JP5396922B2 - L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 - Google Patents
L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5396922B2 JP5396922B2 JP2009053178A JP2009053178A JP5396922B2 JP 5396922 B2 JP5396922 B2 JP 5396922B2 JP 2009053178 A JP2009053178 A JP 2009053178A JP 2009053178 A JP2009053178 A JP 2009053178A JP 5396922 B2 JP5396922 B2 JP 5396922B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cysteine
- gene
- seq
- strain
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CCCC(C)C(CC1)CC1C(C(C1)CC1C1CCCCC1)*(CC)=C Chemical compound CCCC(C)C(CC1)CC1C(C(C1)CC1C1CCCCC1)*(CC)=C 0.000 description 2
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
すなわち本発明は以下のとおりである。
(1)L−システイン生産能を有し、かつ、下記タンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
(2)前記タンパク質をコードする遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下した、前記細菌。
(3)前記遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、前記細菌。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(4)さらに、L−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する前記細菌。
(5)パントエア属に属する細菌である、前記細菌。
(6)パントエア・アナナティスである、前記細菌。
(7)前記細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
(8)前記L−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、前記方法。
(9)下記タンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
(10)下記(a)または(b)に記載のDNAである、前記DNA。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
また、本発明により、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子が提供される。
本発明の細菌は、L−システイン生産能を有し、かつ、d0191遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。d0191遺伝子については後述する。
微生物が産生したL−システインは、培地中で、ジスルフィド結合によって一部がL−シスチンに変換することがある。また、後述するように、L−システインと培地に含まれるチオ硫酸との反応によってS−スルホシステインが生成することがある(Szczepkowski
T.W., Nature, vol.182 (1958))。さらに、細菌の細胞内で生成したL−システインは、細胞中に存在するケトン又はアルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、ヘミチオケタールを中間体としてチアゾリジン誘導体が生成することがある(特許第2992010参照)。これらのチアゾリジン誘導体及びヘミチオケタールは、平衡混合物として存在することがある。したがって、L−システイン生産能とは、L−システインのみを培地中又は菌体内に蓄積する能力に限られず、L−システインに加えて、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、例えばS−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、もしくはヘミチオケタール、又はこれらの混合物を培地中に蓄積する能力も含まれる。
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 (ATCC 27325)、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)又はパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
パントエア・アナナティスとして具体的には、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17株、及びSC17(0)株が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでL−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株AJ13355(FERM BP-6614)から、粘液質低生産変異株として選択された株である(米国特許第6,596,517号)。SC17(0)株は、パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株として構築された株である(参考例1参照)。
JM15(米国特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号公報)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入すれば、L−システイン生産能が付与される。細菌への変異型SAT遺伝子の導入は、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
in Enzymology 68, 326 (1979))あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))、エレクトロポーレーションによる方法等、細菌の形質転換に通常用いられている方法を用いることができる。
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)subsp. pneumoniae MGH 78578(accession: gi|152968982|ref|YP_001334091.1|)
エンテロバクター(Enterobacter)sp. 638(accession: gi|146310575|ref|YP_001175649.1|)
サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)LT2(accession: gi|16763839|ref|NP_459454.1|)
セラチア・プロテオアマキュランス(Serratia proteamaculans)568(accession: gi|157369348|ref|YP_001477337.1|)
エルビニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)subsp. atroseptica SCRI1043(accession: gi|50120095|ref|YP_049262.1|)
ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)O1 biovar eltor str. N16961(accession: gi|15641074|ref|NP_230706.1|)
シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)PfO-1(accession: gi|77457462|ref|YP_346967.1|)
ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)A3(2)(accession: g
i|21219544|ref|NP_625323.1|)
マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)104(accession: gi| 118467280|ref| YP_879726.1|)
Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991))。アンチセンスRNAを発現させることでも達成できる。
1、43、45、47、49、もしくは51の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、d0191遺伝子のバリアントは、例えば腸内細菌科に属する細菌等の染色体を鋳型にして、例えば配列番号1、又は配列番号33、35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは51の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%
SDSに相当する塩濃度、温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそられの誘導体、又はこれらの混合物を採取することにより、これらの化合物を製造することができる。L−システインの誘導体としては、前記したようなS−スルホシステイン、チアゾリジン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当するヘミチオケタール等が挙げられる。
また、培地にS−スルホシステインが蓄積した場合、例えばジチオスライトール等の還元剤を用いて還元することによってL−システインに変換することができる。
パントエア・アナナティスにおいて遺伝子破壊を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645 (2000))を高効率で行うための受容菌を構築した。
M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998))、3)自己調節因子PlacUV5-lacI、及びエシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ非依存性転写ターミネーター(TrrnB)は、λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする(Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004))からである。さらに、RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(sacB)を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図2に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むDNA断片を、それぞれ配列番号6、7、8、9のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載(Skorokhodova, A.Yu et
al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004))と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の2つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の4つの断片を連結することによって得た。
から、プライマーP1(配列番号53)及びP2(配列番号54)を用いたPCR増幅により得たattL(配列番号55)を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性(ApR)の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6(配列番号59及び60)を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8(配列番号61及び62)を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al. 2001. Biotekhnologiya (in Russian) no.5,
3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10(配列番号64及び65)を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理した。
(1)P. ananatis SC17株からのd0191遺伝子のクローニング
P. ananatis SC17株(米国特許第6,596,517号)のゲノミックDNAをテンプレートとして、プライマーd0191(Pa)-FW(CGCGGATCCAAGCTTTTCATTATCCAGCAGAGCG:配列番号16)、d0191(Pa)-RV(CGCGGATCCTAATGCTGTAGGGCCTGAACCAG:配列番号17)を用いたPCRによって、d0191遺伝子の上流約300bpから下流約200bpまでを含むd0191遺伝子断片を取得した。これらのプライマーの5’末端には制限酵素BamHIのサイトがデザインされている。PCRにはPyrobestポリメラーゼ(Takara社)を用い、プロトコールに記載の標準的な反応組成で、94℃-5分の後、98℃ 5秒、55℃ 5秒、72℃ 1分30秒からなるサイクルを30サイクル繰り返すことによって目的の約1.6KBの断片を増幅した。得られた断片をBamHIで処理し、pSTV29(Takara社)のBamHIサイトに挿入し(ベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入)、d0191がクローニングされたプラスミドpSTV-d0191F(クロラムフェニコール耐性マーカー)を取得した。また、同じPCR断片をpACYC177(NipponGene社)のBamHIサイトに挿入し(ベ
クター上のカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きに挿入)、pACYC-d0191F(カナマイシン耐性マーカー)を作製した。シークエンシングによりPCRによるエラーがないことを確認した。こうして、同じd0191領域がクローニングされた、2種類の別の抗生物質耐性マーカーをもつプラスミド(いずれも同じp15A originを持つ)が準備された。また、ハイコピーベクターpHSG299(Takara社)のBamHIサイトに同じ約1.6KB DNA断片が挿入されたpHSG-d0191Fを作製した(カナマイシン耐性マーカー、ベクター上のlacZ遺伝子と同じ向きに挿入)。
上記のように構築されたプラスミドpSTV-d0191FでP. ananatis SC17を形質転換し、d0191強化株SC17/pSTV-d0191F株を作製した。対照株として空のベクターを導入したSC17/pSTV29株も同時に作製した。また、ハイコピーのpHSG-d0191FをP. ananatis SC17に形質転換したd0191強化株SC17/pHSG-d0191F株を作製した。対照株として空のベクターを導入したSC17/ pHSG299株も同時に作製した。P. ananatisの形質転換はエレクトロポーレーションによる定法に従い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(クロラムフェニコールの場合25mg/L、カナマイシンの場合20mg/L)を含むLB寒天培地(5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride, 15g/L agar)にて行った。
上記のように構築されたプラスミドpSTV-d0191FでE. coli MG1655を形質転換し、d0191強化株MG1655/pSTV-d0191F株を作製した。また対照株として空のベクターを導入したMG1655/pSTV29株も同時に作製した。E. coliの形質転換はエレクトロポーレーションによる定法に従い、形質転換体のセレクションはプラスミドの抗生物質耐性マーカーに対応した抗生物質(クロラムフェニコールの場合25mg/L、カナマイシンの場合20mg/L)を含むLB寒天培地(5g/L yeast extract, 10g/L Tryptone, 10g/L sodium chloride, 15g/L agar)にて行った。
d0191遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側に、それぞれデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。
カナマイシン耐性株は、前記DNA断片の両端に存在するd0191遺伝子領域の相同配列により、カナマイシン耐性カセットが染色体上のd0191遺伝子に挿入された、d0191遺伝子破壊株であることが確認された(SC17(0) d0191::Kmr株;図3)。
プラスミドpMIV-CysE5にはフィードバック阻害が解除された変異型SATをコードする遺伝子cysE5(米国特許公開第20050112731(A1))が搭載されており、これを導入することでシステインを著量生産するシステイン生産菌を作製できることが知られている(米国特許公開第20050112731A1、米国特許第5972663など)。以下にpMIV-CysE5の構築方法を示す。
coli cysE遺伝子の終止コドン及びその上流の配列に結合するようにデザインされ、5'末端には6merのXbaI サイトを有している。PCRによって得られた約0.7kbのDNA断片をSalIとXbaIで切断した後、同じくSalIとXbaIで切断したプラスミドpMIV-PompCに挿入し、pMIV-CysE5を構築した。
上記のように構築されたd0191遺伝子を含むプラスミドpACYC-d0191F(カナマイシン耐性)をSC17株に導入し(SC17/pACYC-d0191F)、更に阻害解除型SAT遺伝子搭載プラスミドpMIV-CysE5(クロラムフェニコール耐性)を導入して、システイン生産能を有し、d0191が強化されたP. ananatis菌株を構築した(SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株)。また、対照株としてpACYC-d0191Fのかわりに空のベクターpACYC177を導入したSC17/pMIV-CysE5/pACYC177株を作製した。
上記のように構築されたd0191欠損株SC17 d0191::Kmr株を、プラスミドpMIV-CysE5で形質転換し、d0191を欠損したシステイン生産菌SC17 d0191::Kmr/ pMIV-CysE5株を作製した。一方、対照株としてSC17株にpMIV-CysE5を導入したSC17/ pMIV-CysE5株を作製した。
d0191遺伝子のシステイン耐性への影響を調べるため、d0191欠損株SC17 d0191::Kmr株と、d0191増幅株SC17/pSTV-d0191F株、及びそれぞれの対照株SC17株、SC17/pSTV29株を、異なる濃度のシステインを含むM9最少培地(Sambrook et al., Molecular cloning, 3rd edition, 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)で培養し、その生育の立ち上がりの早さから判断してシステイン耐性の違いを評価した。この培養ではシステインへの耐性が高いほど培地のODの立ち上がりが早く、耐性が低いほど長いラグの後に立ち上がる。実験の手順は以下の通りである。各株を0.4%グルコースを含むM9最少培地(システインを含
まない)にて一晩前培養した後(3ml試験管、34℃、振とう培養)、本培養培地に接種した。その際、前培養のODを測定、本培養の開始時の各株の菌量がそろうように接種量を調整した。本培養開始時のODは約0.007であった。
d0191遺伝子のシステイン耐性への影響を調べるため、d0191の増幅株MG1655/pSTV-d0191F株、及びその対照株MG1655/pSTV29株を、異なる濃度のシステインを含むM9最少培地で培養し、その生育の立ち上がりの早さから判断してシステイン耐性の違いを評価した。基本的な培養の方法は(8)に記載の方法に従った。ただし、本培養開始時のODが約0.006であった点、培養温度が37℃であった点、各システイン濃度が0mM、0.1mM、0.2mMであった点は、(8)とは異なる。培養経過(生育曲線)を図9に示す。システインの濃度が上がるにつれ、ODの立ち上がりが遅くなる傾向が認められたが、d0191強化株MG1655/ pSTV-d0191F株は対照のMG1655/ pSTV29株よりも早く生育し、システイン耐性が付与されていることがわかった。以上の結果から、宿主がP. ananatisであるかE. coliであるかによらず、d0191を強化した場合にシステイン耐性が強化されることがわかった。
システイン耐性に対する表現型から、d0191産物がシステイン分解に関与している可能性が考えられた。そこで、d0191遺伝子産物がシステイン分解活性として知られるシステインデスルフヒドラーゼ活性(以下「CD活性」と省略)を有しているかを検討するため、d0191欠損株と強化株、及びそれぞれの対照株を培養し、それぞれの細胞抽出液中のタンパク質をnative PAGEにより分離後、活性染色によってCD活性を検出した。一連のnative PAGE、活性染色の方法は、N. Awanoら(Effect of cysteine desulfhydrase gene disruption on L-cysteine overproduction in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Aug;62(2-3):239-43)に従った。
DTT(dithiothreitol)、0.01mM PLP(pyridoxal-5'-phosphate))で洗浄後に、1mlの洗浄バッファーに懸濁し、超音波によって破砕、遠心分離で上清(細胞抽出液)を得た。なお、培養は全て34℃で行い、プラスミドを保持している菌株に対しては20mg/Lカナマイシンを添加した。こうして調製された細胞抽出液のタンパク質濃度を定量し、各2.5mg/mlになるように洗浄バッファーで希釈し、5×ローディングバッファ(10mM Tris-HCl(pH8.6)、30% glycerol、0.005% BPB(Bromophenol Blue))を添加し最終濃度2mg/mlのサンプルとした。
ドし、4℃で20mA、1.5時間、native PAGEを行った。このときのgel-runningバッファーの組成は、25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM Glycineであった。電気泳動後、ゲルを染色液(100mM Tris-HCl(pH8.6)、10mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)、 50mM システイン、0.02mM PLP、1.6mM 塩化ビスマス(III))に浸し、適度な発色が見られるまでゆっくり室温でゆすりながら活性染色を行った。図10に、検出されたd0191産物のCD活性によるバンドを示す。d0191欠損株では見られないバンドが対照株では見られ、またこのバンドはd0191強化株では強度が強くなることからも、d0191産物がCD活性によって染色されたバンドと考えられる。以上の結果から、d0191は新規のシステインデスルフヒドラーゼをコードしており、システイン耐性に関与していることが明らかとなった。
d0191遺伝子強化がシステイン生産に及ぼす効果を調べるため、d0191が強化されたシステイン生産菌P. ananatis SC17/pMIV-CysE5/pACYC-d0191F株と、その対照株SC17/pMIV-CysE5/pACYC177株のシステイン生産能を比較した。培養にはシステイン生産培地(組成:15g/L 硫酸アンモニウム, 1.5g/L リン酸二水素カリウム, 1g/L 硫酸マグネシウム七水和物, 0.1mg/L チアミン塩酸塩, 1.7mg/L 硫酸第一鉄七水和物, 0.15mg/L モリブデン酸ナトリウム二水和物, 0.7mg/L 塩化コバルト六水和物, 1.6mg/L 塩化マンガン四水和物, 0.3mg/L硫酸亜鉛七水和物, 0.25mg/L 硫酸銅五水和物, 0.6g/L トリプトン, 0.3g/L イーストエクストラクト, 0.6g/L 塩化ナトリウム, 20g/L 炭酸カルシウム, 135mg/L L-ヒスチジン塩酸塩一水和物, 4g/L チオ硫酸ナトリウム, 2mg/L ピリドキシン塩酸塩, 60g/L グルコース, 25mg/L クロラムフェニコール, 20mg/L カナマイシン)を使用した。
d0191はシステインの分解に関与し、遺伝子の強化によってシステイン生産を減ずることが明らかとなったため、次にd0191の活性抑制(具体的には遺伝子欠損)によってシステイン生産にポジティブな効果があるかどうか検討を行った。上記のように作製されたd0
191欠損をもつシステイン生産菌SC17 d0191::Kmr/pMIV-CysE5株が、d0191非破壊株SC17/pMIV-CysE5株に対して優れたシステイン生産能を有しているかどうかを調べるため、システイン生産培養を行いその能力を比較した。システインの生産培養及び定量の方法は(11)に記述された方法と同じであるただし抗生物質はクロラムフェニコールのみ培地に添加した。対照株は4連で、d0191欠損株は8連で実験を行い、システイン蓄積量の平均値と標準偏差を表2に示した。表2に示すとおり、d0191の活性抑制はシステイン蓄積量を増加させる効果があることが明らかとなった。
(1)d0191遺伝子の転写制御因子の同定
E. coliなどではシステイン存在下でシステインデスルフヒドラーゼ活性が誘導されることが知られている(Awano N et al. Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71(7):4149-52.)。そこでシステインデスルフヒドラーゼ活性を有することが明らかとなったd0191がシステインにより誘導されるかどうかを検討するため、システイン添加後のd0191のmRNAレベルを定量的RT-PCRを用いて調べた。
付のプロトコール、マニュアルに従い標準的な方法にて行った。このときの反応組成は;12.5μl Power SYBR Green Master Mix、0.5μl プライマー1(10pM)、0.5μl プライマー2(10pM)、2.5μl サンプルDNA、9μl 水であり、PCRサイクルは;50℃2分→95℃10分の後に95℃15秒→60℃60秒のサイクルを40回であった。
c0263欠損株(SC17 c0263::Kmr/pSTV29)ではシステインによるd0191の誘導が見られなくなり、c0263をプラスミドで相補した株(SC17 c0263::Kmr/pSTV-c0263)では誘導が見られるようになったことから、d0191の転写の活性化にc0263が関与していることがわかった。
c0263欠損株及びd0191-c0263の二重欠損株の構築は先述のd0191欠損株の構築と同じ方法によって行った。すなわち、SC17(0)/RSF_Red_TER株を用いた「Red-driven integration」により、カナマイシン耐性遺伝子でc0263遺伝子及びd0191-c0263遺伝子を欠損したSC17(0) c0263::Kmr株、及びSC17(0) d0191 c0263::Kmr株を構築し、各々の株の染色体DNAを用いてSC17株を形質転換して、最終的にSC17 c0263:: Kmr株(c0263のC末端約280bpを欠損)及びSC17 d0191-c0263::Kmr株(c0263とd0191の全長を含む領域を欠損)を構築した。このときの遺伝子欠損用DNAを調製するために用いたプライマーの組み合わせは次の通りである。
Dc0263-RV(TCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTCGTGTATTTAATCTCTTCCATCGCGATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA)(配列番号76)
Dc0263-attR2(ACGGCATTATTCGCGGACGGGTCGCTCTGCTGGATAATGAAAAGCTTGGCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA)(配列番号77)
Dc0263-RV(TCAGGGGCCAACAGGCAGGGCTGTCGTGTATTTAATCTCTTCCATCGCGATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA)(配列番号78)
Dd0191-RV(CTAGCCCAGTTCGCGCTGCCAGGGCGTAATATCGCCAATGTGCTCGGCAACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA)(配列番号79)
c0263はd0191の転写活性化に関与する転写因子であることが明らかとなったため、次にc0263遺伝子欠損によってシステイン生産にポジティブな効果があるかどうか検討を行った。上記のように作製されたc0263欠損株及びd0191-c0263二重欠損株を先述のpMIV-CysE5で形質転換することでシステイン生産菌SC17 c0263::Kmr/pMIV-CysE5株及びSC17 d0191-c0263::Kmr/pMIV-CysE5株を構築した。
配列番号1:Pantoea ananatis d0191遺伝子の塩基配列
配列番号2:Pantoea ananatis D0191のアミノ酸配列
配列番号3:Pantoea ananatis hisD遺伝子の塩基配列
配列番号4〜32:PCRプライマー
配列番号33:Citrobacter koseri d0191遺伝子の塩基配列
配列番号34:Citrobacter koseri D0191のアミノ酸配列
配列番号35:Klebsiella pneumoniae d0191遺伝子の塩基配列
配列番号36:Klebsiella pneumoniae D0191のアミノ酸配列
配列番号37:Enterobacter sp. 638 d0191遺伝子の塩基配列
配列番号38:Enterobacter sp. 638 D0191のアミノ酸配列
配列番号39:Salmonella typhimurium d0191遺伝子の塩基配列
配列番号40:Salmonella typhimurium D0191のアミノ酸配列
配列番号41:Serratia proteamaculans d0191遺伝子の塩基配列
配列番号42:Serratia proteamaculans D0191のアミノ酸配列
配列番号43:Erwinia carotovora d0191遺伝子の塩基配列
配列番号44:Erwinia carotovora D0191のアミノ酸配列
配列番号45:Vibrio cholerae d0191遺伝子の塩基配列
配列番号46:Vibrio cholerae D0191のアミノ酸配列
配列番号47:Pseudomonas fluorescens d0191遺伝子の塩基配列
配列番号48:Pseudomonas fluorescens D0191のアミノ酸配列
配列番号49:Streptomyces coelicolor d0191遺伝子の塩基配列
配列番号50:Streptomyces coelicolor D0191のアミノ酸配列
配列番号51:Mycobacterium avium d0191遺伝子の塩基配列
配列番号52:Mycobacterium avium D0191のアミノ酸配列
配列番号53〜54:PCRプライマー
配列番号55:attLの塩基配列
配列番号56〜57:PCRプライマー
配列番号58:attRの塩基配列
配列番号59〜62:PCRプライマー
配列番号63:ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号64〜65:PCRプライマー
配列番号66:Pantoea ananatis c0263遺伝子の塩基配列
配列番号67:Pantoea ananatis C0263のアミノ酸配列
配列番号68〜79:PCRプライマー
配列番号80:Escherichia coli ybaO遺伝子の塩基配列
配列番号81:Escherichia coli YbaOのアミノ酸配列
Claims (9)
- L−システイン生産能を有し、かつ、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を低下させること、又は同遺伝子を破壊することにより、前記タンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記遺伝子が、下記(a)または(b)に記載のDNAである、請求項1に記載の細菌。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - さらに、L−システインによるフィードバック阻害が低減された変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを保持する請求項1又は2に記載の細菌。
- 前記細菌がパントエア属に属する細菌である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項4に記載の細菌。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養し、該培地からL−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物を採取することを特徴とする、L−システイン、L−シスチン、もしくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物の製造法。
- 前記L−システインの誘導体がチアゾリジン誘導体である、請求項6に記載の方法。
- 下記タンパク質をコードするDNA(但し、ゲノムDNAを除く)。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜30個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記(a)または(b)に記載のDNAである、請求項8に記載のDNA(但し、ゲノムDNAを除く)。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA、または
(b)配列番号1の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、システインデスルフヒドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであって、前記ストリンジェントな条件が、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSで洗浄する条件である、DNA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009053178A JP5396922B2 (ja) | 2008-03-06 | 2009-03-06 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008056371 | 2008-03-06 | ||
JP2008056371 | 2008-03-06 | ||
JP2009053178A JP5396922B2 (ja) | 2008-03-06 | 2009-03-06 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009232844A JP2009232844A (ja) | 2009-10-15 |
JP5396922B2 true JP5396922B2 (ja) | 2014-01-22 |
Family
ID=41054011
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009053178A Active JP5396922B2 (ja) | 2008-03-06 | 2009-03-06 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8383372B2 (ja) |
EP (1) | EP2138585B1 (ja) |
JP (1) | JP5396922B2 (ja) |
AT (1) | ATE498017T1 (ja) |
DE (1) | DE602009000714D1 (ja) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2246420B1 (en) * | 2008-02-21 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine |
CN102177246B (zh) * | 2008-09-08 | 2015-02-11 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法 |
JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
ES2646165T3 (es) | 2009-11-30 | 2017-12-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacteria que produce L-cisteína y procedimiento para la producción de L-cisteína |
RU2460793C2 (ru) * | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
JP5803927B2 (ja) | 2010-09-14 | 2015-11-04 | 味の素株式会社 | 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法 |
JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
CN110016484A (zh) | 2011-04-01 | 2019-07-16 | 味之素株式会社 | 用于产生l-半胱氨酸的方法 |
US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | L−システインの製造法 |
DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
ES2694011T3 (es) | 2013-10-21 | 2018-12-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para producir L-aminoácido |
JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
US11649447B2 (en) | 2017-06-12 | 2023-05-16 | Duke University | Compositions, systems, and methods for the production of biomolecules |
WO2019212052A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-METHIONINE USING A BACTERIUM OF THE GENUS Pantoea |
BR112021005543A2 (pt) | 2018-09-28 | 2021-06-29 | Ajinomoto Co., Inc. | método para produzir l-metionina |
EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
WO2020204179A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-amino acids |
WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
US20230124898A1 (en) | 2020-04-03 | 2023-04-20 | Wacker Chemie Ag | Biocatalyst as a core component of an enzyme-catalyzed redox system for the biocatalytic reduction of cystine |
CN116018400A (zh) | 2020-06-26 | 2023-04-25 | 瓦克化学股份公司 | 改进的产生半胱氨酸的菌株 |
CN113430213A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-09-24 | 合肥工业大学 | 一种调控番茄侧枝的基因及方法 |
WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856148A (en) | 1991-12-12 | 1999-01-05 | Wacker Chemie Gmbh | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products |
TW313589B (ja) | 1991-12-12 | 1997-08-21 | Wacker Chemie Gmbh | |
DE19539952A1 (de) | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
DE19726083A1 (de) | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
JP4151094B2 (ja) | 1997-11-25 | 2008-09-17 | 味の素株式会社 | L−システインの製造法 |
DE19949579C1 (de) | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
JP4622111B2 (ja) | 2001-02-09 | 2011-02-02 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
DE60230823D1 (de) | 2001-09-28 | 2009-02-26 | Ajinomoto Kk | L-cystein herstellendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-cystein |
JP4186564B2 (ja) | 2001-09-28 | 2008-11-26 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
DE10232930A1 (de) | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
US7348037B2 (en) | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
JP2006230202A (ja) * | 2003-06-23 | 2006-09-07 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸の製造法 |
DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
ATE554162T1 (de) | 2003-07-16 | 2012-05-15 | Ajinomoto Kk | Mutante serinacetyltransferase und vefahren zur herstellung von l-cystein |
RU2275425C2 (ru) | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
JP4604537B2 (ja) | 2004-03-31 | 2011-01-05 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
BRPI0715584B8 (pt) * | 2006-07-19 | 2017-02-21 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
JP2010263789A (ja) * | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
EP2246420B1 (en) * | 2008-02-21 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine |
JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 |
-
2009
- 2009-03-04 DE DE602009000714T patent/DE602009000714D1/de active Active
- 2009-03-04 AT AT09003107T patent/ATE498017T1/de not_active IP Right Cessation
- 2009-03-04 EP EP09003107A patent/EP2138585B1/en active Active
- 2009-03-04 US US12/397,683 patent/US8383372B2/en active Active
- 2009-03-06 JP JP2009053178A patent/JP5396922B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2138585A1 (en) | 2009-12-30 |
EP2138585B1 (en) | 2011-02-09 |
US20090226984A1 (en) | 2009-09-10 |
US8383372B2 (en) | 2013-02-26 |
DE602009000714D1 (de) | 2011-03-24 |
JP2009232844A (ja) | 2009-10-15 |
ATE498017T1 (de) | 2011-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5396922B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5332237B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5476545B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP6020443B2 (ja) | L−システインの製造法 | |
EP2486123B1 (en) | A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY | |
JP5359409B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5463528B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
JP5817529B2 (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
US20120252076A1 (en) | Method for producing l-cysteine | |
WO2012114802A1 (ja) | L-システイン生産菌及びl-システインの製造法 | |
JP7444164B2 (ja) | 細菌を用いたl-メチオニンの製造方法 | |
JP2010252650A (ja) | L−システインの製造法 | |
JP2017143756A (ja) | L−システインの製造法 | |
WO2012144472A1 (ja) | L-システインの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130604 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130802 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130924 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131007 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5396922 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |