EA011421B1 - Способ получения противоопухолевой вакцины - Google Patents
Способ получения противоопухолевой вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- EA011421B1 EA011421B1 EA200801751A EA200801751A EA011421B1 EA 011421 B1 EA011421 B1 EA 011421B1 EA 200801751 A EA200801751 A EA 200801751A EA 200801751 A EA200801751 A EA 200801751A EA 011421 B1 EA011421 B1 EA 011421B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- antigens
- antigen
- living cells
- presenting cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 199
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 199
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 197
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 30
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000005749 Anthriscus sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710106089 Protein cutoff Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/49—Breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтике и медицине и может быть использовано для производства лекарств и осуществления медицинских технологий, в частности иммунотерапии онкологических заболеваний. Способ получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, включает нагрузку антигенпрезентирующих клеток, которую проводят антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней. Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в создании вакцины, способной повысить цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов в отношении клеток-мишеней за счет облегчения восприятия ими заданной совокупности антигенов.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтике и медицине и может быть использовано для производства лекарств и осуществления медицинских технологий, в частности иммунотерапии онкологических заболеваний.
Наряду с такими методами лечения опухолевых заболеваний, как оперативное лечение, химио- или лучевая терапии, в лечении онкологических больных также используют и иммунотерапию. Одним из наиболее перспективных вариантов иммунотерапии является противоопухолевая вакцинация, которая заключается в индукции у онкологического больного иммунного ответа против антигенов вакцины, которые в той или иной степени идентичны антигенам опухоли. Таким образом, вызванный вакциной иммунный ответ перекрестно повреждает опухолевые клетки (ОК), что и определяет лечебный или профилактический эффекты противоопухолевой вакцинации. Более подробно о противоопухолевых вакцинах можно прочитать в книге Сапсег 1ттипе Тбегару: Ситтеп! апб Ейиге 81га1сц1С8” (ебк. 81иЫе С. апб \Уа1беп Р., 1обп ХУбеу & 8опк, 1пс, 2002).
Основными факторами, определяющими эффективность вакцин, являются, во-первых, специфичность входящих в нее антигенов в отношении клеток опухоли пациента и, во-вторых, возможность вызвать к этим антигенам сильный и устойчивый иммунный ответ.
Известны способы получения противоопухолевых вакцин, включающих антигены различной природы, имеющие свои преимущества и недостатки.
Так, например, в качестве антигенов при получении используют синтезированные пептиды, в частности др100(д209)-2М, МАВТ-127-35, МАСЕ-3.А1, ΝΥ-Ε8Ο-1, К-Вак/12 и т.д. (см. ВокепЬетд 8.А. е! а1. 1ттипо1одю апб Фегареибс еуа1иабоп οί а купФебс рерббе уассше ίοτ 1Не 1геа1теп1 οί рабейк \νίΐ1ι те!ак1абс те1апота. №11иге Меб 1998, ν.4, р.321-327; Сотт1ет Ι.Ν. е! а1. Епбапсетеп! οί се11и1аг 1ттипйу т те1апота рабеп!к интши/еб \νί11ι а рерббе Ггот МАКТ-1/Ме1ап А. Сапсег ί δα. Ат 1997, ν.3, р.37-44; Матсбапб М. е! а1. Титог гедгеккюпк оЬкетуеб т рабеп!к νίΐΐι те!ак!абс те1апота 1геа1еб νίΐΐι ап апбдешс рерббе епсобеб Ьу депе МАСЕ-3 апб ргекейеб Ьу НБА-А1. 1п! 1 Сапсег 1999, ν.80, р.219-230; 1адет Е. е! а1. ’Тпбисбоп оГ рптагу ΝΥ-ΕδΟ-1 1ттипйу: СЭ8+ Т 1утрбосу!е апб апбЬобу гекропкек ш рерббеуассбдНеб рабейк \νί11ι ΝΥ-Ε80-1+ сапсегк. Ргос №б Асаб δα. И8А 2000, ν.97, р.12198-12203; О)ебкеп М.К. е! а1. 1йгабегта1 гак рерббе уассбиЮоп νίΐΐι дгапи1осу!е-тасгорбаде со1опу-кбти1абпд Гас!ог ак абщνап!: сбшса1 апб 1ттипо1од1са1 гекропкек ш рабейк νί(Η рапсгеабс абепосатсшота. 1п! 1 Сапсег 2001, ν. 92, р. 441-450).
В других способах получения противоопухолевых вакцин в качестве антигенов используют белки, например, белки теплового шока или простат-специфический антиген (см., например, Маицб М.Н. е! а1. 'ТттипоШетару оГ сапсег иктд беа! кбоск рго!ешк. Бгоп! Вюка. 2002, ν.7, б.43-52; Ме1бепЬаиег Ν. е! а1. Сепетабоп оГ ЕГГес!ог Се11к АГ!ег Уасстабоп \УИ11 а Р8А-Вакеб Уассше. Ргок!а!е 2000, ν.43, р. 88-100). К основным преимуществам вакцин, полученных указанными способами с применением синтетических пептидов и определенных белков, можно отнести их низкую аллергенность, безопасность и относительную легкость в стандартизации производства.
Основной недостаток известных способов получения вакцин - это невозможность получения вакцин, вызывающих иммунный ответ с высокой противоопухолевой эффективностью. Данное обстоятельство связано с тем, что ОК отличаются генетической нестабильностью и в организме больного постоянно мутируют, что приводит к появлению новых, имеющих измененный антигенный состав ОК. Таким образом, определенный антиген, к которому пептидный или белковый антиген вакцины вызывает иммунный ответ, может быть изменен или отсутствовать у всех или части ОК больного. Более того, для большинства видов опухолей не известны отдельные специфичные для них антигены, которые можно было бы использовать для противоопухолевой вакцинации.
Известны также способы получения противоопухолевых вакцин, включающих специфические опухолевые антигены - так называемых цельноклеточных вакцин. В них в качестве антигенов применяют целые опухолевые клетки. Существует множество примеров применения целых ОК в качестве антигенов противоопухолевых вакцин, в частности, вакцин против колоректального рака, меланомы и карциномы почки (см. Атшкбопд А.С., Еа!оп Ό., Е\тб1д 1.С., Се11и1аг 1ттипо1бегару Гог Сапсег, Вп!. Меб. Т, 2001, ν.3323, р.1289-1293). Из патента США υδ 6039941 (МПК Ο2Ν15/09, А61К31/00, опубл. 21.03.2000) также известен способ получения цельноклеточной противоопухолевой вакцины, где в качестве антигенов используют целые ОК с введенными генно-инженерным способом генами, кодирующими поверхностные белки с иммуностимулирующей активностью.
В других способах получения противоопухолевых вакцин, включающих специфические для опухоли антигены, в качестве антигенов используют неопухолевые клетки. Например, известно использование в качестве антигенов клеток эндотелия сосудов, вакцинация которыми вызывает иммунный ответ, направленный на повреждение сосудов солидных опухолей. Из литературных данных известен способ применения в качестве антигенов ксеногенных эндотелиальных клеток (ЭК), т.е. клеток, выделенных из эндотелия сосудов организма другого биологического вида, нежели вакцинируемый организм (см., например, \¥е1 Υ., 1ттипо!бегару оГ !итогк \ν61ι хеподепею епбо1беНа1 се11к ак а уассбто. №1Шге Мебюше, 2000, ν.6, р. 1160-1166). Недостатком подобных вакцин является то, что ксеногенные антигены хоть и более иммуногенны, но менее специфичны для сосудов опухоли вакцинируемого организма, что в итоге
- 1 011421 приводит к снижению эффективности вакцины.
Из другого источника известно применение в цельноклеточной вакцине в качестве антигенов аллогенных ЭК, т.е. клеток другого организма, но того же биологического вида, что и вакцинируемый организм (см., например, 8еаррайсс1 Р.А., Νοίαη С.Р., 'Тибисбои о! аибЧишот 1ттиийу ίη т1се иктд а куидепе1с еибоШе11а1 се11 уассте, Аибсаисег Кек., 2003, ν.23, р.1165-1672; авторы научной работы также сравнивают эффективность вакцинации при использовании в качестве антигенов ЭК из различных источников). Недостатком аллогенных антигенов ЭК также является низкая их специфичность для сосудов опухоли вакцинируемого организма.
Из статьи Окар Υ. и соавт. (Уассшабои \\йН аи1о1одоик еибоШебиш шЫЬйк аидюдеиебк аиб те1ак1ак1к о! со1ои саисег (НгоидН аШот-шцтЦу. Саисег 8ск, 2004, ν.95, р.85-90) известно применение в качестве антигенов аутологичных ЭК, т. е. клеток, полученных из вакцинируемого или генетически идентичного (сингенного) организма. Подобные вакцины дают наиболее специфичный иммунный ответ, по сравнению с использованием ксеногенных или аллогенных ЭК.
К очевидным преимуществам использования цельноклеточных противоопухолевых вакцин относят их поливалентность (т. е. содержание множества антигенов). Поливалентность вакцины позволяет вызывать иммунный ответ не к одному, а одновременно к множеству антигенов на поверхности ОК пациента, что существенно увеличивает вероятность уничтожения опухоли. Второе преимущество - это высокая специфичность антигенов, особенно в случае применения в качестве антигенов для вакцинации аутологичных ОК, т. е. ОК, выделенных из опухоли того же больного, которому проводят вакцинацию. К преимуществам использования целых ОК в качестве антигенов можно отнести возможность их использования в вакцинации больных с опухолями, для которых неизвестны отдельные опухолеспецифичные антигены и, соответственно, не созданы моновалентные вакцины.
Основным недостатком всех цельноклеточных противоопухолевых вакцин является то, что вакцинация целыми клетками имеет низкую эффективность. Антигены при попадании в организм больного должны поглощаться антигенпрезентирующими клетками для дальнейшего их представления Тлимфоцитам. В случае использования в качестве антигенов целых клеток, поглощение их антигенпрезентирующими клетками затруднено.
Второй существенный недостаток заключается в том, что целые клетки помимо целевых антигенов, которые представлены на их поверхности, содержат множество непригодных для вакцинации антигенов и балластных веществ, происходящих из внутриклеточного содержимого. Непригодность внутриклеточного содержимого для вакцинации объясняется тем, что внутриклеточные антигены скрыты внутри клеток и недоступны для иммунной системы организма. Таким образом, проблема поглощения ОК антигенпрезентирующими клетками и наличие в вакцине нецелевых антигенов и балластных веществ существенно ухудшают эффективность цельноклеточных вакцин.
Частично проблемы цельноклеточных вакцин решаются применением в качестве антигенов не самих ОК, а их лизатов. Из международной заявки νθ 02053176 (МПК А61К39/00; Ο12Ν5/06; А61К39/00; Ο12Ν5/06 опубл. 11.07.2002) известен способ получения противоопухолевой вакцины, включающей антигены, которые представляют собой лизат ОК, содержащий дезагрегированные антигены. Они легко поглощаются антигенпрезентирующими клетками, что в итоге приводит к более выраженному иммунному ответу при вакцинации. Недостатком использования лизатов ОК является то, что основную массу лизата также составляют нецелевые антигены, вызывающие иммунный ответ на скрытое от иммунной системы внутриклеточное содержимое ОК больного. Более того, подобные вакцины содержат множество балластных веществ, в частности, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и т.д.
Из патента США И8 5993829 (МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 30.11.1999) известен способ получения противоопухолевой вакцины, при котором антигены получают с поверхности клеток. ОК культивируют 1и νίΙΐΌ и получают антигены, теряемые ими в ростовую среду. Эти антигены, также описанные в патентах И8 6338853 (МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 15.01.2002), ϋδ 5030621 (С07К14/47, С07К14/435, опубл. 09.07.1991), И8 5635188 (С07К14/47, С07К14/435, опубл. 03.06.1997), представляют собой белки, спонтанно теряемые ОК в составе мембранных везикул, т.н. экзосом, в бессывороточную ростовую среду.
Необходимо отметить, что вакцина, полученная указанным способом, отличается установленным высоким содержанием нецелевых антигенов, в частности внутриклеточных белков (см., например, Рго1еот1с аиа1ук1к о! тектота-бепсеб ехокотек Ьу 1уо-б1теикюиа1 ро1уасгу1ат1бе де1 е1есборЬогек1к аиб такк крес1готе1ту. РгсИеоииск 2004, ν.4, р.4019-4031; РгсИеоиис аиа1ук1к о! ехокотек кесге1еб Ьу Нитаи теко(НеНота се11к. Атебсаи 1оигиа1 о! Ра11ю1оду 2004, ν.164, р.1807-1815; Ехокотек: сотрокйюи, Ьюдеиебк аиб киисбои, №1Р1ге КеОезук 1ттиио1оду, 2002, ν.2, р.569-579). Второй недостаток - это необходимость очистки антигенов перед их употреблением от липидов, являющихся составной частью экзосом.
Общим недостатком антигенов, специфичных для опухолевых клеток или клеток сосудов опухоли, является их слабая иммуногенность. Это объясняется тем, что, в отличие от противомикробной, противовирусной или неспецифической противоопухолевой вакцинации, в которых используют чужеродные и, соответственно, иммуногенные для вакцинируемого организма антигены, в данном случае используют антигены идентичные антигенам клеток вакцинируемого организма. Как правило, нормально функцио- 2 011421 нирующая иммунная система организма толерантна к собственным антигенам, в результате чего вызываемый иммунный ответ бывает слабым, кратковременным, либо вообще отсутствует. Таким образом, эффективность применения подобных опухолеспецифичных антигенов зависит от способности вызвать к ним надлежащий иммунный ответ.
Известны различные способы повышения иммунного ответа на антигены, например, химическая модификация антигенов или смешивание их с адъювантами (маслами, минеральными солями, экстрактами бактерий, цитокинами и т.д.).
Одним из наиболее эффективных способов добиться усиления иммунного ответа на антигены является использование антигенпрезентирующих клеток, т. е. тех клеток, с которыми обычно взаимодействуют введенные в организм антигены.
В способах получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, как правило, в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки (ДК), которые способны поглощать антигены, деградировать их до маленьких фрагментов и представлять их на своей поверхности, ассоциированными с главным комплексом гистосовместимости. Клетки иммунной системы для проявления гуморального и клеточного иммунитета распознают главный комплекс гистосовместимости и ассоциированные с ним антигены. Обычно, зрелые ДК получают ίη νίίτο из СЭ34+ костно-мозговых предшественников или популяции моноцитов периферической крови. После получения ДК нагружают специфичными для опухоли антигенами. Пациенту вводят уже не сами антигены, а нагруженные ими ДК, т.е. применяют так называемую противоопухолевую дендритно-клеточную вакцину.
Известны способы получения противоопухолевой вакцины на основе нагруженных антигенами антигенпрезентирующих клеток, при которых ДК нагружают синтезированными пептидами, опухолевыми клетками или их лизатами, живыми опухолевыми клетками (образованием гибридов ДК и опухолевых клеток) и т.д. Примеры применения ДК, нагруженных различными антигенами, описаны (см., например, 81готс 8.Е. οί а1., 'Ъ1га1еДек ίοτ Апйдеп Ьоабшд οί Оепбпйс Се11к ίο Епйапсе 1йе ΛηΙίΙιιιηοΓ 1ттипе Кекропке, Сапсег Кек., 2002, ν.62, р.1884-1889; Μοιίαπηί К. еί а1., Λυίοίο^οπκ Оепбпйс Се11к Оепсеб Ггот СЭ34+ Рюдет^^ апб Гют Μοηοсуίек Аге Νοί Рипс1юпа11у Ес.|ш\'а1еп1. Сапсег Кек., 1997, ν.57, р.55345541; Τοιφικ Ь., Нитап Μοηοсуίе-^еπνеб Масгорйадек апб Оепбпйс Се11к, Iттиηο1οду, 1997, ν.91, р.635-642; Сйаих Р. еί а1., 1бепййса1юп οί МАОЕ-3 Ер1крек РгекегНеб Ьу НЬА-ЭК Μο^Οϋ^δ ίο ΟΌ4+ Т ^утрйοсуίек, 1. Ехр. Меб. 1989, ν.189, р.767-777; №к11е Е., Уасста1юп οί Мекитота РаОегИк \νί11ι Рерббе - οτ Типюг Йука1е-ри1кеб Оепбпйс Се11к, №-Ииге Меб., 1998, ν.4, р.328-332; КгоЮга Υ., ^трата^е Апа1ук1к οί №сгойс апб Арοрίοί^с Типюг Се11к Ак а δοιιη^ οί Апйдеп(к) т Оепбпйс Се11-Ьакеб 1ттишха1юп, Сапсег Кек., 2001, ν.61, р.8105-8109; Кик С. еί а1., Тйе Оупатюк οί 1йе Т-Се11 Аηί^ίитο^ Кекрοηке, Сапсег Кек., 2001, ν.61, р.8794-8802; 8сйпигг, М., '^торЮ^с Рапстеайс Тинто г Се11к Аге 8ирегюг ίο Се11 Ьу^ек, Сапсег Кек., 2002, ν.62, р.2347-2352).
Недостатки применения ДК, нагруженных отдельными антигенами, целыми опухолевыми клетками или их лизатами, идентичны недостаткам, описанным выше для моновалентных и поливалентных вакцин, не содержащих ДК, а именно - низкая специфичность и наличие нецелевых антигенов. Недостатком гибридов ДК и опухолевых клеток вдобавок является возможность образования гибридных клонов со злокачественными свойствами.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, раскрытый в международной заявке ^02004012685 (8йеб апйдеп уассте \\Й11 бепбпЦс се11 аб_)иуапР', МПК А61К39/00, опубл. 12.02.2004 г.). В известном способе нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами, теряемыми ОК в процессе инкубации ш νίίτο в бессывороточную инкубационную среду (способ получения самих антигенов также описан в патентах США И8 5993829, МПК А61Р35/00, С07К14/47, опубл. 30.11.1999; ϋδ 6338853, МПК А61Р 35/00, С07К14/47, опубл. 15.01.2002; ϋδ 5030621, С07К14/47, С07К14/435, опубл. 09.07.1991; υδ 5635188, С07К14/47, С07К14/435, опубл. 3.06.1997).
Однако нагрузка ДК антигенами, спонтанно теряемыми опухолевыми клетками, имеет ряд установленных недостатков. Протеомный анализ (анализ белкового состава) выявил, что только незначительная часть теряемых клетками антигенов относится к поверхностным белкам, основная же часть относится к внутриклеточному содержимому (см., например, Р^οίеοт^с апа1ук1к οί те1аηοта-бе^^νеб еxοкοтек Ьу ι\\Ό-б^теηк^οηа1 рο1уас^у1ат^бе де1 е1есί^οрйο^ек^к апб такк кресί^οтеί^у, Р^οίеοт^ск 2004, ν.4, р.40194031; Р^οίеοт^с Апа1ук1к οί Еxοкοтек δес^еίеб Ьу Нитап Μекοίйе1^οта Се11к, Атепсап кита οί Раίйο1οβν 2004, ν.164, р.1807-1815; Еxοкοтек: сοтрοк^ί^οη, Ьюдепеак апб №11иге Ие\зе\\'к Iттиηο1ο^ν, 2002, ν.2, р.569-579). Таким образом, культивируемые т νίίτο клетки в основном теряют непригодные для вакцинации антигены.
Теряемые клетками антигены представляют собой смесь белков, представление которых на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в частности зрелых ДК, затруднено. Белковые антигены должны поглощаться ДК, деградироваться до пептидов и только потом представляться на поверхности ДК. Зрелые же ДК неспособны к поглощению антигенов. К недостаткам ближайшего аналога также можно отнести то, что клетки спонтанно теряют свои антигены в виде мембранных везикул - экзосом, содержащих,
- 3 011421 помимо белков, множество липидов. Поэтому выделение из них антигенов требует дополнительной стадии очистки - делипидизации. Также требуется очистка антигенов от компонентов инкубационной среды, в которую ОК теряют свои антигены и которая содержит около 40 компонентов (витамины, аминокислоты, соли, углеводы и т.д.), а также от стороннего белкового загрязнения, источником которого могут служить ростовые среды клеток, потенциально содержащие токсины, прионы и пирогенные белковые примеси.
Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в создании вакцины, способной повысить цитотоксическую активность (ЦТА) клеток иммунной системы в отношении клеток-мишеней за счет облегчения восприятия ими заданной совокупности антигенов.
Данный технический результат обеспечивается при использовании способа получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, согласно настоящему изобретению, нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней.
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют аутологичные живые клетки, так как обеспечивают получение совокупности как специфичных внутривидовых, так и индивидуальных для вакцинируемого организма антигенов.
В других вариантах реализации изобретения используют аллогенные живые клетки в случае необходимости получения совокупности общих для биологического вида внутривидовых антигенов.
Также могут быть использованы ксеногенные живые клетки в случае необходимости получения совокупности общих для различных видов организмов межвидовых антигенов.
В других вариантах реализации изобретения используют аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
Кроме этого могут быть использованы ксеногенные и аллогенные живые клетки в комбинации.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы ксеногенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы ксеногенные, аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
Комбинации различных типов живых клеток применяют для увеличения совокупности специфичных антигенов.
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют свежевыделенные живые клетки. Свежевыделенные клетки наиболее близки по антигенному составу к клеткам организма больного. Получение живых клеток без повреждения поверхностных антигенов, например при их получении из биологических жидкостей или неэнзиматическом способе получения из тканей (при энзиматическом способе получения клеток из тканей происходит повреждение поверхностных антигенов клеток) позволяет применять свежевыделенные клетки для получения антигенов согласно данному изобретению.
В случае отсутствия достаточного количества свежевыделенных клеток для получения необходимого для нагрузки количества антигенов в других вариантах реализации изобретения могут быть использованы живые клетки, представляющие собой по меньшей мере одну первичную культуру. Также могут быть использованы живые клетки по меньшей мере одной клеточной линии. Антигены, расположенные на поверхности упомянутых клеток, также пригодны для нагрузки антигенпрезентирующих клеток.
В целях создания вакцины для цитотоксического повреждения опухолевых клеток используют живые клетки, являющиеся опухолевыми клетками.
В целях создания вакцины для цитотоксического повреждения клеток сосудов опухоли используют живые клетки, являющиеся эндотелиальными клетками.
В других вариантах реализации изобретения для получения совокупности антигенов могут быть использованы живые клетки, представляющие собой генетически модифицированные клетки. Генетическая модификация, повышающая иммуногенность поверхностных антигенов клеток, способствует получению антигенов согласно данному изобретению с более выраженными иммуногенными свойствами.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин. В среднем на каждые 10 аминокислот последовательности белка встречается одно место, расщепляемое трипсином. Исходя из того, что средняя масса аминокислоты составляет 110 Да и того, что неполный протеолиз белков протеазой дает пептиды как с отсутствием, так и с наличием одного или двух недорасщепленных мест, при применении трипсина получаемые антигены предположительно будет соответствовать требуемым молекулярным весам. Однако специфичность аминокислотных последовательностей пептидов и наличие углеводных модификаций влияет на средний размер получаемых антигенов, в связи с чем при подборе конкретных условий получения антигенов необходимо экспериментально контролировать размер получаемых антигенов.
Наиболее простым и быстрым способом контроля размера получаемых антигенов является массспектрометрический анализ.
К антигенпрезентирующим клеткам могут добавлять иммуномодуляторы и цитокины. Любые под
- 4 011421 ходящие комбинации цитокинов, иммуномодуляторов и неспецифических антигенов могут применяться для дифференцировки мононуклеарных лейкоцитов в незрелые ДК, а также для созревания незрелых ДК.
Для создания условий, в которых антигенпрезентирующие клетки способны представлять антигены клеткам иммунной системы, могут добавлять фармацевтический носитель, который может включать одно или несколько веществ. Носитель может способствовать сохранности антигенпрезентирующих клеток при хранении, транспортировке и их введении в организм, питать клетки, обеспечивать газообмен, стабилизировать клеточные мембраны, обеспечивать локальные или системные иммунологические реакции, усиливающие действие антигенпрезентирующих клеток.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы антигенпрезентирующие клетки, полученные искусственным путем, так как искусственные антигенпрезентирующие клетки обладают надлежащими антигенпрезентирующими свойствами и могут быть нагружены антигенами.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки.
Могут быть использованы дендритные клетки, полученные из периферической крови.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы дендритные клетки, полученные из костного мозга, так как костно-мозговые ДК являются полноценными антигенпрезентирующими клетками и могут быть нагружены антигенами ίη νίίτο.
В предпочтительном варианте реализации изобретения используют аутологичные дендритные клетки.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы аллогенные дендритные клетки, так как они способны осуществлять антигенпрезентирующую функцию в отношении аллогенных для них клеток иммунной системы.
В других вариантах реализации изобретения могут использовать смесь аутологичных и аллогенных дендритных клеток. Применение смеси клеток предпочтительно при недостаточном для вакцинации количестве аутологичных дендритных клеток и возможно ввиду способности аллогенных ДК осуществлять антигенпрезентирующую функцию в отношении аллогенных для них клеток иммунной системы.
В предпочтительном варианте используют зрелые антигенпрезентирующие клетки.
Зрелые антигенпрезентирующие клетки могут быть получены непосредственно из тканей организма, либо получены ίη νίίτο из незрелых антигенпрезентирующих клеток.
В других вариантах реализации изобретения могут быть использованы также незрелые антигенпрезентирующие клетки.
Незрелые антигенпрезентирующие клетки, в частности ДК, нагружают антигенами путем их инкубации в среде, содержащей антигены. В процессе инкубации незрелые ДК поглощают антигены, деградируют их и представляют на своей поверхности.
Зрелые антигенпрезентирующие клетки, в частности ДК, могут нагружать антигенами в процессе инкубации с ними путем непосредственного связывания антигенов (без предварительного их поглощения ДК) с главным комплексом гистосовместимости, расположенным на поверхности ДК. В другом варианте зрелые антигенпрезентирующие клетки получают из уже нагруженных антигенами незрелых антигенпрезентирующих клеток.
В случае получения антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, не способных поглощать антигены, например зрелых ДК, тип протеазы, ее концентрация, а также время воздействия на клетки подбирают с учетом того, что получаемые антигены должны быть с молекулярным весом от ~800 до ~3500 Да. Данное обстоятельство связано с тем, что именно такие пептиды способны связываться непосредственно с главным комплексом гистосовместимости, расположенным на поверхности антигенпрезентирующих клеток.
Для получения антигенов нужного молекулярного веса (размера) отщепленные от поверхности клеток антигены могут дополнительно, отдельно от клеток, инкубировать с протеазой для расщепления антигенов до необходимого молекулярного веса. Достижения антигенами нужного молекулярного веса можно контролировать масс-спектрометрическим анализом.
В случае получения антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, способных их поглощать, например незрелых ДК, в предпочтительном варианте молекулярный вес антигенов должен быть не менее 600 Да. Антигены, представляющие собой пептиды меньшего молекулярного веса слабо- или неспецифичны, в связи с чем непригодны для вакцинации. Строгих ограничений на максимальный молекулярный вес антигенов нет, так как антигены после поглощения их антигенпрезентирующими клетками будут деградированы внутриклеточными протеазами до нужного размера.
Время инкубации ДК с антигенами также может существенно варьировать. При нагрузке незрелых ДК время инкубации ДК с антигенами может составлять от 2 до 7 суток. При нагрузке зрелых ДК от 12 ч до 3 суток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения нагрузку дендритных клеток проводят антигенами с молекулярным весом от 800 до 3500 Да.
При этом нагрузку проводят в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 12 ч до 3 суток.
- 5 011421
В случае использования незрелых антигенпрезентирующих клеток их нагрузку могут проводить антигенами с молекулярным весом не менее 600 Да в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 2 до 7 суток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения конечную концентрацию антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, добавляемых в инкубационную среду, выбирают из диапазона от 10 мкг/мл до 1 мг/мл. Если конечная концентрация антигенов будет менее 10 мкг/мл, совокупность антигенов не будет представлена на поверхности антигенпрезентирующих клеток в количестве, необходимом для проявления специфической цитотоксической активности (ЦТА) клеток иммунной системы. При добавлении антигенов с конечной концентрацией, превышающей 1 мг/мл, количество антигенов становится большим, чем предельное их количество, которое могут воспринять антигенпрезентирующие клетки для представления на своей поверхности.
Повышение цитотоксической активности (ЦТА) клеток иммунной системы достигается также в случаях, когда для нагрузки ДК используют антигены, полученные однократным отщеплением протеазой с количества живых клеток вдвое-впятеро большего, чем количество нагружаемых дендритных клеток;
двухкратным-пятикратным отщеплением протеазой с количества живых клеток, равного количеству нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.
При дальнейшем увеличении числа обработок протеазой количество живых клеток уменьшают в соответствии с указанной пропорцией. Число обработок протеазой может достигать 15-20 раз. Экспериментально было установлено, что указанные соотношения живых клеток и дендритных клеток во взаимосвязи с числом обработок протеазой являются оптимальными для представления на поверхности дендритных клеток заданной совокупности антигенов и облегчения восприятия их клетками иммунной системы.
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения нагрузку могут проводить антигенами, полученными однократным отщеплением протеазой с количества живых клеток вдвое-впятеро большего, чем количество нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.
В другом варианте реализации изобретения нагрузку могут проводить антигенами, полученными двухкратным-пятикратным отщеплением протеазой с количества живых клеток, равного количеству нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.
Далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:
на фиг. 1 - результаты исследования цитотоксической активности лимфоцитов в отношении опухолевых клеток МСЕ-7;
на фиг. 2 - результаты исследования цитотоксической активности лимфоцитов в отношении ЭК;
на фиг. 3 - график роста опухоли гепатомы Н22, привитой мышам ВАЕВ/е, в экспериментальной и контрольной (·) группах. Показаны средние значения диаметра опухоли в группе +/- стандартное отклонение.
Пример № 1.
Ниже приведен пример реализации способа получения противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток, нагруженных антигенами. В данном примере нагрузку дендритных клеток проводят антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток с представлением на поверхности дендритных клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов опухолевых клеток-мишеней.
Для нагрузки дендритных клеток получают раствор антигенов, специфичных для опухолевых клеток-мишеней, используя культуру клеток человеческой аденокарциномы груди МСЕ-7.
1. Из флакона с культурой клеток МСЕ-7 удаляют ростовую среду и промывают монослой клеток стерильным физиологическим раствором. Промывку осуществляют не менее 3 раз до удаления остатков ростовой среды.
Следующим и ключевым этапом является витальная для клеток обработка протеазой клеток МСЕ-7, где в качестве протеазы выбирают трипсин (активность ~3000 Ед/мг).
2. Добавляют к монослою клеток 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл раствора на 25 см2 поверхности культурального флакона.
3. Инкубируют флакон при 37°С. Между пятой и седьмой минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены.
4. К клеткам добавляют свежеприготовленную ростовую среду, содержащую сыворотку (обычно 10%), и продолжают их культивирование.
5. Для наработки массы антигенов, с интервалом в сутки от 2-х до 15-ти раз повторяют пп.2-4.
6. Чтобы убрать следы трипсина и других белков, раствор антигенов фильтруют через фильтр с отсечением по белку 10-15 кДа.
7. Получают раствор антигенов, являющихся протеолитическими фрагментами поверхностных белков клеток, т. е. пептидами, которые, ввиду выраженной гликозилированности поверхностных белков
- 6 011421 клеток, также могут характеризоваться той или иной степенью гликозилирования.
Являясь пептидами, патентуемые антигены пригодны для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, в частности зрелых ДК, которые получают ίη νίίτο из очищенной фракции мононуклеарных лейкоцитов (моноцитов) периферической крови (Сапсег Кекеагсй, 2001, ν.61, р.6445-6450). Кровь донора собирают в пробирки с антикоагулянтом (гепарин или цитрат натрия), разбавляют равным объемом стерильного физиологического раствора и наслаивают на раствор фиколл-пак, имеющий плотность 1,077 г/мл (2 объема разведенной крови на один объем раствора фиколла). Центрифугируют 20 мин при 800д и комнатной температуре. Собирают пипеткой фракцию клеток на границе раздела раствора фиколла и плазмы крови, разводят клетки физиологическим раствором и центрифугируют 10 мин при 250 д. Осадок ресуспендируют в среде КРМ1-1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и, в концентрации 50 млн кл/мл, по 10 мл вносят в чашки Петри. Чашки Петри инкубируют в условиях насыщающей влажности, 5% СО2 и 37°С в течение 1 ч. Неприкрепившиеся клетки (в основном лимфоциты) отбирают, центрифугируют, замораживают и хранят в жидком азоте. К монослою прикрепившихся клеток (в основном моноцитов) добавляют по 10 мл свежей среды и инкубируют в стандартных условиях. На следующий день и через три дня (на четвертый день) в инкубационную среду добавляют ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, 800 ед./мл) и ИЛ-4 (интерлейкин-4, 1000 ед./мл). Добавление данной композиции цитокинов необходимо для дифференцировки мононуклеарных лейкоцитов в незрелые ДК. На 6-й день к ДК, для созревания и нагрузки их антигенами, добавляют культуральную среду (КРМ1-1640, 10% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота), содержащую ФНО-α (фактор некроза опухолей-α, 10 нг/мл) и антигены, полученные отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток, как было описано выше (конечная концентрация антигенов 100 мкг/мл), и инкубируют 2 суток при 5% СО2 и 37°С. На 8-й день зрелые ДК собирают в отдельную емкость и используют в качестве противоопухолевой дендритоклеточной вакцины, а также проверяют их способность специфически стимулировать цитотоксические лимфоциты ίη νίίτο.
Пример № 2.
В данном поясняющем, но не ограничивающем изобретение примере нагрузку дендритных клеток проводят антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых эндотелиальных клеток с последующим представлением на поверхности дендритных клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов эндотелиальных клеток-мишеней.
В качестве живых эндотелиальных клеток используют первичную культуру мышиных микро цирку ляторных дермальных ЭК (ЗАО БиоБогемия, Россия).
1. Из чашки Петри с ЭК удаляют ростовую среду и промывают чашку 3-5 раз раствором Хенкса (из расчета 2 мл на 5 см2 поверхности чашки Петри) для удаления следов сыворотки, содержащейся в ростовой среде. После каждого добавления раствора Хенкса клетки выдерживают в нем 2 мин, после чего его удаляют.
2. Добавляют к клеткам охлажденный (+4±2°С) 0,0001% раствор трипсина (активность ~3000 Ед/мг), приготовленный на растворе Хенкса из расчета 1 мл раствора на 5 см2 поверхности чашки Петри и через 10-15 с его удаляют.
3. Сразу после удаления раствора трипсина чашку Петри накрывают крышкой и помещают в инкубатор на 10 мин при 37°С, 5% СО2. Следят, чтобы в инкубаторе была не менее чем 95%-ая влажность, чтобы избежать высыхания и гибели клеток.
4. Достают из инкубатора чашку Петри и струей физиологического раствора (из расчета 250 мкл на 5 см2 поверхности чашки Петри) смывают со дна чашки Петри клетки, с отщепленными с их поверхности фрагментами белков.
5. Отбирают физиологический раствор с открепленными от дна флакона клетками, центрифугируют 5 мин при 200д.
6. Осевшие при центрифугировании клетки ресуспендируют в свежеприготовленной ростовой среде и переносят в чашку Петри для дальнейшего культивирования и повторного использования для получения антигенов.
7. Супернатант, полученный при центрифугировании, отбирают и фильтруют через фильтр с отсечением по белку 10-15 кДа, чтобы убрать следы трипсина и других белков.
8. Полученный фильтрат, представляющий собой раствор поверхностных антигенов ЭК, используют для нагрузки зрелых ДК, полученных из крови здоровых мышей той же породы, аналогично тому, как это было описано в примере № 1.
Далее проводят проверку функциональной активности ДК, нагруженных антигенами.
Функциональную активность ДК, нагруженных поверхностными антигенами опухолевых или ЭК, проверяют их способностью индуцировать ίη νίίτο цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов в отношении клеток-мишеней, а именно, опухолевых клеток МСЕ-7 и мышиных дермальных ЭК. Лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, как было описано выше, суспендировали в культуральной среде. Для стимуляции лимфоцитов ДК отмывали фосфатно-солевым буфером и помещали в 24-луночные планшеты вместе с лимфоцитами при соотношении 1:20 (ДК: лимфоциты), в 1 мл культу
- 7 011421 ральной среды, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. На следующий день после начала стимуляции и далее 1 раз в 3 дня к культуре добавляли по 30 ед./мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2. Через 7 дней проводили вторичную стимуляцию культуры лимфоцитов с использованием ДК в том же количестве, как и при первой стимуляции. Через 5 дней после вторичной стимуляции проводили определение цитотоксической активности лимфоцитов в отношении опухолевых и эндотелиальных клеток. Для этого 1 млн опухолевых клеток или ЭК метили натрия хроматом с 51-ым хромом (3,7 МБк) в течение 1 ч при 37°С и отмывали 4 раза. В лунки 96-ти луночного планшета вносили суспензию стимулированных лимфоцитов в количестве 10-80 тыс. клеток на лунку, а затем добавляли меченые клетки-мишени (5 тыс. клеток на лунку). Через 18 ч отбирали из лунок по 100 мкл супернатанта и измеряли радиоактивность на гамма-счетчике. Результаты измерений использовали для определения специфического лизиса клеток-мишеней и рассчитывали ЦТА стимулированных лимфоцитов по формуле
ЦТА=(1-Р мишень+лнмфошпы/Рмишень) X 1 θθ ?
в которой Рмишень - радиоактивность проб, где инкубировали клетки-мишени;
Рмишень+лимфоциты - радиоактивность проб, где инкубировали клетки-мишени вместе со стимулированными лимфоцитами.
Для получения контрольных измерений также получали экзосомы клеток МСР-7. При этом использовали количество клеток МСР-7, эквивалентное количеству клеток в эксперименте. Экзосомы получали ультрацентрифугированием культуральной среды согласно способу, описанному в заявке ПО 2004012685 (8йеб апйдеп уассше \νί11ι бепбпйс се11 абщуап!, МПК А61К39/00, опубл. 12.02.2004 г.).
Результаты исследования цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов в отношении опухолевых клеток приведены на фиг. 1.
В эксперименте лимфоциты стимулировали ДК-ми, нагруженными поверхностными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток МСР-7 (и). В контроле использовали интактные (не нагруженные антигенами) ДК или ДК, нагруженные экзосомами клеток МСР-7 (·) или поверхностными антигенами ЭК (♦). Показаны средние значения +/- стандартное отклонение.
Как видно из фиг. 1, цитотоксические лимфоциты, полученные после совместного культивирования с дендритными клетками, нагруженными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых опухолевых клеток МСР-7, обладали более высокой цитотоксической активностью против опухолевых клеток по сравнению с контрольными лимфоцитами, стимулированными интактными дендритными клетками или дендритными клетками, нагруженными иными антигенами, включая антигены, полученные согласно ближайшему прототипу изобретения.
Результаты исследования цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов в отношении ЭК приведены на фиг. 2.
В эксперименте лимфоциты стимулировали ДК-ми, нагруженными антигенами, полученными отщеплением трипсином с поверхности живых эндотелиальных клеток . В контроле использовали интактные ДК или ДК, нагруженные лизатом ЭК (·) или поверхностными антигенами клеток МСР-7 (♦). Показаны средние значения +/- стандартное отклонение. Лизат ЭК получали путем трехкратного резкого замораживания клеток в жидком азоте и последующего размораживания при 37°С в водяной бане.
Как видно из фиг. 2, цитотоксические лимфоциты после совместного культивирования с ДК, нагруженными поверхностными антигенами ЭК, обладали более высокой цитотоксической активностью в отношении ЭК (клеток-мишеней) по сравнению с контрольными лимфоцитами, стимулированными интактными дендритными клетками или дендритными клетками, нагруженными иными поверхностными антигенами или лизатом ЭК.
При нагрузке антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток, обеспечивается представление на поверхности антигенпрезентирующих клеток ассоциированной с главным комплексом гистосовместимости совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней. Т-лимфоциты распознают главный комплекс гистосовместимости и ассоциированные с ним антигены. В результате цитотоксическая активность (ЦТА) лимфоцитов проявляется не только в отношении указанных антигенов, но и в отношении клетокмишеней.
Для подтверждения противоопухолевой активности вакцины, полученной патентуемым способом, был поставлен модельный эксперимент на млекопитающих, а именно 12-ти самцах мышей породы ВАЬВ/с примерно одного возраста и веса. Для получения вакцины использовали способ согласно второму примеру реализации изобретения. Антигены были получены с культуры мышиных микроциркуляторных дермальных ЭК (ЗАО БиоБогемия, Россия). За день до получения антигенов ЭК активировали добавлением кондиционированной ростовой среды клеток Н22 в ростовую среду ЭК в соотношении 1:3. ДК получали из крови здоровых мышей той же породы и нагружали антигенами согласно примеру № 2.
0,1 мл раствора нагруженных антигенами ДК (примерно 100 тыс. ДК) вводили в хвостовую вену два раза с перерывом в 3 дня. Животным контрольной группы вводили раствор не нагруженных антиге
- 8 011421 нами ДК. Через 3 дня после последней иммунизации подопытным мышам была привита опухоль подкожным введением в подмышечную впадину 1 млн опухолевых клеток гепатомы Н22. Производили запись размеров опухоли и дня смерти мышей. Средняя продолжительность жизни животных, иммунизированных вакциной, полученной патентуемым способом, увеличилась на 52%.
Результаты измерений размеров опухолей представлены на фиг. 3, из которой следует замедление роста опухолей у животных из экспериментальной группы, что указывает на выраженный противоопухолевый эффект вакцины, полученной патентуемым способом.
Таким образом, показана возможность применения патентуемого способа для получения противоопухолевой вакцины, содержащей антигенпрезентирующие клетки, а именно ДК, способной стимулировать цитотоксическую активность лимфоцитов, с целью селективного повреждения клеток-мишеней как ίη νίίτο, так и ίη νίνο.
Применение протеазы для отщепления антигенов дает возможность получать антигены, являющиеся пептидами, с таким молекулярным весом, который обуславливает их способность быть представленными на поверхности антигенпрезентирующих клеток в форме, пригодной для полноценного восприятия клетками иммунной системы, о чем свидетельствует повышение ЦТА лимфоцитов.
Нагрузка антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток, позволяет получать путем однократного или многократного отщепления заданную совокупность антигенов, специфичных для клеток-мишеней, в количестве, оптимальном для представления указанной совокупности клеткам иммунной системы.
Кроме этого, применяемая мягкая (витальная для клеток) обработка клеток протеазой позволяет получать антигены с живых клеток, т.е. с клеток с сохраненной барьерной функцией цитоплазматической мембраны (стенки клетки). Данное обстоятельство позволяет воздействовать протеазой только на поверхность клеток и, соответственно, отщеплять только поверхностные антигены. Сохранность цитоплазматической мембраны также предотвращает выход из клетки внутриклеточного содержимого, способного загрязнить получаемые антигены нецелевыми внутриклеточными антигенами и другими балластными веществами (белками, липидами, нуклеиновыми кислотами и т.д.), что дает возможность представлять клеткам иммунной системы только антигены, являющиеся специфичными для клеток-мишеней, исключив присутствие на поверхности антигенпрезентирующих клеток других антигенов, не являющихся специфичными.
Таким образом, при нагрузке антигенпрезентирующих клеток антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток (с сохраненной барьерной функцией цитоплазматической мембраны), с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток ассоциированной с главным комплексом гистосовместимости совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней, облегчается последующее полноценное представление клеткам иммунной системы, в частности Т-лимфоцитам, исключительно антигенов, являющихся специфичными для клеток-мишеней, что обеспечивает повышение цитотоксической активности (ЦТА) лимфоцитов в отношении клеток-мишеней.
Claims (33)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения противоопухолевой вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток, нагруженных антигенами, отличающийся тем, что нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами, полученными отщеплением протеазой с поверхности живых клеток с обеспечением представления на поверхности антигенпрезентирующих клеток совокупности антигенов, идентичной совокупности поверхностных антигенов клеток-мишеней.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аутологичные живые клетки.
- 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аллогенные живые клетки.
- 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ксеногенные живые клетки.
- 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
- 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ксеногенные и аллогенные живые клетки в комбинации.
- 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ксеногенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
- 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ксеногенные, аллогенные и аутологичные живые клетки в комбинации.
- 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют свежевыделенные живые клетки.
- 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют живые клетки, представляющие собой по меньшей мере одну первичную культуру.
- 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют живые клетки по меньшей мере одной клеточной линии.- 9 011421
- 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют живые клетки, являющиеся опухолевыми клетками.
- 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют живые клетки, являющиеся эндотелиальными клетками.
- 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют живые клетки, представляющие собой генетически модифицированные клетки.
- 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
- 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что к антигенпрезентирующим клеткам добавляют иммуномодуляторы и цитокины.
- 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что добавляют фармацевтический носитель.
- 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют антигенпрезентирующие клетки, полученные искусственным путем.
- 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки.
- 20. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что используют дендритные клетки, полученные из периферической крови.
- 21. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что используют дендритные клетки, полученные из костного мозга.
- 22. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что используют аллогенные дендритные клетки.
- 23. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что используют аутологичные дендритные клетки.
- 24. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что используют смесь аутологичных и аллогенных дендритных клеток.
- 25. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что нагрузку проводят антигенами, полученными однократным отщеплением протеазой с количества живых клеток вдвое-впятеро большего, чем количество нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.
- 26. Способ по пп.1, 19, отличающийся тем, что нагрузку проводят антигенами, полученными 2-5кратным отщеплением протеазой с количества живых клеток, равного количеству нагружаемых антигенпрезентирующих клеток.
- 27. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют зрелые антигенпрезентирующие клетки.
- 28. Способ по пп.1, 27, отличающийся тем, что нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами с молекулярным весом от 800 до 3500 Да.
- 29. Способ по пп.1, 19, 27, отличающийся тем, что нагрузку проводят в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 12 ч до 3 суток.
- 30. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют незрелые антигенпрезентирующие клетки.
- 31. Способ по пп.1, 30, отличающийся тем, что нагрузку антигенпрезентирующих клеток проводят антигенами с молекулярным весом не менее 600 Да.
- 32. Способ по пп.1, 19, 30, отличающийся тем, что нагрузку проводят в процессе инкубации, время которой выбирают из интервала от 2 до 7 суток.
- 33. Способ по пп.1, 29 или 32, отличающийся тем, что конечную концентрацию антигенов для нагрузки антигенпрезентирующих клеток, добавляемых в инкубационную среду, выбирают из диапазона от 10 мкг/мл до 1 мг/мл.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA011421B1 (ru) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | Способ получения противоопухолевой вакцины |
| PCT/RU2009/000392 WO2010024719A1 (ru) | 2008-08-26 | 2009-08-05 | Способ получения противоопухолевой вакцины |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA011421B1 (ru) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | Способ получения противоопухолевой вакцины |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200801751A1 EA200801751A1 (ru) | 2009-02-27 |
| EA011421B1 true EA011421B1 (ru) | 2009-02-27 |
Family
ID=40849088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200801751A EA011421B1 (ru) | 2008-08-26 | 2008-08-26 | Способ получения противоопухолевой вакцины |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA011421B1 (ru) |
| WO (1) | WO2010024719A1 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063768C1 (ru) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Способ предварительной обработки опухолевой ткани для получения антигена раковой опухоли |
| WO2004012685A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
| US20080160049A1 (en) * | 2004-08-26 | 2008-07-03 | University Of Notre Dame Du Lac | Tissue Vaccines and Uses Thereof |
| US20080160050A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-07-03 | Kenichiro Hasumi | Dendritic cell tumor injection therapy and related vaccine |
| WO2008081035A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Cytovac A/S | Anti-tumor vaccine derived from normal chemically modified cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4431401A1 (de) * | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
| EA200700598A1 (ru) * | 2007-03-07 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии |
| EA009327B1 (ru) * | 2007-04-27 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток |
-
2008
- 2008-08-26 EA EA200801751A patent/EA011421B1/ru active IP Right Revival
-
2009
- 2009-08-05 WO PCT/RU2009/000392 patent/WO2010024719A1/ru active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063768C1 (ru) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Способ предварительной обработки опухолевой ткани для получения антигена раковой опухоли |
| WO2004012685A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
| US20080160049A1 (en) * | 2004-08-26 | 2008-07-03 | University Of Notre Dame Du Lac | Tissue Vaccines and Uses Thereof |
| US20080160050A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-07-03 | Kenichiro Hasumi | Dendritic cell tumor injection therapy and related vaccine |
| WO2008081035A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Cytovac A/S | Anti-tumor vaccine derived from normal chemically modified cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200801751A1 (ru) | 2009-02-27 |
| WO2010024719A1 (ru) | 2010-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220016164A1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| JP6134763B2 (ja) | ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞 | |
| Hegmans et al. | Immunotherapy of murine malignant mesothelioma using tumor lysate–pulsed dendritic cells | |
| AU2001282123B2 (en) | Method for producing ready to use, antigen loaded or unloaded, cryoconserved mature dendritic cells | |
| ES2535835T3 (es) | Composiciones para la preparación de células dendríticas maduras | |
| US11278605B2 (en) | Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| US9694059B2 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| Yin et al. | A novel therapeutic vaccine of GM-CSF/TNFα surface-modified RM-1 cells against the orthotopic prostatic cancer | |
| US20210353674A1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| AU2023208190A1 (en) | Methods relating to activated dendritic cell compositions and immunotherapeutic treatments for subjects with advanced cancers | |
| Sabado et al. | Dendritic cell vaccines | |
| Velek | Immunogenicity of dendritic cell-based HPV16 E6/E7 peptide vaccines: CTL activation and protective effects | |
| KR20180022949A (ko) | 향상되거나 증가된 항-종양 면역 반응을 유도하는 최적으로 활성화된 수지상 세포 | |
| EA011421B1 (ru) | Способ получения противоопухолевой вакцины | |
| Swartz et al. | Generation of tumor targeted dendritic cell vaccines with improved immunogenic and migratory phenotype | |
| NL2024515B1 (en) | Pharmaceutical composition for use in the treatment of pancreatic cancer | |
| CN111518216B (zh) | 多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤免疫中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM MD TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ TJ |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KG RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |