JPH06500128A - 免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有するワクチン - Google Patents
免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有するワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有する
ワクチン
本発明は免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム(IRIV
s)及びそれを含有するワクチンに関する。
免疫原性を増大させるための多くの種類の手法が膨大な経験的要素を留保する手
段に基づいて数十年にわたって開発されてきた。最も有力な方法(例えば、フロ
イントの完全アジュバントと一緒に免疫原を投与する方法)は、思量の段に説明
する多(の種々の原理が組み合わされている:粒子は可溶性抗原jりもマクロフ
ァージに=引されやすく、抑制で=<免疫の(A) 抗原粒子の作製
はうにそのバランスか傾いている。粒子の生成は、単純な熱誘導凝集、そして巧
みなポリマーイi工糧、例えばB型肝炎ウィルスの可溶性抗原などの抗原の自己
凝合、例えばミョウバン沈降物では、粒子形成の効果とゆっ(すした吸着の効果
との組合わせ作用が存在する。
(B)註魅聾 2−
長い歴史のある研究は、死滅ミコバクテリウム・ラベルクロシス(iiyCob
acterium tubercul’ojis)菌、又は大腸菌LPSなどの
毒性の微生物抽出物によって達成され得る全免疫応答の増強を模擬する純粋、安
全、有効、かつ非毒性の小さな有としては未だ見いだされておらず、毒性と効能
とを断絶させるの、は困−である。
例えば、IL−2を抗稈と共1°同時投与すると・抗原及U!、>9.’7oイ
“′をす幾つかの証拠がある; 5taruch、 M、 J、及びfood、
D、 D、のJ、 I+uuno1.130(1983)、 2P9
1を参照のこと。このアプローチがヒトにおける免疫計画に活用できるようにな
る以前には、さらに膨大な調査が必要とされた。しかし、以下の段で説明する教
示から、これは陳腐なものになったようである。
(D) 免疫原の放出の減速化
大量の純粋タンパク質抗原を突然に適用することは免疫応答の抑制経路を活性化
させる危険性を包含し、静脈内経路を使用する場合には特にその危険性を内包す
る。No5sa1. G、 J、 V、のNew Generation Va
ccines、 Marcel Dekker、 IncAニューヨ
ーク、バーゼル(Toodrov、 Levine編)、 (1990) 85
を参照のこと。皮下貯蔵部位からゆっくりと放出させれば、広範に点在する樹状
細胞及びマクロファージに抗原が膨大にアクセスされ、またそうすれば、クロー
ン増殖の最初の爆発後も抗原は依然として利用可能であり、二次応答のある種の
局面が提供されることになる。ゆっくりした放出は水酸化アルミニウムに抗原を
吸着させること(ミョウバン沈降物):抗原を油中水エマルジョンに入れること
:抗原をリポソームに組込むこと;及び他の同様な操作によって行われる。この
方法は、A項で説明している方法と概念的に近似している。
(E) 抗原と高度に免疫原性な物質との同時投与ある具体的なワクチンが高度
に免疫原性であれば、特定の免疫経路に向かう応答を導(ために有しているかも
しれないこのワクチンのアジュバント効果及びその特性も「過剰となり(spi
ll over)J 、それと同時に投与した抗原に対する応答をも導く場合が
ある。例えば、死滅ポルデテルラ・ベルラスシス(killed Bordet
ella pertussis)又はコリネバクテリウム・バルバム(Cory
nebacterium parvum)細菌は強力な免疫原である:純粋なタ
ンパク質を同じ注射で投与すれば、それに対する応答が増大する。ある種の免疫
原は(理由不明であることから)特定の方向下で応答を導く。例えば、Nipp
ostrongylus brasiliensisなどの寄生虫の抽出物は強
力なIgE応答を誘起させる。寄生虫抽出物と同時投与した純粋なタンパク質も
IgE応答を誘起する; No5sa1. G、 J、 V、のNew Gen
eration Vaccines、 1larcel@D
ekker、 Inc、 ニューヨーク、バーゼル(foodrov、Levi
neiii)、 (1990) 85を参照のこと。
おそら(、この効果は、特定の物質によって引き起こされる特定のリンホカイン
産生に幾分関連しているであろう。IL−4などのリンホカインはアイソタイプ
スイッチのパターンを導く。リンホカインのポリクローナル活性化特性も一般に
は免疫応答の強化の基礎をなすものである。
(F) 重要な抗原の遺伝子の運搬体としての遺伝子操作された微生物抗原遺伝
子の運搬体としての遺伝子操作された微生物の概念については、Pan1はワク
ンニアウイルスのゲノムを遺伝子操作して、種々の病原体の重要な宿主保護抗原
をコードする遺伝子をさらに含有させた。これらは、ワクシニアウィルス粒子及
び抗原と共に感染させた細胞によって合成される。この概念の改良が、1.an
gford、 C,J、、Edwards、 S、 J、 、 Sm1th、
G、 L、ら[11o1.Ce11.Biol、 12 i1986)、319
1]に
よって導入された。細胞表面関連抗原は強いT細胞応答を分泌抗原よりも誘起さ
せ易いという考えから、彼らは免疫グロブリン重鎖のトランスメンブランドメイ
ンをコードするDNA配列をPlasmodiu■falcipar北の可溶性
S抗原をコードする遺伝子と結合させ、得られた雑種(ハイブリッド)遺伝子を
ワクノニアウイルスのゲノムに導入した。この構築物により、有意に増大された
免疫原性が得られた。
生サルモネラ、BCG、及び麻疹ウィルスの使用も外来抗原を発現させることに
成功している。従って、生減衰ワクチンの利点は、組換えD N Aを含有する
ウィルスを基礎とするワクチンの利点と組み合わせることができる。
この考えはさらに発展し、種々のインターロイキンの遺伝子が、重要な抗原の遺
伝子を既に担持している遺伝子操作されたウィルスに挿入された。例えば、ワク
/ニアウィルス自身に対する免疫応答は、IL−2遺伝子をウィルスゲノムに挿
入することによって顕著に増大させることができ、免疫不全マウスを他の致命的
な感染から回復させることができるlRam5has、 1. A、、Andr
ev、 M、 E、、Ph1lips、 M。
(G) 疎水性アンカー及び免疫刺激性複合体サポニン又はQuil A\など
の表面活性物質を免疫刺激複合体[アイスコムス(i5coms)]を多くの実
験及び獣医ワクチンに使用した。これらは幾つかの抗原の免疫原性を改善し、特
にウィルスの膜タンパク質の免疫原性を改善した。
上記の「アジュバント方法」はすべて、幾つかの欠点を有している。
ミョウバン沈降物は局所反応、ならびにその炎症前(proinfla+nat
ory)及び脳障害発生の可能性など、望ましくない副作用があるために不都合
である。表面活性物質は多くの副反応を呈する これは刺激的、炎症前約であり
、コレステロール及び溶菌細胞と結合する。インターロイキンは全身反応を引き
起こすので、大量のワクチン注射に常用するのは望ましくない場合がある。
重要な抗原の遺伝子の担体として遺伝子操作された微生物を使用することは安全
面の関心から妨げられている。高度に免疫原性な物質と抗原との同時投与は、限
定されたクラスの小ペプチドの場合に実行できるのみである。抗原粒子を精製す
ることは同時に抗原量の有意な喪失を招く。体液性応答に対するリポソーム関連
抗原の免疫刺激作用は広範に認識される現象であるが、免疫増強は限定的であり
、この増強が引き起こされる機序は現在までのところ全体的に解明されていない
。
従って、本発明が関連する技術的な課題は、上述した不都合な点を有していない
免疫刺激及び免疫増強物質を提供することにある。
上記の技術的課題は、以下の請求の範囲にて特徴付けされている免疫刺激性の再
構成インフルエンザウイロソーム(IRIV)及びそのIRIVを含有するワク
チンを提供することによって解決される。このIRIVは、マクロファージ又は
B細胞などの抗原提示細胞に病原体の所望の抗原(又は全病原体)を能動輸送し
、次いで免疫系に対して該抗原を適切に提示させ、それにより免疫応答を誘起す
るビヒクルとして使用できる。
従って、本発明は、以下の成分を含有するIRIVを提供するものである=(a
) リン脂質の混合物、
(b) 本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロープ、(C) 該IR
IVと細胞膜との融合を誘発でき、また抗原提示細胞、好ましくはマクロファー
ジ又はB細胞によるエンドサイト−シス後の該IRIVの細胞溶解を誘発できる
、生物学的に活性であるインフルエンザ赤血球凝集素(HA)又はその誘導体、
及び
(d) 抗原。
特徴(a)における「リン脂質の混合物」は、天然又は合成リン脂質又はその混
合物を含有している。これは、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノ
ールアミンなどのグリセロリン脂質、及びコレステロールの中から選ばれる少な
くとも2つの別個の成分を含有する。特に4:1の比率にあるホスファチジルコ
リン及びホスファチジルエタノールアミンが好ましい。本発明の好ましい態様は
、該リン脂質の混合物(a)と該本質的に再構成された機能的なウィルスエンベ
ロープ(b)との比率が約1=1から約20:1のものである。最も好ましいの
は約10:1である。
「本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロープ」なる用語は、インフル
エンザウィルスのエンベロープの膜部分の内部(下方)に天然に存在している成
分を実質的に含んでいない再構成されたインフルエンザウィルスエンベロープを
意味する。好ましい態様では、本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロ
ープは、単一ラメラの二層からなる形態をとっている。この欠如している成分に
は、天然のインフルエンザウィルスエンベロープのマトリックスタンパク質があ
る。
本発明のIRIVの成分としての「生物学的に活性であるHA又はその誘導体」
なる用語は、生のHAの完全な生物学的活性を実質的に示し、かつそのために本
発明のIRIVがシアル酸含有レセプターを介してその標的細胞に吸着するのを
媒介できるHA又は誘導体を意味する。さらに、このようなHA酸成分循環して
いる抗−インフルエンザ抗体によって認識され得る。この生物学的活性は本発明
のIRIVの本質的な特徴である。
従って、本発明のIRIVのHA酸成分機能は下記のものと説明できる=(1)
HA酸成分標的細胞のシアル酸(N−アセチルノイラミン酸)含有レセプターに
結合し、ウイロソームー細胞の相互作用を開始させる;及び(2)それは、膜融
合という事象によってIRIVの細胞質内への侵入を媒介し、輸送された抗原の
放出を最終的に導く:(3)殆どのヒトは疾患又はワクチン接種による前暴露の
ためにHAに対して「プライムされている」と考えられるので、HA酸成分「認
識抗原」として働く。
従って、IRIVの本質的な特徴は、それが、生物学的に活性なウィルス糖タン
パク質(HA)又はその誘導体を抗原とは別にその表面に担持していることであ
る。本発明のIRIVのこの成分は、細胞の細胞質膜との迅速な融合を誘発し、
また輸送された抗原を例えば該細胞の膜中に速やかに放出させる。従って、輸送
される抗原が非特異的に分解される場合のある細胞質内に該輸送抗原が長期に滞
留するという望ましくない事象が避けられる。
抗原はマクロファージ及び他の補助細胞にとって適合性であるに違いないという
事実が最も優勢である。この意味において、本発明のIRIVの粒子の性質は、
すべての微生物と同様にそれが粒子本体であるために好都合である。ヒトの体内
に抗体が存在すると(インフルエンザの場合、すべてのヒトはインフルエンザ抗
原に対する抗体を有している。この抗体は従前のインフルエンザ感染又はワクチ
ン接種のいずれかに由来する)、該抗体によって認識される抗原がマクロファー
ジのみならず、細胞外局在として小胞樹状細胞の表面に抗原が長期間保持される
リンパ球様小胞に、侵入する速度を増加させる。マクロファージ及びリンパ球様
小胞に侵入するこの工程はオブソニアン化と呼ばれる。
抗体による結合は抗原の免疫原性の別の帰結である。溶液中にある特定の抗原A
は、特異性抗−Aの抗体分子をその表面に現すB細胞とのみ結合するが、免疫複
合体はFcレセプターによってB細胞に接着することができる。輸入性リンパ管
内のB細胞はリンパ節のB細胞領域に侵入できることから、Fcレセプターを介
したこの非特異的な結合はおそらく、リンパ球様小胞及びリンパ組織の他の塙所
に該抗原が輸送されることに基づく自然感染の1つの経路であろう[No5sa
l、 G。
J、 V、のNew Generation Vaccines(Woodro
v、 G、 C,及びLevine、 M、 1.編)、1撃≠窒モ■戟@De
kk
er、 Inc、 、 (1990) 85]。この機構は単球による輸送に対
して付加的なものであろう。
それ故に、IRIVの表面にインフルエンザ抗原が存在することはオプソニン化
の免疫学的な機構にとって有利である。
1つの態様では、本発明のIRIVは550アミノ酸の単一のポリペプチド鎖と
して合成される完全なHAを含有しており、これは以後、アルギニン329の除
去によって2つの鎖、HA、(36,334ダルトン)及びHA2(25,75
0ダルトン)に開裂される。これらの鎖は、HA、内の14位のシスティン及び
HAz内の137位のシステインに関連したジスルフィド結合によって共有結合
的に連結している場合もあり、2鎖モノマーは非共有結合的に会合し、IRIV
の表面にトリマーを形成している。これらのHA、又はHA2ペプチドは天然又
は合成起源から、又は遺伝子操作によって入手することができる。
好ましい態様では、本発明は該抗原が病原体(その部分を含む)から誘導されて
いるIRIVに関する。このような病原体の好ましい例としてはウィルス、細菌
、寄生虫、該ウィルス、細菌もしくは寄生虫を模擬する抗−イディオタイプ(抗
−Id)抗体、該ウィルス、細菌もしくは寄生虫に対する抗体、又は毒素が挙げ
られる。ウィルスの例示としては、A、B、C1DもしくはE型肝炎ウィルス、
ポリオウィルス、HIV、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルス、又はパラ
インフルエンザウィルスが挙げられる。細菌には、シュードモナス、クレブシェ
ラ、大腸菌、サルモネラ・チフス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ボルデテラ
・ベルラスシス(Bordetella pertussis)、クロストリジ
ウム・テタニ(Clostridiumtetani)、又はコリネバクテリウ
ム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)
がある。寄生虫の例示としてはプラスモディウム・ファルンパルム(Plasm
odiumfalciparum)が挙げられる。
本発明の特に好ましい態様は、該病原体がA型肝炎ウィルス(HAV)の場合で
ある。特に好ましいHAVはHAV株RG−8B XA112であり、これはブ
ダベスト条約の要件の下、パスツール研究所の微生物培養のコレクション・ナシ
ョナルにおいて1991年4月11日に受託番号l−1080として寄託されて
いる。
別の好ましい態様では、本発明のIRIVは抗原として該HAVのVPI、VF
6、VF6、VF4又は外被タンパク質を含有している。
本発明のIRIVのさらに好ましい態様では、抗原は膜に局在している。不活化
HAV抗原又はそのサブユニットはIRIVの表面にカップリングする場合があ
る。これは、抗原と適当な架橋リンカ−分子(例えば、N−スクシンイミジル・
3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、5PDP)との共有結合によって
、又はIRIVの膜の種々のリン脂質もしくはグリコ脂質との自発的な親油的結
合によって行うことができる。
さらに好ましい態様では、抗原、好ましくは不活化HAV抗原又はそのサブユニ
ットは非共有結合的にIR4Vの表面に吸着されている。
本発明の別の好ましい態様では、該抗原をIRIVの内部に局在させる。RG−
3B株又はその可溶性サブユニットの幾つかのHAV粒子をIRIVの再構成膜
によって閉じ込める。この抗原はIRIVのコア液内では可溶性状態にある。
本発明のさらに好ましい態様では、該HA誘導体はインフルエンザHA融合ペプ
チドである。抗原運搬体、IRIVと免疫コンピーテント細胞の細胞膜との融合
は本発明の基本原理であるので、インフルエンザHA融合ペプチド単独でも抗原
の放出を誘導するのに十分である。これは、細胞質体内(エンドサイトシーム)
の内面に特徴的であるpH値にて放出が起こるからである。細胞質体内、例えば
マクロファージ内のpHは約5.0と測定された[ff1ey、 D、 C,及
び5kehe1. J、 J、のAnn、 Rev、 Biochet 56
(1987)、365コ。pH5では、IRIVの表面のインフルエンザHA融
合ペプチドは天然のインフルエンザウィルスの場合と同じく活性化される。
別の言様では、本発明は本発明のIRIVを含有するワクチンを提供する。この
ワクチンは適当な製薬的に許容され得る担体及び/又は希釈剤をさらに含有する
ことができる。このワクチンは通常の経路及び投与量によって投与できる。
添付の図面は以下の事項を示す:
第1図: IRIVの電子顕微鏡写真
IRIVの表面に抗原が結合する前にホスホティング状態(phosphtin
gstate)でネガティブに染色した再構成産物の電子顕微鏡写真である・混
合リン脂質を生物学的に完全な活性インフルエンザ赤血球凝集素糖タンパク質ト
リマーと共にスパイクした。
第2図・rRIVの調製操作の原理
(a) 無傷のインフルエンザウィルス(b) リン脂質の混合物
(C) 無傷の不活化A型肝炎ピリオン(d)HA及びウィルスリン脂質を含有
する可溶性のインフルエンザ・スパイク・サブユニット抗原
(e) 抗原無しのリン脂質膜
(f)HAV抗原の表面における共有結合架橋リンカ−(g) ウィルスから抽
出されたリン脂質、及び表面におけるHAV、及びHAなどのインフルエンザ・
スパイク・タンパク質を担持する他のリン脂質によって再構成された膜を含有す
るI RI V00B図=A型肝炎ワクチンの寛容性
IRIV−HAVワクチンとA/−HAVワクチンとの比較第4図:A型肝炎ワ
クチンの免疫原性
IRIV−HAV’7クチンとAI−HAV’)”)チンとの比較篤5図二種々
の再構成インフルエンザ小胞の生物学的融合活性以下に実施例を挙げて本発明を
さらに説明する。
実施例1
表面に非共有結合的に結合しているA型肝炎ウィルス抗原を用いたIRIVの調
製
(A) ホスファチジルコリン(例えば、レシチン、シグマ)(75%)、ホス
ファチジルエタノールアミン(シグマ)(20%)、及びコレステロール(シグ
マ)(5%)〔すべてのリン脂質1−2%(W/V) =領 013−0.02
7Mコの、0.01Mトリス/塩酸、pH7,3を含有するO、IM NaC1
中分散液を、これらの成分をVIRTISホモジナイザーによって混合すること
により調製した。アセトン/水4・1 (V/V)から酸として再結晶したコー
ル酸ナトリウムをこのミルク状分散液に、非音波処理リン脂質分散液に存在する
多重ラメラ構造体を崩壊させるに必要な少なくとも0.03M(1,3%)の終
濃度で加えた。
NaC17,9mg/菖1.クエン酸三ナトリウム・二水和物4.4wghl、
2−モルホリノエタンスルホン酸・−水和物(MES)2.1℃g/璽l及びN
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸1.2mgklを
水中(INNaOHによってpHを7.3に調B)に含有する緩衝液中、0.1
Mオクタエチレングリコール・モノ(n−ドデシル)エーテル(CI2E8)[
ニツカ・ケミカルズ(東京)]700.l中にて、精製したインフルエンザウィ
ルス90A/台湾のペレット(0,002Mウィルス膜リン脂質)を溶解した。
この混合物を170.000×Gで30分間遠心し、インフルエンザ・スパイク
・タンパク質(HA)及びウィルスリン脂質を含有する上清を上記のミルク状リ
ン脂質混合物に加えた。
得られた懸濁液全体を少なくとも1時間低温(4℃)で撹拌した。次いで、上記
のリン脂質分散液の調製に使用したものと同じ緩衝液(4℃)で平衡化したセフ
ァデックスG−50(中度の粒子径)カラム(80X 15CI)に、得られた
懸濁液を適用し、その緩衝液で溶出した(流速320m1/時)。そのカラムを
超音波処理装置[Bransonic、 Branson Europe BY
、周波数5QkHz±10%]を接続した水浴中に浸した。10秒の超音波ショ
ックを毎分繰り返し、小さな均一ラメラのIRIVを得た。試料容量及びカラム
寸法は、空隙容量v0で溶出されるIRIVとコール酸ミセルとが完全に分離す
るようなものであった。3H−標識化コール酸塩[NENケミカルズ]を用いて
コール酸塩の保持を試験した。最初のセファデックスG−50クロマトグラフイ
ーの後では1%以下のコール酸塩しか保持されず、リン脂質/コール酸塩のモル
比率は〉50であった。4℃における12時間の第2のクロマトグラフィーによ
り、コール酸塩量が検出限界以下に減少し、リン脂質/コール酸塩の比率は>5
00(即ち、10以下のコール酸分子/IRIV)であった。通常の溶血試験に
よって残留Cl2Eaが存在しないことを試験した:その量は検出限界以下であ
った(>10100n。I RI V(第1図)は、約10OrlIOの平均直
径を示し、それは以下の態様でHAV抗原とコンジュゲートされた:HAV抗原
1mgを含有する精製し不活化したHAV懸濁液、株RG−3B XXAl12
(CNCl−1080)を超遠心(4時間、100,0OOXG)によってペレ
ット化した。上述のようにして調製したIRIVをそのペレットに加えた。再懸
濁した後、得られた懸濁液を20℃で一晩(16時間)撹拌した。HAV抗原は
ファンデル・ワールスカによってIRIVの表面に自発的に吸着した。
(B) 精製したインフルエンザウィルスA/シンカポール/6/86を、0゜
1Mオクタエチレングリコール・モノ(n−ドデシル)エーテル[ニツカ・ケミ
カルズ、東京1日本コ、7.9冒g/厘INacf 4.4冨g/諺!クエン酸
三ナトリウム・二水和物、2.1mg/厘nMEs、及び1.2mg/富IN−
ヒドロキシエチルピペラジン−N゛−2−エタンスルホン酸、pH7,3を含有
する緩衝液中で安定化した。この混合物を100.0OOXGで30分間遠心し
、HAを含有する上清を貯蔵した。
ホスファチジルコリン[PC;シグマ・ケミカルCo、、セント・ルイス、M○
]及びホスファチジルエタノールアミン[PE;シグマ](75%:25%vt
/vt)を0、OIM l−リス−Q、IM NaCl5pH7,3中に懸濁し
、ホモジナイズした。再結晶したコール酸ナトリウム[シグマ]を終濃度0.0
2Mで加え、多重ラメラ構造体を崩壊させた。この溶液にHAを含有する上清を
加え、得られた懸濁液を4℃で1時間撹拌した。上清を、領 01Mトリス−0
,1M NaC1゜pH7,3で平衡化したセファデックスG−50カラム[フ
ァルマンア・ファイン・ケミカルズ、アップサラ、スウェーデンコに適用した。
シールしたカラムを水浴中に入れた。溶出の間に、超遠心装置[Branson
ic、 Branson Europe BY、ザ・ネザーランズ]を使用して
超遠心ショック(50kHz; 10s/分)をその水浴に通した。IRIVを
含有する空隙容量の画分をまとめ、同一の条件下で再度クロマトグラフィーにか
けた。得られたIRIVは約150n曽の平均直径を有していた。
既知量の抗原を有する精製不活化HAV懸濁液を100.0OOXGで4時間遠
心し、ウィルスをペレット化した。適量のIRIV懸濁液をそのペレットに加え
、振盪により穏やかに再懸濁した。その懸濁液を20℃で48時時間中かに撹拌
し、HAVをIRIVの表面に吸着させた。このバルク懸濁液を滅菌したリン酸
緩衝化食塩水pH7,4で希釈し、終濃度を2μgHAV抗原/mlとし、ビン
中で保存した。
架橋連結したHAV抗原を用いたIRIVの調製は第2図に模式図的に示してい
る。
以下の改変を加えつつ実施例1の記載に従ってIRIVを調製した:適当な架橋
リンカ−分子を用いてHAV抗原分子をIRIVに接着させた。以下の操作を使
用した。
(A) ホスホエタノールアミン(P E)を以下のようにしてN−スクシンイ
ミジルピリジル・ジチオプロピオネート[5PDP、ピース(Pierce)]
とカップリングした:
PE(20μmol)15++gを5ml容量がラスピン中で乾燥した。得られ
た乾燥PEを乾燥クロロホルム(モレキュラー・シーブで乾燥>2wl中に再溶
解した。
次いで、トリエチルアミン(TEAX3鳳g)30μmol、次に乾燥エタノー
ル1Ml中、SPDP(Lollg)30μ@olを加えた。次いで、得られた
混合物を窒素雰囲気下に室温にて、反応が終了するまで(即ち、遊離のPEが存
在しなくなるまで)1−2時間撹拌した。得られた反応生成物を回転エバポレー
ターで乾燥した。
乾燥した脂質をクロロホルム中に再懸濁し、次ぎのようにして調製しておいたケ
イ酸クロマトグラフィーカラムの上部に素早く適用した:ケイ酸2gをクロロホ
ルム10m1に溶解させる。得られた溶液を、ガラスファイバーでプラグしたI
QmA容量のプラスチック製シリンジバーレル中に注いだ。余剰を漏出させ、シ
リンジバーレルにプラスチック製の使い捨て3ウ工イ蛇口(three−way
tap)を取り付けた。上記の脂質を適用した後、カラムをクロロホルム4露
lで洗浄した。
最後に、まず4 : 0.25(v/v)、次いで4 : 0.5(v/v)、
4:175 (v/v)、そして最後に4 : 1 (V/V)という一連のク
ロロホルム−メタノール混液でカラムを洗浄し、2mlの画分を採取した。次い
で、シリカゲル平板を使用し、クロロホルム−メタノール−水(65:25:4
容量比)で展開する薄層クロマトグラフィー(TLC)によって、純粋な誘導体
を局在化させた。誘導体は遊離のPEよりも速(移動し、ホスホモリブデート又
はヨウ素によってスポットを視覚化した。
所望の生成物を含有する両分をまとめ、回転エバポレーターによる減圧蒸留によ
って濃縮し、た。
(B)HAV抗原を以下の操作によりチオール化した: 精製し不活化したHA
V5冨lを5冨g/冒!−1の濃度でO,1Mリン酸緩衝液(PBS、pH7,
5)中に溶解した。次いで、エタノール中、濃度20 、czaol−’(6+
+g/ml−’)の5PDP溶液を混合し、その150μlをハミルトン・シリ
ンジでHAVタンパク質溶液5茸lに撹拌しながらゆっくりと加え、5PDP:
タンパク質のモル比、15:1を得た。エタノールの濃度を5%以下に保持し、
タンパク質の変性を防止した。
得られた混合物を室!(20℃)で30分間反応させた。反応が停止した後、0
゜05Mクエン酸ナトリウム(Na3CsHsOt ・2H20,19,7g!
−’)、0゜05M リン酸ナトリウム(Na2HP○4・7H20,13,4
g!−’)、及び0゜05M塩化ナトリウム(2,9g−1”)、pH7,0を
含有する溶液で平衡化したセファデックスG−50のゲルクロマトグラフィーに
よって、そのタンパク質を反応体から分離した。
(C) 前処理したIRTV及びHAV抗原を以下のようにしてカップリングし
た・ IRIVを実施例1のようにして調製した。PHの代わりにPE−8PD
Pを使用した。
HAV−3PDPを以下のようにして還元した: クエン酸−リン酸緩衝液中、
HAV−3PDP溶液<7)pHをIM HCI(D添加i:よつrpH5,5
1:調節シタ。
0.2M酢酸緩衝液、pH5,5(1OIf中、酢酸ナトリウム165翼g)中
、DTT溶液、2.5Mジチオスレイトール(DTT、380zg/翼り10μ
lをタンパク質溶液1mj’毎に加えた。得られた溶液を30分間放置した。次
いで、PBS緩衝液、pH7,0で平衡化したセファデックスG−50カラムの
クロマトグラフィーによってタンパク質をDTTから分離した。チオールの酸化
を防止するため、すべての緩衝液は窒素で泡立たせ、酸素を除去した。タンパク
質の両分も窒素雰囲気下に採取した。
最後に、室温、−晩の撹拌によってIRIVをチオール化タンパク質と混合した
。
以下の改変を加えて実施例2に記載のようにしてIRIVを調製した: HAV
抗原を5PDPとはカップリングさせず、VPIタンパク質の表面に既に存在し
ているジスルフィド架橋を遊離チオール基の前駆体部として使用した。遊離チオ
ール基へのこの変換は以下のようにして行った:Q、1Mリン酸緩衝液pH7,
4中、最終抗原濃度5mghlのHAV溶液溶液5壱f製した。この溶液1冨l
当たりにDTT溶液(実施例2に記載のようにして調製)10μlを加えた。得
られた混合物を30分間放置した。次いで、PBS緩衝液pH7,0で平衡化さ
せたセファデックスG−50カラムのクロマトグラフィーによって、タンパク質
をDTTと分離した。タンパク質画分を窒素雰囲気下に採取し、実施例2のIR
IVと混合した。
以下の改変を加えて実施例1に記載のようにしてIRIVを調製した。精製し不
活化した懸濁液中のHAVlmgを精製したインフルエンザウィルス90A/台
湾(ウィルス膜すン脂買0.002M)のペレットに加え、実施例1に記載の方
法によってIRIVに組み込んだ。
実施例1.2.3又は4に従ってHAV−IRIVを調製し、それを終濃度50
0ngHAVタンパク質ml−’でPBS(pH7,4)中に希釈した。このバ
ルク溶液を孔サイズ0.2μ菖の膜[11i11i−pare]に通して滅菌濾
過した。保存剤(チオマーサル(thiomersal))を終濃度10−4で
加えた。得られた最終バルクワクチン0゜6冨lを滅菌条件下にワクチンバイア
ルに充填した。国際基準に則って安定性及び効力試験を行った。
実施例6
C型肝炎に対する抗−イディオタイプIRIVワクチンの調製イディオタイプと
しても知られている抗体分子(Abl)の抗原結合部位は抗体(抗−イディオタ
イプ、又はAb2)の産生を誘導することが示されている。動物にある種のAb
2を接種すると、抗原結合能がAblと類似している抗体(Ab3)が産生され
るので、Ab2の結合部位は、元来はAbl(そして次ぎにAb3)によって認
識される抗原決定基の「鏡像」として機能すると予想される[Jerne、NJ
、、 Ann。
Immunol、 (パリ) 125 C(1974)、 373]、抗原特異
的な抗体(Ab3)を惹起させるために抗−1d抗体(Ab2)を使用する主要
な利点は、ワクチンの受容者が感染物質又は外来遺伝子を含有する物質とは決し
て接触しないことである。
C型肝炎に対する抗−イディオタイプIRIVワクチンを以下のようにして調製
した二 以下の計画に沿ってヒツジをAb、(PBSに濃度1mg/wslで溶
解している)で免疫した。0日日に動物の種々の部位(縫部)に投与量2mlを
筋肉注射した。7.14及び28日目に、両方の後脚に2mlを2回投与した。
42日目に、各ヒツジから血液350m1を採取した。血清画分を分離し、常法
[G10Ck、 R,及びLabert、D、 ;狂犬病の実験手法、WHo、
4版、1991.出版中、を参照のことコに従ってさらに精製した。
精製した抗−1dC型肝炎抗体をペプシンによる消化によって開裂させ、得られ
たF (ab’ ) 2断片をDTTで還元しく実施例2を参照のこと)、2つ
のF ab’断片を得た。これらのF ab’断片は、実施例2のIRIVと直
接反応する遊離のスルフヒドリル基を含有していた。この調製物をPBS(pH
7,4)によってタンパク質濃度50ag/mlにまで希釈し、ワクチンバイア
ル中に0.6mfづつ分取した。
実施例7
不活化A型肝炎ワクチンの安全性及び免疫原性・ 実施例1に従って調製したI
RIV−HAVとミョウバン吸着ワクチンとの比較(A)A型肝炎ウィルス(H
AV)をMRC−5ヒト二倍体細胞[受託番号ATCCCCL 171の下にア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能]にて生育させた後
、精製した。ホルムアルデヒド(0,05%)を用いて37℃で10日間処理し
、そのウィルスを不活化した。2つの組みのワクチンを試験した。ワクチンの第
1組は、実施例1(A)に記載のIRIVに結合した不活化ウィルスから構成さ
れている(IRIV−HAV)。第2組のワクチンは、0゜4%AA’(OH)
3を含有するミョウバン吸着調製物であった(AA’−HAV)。両ワクチンと
もに、0. 5ysl用量当たりHAV抗原150ngを含有していた。血清反
応陰性の成人志願者(15人づつの2グループ)にO5目に2回の筋肉内注射を
し、7日日にデルタ領域内にブースター注射した。全身反応あるいは血液化学の
別の反応も全く検出されなかった。局所反応については、IRIV調製物はミョ
ウバン吸着ワクチンよりも有意に低いパーセンテイジの反応しか惹起させなかっ
た。これらの実験結果を以下の第3表にまとめる。
IRIV調製物はミョウバン調製物よりも免疫原性が高いことも見いだされた。
抗−HAV免疫応答を試験するため、最後の注射の21日及び28日後に血液試
料を志願者から採取した。市販のRIA [アボット(Abbott)]を使用
し、HAV特異的な抗体について血清を試験した。得られた結果を以下の第4表
に示す。その欄の数字は抗−HAV抗体の力価の範囲を示している。従って、I
RIV及びミョウバン吸着ワクチン製剤についての21日目の抗−HAV抗体力
価の範囲はそれぞれ、82−988及び69−844である。IRTV及びミョ
ウバン吸着ワクチン製剤の28日における相乗平均力価(範囲)はそれぞれ、4
53WIU/1l(92−1210)及び361薦IU/厘I(60−929)
であった。このように、本発明のIRIV調製物はミョウバン吸着ワクチンより
も優れている。
(B) 120人のヒト志願者による第1相臨床試験において、単一1RIVア
ジユバント化A型肝炎ワクチンは、A型肝炎に対して誘発される保護抗体力価を
ミョウバン処方後の抗体力価よりも7倍高くすることが証明できた。他のリポソ
ーム、ウイロソーム又はイムノソーム製剤では完全に生物学的に活性な融合ペプ
チドが明らかに欠如しているので、現在までのところ、それらを用いてはこのよ
うなヒトにおける高い免疫強化性は達成されていない。
HAV血清反応陰性(<10真IU/++A’)の120人の健常成人のすべて
に、液状、ミョウバン吸着、又は実施例1(B)に記載のIRIVワクチンのい
ずれかを無作為に投与した。ワクチン(0、5ml)は、デルタ領域内に筋肉注
射で投与した。志願者は、ワクチン接種後約30分間、即時型反応について観察
した。志願者それぞれに、免疫後4日間の有害反応のすべてを記録用紙に記録す
るよう依頼した。抗−HAV抗体を測定するための血清試料を、免疫時及びそれ
から14日後に採取した。
各ワクチン製剤には、用量0. 5mj!当たりHAV抗原1μgが含有されて
いる。IRIV−HAV製剤の1回用量もインフルエンザHALOμg及び総リ
ン脂質125μgを含有している。3つすべてのワクチンが滅菌されており、ま
た毒物に対して無毒性であることが標準的な試験方法によって確かめられた。さ
らに、3つの製剤はともに実験動物に対して良好な抗−HAV抗体応答を惹起さ
せた。
HAV抗体について血清反応陰性の健常成人志願者40人に、各製剤を筋肉的投
与した。各グループは年令及び性別について十分に適合していた。免疫に伴う有
害反応を第1表に示す。すべてのワクチンについて、注射部位の痛みが不平とし
て最も頻繁に記録されたものであった。このような不快さは、液状製剤を投与し
た1人のワクチン接種者(2,5%)、ミョウバン吸着ワクチンによって免疫し
た9人(23%)、そしてIRIV調製物を投与した1人(2,5%)に中等度
と分類された。激しい痛みがミョウバン吸着ワクチンを投与した1人の被験者に
報告された。「痛み」反応を記録した他のすべての被験者ではそれは中等度であ
った。
ミョウバン吸着ワクチンによる免疫は液状又はIRIV製剤のいずれと比較して
も、それよりも有意に(P<0.01)高い痛み及び膨潤/硬化の両傾向を伴っ
た。
ワクチン接種が原因の全身反応は見いだされなかった。
ワクチン接種の14日後に生じた抗−HAV抗体応答を第2表に示す。液状ワク
チンによる免疫により、相乗平均力価(GMT)として15.7mIU/m1が
得られ、被験者の30%が血清変換された(>20m1U/++1)。ミョウバ
ン吸着ワクチンは適度に高いGMT(21,3m1U/g/)及び血清変換率(
44%)の両者を誘起したが、いずれも液状ワクチンを用いて得られるものより
も有意に大きくはなかった。対照的に、IRIVワクチン製剤は遥かに強力な抗
体応答を惹起させた。GM7139.8は他の2つのワクチンのいずれと比較し
ても有意に(P<0.0001)高かった。1人を除いてすべてのワクチン接種
者は≧100mIU/w+1を示した。すべてのワクチン接種者が14日までに
血清変換したことは、他のワクチン製剤が50%以下であったことと比較すれば
、重要な事実である(P<Q、005)。
第1表
ワクチン 痛み 膨潤/ 発赤 発熱 頭痛 倦怠感硬化
液状 42” 0’ OO00
AJ(OH)3−吸着 88 23 0 0 0 0+対*又は且:P<0.0
1
τ対11又は**:P<0. 01
ワクチン 0日 14日 血清交換率
製剤 数〉20冨IU/全数(%)
液状 GO15,7(<1O−100)” 12/40 (30%)!A/(0
11[)3−吸着 <to 21.3 (10−100)+18/40 (44
%)1被験者には08目にワクチンを単一投与した。
5対*又は+: P<0.0001
**対11又は町 :p<Q、005
実施例8
種々の再構成インフルエンザウイロソームの生物学的融合活性インフルエンザウ
ィルスの膜成分の融合反応における役割を詳細に試験するためには、これらの成
分を操作できることが必要である。この目的から、ウィルススパークタンパク質
の単離及び再構成のための方法が必要であり、それにより完全な生物学的融合活
性を有する再構成ウイロソームが得られる。ウィルスエンベロープを再構成する
ために使用されていた殆どの方法は、洗浄剤を用いたウィルス膜の可溶化を基礎
としている。
文献に記載されている種々の方法を使用し、幾つかの再構成インフルエンザウィ
ルスエンベロープを調製した:
[AJ 高い臨界ミセル濃度(C,鳳、C1)の洗浄剤(例えば、オクチルグル
コシド)を使用して調製されたHuang、 R,T、 C,のウイロソーム[
Huang、 R,τ、C,,fahn、に、、 Klenk、 H,D、及び
Rott、R,、Virology 97 (1979)、 pp、212−2
171゜[B] 低い臨界ミセル濃度の洗浄剤(例えば、トリトンX−100)
を使用して調製されたhwasaki、 Lらのウイロソーム[Kawasak
i、 K、 、 5ato、 S、 B、及びOh社ski。
S、1.、 Biochem、 Biophys、 Acta 733 (19
83)、 pl)、26g−2901゜[Cl Non1det P−40を洗
浄剤として使用して調製されたHo5oka、 Y、らのウイロソーム[Ho5
aka、 Y、 、 Yasuda、 Y、及(J7ukaiJ、、 J、Vi
rol、 46 (1983)、 pp、1O14−101
7コ。
[D] 実施例1に記載しているI RI V。
さらに、以下の対照物を調製した:
[E] ポジティブな対照としての精製インフルエンザウィルス懸濁液。
CF] ネガティブな対照としてのPBS−NaC1,pH7,4゜再構成イン
フルエンザウィルスエンベロープ溶液及びインフルエンザウィルス対照それぞれ
から、10+*M NaCAを加えた重炭酸塩を含まないRPMI 1640培
地中(pH7,4)、10gg/l/の赤血球凝集素の濃縮物を調製した。ネガ
ティブ対照(P B 5−NaC1>を同じ培地中に希釈した(1:10)。小
胞結合性及び融合実験のため、MRC−5ヒト二倍体フィブロブラストを12ウ
エルのクラスター皿(NUNC)中で増殖させた。1ウエル当たり34.000
細胞/llで細胞を接種し、3日後にそれを使用した。細胞はこの時点で、約7
0−80%全面成長していた。
各調製物について20ウエルにつき、再構成エンベロープ溶液Q、5zlを各ウ
ェルに加えた。室温にて30分間小胞を細胞に結合させた。このインキュベート
の間に、皿をスピン間180°で反転させ、5009で3分間2ロ転させた。
この遠心工程により、小胞の結合性が約3倍高められる。この30分後、得られ
た細胞をPBS−NaC1pH7,4で4回洗浄し、非結合小胞を除去した。融
合実験のため、融合培地[10mMスクシネート、0. 2%ウシ血清アルブミ
ン及び35rnM NaCl、pH5,0を加えたRPMI 1640]を各ウ
ェルに加え(0゜5 ml/ウェル)、5つの調製物の融合活性を誘発した。1
分後、各調製物について2ウエルにつき、この融合培地を無水エタノールと交換
して融合反応を停止させた。10分が経過するまで、毎分この操作を行った。次
いで、May GrLlnwald −Giemsaの方法に従って細胞を染色
した。 細胞をアルコール性May−Grtlnwald溶f&(Fluka
No、 63590)で覆った。5分後、細胞を素早くリン酸緩衝液pH6,5
で洗浄し、ギムザ溶液(Fluka No、 48900)で染色し、同じリン
酸緩衝液で1=10に希釈した。さらに10分経過後、細胞を流水で洗浄した:
顕微鏡下では、細胞の細胞質は明るい青色に見え、細胞膜は暗い青色に、そし
て核は暗い赤色に見える。
顕微鏡下にて、融合細胞(少なくとも2つの核を含有する細胞)を計数するため
、10視野を評価し、調製物ごとに、及び各時間間隔で計算した。第5図は、2
つのウェルの平均値を示している+ IRIVm製物のみが、インフルエンザウ
ィルス対照に匹敵する融合活性を有していることは明らかであった。調製物[B
]は、ポジティブ対照の約30%の融合活性しか示さなかった。他の調製物は融
合活性を示さなかった(ネガティブ対照と比較して)。これらの結果から導かれ
る結論として、本明細書に記載したIRIVだけしか完全な生物学的融合活性を
示さず、インフルエンザエンベロープ再構成のための他の方法では融合活性を備
えた小胞は得られず、これらは融合活性の大部分の喪失、ないしは完全な喪失を
導く、と言い得る。
F工G、1
へg!A肝炎ワクチンの寛寥性
IRIV−HAV 対AI−HAV
二1履 ■ 2糎
jlHV441& AHfAV
高い有意蓋(gs6.0(2)
A型肝炎ワクチン
!RIV−HAV 対 AI−HAV
シ5=至
種々の再構成インフルエンザ小胞の生物学的融合;舌性細胞融合の時間(分)
4組:(D) 5111:N) 6組:(F)国際調査報告
国際調査報告
EP 9201014
S^ 60403
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(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号A61K 39/395
D 9284−4CN 9284−4C
(81)指定図 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、 SE)、 AU、
CA、JP、 USI
Claims (21)
- 1.以下の成分を含有する免疫刺激性の再構成インフルエンザウイロソーム(I RIV): (a)リン脂質の混合物; (b)本質的に再構成された機能的なウイルスエンベロープ;(c)細胞膜と該 IRIVとの融合を誘発でき、そして抗原提示細胞、好ましくはマクロファージ 又はB細胞によるエンドサイトーシス後に該IRIVの細胞溶解を誘発できる生 物学的に活性であるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質(HA)又はその誘 導体;及び (d)抗原。
- 2.本質的に再構成された機能的なウイルスエンベロープが単一ラメラの二層形 態にある請求項1に記載のIRIV。
- 3.該抗原が病原体から誘導されたものである請求項1に記載のIRIV。
- 4.該病原体が微生物病原体である請求項3に記載のIRIV。
- 5.該病原体がウイルス、細菌又は寄生虫又はそれらの部分である請求項3に記 載のIRIV。
- 6.該抗原が、病原体に特異的な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体である請 求項3に記載のIRIV。
- 7.該抗原が毒素又はトキソイドである請求項3に記載のIRIV。
- 8.該病原体がA型肝炎ウイルス(HAV)である請求項5に記載のIRIV。
- 9.HAVがA型肝炎株SB−RGXA112(CNCMI−1080)である 請求項8に記載のIRIV。
- 10.HAVが不活化されている請求項8又は請求項9に記載のIRIV。
- 11.該病原体からの誘導化抗原がVP1、VP2、VP3、VP4又は該HA Vの外被タンパク質である請求項8又は請求項9に記載のIRIV。
- 12.該抗原が該IRIVの膜に局在している請求項1から請求項11のいずれ かに記載のIRIV。
- 13.該抗原が該IRIVの内部に局在している請求項1から請求項11のいず れかに記載のIRIV。
- 14.該抗原が該IRIVの表面に吸着されている請求項1から請求項11のい ずれかに記載のIRIV。
- 15.該HA誘導体がHA融合ペプチドである請求項1から請求項14のいずれ かに記載のIRIV。
- 16.該混合物がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを 含有する請求項1から請求項15のいずれかに記載のIRIV。
- 17.ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの比率が41 である請求項16に記載のIRIV。
- 18.(a):(b)の比率が約1:1から約20:1である請求項1から請求 項17のいずれかに記載のIRIV。
- 19.製薬的に許容され得る適切な担体及び/又は希釈剤も一緒に含有すること ある、請求項1から請求項18のいずれかに記載のIRIVを含有するワクチン 。
- 20.請求項1から請求項18のいずれかに記載のIRIVの適当な投与量を投 与することを特徴とする、免疫系の刺激が要求されている患者の免疫系を刺激す る方法。
- 21.請求項1から請求項18のいずれかに記載のIRIVの適当な投与量を感 染症の予防が必要である患者に投与することを特徴とする、感染症を予防するた めの方法。
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