WO2008108679A1 - Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale - Google Patents

Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale Download PDF

Info

Publication number
WO2008108679A1
WO2008108679A1 PCT/RU2007/000572 RU2007000572W WO2008108679A1 WO 2008108679 A1 WO2008108679 A1 WO 2008108679A1 RU 2007000572 W RU2007000572 W RU 2007000572W WO 2008108679 A1 WO2008108679 A1 WO 2008108679A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tumor
antigens
cells
vaccine
tumor antigens
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000572
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Petr Genrievich Lokhov
Original Assignee
Petr Genrievich Lokhov
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Petr Genrievich Lokhov filed Critical Petr Genrievich Lokhov
Priority to EP07852028A priority Critical patent/EP2116254A4/en
Priority to JP2009552621A priority patent/JP5172864B2/ja
Priority to CN2007800520447A priority patent/CN101636174B/zh
Publication of WO2008108679A1 publication Critical patent/WO2008108679A1/ru
Priority to US12/545,560 priority patent/US20110027322A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • ANTITUMEN VACCINE METHOD FOR OBTAINING ANTITUMOR VACCINE AND METHOD FOR CARRYING OUT ANTITUMOR IMMUNOTHERAPY
  • the group of inventions relates to medical technologies, namely, immunotherapy of cancer patients, and can be used in medicine for the treatment of cancer and the prevention of relapse.
  • tumor antigens that are either part of the vaccine or are required at various stages of their production (for example, a vaccine based on anti-idiotypic antibodies, dendritic cells, etc.) .
  • a vaccine based on anti-idiotypic antibodies, dendritic cells, etc. for example, a vaccine based on anti-idiotypic antibodies, dendritic cells, etc.
  • Some vaccines are made on the basis of individual tumor cell antigens (hereinafter OK) - peptides, heat shock proteins, polysaccharides and other substances.
  • OK tumor cell antigens
  • a method is known for producing peptide tumor antigens by their synthesis.
  • a vaccine consisting of a synthesized peptide of 9 amino acids in length showed good results in clinical trials in patients with myeloid leukemia (Williams R., “Impressum Sustem: Thompod aphotolip Sapseg Vassipes, 2005, Op.L. N ° 4).
  • Other peptides showed mixed results.
  • a peptide from a gplOO protein that showed good preliminary results was not able to elicit a sufficient immune response to resist the development of a tumor in patients (Yu Z., Restifo N. R., “Sapseg Vassipes: Progress Rewales New Kompléchities” J. Slip. , 2002, v. PO, 289-294).
  • Exosomes are nanometer-sized membrane vesicles secreted by many types of cells, including tumor cells (see, for example, Wolffers J. et al., Tumog-dehydrated exo-somésurfed sháréd tumo gejestiogeniesfogo CT. Nat. Med., 2001, v. 7, 297-303), T and B lymphocytes ("In lumphosets spert aptigep-receptors," J. Exp.Med., 1996, v.183, 1161-1172) and dendritic cells (Zitvodel L.
  • exosomes mainly contain cytosolic proteins and proteins of endosomal compartments (see, for example, the article “Excoms: Compositiop, Biogesis apd functionop", Revisws Impolopu, 2002, v.2, 569-579).
  • the second known disadvantage of this method is the long accumulation time of exosomes, which requires the presence of OK in the growth medium and leads to the need to clean the resulting antigens from the components of the growth medium.
  • a known method of obtaining an antitumor vaccine which is based on the introduction into the body instead of antigens of the tumor of the DNA encoding them.
  • Antigen-presenting cells absorb DNA, produce a tumor antigen and then present it on the cell surface in complex with the main histocompatibility complex, already capable of activating cytotoxic T lymphocytes. So, good results were obtained on animal models using vaccines based on viral vectors (see, for example, Yu Z., Restifo N. R., "Sapseg Vassipes: Progres Respolas Nev Complications" J. CHn. Ipvest, 2002 , v. 110, 289- 294).
  • the disadvantage of this method is the triggered reaction of the immune system to the viral vectors themselves, which leads to the absence of clearly positive results of antitumor vaccination in humans.
  • There is a method of obtaining an antitumor vaccine which involves the use of whole tumor cells as antigens from both the patient (autologous vaccine) and other patients (allovacinum). Cells are pre-inactivated by ionizing radiation.
  • the advantage of these vaccines is the absence of the need for identification and isolation of specific antigens.
  • cells mixed with BCG as an adjuvant were used against colorectal cancer, melanoma, and renal carcinoma (see Armstop AC, Eaton D., Evpg JC, Cellar Imperter for Sapseg, Brit. J., 2001, v. 3323, 1289-1293).
  • the disadvantages of this method are the need for inactivation of tumor cells and the poor suitability of antigens located on the surface of whole tumor cells for phagocytosis and processing of antigen-presenting cells.
  • the disadvantages of this method are, firstly, the need for inactivation of tumor cells, and secondly, antigens on the surface of the tumor cells are poorly suited for phagocytosis and processing by antigen-presenting cells.
  • the closest analogue of the claimed method is a method for producing an antitumor vaccine disclosed in US patent US 5993829 (IPC A61P 35/00, C07K14 / 47, publ. 30.11.1999). Similar methods, including the cultivation of tumor cells with the release of their surface antigens, are also described in patents US 6338853 (IPC A61P 35/00, C07K14 / 47, publ. 15.01.2002), US 5030621 (publ. 09.07.1991), US 5635188 ( published on June 3, 1997).
  • the known method involves the cultivation of tumor cells in a serum-free growth medium and the isolation from the growth medium of cell surface antigens that the tumor cells lose during their cultivation. After cleaning, the collected antigens are used as antigens of the antitumor vaccine.
  • the advantage of such vaccines is the high content of tumor antigens from the surface of the cells, which are accessible (not hidden inside the cell) for the action of the immune system.
  • the disadvantages of this method are:
  • composition of the resulting mixture of antigens requires preliminary purification of the drug from the components of the growth medium and cell waste products.
  • a sufficient amount of antigens for vaccination by a known method can be obtained only in the process of culturing tumor cells, i.e. obtaining antigens from isolated (without culturing) cells in this way is impossible.
  • the high cost of the vaccine which is determined by the duration of OK cultivation and the presence of a stage of purification of surface tumor antigens.
  • an antitumor vaccine based on surface tumor antigens lost by a cell during cultivation is known.
  • the manufacture of a known vaccine implies the possibility of accelerating the process of cell release of antigens into the growth medium by various influences, which can slightly increase the efficiency of creating a vaccine.
  • the vaccine also has the disadvantages of vaccines obtained by culturing OK in serum-free growth medium.
  • the closest analogue of the claimed antitumor vaccine is a vaccine based on surface tumor antigens disclosed in US patent
  • the main disadvantage of the known vaccine is its high cost, which is determined by the duration of the cultivation of OK and the presence of the stage of purification of antigens, as mentioned above.
  • the disadvantage of these methods of immunotherapy is the weak specificity of the resulting antitumor immunity, due to the fact that certain antigens are not specific for the tumor of a particular patient, since they were detected statistically in tumors of a certain type.
  • a known method of conducting antitumor therapy including the introduction into the body of whole inactivated tumor cells, as well as whole tumor cells with increased immunogenicity (see, for example, patent US 6039941, IPC C12N15 / 09, A61K31 / 00, publ. 21.03.2000).
  • the disadvantage of this method of immunotherapy is the low specificity of the obtained antitumor immune response, due to the fact that antigens on the surface of whole tumor cells are not very suitable for phagocytosis and subsequent processing by antigen-presenting cells. Also, this method involves the multiplication of ip vitro cells to achieve the required dose of antigen for vaccination, which leads to a change in the antigenic composition of tumor cells and a decrease in the effectiveness of immunotherapy.
  • this method involves the multiplication of ip vitro cells to achieve the required dose of antigen for vaccination, which leads to a change in the antigenic composition of tumor cells and, as a consequence, a decrease in the effectiveness of immunotherapy.
  • Known methods based on a combination of individual tumor antigens, as well as antigens and various kinds of immunostimulants.
  • the method includes introducing into the patient's body a vaccine obtained from a mixture of antigens, which are fragments of surface proteins of tumor cells spontaneously lost by a cell during cultivation in serum-free growth medium.
  • the disadvantage of this method is the weak specificity of the resulting antitumor immunity.
  • This method involves the use of continuously cultivated OK, which leads to a change in their antigenic composition and reduce the effectiveness of the vaccine.
  • the second disadvantage is the relatively high cost of the method, determined by the time of cell cultivation and the need to clean the resulting antigens from the components of the growth medium.
  • the technical result achieved using the patented group of inventions is to increase the effectiveness of the treatment of cancer by enhancing the antitumor immune response.
  • This technical result is achieved when using an antitumor vaccine based on surface tumor antigens.
  • the vaccine contains a mixture of surface tumor antigens, which are accumulated peptides from the surface proteins of living tumor cells, obtained by periodic and vital exposure of cells to the primary culture of living tumor cells.
  • an antitumor vaccine can be prepared by exposure to trypsin selected as a protease.
  • the specified technical result is also achieved by implementing the method of obtaining an antitumor vaccine, including the cultivation of tumor cells with the release of surface tumor antigens.
  • the primary culture of living tumor cells previously washed from the growth medium is exposed to a protease vital for cells, the released surface tumor antigens are selected, and the treatment of the primary culture of living tumor cells with a protease is repeated at intervals necessary for restoration of surface tumor antigens by cells, and surface tumor tumors are accumulated antigens to achieve the dose necessary for vaccination, control the composition of the received surface tumor antigens.
  • trypsin is used as the protease.
  • the specified technical result is also achieved by implementing a method of carrying out antitumor immunotherapy, comprising administering to the patient a vaccine obtained from a mixture of surface tumor antigens, which are peptides obtained from surface proteins of tumor cells.
  • a mixture of surface tumor antigens is used, which are accumulated peptides from surface proteins of living tumor cells obtained by periodic and vital for cells the action of protease on the primary culture of living tumor cells.
  • trypsin is used as the protease.
  • surface tumor antigens of the tumor cells of the patient are used.
  • surface tumor antigens of the tumor cells of another patient are used.
  • adjuvants are used in the antitumor vaccine.
  • FIG. 1 is a flow chart of a method for producing an anti-tumor vaccine.
  • FIG. 2 is a mass spectrum of surface antigens obtained according to a second embodiment of the invention from a primary tumor cell culture (A); mass spectrum of surface antigens obtained from the same cell culture after complete repair of surface antigens and their repeated treatment with protease (B); mass spectrum obtained from the same cell culture after partial repair of surface antigens after previous treatment with their protease
  • FIG. 3 mass spectra of fragmentation of surface antigens obtained according to this invention.
  • FIG. 4 - survival curve of mice vaccinated with H22 tumor and vaccinated with a peptide mixture.
  • FIG. 1 shows a General diagram of a method of obtaining an antitumor vaccine.
  • the growth medium is removed from the H22 cell culture vial and washed three times with a monolayer of cells with sterile saline using a volume equal to half the growth medium. Rinsing is carried out at least 3 times before removing residues of the growth medium.
  • the next and key step is the processing of the protease concentration vital for the cells, in which trypsin is chosen (activity -3000 U / mg).
  • the accumulated antigens are used to create a vaccine.
  • Mass spectrometric analysis is carried out as follows. 140 ⁇ l of antigen solution is mixed with 140 ⁇ l of ethanol, 720 ⁇ l of butanol and 15 are added ⁇ l of CL4B Sepharose. Incubate with slow stirring for 45 minutes. After incubation, Sepharose is washed twice with a solution with the same alcohol and butanol content and incubated for 30 min in a 50% ethanol solution. The ethanol solution was removed from sepharose and dried on a rotary evaporator. The resulting precipitate was dissolved in 10 ⁇ l of water and analyzed by time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.
  • MALDI-TOF time-of-flight
  • 2 ⁇ l of the analyzed solution is mixed on a mass spectrometric target in a 1: 1 ratio with a saturated solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid containing 50% acetonitrile and 0.5% trifluoroacetic acid.
  • the sample droplets obtained on the target are dried in air and mass spectrometric analysis is carried out in the mass range of peptides from 600 to 4000 Da.
  • trypsin as well as other proteases, leads to the release into the solution of fragments of the surface proteins of the tumor.
  • Surface tumor antigens fragments of surface proteins released under the influence of trypsin, which mainly include antigens suitable for antitumor immunotherapy, are used to vaccinate cancer patients. It should be noted that it is desirable to take a trypsin solution containing peptides cleaved from the cells until the cells are detached from the bottom of the culture vial, which will prevent cells from entering the sample and avoid the additional stage of sample purification.
  • the protease treatment conditions of the cells are determined experimentally for each type of tumor cells and the activity of the used protease, and can vary significantly from 0.0001% to 0.05% for the concentration of the protease, and from 30 seconds to 10 minutes for the processing time of the cells. In case of using trypsin with another activity, its concentration is directly proportional to the increase or decrease in activity.
  • the cells When treated with vital protease concentrations, the cells do not die, which makes it possible to repeat the process of processing the primary cell culture with trypsin.
  • the process of processing the primary culture of living tumor cells with trypsin is repeated many times at intervals of up to a day.
  • cells are incubated according to the protocol for culturing these cells (i.e., at 37 0 C in a CO 2 -incubate, in a growth medium with serum and necessary additives).
  • Accumulated surface tumor antigens are processed in accordance with the technology for producing a specific vaccine, namely, they can be cleaned, concentrated, analyzed for composition, as well as modified or mixed with adjuvants to increase immunogenicity.
  • the process of treating cells with a protease may be coupled with a process of passaging cells.
  • Trypsin solution can be prepared both in sterile physiological saline and in any suitable saline solution.
  • proteases for example, chymotrypsin, etc., can be used.
  • Desalting and concentration of glycosylated peptides for mass spectrometric analysis can be carried out by any suitable method, in particular liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC liquid chromatography
  • tumor cells can be obtained from biological fluids, such as blood, urine, cerebrospinal fluid, lymph, ascites and pleural fluids.
  • the patented method for producing an anti-tumor vaccine can be applied to any type of tumor cell culture, in particular, attached, suspension, cultured in a matrix and on substrates, to all variants of co-cultivation (co-cultivation) of cells, organotypic cultures and cell aggregates (granules, spheroids), as well to freshly isolated tumor cells and fragments of tumor tissue.
  • the invention is further illustrated by a second example of an antitumor vaccine and a method for its preparation using an attached primary human colon cancer cell culture.
  • a tissue fragment of a colon tumor obtained by surgical removal of the tumor is transferred to a sterile tube containing RPMI 1640 medium containing antibiotics and transported to a laboratory.
  • a medium containing tumor cells floating in it is pipetted and transferred to a new culture vial for further cultivation at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the growth medium is removed from the vial and the cells are washed three times with 0.9% sodium chloride solution or silane phosphate buffer, using a volume equal to at least half the volume of the growth medium poured into the culture vial. As a result of washing, traces of serum contained in the growth medium should be removed from the cells.
  • a 0.0001% trypsin solution (activity -3000 U / mg) is added to the cells using 1 ml of solution per 25 cm 2 of the surface of the culture vial.
  • Paragraphs I to 15 are repeated with an interval of one day to produce the necessary amount of antigens for vaccination.
  • the suitability of the generated antigens for vaccination is evaluated by mass spectrometry.
  • the number of cell protease treatments and the length of the intervals between them are controlled by analysis of the composition of the resulting antigenic mixture. If the antigenic composition begins to change, and the increase in the time between the treatment of the cells with a protease does not allow to obtain the initial antigenic composition corresponding to the freshly isolated tumor cells, then the cells are considered unsuitable for receiving the vaccine.
  • composition of the resulting antigenic mixture is controlled by mass spectrometry, as described above for the first example of the method.
  • any method suitable for this is used to isolate cells from the tumor tissue.
  • a protease to dissociate tumor tissue in order to release tumor cells, it is necessary to perform mass spectrometric analysis of surface antigens no earlier than one day after the initiation of the primary tumor culture.
  • the surface tumor antigens obtained according to this invention should be specific for the tumor of the cell donor.
  • cell cultivation significantly distorts the phenotype of the primary culture due to the impossibility of artificially reproducing ip vitro conditions under which tumor cells grew in the donor organism.
  • the composition of the resulting antigens is subject to mandatory control.
  • the following is an example of assessing the quality of antigens obtained according to a second embodiment of the invention.
  • a repeated (control) mass spectrometric analysis of the antigenic mixture reproduces at least 95% of the mass of glycosylated peptides, which can be considered a criterion for the identity of the two compared antigenic mixtures. It is proposed to evaluate the suitability of the antigens produced for vaccination according to this invention by the presence of at least 90% of the mass of glycosylated peptides common with freshly isolated tumor cells.
  • control of the antigenic composition during the cultivation process is carried out according to this invention, but without accumulating their quantity. For example, treatment with vital trypsin concentrations and mass spectrometric analysis 1-2 times a week during cell cultivation.
  • FIG. 2A shows the mass spectrum of surface antigens of the original tumor culture.
  • FIG. 2B shows the mass spectrum of the antigens suitable for vaccination and obtained according to the invention (the spectra in FIGS. 2A and 2B are identical).
  • FIG. 2B shows a mass spectrum of antigens also obtained according to this invention, but not suitable for vaccination (the spectra of FIGS. 2A and 2B are significantly different).
  • the arrows indicate the masses corresponding to the disappeared (in Fig. 2B) and newly appeared (in Fig. 2B) antigens.
  • FIG. ZA and ST show examples of breakdowns of the carbohydrate moieties of glycosylated peptides with masses of 1640 and 1480 Da with cleavage of fragments 162, 203, 291 Da, which corresponds to hexoses (mannose, glucose or galactose), acetylglucosamine and sialic acid, respectively.
  • Fragmentation of the amino acid sequence of the peptides allowed us to identify peptides from the variable and constant domains of the immunoglobulin heavy chain (which have the majority of CD antigens, histocompatibility complexes, T-cell receptor and cell adhesion molecules), low-density lipoprotein receptor, 1R- receptor interleukin 2, G-protein-bound receptor, the main histocompatibility complex of I and P.
  • immunoglobulin heavy chain which have the majority of CD antigens, histocompatibility complexes, T-cell receptor and cell adhesion molecules
  • low-density lipoprotein receptor 1R- receptor interleukin 2
  • G-protein-bound receptor the main histocompatibility complex of I and P.
  • ⁇ is an example of disintegration fragments, indicating b-ions for a doubly charged peptide weighing 857.4 Da with an established amino acid sequence corresponding to a fragment of a G-protein-bound receptor: He Cys Cys AIa Cyc Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys VaI Phe Arg 1 5 10 15
  • FIG. MH presents another example of fragments of the collapse of a singly charged peptide weighing 573.3 Da, indicating the b-ions, and with an established amino acid sequence corresponding to a fragment of the main histocompatibility complex of type 1 1:
  • the antigens obtained according to the invention is characterized in that (1) consist of water-soluble, mainly glycosylated, proteolytic (the sequence of which ends in lysine or arginine, in the case of trypsin as a protease) peptides, weighing from 1.2 to 4 kDa, (2) come from a single source - extracellular (extracellular) protein fragments of the outer plasma membrane of tumor cells, and (3) are obtained by exposing the cells to a protease in a vital concentration for them.
  • proteolytic the sequence of which ends in lysine or arginine, in the case of trypsin as a protease
  • the practical use of the mixture of tumor antigens obtained according to this invention is due to the identity of the amino acid sequences and modifications (glycosylation) of the peptides included in the mixture with protein fragments present on the surface of tumor cells. It is known that the onset of tumor disease is a consequence of the inability of the immune system to destroy the tumor cells formed in the body.
  • the accumulated and purified antigens mixed with an adjuvant enhancing the immune response are introduced into the human or animal body.
  • As a result of the cellular and humoral immune response of the body to the destruction of the introduced peptides existing and / or newly emerging in the body tumor cells are cross-destroyed, which determines the therapeutic and prophylactic effect of antitumor vaccination.
  • Tumor antigens were obtained by the method according to the first embodiment of the invention from a H22 hepatoma tumor cell culture. The resulting antigens were desalted by gel filtration on Sephadex G-IO and concentrated on a SredVac vacuum concentrator.
  • the results of a model experiment do not limit the successful use of the invention by animals, due to the identity of the mechanism of antitumor immunity in animals and humans.
  • the method of administration of antigen and its dose in terms of kilogram of weight remain valid in case of immunotherapy of a tumor in humans, however, the treatment regimen may be individual for each patient due to the severity of the course of the disease, stage of the tumor disease, variability of tumor cells, and the body's ability to express an immune response to the administered antigen, etc.
  • the following is an example of an anti-tumor vaccine and a method for conducting anti-tumor immunotherapy based on surface tumor antigens, manufactured according to the second embodiment of the invention, for conducting anti-tumor immunotherapy of a person.
  • the vaccine consists of 1 mg of a mixture of tumor antigens obtained according to the second embodiment of the invention, dissolved in 0.5 ml of silane phosphate buffer, mixed with 1 ml of adjuvant Montanide ISA-51 (adjuvant of Suptex based on water-in-oil emulsion containing squalene, Plynurik L121, Twin 80).
  • a single dose vaccine is administered to the patient subcutaneously for three weeks weekly and five months monthly.
  • the effectiveness of vaccination is assessed by the resulting tension of immunity in relation to the introduced tumor antigens.
  • the hypersensitivity reaction to the introduced antigens is evaluated according to the size of the redness that occurred at the injection site. In this case, the size of redness after the first injection is taken as the base value. An obvious increase in the hypersensitivity reaction during repeated vaccinations will indicate an antitumor immune response.
  • intravenous or intramuscular administration of a vaccine is possible, as well as administration of a vaccine without adjuvants.
  • Obtaining an immune response when using the claimed invention is provided through the use of a mixture of tumor antigens.
  • the multiplicity of peptides present in the vaccine makes it possible to obtain an immune response to all cells that have proteins with the same amino acid sequences on the surface.
  • the present invention can significantly increase the effectiveness of antitumor immunotherapy compared with known methods in which monovalent vaccines are used.
  • a vaccine enriched with tumor-specific antigens which are surface antigens of tumor cells.
  • tumor-specific antigens which are surface antigens of tumor cells.
  • This opportunity is created by treating tumor cells with a protease in a vital concentration for the cells.
  • the use of vital concentrations of the protease allows one to separate only the surface antigens of tumor cells and to avoid cell death, which entails the destruction of their plasma membranes, which leads to the entry of the contents of the cytoplasm into the vaccine, in particular, which are not of interest for vaccination of the mass of intracellular proteins.
  • an increase in the effectiveness of immunotherapy is achieved through the use of antigens obtained by accumulation from the primary culture of tumor cells.
  • Such a method of manufacturing an antitumor vaccine makes it possible to obtain antigens of practically unchanged composition with each exposure to the protease and to accumulate the amount of tumor antigens necessary for vaccination using primary cell culture.
  • the inclusion in the composition of the vaccine only specific for this tumor antigens is provided due to the ability to control the composition of the obtained antigens.
  • Such antigens may be present in known vaccines made using multiplied cells, since it is known that primary cell cultures, when propagated in vitro, change their antigenic composition. Therefore, the composition of antigens selected from multiplied cells may be different from the composition of a mixture of antigens obtained from isolated (not cultured) tumor cells.
  • the vaccines made according to the present invention can be autologous vaccines (obtained on the basis of tumor cells of the patient itself) or allowacines (based on the tumor cells of another patient).
  • the immunotherapy carried out according to the present invention is effective in both cases due to the presence of peptides having the same amino acid sequence on the surfaces of tumor cells of different patients.
  • the effect is more pronounced, since in this case the vaccine contains individual and stadiospecific antigens that distinguish the development of the tumor process in a particular patient.
  • the invention allows to obtain tumor antigens based on surface cell antigens and to carry out on their basis immunotherapy of cancer, namely vaccination.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯВАКЦИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫИ СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙИММУНОТЕРАПИИ
Область применения
Группа изобретений относится к медицинским технологиям, а именно, иммунотерапии онкологических больных, и может быть использована в медицине для терапии онкологических заболеваний и профилактики их рецидивов.
Предшествующий уровень техники
Ограниченные возможности лечения опухолевых заболеваний методами хирургии, химиотерапии и лучевой терапии делают актуальным поиск новых способов лечения онкологических больных. В частности, перспективным считается развитие методов иммунотерапии, принцип действия которой основывается на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в иммунитете человека.
Одним из эффективных способов иммунотерапии считается вакцинация, эффективность которой зависит от силы иммунного ответа, вызванного опухолевыми антигенами, либо входящими в состав вакцины, либо требующихся на различных стадиях их производства (например, вакцины на основе антиидиотипических антител, дендритных клеток и т.д.). Таким образом, получение опухолевых антигенов является необходимым условием создания противоопухолевых вакцин.
Известны различные способы получения противоопухолевой вакцины.
Некоторые вакцины изготавливают на основе отдельных антигенов опухолевой клетки (далее OK) — пептидов, белков теплового шока, полисахаридов и других веществ. В частности, известен способ получения пептидных опухолевых антигенов путем их синтеза. Так вакцина, состоящая из синтезированного пептида длиною в 9 аминокислот показала хорошие результаты при клинических испытаниях на пациентах с миелоидной лейкемией (Williаms R., "Наrпеssiпg thе Immuпе Sуstеm: Тhе Рrоmisе апd Роtепtiаl оf Сапсег Vассiпеs", ОпсоLоg, 2005, v.50, N°4). Другие пептиды показали неоднозначные результаты. К примеру, пептид из белка gрlОО показавший хорошие предварительные результаты, не смог вызвать достаточного иммунного ответа, чтобы противостоять развитию опухоли у пациентов (Yu Z., Rеstifо N. Р., "Сапсег Vассiпеs: Рrоgrеss Rеvеаls Nеw Соmрlехitiеs" J. Сliп. Iпvеst , 2002, v.ПО, 289- 294).
Известен способ использования в качестве антигенов, вызывающих иммунный ответ, углеводных антигенов опухоли. Однако, эффективность подобных антигенов была показана только при одиночных опухолевых клетках и ранних метастазах (Fгапсо А., "СТL-Ваsеd сапсег Рrеvепtivе/Тhеrареutiс Vассiпеs fог Саrсiпоmаs: RoIe оf Тumоur-Аssосiаtеd Саrbоhуdrаtе Апtigепs", Sсапd. J. Immuпоl., 2005, v.61, 391-397).
Следует отметить, что вакцины, основанные на определенных антигенах имеют существенный недостаток. Помимо того, что OK характеризуются множественностью своих антигенов, повышенная их мутационность и постоянно действующий в организме механизм отбора клеток приводят к появлению новых и изменению уже существующих антигенов OK. Таким образом очевидно преимущество использования аутовакцин (вакцин на основе OK самого пациента), которые содержат весь спектр антигенов, против которых вызывается иммунный ответ, в том числе индивидуальные и стадиоспецифические антигены, отличающие развитие опухолевого процесса у конкретного больного. Известен способ получения антигенов опухоли на основе экзосом. Экзосомы - это нанометровые мембранные везикулы, секретируемые многими типами клеток, в том числе опухолевыми клетками (см., например, Wоlfеrs J. еt аl., "Тumог-dегivеd ехоsоmеs аге а sоurсе оf shаrеd tumог геjесtiоп апtigепs fог CTL сrоss-рrimiпg". Nаt. Меd., 2001, v.7, 297-303), T и В лимфоцитами ("В lуmрhосуtеs sесrеtе апtigеп-рrеsепtiпg vеsiсlеs". J. Ехр. Меd., 1996, v.183, 1161-1172) и дендритными клетками (Zitvодеl L. еt аl., "Еrаdiсаtiоп оf еstаblishеd muriпе tumоrs usiпg а поvеl сеll-fгее vассiпе: dепdгitiс сеll- dеrivеd ехоsоmеs". Nаturе Меd., 1998, v.4, 594-600).
Недостатком указанного способа является невысокий уровень обогащения экзосом поверхностными белками, являющимися потенциальными антигенами для иммунотерапии. Известно, что экзосомы содержат в основном цитозольные белки и белки эндосомальных компартаментов (см., например, статью "Ехоsоmеs: соmроsitiоп, biоgепеsis апd fuпсtiоп", Rеviеws Immuпоlоgу, 2002, v.2, 569-579). Вторым известным недостатком способа является продолжительное время накопления экзосом, что требует нахождения OK в ростовой среде и ведет к необходимости очищать полученные антигены от компонентов ростовой среды.
Известен способ получения противоопухолевой вакцины, который основан на введении в организм вместо антигенов опухоли кодирующей их ДНК. Антиген- представляющие клетки поглощают ДНК, продуцируют опухолевый антиген и затем представляют его на клеточной поверхности в комплексе с главным комплексом гистосовместимости, уже способным активировать цитотоксические T лимфоциты. Так, хорошие результаты были получены на моделях животных, используя вакцины основанные на вирусных векторах (см. более подробно, например, Yu Z., Rеstifо N. Р., "Сапсег Vассiпеs: Рrоgrеss Rеvеаls Nеw Соmрlехitiеs" J. CHn. Iпvеst, 2002, v.110, 289- 294).
Недостатком указанного способа является вызываемая реакция иммунной системы на сами вирусные векторы, что приводит к отсутствию явно положительных результатов противоопухолевой вакцинации на людях. Известен способ получения противоопухолевой вакцины, который предполагает использование в качестве антигенов целых опухолевых клеток как от самого пациента (аутовакцины), так и других пациентов (алловакцины). Клетки предварительно инактивируют ионизирующим излучением. Преимуществом данных вакцин является отсутствие необходимости идентификации и выделения конкретных антигенов. Так клетки, смешанные с БСЖ в качестве адъюванта, были использованы против колоректального рака, меланомы и карциномы почки (см. Аrmstгопg A.C., Eaton D., Еwiпg J.C., "Сеllulаr Immшюthеrару fоr Сапсег", Вrit. Меd. J., 2001, v. 3323, 1289-1293).
Недостатками указанного способа являются необходимость инактивации опухолевых клеток и плохая пригодность антигенов, расположенных на поверхности целых опухолевых клеток, для фагоцитирования и процессинга антиген- пред ставляющими клетками.
Из патента США US 6039941 (МПК C12N15/09, A61K31/00, опубл. 21.03.2000) известен способ получения противоопухолевой вакцины из OK с повышенной иммуногенностью, полученной путем введения генно-инженерным способом генов, кодирующих поверхностные белки с иммуностимулирующей активностью.
Недостатками указанного способа являются, во-первых, необходимость инактивации опухолевых клеток, во-вторых, антигены на поверхности опухолевых клеток плохо пригодны для фагоцитирования и процессинга антиген- представляющими клетками.
Из международной заявки WO02053176 (МПК A61K39/00; C12N5/06; A61K39/00; C12N5/06 опубл. 11.07.2002) известен способ получения противоопухолевой вакцины на основе лизатов культивированных OK. Преимуществом этих вакцин является то, что они не требуют инактивации облучением, а дезагрегированные антигены клеток более пригодны, нежели интактные OK, для фагоцитирования и процессинга антиген-представляющим клетками, что может приводить к более выраженному иммунному ответу. Недостатком указанного способа является то, что основную массу лизата OK составляют внутриклеточные белки, и вызываемый на них иммунный ответ не обладает противоопухолевой активностью, т.к внутриклеточные белки опухолевых клеток недоступны для иммунной системы.
Наиболее близким аналогом заявленного способа является способ получения противоопухолевой вакцины, раскрытый в патенте США US 5993829 (МПК A61P 35/00, C07K14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные способы, включающие культивирование опухолевых клеток с выделением их поверхностных антигенов, также описаны в патентах US 6338853 (МПК A61P 35/00, C07K14/47, опубл. 15.01.2002), US 5030621 (опубл. 09.07.1991), US 5635188 (опубл. 3.06.1997).
Известный способ предусматривает культивирование опухолевых клеток в безсывороточной ростовой среде и выделение из ростовой среды клеточных поверхностных антигенов, которые опухолевые клетки теряют в процессе своего культивирования. После очистки собранные антигены используют в качестве антигенов противоопухолевой вакцины. Преимуществом подобных вакцин является высокое содержание опухолевых антигенов с поверхности клеток, которые являются доступными (не спрятаны внутри клетки) для действия иммунной системы. Недостатками известного способа являются:
- низкая продуктивность получения антигенов ввиду спонтанной, без каких либо воздействий, потери их культивируемыми OK.
- получение материала с низким содержанием целевого продукта (антигенов) и большим количеством примесей, вследствие того, что процесс накопления антигенов предусматривает многочасовую инкубацию OK в ростовой среде (например, инкубация в течение 3 часов в среде RPMI- 1640 описана в патенте US
6338853), что подразумевает попадание антигенов в ростовую среду, содержащую более 40 компонентов (аминокислоты, соли, буфер, витамины, глюкоза и т.д.), а так же продукты метаболизма и другие вещества, выделяемые OK в процессе культивирования.
- анализ состава получаемой смеси антигенов требует предварительной очистки препарата от компонентов ростовой среды и продуктов жизнедеятельности клеток.
- получение необходимой для вакцинации дозы антигенов подразумевает размножение OK продолжительным культивированием, что ведет к искажению состава получаемой антигенной смеси и снижению эффективности вакцинации.
- достаточное для вакцинации количество антигенов по известному способу могут быть получены только в процессе культивирования опухолевых клеток, т.е. получение антигенов из изолированных (без культивирования) клеток по данному способу невозможно. - высокая стоимость вакцины, которая определяется длительностью культивирования OK и наличием стадии очистки поверхностных опухолевых антигенов.
Известны также различные противоопухолевые вакцины на основе смеси отдельных антигенов, антигенов и различных иммуностимулирующих веществ. Из международной заявки WO2004012685 (МПК A61K39/00, опубл.
12.02.2004) известна противоопухолевая вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов теряемых клеткой в процессе культивирования. Изготовление известной вакцины подразумевает возможность ускорения процесса выделения клетками антигенов в ростовую среду различными воздействиями, что может несколько повысить эффективность создания вакцины. Однако данной вакцине так же присущи недостатки вакцин, получаемые при культивировании OK в безсывороточной ростовой среде.
Наиболее близким аналогом заявленной противоопухолевой вакцины является вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов, раскрытая в патенте США
US 5993829 (МПК A61P 35/00, C07K14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные вакцины также описаны в патентах US 6338853 (МПК A61P 35/00, C07K14/47, опубл.
15.01.2002), US 5030621 (опубл. 09.07.1991), US 5635188 (опубл. 3.06.1997). Основным недостатком известной вакцины является ее высокая стоимость, которая определяется длительностью культивирования OK и наличием стадии очистки антигенов, как уже было указано выше.
Известны также различные способы проведения противоопухолевой иммунотерапии.
Известны способы проведения противоопухолевой иммунотерапии моновалентными вакцинами, включающие введение в организм определенных опухолевых антигенов. К ним, например, относятся вакцины на основе синтетических пептидов, белков теплового шока, полисахаридов и других веществ. Указанные способы раскрыты, в частности, в патентах WO2005083074 (МПК A61KЗ 1/7088; A61P35/00; C07K7/06, опубл. 09.09.2005) и RU2271831 (A61K39/385; A61K39/39; A61K51/00, опубл. 20.03.2006).
Недостатком указанных способов иммунотерапии является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета, ввиду того, что определенные антигены не являются специфичными для опухоли конкретного больного, так как были выявлены статистически в опухолях определенного вида.
Известен способ проведения противоопухолевой терапии, включающий введение в организм целых инактивированных опухолевых клеток, а также целых опухолевых клеток с повышенной иммуногенностью (см., например, патент US 6039941, МПК C12N15/09, A61K31/00, опубл. 21.03.2000).
Недостатком указанного способа иммунотерапии является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунного ответа, ввиду того, что антигены на поверхности целых опухолевых клеток мало пригодны для фагоцитирования и последующего процессинга антиген-представляющими клетками. Также данный способ подразумевает размножение клеток iп vitrо для достижения необходимой для вакцинации дозы антигена, что ведет к изменению антигенного состава опухолевых клеток и снижению эффективности иммунотерапии.
Из международной заявки WO02053176 (МПК A61K39/00; C12N5/06; A61K39/00; C12N5/06, опубл. 11.07.2002) известен способ проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающий введение в организм клеточных лизатов опухолевых клеток. Недостатком указанного способа вакцинации является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета. В данном случае вакцина помимо поверхностных антигенов опухоли, отвечающих за специфичность иммунного ответа, содержит внутриклеточные белки, составляющие основную часть лизата. Таким образом, происходит иммунизация к массе балластных белков и "размывание" опухолеспецифичности иммунного ответа. Также данный способ подразумевает размножение клеток iп vitrо для достижения необходимой для вакцинации дозы антигена, что ведет к изменению антигенного состава опухолевых клеток и, как следствие, снижению эффективности иммунотерапии. Известны способы на основе комбинации отдельных опухолевых антигенов, а так же антигенов и различного рода иммуностимуляторов.
Наиболее близким аналогом заявленного способа проведения противоопухолевой иммунотерапии, является способ, раскрытый в патенте США US
5993829 (MIlK A61P 35/00, C07K14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные способы также описаны в патентах US 6338853 (МПК A61P 35/00, C07K14/47, опубл.
15.01.2002), US 5030621 (опубл. 09.07.1991), US 5635188 (опубл. 3.06.1997),
WO2004012685 (МПК A61K39/00, опубл. 12.02.2004). Способ включает введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси антигенов, представляющих собой фрагменты поверхностных белков опухолевых клеток спонтанно потерянных клеткой в процессе культивирования в безсывороточной ростовой среде.
К недостатком известного способа можно отнести слабую специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета. Данный способ подразумевает использование продолжительно культивируемых OK, что приводит к изменению их антигенного состава и снижению эффективности вакцины. Второй недостаток - это относительно высокая стоимость способа, определяемая временем культивирования клеток и необходимостью очистки получаемых антигенов от компонентов ростовой среды.
Раскрытие изобретения
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемой группы изобретений, заключается в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний за счет усиления противоопухолевого иммунного ответа. Данный технический результат обеспечивается при использовании противоопухолевой вакцины на основе поверхностных опухолевых антигенов. Согласно настоящему изобретению вакцина содержит смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения противоопухолевая вакцина может быть получена при воздействии трипсина, выбранного в качестве протеазы.
Указанный технический результат достигается также при реализации способа получения противоопухолевой вакцины, включающего культивирование опухолевых клеток с выделением поверхностных опухолевых антигенов. Согласно настоящему изобретению предварительно отмытую от ростовой среды первичную культуру живых опухолевых клеток подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные опухолевые антигены, при этом обработку первичной культуры живых опухолевых клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных опухолевых антигенов, аккумулируют поверхностные опухолевые антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют состав полученных поверхностных опухолевых антигенов.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин.
Указанный технический результат достигается также при реализации способа проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающего введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой пептиды, полученные из поверхностных белков опухолевых клеток. Согласно настоящему изобретению используют смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
В предпочтительном варианте реализации способа в качестве протеазы используют трипсин. Для получения более специфичного иммунного ответа используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток самого пациента.
В других вариантах реализации изобретения используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток другого пациента.
В предпочтительном варианте реализации способа в составе противоопухолевой вакцины используют адъюванты.
Краткое описание чертежей
Далее группа изобретений поясняется конкретными примерами реализации и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:
На фиг. 1 - схема осуществления способа получения противоопухолевой вакцины.
На фиг. 2 - масс-спектр поверхностных антигенов, полученных согласно второму варианту реализации изобретения с первичной культуры опухолевых клеток (А); масс-спектр поверхностных антигенов полученный с той же культуры клеток после полной репарации поверхностных антигенов и повторной их обработки протеазой (Б); масс-спектр полученный с той же культуры клеток после частичной репарации поверхностных антигенов после предшествующей обработки их протеазой
(В). На фиг. 3 - масс-спектры фрагментации поверхностных антигенов, полученных согласно данному изобретению.
На фиг. ЗА, ЗБ - спектры CID фрагментации углеводной части антигенов.
На фиг. ЗВ, ЗГ - спектры CID фрагментации пептидной последовательности антигенов с определением b/у ионов.
На фиг. 4 - кривая выживаемости мышей с привитой опухолью H22 и вакцинированных пептидной смесью. На фиг. 1 приведена общая схема способа получения противоопухолевой вакцины.
Лучшие варианты осуществления изобретения
Ниже представлен первый пример реализации способа получения противоопухолевой вакцины против привитой мышам опухоли гепатомы человека H22. Для получения вакцины используется та же культура клеток H22.
1. Ростовую среду удаляют из флакона с культурой клеток H22 и трижды промывают монослой клеток стерильным физиологическим раствором, используя объем равный половине ростовой среды. Промывку осуществляют не менее 3-х раз до удаления остатков ростовой среды. Следующим и ключевым этапом является обработка витальной для клеток концентрацией протеазы, в качестве которой выбирают трипсин (активность -3000 Ед/мг).
2. Добавляют к монослою клеток 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл р- ра на 25 см2 поверхности культурального флакона. 3. Инкубируют флакон при 370C. Между пятой и седьмой минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены.
4. К клеткам добавляют свежеприготовленную ростовую среду, содержащую сыворотку (обычно 10%), и продолжают их культивирование. 5. Для наработки массы антигенов с интервалом в сутки повторяют пункты 2-4.
6. Для оценки пригодности нарабатываемых антигенов проводят их масс- спектрометрический анализ.
7. Наработанные антигены используют для создания вакцины.
Масс-спектрометрический анализ проводят следующим образом. 140 мкл раствора антигенов смешивают со 140 мкл этанола, 720 мкл бутанола и добавляют 15 мкл сефарозы CL4B. Инкубируют при медленном перемешивании 45 мин. После инкубации сефарозу дважды промывают раствором с тем же содержанием спирта и бутанола и инкубируют 30 мин в 50%-oм растворе этанола. Раствор этанола отбирают от сефарозы и высушивают на роторном испарителе. Полученный осадок растворяют в 10 мкл воды и анализируют времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрией. 2 мкл анализируемого раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1 :1 с насыщенным раствором 2,5-дигидpoкcибeнзoйнoй кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 600 до 4000 Да.
Известно, что большинство опухолевых антигенов, представляющих интерес для получения вакцины, находятся на поверхности опухолевых клеток (см., например, обзор "Апtitumоr vассiпаtiоп: whеге wе stапd", Неmаtоlоgiса, 2000, v.85, 1172-1206). Обработка первичной культуры клеток витальным воздействием трипсина приводит к отщеплению фрагментов белков с поверхности клеток (см. Lоkhоv P. G., Аrсhаkоv A.I., "Ргоtеоmiс fооtрriпtiпg: а mеthоd fог сеlls рrоfϊliпg bу diгесt mаss-sресtrоmеtrу", тезисы HUPO 5th Аппuаl Wоrld Сопgrеss, 2006, аbstrасt JVs 1201). Таким образом, согласно данному изобретению, действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор фрагментов поверхностных белков опухоли. Высвободившиеся под воздействием трипсина поверхностные опухолевые антигены (фрагменты поверхностных белков), к которым в основном и относятся пригодные для противоопухолевой иммунотерапии антигены, используют для вакцинации онкологических больных. Следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток пептиды, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна кульτурального флакона, что позволит предотвратить попадание клеток в пробу и избежать дополнительной стадии очистки пробы.
Условия обработки протеазой клеток определяют экспериментально для каждого типа опухолевых клеток и активности используемой протеазы, и могут существенно варьировать от 0,0001% до 0,05%, для концентрации протеазы, и от 30 секунд до 10 минут для времени обработки клеток. В случае использования трипсина с другой активностью, концентрацию его меняют прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.
Клетки при обработке витальными концентрациями протеазы не погибают, что дает возможность повторять процесс обработки первичной культуры клеток трипсином. Для получения необходимой для вакцинации дозы поверхностных опухолевых антигенов, процесс обработки первичной культуры живых опухолевых клеток трипсином повторяют многократно с интервалами до суток. При этом в интервалах между воздействием трипсином клетки инкубируют согласно протоколу культивирования данных клеток (т.е. при 370C в CO2-инкyбaтope, в ростовой среде с сывороткой и необходимыми добавками).
Аккумулированные поверхностные опухолевые антигены обрабатывают в соответствии с технологией получения конкретной вакцины, а именно, их могут очищать, концентрировать, анализировать на предмет состава, а так же модифицировать или смешивать с адъювантами для увеличения иммуногенности. В других вариантах реализации изобретения процесс обработки клеток протеазой может быть сопряжен с процессом пассирования клеток.
Раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом растворе.
Вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например, химотрипсин и т.д.
В случае использования суспензии опухолевых клеток необходимо перед забором антигенов клетки осадить на дно, например центрифугированием, или использовать любой другой подходящий способ. Указанный анализ состава антигенов, полученных согласно первому варианту реализации изобретения, проводят по протоколу масс-спектрометрии гликозилированных пептидов (M. Таjiri еt аl., "Diffеrепtiаl апаlуsis оf sitе-sресifiс glусапs on рlаsmа апd сеllulаг fϊbrопесtiпs: аррliсаtiоп оf а hуdгорhiliс аffiпitу mеthоd fог glусорерtidе епriсhmепt". Glусоbiоlоgу, 2005, v. 15, 1332-1340). Это объясняется с одной стороны тем, что внеклеточные фрагменты белков как правило гликозилированы, с другой стороны, именно гликозилированные пептиды являются наиболее иммуногенными и представляют интерес в качестве антигенов вакцины (см., например, Franco A., "СТL-Ваsеd сапсеr Рrеvепtivе/Тhеrареutiс Vассiпеs fог Саrсiпоmаs: RoIe оf Тumоuг-Аssосiаtеd Сагbоhуdгаtе Апtigепs", Sсапd. J. Immuпоl., 2005, v.61, 391-
397).
Обессоливание и концентрирование rликозилированных пептидов для масс- спектрометрического анализа можно осуществлять любым подходящим для этого способ, в частности жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
В других вариантах реализации опухолевые клетки могут быть получены из биологических жидкостей, таких как кровь, моча, ликвор, лимфа, асцитная и плевральная жидкости.
Патентуемый способ получения противоопухолевой вакцины может применяться к любым типам культур опухолевых клеток, в частности прикрепленным, суспензионным, культивированным в матриксе и на подложках, ко всем вариантам совместного культивирования (сокультивирования) клеток, органотипным культурам и клеточным агрегатам (гранулы, сфероиды), а также к свежевыделенным опухолевым клеткам и фрагментам опухолевой ткани.
Далее изобретение поясняется вторым примером противоопухолевой вакцины и способа ее получения с использованием прикрепленной первичной культуры опухолевых клеток рака толстого кишечника человека.
1. Фрагмент ткани опухоли толстого кишечника, полученный в результате хирургического удаления опухоли, переносят в стерильную пробирку со средой RPMI 1640, содержащую антибиотики, и транспортируют в лабораторию.
2. Переносят ткань опухоли в стерильных условиях в чашку Петри и механически удаляют участки некроза, сгустки крови, а так же остатки жировой и соединительной ткани.
3. Осторожно ножницами размельчают ткань опухоли на маленькие фрагменты.
4. Диссоциируют фрагменты опухолевой ткани до мелких клеточных агрегатов энергичным пипетированием в 10 мл фосфатного буфера силана. 5. Дают оставшимся крупным фрагментам ткани осесть на дно пробирки.
6. Осторожно забирают пипеткой клеточные агрегаты, оставшиеся плавать в растворе, и переносят в новую пробирку. 7. Центрифугируют пробирку при 400 g в течение 5 мин и удаляют супернатант. Осадок, содержащий клеточные агрегаты ресуспендируют в ростовой среде RPMI 1640 со следующими добавками: 20 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферина, 50 нМ гидрокортизона, 1 нг/мл эпидермального ростового фактора, 10 мкМ этаноламина, 10 мкМ фосфоэтаноламина, 100 пМ трийодтиронина, 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ глютамина, и 0,5 мМ пирувата натрия, 5 % фетальной бычьей сыворотки, и затем переносят в 25 см флакон для дальнейшего культивирования клеток.
8. Культивируют при 370C и 5% CO2. 9. Для изоляции опухолевых клеток от стромальных клеток, культуральный флакон несколько секунд прижимают к вибрационной мешалке. Опухолевые клетки ввиду плохих адгезивных способностей открепляются и переходят в ростовую среду.
10. Забирают пипеткой среду содержащую плавающие в ней опухолевые клетки и переносят в новый культуральный флакон для дальнейшего культивирования при 370C и 5% CO2.
11. При достижении опухолевыми клетками 80%-oй конфлюентности удаляют из флакона ростовую среду и трижды промывают клетки 0,9%-ым раствором хлорида натрия или фосфатным буфером силана, используя объем равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. В результате промывки с клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде.
12. Добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина (активность -3000 Ед/мг), используя 1 мл р-ра на 25 см2 поверхности культурального флакона.
13. Инкубируют флакон при 370C. Между 5-ой и 7-ой минутами инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены. Опухолевые клетки в момент отбора раствора должны быть прикреплены ко дну культурального флакона. Если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то раствор центрифугуют при 400 g в течение 5 мин и используют супернатант свободный от примеси клеток.
14. Для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе необходимо добавить во флакон свежеприготовленную культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку и продолжить культивирование клеток при 370C и 5% CO2. 15. Раствор, полученный в пункте JVbI 3, концентрируют на вакуумном концентраторе при 450C. Предварительно раствор можно обессолить любым подходящим для этого способом, например обратнофазовой хроматографии, гель фильтрацией и т.д. Для удаления остатков трипсина также можно раствор предварительно отфильтровать через фильтр, пропускающий пептиды массой менее 4 кДа.
16. Пункты с И по 15 повторяют с интервалом в одни сутки для наработки необходимого для вакцинации количества антигенов. Пригодность нарабатываемых антигенов для вакцинации оценивают масс-спектрометрически.
Количество обработок клеток протеазой и длительность интервалов между ними контролируют анализом состава получаемой антигенной смеси. Если антигенный состав начинает меняться, и увеличение времени между обработкой клеток протеазой не позволяет получить изначальный, соответствующей свежевыделенным опухолевым клеткам, антигенный состав, то клетки считают непригодными для получения вакцины.
Контроль состава получаемой антигенной смеси осуществляют масс- спектрометрически, как описано выше для первого примера реализации способа.
Для выделения клеток из опухолевой ткани используют любой пригодный для этого способ. В случае использования протеазы для диссоциации ткани опухоли, с целью высвобождения опухолевых клеток, необходимо проводить масс- спектрометрический анализ поверхностных антигенов не раньше чем через сутки после инициации первичной опухолевой культуры.
Поверхностные опухолевые антигены, получаемые согласно данному изобретению, должны быть специфичны для опухоли донора клеток. Однако культивирование клеток существенно искажает фенотип первичной культуры по причине невозможности искусственного воссоздания iп vitrо условий, при которых росли опухолевые клетки в организме донора. Таким образом, состав получаемых антигенов подлежит обязательному контролю. Ниже представлен пример оценки качества антигенов, получаемых согласно второму варианту реализации изобретения. Согласно полученным данным, при повторном (контрольном) масс- спектрометрическом анализе антигенной смеси воспроизводится не менее 95% масс гликозилированных пептидов, что можно считать критерием идентичности двух сравниваемых антигенных смесей. Предлагается оценивать пригодность антигенов, нарабатываемых для вакцинации согласно данному изобретению, по наличию не менее 90% масс гликозилированных пептидов общих со свежевыделенными опухолевыми клетками.
Из имеющихся экспериментальных данных известно, что культивирование клеток опухоли прямой кишки позволяет получать пригодные для вакцинации антигены только при использовании 1-го, изредка 2-го пассажа клеток, при условии проведения пассирования через три-четыре дня. При этом не исключается, что добавление в ростовую среду тех или иных ингредиентов, сохраняющих фенотип клеток, может увеличить количество пассажей, пригодных для получения антигенов вакцины.
В случае если не удалось выделить из ткани опухоли достаточного количества клеток, необходимо их размножить культивированием до нужного количества, при этом обязательным является контроль изменчивости поверхностных антигенов в процессе культивирования клеток. Контроль антигенного состава в процессе культивирования проводят согласно данному изобретению, но без наработки их количества. Например, обработка витальными концентрациями трипсина и масс- спектрометрический анализ 1-2 раза в неделю в процессе культивирования клеток.
Идентичность антигенов опухоли и антигенов вакцины обеспечивает специфичность вызываемого вакциной иммунного ответа против опухоли. Сравнение масс-спектров антигенов исходной опухоли и нарабатываемых согласно данному изобретению антигенов позволяет контролировать подобную идентичность. На фиг. 2A представлен масс-спектр поверхностных антигенов исходной опухолевой культуры. На фиг. 2Б представлен масс-спектр пригодных для вакцинации и полученных согласно данному изобретению антигенов (спектры на фиг. 2A и 2Б идентичны). На фиг. 2В представлен масс-спектр так же полученных согласно данному изобретению, но не пригодных для вакцинации антигенов (спектры фиг. 2A и 2В существенно отличаются). Стрелками указаны массы соответствующие исчезнувшим (на фиг. 2Б) и вновь появившимся (на фиг. 2В) антигенам. Таким образом, контролируя состав пептидов, можно нарабатывать необходимое для вакцинации количество антигенов, вызывающих специфичный иммунный противоопухолевый ответ.
Для подтверждения (не требуется для реализации изобретения) происхождения антигенов из поверхностных белков опухолевых клеток, были получены спектры их фрагментации, примеры которых представлены на фиг. 3.
Для этого пробы, полученные в процессе инкубации клеток с трипсином, обессоливали, применяя наконечники для автоматических пипеток с обращенной фазой ZipTipci8 (Мilliроrе Соrр., США), в соответствии с протоколом производителя, и наносили на масс-спектрометрическую мишень с матрицей, как описано выше. Масс- спектры снимали в режиме фрагментации ионов. Идентификация белков осуществляли поисковой системой Маsсоt (МаtriхSсiепсе, США) по таксону Ноmо sарiепсе базы белковых последовательностей NCBI (США) с использованием масс b и у ионов (sеqиепсе-tаg метод) и/или установленным аминокислотным последовательностям (dе поvо метод).
На фиг. ЗА и ЗБ показаны примеры развалов углеводных частей гликозилированных пептидов с массами 1640 и 1480 Да с отщеплением фрагментов 162, 203, 291 Да, что соответствует гексозам (манноза, глюкоза или галактоза), ацетилглюкозамину и сиаловой кислоте, соответственно. Фрагментация аминокислотной последовательности пептидов позволила по массам фрагментов идентифицировать в антигенной смеси пептиды из вариабельного и константного доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (которые имеют большинство CD антигенов, комплексы гистосовместимости, Т-клеточный рецептор и молекулы адгезии клеток), рецептора липопротеидов низкой плотности, рецептора интерлейкина 1R-2, G- протеинсвязанного рецептора, главного комплекса гистосовместимости I и П. На фиг. ЗВ представлен пример фрагментов развала, с указанием b-у ионов, для двухзарядноrо пептида массой 857,4 Да с установленной аминокислотной последовательностью, соответствующей фрагменту G-протеинсвязанного рецептора: He Cys Cys AIa Cyc Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys VaI Рhе Аrg 1 5 10 15
На фиг. ЗГ представлен другой пример фрагментов развала однозарядного пептида массой 573,3 Да, с указанием b-у ионов, и с установленной аминокислотной последовательностью, соответствующей фрагменту главного комплекса гистосовместимости типа 1 1 :
AIa VaI Luе Asn Аrg 1 5
Таким образом, получаемые согласно изобретению антигены характеризуется тем, что (1) состоят из водорастворимых, преимущественно гликозилированных, протеолитических (последовательность которых оканчивается на лизин или аргинин, в случае использования трипсина в качестве протеазы) пептидов, массой от 1,2 до 4 кДа, (2) происходят из единого источника - экстрацеллюлярных (внеклеточных) фрагментов белков внешней плазматической мембраны опухолевых клеток, и (3) получаются путем воздействия на клетки протеазой в витальной для них концентрации.
Практическое применение смеси опухолевых антигенов, получаемой согласно данному изобретению, обусловлено идентичностью аминокислотных последовательностей и модификаций (гликозилирования) входящих в смесь пептидов с фрагментами белков, представленных на поверхности опухолевых клеток. Известно, что возникновение опухолевого заболевания является следствием неспособности иммунной системы уничтожать образующиеся в организме опухолевые клетки. Накопленные и очищенные антигены, смешанные с усиливающим иммунный ответ адъювантом, вводят в организм человека или животного. В результате клеточного и гуморального иммунного ответа организма на уничтожение введенных пептидов, перекрестно уничтожаются имеющиеся и/или вновь возникающие в организме опухолевые клетки, что и определяет лечебный и профилактический эффект противоопухолевой вакцинации. Для получения полноценного иммунного ответа применяют повторные инъекции антигенов. Для подтверждения противоопухолевой активности вакцины, полученной согласно данному изобретению, был поставлен модельный эксперимент на подопытных мышах, 20-ти самцах породы ВАLВ/с примерно одного возраста и веса (10 животных в экспериментальной и 10 в контрольной группах). Опухолевые антигены были получены способом согласно первому варианту реализации изобретения с культуры опухолевых клеток гепатомы H22. Полученные антигены были обессолены гельфильрацией на сефадексе G-IO и сконцентрированы на вакуумном концентраторе SрееdVас.
Инъекцию антигенов в количестве 150 мкг вводили подкожно, предварительно смешав в соотношении 1 :1 (об/об) с полным адъювантом Фрейнда. Повторные иммунизации проводили в течение 3 недель (по одной инъекции в неделю) с применением неполного адъюванта Фрейнда. Животным контрольной экспериментальной группы вводили в эквивалентном объеме и по той же схеме, как и в эксперименталной группе, смешанный с физиологическим раствором адъювант Фрейда. После четвертой иммунизации мышам была привита опухоль подкожным введением 1 млн опухолевых клеток гепатомы H22. В течение трех месяцев отслеживали выживаемость животных в экспериментальной и контрольной группах. Полученная кривая выживаемости (см. Фиг. 4) подтвердила наличие противоопухолевой активности антигенов, полученных согласно данному изобретению.
Следует отметить, что результаты модельного эксперимента не ограничивают успешное применение изобретения животными, ввиду идентичности механизма противоопухолевого иммунитета у животных и человека. Способ введения антигена и его доза в пересчете на килограмм веса сохраняют силу в случае иммунотерапии опухоли у человека, однако схема лечения может быть индивидуальна для каждого больного ввиду тяжести протекания заболевания, стадии опухолевого заболевания, изменчивости опухолевых клеток, способности организма к выраженному иммунному ответу на введенный антиген и т.д.
Ниже приведен пример противоопухолевой вакцины и способа проведения противоопухолевой иммунотерапии на основе поверхностных опухолевых антигенов, изготовленной согласно второму варианту реализации изобретения, для проведения противоопухолевой иммунотерапии человека.
Вакцина состоит из 1 мг смеси опухолевых антигенов, полученных согласно второму варианту реализации изобретения, растворенных в 0,5 мл фосфатного буфера силана, смешанных с 1 мл адъюванта Монтанид ISA-51 (адъювант фирмы Sупtех на основе водно-маслянной эмульсии, содержащий сквален, Плюнорик L121, Твин 80).
Вакцину по одной дозе вводят пациенту подкожно в течение трех недель еженедельно и пяти месяцев ежемесячно. Эффективность вакцинации оценивается по возникшей напряженности иммунитета в отношении вводимых опухолевых антигенов. На 2-3-й день после инъекции оценивают реакцию гиперчиствительности к введенным антигенам по размеру покраснения, возникшего в месте их введения. При этом за базовое значение берется размер покраснения после первой инъекции. Очевидное усиление реакции гиперчувствительности при повторных вакцинациях укажет на возникший противоопухолевый иммунный ответ.
В других вариантах реализации способа проведения противоопухолевой иммунотерапии возможно внутривенное или внутримышечное введение вакцины, а так же введение вакцины без адъювантов.
Получение иммунного ответа при использовании заявленного изобретения обеспечивается за счет использования смеси опухолевых антигенов. Множественность пептидов, присутствующих в вакцине, обеспечивает возможность получения иммунного ответа ко всем клеткам, которые имеют на поверхности белки с теми же аминокислотными последовательностями.
Таким образом, настоящее изобретение позволяет многократно увеличить эффективность противоопухолевой иммунотерапии по сравнению с известными способами, в которых применяются моновалентные вакцины. При использовании настоящей группы изобретений обеспечивается возможность проведения противоопухолевой иммунотерапии с использованием вакцины, обогащенной специфичными для опухоли антигенами, являющимися поверхностными антигенами опухолевых клеток. Данная возможность создается за счет обработки опухолевых клеток протеазой в витальной для клеток концентрации. Использование витальных концентраций протеазы позволяет отделять только поверхностные антигены опухолевых клеток и избегать гибели клеток, влекущей за собой разрушение их плазматических мембран, что ведет к попаданию в вакцину содержимого цитоплазмы, в частности, не представляющих интереса для вакцинации массы внутриклеточных белков. Данный факт приводит к снижению доли специфичных для опухоли антигенов в известных вакцинах, "размыванию" иммунного ответа и, как следствие, снижению его специфичности в отношении именно опухолевых антигенов. Таким образом, использование вакцины, обогащенной опухолевыми антигенами, изготовленной согласно настоящему изобретению, позволяет повысить эффективность противоопухолевой иммунотерапии.
Кроме этого повышение эффективности иммунотерапии достигается за счет использования антигенов, полученных аккумулированием с первичной культуры опухолевых клеток. Такой способ изготовления противоопухолевой вакцины позволяет получить при каждом воздействии протеазы антигены практически неизменного состава и накапливать с использованием первичной культуры клеток необходимое для вакцинации количество опухолевых антигенов. Включение в состав вакцины только специфичных для данной опухоли антигенов обеспечивается за счет возможности контроля состава полученных антигенов.
При этом исключается вероятность попадания в состав вакцины антигенов, не являющихся специфичными для данной опухоли. Такие антигены могут присутствовать в составе известных вакцин, изготовленных с использованием размноженных клеток, поскольку известно, что первичные культуры клеток при размножении iп vitrо меняют свой антигенный состав. Поэтому состав антигенов, отобранных от размноженных клеток, может быть отличен от состава смеси антигенов, полученных с изолированных (не культивированных) опухолевых клеток.
Вакцины, изготовленные согласно настоящему изобретению могут представлять собой аутовакцины (полученные на основе опухолевых клеток самого пациента) или алловакцинами (на основе опухолевых клеток другого пациент). Иммунотерапия, проведенная согласно настоящему изобретению, эффективна в обоих случаях ввиду наличия на поверхностях опухолевых клеток различных пациентов пептидов, имеющих одинаковые последовательности аминокислот.
Вместе с тем при использовании аутовакцин, полученных согласно настоящему изобретению, эффект более выражен, поскольку в этом случае вакцина содержит индивидуальные и стадиоспецифические антигены, отличающие развитие опухолевого процесса у конкретного больного.
Промышленная применимость
Таким образом, изобретение позволяет получать опухолевые антигены на основе поверхностных клеточных антигенов и осуществлять на их основе иммунотерапию онкологических заболеваний, а именно вакцинацию.

Claims

Формула изобретения
1. Противоопухолевая вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов, отличающаяся тем, что содержит смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
2. Противоопухолевая вакцина по п.1, отличающаяся тем, что получена при воздействии трипсина, выбранного в качестве протеазы.
3. Способ получения противоопухолевой вакцины, включающий культивирование опухолевых клеток с выделением поверхностных опухолевых антигенов, отличающийся тем, что предварительно отмытую от ростовой среды первичную культуру живых опухолевых клеток подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные опухолевые антигены, при этом обработку первичной культуры живых опухолевых клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных опухолевых антигенов, аккумулируют поверхностные опухолевые антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют состав полученных поверхностных опухолевых антигенов.
4. Способ по п.З, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
5. Способ проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающий введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой пептиды, полученные из поверхностных белков опухолевых клеток, отличающийся тем, что используют смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток самого пациента.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток другого пациента.
9. Способ по п.5, отличающийся тем, что в составе противоопухолевой вакцины используют адъюванты.
PCT/RU2007/000572 2007-03-07 2007-10-16 Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale WO2008108679A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07852028A EP2116254A4 (en) 2007-03-07 2007-10-16 TUMORVAKZINE, METHOD FOR THE PRODUCTION OF A TUMORVAKZINE AND METHOD FOR CARRYING OUT ANTITUMORAL IMMUNOTHERAPY
JP2009552621A JP5172864B2 (ja) 2007-03-07 2007-10-16 抗腫瘍ワクチン、抗腫瘍ワクチンの調製方法及び抗腫瘍免疫療法の実行方法
CN2007800520447A CN101636174B (zh) 2007-03-07 2007-10-16 抗肿瘤疫苗制备方法
US12/545,560 US20110027322A1 (en) 2007-03-07 2009-08-21 Tumor vaccine, a method for producing a tumor vaccine and a method for carrying out antitumor immunotherapy

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200700598A EA200700598A1 (ru) 2007-03-07 2007-03-07 Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии
EA200700598 2007-03-07

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/545,560 Continuation US20110027322A1 (en) 2007-03-07 2009-08-21 Tumor vaccine, a method for producing a tumor vaccine and a method for carrying out antitumor immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008108679A1 true WO2008108679A1 (fr) 2008-09-12

Family

ID=39738469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000572 WO2008108679A1 (fr) 2007-03-07 2007-10-16 Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20110027322A1 (ru)
EP (1) EP2116254A4 (ru)
JP (1) JP5172864B2 (ru)
KR (1) KR20090127132A (ru)
CN (1) CN101636174B (ru)
EA (1) EA200700598A1 (ru)
WO (1) WO2008108679A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2198879A1 (en) 2008-12-11 2010-06-23 Institut Curie CD74 modulator agent for regulating dendritic cell migration and device for studying the motility capacity of a cell
JP2010531806A (ja) * 2007-04-27 2010-09-30 ゲンリエヴィッチ ロクホフ、ペトロ 内皮細胞表面抗原を基礎とする腫瘍ワクチンの製造方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA011421B1 (ru) * 2008-08-26 2009-02-27 Петр Генриевич ЛОХОВ Способ получения противоопухолевой вакцины
RU2475865C2 (ru) * 2010-05-04 2013-02-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "РНИОИ" Минздравсоцразвития России) Способ лечения злокачественных новообразований в эксперименте
CN110898215A (zh) * 2019-12-06 2020-03-24 郑州大学 一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5030621A (en) 1987-04-23 1991-07-09 Bystryn Jean Claude Shed melanoma antigen compositions
US5993829A (en) 1987-04-23 1999-11-30 Bystryn; Jean-Claude Anti-cancer vaccine
US6039941A (en) 1994-08-24 2000-03-21 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Live vaccine for the treatment of tumor diseases
US6338853B1 (en) 1987-04-23 2002-01-15 Jean-Claude Bystryn Anti-cancer vaccine
WO2002053176A2 (en) 2001-01-08 2002-07-11 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. An autologous anti-cancer vaccine
RU2192884C2 (ru) * 2000-11-09 2002-11-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета
WO2004012685A2 (en) 2002-08-05 2004-02-12 Jean-Claude Bystryn Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6033674A (en) * 1995-12-28 2000-03-07 Johns Hopkins University School Of Medicine Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression
US6861234B1 (en) * 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
US7041302B2 (en) * 2001-01-09 2006-05-09 Biother Corporation Therapeutic modulation of the tumor inflammatory response
WO2005120558A2 (en) * 2004-05-25 2005-12-22 University Of Connecticut Health Center Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease
EA009327B1 (ru) * 2007-04-27 2007-12-28 Петр Генриевич ЛОХОВ Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5030621A (en) 1987-04-23 1991-07-09 Bystryn Jean Claude Shed melanoma antigen compositions
US5635188A (en) 1987-04-23 1997-06-03 Bystryn; Jean-Claude Anti-cancer vaccine
US5993829A (en) 1987-04-23 1999-11-30 Bystryn; Jean-Claude Anti-cancer vaccine
US6338853B1 (en) 1987-04-23 2002-01-15 Jean-Claude Bystryn Anti-cancer vaccine
US6039941A (en) 1994-08-24 2000-03-21 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Live vaccine for the treatment of tumor diseases
RU2192884C2 (ru) * 2000-11-09 2002-11-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета
WO2002053176A2 (en) 2001-01-08 2002-07-11 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. An autologous anti-cancer vaccine
WO2004012685A2 (en) 2002-08-05 2004-02-12 Jean-Claude Bystryn Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARMSTRONG A.C.; EATON D.; EWING J.C.: "Cellular Immunotherapy for Cancer", BRIT. MED. J., vol. 3323, 2001, pages 1289 - 1293
BOCCHIA M. ET AL.: "Antitumor vaccination: where we stand", HEMATOLOGICA, vol. 85, 2000, pages 1172 - 1206, XP002336681
FRANCO A.: "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", SCAND. J. IMMUNOL., vol. 61, 2005, pages 391 - 397, XP002448043, DOI: doi:10.1111/j.1365-3083.2005.01596.x
HEGMANS J.P. ET AL.: "Proteomic analysis of exosomes secreted by human mesothelioma cells", AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 164, 2004, pages 1807 - 1815
LOKHOV P.G.; ARCHAKOV A.I.: "Proteomic footprinting: a method for cells profiling by direct mass spectrometry", HUPO THESES, 5-TH ANNUAL WORLD CONGRESS, 2006
M. TAJIRI ET AL.: "Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: application of a hydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment", GLYCOBIOLOGY, vol. 15, 2005, pages 1332 - 1340
RAPOSO G. ET AL.: "B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles", J. EXP. MED., vol. 183, 1996, pages 1161 - 1172, XP002060486, DOI: doi:10.1084/jem.183.3.1161
See also references of EP2116254A4
THERY C. ET AL.: "Exosomes: composition, biogenesis and function", REVIEWS IMMUNOLOGY, vol. 2, 2002, pages 569 - 579, XP001127450
WILLIAMS R.: "Harnessing the Immune System: The Promise and Potential of Cancer Vaccines", ONCOLOG., vol. 50, no. 4, 2005

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010531806A (ja) * 2007-04-27 2010-09-30 ゲンリエヴィッチ ロクホフ、ペトロ 内皮細胞表面抗原を基礎とする腫瘍ワクチンの製造方法
EP2198879A1 (en) 2008-12-11 2010-06-23 Institut Curie CD74 modulator agent for regulating dendritic cell migration and device for studying the motility capacity of a cell

Also Published As

Publication number Publication date
CN101636174B (zh) 2012-11-14
EA009325B1 (ru) 2007-12-28
US20110027322A1 (en) 2011-02-03
KR20090127132A (ko) 2009-12-09
EA200700598A1 (ru) 2007-12-28
JP2010530843A (ja) 2010-09-16
EP2116254A1 (en) 2009-11-11
EP2116254A4 (en) 2010-04-14
JP5172864B2 (ja) 2013-03-27
CN101636174A (zh) 2010-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006277295B2 (en) Glypican-3 (GPC3)-derived tumor rejection antigenic peptides useful for HLA-A2-positive patients and pharmaceutical comprising the same
US20020155108A1 (en) Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells
JP2002504322A (ja) 樹状細胞に対するアポトーシス細胞介在抗原提示
JPH06500128A (ja) 免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有するワクチン
US20020187131A1 (en) Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
CN101861167A (zh) 包含装载有抗原和自然杀伤t细胞配体的单核细胞或未成熟骨髓细胞(imc)的疫苗
TW202039587A (zh) 供合成胜肽免疫原作為免疫刺激劑的人工混雜t輔助細胞抗原決定位
US20240131152A1 (en) Nano-particles that contain synthetic variants of gm3 ganglioside as adjuvants in vaccines
WO2008108679A1 (fr) Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale
CA2700942A1 (en) An ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases
JP2004531496A (ja) 樹状細胞の成熟を誘導するグラム陰性細菌膜画分の使用方法
WO2008133546A1 (fr) Procédé de fabrication d'un vaccin antitumoral sur la base d'antigènes de surface de cellules endothéliales
CN115785206B (zh) 肺癌特异性分子靶标07及其用途
CN115785203B (zh) 肺癌特异性分子靶标10及其用途
CN115785204B (zh) 肺癌特异性分子靶标08及其用途
CN115785208B (zh) 肺癌特异性分子靶标01及其用途
KR20070036020A (ko) 세포독성 반응의 어쥬번트 유도물질로서 프로테오리포솜 및그 유도체류와 수득된 제형
WO2004096244A1 (en) Method of preparing tumor vaccine for the inducement of anti-tumor activity and a pharmaceutical composition containing the same
AU2021299974A1 (en) Immunotherapy
CN115785207A (zh) 肺癌特异性分子靶标02及其用途
CN115785205A (zh) 肺癌特异性分子靶标09及其用途
CN118086212A (zh) 新冠病毒表位多肽致敏的树突状细胞及其应用
CN115246870A (zh) 活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用
CN115785209A (zh) 肺癌特异性分子靶标06及其用途
EA011421B1 (ru) Способ получения противоопухолевой вакцины

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780052044.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07852028

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007852028

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009552621

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020097018706

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE