P. ananatis SC17 strain was cloned ).
- the cloned panD gene is expressed at the read-through of the lac promoter on the vector.
- Plasmid pCR-panD is a plasmid carrying a region containing the panD gene of B. subtilis 168 strain (ATCC 23857).
- pCR-panD (Bs) is a region of 2350947 bp to 2235951 bp of the genome of B. subtilis 168 strain (according to the genome database SubtiList; http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/) on the BamHI site of pMW218 vector (Nippon Gene) ) Has a structure inserted by Sau3AI at both ends.
- a panD gene of B. subtilis 168 strain and its peripheral region can be easily obtained by a conventional method such as PCR, and a plasmid having the same structure as pCR-panD (Bs) that meets the purpose of this experiment can be constructed.
- Plasmid pMIV-CysE5 Japanese Patent Laid-Open No. 2009-232844 includes a gene (cysE5) encoding cysE5 (US20050112731 (A1)), a mutant SAT that has been desensitized to feedback inhibition by L-cysteine, and a chloramphenicol resistance gene The CysE5 cassette containing is installed.
- a tetracycline resistance gene excised from plasmid pACYC184 with Eco88I-XbaI was blunt-ended and inserted into the PvuI site of pMIV-CysE5 which was also blunt-ended to construct pMT-CysE5.
- the CysE5 cassette was introduced into the chromosome of the SC17 strain, a wild strain of P. ananatis, by a mini-Mu phage system (EP1149911 (A)) according to a conventional method using pMH10 as a helper. Transformants were selected using chloramphenicol resistance as a marker. When about 50 transformants in which the CysE5 cassette was introduced into the chromosome were picked up and cysteine was produced and cultured, most clones produced 0.2 to 0.3 g / L of cysteine. Among them, one clone produced about 0.7 g / L of cysteine, and this clone was named SC17intE511.
- the genomic DNA of SC17intE511 was extracted, and the obtained genomic DNA was introduced into SC17 by electroporation, and a strain in which the CysE5 cassette was introduced into the chromosome was newly prepared.
- Transformants were selected using chloramphenicol resistance as a marker. When about 20 transformants were picked up and cysteine was produced and cultured, almost all clones produced 0.2 to 0.3 g / L of cysteine.
- the SAT activity of some clones was measured by a conventional method (US20050112731 (A)), and a clone having SAT activity comparable to the parent strain SC17intE511 was selected and named SC17intE511-2.
- ananatis is performed by electroporation according to a conventional method, and the selection of transformants is LB containing antibiotics corresponding to the antibiotic resistance marker of the plasmid (25 mg / L chloramphenicol or 20 mg / L kanamycin).
- the test was performed on an agar medium (5 g / L yeast extract, 10 g / L tryptone, 10 g / L sodium chloride, 15 g / L agar).
- an agar medium 5 g / L yeast extract, 10 g / L tryptone, 10 g / L sodium chloride, 15 g / L agar.
- what transformed each empty vector was also acquired as a control strain.
- SC17intE511-2 / pMW218-panD Cg
- SC17intE511-2 / pMW218, SC17intE511-2 / pSTV28-panD Pa
- SC17intE511-2 / pSTV29 SC17intE511-2 / Cysteine production culture was performed using pCR-panD (Bs) strain and SC17intE511-2 / pCR strain, and the amount of cysteine produced was compared.
- Bs pCR-panD
- SC17intE511-2 / pSTV29 strain 20 mg / L of calcium pantothenate was added to carry out cysteine production culture, and the effect of pantothenic acid addition on cysteine production was examined.
- cysteine production medium ammonium sulfate 15 g / L Potassium dihydrogen phosphate 1.5 g / L
- Manganese chloride tetrahydrate 1.6 mg / L
- Cysteine production culture was performed according to the following procedure. Each strain of cysteine-producing bacteria was spread on an LB agar medium containing chloramphenicol or kanamycin, and precultured overnight at 34 ° C. Scratch about 7 cm of cells on the plate with a 10 microliter inoculation loop (NUNC Blue Loop) and plant in 2 ml of cysteine production medium in a large test tube (inner diameter 23 mm, length 20 cm). Bacteria were prepared so that the amount of cells at the start of the culture was almost the same. After shaking culture at 32 ° C., when the glucose was completely consumed, the culture was terminated (about 13 to 16 hours), and the amount of cysteine produced in the medium was quantified.
- NUNC Blue Loop 10 microliter inoculation loop
- the plasmid pACYC-DE1 carries the cysEX gene (US5972663A) that encodes a mutant SAT that has been desensitized to feedback inhibition by L-cysteine, and the ydeD gene that encodes an excretion factor of cysteine and acetylserine. By introducing, a cysteine-producing bacterium that produces a significant amount of cysteine can be produced.
- pACYC-DE1 can be constructed by almost the same method as the construction method of pACYC-DES described in EP1528108B1.
- pACYC-DE1 The difference from pACYC-DES is that in pACYC-DE1, the serA5 gene is not loaded, and only two genes, cysEX gene and ydeD gene, are loaded in the pACYC184 vector. In pACYC-DE1, both the cysEX gene and the ydeD gene are linked to the ompA promoter. This pACYC-DE1 was cut with MnuI and self-ligated to delete about 330 bp inside ydeD. The thus constructed plasmid carrying the cysEX gene and losing the function of the ydeD gene was designated as pACYC-E1, and used in the following experiments.
- transformant MG1655 / pACYC-E1 obtained by introducing the above pACYC-E1 (tetracycline resistance marker) into E. coli MG1655 strain by electroporation was used.
- E. coli cysteine-producing bacterium MG1655 / pACYC-E1 was transformed with pMW218-panD (Cg) and pMW218-panD (Ec).
- E.coli is transformed by electroporation according to a standard method, and the selection of transformants is LB containing antibiotics corresponding to the antibiotic resistance marker of the plasmid (25mg / L chloramphenicol or 20mg / L kanamycin).
- the test was performed on an agar medium.
- As a control strain a strain transformed with the empty vector pMW218 was also obtained.
- MG1655 / pACYC-E1 / pMW-panD Cg
- MG1655 / pACYC-E1 / pMW-panD Ec
- MG1655 / pACYC-E1 / pMW-218 obtained as described above Cysteine production culture was performed and the amount of cysteine produced was compared.
- MG1655 / pACYC-E1 / pMW-218 strain was used and 10 mg / L of calcium pantothenate was added to carry out cysteine production culture, and the effect of pantothenic acid addition on cysteine production was examined.
- the composition of the cysteine production medium used is as described above except that the glucose concentration is 40 g / L.
- the cells were cultured for 19 to 22 hours until glucose was completely consumed, and the amount of cysteine produced in the medium was quantified. Culture was performed in quadruplicate for each strain. Table 2 shows the mean value and standard deviation of cysteine production. As shown in Table 2, also in E. coli, it was revealed that the enhanced expression of various panD genes and the addition of pantothenic acid both increase the cysteine production amount.
- pantothenic acid addition concentration Since it became clear that cysteine production increases by adding pantothenic acid, we next examined the pantothenic acid concentration necessary to obtain the effect.
- P. ananatis SC17intE511-2 / pSTV29 strain was cultured in a cysteine production medium supplemented with calcium pantothenate at a concentration range of 10 mg to 100 mg / L, and the amount of cysteine produced was measured.
- the composition of the cysteine production medium used was as described above, and the glucose concentration was 60 g / L. Each concentration was cultured in quadruplicate for about 16-20 hours. The average value and standard deviation of cysteine production are shown in FIG. When calcium pantothenate was added in an amount of 1 mg / L or more, it was revealed that cysteine production increased depending on the pantothenic acid concentration.
- the obtained fragment is placed under the control of an appropriate promoter, for example, introduced into the SmaI site of pSTV28 (TaKaRa) and placed under the control of the lac promoter to produce an expression vector for the PanD gene.
- an appropriate promoter for example, introduced into the SmaI site of pSTV28 (TaKaRa) and placed under the control of the lac promoter to produce an expression vector for the PanD gene.
- L-cysteine-producing ability of bacteria can be improved, and L-cysteine or a related substance or a mixture thereof can be efficiently produced.
- SEQ ID NO: 1 Primer for amplifying panD gene of C. glutamicum 2256
- SEQ ID NO: 2 Primer for amplifying panD gene of C. glutamicum 2256
- SEQ ID NO: 3 Primer for amplifying panD gene of E. coli MG1655
- SEQ ID NO: 4 Primer for amplifying the panD gene of E. coli MG1655
- SEQ ID NO: 5 Primer for amplifying the panD gene of P. ananatis SC17
- 6 Primer for amplifying the panD gene of P. ananatis SC17 SEQ ID NO: 7: of the panD gene of E.
- SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of the PanD protein of E. coli MG1655
- SEQ ID NO: 9 Base sequence of the panD gene of P. ananatis SC17
- SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of the PanD protein of P. ananatis SC17 SEQ ID NO: 11: C.
- the nucleotide sequence of the panD gene of glutamicum 2256 SEQ ID NO: 12 The amino acid sequence of the PanD protein of C. glutamicum 2256 SEQ ID NO: 13: The nucleotide sequence of the panD gene of B. subtilis 168 SEQ ID NO: 14: B.
- subtilis 168 PanD protein of SEQ ID NO: 15 base sequence of panD gene of Arthrobacter aurescens
- SEQ ID NO: 16 amino acid sequence of PanD protein of Arthrobacter aurescens
- SEQ ID NO: 17 base sequence of panD gene of Bacteroides fragilis
- SEQ ID NO: 18 PanD of Bacteroides fragilis
- Amino acid sequence of the protein SEQ ID NO: 19 Base sequence of the panD gene of Bacteroides vulgatus SEQ ID NO: 20: Amino acid sequence of the PanD protein of Bacteroides vulgatus
- SEQ ID NO: 22 PanD protein of the PanD protein of Brevibacterium lactofermentum
- Amino acid sequence SEQ ID NO: 23 nucleotide sequence of the panD gene of Chlorobium tepidum
- SEQ ID NO: 24 amino acid sequence of the PanD protein of Chlorobi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
細菌のL-システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、L-システイン生産菌、及び同細菌を用いたL-システイン等の化合物の製造法を提供する。L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することによって、これらの化合物を製造する。
Description
本発明は、L-システイン又はその関連物質の製造法に関し、詳しくはL-システイン又はその関連物質の製造に好適な細菌、及びそれを用いたL-システイン又はその関連物質の製造法に関する。L-システイン及びその関連物質は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
従来、L-システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはDL-2-アミノチアゾリン-4-カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるL-システインの大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた発酵法によるL-システインの生産も試みられている。
L-システイン生産能を有する微生物としては、例えば、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌(特許文献1)が知られている。また、L-システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持させることにより、L-システイン生産能を高める技術が知られている(特許文献2~4)。
また、L-システイン分解系を抑制することによってL-システイン生産能が高められた微生物としては、シスタチオニン-β-リアーゼ(特許文献2)、トリプトファナーゼ(特許文献5)、O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼB(特許文献6)の活性を低下又は欠失させたコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌が知られている。
さらに、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝子は、システイン経路の代謝産物の排出に関与していることが知られている(非特許文献1)。また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるmar遺伝子座、emr遺伝子座、acr遺伝子座、cmr遺伝子座、mex遺伝子、bmr遺伝子、若しくはqacA遺伝子(特許文献7)、又はemrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、若しくはcusA遺伝子(特許文献8)の発現を上昇させることによりL-システイン生産能を高める技術が知られている。
また、L-システイン生産菌として、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ(特許文献9)が知られている。
さらに、セリンによるフィードバック阻害が低減された3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAが知られており、エシェリヒア・コリのL-システイン生産に利用することが示唆されている(特許文献10、11)。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.11)は、L-アスパラギン酸を脱炭酸しβ-アラニンを生成する反応を触媒する酵素である。L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼは、一般的に、不活性な前駆体タンパク質として翻訳され、その後、特定の部位でプロセッシングされ活性なタンパク質となることが知られている。L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼは、L-システイン酸により競合阻害を受けることが知られているが(非特許文献2)、L-システインにより阻害を受けるかは知られていない。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼの触媒反応により生成したβ-アラニンは、パントテン酸生合成の中間産物として用いられ、パントテン酸はコエンザイムA(CoA)に変換されて生体内で利用される。したがって、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼは、アセチルCoAの生合成の鍵酵素となり得る(非特許文献3)。しかしながら、L-システインの生産において、アセチルCoAの生合成が律速となり得るかは知られていない。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼをコードするpanD遺伝子の発現を増強することにより、パントテン酸の生産量が増大することが知られている(非特許文献4)。また、パントテン酸を含有する培地を用いてL-グルタミン酸を製造する方法が知られている(特許文献12)。
しかしながら、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼまたはパントテン酸と、L-システイン生産との関連は知られていない。
Dassler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)
Williamson JM. et al., J Biol Chem. 1979 Aug 25;254(16):8074-82.
Kennedy J. et al., Anal Biochem. 2004 Apr 1;327(1):91-6.
Dusch N. et al., Appl Environ Microbiol. 1999 Apr;65(4):1530-9.
本発明は、細菌のL-システイン生産能を向上させる新規な技術を開発し、L-システイン生産菌、及び同細菌を用いたL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼの活性が増大するように細菌を改変することによってL-システイン生産能を向上させることができることを見出した。本発明者は、さらに、L-システイン生産に用いる培地にパントテン酸を添加することによりL-システイン生産能を向上させることができることを見出した。以上に基づき、本発明は完成された。
すなわち本発明は以下のとおり例示できる。
[1]
L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
[2]
panD遺伝子の発現量を増大させることにより、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大した、前記細菌。
[3]
panD遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、panD遺伝子の発現量が増大した、前記細菌。
[4]
前記panD遺伝子が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質をコードするDNAである、前記細菌。
(A)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
[5]
前記panD遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、前記細菌。
(a)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[6]
前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、下記(1)および(2)の特徴を有する、前記細菌。
(1)24位のグリシンおよび25位のセリンが保存されている。
(2)9位のリジン、11位のヒスチジン、57位のスレオニン、および58位のチロシンが保存されている。
[7]
前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、さらに下記(3)の特徴を有する、前記細菌。
(3)15位のバリン、16位のスレオニン、20位のロイシン、22位のチロシン、29位のアスパラギン酸、42位のグルタミン酸、51位のアスパラギン、52位のグリシン、54位のアルギニン、60位のイソロイシン、72位のアスパラギン、73位のグリシン、74位のアラニン、75位のアラニン、76位のアラニン、83位のアスパラギン酸、および86位のイソロイシンが保存されている。
[8]
さらに、下記の性質(1)~(3)の1またはそれ以上を有する前記細菌。
(1)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
(2)L-システイン排出系が強化されている。
(3)3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
[9]
前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
[10]
前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
[11]
前記細菌がパントエア属細菌である、前記細菌。
[12]
前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記細菌。
[13]
前記細菌を培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[14]
前記培地がパントテン酸を含有する、前記方法。
[15]
L-システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[16]
前記培地におけるパントテン酸の含有量が1mg/L以上である、前記方法。
[17]
前記関連物質がL-シスチン、チアゾリジン誘導体、またはL-メチオニンである、前記方法。
[1]
L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
[2]
panD遺伝子の発現量を増大させることにより、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大した、前記細菌。
[3]
panD遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、panD遺伝子の発現量が増大した、前記細菌。
[4]
前記panD遺伝子が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質をコードするDNAである、前記細菌。
(A)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
[5]
前記panD遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、前記細菌。
(a)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[6]
前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、下記(1)および(2)の特徴を有する、前記細菌。
(1)24位のグリシンおよび25位のセリンが保存されている。
(2)9位のリジン、11位のヒスチジン、57位のスレオニン、および58位のチロシンが保存されている。
[7]
前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、さらに下記(3)の特徴を有する、前記細菌。
(3)15位のバリン、16位のスレオニン、20位のロイシン、22位のチロシン、29位のアスパラギン酸、42位のグルタミン酸、51位のアスパラギン、52位のグリシン、54位のアルギニン、60位のイソロイシン、72位のアスパラギン、73位のグリシン、74位のアラニン、75位のアラニン、76位のアラニン、83位のアスパラギン酸、および86位のイソロイシンが保存されている。
[8]
さらに、下記の性質(1)~(3)の1またはそれ以上を有する前記細菌。
(1)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
(2)L-システイン排出系が強化されている。
(3)3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
[9]
前記細菌がエシェリヒア属細菌である、前記細菌。
[10]
前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記細菌。
[11]
前記細菌がパントエア属細菌である、前記細菌。
[12]
前記細菌がパントエア・アナナティスである、前記細菌。
[13]
前記細菌を培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[14]
前記培地がパントテン酸を含有する、前記方法。
[15]
L-システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
[16]
前記培地におけるパントテン酸の含有量が1mg/L以上である、前記方法。
[17]
前記関連物質がL-シスチン、チアゾリジン誘導体、またはL-メチオニンである、前記方法。
<1>本発明の細菌
本発明の細菌は、L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼの活性が増大するように改変された、腸内細菌科に属する細菌である。
本発明の細菌は、L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼの活性が増大するように改変された、腸内細菌科に属する細菌である。
本発明において、L-システインとは、フリー体のL-システインもしくはその塩、又はそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
本発明において、L-システイン生産能とは、細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。L-システイン生産能を有する細菌とは、野生株または親株よりも多い量のL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地中または菌体内に蓄積することができる細菌を意味する。L-システイン生産能を有する細菌とは、好ましくは、0.05g/L以上、より好ましくは0.1g/L以上、特に好ましくは0.2g/L以上の量のL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を生産し培地に蓄積することができる細菌を意味する。
細菌が産生したL-システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がL-シスチンに変換されることがある。また、L-システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってS-スルホシステインが生成することがある(Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958))。さらに、細菌の細胞内で生成したL-システインは、細胞内に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある(特許第2992010号)。これらチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。
また、L-システインは、γ-グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、L-メチオニン、S-アデノシルメチオニン等の生合成の出発物質として用いられる。したがって、L-システイン生産能に加えて、これらL-システインを経由して生産される化合物を産生する能力を有する細菌を用いることによって、これらの化合物を製造することができる。
したがって、本発明において、L-システイン生産能とは、L-システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、L-システイン、L-シスチン、前記のようなL-システインの誘導体(例えばS-スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、ヘミチオケタール)、もしくは前記のようなL-システインを経由して生産される他の化合物(例えばγ-グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、L-メチオニン、S-アデノシルメチオニン)、又はこれらの混合物を培地中又は菌体内に蓄積する能力も含まれるものとする。なお、本発明において、L-シスチン、前記のようなL-システインの誘導体、及び前記のようなL-システインを経由して生産される他の化合物をまとめてL-システインの関連物質という。
L-システイン生産能を有する細菌としては、本来的にL-システイン生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、L-システイン生産能を有するように改変したものであってもよい。
本発明に用いる細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属など、腸内細菌科に属する細菌であって、L-システインを生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI(National Center for Biotechnology Information)データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌、又はクレブシエラ属細菌を用いることが望ましい。
エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に挙げられるものが利用できる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110株(ATCC 27325)、エシェリヒア・コリ MG1655株(ATCC 47076)等が挙げられる。
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)が挙げられる。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランス ATCC 12287株が挙げられる。また、具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)が挙げられる。
パントエア・アナナティスとしては、具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP-6614)、SC17株(FERM BP-11091)が挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでL-グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である(米国特許第6,596,517号)。パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所(現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。また、パントエア・アナナティスSC17株は、平成21年2月4日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター(住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。尚、パントエア・アナナティスAJ13355株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)、エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ(Klebsiella planticola)が挙げられる。
なお、特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ-プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である(J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067)。よって、エンテロバクター属に属する細菌には、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、パントエア・アグロメランス又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345)。例えば、エンテロバクター・アグロメランスには、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・スチューアルティに再分類されているものがある。また、エルビニア属に属する細菌には、パントエア・アナナス(Pantoea ananas)、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある(International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照)。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属、パントエア属、及びエルビニア属等のいずれに属するものであってもよい。
以下、腸内細菌科に属する細菌にL-システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のL-システイン生産能を増強する方法について述べる。
細菌にL-システイン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、L-システインの生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照)。ここで、L-システイン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、2種又はそれ以上であってもよい。また、発現が増強されるL-システイン生合成系酵素も、単独であってもよく、2種又はそれ以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
L-システイン生産能を有する栄養要求性変異株、L-システインのアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちX線や紫外線の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)もしくはエチルメタンスルフォネート(EMS)等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつL-システイン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
以下、腸内細菌科に属する細菌にL-システイン生産能を付与する方法、又はこれらの細菌のL-システイン生産能を増強する方法、及びL-システイン生産能を有する細菌について具体的に例示する。
L-システイン生産能の付与又は増強、及びL-システイン生産菌
細菌のL-システイン生産能は、L-システイン生合成経路の酵素、又はL-セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することにより向上させることができる。そのような酵素としては、例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT)や3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ(PGD)が挙げられる。酵素活性の増強は、後述するように、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することや、目的の酵素の非活性を増強することにより達成できる。セリンアセチルトランスフェラーゼは、L-システインによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。
細菌のL-システイン生産能は、L-システイン生合成経路の酵素、又はL-セリン等、同経路の基質となる化合物の生成に関与する酵素の活性を増強することにより向上させることができる。そのような酵素としては、例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT)や3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ(PGD)が挙げられる。酵素活性の増強は、後述するように、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することや、目的の酵素の非活性を増強することにより達成できる。セリンアセチルトランスフェラーゼは、L-システインによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。また、3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリンによるフィードバック阻害を受けるため、特に、このフィードバック阻害が低減又は解除された変異型3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に保持させることによって、同酵素活性を増強することができる。
エシェリヒア・コリに由来する、フィードバック阻害耐性の変異型SATとして具体的には、256位のメチオニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型SAT(特開平11-155571)、256位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型SAT(Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987))、97位のアミノ酸残基から273位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は227位のアミノ酸残基からC末端領域の欠失を有する変異型SAT(WO97/15673、米国特許第6218168号)、野生型SATの89~96位に相当するアミノ酸配列において1又は複数の変異を含み、かつ、L-システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型SAT(米国特許公開第20050112731(A1))、95位及び96位のVal残基及びAsp残基が、各々Arg残基及びPro残基に置換された変異型SAT(変異型遺伝子名cysE5、米国特許公開第20050112731(A1))、及び、167位のスレオニン残基がアラニン残基に置換された変異型SAT(米国特許第6218168号、米国特許公開第20050112731(A1))等が知られている。
SATをコードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリの遺伝子に限られず、SAT活性を有するタンパク質をコードするものであれば、使用することができる。例えば、L-システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムが知られており、これをコードする遺伝子を用いることもできる(FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459)。
また、セリンによるフィードバック阻害耐性の変異型PGDをコードする遺伝子としては、serA5遺伝子(米国特許第6,180,373号)が知られている。
また、細菌のL-システイン生産能は、L-システイン排出系を強化することによっても向上させることができる。L-システイン排出系は、L-システインの排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することにより強化することができる。L-システインの排出に関与するタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるYdeDタンパク質、yfiK遺伝子にコードされるYfiKタンパク質、yeaS遺伝子にコードされるYeaSタンパク質が挙げられる。よって、ydeD遺伝子(Dassler et al., Mol. Microbiol.36. 1101-1112 (2000))、yfiK遺伝子(特開2004-49237)、又はyeaS遺伝子(欧州特許出願公開第1016710号明細書)の発現を増強することにより、L-システイン生産能を高めることができる。また、YeaSタンパク質の28位のスレオニン残基、137位のフェニルアラニン残基、および/または188位のロイシン残基に変異を導入することによっても、L-システイン排出系が強化されL-システイン生産能を高めることができる(欧州特許出願公開第2218729号明細書)。具体的には、YeaSタンパク質の28位のスレオニン残基をアスパラギンに置換する変異、137位のフェニルアラニン残基をセリン、グルタミン、アラニン、ヒスチジン、システイン、及びグリシンのいずれかに置換する変異、および/または188位のロイシン残基をグルタミンに置換する変異が好ましい(欧州特許出願公開第2218729号明細書)。
また、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質の中には、L-システインの排出に関与するものがある。よって、それらをコードする遺伝子の発現を増強することによりL-システイン排出系を強化することができる。例えば、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子であるmar遺伝子座、emr遺伝子座、acr遺伝子座、cmr遺伝子座、mex遺伝子、bmr遺伝子、若しくはqacA遺伝子(米国特許第5972663号)、又はemrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、若しくはcusA遺伝子(特開2005-287333号公報)の発現を上昇させることにより、L-システイン生産能を高めることができる。
また、硫酸塩/チオ硫酸塩輸送系を増強することによっても、L-システイン生産能を向上させることができる。硫酸塩/チオ硫酸塩輸送系タンパク質群は、cysPTWAM遺伝子クラスターによってコードされている(特開2005-137369号公報、EP1528108号明細書)。
また、細菌のL-システイン生産能は、L-システインの分解に寄与するシステインデスルフヒドラーゼの活性を低下させることにより向上させることができる。エシェリヒア・コリでは、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質として、metC遺伝子にコードされるシスタチオニン-β-リアーゼ(特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069))、tnaA遺伝子にコードされるトリプトファナーゼ(特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218)、cysM遺伝子にコードされるO-アセチルセリン スルフヒドリラーゼB(特開2005-245311)、及び、malY遺伝子にコードされるMalY(特開2005-245311)が知られている。酵素活性の低下は、後述する手法により達成できる。
L-システイン生産菌は、下記の性質(1)~(3)の1またはそれ以上を有するのが好ましい。
(1)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
(2)L-システイン排出系が強化されている。
(3)3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
(1)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
(2)L-システイン排出系が強化されている。
(3)3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。
L-システイン生産菌としては、具体的には、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT)をコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM15株(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性を示す物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するエシェリヒア・コリ W3110株(米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ(特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリ W3110株(WO01/27307)などのエシェリヒア属に属する株、ydeD遺伝子、変異型cysE遺伝子および変異型serA5遺伝子を保持するプラスミドpACYC-DES(特開2005-137369(US20050124049(A1)、EP1528108(A1)))を有するエシェリヒア・コリ等が挙げられるが、これらに限定されない。pACYC-DESは、前記3遺伝子をpACYC184に挿入することによって得られたプラスミドであり、各遺伝子はPompAプロモーターにより制御される。
L-システインを出発物質として生合成されるγ-グルタミルシステイン、グルタチオン、シスタチオニン、ホモシステイン、L-メチオニン、及びS-アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。
例えば、γ-グルタミルシステイン生産能は、γ-グルタミルシステイン合成酵素活性の増強及び/又はグルタチオン合成酵素活性の低下によって、増強することができる。また、グルタチオン生産能はγ-グルタミルシステイン合成酵素活性及び/又はグルタチオン合成酵素活性の増強によって、付与又は増強することができる。また、グルタチオンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型γ-グルタミルシステイン合成酵素を用いることでもγ-グルタミルシステインやグルタチオンの生産能を増強させることができる。グルタチオンの生産についてはLiらの総説(Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 233-242)に詳しく記載されている。
L-メチオニン生産能は、L-スレオニン要求性またはノルロイシン耐性を付与することによって、付与又は増強することができる(特開2000-139471号)。E. coliにおいては、L-スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン(thrABC)として存在し、例えば、thrBC部分を欠失させることによってL-ホモセリン以降の生合成能を失ったL-スレオニン要求株を取得することができる。ノルロイシン耐性株では、S-アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化され、L-メチオニン生産能が付与又は増強される。E. coliにおいては、S-アデノシルメチオニンシンセターゼはmetK遺伝子にコードされている。また、L-メチオニン生産能は、メチオニンリプレッサーの欠損、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテース、及びアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼIIなどのL-メチオニン生合成に関与する酵素の活性の増強によっても、付与又は増強することができる(特開2000-139471号)。E. coliにおいては、メチオニンリプレッサーはmetJ遺伝子に、ホモセリントランスサクシニラーゼはmetA遺伝子に、シスタチオニンγ-シンテースはmetB遺伝子に、アスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼIIはmetL遺伝子にそれぞれコードされている。また、L-メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを用いることでもL-メチオニンの生産能を付与又は増強することができる(特開2000-139471号、US20090029424)。なお、L-メチオニンはL-システインを中間体として生合成されるため、L-システインの生産能の向上によりL-メチオニンの生産能も向上させることができる(特開2000-139471号、US20080311632)。よって、L-メチオニン生産能を付与又は増強するためには、L-システイン生産能を付与又は増強させることも有効である。
L-メチオニン生産菌としては、具体的には、AJ11539 (NRRL B-12399)、AJ11540 (NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、L-メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有する218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)等のE. coli株が挙げられる。
また、L-メチオニン生産菌としては、E. coli W3110由来のAJ13425 (FERM P-16808)(特開2000-139471号)を用いることもできる。AJ13425は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のS-アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ-シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強されたL-スレオニン要求株である。AJ13425は、平成10年5月14日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託され、受託番号FERM P-16808が付与されている。
シスタチオニン、ホモシステインはL-メチオニン生合成経路の中間体であるため、これら物質の生産能を増強するためには、上記のL-メチオニンの生産能を増強させる方法を一部利用することが有効である。シスタチオニン生産能を増強させる具体的方法として、メチオニン要求性変異株を用いる方法(特願2003-010654)や、発酵培地にシステイン(またはその生合成原料)及び/又はホモセリン(またはその生合成原料)を添加する方法(特開2005-168422)が知られている。ホモシステインはシスタチオニンを前駆体とするため、ホモシステイン生産能を増強するためには、シスタチオニン生産能を増強させる上記方法も有効である。
また、L-メチオニンを出発物質として生合成されるS-アデノシルメチオニン等の化合物の生産能も、目的の化合物の生合成系路の酵素活性を増強するか、その生合成系路から分岐する経路の酵素又は目的化合物を分解する酵素の活性を低下させることによって、付与又は増強することができる。例えば、S-アデノシルメチオニン生産能は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を強化することや(EP0647712、EP1457569)、mdfA遺伝子にコードされる排出因子MdfAを強化すること(US7410789)で付与又は増強することができる。
以下、システインデスルフヒドラーゼ等の酵素活性を低下させる手法について記載する。本発明において、「酵素の活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。酵素活性は、例えば非改変株と比較して75%以下、50%以下、25%以下、又は10%以下に低下していることが好ましく、活性が完全に消失しているのが特に好ましい。なお、酵素によっては、活性を完全に消失させないのが好ましい場合もある。
酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやSD配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは1塩基以上、より好ましくは2塩基以上、特に好ましくは3塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、アンチセンスRNAを発現させることによっても達成できる。
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、N末端領域、内部領域、C末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換(ミスセンス変異)を導入すること、終始コドンを導入すること(ナンセンス変異)、あるいは1~2塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997) Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991))。
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性等のマーカー遺伝子やL-システイン生産に有用な遺伝子が挙げられる。
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えDNAには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000))、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))とを組み合わせた方法(WO2005/010175号参照)等の直鎖状DNAを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある(米国特許第6303383号、特開平05-007491号)。
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、紫外線照射、または、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、メチルメタンスルフォネート(MMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。
酵素活性が低下したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。システインデスルフヒドラーゼ活性は、特開2002-233384公報に記載された手法により測定することができる。
標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。
標的タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性の増大
本発明の細菌は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、上述したようなL-システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変を行った後に、L-システイン生産能を付与又は増強してもよい。
本発明の細菌は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、上述したようなL-システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変を行った後に、L-システイン生産能を付与又は増強してもよい。
本発明において、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性とは、L-アスパラギン酸を脱炭酸しβ-アラニンを生成する反応を触媒する活性をいう。また、本発明において、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼという。L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大することで、β-アラニンを中間代謝産物して生合成されるパントテン酸の生産量が増大すると予想される。
「L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大する」とは、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、非改変株と比較して好ましくは150%以上、より好ましくは200%以上、さらに好ましくは300%以上に向上している。また、「L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大する」とは、もともとL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有する菌株においてL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増大させることだけでなく、もともとL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が存在しない菌株にL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を付与することを含む。また、結果としてL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大する限り、細菌が本来有するL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼを弱化および/または欠損させた上で、好適なL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼを導入してもよい。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変は、例えば、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現を増強させることによって達成される。
遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
遺伝子のコピー数の増加は、染色体に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列(repetitive DNA)や、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピート等が挙げられるが、これらに限定されない。また、染色体上に存在するL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。このような遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはインテグレーションベクターを用いて達成することが出来る。また、米国特許第5,595,889号に開示されるように、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。トランスポゾンとしては、例えば、Mu、Tn10、Tn5が利用できる。染色体に遺伝子が導入されたことは、遺伝子の一部をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認できる。
また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、目的遺伝子を含むDNA断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して目的遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、目的遺伝子のコピー数を増加させることができる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、pBR322、pSTV29(いずれもタカラバイオ社より入手可)、pMW219(ニッポンジーン社)、pTrc99A(ファルマシア社)、pPROK系ベクター(クロンテック社)、pKK233‐2(クロンテック社製)、pET系ベクター(ノバジェン社)、pQE系ベクター(キアゲン社)、広宿主域ベクターRSF1010等が挙げられる。
また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、およびPLプロモーター等を用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
また、遺伝子の発現の増強は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のSD配列(リボソーム結合部位(RBS)ともいう)をより強力なSD配列に置換することにより達成できる。「より強力なSD配列」とは、mRNAの翻訳が、もともと存在している野生型のSD配列よりも向上するSD配列を意味する。より強力なSD配列としては、例えば、ファージT7由来の遺伝子10のRBSが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
本発明においては、プロモーター、SD配列、およびRBSと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)により行うことができる。
また、遺伝子の発現の増強は、目的の遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、目的の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。レギュレーターとしては、例えばLysRファミリーなどに属するものが挙げられ、データベースEcoCyc(http://ecocyc.org/)等を利用して見出すことができる。目的の遺伝子の転写量の増大や目的のタンパク質の量の増大を指標として、レギュレーターの改変を行えばよい。
上記のような遺伝子の発現を増強させる手法は、単独で用いてもよく、任意に組み合わせて用いてもよい。
また、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変は、例えば、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼの非活性を増強することによっても達成できる。非活性が増強されたL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼは、例えば、種々の細菌を探索し取得することができる。また、在来のL-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼに変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。非活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12株について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977))を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978))も応用できる。
目的の酵素活性が増大したことは、同酵素活性を測定することにより確認できる。L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性は、非特許文献4(Dusch N. et al., Appl Environ Microbiol. 1999 Apr;65(4):1530-9.)に記載された手法により測定することができる。
目的の遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。
目的のタンパク質の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001))。
なお、上記のような遺伝子の発現や酵素の非活性を増強する手法は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼやそれをコードする遺伝子に限られず、SAT等の任意の酵素やそれらをコードする遺伝子等についても同様に適用できる。
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼは、通常、panD遺伝子によりコードされる。panD遺伝子がコードするタンパク質をPanDタンパク質ともいう。エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のpanD遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、146314~146694位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のpanD遺伝子は、ECK0130、JW0127と同義である。また、エシェリヒア・コリ K12 MG1655株のPanDタンパク質は、GenBank accession NP_414673(version NP_414673.1 GI:16128124、locus_tag=“b0131”)として登録されている。前記MG1655株のpanD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号7及び8に示す。また、パントエア・アナナティスSC17株のpanD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号9及び10に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株のpanD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号11及び12に示す。バチラス・サブチリス168株のpanD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号13及び14に示す。
細菌が属する属、種、又は菌株によって、panD遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増大させるような改変を受けるpanD遺伝子は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号7、9、11、または13に示す塩基配列のバリアントであってもよい。panD遺伝子のバリアントは、例えば配列番号7、9、11、または13の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、panD遺伝子のバリアントは、同遺伝子のホモログを含む。同遺伝子のホモログとしては、例えば腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、例えば配列番号7、9、11、または13の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子が挙げられる。
また、上記以外の細菌のpanD遺伝子ホモログの例として、以下の細菌のpanD遺伝子が挙げられる。カッコ内は、エシェリヒア・コリK12株のPanDタンパク質(配列番号8)と、各細菌のpanD遺伝子ホモログがコードするPanDタンパク質との、BLASTによる同一性(%)を示す。これらの遺伝子の塩基配列及びそれらがコードするアミノ酸配列を、配列番号15~60に示す。なお、panD遺伝子は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、これらホモログのバリアントであってもよい。
Arthrobacter aurescens ATCC BAA-1386(54)
Bacteroides fragilis ATCC 25285(44)
Bacteroides vulgatus ATCC 8482(48)
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869(43)
Chlorobium tepidum ATCC 49652(47)
Citrobacter koseri ATCC BAA-895(96)
Clavibacter michiganensis NCPPB 382(51)
Corynebacterium jeikeium NCTC 11915(48)
Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406(44)
Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894(90)
Flavobacterium johnsoniae ATCC 17061(45)
Flavobacterium psychrophilum ATCC 49511(44)
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH78578 ATCC 700721(89)
Methylophilus methylotrophus ATCC 53528(53)
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19851(50)
Parabacteroides distasonis ATCC 8503(48)
Porphyromonas gingivalis ATCC 53978(45)
Rhodococcus sp(49)
Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635(51)
Salinibacter ruber ATCC BAA-605(44)
Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62 ATCC BAA-731(96)
Streptomyces coelicolor ATCC 10147(51)
Thermobifida fusca ATCC 27730(49)
Arthrobacter aurescens ATCC BAA-1386(54)
Bacteroides fragilis ATCC 25285(44)
Bacteroides vulgatus ATCC 8482(48)
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869(43)
Chlorobium tepidum ATCC 49652(47)
Citrobacter koseri ATCC BAA-895(96)
Clavibacter michiganensis NCPPB 382(51)
Corynebacterium jeikeium NCTC 11915(48)
Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406(44)
Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894(90)
Flavobacterium johnsoniae ATCC 17061(45)
Flavobacterium psychrophilum ATCC 49511(44)
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH78578 ATCC 700721(89)
Methylophilus methylotrophus ATCC 53528(53)
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19851(50)
Parabacteroides distasonis ATCC 8503(48)
Porphyromonas gingivalis ATCC 53978(45)
Rhodococcus sp(49)
Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635(51)
Salinibacter ruber ATCC BAA-605(44)
Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62 ATCC BAA-731(96)
Streptomyces coelicolor ATCC 10147(51)
Thermobifida fusca ATCC 27730(49)
panD遺伝子は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、上記のようなPanDタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1~20個、より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個を意味する。上記の1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記のようなPanDタンパク質のアミノ酸配列全体、例えば配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」(homology)は、「同一性」(identity)を指すことがある。
また、panD遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、より好ましくは2~3回洗浄する条件が挙げられる。
プローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、セリンアセチルトランスフェラーゼ、3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ等の酵素、およびYdeDタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子にも同様に適用される。
各細菌由来PanDタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図1に示す。これまでに報告されているように、PanDタンパク質には共通して保存されている領域が存在する(Armando Albert et al., (1998) Nature structural biology volume 5 number 4:289-293)。したがって、PanDタンパク質においては、それらの保存領域が保存されているのが好ましい。
具体的には、PanDタンパク質において、24位のグリシンおよび25位のセリンが保存されているのが好ましい。PanDタンパク質はαサブユニットとβサブユニットに分割されるが、24位のグリシンおよび25位のセリンはその分割場所である。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント(図1)において、どの種のPanDタンパク質においても共通して保存されていた。
また、9位のリジン、11位のヒスチジン、57位のスレオニン、および58位のチロシンが保存されているのが好ましい。これらのアミノ酸残基は立体構造からポケットと推測され、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性に寄与すると考えられる。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント(図1)において、どの種のPanDタンパク質においても共通して保存されていた。
また、15位のバリン、16位のスレオニン、20位のロイシン、22位のチロシン、29位のアスパラギン酸、42位のグルタミン酸、51位のアスパラギン、52位のグリシン、54位のアルギニン、60位のイソロイシン、72位のアスパラギン、73位のグリシン、74位のアラニン、75位のアラニン、76位のアラニン、83位のアスパラギン酸、および86位のイソロイシンから選択される1またはそれ以上の残基が保存されているのが好ましく、これら全ての残基が保存されているのがより好ましい。これらのアミノ酸残基は、前記アラインメント(図1)において、ほぼ共通して保存されていた。
なお、上記各アミノ酸残基は、配列番号8における各位置に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記各アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「25位のセリン残基」とは、配列番号8における25位に相当するセリン残基を意味し、25位よりもN末端側の1アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から24番目(開始コドンによってコードされるメチニオン残基を含む)のセリン残基が「25位のセリン残基」であるものとする。また、25位よりもN末端側に1アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から26番目のセリン残基が「25位のセリン残基」であるものとする。また、例えば、PanDタンパク質において「25位のセリン残基が保存されている」とは、当該PanDタンパク質において配列番号8における25位に相当するアミノ酸残基がセリンであることを意味する。その他のアミノ酸残基についても同様である。
<2>本発明のL-システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からL-システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。L-システインの関連物質としては、先述したS-スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に対応するヘミチオケタール、L-メチオニン、S-アデノシルメチオニン等が挙げられる。
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からL-システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。L-システインの関連物質としては、先述したS-スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に対応するヘミチオケタール、L-メチオニン、S-アデノシルメチオニン等が挙げられる。
使用する培地としては、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化物等の無機硫黄化合物が挙げられる。
有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で30~90時間実施するのがよく、培養温度は25℃~37℃に、培養中pHは5~8に制御することが好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
培養物からのL-システイン、もしくはその関連物質、又はこれらの混合物の採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
上記のようにして得られるL-システインは、L-システイン誘導体の製造に用いることができる。L-システイン誘導体としては、メチルシステイン、エチルシステイン、カルボシステイン、スルホシステイン、アセチルシステイン等が挙げられる。
また、L-システインのチアゾリジン誘導体が培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリジン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とL-システインとの間の反応平衡をL-システイン側に移動させることによって、L-システインを製造することができる。また、培地にS-スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスレイトール等の還元剤を用いて還元することによってL-システインに変換することができる。
また、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するようL-システイン生産菌を改変することに代えて、パントテン酸を培地に添加することによってもL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を製造することができる。すなわち、本発明の方法のさらなる態様(以下、本発明の第2の方法ともいう)は、L-システイン生産能を有する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法、である。
なお、本発明の第2の方法に用いるL-システイン生産能を有する細菌は、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するよう改変されていてもよく、そうでなくともよい。すなわち、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するようL-システイン生産菌を改変することと、パントテン酸を培地に添加することとを組み合わせてもよい。
培地におけるパントテン酸の含有量は、1mg/L以上であるのが好ましく、2mg/L以上であるのがより好ましく、5mg/L以上であるのがさらに好ましく、10mg/L以上であるのが特に好ましい。パントテン酸の含有量の上限は特に制限されないが、例えば、10g/L以下であってもよく、1g/L以下であってもよい。パントテン酸は、フリー体であってもよく、パントテン酸塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。パントテン酸塩としては、特に制限されず、カルシウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
パントテン酸は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、本発明の方法が、L-システイン生産菌を増殖させる段階と、L-システインを生産蓄積させる段階を含む場合、少なくともL-システインを生産蓄積させる段階においてパントテン酸を培地に含有させればよく、L-システイン生産菌を増殖させる段階においては、パントテン酸を培地に含有させてもよく、含有させなくてもよい。また、L-システインを生産蓄積させる段階においても、パントテン酸は、その全期間において培地に含有されていてもよく、その一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、パントテン酸の含有量は、L-システインを生産蓄積させる段階の全期間において前記の範囲である必要はなく、同段階の初期に含有量が前記の範囲となるようにパントテン酸を培地に含有させ、培養時間の経過に伴いパントテン酸含有量が減少してもよい。また、パントテン酸を連続的あるいは間欠的に追加添加してもよい。
本発明の第2の方法においては、パントテン酸を含有する培地を用いる限り、上述した本発明の細菌を用いる方法と同様の培地成分および同様の培養条件を用いることができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例において、システインはL-システインを意味する。
<実施例>
(1)C.glutamicum 2256株、E.coli MG1655株、P.ananatis SC17株、B.subtilis 168株由来panD遺伝子を搭載したプラスミドの構築
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増強するため、各種panD遺伝子を搭載したpanD遺伝子の発現用プラスミドを以下の手順で構築した。
(1)C.glutamicum 2256株、E.coli MG1655株、P.ananatis SC17株、B.subtilis 168株由来panD遺伝子を搭載したプラスミドの構築
L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を増強するため、各種panD遺伝子を搭載したpanD遺伝子の発現用プラスミドを以下の手順で構築した。
C.glutamicum 2256株(ATCC13869)のゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーpanD(Cg)-FW(CCAAGCTTATGGCATTCCAATAGTCAGG:配列番号1)およびpanD(Cg)-RV(CGAAGCTTGGGAAAAAGACGGCTCTACC:配列番号2)を用いたPCRにより、panD遺伝子の上流約300bpから下流約200bpまでを含む約900bpのpanD(Cg)遺伝子断片を増幅した。上記プライマーは、5'末端に制限酵素HindIIIのサイトを有するようデザインされている。PCRは、Pyrobestポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いてプロトコールに記載の標準的な組成で行い、反応条件は94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を30サイクルとした。得られた断片をHindIIIで処理し、pSTV29(Takara社)のHindIIIサイトに挿入してサブクローニングを行い、シークエンスが正しいことを確認した。そこから再度HindIIIにて切り出した断片を、同酵素で消化したpMW218(Takara社)にベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、C.glutamicum 2256株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpMW218-panD(Cg)(カナマイシン耐性マーカー)を取得した。
同様に、E.coli MG1655株(ATCC47076)のゲノムDNAをテンプレートとして、プライマーpanD(Ec)-FW(ATGATTCGCACGATGCTGCAGG:配列番号3)およびpanD(Ec)-RV(TCAAGCAACCTGTACCGGAATCG:配列番号4)を用いたPCRにより、panD(Ec)遺伝子断片を取得した。PCRは、上記と同一の条件で行った。pMW218をSmaI消化した後、得られた断片をベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、E.coli MG1655株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpMW218-panD(Ec)(カナマイシン耐性マーカー)を取得した。クローニングされたpanD遺伝子は、ベクター上のlacプロモーターのリードスルーにて発現する。
同様に、P.ananatis SC17株(FERM BP-11091)のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーpanD(Pa)-FW(GTAAAGGCTGCAGGTCGTATTTTTGGCTGT:配列番号5)およびpanD(Pa)-RW(GTTCTATATCGCGGTCTACTTCCTGATTCA:配列番号6)を用いたPCRにより、panD(Pa)遺伝子断片を取得した。PCRは、Pyrobestポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いてプロトコールに記載の標準的な組成で行い、反応条件は94℃-1分の後、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分を30サイクルとした。pSTV29をsmaI消化した後、得られた断片をベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入し、P.ananatis SC17株のpanD遺伝子がクローニングされたプラスミドpSTV29-panD(Pa)(クロラムフェニコール耐性マーカー)を取得した。クローニングされたpanD遺伝子は、ベクター上のlacプロモーターのリードスルーにて発現する。
プラスミドpCR-panD(Bs)は、B.subtilis 168株(ATCC23857)のpanD遺伝子を含む領域が搭載されたプラスミドである。pCR-panD(Bs)は、pMW218ベクター(Nippon Gene社)のBamHIサイトにB.subtilis 168株のゲノムの2350947bp~2353681bpの領域(ゲノムデータベースSubtiListによる;http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)が両端のSau3AIで挿入された構造を有する。PCR等の定法によりB.subtilis 168株のpanD遺伝子およびその周辺領域を容易に取得でき、本実験の目的に合致するpCR-panD(Bs)と同様の構造のプラスミドを構築できる。
(2)P.ananatisシステイン生産菌SC17intE511-2の構築
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatis SC17株の染色体に阻害解除型SATをコードする遺伝子を挿入し、システイン生産能を有するSC17intE511-2株を以下の手順で構築した。
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatis SC17株の染色体に阻害解除型SATをコードする遺伝子を挿入し、システイン生産能を有するSC17intE511-2株を以下の手順で構築した。
プラスミドpMIV-CysE5(特開2009-232844)には、L-システインによるフィードバック阻害が解除された変異型SATであるCysE5(US20050112731(A1))をコードする遺伝子(cysE5)およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むCysE5カセットが搭載されている。プラスミドpACYC184からEco88I-XbaIで切り出したテトラサイクリン耐性遺伝子を平滑末端化し、同じく平滑末端化した前記pMIV-CysE5のPvuIサイトに挿入し、pMT-CysE5を構築した。得られたpMT-CysE5を利用し、ヘルパーとしてpMH10を用いる定法に従ったmini-Muファージシステム(EP1149911(A))により、CysE5カセットをP.ananatis野生株であるSC17株の染色体に導入した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール耐性をマーカーとして行った。CysE5カセットが染色体に導入された形質転換体を約50個ピックアップし、システインの生産培養を行ったところ、大部分のクローンが0.2~0.3 g/Lのシステインを生産した。その中で、1クローンがシステインを約0.7 g/L生産し、このクローンをSC17intE511と名づけた。SC17intE511のゲノムDNAを抽出し、得られたゲノムDNAをエレクトロポレーションにてSC17に導入し、CysE5カセットが染色体に導入された株を改めて作製した。形質転換体の選択は、クロラムフェニコール耐性をマーカーとして行った。約20個の形質転換体をピックアップし、システインの生産培養を行ったところ、ほぼすべてのクローンが0.2~0.3 g/Lのシステインを生産した。このうちいくつかのクローンのSAT活性を定法(US20050112731(A))により測定し、親株であるSC17intE511と同程度のSAT活性を有するクローンを選択してSC17intE511-2と名づけた。
(3)P.ananatisシステイン生産菌における各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加のシステイン生産への効果
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatisシステイン生産菌SC17intE511-2を上記のように構築されたプラスミドpMW218-panD(Cg)、pSTV28-panD(Pa)、pCR-panD(Bs)で形質転換した。P.ananatisの形質転換は定法に従ってエレクトロポレーションにより行い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン)を含むLB寒天培地(5g/L イーストエクストラクト、10g/L トリプトン、10g/L 塩化ナトリウム、15g/L アガー)にて行った。また対照株として、それぞれ空ベクターを形質転換したものも取得した。
各種panD遺伝子の発現強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、P.ananatisシステイン生産菌SC17intE511-2を上記のように構築されたプラスミドpMW218-panD(Cg)、pSTV28-panD(Pa)、pCR-panD(Bs)で形質転換した。P.ananatisの形質転換は定法に従ってエレクトロポレーションにより行い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン)を含むLB寒天培地(5g/L イーストエクストラクト、10g/L トリプトン、10g/L 塩化ナトリウム、15g/L アガー)にて行った。また対照株として、それぞれ空ベクターを形質転換したものも取得した。
以上のようにして得られたSC17intE511-2/ pMW218-panD(Cg)株、SC17intE511-2/ pMW218株、SC17intE511-2/ pSTV28-panD(Pa)株、SC17intE511-2/ pSTV29株、SC17intE511-2/ pCR-panD(Bs)株、SC17intE511-2/ pCR株を用いてシステイン生産培養を行い、生産されるシステインの量を比較した。また、SC17intE511-2/ pSTV29株を用い、パントテン酸カルシウムを20mg/L添加してシステイン生産培養を行い、パントテン酸添加がシステイン生産に及ぼす効果を調べた。培養には、下記組成のシステイン生産培地にプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン)を添加して用いた。
システイン生産培地組成
硫酸アンモニウム 15 g/L
リン酸二水素カリウム 1.5 g/L
硫酸マグネシウム七水和物 1 g/L
チアミン塩酸塩 0.1 mg/L
硫酸第一鉄七水和物 1.7 mg/L
モリブデン酸ナトリウム二水和物 0.15 mg/L
塩化コバルト六水和物 0.7 mg/L
塩化マンガン四水和物 1.6 mg/L
硫酸亜鉛七水和物 0.3 mg/L
硫酸銅五水和物 0.25 mg/L
トリプトン 0.6 g/L
イーストエクストラクト 0.3 g/L
塩化ナトリウム 0.6 g/L
炭酸カルシウム 20 g/L
L-ヒスチジン塩酸塩一水和物 135 mg/L
チオ硫酸ナトリウム 4 g/L
ピリドキシン塩酸塩 2 mg/L
グルコース 60 g/L
システイン生産培地組成
硫酸アンモニウム 15 g/L
リン酸二水素カリウム 1.5 g/L
硫酸マグネシウム七水和物 1 g/L
チアミン塩酸塩 0.1 mg/L
硫酸第一鉄七水和物 1.7 mg/L
モリブデン酸ナトリウム二水和物 0.15 mg/L
塩化コバルト六水和物 0.7 mg/L
塩化マンガン四水和物 1.6 mg/L
硫酸亜鉛七水和物 0.3 mg/L
硫酸銅五水和物 0.25 mg/L
トリプトン 0.6 g/L
イーストエクストラクト 0.3 g/L
塩化ナトリウム 0.6 g/L
炭酸カルシウム 20 g/L
L-ヒスチジン塩酸塩一水和物 135 mg/L
チオ硫酸ナトリウム 4 g/L
ピリドキシン塩酸塩 2 mg/L
グルコース 60 g/L
システイン生産培養は以下の手順で行った。システイン生産菌各株をクロラムフェニコールまたはカナマイシンを含有するLB寒天培地に塗り広げ、34℃で一晩前培養を行った。10マイクロリッターサイズの植菌用ループ(NUNC社ブルーループ)でプレート上約7cm分の菌体を掻き取り、大試験管(内径23mm、長さ20cm)に入れた2mlのシステイン生産培地中に植菌し、培養開始時点での菌体量がほぼ同じになるよう調製した。32℃にて振とう培養を行い、グルコースが完全に消費された時点で培養を終了(約13~16時間)し、培地中に生産されたシステイン量を定量した。培養は、各株とも4連で行った。システインの定量はGaitonde, M.K.(Biochem J. 1967 Aug;104(2):627-33)に記載の方法で行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を表1に示す。表1に示したとおり、各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加はいずれもシステイン生産量を増加させることが明らかとなった。
(4)阻害解除型SAT遺伝子搭載プラスミドpACYC-E1の構築
システイン生産菌を構築するために用いる、阻害解除型SATをコードする遺伝子を搭載するプラスミドpACYC-E1を以下の手順で構築した。
システイン生産菌を構築するために用いる、阻害解除型SATをコードする遺伝子を搭載するプラスミドpACYC-E1を以下の手順で構築した。
プラスミドpACYC-DE1には、L-システインによるフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードするcysEX遺伝子(US5972663A)、並びに、システインおよびアセチルセリンの排出因子をコードするydeD遺伝子が搭載されており、これを導入することでシステインを著量生産するシステイン生産菌を作製できる。pACYC-DE1は、EP1528108B1に記載されているpACYC-DESの構築方法と概ね同じ方法により構築することができる。pACYC-DESとの違いは、pACYC-DE1では、serA5遺伝子が搭載されておらず、cysEX遺伝子とydeD遺伝子の2遺伝子のみがpACYC184ベクターに搭載されている点である。pACYC-DE1において、cysEX遺伝子とydeD遺伝子はいずれもompAプロモーターに連結されている。このpACYC-DE1をMnuIで切断してセルフライゲーションさせ、ydeDの内側約330bpを欠損させた。こうして構築した、cysEX遺伝子を搭載し、ydeD遺伝子の機能が消失したプラスミドをpACYC-E1とし、以下の実験に使用した。
(5)E.coliシステイン生産菌における各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加のシステイン生産への効果
panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加の効果がP.ananatis以外の細菌においても得られるかどうか、E.coliシステイン生産菌を用いて検討した。
panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加の効果がP.ananatis以外の細菌においても得られるかどうか、E.coliシステイン生産菌を用いて検討した。
E.coliシステイン生産菌としては、E.coli MG1655株に前記pACYC-E1(テトラサイクリン耐性マーカー)をエレクトロポレーション法により導入して得られた形質転換体MG1655/ pACYC-E1を用いた。
このE.coliシステイン生産菌MG1655/ pACYC-E1を、pMW218-panD(Cg)、pMW218-panD(Ec)で形質転換した。E.coliの形質転換は定法に従ってエレクトロポレーションにより行い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(25mg/L クロラムフェニコール、または20mg/L カナマイシン)を含むLB寒天培地にて行った。また対照株として、空ベクターpMW218を形質転換した株も取得した。
以上のようにして得られた、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-panD(Cg)株、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-panD(Ec)株、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-218株を用いてシステイン生産培養を行い、生産されるシステインの量を比較した。また、MG1655/ pACYC-E1/ pMW-218株を用い、パントテン酸カルシウムを10mg/L添加してシステイン生産培養を行い、パントテン酸添加がシステイン生産に及ぼす効果を調べた。用いたシステイン生産培地の組成は、グルコース濃度を40g/Lとしたこと以外は上記の通りである。上記と同様の方法で、グルコースが完全に消費されるまで19~22時間培養し、培地中に生産されたシステイン量を定量した。培養は、各株とも4連で行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を表2に示す。表2に示したとおり、E.coliにおいても、各種panD遺伝子の発現強化およびパントテン酸添加はいずれもシステイン生産量を増加させることが明らかとなった。
(6)パントテン酸添加濃度の検討
パントテン酸を添加することによりシステイン生産が増加することが今回明らかとなったため、次に、効果が得られるために必要なパントテン酸濃度の検討を行った。
パントテン酸を添加することによりシステイン生産が増加することが今回明らかとなったため、次に、効果が得られるために必要なパントテン酸濃度の検討を行った。
P.ananatis SC17intE511-2/ pSTV29株を、10mg~100mg/Lの濃度域でパントテン酸カルシウムを添加したシステイン生産培地にて培養し、システイン生産量を測定した。用いたシステイン生産培地の組成は上記の通りであり、グルコース濃度は60g/Lとした。各濃度とも4連で、約16~20時間培養を行った。システイン生産量の平均値と標準偏差を図2に示す。パントテン酸カルシウムを1mg/L以上添加した場合に、パントテン酸濃度依存的にシステイン生産量が増加することが明らかとなった。
(7)各種panD遺伝子の発現強化株によるシステイン生産
各種PanDタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、例えば配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列のうち先頭20 bpをフォワード(Fw)プライマーに、末端20 bpの相補配列をリバース(Rv)プライマーに設定し、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を30サイクルからなるPCRにより各種PanD断片を増幅する。得られた断片を適当なプロモーター制御下に配置する、例えばpSTV28(TaKaRa社)のSmaIサイトへ導入してlacプロモーター制御下に配置することで、PanD遺伝子の発現ベクターを作製する。得られたPanD遺伝子の発現ベクターをシステイン生産菌、例えばP.ananatis SC17intE511-2へエレクトロポレーション法にて導入し、上記の方法にてシステイン生産培養を行うことで、効率的にシステインを生産できる。
各種PanDタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、例えば配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列のうち先頭20 bpをフォワード(Fw)プライマーに、末端20 bpの相補配列をリバース(Rv)プライマーに設定し、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を30サイクルからなるPCRにより各種PanD断片を増幅する。得られた断片を適当なプロモーター制御下に配置する、例えばpSTV28(TaKaRa社)のSmaIサイトへ導入してlacプロモーター制御下に配置することで、PanD遺伝子の発現ベクターを作製する。得られたPanD遺伝子の発現ベクターをシステイン生産菌、例えばP.ananatis SC17intE511-2へエレクトロポレーション法にて導入し、上記の方法にてシステイン生産培養を行うことで、効率的にシステインを生産できる。
本発明により、細菌のL-システイン生産能を向上させることができ、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を効率よく製造することができる。
配列表の説明
配列番号1:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号2:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号3:E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号4:E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号5:P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号6:P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号7:E. coli MG1655のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号8:E. coli MG1655のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:P. ananatis SC17のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号10:P. ananatis SC17のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号12:C. glutamicum 2256のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:B. subtilis 168のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号14:B. subtilis 168のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15:Arthrobacter aurescensのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号16:Arthrobacter aurescensのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:Bacteroides fragilisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号18:Bacteroides fragilisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Bacteroides vulgatusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号20:Bacteroides vulgatusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Brevibacterium lactofermentumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Brevibacterium lactofermentumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Chlorobium tepidumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号24:Chlorobium tepidumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号25:Citrobacter koseriのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号26:Citrobacter koseriのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Clavibacter michiganensisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号28:Clavibacter michiganensisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium jeikeiumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号30:Corynebacterium jeikeiumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Cytophaga hutchinsoniiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号32:Cytophaga hutchinsoniiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Enterobacter sakazakiiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号34:Enterobacter sakazakiiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Flavobacterium johnsoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号36:Flavobacterium johnsoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Flavobacterium psychrophilumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Flavobacterium psychrophilumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Klebsiella pneumoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号40:Klebsiella pneumoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Methylophilus methylotrophusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号42:Methylophilus methylotrophusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Mycobacterium aviumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号44:Mycobacterium aviumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Parabacteroides distasonisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号46:Parabacteroides distasonisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Porphyromonas gingivalisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号48:Porphyromonas gingivalisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Rhodococcus属細菌のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号50:Rhodococcus属細菌のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51:Saccharopolyspora erythraeaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号52:Saccharopolyspora erythraeaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号53:Salinibacter ruberのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号54:Salinibacter ruberのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号55:Salmonella entericaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号56:Salmonella entericaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号57:Streptomyces coelicolorのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号58:Streptomyces coelicolorのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号59:Thermobifida fuscaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号60:Thermobifida fuscaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号1:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号2:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号3:E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号4:E. coli MG1655のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号5:P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号6:P. ananatis SC17のpanD遺伝子増幅用プライマー
配列番号7:E. coli MG1655のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号8:E. coli MG1655のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:P. ananatis SC17のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号10:P. ananatis SC17のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11:C. glutamicum 2256のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号12:C. glutamicum 2256のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:B. subtilis 168のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号14:B. subtilis 168のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15:Arthrobacter aurescensのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号16:Arthrobacter aurescensのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:Bacteroides fragilisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号18:Bacteroides fragilisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Bacteroides vulgatusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号20:Bacteroides vulgatusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Brevibacterium lactofermentumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Brevibacterium lactofermentumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Chlorobium tepidumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号24:Chlorobium tepidumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号25:Citrobacter koseriのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号26:Citrobacter koseriのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Clavibacter michiganensisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号28:Clavibacter michiganensisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium jeikeiumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号30:Corynebacterium jeikeiumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Cytophaga hutchinsoniiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号32:Cytophaga hutchinsoniiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Enterobacter sakazakiiのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号34:Enterobacter sakazakiiのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Flavobacterium johnsoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号36:Flavobacterium johnsoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Flavobacterium psychrophilumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Flavobacterium psychrophilumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Klebsiella pneumoniaeのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号40:Klebsiella pneumoniaeのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Methylophilus methylotrophusのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号42:Methylophilus methylotrophusのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Mycobacterium aviumのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号44:Mycobacterium aviumのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Parabacteroides distasonisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号46:Parabacteroides distasonisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Porphyromonas gingivalisのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号48:Porphyromonas gingivalisのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Rhodococcus属細菌のpanD遺伝子の塩基配列
配列番号50:Rhodococcus属細菌のPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51:Saccharopolyspora erythraeaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号52:Saccharopolyspora erythraeaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号53:Salinibacter ruberのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号54:Salinibacter ruberのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号55:Salmonella entericaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号56:Salmonella entericaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号57:Streptomyces coelicolorのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号58:Streptomyces coelicolorのPanDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号59:Thermobifida fuscaのpanD遺伝子の塩基配列
配列番号60:Thermobifida fuscaのPanDタンパク質のアミノ酸配列
Claims (17)
- L-システイン生産能を有し、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
- panD遺伝子の発現量を増大させることにより、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性が増大した、請求項1に記載の細菌。
- panD遺伝子のコピー数を高めること、又は、同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、panD遺伝子の発現量が増大した、請求項2に記載の細菌。
- 前記panD遺伝子が、下記(A)または(B)に記載のタンパク質をコードするDNAである、請求項2または3に記載の細菌。
(A)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、または60に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記panD遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、請求項2~4のいずれか1項に記載の細菌。
(a)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59に示す塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、下記(1)および(2)の特徴を有する、請求項4または5に記載の細菌。
(1)24位のグリシンおよび25位のセリンが保存されている。
(2)9位のリジン、11位のヒスチジン、57位のスレオニン、および58位のチロシンが保存されている。 - 前記L-アスパルテート-α-デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質が、さらに下記(3)の特徴を有する、請求項6に記載の細菌。
(3)15位のバリン、16位のスレオニン、20位のロイシン、22位のチロシン、29位のアスパラギン酸、42位のグルタミン酸、51位のアスパラギン、52位のグリシン、54位のアルギニン、60位のイソロイシン、72位のアスパラギン、73位のグリシン、74位のアラニン、75位のアラニン、76位のアラニン、83位のアスパラギン酸、および86位のイソロイシンが保存されている。 - さらに、下記の性質(1)~(3)の1またはそれ以上を有する請求項1~7のいずれか1項に記載の細菌。
(1)セリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇するように改変されている。
(2)L-システイン排出系が強化されている。
(3)3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変されている。 - 前記細菌がエシェリヒア属細菌である、請求項1~8のいずれか1項に記載の細菌。
- 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項9に記載の細菌。
- 前記細菌がパントエア属細菌である、請求項1~8のいずれか1項に記載の細菌。
- 前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項11記載の細菌。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
- 前記培地がパントテン酸を含有する、請求項13に記載の方法。
- L-システイン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、パントテン酸を含有する培地中で培養し、該培地からL-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L-システインもしくはその関連物質、又はこれらの混合物の製造法。
- 前記培地におけるパントテン酸の含有量が1mg/L以上である、請求項14または15に記載の方法。
- 前記関連物質がL-シスチン、チアゾリジン誘導体、またはL-メチオニンである、請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12749381.5A EP2679680A4 (en) | 2011-02-22 | 2012-01-19 | L-CYSTEINE PRODUCING BACTERIUM AND PROCESS FOR PRODUCING L-CYSTEINE |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011035289A JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2011-02-22 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2011-035289 | 2011-02-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2012114802A1 true WO2012114802A1 (ja) | 2012-08-30 |
Family
ID=46720591
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2012/051084 WO2012114802A1 (ja) | 2011-02-22 | 2012-01-19 | L-システイン生産菌及びl-システインの製造法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2679680A4 (ja) |
JP (1) | JP2014087259A (ja) |
WO (1) | WO2012114802A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109913398A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-21 | 浙江工业大学 | 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108728470B (zh) * | 2017-04-14 | 2022-01-11 | 中国科学院微生物研究所 | 产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用 |
Citations (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2075055A (en) | 1980-04-14 | 1981-11-11 | Ajinomoto Kk | L-methionone-producing Microorganisms |
JPH057491A (ja) | 1990-10-15 | 1993-01-19 | Ajinomoto Co Inc | 温度感受性プラスミド |
EP0647712A1 (en) | 1993-10-07 | 1995-04-12 | Boehringer Ingelheim Espana S.A. | Production of S-adenosyl-methionine (SAM) by fermentation of transformed bacteria |
US5595889A (en) | 1988-02-22 | 1997-01-21 | Eurolysine | Process for integration of a chosen gene on the chromosome of a bacterium using Mu transposons |
WO1997015673A1 (de) | 1995-10-26 | 1997-05-01 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur herstellung von o-acetylserin, l-cystein und l-cystein-verwandten produkten |
US5856148A (en) | 1991-12-12 | 1999-01-05 | Wacker Chemie Gmbh | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products |
JPH11155571A (ja) | 1997-11-25 | 1999-06-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システインの製造法 |
US5972663A (en) | 1997-06-19 | 1999-10-26 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Microorganisms and processes for the fermentative preparation of L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or thiazolidine derivatives |
EP0952221A2 (en) | 1998-03-18 | 1999-10-27 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
WO2000018935A1 (fr) | 1998-09-25 | 2000-04-06 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de construction d'une bacterie produisant des acides amines, et procede de production d'acides amines par une technique de fermentation utilisant ladite bacterie |
JP2000139471A (ja) | 1998-11-17 | 2000-05-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−メチオニンの製造法 |
JP2000166578A (ja) * | 1998-12-01 | 2000-06-20 | Degussa Huels Ag | D―パントテン酸の製造方法及びE.coli属の微生物 |
EP1016710A2 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids |
US6180373B1 (en) | 1992-09-28 | 2001-01-30 | Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH | Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof |
WO2001027307A1 (de) | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten |
US6303383B1 (en) | 1999-03-16 | 2001-10-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Temperature sensitive plasmid for coryneform bacteria |
EP1149911A2 (en) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Ajinomoto Co., Ltd. | Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid |
JP2002233384A (ja) | 2001-02-09 | 2002-08-20 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2003010654A (ja) | 2001-04-24 | 2003-01-14 | Kuraray Co Ltd | 中空糸膜の製造方法 |
JP2003169668A (ja) | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
US6596517B2 (en) | 2001-02-20 | 2003-07-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-glutamic acid |
RU2209248C2 (ru) | 2001-06-26 | 2003-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-метионина, штамм бактерии escherichia coli вкпм в-8125 - продуцент l-метионина |
RU2215782C2 (ru) | 2001-02-26 | 2003-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) |
JP2004049237A (ja) | 2002-07-19 | 2004-02-19 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 |
EP1457569A1 (de) | 2003-03-06 | 2004-09-15 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosylmethionin |
WO2004111258A1 (ja) | 2003-06-10 | 2004-12-23 | Ajinomoto Co., Inc. | L−グルタミン酸の製造法 |
US20050009162A1 (en) | 2003-07-10 | 2005-01-13 | Thomas Maier | 3-phosphoglycerate dehydrogenase variants whose inhibition by L-serine is reduced, and genes encoding them |
WO2005010175A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity |
EP1528108A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-cysteine using bacteria belonging to the genus Escherichia |
US20050112731A1 (en) | 2003-07-16 | 2005-05-26 | Tatsuki Kashiwagi | Mutant serine acetyltransferase |
JP2005168422A (ja) | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Kazumi Araki | 発酵法によるl−シスタチオニンの製造法 |
JP2005245311A (ja) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2005287333A (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
US7410789B2 (en) | 2005-03-03 | 2008-08-12 | Wacker Chemie Ag | Process for the fermentative production of S-adenosylmethionine |
US20080311632A1 (en) | 2006-01-04 | 2008-12-18 | Rainer Figge | Methods for Producing Methionine by Culturing a Microorganism Modified to Enhance Production of Cysteine |
US20090029424A1 (en) | 2004-05-12 | 2009-01-29 | Metabolic Explorer | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity |
JP2009232844A (ja) | 2008-03-06 | 2009-10-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
EP2218729A1 (en) | 2009-02-16 | 2010-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-amino acid-producing bacterium and a method for producing an L-amino acid |
JP2010200645A (ja) * | 2009-03-02 | 2010-09-16 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009165355A (ja) * | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸を生産する微生物及びl−アミノ酸の製造法 |
JP5476545B2 (ja) * | 2008-02-21 | 2014-04-23 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
-
2011
- 2011-02-22 JP JP2011035289A patent/JP2014087259A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-01-19 EP EP12749381.5A patent/EP2679680A4/en not_active Withdrawn
- 2012-01-19 WO PCT/JP2012/051084 patent/WO2012114802A1/ja active Application Filing
Patent Citations (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2075055A (en) | 1980-04-14 | 1981-11-11 | Ajinomoto Kk | L-methionone-producing Microorganisms |
US5595889A (en) | 1988-02-22 | 1997-01-21 | Eurolysine | Process for integration of a chosen gene on the chromosome of a bacterium using Mu transposons |
JPH057491A (ja) | 1990-10-15 | 1993-01-19 | Ajinomoto Co Inc | 温度感受性プラスミド |
US5856148A (en) | 1991-12-12 | 1999-01-05 | Wacker Chemie Gmbh | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products |
US6180373B1 (en) | 1992-09-28 | 2001-01-30 | Consortium f{umlaut over (u)}r elektrochemische Industrie GmbH | Microorganisms for the production of tryptophan and process for the preparation thereof |
EP0647712A1 (en) | 1993-10-07 | 1995-04-12 | Boehringer Ingelheim Espana S.A. | Production of S-adenosyl-methionine (SAM) by fermentation of transformed bacteria |
US6218168B1 (en) | 1995-10-26 | 2001-04-17 | CONSORTIUM FüR ELEKTROCHEMISCHE INUDSTRIE GMBH | Process for preparing O-acetylserine, L-cysteine and L-cysteine-related products |
WO1997015673A1 (de) | 1995-10-26 | 1997-05-01 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur herstellung von o-acetylserin, l-cystein und l-cystein-verwandten produkten |
JP2992010B2 (ja) | 1997-06-19 | 1999-12-20 | コンゾルテイウム フユール エレクトロケミツシエ インヅストリー ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング | 微生物株、遺伝子、プラスミド、及びl−システイン、l−シスチン、n−アセチルセリン又はチアゾリジン誘導体の製法ならびに流出遺伝子の使用 |
US5972663A (en) | 1997-06-19 | 1999-10-26 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Microorganisms and processes for the fermentative preparation of L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or thiazolidine derivatives |
JPH11155571A (ja) | 1997-11-25 | 1999-06-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システインの製造法 |
EP0952221A2 (en) | 1998-03-18 | 1999-10-27 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
WO2000018935A1 (fr) | 1998-09-25 | 2000-04-06 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de construction d'une bacterie produisant des acides amines, et procede de production d'acides amines par une technique de fermentation utilisant ladite bacterie |
JP2000139471A (ja) | 1998-11-17 | 2000-05-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−メチオニンの製造法 |
JP2000166578A (ja) * | 1998-12-01 | 2000-06-20 | Degussa Huels Ag | D―パントテン酸の製造方法及びE.coli属の微生物 |
EP1016710A2 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids |
US6303383B1 (en) | 1999-03-16 | 2001-10-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Temperature sensitive plasmid for coryneform bacteria |
WO2001027307A1 (de) | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten |
EP1149911A2 (en) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Ajinomoto Co., Ltd. | Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid |
JP2002233384A (ja) | 2001-02-09 | 2002-08-20 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
US6596517B2 (en) | 2001-02-20 | 2003-07-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-glutamic acid |
RU2215782C2 (ru) | 2001-02-26 | 2003-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) |
JP2003010654A (ja) | 2001-04-24 | 2003-01-14 | Kuraray Co Ltd | 中空糸膜の製造方法 |
RU2209248C2 (ru) | 2001-06-26 | 2003-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-метионина, штамм бактерии escherichia coli вкпм в-8125 - продуцент l-метионина |
JP2003169668A (ja) | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2004049237A (ja) | 2002-07-19 | 2004-02-19 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 |
EP1457569A1 (de) | 2003-03-06 | 2004-09-15 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosylmethionin |
WO2004111258A1 (ja) | 2003-06-10 | 2004-12-23 | Ajinomoto Co., Inc. | L−グルタミン酸の製造法 |
US20050009162A1 (en) | 2003-07-10 | 2005-01-13 | Thomas Maier | 3-phosphoglycerate dehydrogenase variants whose inhibition by L-serine is reduced, and genes encoding them |
US20050112731A1 (en) | 2003-07-16 | 2005-05-26 | Tatsuki Kashiwagi | Mutant serine acetyltransferase |
WO2005010175A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity |
EP1528108B1 (en) | 2003-11-03 | 2007-08-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-cysteine using bacteria belonging to the genus Escherichia |
JP2005137369A (ja) | 2003-11-03 | 2005-06-02 | Ajinomoto Co Inc | エシェリヒア属細菌を用いたl−システインの製造法 |
US20050124049A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-06-09 | Ziyatdinov Mikhail K. | Method for producing L-cysteine using bacteria belonging to the genus Escherichia |
EP1528108A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-cysteine using bacteria belonging to the genus Escherichia |
JP2005168422A (ja) | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Kazumi Araki | 発酵法によるl−シスタチオニンの製造法 |
JP2005245311A (ja) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP2005287333A (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
US20090029424A1 (en) | 2004-05-12 | 2009-01-29 | Metabolic Explorer | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity |
US7410789B2 (en) | 2005-03-03 | 2008-08-12 | Wacker Chemie Ag | Process for the fermentative production of S-adenosylmethionine |
US20080311632A1 (en) | 2006-01-04 | 2008-12-18 | Rainer Figge | Methods for Producing Methionine by Culturing a Microorganism Modified to Enhance Production of Cysteine |
JP2009232844A (ja) | 2008-03-06 | 2009-10-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
EP2218729A1 (en) | 2009-02-16 | 2010-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-amino acid-producing bacterium and a method for producing an L-amino acid |
JP2010200645A (ja) * | 2009-03-02 | 2010-09-16 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
Non-Patent Citations (33)
Title |
---|
"Amino Acid Fermentation", 30 May 1986, GAKKAI SHUPPAN CENTER (LTD., pages: 77 - 100 |
"Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology", AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY PRESS |
"Molecular Cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS |
ARMANDO ALBERT ET AL., NATURE STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 5, no. 4, 1998, pages 289 - 293 |
AUSTIN NEWTON ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 240, 1965, pages 1211 - 1218 |
BACKMANN B.J., DERIVATIONS AND GENOTYPES OF SOME MUTANT DERIVATIVES OF ESCHERICHIA COLI K-12, 1996, pages 2460 - 2488 |
BIBB, M.J.; WARD, J.M.; HOPWOOD, O.A., NATURE, vol. 274, 1978, pages 398 |
CHANDRA ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 21, 1982, pages 3064 - 3069 |
CHANG, S.; CHOEN, S.N., MOLEC. GEN. GENET., vol. 168, 1979, pages 111 |
CHO, E.H.; GUMPORT, R.I.; GARDNER, J.F., J. BACTERIOL., vol. 184, 2002, pages 5200 - 5203 |
DASSLER ET AL., MOL. MICROBIOL., vol. 36, 2000, pages 1101 - 1112 |
DATSENKO, K.A.; WANNER, B.L., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 6640 - 6645 |
DENK, D.; BOECK, A., J. GENERAL MICROBIOL., vol. 133, 1987, pages 515 - 525 |
DUNCAN, C.H.; WILSON, G.A.; YOUNG, F.E., GENE, vol. 1, 1977, pages 153 |
DUSCH N. ET AL., APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 65, no. 4, April 1999 (1999-04-01), pages 1530 - 9 |
FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 179, 1999, pages 453 - 459 |
GAITONDE, M.K., BIOCHEM. J., vol. 4, no. 2, 10 August 1967 (1967-08-10), pages 627 - 33 |
GOLDSTEIN ET AL.: "Prokaryotic Promoters in Biotechnology", BIOTECHNOL. ANNU. REV., vol. 1, 1995, pages 105 - 128 |
HINNEN, A.; HICKS, J.B.; FINK, G.R., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929 |
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, October 1997 (1997-10-01), pages 1061 - 1067 |
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 39, no. 3, July 1989 (1989-07-01), pages 337 - 345 |
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 43, no. 1, January 1993 (1993-01-01), pages 162 - 173 |
J. GEN. APPL. MICROBIOL., vol. 43, 1997, pages 355 - 361 |
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 266, 1991, pages 20833 - 20839 |
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 272, 1997, pages 8611 - 8617 |
KENNEDY J. ET AL., ANAL. BIOCHEM., vol. 327, no. 1, 1 April 2004 (2004-04-01), pages 91 - 6 |
MANDEL, M.; HIGA, A., J. MOL. BIOL., vol. 53, 1970, pages 159 - 162 |
OLINS P.O. ET AL., GENE, vol. 73, 1988, pages 227 - 235 |
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 95, 1998, pages 5511 - 5515 |
See also references of EP2679680A4 * |
SZCZEPKOWSKI T.W., NATURE, vol. 182, 1958 |
WILLIAMSON JM. ET AL., J. BIOL.CHEM., vol. 254, no. 16, 25 August 1979 (1979-08-25), pages 8074 - 82 |
YIN LI; GONGYUAN WEI; JIAN CHEN, APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 66, 2004, pages 233 - 242 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109913398A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-21 | 浙江工业大学 | 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用 |
CN109913398B (zh) * | 2019-03-14 | 2020-07-31 | 浙江工业大学 | 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014087259A (ja) | 2014-05-15 |
EP2679680A4 (en) | 2014-05-07 |
EP2679680A1 (en) | 2014-01-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2695940B1 (en) | Method for producing l-cysteine | |
JP5396922B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5332237B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5476545B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5880434B2 (ja) | 腸内細菌科の細菌を使用する、l−システイン、l−シスチン、その誘導体若しくは前駆体、又はその混合物の製造方法 | |
JP5463528B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
US20100233765A1 (en) | L-cysteine-producing bacterium and a method for producing l-cysteine | |
US9234223B2 (en) | Method for producing L-cysteine | |
JP5817529B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5803927B2 (ja) | 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法 | |
WO2012114802A1 (ja) | L-システイン生産菌及びl-システインの製造法 | |
JP7444164B2 (ja) | 細菌を用いたl-メチオニンの製造方法 | |
JP2017143756A (ja) | L−システインの製造法 | |
WO2012144472A1 (ja) | L-システインの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 12749381 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2012749381 Country of ref document: EP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: JP |