JPH11155571A

JPH11155571A - Ｌ−システインの製造法

Info

Publication number: JPH11155571A
Application number: JP9323210A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Nakamori; 茂中森; Hiroshi Takagi; 博史高木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-11-25
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 1999-06-15
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: JP4151094B2

Abstract

(57)【要約】【課題】エシェリヒア属細菌を用いたＬ−システイン
の改良された製造法を提供する。【解決手段】細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ
活性が低下し、かつ、Ｌ−システインによるフィードバ
ック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラー
ゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地に培養し、該培
養物中にＬ−システインを生成蓄積せしめ、該培養物か
らＬ−システインを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−システインの
製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な
新エシェリヒア属細菌、及びそれを用いたＬ−システイ
ンの製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システイ
ンの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用され
ている。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽
毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、ある
いはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前
駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、
新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システイン
の大量生産も計画されている。さらに、微生物を用いた
発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。

【０００３】Ｌ−システインの生合成について、エシェ
リヒア・コリ等の細菌では詳細に研究されており（Kred
ich, N. M. et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965
(1966), Kredich, N. M. et al., 1987, Biosynthesis
of Cysteine. In: Neidhardt, F.C., et al., (eds) Es
cherichia coli and Salmonella typhimurium: cellula
r and molecular biology, Vol.1, American Society f
or Microbiology, Washington D.C., 419-428）、Ｌ−
セリンから２段階の反応によりＬ−システインが生成す
ることがわかっている。エシェリヒア・コリでは、第一
の反応は、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化
であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（serine a
cetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「ＳＡＴ」
ともいう）により触媒される。第二の反応は、上記反応
により生成するＯ−アセチルセリンからＬ−システイン
が生成する反応であり、Ｏ−アセチルセリン（チオー
ル）リアーゼにより触媒される。

【０００４】ＳＡＴをコードする遺伝子（ｃｙｓＥ）
は、エシェリヒア・コリにおいては、野生株及びＬ−シ
ステイン分泌変異株よりクローニングされている（Den
k, D. and Bock, A., J. General Microbiol., 133, 51
5-525 (1987)）。また、これらのｃｙｓＥの塩基配列が
決定され、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が
減少したＳＡＴは、２５６位のメチオニン残基がイソロ
イシン残基に置換されていたことが報告されている。さ
らに、上記変異とは異なる変異によりＬ−システインに
よるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴをコードす
るＤＮＡを用いて、Ｌ−システイン等を製造する方法が
開示されている（WO 97/15673号国際公開パンフレッ
ト）。このＳＡＴは、９７位のアミノ酸残基から２７３
位のアミノ酸残基までの領域における変異、又は２２７
位のアミノ酸残基からＣ末端領域の欠失を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、Ｌ−シ
ステインによるフィードバック阻害が低減したＳＡＴを
コードする遺伝子を利用してＬ−システインを製造する
技術が知られているが、未だ改良の余地が残されてい
る。すなわち、本発明者は、エシェリヒア属細菌のＬ−
システイン生合成について研究を行ったところ、Ｌ−シ
ステインによるフィードバック阻害が低減されたＳＡＴ
を保持するエシェリヒア属細菌は、Ｌ−システインの生
産性が不安定であることを見出した。本発明は、エシェ
リヒア属細菌を用いたＬ−システインの改良された製造
法及びこの方法に用いるエシェリヒア属細菌を提供する
ことを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記のＬ−シ
ステイン生産の不安定性は、細胞中のシステインデスル
フヒドラーゼ活性を低下させることにより安定化される
ことを見出し、本発明を完成させるに至った。

【０００７】すなわち本発明は、Ｌ−システイン分解系
が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバッ
ク阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ
を保持するエシェリヒア属細菌である。前記エシェリヒ
ア細菌としては、細胞中のシステインデスルフヒドラー
ゼ（cystein desulfhydrase：以下、「ＣＤａｓｅ」と
もいう）活性の低下によりＬ−システイン分解系が抑制
されたエシェリヒア属細菌が挙げられる。

【０００８】前記Ｌ−システインによるフィードバック
阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼと
しては、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２
５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジ
ン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する
変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ
酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するセ
リンアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。

【０００９】また本発明は、前記エシェリヒア属細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積
せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することを
特徴とするＬ−システインの製造法を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌本発明のエシェリヒア属細菌としては、例えばエシェリ
ヒア・コリ（E. coli）が挙げられる。

【００１２】本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−シス
テイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによる
フィードバック阻害が低減されたＳＡＴ（以下、「変異
型ＳＡＴ」ともいう）を保持するものであり、Ｌ−シス
テイン分解系が抑制されたエシェリヒア属細菌（以下、
「Ｌ−システイン分解系抑制株」ともいう）に変異型Ｓ
ＡＴを保持させるか、あるいは変異型ＳＡＴを保持する
エシェリヒア属細菌に、細胞中のＬ−システイン分解系
が抑制されるような変異を生じさせることにより得るこ
とができる。尚、「Ｌ−システイン分解系の抑制」と
は、システインの分解に関与する酵素のうち少なくとも
一つの活性が低下又は消失していることをいう。また、
「フィードバック阻害の低減」とは、低減されたフィー
ドバック阻害が残存している場合の他、フィードバック
阻害が実質的に解除されている場合を含む。前記Ｌ−シ
ステインの分解に関与する酵素としては、ＣＤａｓｅ及
びシスタチオンβリアーゼが挙げられる。ＣＤａｓｅ活
性が低下又は消失した株（以下、「ＣＤａｓｅ活性低下
株」ともいう）は、野生型ＣＤａｓｅを保持するエシェ
リヒア属細菌を変異処理し、Ｌ−システインを唯一の窒
素源とする培地で生育できず、かつ、通常の窒素源を含
む培地で生育できる変異株を選択することによって取得
することができる。変異処理としては、紫外線照射また
はN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常の突然変異に用いられてい
る変異剤による処理が挙げられる。得られた候補株のＣ
Ｄａｓｅ活性が低下していることは、候補株の菌体抽出
液について、Kredichらの方法（J. Biol. Chem., 248,
6187-6196 (1973)）等により、ＣＤａｓｅ活性を測定
し、親株のＣＤａｓｅ活性と比較することにより確認す
ることができる。同様に、野生型シスタチオンβリアー
ゼを保持するエシェリヒア属細菌を変異処理し、シスタ
チオンβリアーゼ活性が低下又は消失している株を選択
することにより、シスタチオンβリアーゼ活性低下株を
取得することができる。

【００１３】エシェリヒア属細菌に変異型ＳＡＴを保持
させるには、野生型ＳＡＴを保持するエシェリヒア属細
菌を変異処理し、変異型ＳＡＴを保持する変異株を選択
するか、あるいは、変異型ＳＡＴをコードするＤＮＡ
（以下、「変異型ｃｙｓＥ」ともいう）をエシェリヒア
属細菌に導入することによって行うことができる。変異
型ｃｙｓＥは、野生型ｃｙｓＥに、コードするＳＡＴが
Ｌ−システインによるフィードバック阻害が解除される
ような変異を導入することによって得られる。このよう
な変異としては、コードされるＳＡＴのアセチル−Ｃｏ
ＡによるＬ−セリンの活性化を触媒する活性を実質的に
損なわないものであれば特に制限されないが、具体的に
は、野生型ＳＡＴの２５６位のメチオニン残基又はこの
メチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及
びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又
は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基か
らＣ末端側の領域を欠失させる変異が挙げられる。前記
他のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成す
るアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロ
イシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられ
る。また、変異型ｃｙｓＥが有する変異としては、WO 9
7/15673号国際公開パンフレットに記載されている変異
であってもよい。

【００１４】本発明における変異型ＳＡＴとしては、上
記のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減す
る変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの
活性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよ
い。そのような変異を有するＳＡＴにおいては、２５６
位のメチオニン残基の位置が変わっている場合もある
が、そのような場合であっても、２５６位のメチオニン
残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン
残基以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−
システインによるフィードバック阻害が低減した変異型
ＳＡＴが取得され得る。

【００１５】野生型ｃｙｓＥは、デンクらによって報告
されている方法（Denk, D. and Bock, A., J. general
Microbiol., 133, 515-525 (1987)）、あるいはこの報
告に記載されているｃｙｓＥの塩基配列に基づいて作製
したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒ
ア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション；White,T.J. et al ;Tren
ds Genet. 5,185(1989)参照）により、ｃｙｓＥを含む
ＤＮＡ断片を増幅することによって得られる。前記プラ
イマーとして具体的には、配列番号１及び２に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。参
考として、配列番号５及び６に、デンクらによって報告
されている野生型ｃｙｓＥの塩基配列及びコードされる
アミノ酸配列を示す。

【００１６】得られたｃｙｓＥに所望の変異を導入する
方法としては、部位特異的変異が挙げられる。部位特異
的変異に用いるプライマーとしては、例えば、配列番号
３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
挙げられる。変異が導入されたｃｙｓＥ断片から変異が
導入された部位を含む領域を切り出し、野生型ｃｙｓＥ
と、相当する領域を入れ換えることにより、変異型ｃｙ
ｓＥを得ることができる。

【００１７】上記のようにして得られる変異型ｃｙｓＥ
を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するに
は、通常のタンパク質発現に用いられる種々のベクター
を用いることができる。その際、変異型ｃｙｓＥ遺伝子
を自律複製可能なベクターに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主エシ
ェリヒア属細菌に保持させてもよいが、変異型ｃｙｓＥ
遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Ber
g,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、
Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性
組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Sp
ring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主エシェリ
ヒア属細菌の染色体に組み込んでもよい。

【００１８】プロモーターとしては、ｃｙｓＥ固有のプ
ロモーターを用いてもよいが、発現ベクターに含まれて
いるプロモーターを用いて、これにｃｙｓＥコード領域
を連結してもよい。発現ベクターとしては、pBluescrip
tII SK+（STRATAGENE社）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pUC系（宝酒造（株）等）、pPROK系（クロンテッ
ク製）、pKK233-2（クロンテック製）等、市販のベクタ
ーを使用することができる。

【００１９】ｃｙｓＥを含む発現ベクターをエシェリヒ
ア属細菌に導入するには、D.M.Morrisonの方法（Method
s in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）
等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用いられてい
る方法により行うことができる。

【００２０】＜２＞Ｌ−システインの製造法上記のようにして細胞中のシステインデスルフヒドラー
ゼ活性が低下又は消失し、かつ、Ｌ−システインによる
フィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトラン
スフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌を好適な培
地で培養し、該培養物中にＬ−システインを生産蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−システインを採取することによ
り、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定に製造する
ことができる。尚、本発明の方法により製造されるＬ−
システインには、還元型のシステインに加えてシスチン
も含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物には
シスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物
も含まれる。

【００２１】使用する培地としては、炭素源、窒素源、
イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分
を含有する通常の培地が挙げられる。炭素源としては、
グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでん
ぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、
コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

【００２２】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００２３】イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫
化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙
げられる、有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１など
の要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが
望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が
少量添加される。

【００２４】培養は好気的条件下で30〜90時間実施する
のがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは
５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無
機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にア
ンモニアガス等を使用することができる。培養物からの
Ｌ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱
法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施で
きる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２６】＜１＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子の及び該遺伝
子導入用プラスミドの構築エシェリヒア・コリJM240（Hfr ProC47 Cys-54 supE4
2）から染色体ＤＮＡを常法により調製し、これを鋳型
として用い、公知のｃｙｓＥの塩基配列に基づいて合成
したオリゴヌクレオチド（配列番号１、２）をプライマ
ーとするＰＣＲによって、ｃｙｓＥを含むＤＮＡ断片を
増幅した。プライマーは、増幅される配列がコード領域
及びプロモーター配列を含むように設計した。ＰＣＲ反
応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ200
0型を用い、Taq DNAポリメラーゼを用い、供給者により
指定された方法に従って行なった。

【００２７】増幅された１．２ｋｂのＤＮＡ断片につい
て、EcoRVで切断したpBluescriptIISK+を用いてＴＡク
ローニングを行い、４．２ｋｂのプラスミドを得た。こ
のプラスミドをｐＣＥと名付けた。得られたクローニン
グ断片の塩基配列を決定し、野生型のｃｙｓＥと同一の
塩基配列を含むことを確認した。

【００２８】上記のようにして得られたｃｙｓＥに、コ
ードされるＳＡＴの２５６位のメチオニン残基を他の１
９種類のアミノ酸残基又は終止コドンに置換する変異
を、配列番号３及び４に示す塩基配列を有する相補的な
オリゴヌクレオチド対を用い、ｐＣＥを鋳型とする部位
特異的変異により導入した。変異が導入されたｃｙｓＥ
の一部を含む断片とｐＣＥをPstIとBstEIIで消化し、生
じた0.31kbの断片を入れ換え、変異型ｃｙｓＥを含むプ
ラスミドを得た（図１）。得られたプラスミドについて
塩基配列決定を行い、変異型ｃｙｓＥの目的の部位に変
異が導入されたこと、及び目的部位以外の部位にミスマ
ッチ変異が生じていないことを確認した。但し、２５６
位のメチオニン残基をリジン残基に置換したものは、２
２４位のセリン残基がプロリン残基に置換されるミスマ
ッチ変異が生じていた。こうして得られたプラスミドの
シリーズを総称してｐＣＥＭ２５６＊と名付けた。尚、
「＊」はメチオニン残基以外のアミノ酸残基を表す記号
を代表し、例えば、ｐＣＥＭ２５６Ａは、２５６位のメ
チオニン残基がアラニン残基に置換されたＳＡＴをコー
ドする変異型ｃｙｓＥを含むプラスミドを表す。

【００２９】プラスミドｐＣＥ及び上記のようにして得
られたｐＣＥＭ２５６＊で、ｃｙｓＥ欠損株であるエシ
ェリヒア・コリJM39（F⁺ cysＥ51 tfr-8）（Denk, D. a
nd Bock, A., J. Gene. Microbiol, 133, 515-525(198
7)）を形質転換し、得られた形質転換株をそれぞれJM39
(pCE)及びJM39(pCEM256*)と名付けた。

【００３０】アンピシリン 50mg/Lを含むＬＢ（Bacto-T
ryptone 10g/L、Bacto-Yeast Extract 5g/L、NaCl 5g/
L、pH7.0）プレート培地で３０℃、２４時間培養した各
形質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加し
た下記液体培地（組成は下記のとおり）３ｍｌを入れた
試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間培養した。
培養は、各形質転換体について２連で行った。培養後、
生育、ｐＨ及びシステイン蓄積量を調べた。生育は、培
養液を0.1N HClで２６倍希釈し、５６２ｎｍにおける吸
光度（OD₅₆₂）を測定することにより調べた。Ｌ−シス
テインの蓄積量は、沈澱したシスチンを溶かすため培養
液をO.5N HClで希釈したものを、ロイコノストック・メ
センテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）を用い
るバイオアッセイ（Tsunoda, T. et al., Amino acids,
3, 7-13 (1961)）により、還元型システイン及びシス
チンの総量として測定した。その結果を表１に示す。表
中の「256th」は、２５６位のアミノ酸残基を示す。ま
た、「stop」は、２５６位が終止コドンに置換されたこ
とを示す。

【００３１】野生型ｃｙｓＥを含むプラスミドを保持す
るJM39(pCE)に比べて、変異型ｃｙｓＥを含むプラスミ
ドを保持するJM39(pCEM256*)では、２５６位のメチオニ
ン残基がロイシン残基又はリジン残基に置換されたもの
（JM39(pCEM256L、JM39(pCEM256K）を除いて、システイ
ン蓄積量が大幅に増加したが、結果にばらつきがあり、
システイン生産性は不安定であった。

【００３２】（培地組成）グルコース 30g/L 塩化アンモニウム 10g/L KH₂PO₄ 2g/L MgSO₄・7H₂O 1g/L FeSO₄・7H₂O 10mg/L MnCl₂・4H₂O 10mg/L CaCO₃ 20g/L

【００３３】

【表１】

【００３４】＜２＞ＣＤａｓｅ低下株の取得エシェリヒア・コリJM39を、0.1mg/mlのＮＴＧ溶液中で
１５分変異処理し、塩化アンモニウムをＬ−システイン
（0.3g/L）に置換したＭ９培地（組成は下記のとおり）
プレートでは生育できず、Ｌ−シテステイン0.1g/Lを含
むＭ９培地で生育する変異株、39-8株を選択した。

【００３５】（培地組成） Na₂HPO₄ 6g/L KH₂PO₄ 3g/L NaCl 0.5g/L MgSO₄・7H₂O 0.25g/L CaCl₂・4H₂O 0.015mg/L グルコース 4g/L チアミン・HCl 0.001g/L

【００３６】次に、得られたＬ−システイン非資化性株
である39-8株のＣＤａｓｅ活性を次のようにして測定し
た。39-8株を、ＬＢ培地にＬ−システイン−ＨＣｌ1mg/
mlを添加した培地で３７℃、８時間培養し、菌体を超音
波処理し、30,000×ｇで３０分遠心し、上清を採取して
粗酵素液とした。この粗酵素液について、Kredichらの
方法（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）でＣ
Ｄａｓｅ活性を測定した。すなわち、0.1M Tris-HCl、5
mM ピリドキサールリン酸、2mM Ｌ−システイン・ＨＣ
ｌ、0.3ml粗酵素液からなる反応液1.5mlを３７℃で３０
分反応させ、生成するピルビン酸を定量し、タンパク当
たりの生成量をＣＤａｓｅ活性とした。結果を表２に示
す。39-8株のＣＤａｓｅ活性は、親株に比べて明らかに
低下していた。

【００３７】

【表２】

【００３８】＜３＞ＣＤＡｓｅ低下株への変異型ｃｙｓ
Ｅ遺伝子の導入及びＬ−システインの生産上記で得られたＣＤａｓｅ低下株である39-8株を、ｐＣ
Ｅ及びｐＣＥＭ２５６＊で形質転換した。得られた形質
転換株をそれぞれ39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)と名付
けた。これらの形質転換株を、アンピシリン 50mg/Lを
含むＬＢプレート培地で３０℃、２４時間培養した各形
質転換体１白金耳を、アンピシリン 50mg/Lを添加した
Ｃ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌを入れた坂口
フラスコにそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振盪培養
した。培養は、各形質転換体について２連で行った。培
養後、生育、培養液のｐＨ、残糖、Ｌ−システインの蓄
積量、及び対糖収率を調べた。生育及びＬ−システイン
量は、前記と同様にして行った。結果を表３に示す。

【００３９】また、39(pCE)及び39(pCEM256*)を上記と
同様にして培養し、Ｌ−システインの蓄積量を調べた結
果を表４に示す。この結果から、変異型ｃｙｓＥをＣＤ
ａｓｅ低下株に導入することによって、Ｌ−システイン
生産量が増加し、かつ、安定した生産性を示すことが明
らかである。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【表４】

【００４２】２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸
残基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを含
むｐＣＥＭ２５６Ｅを保持する39-8株（E. coli 39-8(p
CEM256 )、プライベートナンバー：ＡＪ１３３９１）
は、平成９年１１月２０日より工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭＰ−１６５２７の受託
番号のもとで寄託されている。上記寄託菌株よりｐＣＥ
Ｍ２５６Ｅを取得し、部位特異的変異を導入することに
よって、２５６位のメチオニン残基を所望のアミノ酸残
基に置換したＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥを得る
ことができる。

【００４３】＜４＞変異型ｃｙｓＥ遺伝子を導入したＣ
Ｄａｓｅ低下株のＳＡＴ活性の測定 39-8(pCE)及び39-8(pCEM256*)株を、アンピシリン 50mg
/Lを添加したＣ１培地（組成は下記のとおり）２０ｍｌ
を入れた坂口フラスコに接種し、３０℃で４８時間振盪
培養した後、集菌した。菌体を、氷冷した50mM Tris-HC
l(pH7.5)で２回洗浄し、2mM ジチオスレイトールを含む
50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波処理により菌体
を破砕した。破砕物を30,000×ｇで３０分遠心し、上清
を粗抽出液としてＳＡＴ活性の測定に用いた。

【００４４】ＳＡＴ活性の測定は、50mM Tris-HCl(pH7.
5)、1mM Ｌ−セリン、0.1mM アセチル−ＣｏＡ及び粗酵
素液を含む１ｍｌの反応液を３０℃で１５分反応させ、
アセチル−ＣｏＡのチオエステル結合の開裂による232n
mの吸光度の減少を測定することによって行った。前記
反応液からＬ−セリンを除いたものをブランクとした。
また、前記反応液にＬ−システイン10μMを加えて同様
に反応を行い、Ｌ−システインによるフィードバック阻
害の程度を調べた。尚、アセチル−ＣｏＡのε値は6.5
×10³M^-1cm^-1である。Ｌ−システインを添加しない場合
のＳＡＴ比活性及びＬ−システインを加えたときの残存
活性（％）を表５に示す。

【００４５】２５６位のメチオニン残基を他のアミノ酸
残基に置換したＳＡＴは、いずれもＬ−システインによ
るフィードバック阻害が低減されていた。尚、２５６位
のメチオニン残基をロイシン残基又はリジン残基に置換
したＳＡＴは、ＳＡＴ活性が認められなかった。

【００４６】

【表５】

【００４７】

【発明の効果】本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−シ
ステインを高効率かつ安定に生産する能力を有してい
る。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：26 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：NO 配列 GGGAATTCAT CGCTTCGGCG TTGAAA 26

【００４９】配列番号：２配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：YES 配列 GGCTCTAGAA GCGGTATTGA GAGATTA 27

【００５０】配列番号：３配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：NO 配列の特徴：特徴を表す記号：存在位置：8..10 特徴を決定した方法：その他の情報：NNNはメチオニン以外のアミノ酸をコー
ドするコドンを表す配列 GCTGGTCNNN ATCCATT 17

【００５１】配列番号：４配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチドアンチセンス：YES 配列の特徴：特徴を表す記号：存在位置：8..10 特徴を決定した方法：その他の情報：NNNはメチオニン以外のアミノ酸をコー
ドするコドンを表す配列 AATGGATNNN GACCAGC 17

【００５２】配列番号：５配列の長さ：1134 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：エシェリヒア・コリ株名：JM39 配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：223..1044 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TCCGCGAACT GGCGCATCGC TTCGGCGTTG AAATGCCAAT AACCGAGGAA ATTTATCAAG 60 TATTATATTG CGGAAAAAAC GCGCGCGAGG CAGCATTGAC TTTACTAGGT CGTGCACGCA 120 AGGACGAGCG CAGCAGCCAC TAACCCCAGG GAACCTTTGT TACCGCTATG ACCCGGCCCG 180 CGCAGAACGG GCCGGTCATT ATCTCATCGT GTGGAGTAAG CA ATG TCG TGT GAA 234 Met Ser Cys Glu 1 GAA CTG GAA ATT GTC TGG AAC AAT ATT AAA GCC GAA GCC AGA ACG CTG 282 Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu Ala Arg Thr Leu 5 10 15 20 GCG GAC TGT GAG CCA ATG CTG GCC AGT TTT TAC CAC GCG ACG CTA CTC 330 Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His Ala Thr Leu Leu 25 30 35 AAG CAC GAA AAC CTT GGC AGT GCA CTG AGC TAC ATG CTG GCG AAC AAG 378 Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met Leu Ala Asn Lys 40 45 50 CTG TCA TCG CCA ATT ATG CCT GCT ATT GCT ATC CGT GAA GTG GTG GAA 426 Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg Glu Val Val Glu 55 60 65 GAA GCC TAC GCC GCT GAC CCG GAA ATG ATC GCC TCT GCG GCC TGT GAT 474 Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser Ala Ala Cys Asp 70 75 80 ATT CAG GCG GTG CGT ACC CGC GAC CCG GCA GTC GAT AAA TAC TCA ACC 522 Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp Lys Tyr Ser Thr 85 90 95 100 CCG TTG TTA TAC CTG AAG GGT TTT CAT GCC TTG CAG GCC TAT CGC ATC 570 Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln Ala Tyr Arg Ile 105 110 115 GGT CAC TGG TTG TGG AAT CAG GGG CGT CGC GCA CTG GCA ATC TTT CTG 618 Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu Ala Ile Phe Leu 120 125 130 CAA AAC CAG GTT TCT GTG ACG TTC CAG GTC GAT ATT CAC CCG GCA GCA 666 Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile His Pro Ala Ala 135 140 145 AAA ATT GGT CGC GGT ATC ATG CTT GAC CAC GCG ACA GGC ATC GTC GTT 714 Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr Gly Ile Val Val 150 155 160 GGT GAA ACG GCG GTG ATT GAA AAC GAC GTA TCG ATT CTG CAA TCT GTG 762 Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile Leu Gln Ser Val 165 170 175 180 ACG CTT GGC GGT ACG GGT AAA TCT GGT GGT GAC CGT CAC CCG AAA ATT 810 Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg His Pro Lys Ile 185 190 195 CGT GAA GGT GTG ATG ATT GGC GCG GGC GCG AAA ATC CTC GGC AAT ATT 858 Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile Leu Gly Asn Ile 200 205 210 GAA GTT GGG CGC GGC GCG AAG ATT GGC GCA GGT TCC GTG GTG CTG CAA 906 Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser Val Val Leu Gln 215 220 225 CCG GTG CCG CCG CAT ACC ACC GCC GCT GGC GTT CCG GCT CGT ATT GTC 954 Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Ile Val 230 235 240 GGT AAA CCA GAC AGC GAT AAG CCA TCA ATG GAT ATG GAC CAG CAT TTC 1002 Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met Asp Gln His Phe 245 250 255 260 AAC GGT ATT AAC CAT ACA TTT GAG TAT GGG GAT GGG ATC TAATGTCCTG 1051 Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly Ile 265 270 TGATCGTGCC GGATGCGATG TAATCATCTA TCCGGCCTAC AGTAACTAAT CTCTCAATAC 1111 CGCTCCCGAT ACCCCAACTG TCG 1134

【００５３】配列番号：６配列の長さ：272 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255 Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270 Ile

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＣＥＭ２５６＊の構築の概略を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−システイン分解系が抑制され、か
つ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減さ
れたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシ
ェリヒア属細菌。
【請求項２】前記Ｌ−システイン分解系の抑制が、細
胞中のシステインデスルフヒドラーゼ活性の低下による
ものである請求項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】前記Ｌ−システインによるフィードバッ
ク阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ
が、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６
位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残
基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変
異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸
残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有する請求
項１記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載のエ
シェリヒア属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−シ
ステインを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−システイ
ンを採取することを特徴とするＬ−システインの製造
法。