KR20090127132A - 항 종양 백신의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의료 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양 환자의 면역요법에 관한 것이다. 표면 종양 항원을 포함하는 항 종양 백신이 표면 종양 항원의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 항 종양 백신의 제조방법은 종양 세포를 배양하고 표면 종양 항원을 분리하는 것을 포함한다. 살아 있는 종양 세포의 1차 배양물에서 성장 배지를 예비 세척하고, 세포치사를 유도하지 않는 정도로 프로테아제를 처리한 다음 방출된 표면 종양 항원을 수집한다. 종양 세포가 표면 항원을 회복하기에 필요한 시간 간격으로 종양 세포 배양물을 프로테아제로 반복적으로 처리한다. 백신 제조에 필요한 양에 도달할 때까지 표면 종양 항원을 축적한다. 축적된 표면 종양 항원의 조성에 대해 품질관리를 수행한다. 프로테아제로서는 트립신이 사용될 수 있다. 항 종양 면역요법을 수행하는 방법은 종양 세포의 표면 단백질로부터 얻은 단백질인 표면 종양 항원의 혼합물로부터 제조된 백신을 환자의 장기에 주입하는 단계를 포함한다. 본 발명을 이용함으로써 얻는 기술적 효과는 항 종양 면역 반응의 증진을 통해 종양 질환의 치료 효과를 증진시키는 데 있다.
종양 세포, 종양 백신, 프로테아제, 표면 항원, 면역내성
Description
본 발명은 생물공학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항 종양 백신의 제조방법에 관한 것이다.
외과적 수술방법, 화학요법 및 방사선 요법 등의 방법을 이용하여 종양 질환을 치료할 수 있는 가능성이 제한되어 있어서 종양 환자를 위한 새로운 치료방법의 개발이 더욱 시급한 실정이다. 특히, 면역요법의 개발은 종양 질환의 치료에 밝은 전망을 제공할 것으로 여겨지며, 면역요법의 원리는 인간의 면역성에 있어서 고유의 항 종양 방어작용을 증진시키는 것이다. .
면역요법의 효과적인 방법 중의 한 가지는 백신 접종인 것으로 여겨지며, 백신 접종의 효과는 백신 조성물에 존재하는 종양 항원 또는 여러 단계의 백신 제조공정 중에 필요한 종양 항원에 의해 야기되는 면역 반응의 강도에 의존한다(예를 들어, 항-이디오타입 항체, 수지상 세포 등). 따라서, 종양 항원의 분리는 항 종양 백신의 개발을 위해 필요한 전제 조건이다.
항 종양 백신을 제조하는 방법으로서 여러 가지 방법이 공지되어 있다.
몇 가지 백신은 종양 세포(TC)의 특정 항원을 사용하여 제조된다- 즉, 펩티드 열충격 단백질, 다당류 물질 및 그 밖의 물질. 특히 잘 알려져 있는 방법은 합성에 의해 종양 펩티드 항원을 제조하는 방법이다. 예를 들어, 9개의 아미노산으로 된 합성 펩티드로 되어 있는 백신은 골수 백혈병 환자에 대한 임상 시험에서 좋은 결과를 보여주었다((Williams R., "Harnessing the Immune System: The Promise and Potential of Cancer Vaccines", Oncolog., 2005, v. 50, No.4). 다른 펩티드들은 균일하지 않은 결과를 나타냈다. 예를 들어, gp100 단백질로부터의 펩티드는 예비 결과는 양호하였으나 환자에게서 종양 발생을 저지하기에 충분한 면역 반응을 일으키지는 않았다(Yu Z., Restifo N.P., "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest., 2002, v. 110, 289-294).
면역 반응을 일으키는 항원으로서 종양 탄수화물을 사용하는 방법도 공지되어 있다. 그러나, 유사한 항원 효과는 단일 종양 세포와 초기 전이의 경우에만 나타났다(Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J. Immunol., 2005, v. 61, 391-397).
한정된 항원을 기초로 하는 백신은 필연적인 단점을 가진다는 점에 주목할 필요가 있다. TC는 복수의 항원 뿐만 아니라 높은 돌연변이율을 특징으로 하며, 유기체에 있어서 세포 선택의 메커니즘에 계속적으로 작용하여 새로운 항원의 출현을 초래하거나 이미 존재하는 TC의 항원의 변형을 초래한다. 그러므로, 자가 백신(환자 자신의 TC를 기초로 하는 백신)을 사용하는 것이 유리하다는 점이 분명해 지는데, 자가 백신은 개별적인 항원 및 환자의 종양의 진행 과정을 특정짓는 질병 단계 특이적인 항원을 포함하여, 면역 반응을 이끌어내는 전 범위의 항원을 포함한다.
엑소좀(exosome)을 이용하여 종양 항원을 제조하는 방법도 잘 알려져 있다. 엑소좀은 직경이 수 nm인 멤브레인 소포체로서 많은 유형의 세포에 의해 분비되는데, 예를 들어 종양 세포((예: Wolfers J. et al., "Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming", Nat. Med., 2001, v. 7, 297-303), T- 및 B-림프구(Raposo G. et al., "B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles", J. Exp. Med., 1996, v. 183, 1161-1172) 및 수지상 세포(Zitvogel L. et al., "Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes", Nature Med., 1998, v. 4, 594-600)에 의해 분비된다.
상기 방법의 단점은 엑소좀에 면역요법을 수행하기 위한 잠재적인 항원인 표면 단백질이 낮은 농도로 존재한다는 점이다. 엑소좀은 주로 세포질 단백질과 엔도좀 부분의 단백질을 포함한다(예: Thery C. et al., Exosomes: composition, biogenesis and function" Reviews Immunology, 2002, v. 2, 569-579). 이 방법의 또 다른 단점은 엑소좀의 축적을 위해 장시간이 필요하다는 점인데, 이 방법에서는 성장 배지에 TC가 존재해야 하며, 성장 배지 성분으로부터 항원이 정제되어야 한다.
항원 자체를 사용하는 대신 항원을 코딩하는 DNA를 유기체에 도입하는 것을 기초로 하여 항 종양 백신을 제조하는 방법도 잘 알려져 있다. 항원-제시 세포는 DNA을 흡수하여 종양 항원을 생산하고, 세포독성 T-림프구를 활성화시킬 수 있는 주 조직적합성 복합체가 결합된 세포 표면상에 항원을 제시한다. 그러므로, 바이러스 벡터를 기초로 하는 백신을 이용하는 동물 모델에서는 양호한 결과를 얻었다(예: Yu Z., Restifo N.P., "Cancer Vaccines: Progress Reveals New Complexities", J. Clin. Invest, 2002, v. 110, 289-294).
상기 방법의 단점은 바이러스 벡터 자체에 의해 유도된 면역 시스템의 반응인데, 인간에서는 항 종양 백신 접종의 양호한 효과가 분명하게 나타나지 않았다.
환자 자신의 종양(자가 백신) 뿐만 아니라 다른 환자의 종양(이종 백신)으로부터 얻은 종양 세포 전체를 항원으로 사용하여 항 종양 백신을 제조하는 방법도 잘 알려져 있다. 이온화 방사선으로 세포를 먼저 불활성화시킨다. 이러한 백신의 장점은 특정 항원을 동정 및 분리할 필요가 없다는 점이다. 예를 들어, 면역보강제로서 BCG-백신과 혼합된 세포를 직장암, 흑색종 및 신장암에 대해 사용하였다(Armstrong A.C., Eaton D., Ewing J.C., "Cellular Immunotherapy for Cancer", Brit. Med. J., 2001, v. 3323, 1289-1293).
상기 방법의 단점은 종양 세포를 불활성화시켜야 하며 전체 종양 세포 표면에 위치하는 항원을 항원-제시 세포에 의한 포식 및 프로세싱에 사용하기가 적합하지 않다는 점이다.
US Patent 6039941(C12N 15/09, A61K 31/00, 2000년 3월 21일)에는 면역자극 활성을 가진 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 유전공학적 방법으로 도입함으로써 얻어진 TC로부터 면역원성이 매우 높은 항 종양 백신을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
상기 방법의 단점은 첫째 종양 세포를 불활성화시켜야 하며, 둘째 종양 세포 표면 상의 항원은 항원-제시 세포에 의한 포식 및 프로세싱에 사용하기가 그다지 적합하지 않다는 점이다.
국제공개 WO 02053176(A61K 39/00; C12N 5/06; 2002년 7월 11일)에는 배양된 TC의 용해물을 기초로 하는 항 종양 백신을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 백신의 장점은 이온화 방사선에 의한 불활성화가 불필요하며, 원래의 TC와는 달리 응집되지 않은 세포 항원이 항원-제시 세포에 의한 포식 및 프로세싱에 적합하므로 보다 효과적인 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 점이다.
그러나, 상기 방법의 단점은 TC 용해물의 대부분이 세포내 단백질로 되어 있어서 이러한 단백질에 의해 야기되는 면역 반응은 항 종양 활성을 나타내지 않는데, 그 이유는 종양 세포의 세포내 단백질은 면역 시스템에 이용될 수 없기 때문이다.
상기 방법과 가장 유사한 방법은 US Patent 5993829(A61P 35/00, C07K 14/47, 1999년 11월 30일)에 기재되어 있는 항 종양 백신의 제조방법이다. 종양 세포를 배양하고 그들의 표면 항원을 분리하는 것을 포함하는 유사한 방법들이 하기 문헌에도 기재되어 있다: US 6338853(A61P 35/00, C07K 14/47, 2002년 1월 15일), US 5030621(1991년7월 9일) 및 US 5635188(1997년6월 3일).
공지의 방법은 혈청 비함유 성장 배지에서 종양 세포를 배양하고 성장 배지로부터 표면 세포 항원을 분리하는 것을 포함하며, 배양 과정에서 종양 세포가 소실된다. 정제 후, 수집된 항원을 항 종양 백신의 항원으로서 사용한다. 이러한 백신의 장점은 세포 표면에 종양 항원이 고농도로 존재하므로 (세포 내부에 은폐되어 있지 않기 때문에) 면역 시스템에 이용될 수 있다는 점이다. 그러나, 이 방법의 단점은 다음과 같다:
- 외부의 영향과 관계 없이 배양된 TC에 의해 항원이 자연적으로 소실되기 때문에 항원의 생산성이 낮다;
- 항원 축적을 위해 성장 배지에서 장시간 동안 TC를 배양(예: US Patent 6338853에서는 RPMI-1640 배지에서 3시간 배양)함에 따라, 성장 배지가 40 종 이상의 물질(아미노산, 염, 완충제, 비타민, 포도당 등)을 함유하고 있으며 또한 배양 과정에서 생기는 대사생성물 및 그 밖에 TC에 의해 분비되는 물질을 포함하게 되어, 원하는 생성물(항원)은 낮은 농도로 존재하고 불순물이 다량으로 존재하는 물질을 얻게 된다;
- 항원 혼합물의 조성을 분석하기 위해서는 성장 배지의 성분들과 세포 대사 생성물로부터 제조물을 예비 정제해야 한다;
- 백신 접종에 필요한 투여량의 항원을 분리하기 위해서는 연장된 배양을 통해 TC를 증식시켜야 하며, 이는 항원 혼합물의 조성에 변화를 초래하여 백신 접종의 효과를 떨어뜨린다;
- 백신 접종에 필요한 양의 항원을 종양 세포의 배양을 통해서만 얻을 수 있 어서 상기 방법에 따라 (배양 없이) 분리된 항원을 추출하기가 불가능하다;
- TC를 장기간 배양해야 하고 표면 종양 항원을 정제해야 하므로 백신이 비싸다.
TC가 멤브레인 소포체(엑소좀)의 형태로 항원을 혈청 비함유 배지내로 자발적으로 방출되므로, 이 점에서 상기 항원 제조방법은 전술한 엑소좀을 기초로 한 항원의 제조방법과 유사한 방법임에 주목할 필요가 있다. 잘 알려져 있는 바와 같이, 엑소좀은 표면 항원 이외에 백신 접종에 무용한 항원, 특히 세포내 단백질을 고농도로 포함한다(예: Mears R. et al., "Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and 질량 spectrometry", Proteomics, 2004, v.4, 4019-4031; Hegmans J.P. et al., "Proteomic analysis of exosomes secreted by human mesothelioma cells", American Journal of Pathology, 2004, v.164, 1807-1815; Thery C. et al., "Exosomes: composition, biogenesis and function", Nature Reviews Immunology, 2002, v.2, 569-579). 상기 방법에 따라 제조된 항원 역시 사용 전에 엑소좀의 일부를 구성하는 지질로부터 정제될 필요가 있다.
상기 방법의 또 다른 단점은 파이로젠(pyrogen), 독소 및 프리온과 같은 위험한 단백질로 부터 항원을 정제하기가 어렵다는 점이다. 그 이유는 TC에 의해 단백질 혼합물로부터 항원이 자발적으로 소실되어 혼합물로부터의 모든 무용한 단백질 오염물의 제거를 방해하기 때문이다.
본 발명에 의해 얻어지는 기술적 효과는 항 종양 면역 반응의 증진을 통해 종양 질환의 치료 효과를 증진시킨다데 있다.
이러한 기술적 효과는 종양 세포를 배양하고, 표면 종양 항원을 분리하는 것을 포함하는 본 발명의 항 종양 백신의 제조방법에 의해 달성된다. 본 발명에 따르면, 살아 있는 종양 세포를 배양하고, 세척하여 성장 배지를 제거한 다음 프로테아제를 세포치사를 유도하지 않는 농도로 작용시켜 방출된 표면 종양 항원을 수집한다. 살아 있는 종양 세포를 프로테아제로 처리하는 공정은 세포가 표면 종양 항원을 회복하기에 필요한 시간 간격으로 반복되고, 백신 접종에 충분한 양을 얻을 때까지 표면 종양 항원을 축적하고, 얻어진 표면 종양 항원의 조성에 대해 품질관리를 행한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 프로테아제로서 트립신이 사용된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 종양 세포의 1차 배양물(primary culture)를 사용한다.
보다 특이적인 면역 반응을 얻기 위해, 환자 자신의 종양 세포의 표면 종양 항원을 사용한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 다른 환자의 종양 세포의 표면 종양 항원을 사용한다
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 면역보강제가 백신 조성물의 일부로서 사용된다.
본 발명은 실시예 및 도면에 의해 보다 상세히 설명된다.
도 1은 백신 제조방법의 일예에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 1차 종양 세포 배양물로부터 얻은 표면 항원의 질량 스펙트럼(A); 동일한 세포 배양물에 대해 표면 항원의 완전한 복구 후 프로테아제로 세포를 반복처리함으로써 얻은 표면 항원의 질량 스펙트럼(B); 및 동일한 세포 배양물에 대해 표면 항원의 부분적인 복구 후 프로테아제로 세포를 처리함으로써 얻은 표면 항원의 질량 스펙트럼(B)을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 얻은 표면 항원의 단편에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 3A 및 3B는 항원의 탄수화물 부분에 대한 CID 단편화(fragmentation)의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 3C 및 3D는 b/y 이온들로 표시된, 항원의 펩디드 서열에 대한 CID 단편의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 펩티드 혼합물을 백신 접종하여 접종된 종양 세포주 H22를 가지고 있는 쥐의 생존율 곡선을 나타낸다.
쥐에게 접종된 인간 헤파토마 H22에 대한 항 종양 항원에 관한 일실시예가 설명된다. 백신의 제조를 위해 동일한 H22 세포 배양물이 이용된다.
1. H22 세포 배양물이 들어 있는 플라스크로부터 성장 배지를 제거하고, 성장 배지의 양의 절반 이상의 양의 멸균 생리 용액을 사용하여 세포 단 층(mololayer)을 세척한다. 성장 배지의 잔류물을 완전히 제거하기 위해 세척은 3회 이상 실시해야 한다.
1. 활성화된 EC의 배양물이 들어 있는 플라스크로부터 성장 배지를 제거하고 단층의 세포를 (성장 배지의 양의 절반의 양의) 멸균된 생리용액으로 3회 이상 세척한다. 이러한 세척은 성장 배지의 잔류물의 제거를 위해 실시된다.
다음 단계로서 역시 중요한 단계는 이러한 세포에 대해 세포치사를 유도하지 않는 농도의 프로테아제, 통상 트립신(활성은 약 3000 U/mg)으로 세포를 처리하는 단계이다.
2. 0.0001% 트립신 용액을, 플라스크 표면 25 cm2당 1 ml 사용하여 단층의 세포에 부가한다.
3. 상기 플라스크를 37℃에서 배양한다. 트립신 용액을 처리한 후 5-7분 사이에, 세포 표면으로부터 방출된 항원을 포함하는 트립신 용액을 수집한다.
4. 새로이 준비된, 혈청(통상 10%)을 함유하는 성장 배지를 부가한 후 배양을 계속한다.
5. 백신 제조에 필요한 양의 표면 항원을 축적하기 위해, 상기 단계 2-4를 24시간 간격으로 반복한다.
6. 항원의 유용성을 평가하기 위해 질량 스펙트럼 분석을 실시한다.
7. 축적된 항원을 사용하여 백신을 제조한다.
질량 스펙트럼 분석은 다음과 같이 수행한다: 140 ㎕의 항원 용액을 140 ㎕ 의 에탄올과 720 ㎕의 부탄올과 혼합한 다음 15 ㎕의 Sepharose CL4B를 부가한다. 이 혼합물을 서서히 교반하면서 45분 동안 배양한다. 배양 후, 세파로오스를 동일한 에탄올-부탄올 용액으로 2회 세척한 다음 50% 에탄올 용액 중에서 30분간 배양한다. 에탄올 용액을 모으고 로터 증발장치에서 건조시킨다. 그 결과 얻은 건조 물질을 10 ㎕ 물에 용해하고 MALDI-TOF 질량 스펙트로미터 장치를 이용하여 분석한다. 분석을 위해 2 ㎕ 용액을 50% 아세토니트릴과 0.5% 트리플루오로아세트산을 포함하는 2,5-디하이드록시벤조산의 포화용액과 1:1의 비율로 질량 스펙트로미터 타겟 상에서 혼합한다. 타겟상의 샘플을 공기 건조하여 600-4000 Da의 질량 범위에서 펩티드에 대한 질량 스펙트럼 분석을 실시한다.
백신 개발을 위해 관심의 대상이 되는 대부분의 종양 항원들은 세포 표면 상에서 발견되는 것으로 알려져 있다(예: Bocchia M. et al., "Antitumor vaccination: where we stand", Hematologica, 2000, v. 85, 1172-1206). 세포치사를 유도하지 않는 농도의 트립신으로 1차 세포 배양물을 처리하면 세포 표면으로부터 단백질 단편의 분리가 유도되는 것으로 알려져 있다(Lokhov P.G., Archakov A.I., Proteomic footprinting: a method for cells profiling by direct 질량 spectrometry", HUPO theses, 5-th Annual World Congress, 2006, abstract No 1201). 그러므로, 본 발명에 따르면, 트립신의 작용은 다른 프로테아제와 마찬가지로 종양 표면 단백질의 단편을 용액 중으로 방출시키는 것이다. 트립신의 작용에 의해 방출된 표면 종양 항원(표면 단백질의 단편)은 대부분 면역요법을 위한 항원으로 적합하므로, 종양 환자의 백신 접종에 이용된다.
세포로부터 방출된 펩티드를 포함하는 트립신 용액을 수집하는 단계는 플라스크의 바닥으로부터 세포를 분리시키기 전에 실시하는 것이 바람직한데, 이는 세포가 샘플내로 유입되는 것을 방지함으로써 불필요한 정제단계를 피할 수 있기 때문이라는 점에 주목할 필요가 있다.
세포를 프로테아제로 처리하는 조건은 종양 세포의 유형별로 실험적으로 정해지며, 사용되는 프로테아제의 활성도에 따라, 프로테아제 농도는 0.0001% 내지 0.05%, 처리시간은 30초 내지 10분 정도로 크게 달라질 수 있다. 활성도가 다양한 트립신을 이용하는 경우에 효소 활성의 증가 또는 감소에 비례하여 사용되는 트립신의 농도가 달라진다.
세포치사를 유도하지 않는 농도의 프로테아제로 세포를 처리하면 세포가 죽지 않으며, 트립신으로 세포 배양물을 반복적으로 처리할 수 있다. 백신 접종에 필요한 양의 표면 종양 항원을 얻기 위해서, 살아 있는 세포 배양물에 대한 트립신 처리를 24 시간 이하의 간격으로 여러 회 반복한다. 트립신 처리 사이의 시간간격 동안에 주어진 세포에 대해 표준 배양방법에 따라 세포를 배양한다(즉, 37℃에서 CO2 존재하의 배양기에서, 혈청 및 활성 상태를 유지하기 위해 필요한 첨가제의 존재하에서).
축적된 표면 종양 항원을 주어진 백신의 제조방법에 따라 후속 처리한다: 즉 정제, 농축, 조성 분석 및 면역성의 증진을 위한 면역보강제와의 혼합 또는 이를 이용한 변형.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 세포를 프로테아제로 처리하는 단계는 세포계대배양과 조합가능하다.
트립신 용액은 멸균 생리용액 및 임의의 적절한 생리식염수를 이용하여 제조될 수 있다.
트립신 대신 키모트립신 등의 다른 프로테아제가 이용될 수 있다.
세포 현탁액을 사용하는 경우에 항원을 축적시키기 전에 원심분리 또는 임의의 적절한 방법을 이용하여 세포를 수집할 필요가 있다.
본 발명의 일실시예에 따라 얻은 항원의 조성에 대한 분석은 글리코실화 펩티드에 대한 질량 스펙트럼 분석법을 이용하여 실시한다(M. Tajiri et al., "Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: application of a hydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment", Glycobiology, 2005, v. 15, 1332-1340). 그 이유는 단백질 단편은 통상 글리코실화된다는 사실과 글리코실화 펩티드가 면역원성이 가장 높은 펩티드이므로 백신 항원으로서 관심의 대상이 된다는 것은 명백하기 때문이다(예: Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand. J. Immunol., 2005, v. 61, 391-397).
글리코실화 항원의 탈염 및 농축은 임의의 적절한 방법, 특히 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 종양 세포는 혈액, 소변, 액체, 림프, 복 수 및 흉수와 같은 생물학적 액체로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 항 종양 백신의 제조방법은 모든 종류의 세포 배양물, 특히 부착 배양, 현탁 배양, 매트릭스 및 기타 기질을 이용한 세포 배양, 공동배양, 유기형 배양 및 세포 응집체(그래뉼, 스페로이드), 및 새로이 분리된 종양 세포 및 종양 조직 단편 등의 모든 종류의 세포 배양물에 적용될 수 있다.
본 발명은 후술하는 항 종양 백신의 제조방법의 또 다른 실시예에 의해 보다 상세히 설명되며, 이 실시예에서는 인간의 대장암 세포의 부착형 1차 배양물을 이용한다.
1. 종양에 대한 절제 수술 과정에서 얻은 대장암 조직의 단편을, 항생제가 함유된 RPMI 1640 배지가 들어 있는 멸균 시험관에 넣고 실험실로 옮겼다.
2. 멸균 조건하에서, 종양 조직을 페트리 디쉬에 옮기고, 괴사 부위, 혈액 응고 부위 및 잔류하는 지방 및 연결 조직을 기계적으로 제거하였다.
3. 가위를 이용하여 조직을 작은 단편으로 절단한다.
4. 강렬한 피펫작용에 의해 종양 조직의 단편을 작은 세포 응집체로 해리시킨 다. 이 과정에서 단편은 10 ml의 인산완충생리식염수(PBS)에 현탁시킨다.
5. 남아 있는 조직의 커다란 단편은 시험관 바닥에 가라앉도록 한다.
6. 액체 중에 여전히 부유하고 있는 세포 응집체를 피펫을 이용하여 조심스럽게 모아서 새로운 시험관에 옮긴다.
7. 시험관에 대해 400g로 5분간 원심분리를 실시하여 상등액을 따라낸다. 세포 응집체를 포함하는 펠릿을 다음과 같은 성분이 들어 있는 RPMI 1640 배지에 재현탁시킨다: 인슐린(20 ㎍/ml), 트랜스페린(10 ㎍/ml), 하이드로코르티손(50 nM), 내피성장인자(1 ng/ml), 에탄올아민(10 ㎛), 포스포에탄올아민(10 ㎛), 트리요오도티로닌(100 pM), 송아지혈청알부민(BSA: 2 mg/ml), 글라타민(2 mM), 피루브산나트륨(0.5 mM), 송아지태아혈청(5%). 그런 다음 세포 배양을 위해 플라스크(25 cm2 )에 옮긴다.
8. 37℃에서 5% CO2 존재하에 배양을 실시한다.
9. 스트로마 세포로부터 종양 세포를 분리하기 위해 배양 플라스크를 수 초동안 진동 교반장치와 접촉시킨다. 종양 세포가 약하게 부착되어 있는 특성으로 인해 탈착되어 성장 배지 중으로 방출된다.
10. 세포가 부유하고 있는 배지를 피펫으로 수거한 다음 새로운 배양 플라스크에 옮겨 37℃에서 5% CO2 존재하에 다시 배양을 실시한다.
11. 종양 세포가 80% 융합상태(confluency)에 도달하면, 플라스크로부터 성장 배지를 제거하고 세포를 0.9% NaCl 또는 PBS로 3회 세척한다. 세척 용액의 부피는 성장 배지의 부피의 절반 이상이어야 한다. 세척을 통해 성장 배지 중에 함유된 미량의 혈청이 제거되어야 한다.
12. 0.0001% 트립신 용액(활성 약 3000 U/mg)을 세포에 첨가한다. 배양 플라스크 표면 25 cm2당 1 ml의 용액을 이용한다.
13. 플라스크를 37℃에서 배양한다. 배양 후 5분 내지 7분 사이에 세포로부 터 방출된 표면 항원을 포함하는 용액을 수집한다. 상기 용액을 수집하는 동안 종양 세포는 플라스크의 바닥에 부착된 채 잔류해야 한다. 트립신의 효과로 세포의 일부가 플라스크 표면으로부터 탈착되어 액체 중에 부유하는 경우에는 400g로 5분 동안 원심분리하여 세포가 존재하지 않는 상등액을 이용한다.
14. 배양 플라스크에 남아 있는 트립신의 불활성화를 위해 송아지 태아 혈청을 함유하는 신선한 배양 배지를 첨가하여 37℃에서 5% CO2 존재하에 배양을 계속한다.
15. 단계 13에 따라 얻은 용액을 45℃에서 진공 농축기를 이용하여 농축한다. 그 이전에 용액에 대해 역상 크로마토그라피, 겔여과 등의 임의의 적절한 방법으로 탈염처리를 실시해도 된다. 그 이전에 나머지 트립신을 제거하기 위해 분자량이 4 kDa 미만인 펩티드를 통과시키는 필터를 이용하여 여과공정을 실시해도 된다.
16. 필요한 양의 항원을 축적하기 위해, 단계 11-15를 24시간 간격으로 반복실시한다. 질량 스펙트로미터를 이용하여 백신 제조를 위한 항원의 유용성을 평가한다.
세포를 프로테아제로 처리하는 횟수 및 처리 간격은 축적된 항원 혼합물의 조성에 대한 분석을 통해 조절된다. 항원 조성이 변화되기 시작하고 처리 간격이 증가해도 새로이 분리된 종양 세포에 대응하는 원래의 항원 조성을 얻을 수 없는 경우에는, 그 세포는 백신 제조에 적합하지 않은 것으로 본다.
축적된 항원 혼합물의 조성에 대한 품질관리는 전술한 바와 같이 질량 스텍트로미터를 이용하여 실시한다.
종양 조직으로부터 세포를 분리하는 데에는 임의의 적절한 방법이 이용된다. 종양 세포의 방출을 목적으로 종양 조직을 해리시키기 위해 프로테아제가 이용되는 경우, 1차 종양 배양의 개시 후 적어도 24 시간 경과 후에 표면 구조에 대해 질량 스펙트럼 분석을 실시할 필요가 있다.
본 발명에 따라 얻어지는 표면 종양 항원은 세포 공여자의 종양에 대해 특이적이다. 그러나, 그 세포를 배양하면, 종양 세포가 공여자의 장기에서 성장했던 조건을 인 비트로 방식으로 인공적으로 재창출할 수 없기 때문에, 1차 배양물의 표현형이 크게 달라진다. 따라서 축적된 항원의 조성에 대해서는 품질관리를 해야 한다. 이하, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 얻은 항원의 품질을 평가하는 방법에 대하여 설명한다.
항원 혼합물에 대한 반복적인 질량 스펙트로미터 분석을 통해 얻은 데이터에 따르면, 글리코실화 펩티드의 95% 이상의 질량이 재생되며, 이것이 2개의 비교되는 항원 혼합물을 동정하는 기준으로 작용할 수 있다. 이를 위해, 새로이 분리된 종양 세포와 공통인 글리코실화 펩티드가 90% 이상 존재하는 것을 기준으로, 백신용으로서 축적된 항원의 적합성을 평가한다.
실험 데이터로부터, 직장암 세포를 배양하면 세포계대가 3-4일 후에 실시되는 조건하에 단지 제1 및 제2 세포계대를 이용하는 것 만으로 백신 제조에 적합한 항원을 만들 수 있는 것으로 알려져 있다. 당업자라면, 세포 표현형을 유지하기 위한 몇 가지 성분을 성장 배지에 첨가하면 백신 항원의 축적에 이용될 수 있는 계대 수를 증가시킬 수 있다는 점을 배제할 수 없다.
종양 조직으로부터 충분한 양의 세포를 얻을 수 없는 것으로 판명된 경우에는, 필요한 양에 도달할 때까지 배양에 의해 세포를 증식할 필요가 있으며, 세포 배양 과정 동안 표면 항원에 대해 품질관리를 해야 한다. 배양 과정 동안의 항원 조성의 품질관리는 추가적인 세포 증식 없이 본 발명에 따라 실시한다. 예를 들어, 세포치사를 유도하지 않는 농도로 프로테아제를 처리하고, 배양 과정 동안 일주일에 1회 또는 2회 질량 스펙트럼 분석을 실시한다.
종양과 백신 항원을 동정하면 그 백신에 의해 유도된 항 종양 면역 반응의 특이성을 알 수 있다. 원래 종양의 항원과 본 발명에 따라 축적된 항원에 대한 질량 스펙트럼을 비교하면 상기 동정이 가능하다. 도 2A는 원래 종양 세포의 표면 항원에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 2B는 본 발명에 따라 제조된, 백신 제조에 적합한 항원에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸다(도 2A와 2B의 질량 스펙트럼은 동일하다). 도 2C는 본 발명의 비교예에 따라 얻은 항원으로서 백신 제조에 적합하지 않은 항원에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸다(도 2A와 2C의 질량 스펙트럼은 현저하게 다르다). 사라진 항원(도 2B)과 새로이 나타난 항원(도 2C)에 해당하는 질량에 대해 화살표로 표시되어 있다. 펩티드 조성을 조절하면, 특이적 항 종양 면역 반응을 유도하는 백신 제조에 필요한 양의 항원을 축적시킬 수 있다.
(본 발명의 구현을 위해 필요하지는 않지만) 종양 세포의 표면 단백질로부터의 항원의 유래를 확인하기 위해, 이들의 단편에 대한 스펙트럼을 얻었으며, 그 예 가 도 3에 나타나 있다.
이를 위해, 트립신으로 세포를 처리하여 배양하는 동안 얻은 시료에 대해 제조자의 표준 방식에 따라 역상 ZipTipC18(Millipore Corp., 미국)과 자동 피펫의 팁을 이용하여 탈염처리하고, 매트릭스를 가진 질량 스펙트로미터 타겟상에 놓았다. 이온 단편화에 따라 질량 스펙트럼을 등록하고, 써치 시스템 Mascot(MatrixScience, 미국)을 이용하여 단백질에 대해 동정하였는데, 이온 질량 'b'와 'y' (서열-태그 방법) 및/또는 확립된 아미노산 서열(합성법)을 이용하여, 분류 "Homo sapiens"의 단백질 서열 데이터베이스(NCBI, 미국)를 기준으로 사용하였다.
도 3A와 3B는 질량이 1640과 1480 Da인 글리코실 펩티드의 탄수화물 부분에 대한 분해의 예를 보여주는 것으로 질량이 162, 203 및 291 Da인 단편이 분리되었는데, 이는 각각 헥소오스(만노오스, 글루코오스 또는 갈락토오스), 아세틸글루코사민 및 시알산에 해당한다. 펩티드의 단편화를 통해 그것의 아미노산 서열을 동정할 수 있으며, 항원 혼합물 중에 면역글로불린(CD 항원, 조직적합성 복합체, T-세포 수용체, 세포 부착 분자)의 중쇄의 가변영역과 불변영역의 펩티드, 저밀도 지단백질 수용체, 인터루킨 IR-2의 수용체, G-단백질 결합 수용체가 드러나게 된다. 도 3C는 질량이 857.4 Da인 펩티드(two-charge peptide)에 대해 b-y 이온이 표시되어 있는 분해 단편에 대한 예로서, 확립된 아미노산 서열은 G-단백질 결합 수용체의 단편에 해당한다:
Ile Cys Cys Ala Cys Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys Val Phe Arg
1 5 10 15
도 3D는 질량이 573.3 Da인 펩티드(one-charge peptide)에 대해 b-y 이온이 표시되어 있는 분해 단편에 대한 예로서, 확립된 아미노산 서열은 조직적합성 복합체 I에 해당한다:
Ala Val Leu Asn Arg
1 5
본 발명에 따라 제조되는 항원은 다음과 같은 사항을 특징으로 한다.
1) 수용성의, 주로 글리코실된, 단백질가수분해성 펩티드(트립신이 프로테아제로 사용되는 경우에 말단이 통상 리신이나 아르기닌임)로서 질량은 1.2 내지 4 kDa 이다.
2) 하나의 소스-종양 세포의 외부 플라스마 멤브레인의 단백질의 세포외 단편으로부터 유래된 것이다.
3) 세포치사를 유도하지 않는 농도의 프로테아제로 살아 있는 세포를 처리함으로써 제조된다.
본 발명에 따라 제조된 종양 항원의 혼합물의 실용성은 세포 표면 상의 단백질 단편을 포함하는 혼합물 중의 펩티드의 아미노산 서열 및 변형(글리코실화)의 동정에 의존한다. 종양 질환의 발생은 유기체에서 발생되는 종양 세포를 파괴하는 면역 시스템의 부전으로 인한 것으로 알려져 있다. 축적되고 정제된 항원이 면역 반응을 증강시키는 면역보강제와 혼합되어 인간 또는 동물에 주입된다. 그 결과, 세포 및 체액의 면역 반응으로 주입된 항원이 이미 존재하는 종양 세포를 불활성화시키거나 또는 새로이 출현한 종양 세포가 파괴(cross-destroy)되며, 이는 항 종양 백신의 질병 치료 및 예방 효과를 나타내는 것이다. 완전한 면역 반응을 얻기 위해서는 항원의 반복 주입이 이루어진다.
본 발명에 따라 얻은 백신의 항종양 활성을 입증하기 위해, 동일한 연령과 체중을 가진 수컷 쥐(BALB/c) 20마리(대조군 10마리와 실험군 10마리)에 대해 동물실험을 실시하했다.
본 발명의 일실시예에 따라 헤파토마 H22 세포 배양물로부터 종양 항원을 얻었다. 수집된 항원에 대해 Sephadex G-10을 사용하여 겔여과 방법으로 탈염처리하고 진공 농축기(SpeedVac)를 이용하여 농축했다.
완전 면역보강제(complete Freund's adjuvant)와 1:1의 비율로 혼합된 항원(150 ㎍)을 피하주사방식으로 주입하였다. 이어서 3주 동안 1주일에 1회씩 불완전 면역보강제(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 면역화를 반복 실시하였다. 대조군의 동물에 대해서는 면역보강제(Freund's adjuvant)와 혼합된 PBS를 동일한 방식으로 주입했다. 4차 면역화 후, 헤파토마 H22(106개의 세포)를 피하주사 방법으로 쥐에게 접종했다. 3개월 동안 대조군과 실험군에 있어서의 동물의 생존율을 조사했다. 생존율 곡선(도 4)은 본 발명에 따라 제조된 항원의 항 종양 활성의 존재를 입증해 주었다.
항 종양 면역 반응의 메커니즘은 인간과 동물에서 동일하기 때문에 동물 실 험의 결과가 동물에만 제한되는 것은 아니라는 점을 이해해야 한다. 항원의 투여 방법과 체중 1 kg 당 계산된 항원 투여량은 인간의 면역화의 경우에도 마찬가지로 적용될 수 있디. 다만, 처리 절차는 질환의 중증도, 종양 질환의 발전단게, 종양 세포의 돌연변이성, 항원에 대해 분명한 면역 반응을 일으키는 유기체의 능력에 따라 환자별로 개별적으로 조절될 수 있다.
후술하는 실시예는 인간의 항 종양 치료를 위해, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 제조되는 표면 종양 항원을 기초로 하여 항 종양 백신을 제조하는 방법과 항 종양 치료방법에 관한 것이다.
상기 백신은 0.5 ml의 PBS 에 용해된 1 mg의 종양 항원 혼합물(본 발명의 제2실시예에 따라 제조됨)을 포함하며, 여기에는 1 ml의 면역보강제(Montanide ISA-51:수-유 에멀젼 베이스의 Syntex, 스쿠알렌, Punoric L121, Tween 80 함유)가 혼합되어 있다.
3주 동안 매주 환자에게 1 투여단위량의 백신을 피하주사하고, 이어서 5개월 동안 매달 1회1 주사한다.
접종 2-3일 후 주입된 종양 항원에 대한 면역성의 강도를 조사하여 백신접종의 효과를 측정하고, 접종된 항원에 대한 과민반응에 대해서는 접종 부위에 나타나는 홍반의 크기를 측정하여 평가한다. 1차 접종 후 나타나는 홍반의 크기를를 기저 인덱스로 설정한다. 반복되는 백신 접종 후 과민반응이 증진되는 것은 면역 반응이 일어난다는 것을 나타내는 것이다.
본 발명의 항 종양 면역요법을 구현하기 위한 또 다른 실시예에 있어서, 백 신을 정맥 주사 또는 근육 주사할 수도 있으며, 보강제 없이 백신을 주사하는 것도 가능하다.
본 발명에서는 종양 항원의 혼합물을 이용함으로써 면역 반응이 확실하게 보장된다. 백신에 존재하는 복수의 단백질로 인해 표면 상에 동일한 아미노산 서열의 단백질을 가지고 있는 모든 세포에 대해 면역 반응이 가능하다.
따라서, 본 발명에 따르면, 1가 백신을 사용하는 종래의 공지된 방법과 비교하여 항 종양 면역요법의 효과가 크게 증가된다.
또한, 종양 세포의 표면 항원인 종양 특이적 항원이 농축된 백신을 사용하여 항 종양 면역요법을 수행할 수 있다.
이러한 효과는 세포치사를 유도하지 않는 정도의 프로테아제로 종양 세포를 처리함으로써 가능한 것이다. 세포치사를 유도하지 않는 농도로 프로테아제를 사용함으로써 종양 세포의 표면 항원만을 분리하여 처리할 수 있고, 또한 플라스마 멤브레인의 파괴에 의해 수반되는 세포의 죽음을 회피할 수 있다. 플라스마 멤브레인의 파괴는, 특히 백신화에 무용한 다량의 세포내 단백질을 포함하는 세포질 물질의 출현을 야기한다. 이러한 상황은 종래의 공지의 백신에서 종양 특이적 항원 부분을 감소를 초래하여 의도하지 않은 면역 반응을 유도하고, 그 결과 종양 항원에 대한 면역 반응 특이성을 감소시키는 결과를 초래한다.
따라서, 종양 항원이 풍부하게 농축된, 본 발명에 따라 제조된 백신을 이용하면 항 종양 면역요법의 효능을 증진시킬 수 있다.
또한, 1차 종양 세포 배양물의 축적을 통해 얻은 항원을 이용함으로써 면역 요법의 효능도 증진시킬 수 있다. 이러한 항 종양 백신의 제조방법에 따르면, 프로테아제를 사용할 때마다 실질적으로 변화되지 않은 조성의 항원을 얻을 수 있고 1차 세포 배양을 통해 백신 제조에 필요한 양의 항원을 축적할 수 있다. 특정 종양에 대해서만 특이적인 종양 항원을 백신에 도입하는 공정은 축적된 항원의 조성에 대한 품질관리를 통해 이루어진다.
또한 주어진 종양에 대해 비특이적인 항원이 백신 중에 존재할 가능성도 배제된다. 이러한 비특이적인 항원은, 인 비트로 증식을 위한 1차 배양 동안 항원 조성이 변화하고, 이렇게 증식된 세포를 사용하여 제조되는 종래의 백신에서는 존재할 수 있다. 따라서, 증식된 세포로부터 수집된 항원 혼합물의 조성은 분리된(배양되지 않은) 종양 세포로부터 얻은 항원 조성과는 크게 다를 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 백신은 자가 백신(환자 자신의 세포로부터 만들어짐) 또는 이종 백신(다른 환자의 세포를 사용하여 만들어짐) 일 수 있다.
다른 환자의 종양 세포도 그 표면에 동일한 아미노산 서열을 가진 펩티드를 가지고 있기 때문에 본 발명에 따른 면역요법은 자가 백신 및 이종 백신 모두에 대해 효과적이다.
다만, 자가 백신을 사용하는 것이 보다 효과적인데, 그 이유는 자가 백신의 경우에 특정 환자의 종양 진행 과정에 대해 특징적인 개별적 및 단계-특이적인 항원을 함유하기 때문이다.
본 발명에 따르면 표면 세포 항원을 기초로 하여 종양 항원을 제조할 수 있 으며, 이러한 종양 항원을 기초로 하여 주로 백신 접종을 통해 종양 질환을 치료할 수 있다.
Claims (9)
- 표면 종양 항원을 기초로 하는 항 종양 백신으로서,상기 백신이 표혐 종양 항원의 혼합물을 포함하며, 상기 표면 종양 항원은 살아 있는 종양 세포의 1차 배양물을 세포치사를 유도하지 않는 농도의 프로테아제로 주기적으로 처리함으로써 얻은, 살아 있는 종양 세포의 표면 단백질로부터 축적된 펩티드인, 항 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 상기 백신이 프로테아제로서 트립신이 선택될 때 제조된 것임을 특징으로 하는 종양 백신의 제조방법.
- 종양 세포를 배양하는 단계;종양 세포 배양물에서 성장 배지를 예비 세척하고, 세포치사를 유도하지 않는 정도로 프로테아제를 처리한 다음 방출된 표면 종양 항원을 모아서 분리하는 단계;종양 세포가 표면 항원을 회복하기에 필요한 시간 간격으로 종양 세포 배양물을 프로테아제로 반복적으로 처리하는 단계;백신 제조에 필요한 양에 도달할 때까지 표면 종양 항원을 축적하는 단계; 및축적된 표면 종양 항원의 조성에 대해 품질관리를 수행하는 단계를 포함하는 항 종양 백신의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 프로테아제로서 트립신을 사용하는 것을 특징으로 하는 항 종양 백신의 제조방법.
- 종양 세포의 표면 단백질로부터 얻은 단백질인 표면 종양 항원의 혼합물로부터 제조된 백신을 환자의 장기에 주입하는 단계를 포함하는 항 종양 면역요법을 수행하는 방법에 있어서,상기 표면 종양 항원의 혼합물이 사용되며, 상기 항원은 살아 있는 종양 세포의 1차 배양물을 세포치사를 유도하지 않는 농도의 프로테아제로 주기적으로 처리함으로써 얻은, 살아 있는 종양 세포의 표면 단백질로부터 축적된 펩티드인, 면역요범의 수행방법.
- 제5항에 있어서, 상기 프로테아제로서 트립신을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역요법의 수행방법.
- 제5항에 있어서, 자가 종양 세포의 표면 항원을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역요법의 수행방법.
- 제5항에 있어서, 이종 종양 세포의 표면 항원을 사용하는 것을 특징으로 하 는 면역요법의 수행방법.
- 제5항에 있어서, 상기 항 종양 백신이 면역보강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역요법의 수행방법.
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