WO2007139201A1 - 生体試料撮像方法および生体試料撮像装置 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an analysis method and an analysis apparatus for analyzing an observation target site in a biological sample emitting faint light with an appropriate resolution. Note that the present invention incorporates the description in the present invention by applying the method and apparatus described in PCT / JP2006 / 319589, which is an international application filed by the present applicant, to this application.
- the present invention relates to a biological sample imaging method and a biological sample imaging device for imaging a site to be observed in a biological sample emitting faint light.
- the present invention relates to a method for detecting a biological activity in a biological sample such as a cell or tissue for a long period or continuously without losing the activity as much as possible.
- the invention also includes software for an automated device executed by the method.
- a luminescence-related gene that expresses a bioluminescent protein (specifically, luciferase, equorin, etc.) is used for analysis of various functions in the cell (specifically, the luminescence-related gene is used as a reporter molecule for protein expression).
- the lens is focused on a specific part of the cell and a clear image is drawn, or light emission from a specific bioluminescent protein introduced into the cell is efficiently performed. It is very important to receive light.
- the intensity of light emitted from a biological sample is generally very weak, In many cases, light emitted from a biological sample cannot be directly confirmed with the naked eye. Even if an optical element (such as a detection system lens) is adjusted for a sample that emits such weak light, it is naturally difficult for the naked eye to focus the lens on a specific part in the sample.
- Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose a method of detecting the bottom surface position of a sample container and focusing light on a sample in the sample container based on the detected position information.
- light is irradiated onto the bottom surface of the sample container through the objective lens, and the intensity of the specular reflected light from the bottom surface of the sample container is detected in order while moving the light irradiation position up and down, and the detected light is detected.
- the bottom surface position of the sample container is detected based on the intensity, the position of the sample in the sample container is estimated based on the detected position information, and light is focused on the estimated position.
- light is irradiated obliquely from below to the bottom surface of the sample container through the objective lens, and the amount of deviation of the specular reflected light from the bottom surface of the sample container on the XY plane is detected by a photodetector. Based on the amount of deviation, the bottom position of the sample container on the optical axis is detected, the position of the sample in the sample container is estimated based on the detected position information, and light is focused on the estimated position. Thereby, the focal position of the objective lens can be adjusted to the sample in the sample container.
- reporter assembly In research in the fields of biology and medicine, a technique for detecting the biological activity of biological samples such as cells by reporter assembly has been widely used. Reporter assembly can be used to visualize biological activities that cannot be visually examined. In conventional clinical tests, only biological substances (nucleic acid, blood, hormones, proteins, etc.) to be examined from biological samples are isolated by various separation methods, and the amount and activity of the isolated biological substances are determined. Reacted with reagents. However, in living organisms, various living organisms The interaction between related substances is the true biological activity. In recent years, when researching or developing drugs for medical use, drugs that act most effectively on biological activity in living biological samples have become critical conditions. In reporter assembly for living biological samples, there is an increasing need to image biological samples and biological substances to be examined and observe dynamic changes inside and outside the biological samples over time.
- timelabs and movies are used to capture the dynamic functional expression of protein molecules in a sample.
- dynamic changes are observed using images taken of fluorescent samples (for example, observation of a single protein molecule using fluorescence).
- the amount of light emitted by the fluorescent sample decreases as time elapses by continuing to irradiate excitation light, so that a stable image that can be used for quantitative evaluation can be obtained over time.
- I was able to take a clear, high spatial resolution image with a short exposure time.
- the amount of light emitted from a luminescent sample has been measured in observing the luminescent sample.
- the amount of luminescence from the cell due to the luciferase activity was measured in order to investigate the intensity of the luciferase gene expression (specifically, the expression level).
- the amount of luminescence from the cells due to luciferase activity is measured by first reacting the cell lysate with cells lysed with a substrate solution containing luciferin, ATP, magnesium, etc., and reacting with the substrate solution.
- the amount of luminescence from the cell lysate was quantified with a luminometer using a photomultiplier tube. That is, the amount of luminescence was measured after cell lysis. As a result, the expression level of the luciferase gene at a certain time point could be measured as an average value of the whole cell.
- a luminescent gene such as a luciferase gene is used as a reporter gene. Examples of methods for introducing cells into cells include the calcium phosphate method, lipofectin method, and electo mouth position method, and each method is properly used depending on the purpose and the type of cell.
- the upstream of the luciferase gene introduced into the cell By linking the target DNA fragment downstream, it is possible to examine the effect of the DNA fragment on the transcription of the luciferase gene, and for transcription factors that are thought to affect the transcription of the luciferase gene introduced into the cell.
- the effect of the gene product on the expression of the luciferase gene can be examined.
- the response of drugs via receptors on the cell membrane surface may vary among individual cells. That is, even if a response as a whole cell is not detected, several cells may be responding. For this reason, when the expression of the luminescent gene is transient, it is important to measure the amount of luminescence from individual cells over time rather than from the whole cell.
- the time-dependent measurement of the amount of light emitted from each individual living cell using a microscope shows that the light emitted from each cell is extremely weak. This was done using a CCD camera equipped with a tensiifier and a photon counting device. As a result, we were able to capture changes over time in the expression level of the luminescent gene in individual living cells.
- Patent Document 5 discloses a method and an apparatus for analyzing gene expression by bioluminescence using a luminometer.
- Patent Document 1 Special Table 2002— ⁇ 541430
- Patent Document 2 :: Special Table 2002—
- Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 354650
- Patent Document 4 JP-A-2005- ⁇ 173288
- Patent Literature 5 : Special Table 2004- ⁇ 500576 Publication
- Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-118050
- the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method and an apparatus for analyzing a weak light image that quickly and accurately performs analysis of a biological sample using weak light. .
- Another object of the present invention is to provide a biological sample imaging method and a biological sample imaging apparatus that perform rapid and accurate imaging of a biological sample with weak light. .
- the present invention has been made in view of the above problems, and a method for imaging a biological sample capable of capturing a clear image with a short exposure time and in real time even with a luminescent sample with a small amount of luminescence, and An object is to provide an imaging device.
- the method for analyzing a faint light image should analyze the biological sample in image analysis of the biological sample emitting faint light.
- At least one reference position related to the target portion is determined using electromagnetic energy of a type different from the weak light at the target portion, and a focal position for weak light corresponding to the target portion with respect to the reference position is determined.
- the imaging is performed with the weak light aiming at the determined focal position, the numerical value of the necessary measurement parameter is extracted from the weak light image, and the target part is evaluated based on the extracted parameter value.
- the weak light image analysis method according to the present invention is the weak light image analysis method described above, wherein the determination of the reference position includes acquisition of a reference image by the electromagnetic energy.
- the method for analyzing a weak light image according to the present invention is the method for analyzing a weak light image as described in the above item, wherein the acquisition of the reference image is to acquire an image of a sample region including the target region.
- the electromagnetic energy is any one of visible light, near-infrared light, ultrasonic waves, and lines of magnetic force with little damage to a living body. This is a method for analyzing weak light images.
- the method for analyzing a faint light image includes faint light that is difficult to directly visualize.
- a weak light image of the biological sample is determined by accumulating the weak light until a necessary image is obtained by aiming the objective lens at the determined focal position for the weak light.
- the method for analyzing a weak light image according to the present invention is characterized in that direct visualization is defined as difficult to visualize when the exposure time for optical image formation is 10 seconds or more.
- the method for analyzing a weak light image according to the present invention is the method for analyzing a weak light image as described above, wherein the image signal based on the irradiation light is transmitted light or fluorescence.
- the determination of the focal position for the weak light is performed for each observation part of the biological sample. Preferably it is done.
- the weak light image analysis method according to the present invention is the weak light image analysis method described above, wherein the reference position and the focal position are determined on the same beam path of the objective lens.
- the acquisition of the weak light image is performed at a plurality of times according to inspection items. It is preferable to accumulate a plurality of weak light images, collate observation target parts in the plurality of accumulated weak light images, and compare the collated plural weak light images for each time.
- the focal positions of the reference image and the weak light image are compared and set in comparison with the method for analyzing a weak light image described above. If it is out of the range, the acquisition of the reference image and the Z or faint light image is preferably performed again.
- the evaluation of the faint light image further includes acquisition of a measurement parameter from the reference image. The weak light parameter is evaluated in association with the measurement data of the reference image force.
- the method of analyzing a weak light image according to the present invention uses two or more different types of images by evaluating the weak light image in association with the contour information of the target region in the reference image. By combining image processing, the ability to evaluate faint light may be maximized.
- the method for analyzing a faint light image according to the present invention is the method for analyzing a faint light image as described above, wherein the evaluation is the faint light intensity per area corresponding to the contour of the target portion.
- the evaluation is the method for analyzing a weak light image according to the above, wherein the position or distribution of the weak light in the contour of the target region is determined as the method for analyzing the weak light image according to the present invention.
- the biological sample is individually stored in a plurality of storage units, and the reference position is executed for each storage unit.
- the weak light image analysis method according to the above which is characterized by the above.
- the accommodating portion include a microplate that integrates a plurality of accommodating portions.
- a case where a plurality of storage units are placed separately and transported as necessary is also included.
- the present invention provides an analysis method suitable for evaluating weak light of a biological sample force accommodated in a plurality of storage portions.
- the method for analyzing a weak light image the method for analyzing a weak light image described above, wherein the acquisition of the weak light image is performed in a wide-angle field of view including a plurality of storage units. For example, it is not only necessary to acquire a weak light image for each storage unit, but also evaluation can be performed without missing a change in weak light for each storage unit.
- the method for analyzing a faint light image according to the present invention is characterized in that the measurement parameter is acquired from the target site by optically and / or electrically enlarging the faint light image. This is a method for analyzing a weak light image.
- the biological sample is a living cell or tissue.
- the method for analyzing a faint light image according to the present invention is the method for analyzing a faint light image as described above, wherein the faint light is luminescence accompanying the expression of a bioluminescent protein. This is preferable in that it enables analysis of gene expression for each cell.
- the present invention relates to a biological sample imaging method, and the biological sample imaging method according to claim 1, which is useful for the present invention, is weakly accommodated in the accommodating portion of a substrate having a plurality of accommodating portions.
- a biological sample imaging method for imaging a biological sample that emits light through an objective lens wherein the substrate and / or the objective lens are moved until the desired accommodating portion is within the field of view of the objective lens, The focal position on the near point side of the objective lens and the focal position on the far point side of Z or the objective lens are measured, and the living body accommodated in the desired accommodating portion is measured based on the measured focal position.
- the focal position of the objective lens that matches the observation target site in the sample is determined, the focal position of the objective lens is aligned with the determined focal position, and the biological sample is imaged through the objective lens. Obtaining a luminescent image of the biological sample in Rukoto, it characterized.
- the biological sample imaging method according to claim 2 according to the present invention is similar to the biological sample imaging method according to claim 1, and the desired storage unit is disposed within the field of view of the objective lens.
- the position of the substrate and / or the objective lens at the movement destination is measured, and the movement destination position information regarding the measured position at the movement destination is obtained.
- the storage unit is stored in association with the storage unit identification information for identifying the desired storage unit.
- the present invention relates to a biological sample imaging method
- the biological sample imaging method according to claim 3 according to the present invention is a weak light accommodated in the accommodating portion of a substrate having a plurality of accommodating portions.
- a light irradiation sample imaging step for imaging the biological sample irradiated with light in the light irradiation step at the focal position changed in the position changing step; and the light irradiation.
- a feature quantity calculation step for calculating a feature amount characterizing the captured image on the basis of the charges captured image captured by the imaging step, the focal position changing step, the focal position measurement scan
- a focus position selecting step for selecting at least one focus position based on the focus position, and the focus position selected in the focus position selecting step based on the focus position in the biological sample stored in the desired storage section.
- a focal position determining step for determining the focal position of the objective lens so as to match the observation target site, and a focal position adjusting step for aligning the focal position of the objective lens with the focal position determined in the focal position determining step.
- luminescent image acquisition for acquiring a luminescent image of the biological sample by imaging the biological sample through the objective lens And a step.
- the biological sample imaging method according to claim 4 is the biological sample imaging method according to claim 3, wherein the moving step is performed within the field of view of the objective lens.
- the substrate and / or the objective lens is moved until the accommodating portion is accommodated, the position of the substrate and / or the objective lens at the destination is measured, and the measured destination position information regarding the position at the destination is measured.
- the storage unit is stored in association with storage unit identification information for identifying the desired storage unit.
- the present invention relates to a biological sample imaging device, and the biological sample imaging device according to claim 5 according to the present invention is a weak light housed in the housing portion of a substrate having a plurality of housing portions.
- a biological sample imaging apparatus for imaging a biological sample that emits light through an objective lens, and a moving means for moving the substrate and / or the objective lens until the desired accommodating portion is within the field of view of the objective lens
- Sample imaging means for controlling each means so as to repeatedly execute the measurement means, the sample imaging means, and the feature amount calculation means, and a plurality of accumulated data obtained by repeatedly executing each means by the control means. Repeatedly executed from the focal position Based on the plurality of feature quantities accumulated in this manner, the focus position selecting means for selecting at least one focus position, and the desired storage section based on the focus position selected by the focus position selecting means. And a focal position determining means for determining the focal position of the objective lens so as to match the observation target site in the stored biological sample.
- the biological sample imaging device is the biological sample imaging device according to claim 5, wherein the moving means moves the substrate and z or the objective lens.
- Destination position measuring means for measuring the position of the substrate and Z or the objective lens at the destination, and destination position information relating to the position at the destination measured by the destination position measuring means.
- Storage means for storing the information in association with the storage unit identification information for identifying the storage unit.
- the biological sample imaging method according to the present invention is applied with optical conditions determined by a high numerical aperture (NA) and magnification. It is characterized by optimizing the linkage with weak light imaging in cooperation with the power method or device.
- the imaging includes a step of setting an interval condition, and a plurality of images related to the biological sample are acquired at different times.
- image analysis including cells can be performed by including at least cells that generate faint light.
- the present invention is also an imaging apparatus using the above method. This apparatus is preferably linked with software for analyzing cells that generate faint light.
- a luminescent sample imaging method that embodies the imaging device and imaging method described above is represented by a numerical aperture (NA) and a projection magnification ( ⁇ ) in comparison with a luminescent sample imaging method for imaging a luminescent sample. It is characterized by using an objective lens whose square value of (NA ⁇ j3) is 0.01 or more, preferably 0.039 or more.
- the present invention can be embodied in a luminescent cell imaging method, and is expressed by a numerical aperture (NA) and a projection magnification (/ 3) in a luminescent cell imaging method for imaging a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced.
- An objective lens having a square value of (NA ⁇ j3) of 0.01 or more, preferably 0.039 or more is used.
- the present invention also relates to an objective lens.
- the objective lens used in the above-described luminescent sample imaging method for imaging a light sample the numerical aperture (
- NA NA
- NA ⁇ the square value of (NA ⁇ ) represented by the projection magnification () is 0 ⁇ 01 or more, preferably 0.039 or more.
- the present invention also relates to an objective lens.
- the objective lens which is particularly useful for the present invention, is similar to the objective lens used in the above luminescent cell imaging method for imaging luminescent cells into which a luciferase gene has been introduced.
- the square value of (NA ⁇ j3) expressed by the numerical aperture (NA) and projection magnification (/ 3) of the objective lens is 0.01 or more, preferably 0.039 or more. Let's say.
- the present invention also relates to an objective lens.
- the objective lens which is a power of the present invention, is an objective lens used in the above-described luminescent sample imaging method for imaging a luminescent sample, and the objective lens and / or the objective lens.
- the packaging container for wrapping the objective lens is characterized in that the numerical value (NA) and the square value of (NA + ⁇ ) expressed by the projection magnification (/ 3) are described.
- a biological sample can be analyzed quickly and accurately. Further, according to the biological sample imaging method and the biological sample imaging apparatus according to the present invention, imaging of the biological sample accommodated in each accommodating part (for example, each of the walls included in the microplate) included in the substrate can be performed quickly and accurately. It can be carried out.
- the substrate and the eyelid or the objective lens are moved until the desired accommodating portion is within the field of view of the objective lens
- the position of the objective lens at the destination is measured, and the destination position information related to the measured position at the destination is stored in association with the storage unit identification information for identifying the desired storage unit.
- the substrate and / or the objective lens can be moved until the desired storage unit is within the field of view of the objective lens.
- the square value of (NA ⁇ j3) represented by the numerical aperture ( ⁇ ) and the projection magnification () is An objective lens of 0.01 or more, preferably 0.01 or more, preferably 0.039 or more is used.
- a luminescent sample for example, a photoprotein (for example, an introduced gene ( (E.g., photoprotein expressed from noreluciferase gene), luminescent cells or aggregates of luminescent cells, luminescent tissue samples, luminescent individuals (eg animals and organs)
- a luminescent sample for example, a photoprotein (for example, an introduced gene ( (E.g., photoprotein expressed from noreluciferase gene), luminescent cells or aggregates of luminescent cells, luminescent tissue samples, luminescent individuals (eg animals and organs)
- it has the effect of being able to capture clear images with a short exposure time and in real time.
- the square value of ((+ / 3) represented by the numerical aperture (NA) and the projection magnification ( ⁇ ) is 0. Since an objective lens of 01 or higher, preferably 0.039 or higher, is used, it is possible to take a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced as an imaging target and to take a clear image with a short exposure time and in real time. Play.
- the objective lens used in the luminescent sample imaging method and the issued cell imaging method embodying the imaging apparatus and imaging method according to the present invention is expressed by a numerical aperture ( ⁇ ) and a projection magnification ( ⁇ ) (NA) ⁇ Since the square value of j3) is 0.01 or more, preferably 0.039 or more, a luminescent sample with a small amount of luminescence (for example, a photoprotein (for example, an introduced gene (for example, a noluciferase gene)) (Photoproteins expressed from), luminescent cells or aggregates of luminescent cells, luminescent tissue samples, and luminescent individuals (such as animals and organs).
- a luminescent sample with a small amount of luminescence for example, a photoprotein (for example, an introduced gene (for example, a noluciferase gene)
- Photoproteins expressed from for example, a photoprotein (for example, an introduced gene (for example, a noluciferase gene))
- the effect is that you can shoot in real
- the objective lens used in the luminescent sample imaging method and the issued cell imaging method embodying the imaging apparatus and imaging method according to the present invention has a larger aperture number and magnification than the conventional objective lens. Therefore, if this objective lens is used, a wide range can be imaged with high resolution. Thereby, for example, moving luminescent samples and luminescent samples distributed over a wide range can be targeted for imaging.
- this objective lens is squared (NA + ⁇ ) expressed by the numerical aperture (NA) and the projection magnification (/ 3) on the objective lens and Z or a packaging container (package) that wraps the objective lens. (For example, 0.01 or more, preferably 0.039 or more).
- a person who observes a luminescent image can check the square value of ( ⁇ + / 3), which is suitable for imaging a luminescent sample in a short exposure time and in real time. Easy selection of objective lens There is an effect that the power S can be.
- FIG. 1 is a diagram schematically showing an object point, an entrance pupil, an exit pupil, and an image plane of an optical system.
- Figure 2 shows an example of how the output signal of each pixel of the CCD camera changes when a cell is imaged with a CCD camera while moving the objective lens, and schematically shows how this changes. It is a figure which shows the position of the petri dish and the position of the cell which were written in (2).
- FIG. 3 shows the distribution of the light intensity of each pixel included in a specific pixel column of the CCD camera when the cell is imaged at the position ⁇ in FIG. 2 and when the cell is imaged at the position in FIG. It is a figure which shows distribution of the light intensity of each pixel contained in the specific pixel row
- FIG. 4 shows the measurement results of the focal position on the optical axis of the objective lens when two illumination images were taken and the focal position on the optical axis of the objective lens when taking a luminescent image.
- FIG. 5 is a diagram schematically showing the focal position of the object lens when the focal position of the objective lens matches the position of the outer bottom surface of the petri dish.
- FIG. 6 is a diagram showing an illumination image and a luminescent image with the highest contrast imaged on the near point side.
- FIG. 7 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 6 is taken.
- FIG. 8 is a diagram showing the highest-contrast illumination image and light-emitting image captured at the center point.
- FIG. 9 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 8 is taken.
- FIG. 10 is a diagram showing an illumination image and a luminescent image with the highest contrast imaged on the far point side.
- FIG. 11 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 10 is taken.
- FIG. 12 is a diagram showing a basic configuration of the focal position determining apparatus 1 of the first embodiment.
- FIG. 13 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determining device 1 according to the first embodiment. It is.
- FIG. 14 is a diagram showing an example of the configuration of each part arranged in the vicinity of the sample stage 17.
- FIG. 15 is a diagram showing an example of a configuration of the aperture unit 24 and an image of an aperture projected on the pupil of the objective lens 30.
- FIG. 15 is a diagram showing an example of a configuration of the aperture unit 24 and an image of an aperture projected on the pupil of the objective lens 30.
- FIG. 16 is a diagram illustrating an example of another configuration of the aperture unit 24 and a projected image of the aperture at the pupil of the objective lens 30.
- FIG. 16 is a diagram illustrating an example of another configuration of the aperture unit 24 and a projected image of the aperture at the pupil of the objective lens 30.
- FIG. 17 is a diagram showing another specific example of the configuration of the focal position determining apparatus 1 of the first embodiment.
- FIG. 18 is a flowchart showing an example of a focus position determination process performed by the focus position determination apparatus 1 of the first embodiment.
- FIG. 19 is a flowchart showing an example of a focus position redetermination process performed by the focus position determination device 1 of the first embodiment.
- FIG. 20 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determining apparatus 1 of the second embodiment.
- FIG. 21 is a diagram showing another specific example of the configuration of the focal position determining device 1 of the second embodiment.
- FIG. 22 is a diagram showing another specific example of the configuration of the focal position determining device 1 of the second embodiment.
- FIG. 23 is a diagram showing an illumination image and a fluorescence image of HeLa cells into which a plasmid vector has been introduced.
- FIG. 24 is a diagram showing an illumination image and a luminescence image of HeLa cells into which a plasmid vector has been introduced.
- Fig. 25 is a graph showing the time variation of the luminescence intensity from the selected HeLa cell of number 1.
- FIG. 26 is a diagram showing an example of the configuration of an apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method that is effective in the present embodiment.
- FIG. 27 is a diagram showing an example of an objective lens 2 ⁇ in which a square value of (NAZ ⁇ ) is expressed.
- FIG. 28 is a diagram showing a configuration in the case where the weak light sample imaging device shown in FIG. 26 is arranged in the light shielding device and automatically controlled from the outside.
- FIG. 29 is a diagram showing a configuration of a container that holds the sample 1B shown in FIG. 28 and has variable environmental conditions.
- FIG. 30 is a conceptual diagram showing the overall configuration of a high-throughput imaging apparatus as an application example of this embodiment.
- FIG. 31 is an internal configuration diagram of an imaging apparatus of the present invention in which a culture apparatus and a microscope apparatus applicable to the present embodiment are integrated.
- Figure 32 shows a block diagram of an electrically controllable unit in a high-throughput imaging device.
- FIG. 33 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- FIG. 34 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- FIG. 35 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- FIG. 36 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- FIG. 37 is a diagram showing a specific example of the configuration of the inspection system that is effective in the third embodiment.
- FIG. 38 is a diagram showing a specific example of the configuration of the microplate used in the detection system emphasizing the third embodiment.
- FIG. 39 is a diagram showing a specific example of the configuration of a modified example of the detection system that works on the third embodiment.
- FIG. 40 is a flowchart showing an example of a biological sample imaging 'analysis process performed by the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- FIG. 41 shows a focal position determination device as a biological sample imaging device according to the third embodiment.
- 5 is a flowchart showing an example of a focal position determination process performed by the apparatus 1;
- Focus position change unit objective lens z-axis movement mechanism
- the present invention determines the focal position of the objective lens as a reference, and uses the determined focal position as a reference, the focal position on the near point side (substantially the focal position) of the objective lens and / or the focal position on the far point side of the objective lens ( (Approximate focal position) is measured, and based on the measured focal position, the focal position of the objective lens that matches the observation target part in the sample is determined, and the focal position of the objective lens is adjusted (moved) to the determined focal position. .
- the present invention includes (1) irradiating a sample with light, (2) moving the position of the sample and / or the position of the objective lens in the optical axis direction, and the Z or objective lens, for example.
- the focal length in this case, a variable focus lens is used
- the focal position of the objective lens is changed, for example, by a fixed amount
- the changed focal position is measured, and (4) the changed focal position.
- a sample irradiated with light at a position is imaged using a CCD camera, and (5) feature quantities that characterize the captured image based on the captured image (for example, the contrast of the captured image and the integral of the brightness of the captured image) Value, statistics obtained from the luminance distribution of the captured image, and the ratio of the number of pixels with luminance exceeding the specified threshold in the captured image to the total number of pixels) (6) (2) to (5 ) Repeatedly, and (7) Multiple focal positions accumulated ( Based on a plurality of feature values accumulated by execution from the coordinate values on the optical axis representing the point position), at least one focal position (specifically, the focal position on the near point side of the objective lens and / or The focal position of the objective lens on the far point side) is selected.
- the focal position of the objective lens that matches the observation target site in the sample is determined.
- the objective lens position in the optical axis direction and / or changing the focal length of the objective lens (in this case, a variable focus lens is used)
- the objective lens is moved to the determined focal point position. Adjust the focus position (move).
- two focus positions (specifically, based on a plurality of feature amounts executed and accumulated from a plurality of focus positions executed and accumulated in (7) above).
- the central position (substantially central position) of the two focal positions may be determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target site in the sample.
- one focal position (specifically, based on a plurality of feature amounts that have been executed and accumulated from a plurality of focal positions that have been executed and accumulated.
- a position away from the focal position by the distance may be determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target portion in the sample.
- the present invention is characterized in that (10) a light emission image of a sample is captured using a CCD camera at the focal position determined in (8) above, and (11) the image is based on the captured image. (12) Change the focal position determined in (8) above, (13) Take a light emission image of the sample using the CCD camera at the changed focal position, and (14) Take the captured image (15) The feature value calculated in (11) is compared with the feature value calculated in (14). (16) As a result of comparison, it was calculated in (14) above. If the feature amount is larger, the focal position changed in (12) may be determined again as the focal position of the objective lens that matches the observation target site in the sample.
- the aperture may be arranged eccentrically with respect to the optical axis, for example, at the pupil position of the illumination optical system including the light source used in (1).
- a narrow band pass filter may be arranged in the illumination optical system including the light source used in 1).
- a light source that emits monochromatic visible light may be used as the light source used in the above (1).
- a biological cell or tissue is used as a sample.
- Figure 1 is a diagram schematically showing the object point, the entrance pupil, exit pupil, and image plane of the optical system.
- a living cell can usually be handled optically as a phase object.
- Living cells usually have almost the same shape. Therefore, for example, when illumination light is incident on cultured living cells distributed in a petri dish, the living cells play a role like a diffraction grating, and the irradiation light is diffracted in a specific direction depending on the shape of the living cells. Diffracted light is observed. In other words, when illumination light enters a cell in the petri dish from a specific direction, diffraction occurs in the incident light due to the cell, and zero-order diffracted light (transmitted light) is generated in the direction of the incident light. First-order diffracted light is generated in the direction of the angle.
- a biological cell can be arranged at a position shifted from the in-focus position of the optical system, and a phase difference can be generated between each light beam that passes through the optical system.
- a phase difference can be generated between each light beam that passes through the optical system.
- a phase difference according to (defocus amount) can be generated.
- the objective lens is moved along the optical axis so that the focal position of the objective lens is the in-focus position in normal observation, and the objective lens is further reduced from the moved position.
- phase difference proportional to the amount of movement can be generated between each light beam transmitted through the observation optical system.
- This phase difference is maximized for light rays that pass through the maximum NA of the objective lens.
- part of the diffracted light is diffracted out of the NA of the objective lens and does not pass through the observation optical system due to the oblique illumination, so that a contrast image with a relief feeling can be formed as in the case of refracted light.
- Forming power S is possible.
- the contrast proportional to the phase distribution of the phase object is proportional to the phase amount of the phase object and the phase difference amount provided between the transmitted light and the diffracted light.
- the angle between the transmitted light and the diffracted light varies depending on the shape of the phase object. Furthermore, if the angle between the transmitted light and the diffracted light changes, the amount of phase difference generated between the two light fluxes will differ even with the same defocus amount.
- the aperture by arranging the aperture to be decentered with respect to the optical axis of the illumination optical system at the pupil position of the illumination optical system of the microscope, it is possible to generate illumination light that irradiates the object at a specific angle.
- the aperture Since the aperture is decentered, diffracted light that is more angled than the transmitted light that is transmitted in the direction of the incident light on the object can be made incident on the entrance pupil of the optical system.
- the ability to further increase the phase difference from light can be achieved.
- the angle of the diffracted light can be made greater than that of the transmitted light, so that the phase difference between the transmitted light and the diffracted light is made larger. (See JP 2004-354650 A). In other words, if the phase difference between transmitted light and diffracted light is increased by these methods, the contrast of the observed image can be increased.
- the sign of the phase difference between each light beam caused by defocusing varies depending on whether the object is shifted to the near point side or the far point side when the object is in focus.
- the contrast of the image the phase object such as the cultured cell is shifted between the focusing position force of the observation optical system to the near point side and the image observed by shifting to the far point side. Is inverted corresponding to the phase distribution of. Also, attach it to the bottom of the petri dish.
- An object that absorbs light from attached dust or the like is no longer a phase object, so even if a phase difference is given to the object by defocusing, the contrast of the image does not change. Therefore, defocusing can clearly distinguish between phase objects and non-phase objects. Therefore, it is possible to separate image components that are not affected by the phase difference given by defocusing by performing inter-image computation on the image captured by shifting to the near point side and the image captured by shifting to the far point side. Can do. In particular, by calculating the difference between each pixel of two images, the contrast of the image component corresponding to the phase distribution of the object can be doubled, so that the phase of dust, foreign matter, illumination unevenness, etc. Image components that do not have information can be eliminated. That is, the contrast of the observation image can be further increased by these methods.
- the change in the output signal from each pixel of the CCD camera (digital signal corresponding to the light intensity captured by each pixel) when a biological cell is imaged by the CCD camera while moving the objective lens See Fig. 2 and Fig. 3 for an example of how to determine the focal position of the objective lens that matches a specific part (observation target part) in a living cell based on how the output signal changes.
- the living cells immersed in the culture solution in the sample container (petri dish), illuminate the living cells and move the objective lens from the lower side to the upper side along the optical axis (z axis).
- the integrated value of the light intensity from all the pixels of the CCD camera is, first, the outside of the sample container where the irradiated light is strongly reflected. Maximum and maximum at bottom position.
- the integrated value of the light intensity from all the pixels of the CCD camera gradually decreases and becomes maximum again at the position of the inner bottom surface of the sample container.
- the integrated value at the position of the inner bottom surface of the sample container indicates that the difference in refractive index between the inner bottom surface of the sample container and the culture solution in contact with the difference between the refractive indices of the outer bottom surface of the sample container and the air contact surface is smaller.
- the objective lens is in focus at a substantially central position of the living cell.
- the integrated value of the light intensity from all the pixels of the CCD camera increases and becomes maximum again at the position ⁇ shown in FIG. .
- the position ⁇ is also a position on the ⁇ axis where a high-contrast captured image due to the default is obtained.
- the objective lens is focused on the upper ridge portion (upper edge) of the living cell.
- the objective lens is focused inside the living cell, so that the position ⁇ and the position ⁇
- the position may be determined as the focal position of the objective lens that matches a predetermined site in the living cell.
- an output signal of each pixel force of the CCD camera (digital signal corresponding to the light intensity captured by each pixel) when a biological cell is imaged at the position ⁇ shown in Fig. 2A
- From the output signals from each pixel of the CCD camera when a biological cell is imaged at the position ⁇ shown in Fig. 2 (A) only output signals that exceed a predetermined threshold are selected as effective output signals.
- the intensity distribution of each output signal was determined (see Fig. 3).
- Fig. 3 shows the distribution of the light intensity (Fig. 3 (A)) of each pixel included in a specific pixel column of the CCD camera when imaging a living cell at the position indicated by (A) in Fig.
- the focal position force of the objective lens determined based on the focal position of the objective lens when two high-contrast images (illumination images) were captured. ) was confirmed by actually taking a luminescence image of the cell.
- the living cells used here are HeLa cells into which a luciferase gene (pGL3_control vector: Promega) was introduced by adding ImM luciferin. The luminescence image was taken after the HeLa cells were exposed for 1 minute at room temperature.
- the HeLa cells were imaged while illuminating with an illumination light source, and the image with the highest contrast imaged on the far point side of the objective lens (illuminated image) was captured. ) And a captured image (illumination image) having the highest contrast imaged on the near point side of the objective lens.
- HeLa cells were imaged without illumination while moving the objective lens along the optical axis, and the captured image (luminescence image) with the highest contrast was selected.
- the focal position on the optical axis of the objective lens (20x, 40x) when the two selected illumination images were captured and the objective lens (20x, 40x) when the selected emission image was captured ) On the optical axis.
- Figure 4 shows the measurement results.
- the measured focal position is the position (reference position) on the optical axis of the objective lens when the focal position of the objective lens matches the position of the outer bottom surface of the sample container (petriet). It is the same as the distance from.
- the focal position of the objective lens (10.507 described in the column “center point” shown in FIG. 4) when the selected emission image ((B) in FIG. 8) was captured.
- 10. 506: “Zb” shown in FIG. 9 is the focal position of the objective lens when the illumination image corresponding to the far point side ((A) in FIG. 10) is captured (“far point side” shown in FIG. 4).
- FIG. 6 is a diagram showing the illumination image (A) and the light emission image (B) with the highest contrast imaged on the near point side.
- FIG. 7 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 6 is captured.
- FIG. 8 is a diagram showing the illumination image (A) and the luminescent image (B) with the highest contrast imaged at the center point.
- FIG. 9 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 8 is taken.
- FIG. 10 is a diagram showing the illumination image (A) and the light emission image (B) with the highest contrast imaged on the far point side.
- FIG. 11 is a diagram schematically showing the focal position of the objective lens when the image of FIG. 10 is captured.
- FIG. 12 is a diagram showing a basic configuration of the focal position determining device 1 of the first embodiment.
- the focal position determination device 1 determines the focal position of the objective lens 30 that matches the observation target site 10a in the sample 10 at the time when the sample 10 such as a living cell or tissue is placed when performing the luminescence observation.
- the focal position determination apparatus 1 includes a light irradiation unit 20, an objective lens 30, a focal position change unit 40, a focal position measurement unit 50, a sample imaging unit 60, and an information processing device 70. And is composed of.
- the light irradiation unit (light source) 20 irradiates the sample 10 with light.
- the light irradiation unit 20 is an incoherent light source that emits light having a wavelength in the visible light region (visible light), and specifically includes a halogen lamp, a LED, a tungsten lamp, a mercury lamp, and the like.
- a coherent light source such as a laser may be used as the light irradiation unit 20.
- light (laser light or the like) emitted from a coherent light source is irradiated to the sample 10 after being converted into incoherent light using a diffusion plate or the like.
- a light source that emits infrared light can be used as the light irradiator 20.
- the focus determination using infrared light has the advantage that the focus determination can be performed accurately.
- the weak light to be detected partially overlaps with the light or the light has the same wavelength as that of the weak light, the light intensity is significantly strong with respect to the weak light for a short time (for example, 0. If it can be detected within 5 seconds), it can be used as illumination light for focus determination.
- the objective lens 30 is for forming an image of the sample 10.
- a variable focus lens may be used as the objective lens 30.
- the objective lens has a square value of (NA + ⁇ ) expressed by numerical aperture (NA) and projection magnification () of 0.01 or more, especially 0.071 or more. Is preferable.
- the focal position changing unit 40 specifically moves the position of the sample 10 and / or the position of the objective lens 30 in the optical axis direction and / or changes the focal length of the objective lens 30 to thereby change the objective lens 30. Change the focus position.
- the focal position measuring unit 50 is connected to the focal position changing unit 40.
- the focal position measuring unit 50 is less than the position of the sample 10 on the optical axis, the position of the objective lens 30 on the optical axis, and the focal length of the objective lens 30.
- the focal position of the objective lens 30 is measured based on one of them.
- the sample imaging unit 60 images the sample 10.
- the sample imaging unit 60 is a highly sensitive CCD camera having an imaging device.
- the information processing device 70 is a commercially available personal computer, and is connected to the focal position changing unit 40, the focal position measuring unit 50, and the sample imaging unit 60.
- the information processing device 70 includes a control unit 70a and a storage unit 70b.
- the control unit 70a is a CPU or the like that comprehensively controls the control unit 70a. Information processing for executing various processes based on these programs I do.
- the control unit 70a controls each of these units so as to repeatedly execute the focus position changing unit 40, the focus position measuring unit 50, the sample imaging unit 60, and a feature amount calculating unit 70al described later, or the control unit 70a. Control each part of the.
- the control unit 7 Oa acquires information input from the input device or outputs it. Output information to the device.
- the control unit 70a includes a feature amount calculation unit 70al, a focus position selection unit 70a2, a focus position determination unit 70a3, a feature amount comparison unit 70a4, and a focus position re-determination unit 70a5.
- the feature amount calculation unit 70al is a feature amount that characterizes the captured image based on the captured image captured by the sample imaging unit 60 (for example, obtained from the contrast of the captured image, the integral value of the brightness of the captured image, and the brightness distribution of the captured image). Statistics, the ratio of the number of pixels having a luminance exceeding a predetermined threshold in the captured image, and the total number of pixels).
- the focal position selection unit 70a2 is accumulated by repeatedly executing each unit (specifically, the focal position changing unit 40, the focal position measuring unit 50, the sample imaging unit 60, the feature amount calculating unit 70al) in the control unit 70a.
- At least one focus position is selected from a plurality of focus positions (focus positions measured by the focus position measurement unit 50) based on the feature values accumulated by repeated execution.
- the focal position determination unit 70a3 determines the focal position of the objective lens that matches the observation target position 10a in the sample 10 based on the focal position selected by the focal position selection unit 70a2.
- the feature amount comparison unit 70a4 compares the two feature amounts individually calculated in advance by the feature amount calculation unit 70al.
- the focus position re-determination unit 70a5 determines again the focus position of the objective lens that matches the observation target part 10a in the sample 10 based on the result of comparison by the feature amount comparison unit 70a4.
- the storage unit 70b is a storage means, and specifically, can use a memory device such as a RAM or a ROM, a fixed disk device such as a hard disk, a flexible disk, an optical disk, or the like.
- the storage unit 70b stores a captured image database 70bl and a focus position management file 70b2 as illustrated.
- the captured image database 70bl includes image identification information for uniquely identifying the captured image, the captured image, the focal position of the objective lens when the captured image is captured, and the feature amount of the captured image. Store in association.
- the focus position management file 70b2 is an objective lens that matches the observation target part 10a in the sample 10. (Specifically, the focal position determined by the focal position determining unit 70a3 and the focal position determined again by the focal position re-determining unit 70a5).
- the captured image includes an illumination image, a light emission image, and a fluorescence image.
- FIG. 13 is a diagram illustrating a specific example of the configuration of the focal position determining device 1 according to the first embodiment.
- the focal position determination device 1 shown in FIG. 13 is based on an inverted microscope, and is used for luminescence observation of living cells that emit faint light, similar to the focal position determination device 1 shown in FIG. Les.
- the focal position determining device 1 shown in FIG. is configured to include an illumination optical system, an observation optical system, an eyepiece lens 43, and the like.
- each part which comprises the said focus position determination apparatus 1 is demonstrated in detail.
- the sample 10 is immersed in the culture solution placed in the sample container 11.
- the sample container 11 is specifically a petri dish, and at least the bottom surface of the sample container 11 is optically transparent (that can be handled by a normal objective lens).
- the bottom surface is specifically the same material as the microscope cover glass and has a thickness of 0.17 mm.
- a sample container 11 a glass slide, a microplate, etc. may be used in addition to a petri dish.
- a lid 18 may be provided for the sample container 11 as shown in FIG.
- the sample container 11 is placed in a water tank 12 filled with pure water supplied through a nozzle 13. The pure water is put in the water tank 12 for the purpose of keeping the humidity in the sample container 11.
- the water tank 12 contains 5% mixed gas (carbon dioxide (C0)) discharged from the gas cylinder 14 and acid.
- Gas containing 95% elemental (O 2) passes through the gas supply tube 15 and enters the tank 12 as shown in the figure.
- the shape of the water tank 12 may be a shape that covers the entire sample container 11 as shown in FIG. In this case, a detachable lid 19 is disposed at the top of the water tank 12.
- the water tank 12 is arranged on the heat plate 16.
- the heat plate 16 is for setting the environmental temperature, and is disposed on the sample stage 17. The heat plate 16 can set the environmental temperature at intervals of 0.5 ° C. by controlling a temperature controller (not shown) connected to the heat plate 16.
- the sample stage 17 is a plate-like object for setting the sample 10 and the like, and is arranged so as to be orthogonal to the optical axis (z axis) as shown in the figure.
- the sample stage 17 is disposed by the driving force of two stepping motors (not shown) mounted at predetermined positions on the stage in directions orthogonal to each other (90 ° direction). It is possible to move in the direction perpendicular to the optical axis (z-axis) (for example, the X direction and the y direction).
- Each stepping motor is controlled by a sample stage controller (not shown) connected to each motor.
- the sample stage controller 1 is connected to the information processing device 70, and appropriately drives each stepping motor based on a command from the information processing device 70 to move the sample stage 17.
- the illumination optical system is for guiding the illumination light emitted from the light source 20 to the sample 10.
- the collector lens 21, the deflection mirror 22 for deflecting the optical axis of the illumination light, and the image of the light source 20 are displayed.
- FIG. 15A is detachably disposed at the pupil position of the condenser lens 23.
- FIG. 15 is a diagram illustrating an example of a configuration of the aperture unit 24 and an projected image of the aperture in the pupil of the objective lens 30.
- the opening unit 24 includes a partial ring zone opening 24a and a light shielding plate 24b having light shielding properties.
- the opening 24a is disposed with respect to the optical axis so as to be eccentric with respect to the center of the pupil, and is configured to be able to cause lateral displacement freely.
- the aperture diameter of the aperture 24a is determined so that the projected image of the aperture 24a is substantially inscribed in the outer peripheral portion of the pupil of the objective lens 30 as shown in FIG.
- the width of the opening 24a (“Ro_Ri” shown in FIG. 15A) is preferably equal to or less than one third of the pupil radius of the objective lens 30 having a conjugate relationship. Accordingly, an image with the best contrast can be obtained by appropriately setting the amount of movement of the objective lens 30 according to the type of living cell to be observed.
- the opening unit 24 may be provided with a rectangular opening 24a as shown in FIG. Figure 16 shows another configuration of the aperture unit 24 and the opening at the pupil of the objective lens 30. It is a figure which shows an example of the projection image of a mouth.
- the rectangular opening 24a is arranged at a position away from the center position of the pupil by a predetermined distance in a state of being eccentric with respect to the center of the pupil.
- the image of the aperture 24a is projected onto the pupil of the objective lens 30.
- the rectangular opening 24a is not concentrically arranged with respect to the center of the pupil, for example, when a biological cell to be observed is elongated, an image with high contrast can be obtained.
- the incident illumination light is incident on a living cell having a three-dimensional size, separated into transmitted light, refracted light, and diffracted light, and emitted from the living cell.
- refracted light increases from a portion having a contour close to a sphere or ellipsoid
- transmitted light and diffracted light increase from a flat portion.
- Part of the refracted light that is refracted in the part of the cell that is close to a sphere or ellipsoid is larger than the NA of the objective lens 30, so it is not captured by the objective lens 30.
- an interference filter 25 for making the light source 20 quasi-monochromatic may be disposed below the deflection mirror 22.
- the traveling direction of the illumination light emitted from the light source 20 is deflected by the deflecting mirror 22, and the deflected illumination light passes through the interference filter 25 to become a monochromatic light with a very narrow wavelength bandwidth. Go to condenser lens 23.
- an interference filter not only an interference filter but a narrow band-pass filter may be used.
- the observation optical system is for forming an image of the sample 10, and is arranged upside down below the sample stage 17.
- the observation optical system includes a relay lens 31 that forms an image (image of the sample 10) formed by the objective lens 30 on the imaging surface, and a deflection mirror 32 that deflects light from the objective lens 30.
- a relay lens 33 that forms an image formed by the objective lens 30 together with the relay lens 31 (an image of the sample 10) on the imaging surface. Therefore, the value of “(NA ⁇ / 3) squared”, which is the optical condition for the objective lens described above and later, means the condition for all the lenses in the observation optical system.
- the objective lens selection condition when replacing the objective lens with a low or high magnification is described. It is not an optical condition to be determined.
- examples of the observation optical element other than the objective lens include the relay lenses 31 and 33 shown in FIG. 13 and the condensing lens 3A shown in FIG. Provided with such an observation optical system.
- the focal position changing unit 40 moves (drives) the objective lens 30 in the optical axis direction (z-axis direction) with a rack and pinion mechanism (not shown).
- the knob included in the rack and pinion mechanism is rotated by a computer controlled stepper motor (not shown).
- the objective lens z-axis moving mechanism can be moved in the direction of the optical axis by a friction roller mechanism in addition to the rack and pinion mechanism.
- the focal position changing unit 40 may be configured to move the sample stage 17 along the optical axis in addition to the configuration that moves the objective lens 30 along the optical axis.
- Objective Lens The z-axis moving mechanism is provided with an objective lens heater 41 as shown.
- the objective lens heater 41 is attached around the objective lens 30 in contact with the objective lens 30 as shown.
- the objective lens heater 41 is controlled by a temperature adjusting device (not shown) connected to the objective lens heater 41.
- the objective lens heater 41 keeps the temperature of the objective lens 30 constant by setting the temperature of the objective lens 30 from the outside of the objective lens 30 at intervals of 0.5 ° C.
- the eyepiece 43 is for enlarging the image of the sample 10, and is for allowing an observer to observe the image of the sample 10 visually.
- the switching mirror 44 is disposed between the eyepiece lens 43 and the relay lens 33 as shown. Thereby, the visual observation of the sample 10 by the eyepiece 43 and the observation of the sample 10 by the sample imaging unit 60 can be arbitrarily switched.
- the switching mirror 44 may be of a type that mechanically switches between two optical paths, or a type that separates two optical paths using a half mirror.
- the infrared cut filter 45 is detachably provided above the light receiving surface of the sample imaging unit 60 as shown in the figure, and cuts off the infrared rays serving as background light. In other words, the infrared cut filter 45 prevents the infrared light serving as background light from entering the sample imaging unit 60 as necessary.
- the sample imaging unit 60 is a CCD camera having an imaging element 60a on its light receiving surface.
- the number of pixels of the image sensor 60a is 1360 ⁇ 1024.
- the CCD camera should be as sensitive as possible so that the faint light emitted from sample 10 can be detected. Use.
- a CCD camera in order to capture a color bright-field image, a three-plate type color melody may be used.
- the sample imaging unit 60 may be a CMOS image sensor, a SIT camera, or the like, without being limited to the CCD camera.
- the sample imaging unit 60 is connected to an information processing device 70 (a TV monitor connected to the information processing device 70) via a signal cable.
- a cooling device 61 is disposed at the bottom of the sample imaging unit 60 in order to suppress the soot generated from the CCD camera.
- the cooling device 61 is composed of a Peltier element, and cools and keeps the temperature of the sample imaging unit 60 at about 0 ° C.
- the information processing device 70 further includes an input / output device (TV monitor, keyboard, mouse, etc.).
- the information processing device 70 displays the captured image captured by the sample imaging unit 60 on the TV monitor.
- the light emitted from the light irradiation unit 20 is collimated by the collector lens 21, and this parallel light is projected onto the pupil position of the condenser lens 23. Is done. Then, the light image emitted from the light irradiation unit 20 illuminates the sample 10 as Koehler illumination by the condenser lens 23. Next, the light illuminating the sample 10 passes through the sample 10 and enters the objective lens 30. Next, the light (measurement light) incident on the objective lens 30 forms an image of the sample 10 on the image plane by the objective lens 30, the relay lens 31, and the relay lens 32. Then, the image of the sample 10 formed on the imaging surface is directly incident on the eyepiece lens 43 and is imaged on the image sensor 60 a of the CCD camera 60 by the switching mirror 44.
- FIG. 18 is a flowchart illustrating an example of a focus position determination process performed by the focus position determination apparatus 1 according to the first embodiment.
- the focus position determination process in the case where the observation of luminescence of a living cell is performed using the focus position determination apparatus 1 shown in FIG. 13 will be described.
- the focal position determining device 1 irradiates the living cells with the illumination light emitted from the light source 20 (step SA_1).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the objective lens z-axis moving mechanism that is the focal position changing unit 40, and the objective lens z-axis moving mechanism is used to operate the object lens.
- the focal position of the objective lens 30 is changed by moving 30 from the initial position by a certain amount along the optical axis (step SA-2).
- the focal position measurement unit 50 is operated by the control unit 70a of the information processing apparatus 70, and the focal position of the objective lens 30 is measured by the focal position measurement unit 50 (step SA_ 3).
- control unit 70a of the information processing device 70 operates the CCD camera, which is the sample imaging unit 60, and images biological cells with the CCD camera (step SA4).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the feature amount calculation unit 70al, and the feature amount calculation unit 70al is based on the captured image captured in step SA-4.
- the contrast of the captured image is calculated (step SA-5).
- the focal position determination device 1 is controlled by the control unit 70a of the information processing device 70 in step SA.
- the focal position measured in step 3, the captured image captured in step SA-4 and the contrast calculated in step SA-5 are associated with each other and stored in the captured image data base 70bl of the storage unit 70b.
- the focus position determination device 1 uses the control unit 70a of the information processing device 70 to change the focus position of the objective lens 30 changed from step SA-2 to step SA-5 to step SA-2. Repeat until a predetermined position on the axis is exceeded (step SA-6).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the focal position selection unit 70a2, and the focal position selection unit 70a2 performs a plurality of operations stored in the captured image database 70b 1.
- the two contrasts that are the maximum of the contrasts are selected, and the focal points stored in the captured image database 70bl are associated with the selected contrasts.
- Get position step SA—7).
- the focus position determination device 1 uses the focus position selection unit 70a2 based on a plurality of feature amounts stored in the captured image database 70bl from a plurality of focus positions stored in the captured image database 70bl.
- a focal position on the near point side (substantially focal position) of 0 and a focal position on the far point side of the objective lens 30 (substantially focal position) are selected.
- the focal position determination device 1 operates the focal position determination unit 70a3 by the control unit 70a of the information processing device 70, and the two focal positions selected in step SA-7 by the focal position determination unit 70a3. Based on the above, the central position (substantially central position) of the two focal positions is determined as the focal position of the objective lens 30 that matches the observation target site 10a in the living cell (step SA-8).
- the focus position determination device 1 operates the objective lens z-axis movement mechanism by the control unit 70a of the information processing device 70, and the central position determined in step SA-8 by the objective lens z-axis movement mechanism.
- the position of the objective lens 30 is adjusted so that the focal position of the objective lens 30 is aligned with the position (approximately the center position) (step SA-9).
- a light emission image as a weak light image is acquired using the focus position adjusted in this way, and the light emission image is subjected to image analysis (steps SA-10 and 11). This image analysis can be performed more quickly and accurately by analyzing the image together with the illumination image obtained by light irradiation.
- the focal position determination device 1 of the first embodiment irradiates the living cells with the irradiation light by the light source 20. Then, the focal position determination device 1 uses the focal position measurement unit 50 to move the objective lens 30 repeatedly while moving the objective lens 30 along the optical axis repeatedly by a certain amount by the objective lens z-axis movement mechanism. Then, a biological cell is illuminated by a CCD camera and imaged, and the feature amount calculation unit 70al calculates the contrast of the captured image. Then, the focal position determination device 1 selects two maximum contrasts from the plurality of contrasts accumulated by repeatedly moving the object lens 30 by the focal position selection unit 70a2, and corresponds to the selected contrast.
- the focal position of the objective lens 30 when the captured image is captured is acquired from a plurality of focal positions accumulated by repeatedly moving the objective lens 30. Then, the focal position determination device 1 uses the focal position determination unit 70a3 based on the two focal positions acquired by the focal position determination unit 70a3. (Center position) is determined as the focal position of the objective lens 30 so as to match the observation target site 10a in the living cell, and the objective lens 30 is moved by the objective lens z-axis moving mechanism. The focal position is adjusted to the determined focal position. As a result, when the observation target site 10a is subjected to light emission observation using a specific site in the living cell as the observation target site 10a, the objective lens 30 that matches the observation target site 10a when the biological cell is installed is provided.
- the focal point position can be determined, and as a result, the focal position of the objective lens 30 can be adjusted to the observation target part 10a.
- a biological cell that emits faint light is observed using an enlarged imaging optical means including a lens, light emission from the biological cell is measured, for example, Even if the light emitted from the living cell is not confirmed by a microscope that observes the weak light emitted by the bioluminescent protein from inside the living cell, the light emitting site in the living cell (bioluminescent protein)
- the focus of the objective lens can be automatically adjusted to the location where the is localized.
- the focal position of the objective lens is quickly adjusted to the target site in the sample as compared with the case where it is manually performed. In addition, it can be set with high accuracy.
- the focal position determination device 1 uses the illumination image of the sample in determining the focal position of the objective lens. However, the illumination image is bright and has high contrast, so it matches the observation target region 10a in the sample 10. Such a focal position of the objective lens 30 can be easily and quickly determined as compared with the case of visual observation.
- the focal position determination apparatus 1 since the contrast is high and the focal position of the objective lens 30 when the illumination image of the sample 10 is captured corresponds to the upper and lower edges of the sample 10, the center position thereof is determined.
- the position (substantially central position) should be determined as the focal position of the objective lens 30 so as to match the observation target part 10a in the sample 10. This makes it possible to easily and easily determine the focal position of the objective lens 30 that matches the observation target site 10a in the sample 10.
- the intensity of the luminescence from the organism is extremely weak at the time the sample is placed, so it can be detected almost even with a high-performance CCD camera.
- the objective lens cannot be focused while confirming the observation target site (cells, etc.) in the living organism as in normal microscope observation.
- the organism is installed, it is usually possible to observe the internal structure of the organism. I can't.
- the focal position of the objective lens detected based on the illumination image of the object the observation image is blurred because it does not match the luminescent part of the photoprotein localized in the cell.
- the position where the fluorescence intensity is highest for the phase object emitting fluorescence by fluorescence excitation light is determined as the focal position.
- the focal position determination apparatus 1 irradiates a living organism with light emitted from a light source 20 such as a halogen lamp as an image observation using illumination light, obtains an illumination image of the organism with a microscope, and performs an objective based on the acquired illumination image. Determine the focal position of the lens 30. In other words, a living cell is imaged under illumination, and the position inside the living cell is estimated.
- the internal structure of the organism can be observed when the organism is installed.
- the objective lens when simultaneously observing a site where a luminescent protein in a cell is localized (a site that emits weak light) between cells, the objective lens can be focused on the luminescent portion of the photoprotein localized in the cell. The In addition, since the focal position of the objective lens is not determined by fluorescence, it is possible to perform long-term fluorescence observation.
- step SA-7 the focal position determination device 1 uses a plurality of features stored in the captured image database 70b 1 from a plurality of focal positions stored in the captured image database 70bl by the focal position selection unit 70a2. Based on the amount, the focal position on the near point side of the objective lens 30 (the focal position of the objective lens 30 when a high-contrast captured image is obtained on the near point side of the objective lens 30) is selected, and step SA-8 In this case, a position separated from the focal position on the near point side of the selected objective lens 30 by the focal position determination unit 70a3 above the optical axis by a distance that is half the thickness of the biological cell measured in advance is observed in the biological cell.
- the focal position of the objective lens 30 may be determined so as to match the elephant site 10a.
- the focal position determination device 1 obtains a high-contrast image on the near point side by observation under illumination.
- the focal position of the objective lens 30 is selected and the position away from the selected focal position by about half the cell thickness above the optical axis is aligned with the observation target site 10a in the living cell.
- the focal position of the objective lens 30 may be determined.
- the focal position determination device 1 uses a plurality of focal positions stored in the captured image database 70bl from the plurality of focal positions stored in the captured image database 70bl by the focal position selection unit 70a2.
- the focal position on the far point side of the objective lens 30 (the focal position of the objective lens 30 when a high-contrast captured image is obtained on the far point side of the objective lens 30) is selected.
- the focal position determining unit 70a3 selects the focal position force on the far point side of the selected object lens 30.
- the focal position of the objective lens 30 may be determined so as to match the observation target portion 10a in the living cell.
- the focal position determining device 1 selects the focal position of the objective lens 30 when a high-contrast image on the far point side is obtained by observation under illumination, and the thickness of the cell is selected from the selected focal position.
- a position separated by about half the distance below the optical axis may be determined as the focal position of the objective lens 30 so as to match the observation target site 10a in the living cell.
- the focal position of the objective lens that matches the observation target part 10a in the sample 10 can be set as compared with the case where the objective lens 30 and the sample 10 are powered and the defocus positions on the near point side and the far point side are selected.
- the focal position determination device 1 can be adapted to the observation target site 10a in the living cell placed in the sample container 11 by executing the following steps 1 to 6.
- the focal point position of the objective lens 30 may be determined.
- Step 1 The light source 20 is turned on, the shutter of the light source 20 is opened and closed, and illumination light is irradiated from above the sample container 11.
- Step 2 Determine the focal position (corresponding to “Zd” in FIG. 14) of the objective lens 30 that matches the bottom surface (outer bottom surface or inner bottom surface) of the sample container 11. Specifically, every time the objective lens 30 is moved by a certain amount while moving the objective lens 30 along the optical axis by the objective lens z-axis moving mechanism, a biological cell is imaged under illumination by a CCD camera.
- the feature value calculation unit 70al allows the integrated value of the light intensity from all pixels of the captured image (the output signal from the CCD camera Intensity) and the controller 70a checks whether or not the calculated integrated value is a maximum value. If it is determined that the calculated value is a maximum value, the captured image that is the source of the maximum value is calculated.
- the focal position of the objective lens 30 (corresponding to “Zd” in FIG. 14) at the time of the image is taken as the focal position.
- Measure with the measuring unit 50 That is, the maximum value of the reflected light from the bottom surface of the sample container 11 is determined by the illumination image while moving the objective lens 30 along the optical axis.
- Step 3 On the near point side of the objective lens 30, the focal position (corresponding to “Zc” in FIG. 14) of the objective lens 30 when a captured image with high contrast is taken is determined. Specifically, each time the objective lens 30 is moved a certain amount along the optical axis from the position moved in (Step 2) by the objective lens z-axis moving mechanism, the CCD is moved each time. A biological cell is imaged under illumination by a camera, the contrast of the captured image is calculated by the feature amount calculation unit 70al, and whether or not the calculated contrast is the maximum value is confirmed by the control unit 70a.
- the focal position measurement unit 50 measures the focal position (corresponding to “Zc” in FIG. 14) of the objective lens 30 when the image is taken.
- Step 4 On the far point side of the objective lens 30, the focal position (corresponding to “Za” in FIG. 14) of the objective lens 30 when a captured image with high contrast is taken is determined. Specifically, every time the objective lens 30 is moved by a certain amount along the optical axis from the position where the objective lens 30 is moved in (Step 3) by the objective lens z-axis moving mechanism, it is moved by the CCD camera. Biological cells are imaged under illumination, the feature amount calculation unit 70al calculates the contrast of the captured image, and the control unit 70a checks whether the calculated contrast is a maximum value.
- the objective lens 30 is in focus on the upper end surface of the living cell when the captured image that is the source of the local maximum is captured, and the image is captured.
- the focal position of the objective lens 30 at the time is measured by the focal position measurement unit 50.
- Step 5 The focus position determined in (Step 3) (corresponding to “Zc” in FIG. 14) and the focus position determined in (Step 4) (corresponding to “Za” in FIG. 14) (for example, Fig. 14 "Zb ((Zc + Z a) ⁇ 2) “corresponding to“) ”is determined as the focal position of the objective lens 30 that matches the observation target part 10a in the living cell.
- Step 6 The objective lens 30 is moved so that the focal position of the objective lens 30 is aligned with the central position determined in (Step 5).
- steps 4 and 5 every time the objective lens 30 is moved by a certain amount, a biological cell is imaged under illumination with a CCD camera, and the focal position of the objective lens 30 at the time of imaging is measured, and the objective lens 30 is measured.
- Calculate the contrast of the multiple captured images taken while moving the lens 30 sum of the output signals from each pixel of the multiple captured images), and compare the calculated contrasts (totals) Select the contrast (sum) and measure the focal position of the objective lens 30 when moving the objective lens 30 when the captured image corresponding to the selected contrast (sum) is captured.
- the focal position of the objective lens 30 corresponding to “Zc” or “Za” in FIG. 14 may be determined by selecting from the above.
- the focus position determination device 1 may be equipped with a photodiode instead of a CCD camera.
- steps 4 and 5 each time the objective lens 30 is moved by a certain amount, the output current of the photodiode is amplified and converted into a voltage signal, and the focal position of the objective lens 30 is measured. Compare the intensity of multiple voltage signals converted while moving 30 to select the maximum voltage signal intensity, and move the objective lens 30 to the focal position of the objective lens 30 corresponding to the selected voltage signal intensity
- the focal position of the objective lens 30 corresponding to “Zc” or “Za” in FIG. 14 may be determined by selecting from among the focal positions of the plurality of objective lenses 30 that have been measured.
- the amount (movement amount) by which the objective lens 30 and the sample 10 are moved is within a range in which the image captured by the CCD camera is not blurred. Specifically, the amount of movement is not more than a value obtained by dividing the wavelength of light emitted from the light source 20 by the square of NA of the objective lens 30 ( ⁇ + NA 2 : ⁇ is the wavelength, and ⁇ is the numerical aperture). desirable.
- a light source such as a laser having high monochromaticity may be used as the light source 20.
- the monochromaticity of the light source is high, there is almost no chromatic dispersion when illuminating light is applied to the phase object, so that sharp diffracted light can be obtained. Therefore, the contrast of the captured image on the near point side and the captured image on the far point side is white light. This is much higher than when using the source. Thereby, it is possible to easily select the focal position of the objective lens when the captured image having the maximum contrast is captured.
- the observer increases the contrast of the image of the living cell through the eyepiece 43 while manually turning the knob of the objective lens z-axis moving mechanism.
- the positions of the two objective lenses are visually determined, the focal position measurement unit 50 measures the focal position of the objective lens at the time of the determination, and the central position of the two focal positions measured by the focal position determination unit 70a3.
- the position may be determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target site 10a in the living cell.
- the objective lens 30 is moved back and forth by a minute amount with respect to the sample 10 from the focus position of the normal observation.
- An image having the same contrast as that of the phase difference observation method can be obtained without using a lens.
- the focal position determining apparatus since it is not necessary to consider the pupil aberration between the objective lens 30 and the condenser lens 23, a low-magnification objective lens can be used.
- a phase object such as a cultured cell can be observed even using an objective lens having a magnification of 1 or 2 that cannot be used in the phase difference observation method. A wide range of observations not possible with conventional observation methods are possible.
- the focal position determining apparatus 1 it is possible to obtain a high contrast image with a relief feeling in which the phase distribution is shaded by the oblique illumination.
- the switching mirror 44 can be used to switch between visual observation and TV monitor observation. Further, by using a half mirror as the switching mirror 44, visual observation and TV monitor observation can be performed simultaneously.
- the sample can be observed as a normal microscope by removing the opening.
- the focal position of the objective lens 30 is determined in two stages, so that the focal position can be determined even when a high-magnification objective lens is used.
- the focal position determining apparatus 1 since excitation light is not used, even if the focal position determining process is repeatedly performed on a biological sample that emits fluorescence, there is almost no influence of phototoxicity. There are advantages. In other words, when observing live cells continuously and over time, it is possible to continue to capture a clear captured image by repeatedly performing the focal position determination process. The In addition, according to the focal position determination apparatus 1, when performing the focal position determination process using infrared light, the focal position of the objective lens is adjusted while maintaining the state where illumination with visible light is not performed. Therefore, it is possible to effectively prevent noise from occurring in the captured image due to self-emission.
- the focal position determination device 1 determines the observation target in the sample 10 determined when the sample 10 is installed.
- the focus position of the objective lens that matches the part 10a may be determined again (focus position re-determination process).
- the focal position determined by the above-described focal position determination process is a force that is approximately aligned with the center of the sample 10.
- the observation target part 10a in the sample 10 is more accurately obtained. It is necessary to determine the focal position of the objective lens 30 that meets the requirements. Therefore, by executing the focus position re-determination process, the focus of the objective lens that matches the observation target part 10a in the sample 10 can be obtained even after starting the emission observation of the sample 10 just after the sample 10 is installed.
- the position can be continuously determined, and as a result, the focal position of the objective lens can always be adjusted to the observation target part 10a.
- FIG. 19 is a flowchart illustrating an example of a focus position redetermination process performed by the focus position determination device 1 according to the first embodiment.
- the focus position determination device 1 operates the CCD camera by the control unit 70a, and the focus position determined by the focus position determination unit 70a3 by the CCD camera (determined in step SA-8 in FIG. 18 described above). Then, the sample 10 is imaged without illumination at the focal position of the objective lens 30 that matches the observation target site 10a in the sample 10 (step SB-1).
- the control unit 70a operates the feature amount calculation unit 70al, and the feature amount calculation unit 70al uses the captured image (light-emitting image) captured in step SB-1.
- a feature amount (for example, emission intensity from each pixel of the emission image, statistics obtained from the emission intensity distribution of the emission image, contrast of the emission image, etc.) is calculated (step SB — 2).
- the control unit 70a operates the objective lens z-axis movement mechanism, and the objective lens z-axis movement mechanism moves the objective lens 30 by a certain amount along the optical axis.
- the focal position determined by the focal position determining unit 70a3 is changed (step SB-3).
- the focal position may be changed by moving the sample stage 17 in addition to the movement of the objective lens 30.
- the focus position determination device 1 operates the CCD camera by the control unit 70a, and images the sample 10 by the CCD power camera without illuminating at the focus position changed in step SB-3 ( Step SB—4).
- the control unit 70a operates the feature amount calculation unit 70al, and the feature amount calculation unit 70al uses the captured image (light-emitting image) captured in step SB-4.
- the feature amount (for example, the light emission intensity from each pixel of the light emission image, the statistics obtained from the light emission intensity distribution of the light emission image, the contrast of the light emission image, etc.) is calculated (step SB_5).
- the control unit 70a operates the feature amount comparison unit 70a4, and the feature amount comparison unit 70a4 calculates the feature amount calculated in step SB-2 and the step SB-5. Compare with the feature value (Step SB-6). It should be noted that in comparing feature quantities, there are cases where it is appropriate to compare by contrast depending on the type and characteristics of sample 10, and it may be more appropriate to compare by statistics obtained from the emission intensity distribution. Finally, compare by S / N (signal 'noise ratio).
- step SB-7 when the comparison result in step SB-6 is greater in the feature amount calculated in step SB-5 (step SB-7: Yes), the focal position determination device 1 determines whether the control unit The focus position determination unit 70a5 is operated by 70a, and the focus position determination unit 70a5 determines the focus position changed in step SB_3 as the focus position of the objective lens that matches the observation target site 10a in the living cell ( Step SB_8).
- step SB-7 when the comparison result in step SB_6 shows that the feature amount calculated in step SB_5 has a greater force (step SB-7: No), the focal position determination device 1 70a confirms whether or not the number of executions of step SB-3 has reached a predetermined number (check whether the amount of movement of the objective lens 30 in step SB-3 has reached a predetermined amount, and has reached the predetermined number In this case (Step SB—9: Yes), the control unit 70a operates the objective lens z-axis moving mechanism, The focal position of the objective lens 30 changed in step SB-3 by the objective lens z-axis moving mechanism was determined by the focal position initially determined by the focal position determination unit 70a3 (determined in step SA-8 in FIG. 18 described above).
- step SB-9 the focal position determination device 1 returns to the processing of step SB-3 by the control unit 70a.
- FIG. 20 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determining device 1 of the second embodiment.
- the focal position determining apparatus 1 shown in FIG. 20 has a configuration based on an inverted microscope, and is used to simultaneously perform luminescence observation and fluorescence observation of a living cell emitting faint light.
- the focal position determination device 1 is configured to focus the object lens 30 so that it matches the observation target region 10a in the sample 10 when the sample 10 such as a living cell or tissue is set when performing fluorescence observation and light emission observation simultaneously. Determine the position. As shown in FIG.
- the focal position determination device 1 is further provided with an excitation optical system including an excitation light irradiation unit (excitation light source) 80, a collimating lens 81, a deflection mirror 82, and a dichroic mirror 83. ing.
- the numerical aperture as the objective lens 30 is obtained. (NA) of about 0.9 is used, and when the sample 10 is immersed in a liquid, an objective lens 40 having a numerical aperture of 1.0 or more is used. Sample 10 is prestained with rhodamine green (RhG), which is a fluorescent dye (fluorescent substance).
- RhG rhodamine green
- the excitation light irradiation unit 80 is a gas laser (eg, argon laser, helium neon laser (He'Ne laser), etc.) that emits laser light having a wavelength in the visible light region.
- sample 10 when the sample 10 is stained with TMR, which is a fluorescent substance, an argon laser with a wavelength of 514.5 nm is used as the excitation light irradiation unit 80 to excite the TMR.
- TMR which is a fluorescent substance
- an argon laser with a wavelength of 514.5 nm is used as the excitation light irradiation unit 80 to excite the TMR.
- 5-Tamra a fluorescent substance
- a He'Ne laser with a wavelength of 543.5 nm is used as the excitation light irradiation unit 80 to excite the 5_Tamra.
- the collimator lens 81 converts the laser light emitted from the excitation light irradiation unit 80 into a circular parallel light beam having a beam width.
- the deflecting mirror 82 deflects the optical axis of the laser light converted into a parallel light beam by the collimating lens 81.
- the dichroic mirror 83 is specifically a switchable dichroic mirror, and makes the laser beam deflected by the deflecting mirror 82 enter the objective lens 30.
- the switchable dichroic mirror has a spectral characteristic that reflects light having the oscillation wavelength of the excitation light source 80 and transmits the fluorescence signal and the emission signal.
- the dichroic mirror 83 is housed in a holder (not shown), and is arranged so as to be replaceable in accordance with the oscillation wavelength of the laser light. If it is not necessary to change the wavelength of the laser light emitted from the excitation light irradiation unit 80, a normal dichroic mirror that is not a switching type may be used as the dichroic mirror 83.
- the fluorescence and luminescence emitted from the sample 10 reach the dichroic mirror 83 through the objective lens 30. Then, the fluorescence and light that have reached the dichroic mirror 83 are transmitted through the dichroic mirror 83, reflected through the relay lens 31 and relay lens 33, and reflected by the switching mirror 44, and on the light receiving surface of the CCD camera 60. Focus on 60a.
- the switching mirror 44 is removed from the optical path, the fluorescence and luminescence emitted from the sample 10 reach the eyepiece lens 43. As a result, the observer can directly observe the image of the sample 10.
- FIG. 21 shows the focus position determination apparatus 1 according to the second embodiment. It is a figure which shows another specific example of a structure.
- the main body (optical system part) of the focal position determining device 1 is fixed to the main body frame 106.
- the main body base 106 is configured to be movable in the vertical direction.
- the main frame 106 is attached to the column 105.
- the column 105 is fixed on the bottom plate 100.
- the observation optical system of the focal position determination device 1 and the CCD camera 60 are housed in a lens barrel.
- the lens barrel includes a lens barrel upper portion 107 and a lens barrel lower portion 108 connected to the lens barrel upper portion 107.
- the upper part 107 of the lens barrel is fixed to the main frame 106.
- the lower part 108 of the lens barrel is fixed on the base frame 104.
- the lens barrel is mounted so as to be movable in the vertical direction.
- the base mount 104 is fixed on the bottom plate 100.
- the main body of the focal position determining device 1 is covered with a light shielding box 101 having a light shielding property.
- the light shielding box 101 is fixed to the bottom plate 100.
- a light shielding lid 102 is attached to the upper surface of the light shielding box 101.
- One end of the light shielding lid 102 is connected by a light shielding box 101 and a hinge 103, and is attached so that it can be opened and closed.
- the sample container 11 containing the sample 10 is arranged on the sample stage 17.
- the sample container 11 may be placed in the water tank 12 and disposed on the sample stage 17.
- the light irradiating unit 20 is a halogen lamp, a metal halide lamp, etc., and the light emitted from the light irradiating unit 20 passes through the optical fiber 26 and the sample 10 on the sample stage 17.
- the sample container 11 containing is irradiated.
- the deflection mirror 32 is not used, and a relay lens 34 that forms an image formed by the objective lens 30 (image of the sample 10) is disposed at the lower part 108 of the lens barrel as shown in the figure.
- the focal position determining apparatus 1 shown in FIG. 21 moves, as the focal position changing unit 40, the sample stage 17 that is not moved by the objective lens z-axis moving mechanism along the z-axis.
- Stage to be provided A z-axis moving mechanism may be provided.
- a Z-axis moving stage equipped with a stage z-axis moving mechanism is installed on the main frame 106.
- the Z-axis moving stage is attached below the XY sample stage that can move in the XY direction so as to support the XY sample stage.
- a sample container 11 is arranged above the Z-axis moving stage. The sample container 11 moves up and down as the z-axis moving stage moves up and down.
- the z-axis moving stage moves up and down by a rack and pinion mechanism.
- the rack and pinion mechanism is operated by rotating a knob (not shown) of the rack and pinion mechanism by a stepping motor.
- the stepping motor drive is controlled by the computer.
- the same operation as when the objective lens 30 is moved up and down can be performed.
- the vertical movement of the Z-axis moving stage may be performed manually.
- the rack and pinion mechanism may be operated by rotating a knob (not shown) of the rack and pinion mechanism.
- the CCD camera 60 is arranged so that the center of its light receiving surface substantially matches the optical axis. Fluorescence and luminescence emitted from the sample (biological cell) 10 are transmitted through the dichroic mirror 83 and are condensed on the light receiving surface of the CCD camera 60 through the relay lens 34. Here, when taking out infrared light, the infrared cut filter 45 attached to the front surface of the CCD camera 60 is removed before starting the focal position determining apparatus 1.
- the CCD camera 60 is connected to an information processing device 70 that processes an output signal from the CCD camera 60 via a cable.
- the information processing device 70 renders and analyzes the output signal power emission image of the CCD camera, analyzes it, measures the temporal change of the light emission intensity, and analyzes the output signal.
- the information processing device 70 operates the CCD camera with the control unit 70a to receive fluorescence and light emission from the sample 10 after the focal position of the objective lens 30 is aligned with the observation target part 10a in the sample 10.
- the excitation light irradiation unit 80 is an argon laser having a wavelength of 488 nm and an output of 10 mW, and is disposed outside the light shielding box 101 as shown. Incidentally, Ru les, the optical fiber one passing to the laser incident opening 8 4 is provided on the light shielding box 101.
- the laser light emitted from the excitation light irradiation unit 80 passes through the collimator lens 81 and propagates through the optical fiber, and the propagated laser light reaches the dichroic mirror 83.
- the laser beam that reaches the dichroic mirror 83 is reflected by the dichroic mirror 83 and enters the objective lens 30 from below, and the incident laser beam is condensed and applied to the sample 10.
- the dichroic mirror 83 is housed in a holder 85, and is arranged so as to be replaceable in accordance with the oscillation wavelength of the laser beam. As described above, in the focal position determining apparatus 1 shown in FIG. 21, the fluorescence and luminescence emitted from the sample 10 pass through the objective lens 30 and reach the dichroic mirror 83. Then, the fluorescence and light emission that have reached the dichroic aperture mirror 83 pass through the dichroic mirror 83, pass through the relay lens 34, and are focused on the image sensor 60a on the light receiving surface of the CCD camera.
- the focus position determination process and the focus position redetermination process performed by the focus position determination apparatus 1 of the second embodiment are the same as those described in the first embodiment, and thus the description thereof is omitted. .
- the focal position determination device 1 of the second embodiment further includes an excitation optical system.
- the focal position determining apparatus 1 according to the second embodiment irradiates the living cells with the irradiation light by the light source 20. Then, the focal position determination device 1 uses the focal position measurement unit 50 to move the objective lens 30 repeatedly while moving the objective lens 30 along the optical axis repeatedly by a certain amount by the objective lens z-axis movement mechanism.
- the living body cell is imaged under illumination with a CCD camera, and the contrast of the captured image is calculated by the feature amount calculation unit 70al.
- the focal position determination device 1 selects two maximum contrasts among a plurality of contrasts accumulated by repeatedly moving the objective lens 30 by the focal position selection unit 70a2, and corresponds to the selected contrast.
- the focal position of the objective lens 30 when the captured image is captured is acquired from a plurality of focal positions accumulated by repeatedly moving the objective lens 30.
- the focal position determining apparatus 1 uses the focal position determining unit 70a3 to convert the central position (substantially central position) of the two focal positions to the observation target site 10a in the living cell based on the acquired focal position.
- the focal position of the objective lens 30 is determined to be suitable, and the objective lens 30 is moved by the objective lens z-axis moving mechanism so that the focal position of the objective lens 30 is adjusted to the determined focal position.
- the focal position of the objective lens 30 can be determined, and as a result, the focal position of the objective lens 30 can be adjusted to the observation target site 10a.
- a luminescent image and fluorescence of a living cell Some methods for measuring the amount of ATP in living cells while simultaneously observing images are described below. Since the luminescence reaction of luciferase (the intensity of luminescence) depends on the amount of ATP, quantification of ATP using the luminescence reaction of luciferase has been performed for some time. In the fields of biotechnology, clinical examination, food hygiene, etc., the amount of ATP in cells is measured using luciferase. ATP (adenosine triphosphate) is a source of energy in the cell and is deeply involved in life phenomena. Firefly luciferase, on the other hand, in the presence of ATP, O, Mg 2+
- Measurement of the amount of ATP in living cells is usually performed by the following steps (1A) to (: 1C) (H. J. Kennedy, AE Pouli, EK Ainscow, LS Jouaville, R. Rizzut o , GA Rutter, "Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet ⁇ -cells., Journal of Biological Chemistry, vol. 274, pp. 13281-13291, 1999).
- IC Intracellular ATP is quantified by measuring the amount of luminescence generated from the reaction solution to which the extract is added.
- the measurement of the amount of ATP in cells is usually performed in the following steps (2A) to (2C).
- (2C) Detect the amount of luminescence generated from the culture medium added with luciferin and quantify intracellular ATP.
- the time-lapse measurement of the amount of ATP at a predetermined site (specifically, mitochondria) in a living cell is performed by the following steps (3A) and (3B) (HJ Kennedy, AE Pouli, EK Ainscow, LS Jouaville, R. Rizzuto, GA Rutter, Glucose generates sub—plasma membrane ATP microdomains in single islet ⁇ —cells., Journal of Biological Chemistry, vol. 274, pp. 13281-13291, 1999).
- a mitochondrial translocation signal gene is fused to a luciferase gene, and the fused gene is introduced into a cell.
- the fusion gene to be introduced into the cell is a fusion gene in which a fluorescence-related gene that expresses a fluorescent protein is further fused in addition to a transition base sequence and a luminescence-related gene.
- the time variation of ATP in the mitochondria in the cell is measured by measuring the amount of light emitted from the cell over time. Specifically, a fluorescent image of a cell into which the fusion gene has been introduced is taken, and it is determined whether or not the photoprotein is localized at a predetermined site based on the obtained fluorescent image. If it is concluded that the determination result is localized, the amount of light emitted from the cell is detected. Thereby, it can be determined whether or not the luminescent protein is localized at a predetermined site of the cell. That is, the localization of the luminescent protein is confirmed in living cells into which the fusion gene has been introduced, and the amount of luminescence from the cells is measured. Further, it can be confirmed that the measured light emission amount is from a predetermined site.
- fluorescent images and luminescent images of the cells are taken, and based on the fluorescent images, photoproteins are present at predetermined sites. Determine whether each cell is localized, superimpose the captured fluorescence image and the captured emission image, select the cell to be measured from the cells determined to be localized, and Measure the amount of light emitted from the selected cells. Thereby, individual cells can be identified from a plurality of cells, and the amount of luminescence from a predetermined portion in a single cell can be measured separately from the others.
- the localization of the luminescent protein in the measurement target cell and the luminescence intensity emitted from the cell can be obtained simultaneously. Therefore, it is possible to perform an analysis that excludes the effects of differences in the physiological state of individual cells due to the efficiency of gene transfer and the cell cycle.
- a fluorescent image After taking a fluorescent image, it is determined whether or not the photoprotein is localized at a predetermined site. If it is determined that the photoprotein is localized, a luminescent image may be taken. Les.
- a biological sample emitting faint light accommodated in a housing portion of a substrate having a plurality of housing portions is imaged through an objective lens.
- the present invention moves the substrate and / or the objective lens until the desired accommodating portion is within the field of view of the objective lens, and determines the focal position on the near side of the objective lens and / or the focal position on the far side of the objective lens. Based on the measured focal position, the focal position of the objective lens that matches the observation target part in the biological sample accommodated in the desired accommodating portion is determined, and the focal position of the object lens is determined to the determined focal position.
- the position of the substrate and / or the objective lens at the destination is measured.
- the destination position information relating to the measured position at the destination may be stored in association with the storage unit identification information for identifying the desired storage unit.
- the present invention provides (1) moving the substrate and / or the objective lens until the desired accommodating portion is within the field of view of the objective lens, (2) irradiating the biological sample with light, and (3) the objective. Change the focal position of the lens, (4) measure the changed focal position, (5) image the biological sample irradiated with light at the changed focal position, and (6) based on the captured image Then, calculate the feature value that characterizes the captured image, and (7) repeat the above-mentioned "Change focal position", “Measure focal position", "Imaging sample”, and "Calculate feature quantity".
- At least one focus position is selected from the multiple focus positions based on the plurality of feature amounts accumulated repeatedly, and (9) based on the selected focus position, it is stored in a desired container.
- a luminescence image of the biological sample is acquired.
- the substrate and / or the objective lens are moved by the processing of (1) until the desired accommodation portion is within the field of view of the objective lens, and the substrate and / or the object is moved.
- the position of the lens at the movement destination may be measured, and the movement destination position information relating to the measured position at the movement destination may be stored in association with the storage unit identification information for identifying the desired storage unit.
- FIG. 33 and FIG. 34 are diagrams each showing a specific example of the configuration of the focal position determining device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- the focal position determining apparatus 1 of the third embodiment shown in FIGS. 33 and 34 is the same as the focal position determining apparatus 1 of the first embodiment shown in FIGS. 13 and 17, respectively, in the sample container 11, the water tank 12, and the sample stage 17. Stepping 'Mounted at a predetermined position of the motor configuration.
- FIG. 35 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- the focal position determining apparatus 1 of the third embodiment shown in FIG. 35 is the same as the focal position determining apparatus 1 of the second embodiment shown in FIG.
- the configuration of the stepping motor attached to the predetermined positions of the vessel 11, the water tank 12, and the sample stage 17 is changed.
- the sample container 11 is specifically a microplate having a plurality of wells.
- the bottom surface of the microplate (at least the bottom surface corresponding to the tool) is flat and optically transparent (so that it can be handled by a normal objective lens).
- the water tank 12 is configured so as to surround the sample container 11 without providing its bottom surface as shown.
- the number of stepping motors (not shown) is three, and each stepping motor is attached to a predetermined position of the sample stage 17 in a direction orthogonal to each other (90 ° direction).
- the sample stage 17 moves in the direction of the optical axis (z-axis) or the direction perpendicular to it (for example, the X direction or the y direction) from the position where the stage is placed due to the driving force of these stepping motors. Is possible.
- FIG. 36 is a diagram showing a specific example of the configuration of the focal position determining device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- the focal position determining apparatus 1 of the third embodiment shown in FIG. 36 is obtained by changing the sample container 11 and the sample stage 17 in the focal position determining apparatus 1 of the second embodiment shown in FIG.
- the sample container 11 is specifically a microphone port plate having a plurality of tools.
- the bottom surface of the microplate (at least the bottom surface corresponding to the well) is flat and optically transparent (so that it can be handled with a normal objective lens).
- the sample stage 17 includes a stage XYZ axis moving mechanism for moving the stage along the optical axis (Z axis) or moving it in a direction (XY direction) perpendicular thereto.
- FIG. 37 is a diagram showing a specific example of the configuration of the screening system according to the third embodiment.
- the detection system shown in FIG. 37 has a high throughput configuration suitable for comprehensive analysis of specimens in a plurality of containers (in particular, a large number of microplate wells).
- An illumination system for performing bright field observation is disposed above the microplate chamber 11 ID.
- an imaging system for imaging the visual field is provided below the microplate chamber 111D.
- the sample or biological tissue containing the cells contained in the well has a low density so that individual cells can be recognized and do not overlap in the optical path. This is different from the measurement based on the number of cells with high density superimposed, such as a system that analyzes the amount of light emitted from the entire well, such as a noremeter.
- the microplate chamber 111D and the lens element of the illumination system are stored in a heat insulating box 115D for maintaining a biological sample such as a cell or an antigen 'antibody at a temperature capable of maintaining the activity.
- a biological sample such as a cell or an antigen 'antibody at a temperature capable of maintaining the activity.
- the various lens elements of the observation system and the imaging system described above are disposed outside the heat insulating box 115D, and are further protected by a heat insulating member (for example, an aluminum film or a ceramic cylinder) having a light shielding property.
- the electric stage 112D can be moved in the optical axis direction (Z-axis) or the direction orthogonal to it (XY direction) by appropriately driving three motors under the control of the controller 132D.
- the objective lens 121D is provided with an objective lens Z-axis drive mechanism that moves the objective lens in the optical axis (Z-axis) direction.
- the light generated by the sample force in the microplate chamber 111D passes through the objective lens 121D set to an appropriate optical condition, is reflected by the lowermost imaging mirror, and further passes through the imaging lens.
- the image is sent to the imaging device 114D.
- a highly reflective mirror ideal for observation can be used for the eyepiece 113D.
- the drive of the movable mirror may be an automatic switching type or a manual operation type using a slide bar.
- the insulation box 115D is further stored in the enclosure 116D for shielding the influence from the external environment (light, air temperature, humidity, oxygen, etc.), so that the entire inspection system has a double structure. It has become.
- the hot air introduction device is installed at a position that appropriately considers the internal air conditioning efficiency.
- 117D (the upper left wall side of the dark box in Fig. 37)
- the hot air discharge device 118D (the upper right wall side of the dark box in Fig. 37) are installed.
- the heat insulation box 115D and the dark box 116D are provided with an inner door and an outer door, respectively, so that the microplate installed on the electric stage 112D can be replaced.
- the light source for the illumination system (halogen lamp in Fig. 37) 120D and the imaging device for the imaging system (in Fig. 37) C—CCD camera) 114D.
- An imaging lens for the imaging device 114D and a rotary filter wheel for wavelength selection are arranged between the heat insulating box 115D and the basket box 116D.
- a laser detection mechanism that performs designated point focusing with infrared light or visible light may be installed in order to strictly focus observation and imaging in the microplate.
- a light splitting mirror is disposed below the electric stage 112D.
- Such a designated point focus is not an essential configuration unless a fine image resolution is required.
- the light splitting mirror it is necessary to minimize the optical loss from the sample by using a dichroic mirror by using infrared rays. Similarly, it is preferable to prevent light loss by using a half mirror or a movable mirror as described above.
- the image data sent from the imaging device 114D is subjected to statistical analysis or shape analysis by the arithmetic processing unit 130D, and is displayed on the display unit 131D.
- various analyzes such as time-series analysis for each well or comparison between wells.
- Numerical data can be graphically displayed on the display unit 131D as a time series curve.
- the present inspection system stores the image data in the image data storage unit 133D connected to the controller 132D, and reproduces the image data stored in the image data storage unit 133D to the display unit 131D as necessary. It is possible to do this.
- the present inspection system by specifying the data part (measurement point or data area) of the data of interest in the graphical display data with an appropriate designation means (mouse pointer, touch pen, keyboard, etc.), Recall function to play back the time-series data of that part as a still image or moving image It is also possible to demonstrate. According to this inspection system, it is possible to display only image data or display a combination of image data and numerical data on the display unit 131D. In this case, according to the present inspection system, in addition, by designating a part or region of an image of interest among the displayed images with an appropriate designation means, a corresponding numerical value or graph can be called up, It is also possible to emphasize specific numerical values and graph parts by color so that they can be easily confirmed.
- the present inspection system when different specimens (for example, organs, disease states, patients, and measurement items) are accommodated in many containers, the desired order or correlation is displayed for each specimen. It is also possible to analyze as expressed in part 131D. These various analysis and display formats can be realized by designing them to be executable by interchangeable software or internal programs.
- the control and control of various electrical controls and signal processing are performed by the controller 132D in an integrated manner.
- the controller 132D is capable of data distribution in a distributed manner or by centralized management of a host computer by using a remote system capable of communicating the above-described many inspection apparatuses and inspection systems through communication lines (wireless or wired). Medical cooperation such as sharing and diagnosis may be performed in real time.
- various useful medical databases and controller 132D via communication, etc., it is possible to analyze the relationship with biological systems while obtaining the latest data in real time. It is a word.
- Fig. 39 is a modification of the above-described inspection system, and shows an example of imaging with an objective lens.
- a glass or plastic microplate 203E having a flat bottom surface is fixed on the electrically controlled XYZ stage 201E.
- a plate force bar 202E for covering each well 207E and the upper part of the microplate and fixing the microplate on the XYZ stage 201E is disposed above the microplate 203E.
- Piping (not shown) is formed on the plate cover 202E, and the plate cover 202E is connected to a gas supply unit 210E for supplying and discharging gas (for example, carbon dioxide gas and hot air) to each tool through a flexible tube 209aE. is doing.
- the entire housing 206E includes an openable upper housing 206aE for plate exchange, reagent dispensing, ventilation, etc., and a lower housing 206bE as a base for fixing each means. .
- the temperature inside the housing 206E is raised to be convenient for biological activity by sending warm air from the hot air generator 208E through the tube 209bE into the housing.
- the temperature of the microplate 203E and the XYZ stage 201E is preferably controlled by the temperature sensor 211E so as to be a desired temperature through a controller as shown in FIG.
- the objective lens 204E with low magnification covers all individual cells. It is preferable to obtain a visually recognizable visual field, which is suitable for freely transferring the microplate 203E. If the grounding error or lot difference of the microplate 203E should be taken into consideration for any magnification objective lens 204E, the distance from the bottom surface of the microplate 203E is adjusted by the Z-axis drive mechanism 205E as shown in the figure. It is preferable to make adjustments so as to maintain an appropriate distance.
- FIG. 40 is a flowchart showing an example of biological sample imaging 'analysis processing performed by the focal position determination device 1 as the biological sample imaging device according to the third embodiment.
- a description will be given of processing in the case where clear vision observation and luminescence observation of a living cell are performed using the focal position determining apparatus 1 shown in FIG.
- the focus position determination device 1 performs the following processing.
- the focal position determination device 1 uses the control unit 70a of the information processing device 70 to determine the time interval (timelabus interval) when performing timelabus observation of living cells and the number of times the timelabus observation is performed (timelabus count). , Let the observer specify (step SC_1). Next, the focal position determination device 1 uses the control unit 70a of the information processing device 70 to determine the number of wells (observation wells) to be observed among the wells of the microplate and the observation order of each observation well. And let the observer specify the position on the microplate (step SC-2).
- the focal position determination device 1 causes the control unit 70a of the information processing device 70 to appropriately operate each stepping motor attached to a predetermined position of the sample stage 17, and Depending on the operation, it is based on the position specified in step SC-2 (specifically, the position of the observation object in the early observation order on the microplate).
- Step SC—3) when the microplate has been moved, the position of the tool at the destination of the microplate is measured, and the destination position information relating to the position of the well at the destination of the measurement is obtained. May be stored in association with the storage unit identification information for identifying. As a result, when re-positioning the same well as the one that has been previously positioned, the same well is quickly and appropriately positioned based on the stored destination position information and storage unit identification information. be able to.
- the focal position determination device 1 starts irradiating the living cells with illumination light emitted from the light source 20 in order to start bright field observation (step SC-4).
- the focus position determination device 1 stores the focus position for bright field observation corresponding to the observation target well positioned in step SC-3, and in this case (step SC-5: No ),
- the control unit 70a of the information processing apparatus 70 operates each processing unit as appropriate, and executes the focal position determination process shown in FIG. 41, so that bright field observation corresponding to the positioned observation target well is performed.
- Determine and store the focus position step SC_6). If the focus position for bright field observation corresponding to the observation target well positioned in step SC-3 is memorized (step SC-5: Yes), proceed to step SC-7.
- FIG. 5 is a flowchart showing an example of a focal position determination process performed by a focal position determination apparatus 1 as a powerful biological sample imaging apparatus.
- processing in the case where the focus position determination device 1 shown in FIG. 33 is used will be described.
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the objective lens z-axis moving mechanism, and the objective lens z-axis moving mechanism moves the objective lens 30 along the optical axis from the initial position.
- the focal position of the objective lens 30 is changed by moving it by a certain amount (step SD_1).
- the focal position determination device 1 operates the focal position measurement unit 50 by the control unit 70a of the information processing device 70, and detects and stores the focal position of the objective lens 30 by the focal position measurement unit 50. (Step SD-2).
- the focal position determination device 1 operates the CCD camera by the control unit 70a of the information processing device 70, and when the CCD camera is irradiated with light, displays a bright-field image of a living cell. If no light is irradiated, a luminescent image of the living cell is captured and stored (step SD-3).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the feature amount calculation unit 70al, and the feature amount calculation unit 70al uses the captured image (brightness) captured in step SD-3.
- the contrast of the captured image is calculated based on the field-of-view image or the luminescent image (step SD-4).
- the focal position determination device 1 uses the control unit 70a of the information processing device 70 to mutually compare the focal position detected in step SD-2, the captured image captured in step SD-3, and the contrast calculated in step SD-4. And stored in the captured image database 70b1 of the storage unit 70b.
- the focus position determination device 1 uses the control unit 70a of the information processing device 70 to change the focus position of the objective lens 30 changed from step SD_1 to step SD-4 to step SD_1 on the optical axis. This is repeated until the predetermined position is exceeded (step SD_5).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the focal position selection unit 70a2, and the focal position selection unit 70a2 performs a plurality of contrasts stored in the captured image database 70bl. 2 of the maximum contrasts are selected and stored in the captured image database 70bl associated with each selected contrast 2
- Two focal positions are acquired, and the focal position determination unit 70a3 is operated by the control unit 70a of the information processing device 70, and the two focal positions are acquired based on the two acquired focal positions by the focal position determination unit 70a3.
- the center position (substantially the center position) is determined as the focal position of the objective lens 30 so as to match the observation target site 10a in the living cell (step SD-6).
- the focal position determination device 1 uses the focal position selection unit 70a2 to generate a reference based on a plurality of feature amounts stored in the captured image database 70bl from a plurality of focal positions stored in the captured image database 70bl. Then, the focal position on the near point side (substantially focal position) of the objective lens 30 and the focal position on the far point side (substantially focal position) of the objective lens 30 are selected, and the selected near point is selected by the focal position determination unit 70a3. Based on the focal position on the side and the focal position on the far point side, the focal point of the objective lens 30 is set so that the central position (substantially central position) of these two focal positions matches the observation target position 10a in the living cell. Determine as position.
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the objective lens z-axis moving mechanism, and the focal position of the objective lens 30 is adjusted by the objective lens z-axis moving mechanism.
- the objective lens is moved along the optical axis until it matches the focus position for bright field observation (or the stored focus position for clear field observation) determined in step SC-6, and the information processing device 70 operates the CCD camera by the control unit 70a of the CCD camera, the focal position is moved to the imaging stores bright field image of the biological cell (step SC- 7) 0
- the focal position determining apparatus 1 ends the irradiation of the illumination light emitted from the light source 20 to the living cells in order to end the bright field observation (step SC-8).
- the focus position determination device 1 stores the focus position for light emission observation corresponding to the observation target well positioned in step SC_3, and in the case (step SC_9: No).
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates each processing unit as appropriate, and executes the focus position determination process shown in FIG. 41 described above, thereby performing the emission observation corresponding to the positioned observation object well.
- the focal position is determined and stored (step SC_10).
- step SC_9: Yes the process proceeds to step SC_11.
- the control unit 70a of the information processing device 70 operates the objective lens z-axis moving mechanism, and the objective lens 30 moves the focal position force S step SC —
- the objective lens is moved along the optical axis until it matches the focus position for light emission observation (or the stored focus position for light emission observation) determined in 10, and the control unit 70a of the information processing device 70 performs CCD measurement.
- the camera is operated, and the CCD camera is used to capture and store a luminescent image as a weak light image related to the living cells, at the moved focal position (step SC-11).
- the focal position determination device 1 finishes the bright field observation and the light emission observation for the number of analysis target wells specified in step SC_2.
- the control unit 70a appropriately operates each processing unit, and processes up to step SC_3 force SC_11 for the remaining analysis target tools for which bright field observation and light emission observation are not completed. Repeatedly.
- the focus position determination device 1 performs the information processing when the bright field observation and the light emission observation are completed for the number of analysis target wells specified in Step SC-2 (Step SC-12: Yes).
- the controller 70a of the device 70 confirms and confirms the number of timelabs observations that have been performed. If the number of timelabs specified in step SC-1 has been completed (step SC-13: Yes), step SC— Proceed to 15.
- step SC-13 the focal position determination device 1 determines the control unit of the information processing device 70. If the timelabs interval specified in Step SC-1 has elapsed (Step SC-14: Yes) as a result of checking and confirming the elapsed time from the start of Timelabus observation using 70a, the remaining timelabs observation is performed. Return to Step SC—3 to begin.
- the focus position determination device 1 performs image analysis on the luminescence image acquired so far in Step SC_11 by the control unit 70a of the information processing device 70, and displays and records it (Step SC— 15).
- This image analysis of the luminescent image is performed together with the bright field image acquired in step SC-7 so far (specifically, the image analysis is performed on the superimposed image of the luminescent image and the bright field image). This makes it possible to perform quicker and more accurate analysis.
- This is the end of the description of the biological sample imaging 'analysis process.
- the objective lens is focused on a plurality of HeLa cells into which the plasmid vector has been introduced by the focal position determination apparatus 1 of the second embodiment, and HeLa cells that are the target of force of the plurality of HeLa cells are selected.
- the amount of light emitted from mitochondria and the amount of ATP in selected HeLa cells were measured over time.
- FIG. 23 shows an illumination image and a fluorescence image of HeLa cells into which a plasmid vector has been introduced.
- FIG. 24 is a diagram showing an illumination image and a luminescence image of HeLa cells into which a plasmid vector has been introduced.
- the number 1 HeLa cell It was confirmed that the fusion gene was introduced by the plasmid vector and the luciferase was localized in the mitochondria. In addition, in the HeLa cells of No. 2 and No. 4, it was confirmed that the fusion gene was not introduced by the plasmid vector. Furthermore, in the HeLa cell of No. 3, it was confirmed that the luciferase was not localized in the mitochondria although the fusion gene was introduced by the plasmid vector. In other words, since the fusion gene was introduced by the plasmid vector and the luciferase was confirmed to be localized in mitochondria, the HeLa cell was the number 1 HeLa cell only. Selected for HeLa cells.
- FIG. 25 is a graph showing the change over time in the luminescence intensity from the selected HeLa cell of No. 1.
- the focal position determination method determines the focal position of the objective lens that matches the observation target site in the sample.
- a focal point position determination method that measures a focal point position on the near point side of an objective lens and / or a focal point position on a far point side of an objective lens, and determines the focal point position based on the measured focal point position. It is characterized in that the focal position of the objective lens to be fitted is determined.
- the focal position determining method is a focal position determining method for determining a focal position of an objective lens that matches an observation target site in a sample.
- the light irradiation step for irradiating light, the focal position changing step for changing the focal position of the objective lens, the focal position measuring step for measuring the focal position changed in the focal position changing step, and the focal position changing step are changed.
- Step focus position changing step, focus position measuring step, sample An execution step that repeatedly executes the imaging step and the feature amount calculation step, and at least one of the plurality of focus positions accumulated by executing the execution step, based on the plurality of feature amounts accumulated by execution.
- a focus position selection step for selecting a focus position, and a focus position determination step for determining a focus position of the objective lens that matches the observation target position based on the focus position selected in the focus position selection step. It is characterized by including.
- the focal position determining method according to supplementary item 3 of the present invention is the focal position determining method according to supplementary item 2, in the focal point position selecting step, the plurality of execution steps stored and executed. Two focal positions are selected from the focal positions based on the plurality of feature values that have been executed and accumulated. In the focal position determination step, the two focal positions selected in the focal position selection step are selected. Thus, the center position of the two focal positions is determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target region.
- the focal position determining method according to supplementary note 4 according to the present invention is the focal position determining method according to supplementary claim 3, wherein the two focal positions are a focal position on the near point side of the objective lens and It is a focal position on the far point side of the objective lens.
- the focus position determination method is the focus position determination method according to supplementary item 2, in the focus position selection step, the execution step is executed and the execution step is stored. From the focal position, one focal position is selected based on the plurality of feature values accumulated through execution, and in the focal position determination step, the one focal position selected in the focal position selection step and the focus position are selected in advance. Based on the determined distance, a position away from the focal position by the distance is determined as a focal position of the objective lens that matches the observation target region.
- the focus position determination method according to Supplementary Note 6 is the focus position determination method according to Supplementary Note 5, wherein the one focus position is a focus position on a near point side of the objective lens or It is a focal position on the far point side of the objective lens.
- the focal position determination method according to supplementary item 7 of the present invention is the same as the focal position determination method according to any one of supplementary items 2 to 6, and the focal position determination method according to one.
- the post-decision focus position change step for changing the focus position determined in step 1, the post-determination sample imaging step for imaging the sample at the focal position changed in the post-determination focus position change step, and the post-determination sample imaging step.
- the focal position determining method according to supplementary item 8 of the present invention is different from the focal position determining method according to any one of supplementary items 2 to 7, wherein the sample is a living cell. Or it is an organization.
- the present invention relates to a focal position determining apparatus, and the focal position determining apparatus according to appendix 9 according to the present invention determines a focal position of an objective lens suitable for an observation target site in a sample.
- a focal position determination device for irradiating a sample with light, a focal position changing means for changing the focal position of the object lens, a focal position measuring means for measuring the focal position of the objective lens, Sample imaging means for imaging a sample, feature quantity calculating means for calculating a feature quantity characterizing a captured image based on a captured image taken by the sample imaging means, the focal position changing means, the focal position measuring means,
- a control means for controlling each means so that the sample imaging means and the feature quantity calculating means are repeatedly executed, and accumulated by repeatedly executing each means by the control means.
- the focal position determining device is the focal position determining device according to supplementary item 9, wherein the focal position selecting unit is configured to use the plurality of accumulated focal point positions. The two focal positions are selected based on the plurality of accumulated feature amounts, and the focal position determining means is configured to select the two focal positions based on the two focal positions selected by the focal position selecting means. Is determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target region.
- the focal position determining device is the focal position determining device according to supplementary item 10, wherein the two focal positions are focal point positions on a near point side of the objective lens. And the focal position on the far point side of the objective lens.
- the focal position determining device is the focal position determining device according to supplementary item 9, in which the focal position selecting unit is configured to extract the plurality of accumulated focal point positions. One focus position is selected based on the plurality of accumulated feature amounts, and the focus position determination means is configured to select the focus position based on the one focus position selected by the focus position selection means and a predetermined distance. A position away from the position by the distance is determined as a focal position of the objective lens that matches the observation target part.
- the focal position determining device is the focal point position determining device according to supplementary item 12, wherein the one focal position is a focal point on the near point side of the objective lens. It is a position or a focal position on the far point side of the objective lens.
- the focal position determining device is the focal position determining device according to any one of supplementary items 9 to 13, wherein the feature amount calculating means individually A feature amount comparison unit that compares the two calculated feature amounts, and a focus position re-determination unit that re-determines the focus position of the objective lens that matches the observation target part based on the comparison result of the feature amount comparison unit.
- the sample imaging means images the sample at the focal position determined by the focal position determination means, the feature quantity calculation means calculates the feature quantity based on the captured image, and the focal position determination means
- the focal position determined in step 1 is changed by the focal position changing unit, the sample is imaged by the sample imaging unit at the changed focal position, and the feature amount is calculated by the feature amount calculating unit based on the captured image. Calculation, before The feature amount corresponding to the determined focal position and the changed focal position
- the focus position re-determination means uses the changed focus position. Is again determined as the focal position of the objective lens so as to match the site to be observed.
- the focus position determination device is the focus position determination device according to any one of supplementary items 9 to 14, wherein the sample is a living cell or tissue. It is characterized by being.
- the focus position determining device which is a force applied to the present invention, is the focus position determining device according to any one of supplementary items 9 to 15, wherein the illumination optical system includes the light irradiation unit. An aperture is arranged at the pupil position of the system.
- the focal position determining device according to supplementary item 17 of the present invention is characterized in that, in the focal position determining device according to supplementary item 16, the opening is arranged eccentrically with respect to the optical axis.
- the focal position determining device is the illumination optical system including the light irradiation unit in the focal position determining device according to any one of supplementary items 9 to 15. It is characterized by arranging a narrow band pass filter.
- the focal position determining device is the focal position determining device according to any one of supplementary items 9 to 18, wherein the light irradiation means is monochromatic visible light. It is characterized by emitting.
- the focal position determining device is the excitation light that irradiates the sample with excitation light in the focal position determining device according to any one of supplementary items 9 to 19. It further has an irradiation means.
- the sample is irradiated with light
- the focus position of the objective lens is changed
- the changed focus (4) Image the sample irradiated with light at the changed focal position
- (6) ( (2) to (5) are repeatedly executed.
- At least one focus position is selected from the plurality of focus positions that have been executed and accumulated based on the plurality of feature values that have been executed and accumulated.
- the focal position of the objective lens that matches the observation target part in the sample is determined, so that when the light emission observation of the observation target part is performed with a specific part in the sample as the observation target part
- the focal point of the objective lens that matches the site to be observed You can determine the location, so that an effect that it is Rukoto focused position of the objective lens to the examination site.
- the objective lens when observing the light emission site in the sample, the objective lens can be focused on the light emission site in the sample without confirming the light emission from the light emission site. There is an effect.
- the focal position determination method and the focal position determination apparatus in the above (7), from the plurality of focal positions that have been executed and accumulated, to the plurality of feature quantities that have been executed and accumulated. Based on the selected two focal positions, the central position (substantially central position) of the two focal positions is selected as the observation target site in the sample. Since it is determined as the focal position of the objective lens that fits, it is possible to easily determine the focal position of the objective lens that matches the observation target position in the sample.
- the two focal positions are the focal position on the near point side (substantially the focal position) of the objective lens and the far point side of the objective lens. Therefore, it is possible to easily and easily determine the focal position of the object lens that matches the observation target site in the sample.
- one focus position is selected from a plurality of focus positions that have been executed and accumulated based on a plurality of feature values that have been executed and accumulated.
- one selected focus is selected. Based on the position and a predetermined distance, the position away from the focal position by the distance is determined as the focal position of the objective lens that matches the observation target part in the sample. If the focus position of a suitable objective lens can be determined more easily, there will be an effect.
- one focal position is a focal position on the near point side (substantially focal position) of the objective lens or a far point side of the objective lens. Therefore, it is possible to more easily and easily determine the focal position of the object lens that matches the observation target site in the sample.
- the sample is imaged at the focal position determined in (8) above, and (10) the captured image is captured.
- (11) change the focal position determined in (8) above, (12) image the sample at the changed focal position, and (13)
- the feature value calculated in (10) is compared with the feature value calculated in (13).
- the feature value calculated in (13) If it is larger, the focus position changed in (11) is determined again as the focus position of the objective lens that matches the observation target site in the sample. Even after starting observation, it is possible to continue to determine the focal position of the objective lens so that it matches the target region in the sample. Brings about an effect that it is possible to adjust the focal position of the objective lens is always on the examination site.
- the biological sample is a biological cell or tissue, it is possible to use a material that emits faint light as the sample.
- the phase difference between the transmitted light and the diffracted light is increased by arranging an opening at the pupil position of the illumination optical system including the light irradiation means (light source).
- the contrast of the captured image can be increased.
- the aperture By arranging the aperture to be eccentric with respect to the optical axis, the phase difference between the transmitted light and the diffracted light can be further increased, and as a result, the contrast of the captured image can be further increased. There is an effect that force S can be done.
- the light emitted from the light source can be made into monochromatic light with an extremely narrow wavelength band bandwidth.
- the effect is that the contrast of the captured image can be increased.
- the light irradiation means (light source) emits monochromatic visible light, when the sample is irradiated with light emitted from the light source, there is almost no wavelength dispersion, and sharp diffracted light can be obtained. As a result, there is an effect that the contrast of the captured image can be increased.
- excitation light irradiation means excitation light source
- Additional Item 1 A When performing image analysis on a biological sample that emits faint light, at least one reference position related to the target portion is set on the target site to be analyzed using electromagnetic energy of a type different from the faint light. Determine the focal position for weak light corresponding to the target position with respect to the reference position, execute imaging with the weak light aiming at the determined focal position, and perform necessary measurement from the weak light image A method for analyzing a weak light image, characterized in that a numerical value of a parameter is extracted and a target part is evaluated based on the extracted numerical value of the parameter.
- Additional Item 2A The method for analyzing a weak light image according to Additional Item 1A, wherein the determination of the reference position includes acquisition of a reference image using the electromagnetic energy.
- Additional Item 3A The method for analyzing a weak light image according to Additional Item 2A, wherein the acquisition of the reference image acquires an image of a sample region including the target region.
- Additional Item 4A The weak light image according to Additional Item 1A or 2A, wherein the electromagnetic energy force S, visible light with little damage to a living body, near-infrared light, ultrasonic wave, magnetic field lines are shifted or shifted. Analysis method.
- Additional Item 5A A biological sample that emits weak light that is difficult to visualize directly is irradiated with easy-to-visualize irradiation light to visualize the reference image that the visualized biological sample provides, and the light from the reference image is used.
- the focal position on the near point side of the receiving objective lens and the Z or The focus position for the weak light by the objective lens is a position corresponding to the distance necessary for imaging the weak light generated by the target site force to be analyzed of the biological sample, with the focal position on the far point side of the objective lens as the reference position.
- a method for analyzing a weak light image characterized in that the presence / absence or light intensity of the weak light in the target region is evaluated from the weak light image.
- Additional Item 6A Weak visualization according to Additional Item 5A, characterized in that direct visualization is defined as difficult to visualize when the exposure time for optical image formation is 10 seconds or longer. Light Image analysis method.
- Additional Item 7A The method for analyzing a weak light image according to Additional Item 5A, wherein the image signal based on the irradiation light is transmitted light or fluorescence.
- Additional Item 8A The method for analyzing a weak light image according to any one of Additional Items 1A to 7A, wherein the determination of the focal position for the weak light is performed for each observation site of the biological sample. .
- Additional Item 9A The method for analyzing a weak light image according to any one of Additional Items 1A to 8A, wherein the reference position and the focal position are determined on the same beam path of the objective lens.
- Additional Item 10A Acquire a plurality of weak light images by executing acquisition of the weak light images at a plurality of times according to examination items, and collate observation target parts in the plurality of accumulated weak light images.
- Additional Item 11A When the focal positions of the reference image and the weak light image are compared and the set distance range is not satisfied, the acquisition of the reference image and the Z or weak light image is executed again. Item 2. The weak light image analysis method according to one of the additional items 2A to 10A.
- Additional Item 12A The evaluation of the weak light image further includes obtaining a measurement parameter from the reference image, and the weak light parameter is evaluated in association with measurement data from the reference image.
- Additional Item 13A The method for analyzing a weak light image according to Additional Item 12A, wherein the weak light image is evaluated in association with contour information of a target region in the reference image.
- Additional Item 14A The weak light image analysis method according to any one of Additional Items 1A to 13A, wherein the evaluation is weak light intensity per area corresponding to the contour of the target portion.
- Additional Item 15A The method for analyzing a weak light image according to any one of Additional Items 1A to 13A, wherein the evaluation determines the position or distribution of the weak light in the outline of the target region.
- Additional Item 16A Any one of Additional Items 1A to 15A, wherein the biological sample is individually stored in a plurality of storage units, and the reference position is executed for each of the storage units. The analysis method of the weak light image as described in one.
- Additional Item 17A The weak light image analysis method according to any one of Additional Items 1A to 16A, wherein the acquisition of the weak light image is performed in a wide-angle visual field including a plurality of storage units.
- Additional Item 18A The method for analyzing a weak light image according to Additional Item 17A, wherein the measurement parameter is acquired from the target site by optically and / or electrically expanding the weak light image.
- Additional Item 19A The method for analyzing a faint light image according to any one of Additional Items 1A to 17A, wherein the biological sample is a living cell or tissue.
- Additional Item 20A The method for analyzing a weak light image according to any one of Additional Items 1A to 19A, wherein the feeble light is luminescence accompanying expression of a bioluminescent protein.
- the method and apparatus for analyzing a weak light image and the biological sample imaging method and biological sample imaging apparatus according to the present invention are particularly suitable for luminescence observation, fluorescence observation, and simultaneous fluorescence / luminescence observation of biological cells. It can be understood that the industrial applicability is high.
- FIG. 26 is a diagram showing an example of the configuration of an apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method of the first embodiment.
- the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method of the first embodiment is for imaging the sample 1A to be imaged with a short exposure time and in real time. It consists of lens 2A, condenser lens 3A, CCD camera 4A and CPU5A.
- the apparatus may further include a zoom lens 6A as shown.
- Sample 1A is a luminescent sample, for example, a luminescent protein (for example, a luminescent protein expressed from an introduced gene (such as a noreluciferase gene)), a luminescent cell, or a luminescent cell. Aggregates, luminescent tissue samples, luminescent organs, luminescent individuals (animals, etc.). Sample 1A may specifically be a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced.
- the objective lens 2A has a square value of (NA ⁇ ) expressed by the numerical aperture (NA) and the projection magnification () of 0.01 or more, preferably 0.039 or more.
- the condenser lens 3A collects light emitted from the sample 1A that has reached through the objective lens 2A.
- the CCD camera 4A is a cooled CCD camera at about 0 ° C, and images the sample 1A through the objective lens 2A and the condensing lens 3A.
- CPU5A outputs the image captured by CCD camera 4A.
- the objective lens 2A and the packaging container (package) of the objective lens 2A represent the square value of (NA / ⁇ ).
- an example of an objective lens in which the square value of (NA / iS) is described will be described with reference to FIG.
- FIG. 27 is a diagram showing an example of the objective lens 2A in which the square value of (NA / i3) is expressed.
- Conventional objectives are labeled with the lens type (eg "Plan Apo"), magnification ZNA oil penetration (eg " ⁇ ⁇ ⁇ .40oil”) and infinity / cover glass thickness (eg " ⁇ / 0.17”) It had been.
- the objective lens (objective lens 2A) includes a lens type (for example, “PlanApo”), a magnification ZNA oil immersion (for example, “100 X / 1.40oil”), an infinite distance Z cover glass thickness (for example, In addition to “ ⁇ .17”), the injection aperture angle (for example, “(NAZ J3) squared: 0.05”) is also written.
- a lens type for example, “PlanApo”
- a magnification ZNA oil immersion for example, “100 X / 1.40oil”
- an infinite distance Z cover glass thickness for example, In addition to “ ⁇ .17”
- the injection aperture angle for example, “(NAZ J3) squared: 0.05”
- the square value of (NA ⁇ ⁇ ) expressed by the numerical aperture (NA) and the projection magnification () is 0.01 or more, preferably 0.039 or more.
- luminescence samples with low luminescence such as photoproteins (eg, photoproteins expressed from introduced genes (eg, luciferase genes)), luminescent cells, or aggregates of luminescent cells
- a luminescent tissue sample or a luminescent individual can take a clear image with a short exposure time and in real time.
- a luminescent cell into which a luciferase gene has been introduced can be used as an imaging target, and a clear image can be taken with a short exposure time and in real time.
- the objective lens 2 ⁇ has a larger numerical aperture and a smaller magnification than the conventional objective lens, a wide range can be imaged with high resolution by using the objective lens 2 ⁇ .
- a moving luminescent sample, a moving luminescent sample, or a luminescent sample distributed over a wide range can be used as an imaging target.
- the objective lens 2 ⁇ has a numerical aperture ( ⁇ ) and a projection magnification (i3) of 2 ( ⁇ ⁇ ) on the objective lens 2 ⁇ and ⁇ or a packaging container (package) that wraps the objective lens 2 ⁇ .
- a power value (for example, 0 ⁇ 01 or more, preferably 0.039 or more) is shown.
- the amount of luminescence is measured after the cells are lysed, so only the expression level at a certain point in time can be captured. End up.
- the ability to capture changes in the expression level of a cell colony over time cannot capture changes in the expression level of individual cells.
- the amount of luminescence from living cells is extremely weak, so it is exposed for a long time with a cooled CCD camera at a liquid nitrogen temperature level or equipped with an image intensifier. I have to do photo counting with a CCD camera. As a result, the light emission detection lens is expensive and requires a large force.
- the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method of the first embodiment when observing the luminescence of individual cells exhibiting the activity of luciferase as a reporter gene product with a microscope, if the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method of the first embodiment is used, an image can be obtained. Quantitative images can be acquired using a cooled CCD camera at about 0 ° C without attaching an intensifier. That is, if the apparatus for performing the luminescent sample imaging method of the first embodiment is used, the luminescence of individual cells can be observed in a living state with a cooled CCD camera at about 0 ° C. No image intensifier is needed for photon counting. In other words, it is possible to image a luminescent sample at low cost.
- the apparatus for performing the luminescent sample imaging method of the first embodiment is used, the luminescence of individual living cells can be observed over time while being cultured, and further observed in real time. You can also. Further, by using the apparatus for performing the luminescent sample imaging method of the first embodiment, it is possible to monitor the response of drugs and stimuli under different conditions for the same cell.
- Equation 1 E is the wavelength of light, and ⁇ is the numerical aperture.
- the diameter d of the observation range is expressed by the following formula 2.
- D is the number of fields and M is the magnification. Note that the number of fields is generally 22 to 26.
- the focal length of microscope objectives was 45 mm as an international standard. Recently, objective lenses with a focal length of 60 mm have begun to be used. If a lens with a large NA, that is, a high spatial resolution is designed on the premise of this focal length, the working distance (WD) is generally about 0.5 mm, and the long WD design is about 8 mm. When such an objective lens is used, the observation range is about 0.5 mm in diameter.
- the observation range may range from 1 to several centimeters. If you want to observe such a range with good resolution, you must maintain NA at a large value, even though the magnification is low. Change In other words, since NA is the ratio of the lens radius to the focal length, an objective lens that can observe a wide range with a large NA needs to be low magnification. As a result, such an object lens has a large diameter. In the production of a large-diameter objective lens, generally high accuracy is required in terms of uniformity of physical properties of optical materials and uniformity of coating, and lens shape.
- the transmittance of the optical system, the numerical aperture of the objective lens, the projection magnification on the chip surface of the CCD camera, the performance of the CCD camera, etc. greatly affect the brightness of the image.
- the brightness of the image is evaluated by the square of the numerical value (NA) divided by the projection magnification (/ 3), that is, the square of (NA / ⁇ ).
- NA numerical value
- the objective lens generally has the relationship of the following formula 3 between the incident aperture angle ⁇ and the exit aperture angle NA ', and NA' 2 is the brightness that reaches the observer's eyes or CCD force sera. Is a value indicating
- Equation 3 ⁇ is the incident aperture angle (numerical aperture), ⁇ is the exit aperture angle, and ⁇ is the projection magnification.
- an objective lens with large NA and small j3 characteristics is required.
- the objective lens tends to have a large aperture.
- Such an objective lens is required to be designed and manufactured easily by simplifying the function without considering the function of projection of the excitation light.
- timelabs and video imaging are required to capture the dynamic expression of protein molecules in a sample.
- video observation of a single protein molecule using fluorescence has been performed. In these imaging, the exposure time per frame of image becomes shorter as the number of imaging frames per unit time increases. Such observation requires a bright optical system, particularly a bright objective lens.
- the objective lens according to the first embodiment manufactured based on the above circumstances has large NA and small characteristics as compared with a commercially available objective lens.
- an objective lens having a square value of (NA / ⁇ ) in the range of 0.01 to 0.09 It was possible to generate luminescence images of cells with photoproteins within 5 minutes and to measure the amount of luminescence of individual cells.
- an objective lens having a square value of (NA / J 3) of 0 ⁇ 007 or less could not generate a luminescent image that can be recognized by the naked eye or image analysis software.
- the square value of ( ⁇ / ⁇ ) or ⁇ of the objective lens of the first embodiment capable of generating a luminescent image is significantly larger than the range of conventionally used objective lenses. is there. That is, it can be said that the objective lens of the first embodiment is a bright objective lens under conditions different from those conventionally used.
- a bright objective lens such as the objective lens of the first embodiment
- light emitted from a light-emitting sample with a small amount of light can be observed with an image.
- the objective lens of the first embodiment with a large numerical aperture was attached to the stereomicroscope, and the image was cooled to about 0 ° C without attaching the image intensifier.
- the objective lens of the first embodiment has a large diameter of about 5 cm to 10 cm. As a result, it is possible to capture a luminescent sample having movements such as shaking, deformation, splitting, and movement that could not be an imaging target in the past or a luminescent sample distributed over a wide range.
- a luminescent sample having movements such as shaking, deformation, splitting, and movement that could not be an imaging target in the past or a luminescent sample distributed over a wide range.
- a visual field range equivalent to 1 cm square, preferably 2 cm to 5 cm square or more can be observed.
- the whole or most of the organ for example, brain, suprachiasmatic nucleus, spleen, tumor tissue, nematode, etc.
- the above description does not exclude application of the cryogenic cooling CCD such as liquid nitrogen to the first embodiment.
- the cryogenic cooling CCD such as liquid nitrogen
- high-speed imaging that could not be obtained even with a cryogenic cooled CCD is realized only by the optical configuration before light reception including the objective lens. Therefore, by combining the method and apparatus of the first embodiment with an extremely low temperature cooled CCD, high sensitivity is achieved and the S / N ratio is increased, so that the image quality is improved. I can do it.
- the lenses used as the objective lens 2A and the condenser lens 3A for image formation are, for example, commercially available products having specifications of "Oil, 20 times, NA 0.8.8" and “5 times, NA 0.13", respectively. It is an objective lens for microscopes, and the total magnification corresponding to the magnification Mg is 4 times.
- CCD camera 4A is 5. This is a C-cooled digital camera for microscopes “DP30BW (manufactured by Olympus)”.
- the CCD element is a 2/3 inch type, the number of pixels is 1360 X 1024, and the pixel size is 6 ⁇ m square.
- the apparatus for carrying out the luminescent sample imaging method for example, 1 minute without photon counting by a cooling CCD cooled at 5 ° C. With a very short exposure time, it is possible to image weak light emitted by the luciferase gene.
- the position of the luciferase gene that emits light can be observed with a clear image, and cells containing this luciferase gene can be easily observed. Can be identified.
- the position of the luciferase gene that emits light is identified and tracked in time series, and the time course of the luminescence phenomenon is measured. You can also.
- the imaging optical system composed of the object lens 2A and the focusing lens 3A for imaging is an infinity correction system.
- the sampler 1A can be observed by various methods.
- an apparatus for performing the luminescent sample imaging method according to this embodiment is used as a biochip reader for optically reading a biochip such as a DNA microarray, a cell array, or a protein array.
- a biochip as a substrate having a plurality of accommodating parts is a substrate made of a resin such as glass or polystyrene, and has a small part addressed (for example, a diameter of 0 ⁇ 05 to 5. Omm). 2 ⁇ 1000 pieces, 0.:! ⁇ 1. Attached at intervals of Omm, and various kinds of DNA (or RNA) fragments, synthetic oligonucleotides, cells, proteins, etc.
- the fluorescence or luminescence emitted by this biochip force is very weak. If the apparatus for performing the luminescent sample imaging method according to this embodiment is used, the amount of solid phase applied to a microbiochip on which a conventional genetic or immunological substance is solid-phased can be greatly reduced. However, it is superior in that it may be able to detect in real time.
- a general biochip reader is a combination of a laser irradiation confocal optical system and a high-speed moving scanning stage when the light emitted from the biochip is fluorescence. , Because it is the sum of the amount of light emitted from the spot excitation light irradiation point, the amount of light measured changes each time the scanning width changes. Absolute light intensity cannot be measured. Therefore, using a device for performing the luminescent sample imaging method that is powerful in this embodiment, for example, a stage that holds the biochip in a 0.6 mm step with respect to an objective lens having a field of view of 0.5 mm diameter. The absolute light quantity can be measured by moving the and measuring the light every time it is stopped.
- an imaging device having an optical condition capable of sufficiently detecting light emission that emits light weaker than fluorescence is designed according to a predetermined magnification.
- the apparatus for performing the luminescent sample imaging method according to the second embodiment is an inverted type.
- the inverted weak light sample imaging device of FIG. 28 is placed in a light shielding device such as a chamber that blocks light from the outside, so that it is stable and weak without being affected by external light. Light can be detected, and a sample 1B self-luminous image can be captured clearly.
- the light shielding device shown in FIG. 28 forms a dark room by the base 41B, the enclosure 42B, and the lid 43B, and the faint light sample imaging device is provided on the base 41B in this chamber.
- the lid 43B is opened around the hinge portion 44B, and the specimen 1B can be exchanged.
- the weak light specimen imaging device is controlled by the control device 46B such as a computer having the input device 47B such as a keyboard and a mouse. It is recommended that the optical specimen imaging device be remotely controlled and automatically controlled from the outside of the shading device. In particular, the focusing operation and alignment operation for the specimen 1B, the imaging operation of the camera 5B, etc., and the adjustment of the illumination light by the illumination fiber 15B You should be able to control light automatically.
- the alignment operation with respect to the specimen 1B means that at least one of the imaging optical system including the objective lens 6aB and the imaging lens 10B, the camera 5B, and the sample stage 13B holding the specimen 1B is lighted.
- the specimen 1B is disposed in the field of view of the objective lens 6aB by moving in a direction substantially perpendicular to the axis.
- an Airy disk is used for each Airy disk of interest among the Airy disks formed by the imaging lens 10B. You can process it so that the center of the pixel and the center of the CCD pixel match. In this case, for example, a position where the output corresponding to the pixel is maximized may be detected by operating the Airy disk and the pixel relatively two-dimensionally.
- the control device 46B includes a display device 48B, and the display device 48B supports an image corresponding to the bright field image of the sample 1B and an image of the sample 1B by self-luminescence. It is advisable to superimpose and display the image. Further, the control device 46B may include a storage unit such as a memory for storing these images.
- the weak light sample imaging device which is a force in the second embodiment is replaced with the sample stage 13B, for example, as shown in FIG. 29, a container 51B, a partition 52B, and a transparent plate 53B are also included.
- a sealed container as a step may be provided, and the specimen 1B may be held on the petri dish 51B.
- this airtight container captures constant temperature and low humidity CO generated by an air conditioner (not shown).
- a heat sheet or the like may be provided inside the container to electrically adjust the temperature in the sealed container.
- the feeble light sample imaging apparatus may include an illuminating means for illuminating the sample 1B.
- an illumination fiber that guides illumination light from a white light source, etc. an illumination device that achieves critical illumination by combining a white LED and a single lens, and a Koehler illumination device that uses a condenser lens, a UCD for microscopes Etc. can be used.
- the feeble light sample imaging apparatus may include an illumination device that performs differential interference observation and phase difference observation as illumination means. In this case, however, a dedicated ring stop, prism, objective lens, etc. must be provided.
- the weak light sample imaging apparatus that works on the second embodiment is an upright optical system or an inverted type according to the type and purpose of the sample.
- the advantage of the upright type is that it makes it easier to observe from above the membrane without obstructing it when observing a tissue section using a membrane to ensure good contact with the sample container.
- tissue sections it preferably has a cell layer sliced to a thickness close to one. It can be said that it is an extremely important technology to be able to take a luminescence image for a long period of time while culturing a section of living tissue for a long period of time.
- tissue sections include central system tissues such as the cerebellum and suprachiasmatic nucleus, and various organ system tissues such as presumptive and organ tumors.
- the biological sample is a small animal or insect having light transmittance such as a nematode, the biological sample can be observed without slicing.
- the weak light specimen imaging apparatus that is powerful in the second embodiment also provides an optical system having a wide field of view, so that a biological sample such as a small animal or an insect maintaining a motor ability can be emitted from this apparatus with a non-toxic light emission. The advantage of being able to observe for a long period of time is great.
- the advantage of the inverted type is that when the weak light is to be measured under more severe light-shielding conditions, the entire imaging system can be placed under the sample stage. , Injecting drugs, etc., and opening the cover for other maintenance inspections) while maintaining optical isolation from the work performed above the sample (with as little influence of extraneous light as possible) and constant imaging This is in that the conditions can be maintained.
- the CCD is used as the imaging means.
- an imaging element such as a CMOS is used.
- Rejection An image sensor having an imaging sensitivity equivalent to that of a CCD may be used.
- the luminescent sample imaging method, the luminescent cell imaging method, and the objective lens according to the present embodiment include, for example, analysis of a promoter that controls a gene expression and transcription using a luminescent gene such as luciferase as a reporter gene. It can be suitably used in reporter assemblies for examining the effects of factors such as factor genes and various drugs.
- the system and method of this embodiment can be easily adapted to image any of a variety of cells provided in a variety of forms, depending on the type of substrate.
- the cell can be a bacterial, protozoan, fungal prokaryotic cell, or eukaryotic cell, and a bird, reptile, amphibian, plant, or mammal (eg, primate (eg, human), rodent It can also be a cell derived from a species (eg, mouse, rat), rabbit, ungulate (eg, ushi, hidge, pig, etc.).
- the cells can be primary cells, normal and cancerous cell lines, genetically modified cells, and cultured cells.
- These cells include various types of cell lines that are spontaneously induced, various cell types that are selected from individual cell lines according to the desired growth characteristics or response characteristics, and types of tumors. It includes similar cell lines, but different patients or multiple cell lines induced with different site forces. Cell culture is typically 92-95% air and 5-8 moisturized. / 0 C0 atmosphere
- the cells can be cultured in a nutrient mixture containing a biological fluid such as unidentified urchin fetal serum or in a serum-free medium in which all components are known.
- a biological fluid such as unidentified urchin fetal serum or in a serum-free medium in which all components are known.
- the cells to be imaged can be genetically modified cells (eg, recombinant cells).
- live cell imaging although this embodiment also contemplates cell membrane permeabilization or fixed cell imaging, depending on the aspect.
- the cells are usually imaged in a sample containing a culture medium intended for cell maintenance and / or growth.
- the cells are sufficiently immobilized on the substrate surface.
- a substrate eg, a substrate treated by coating with a substance that adheres to cells
- the cells do not move relative to the substrate.
- a substrate eg, tissue culture plastic in a well
- the position of the cells is relatively fixed with respect to the substrate so that the position of the cells relative to the substrate does not move. Make sure that you can. This makes it possible to return exactly to the same cell field, or to return exactly to the same individual cell in the cell field.
- This embodiment is generally intended for single-cell imaging, and in particular for live cell imaging.
- the cells may be dispersed as single isolated cells on the substrate surface or may be in contact with other cells, for example in the case of monolayers. A thin layer may be formed as in the case of a piece.
- the cells to be imaged may be a homogeneous cell population or a heterogeneous cell population (eg, a mixed cell culture). As described above, the present embodiment enables imaging of a single cell and imaging of a cell population (this cell population may include a plurality of different cells in some cases). .
- Imaging of cells may be performed using a detectable marker (for example, a fluorescent label or a luminescence (chemiluminescence, bioluminescence) label), or may be performed without using them.
- detectable markers include, for example, fluorophores or fluorescence, chemiluminescent substances, other suitable detectable labels (eg FRET (fluorescence resonance energy transfer) detection system, BRET (bioluminescence resonance energy transfer) detection system) For example).
- the system and method of this embodiment enables imaging of cell populations and individual cells.
- the system and method of the present embodiment are particularly useful for cell viability (eg, cell viability and cell health), cell physiological properties (synaptic physiological properties), signal transmission, and location and function of organelles. And time-lapse imaging to observe changes in cell position, function (including interactions and turnover), enzyme activity, receptor expression and position, cell surface changes, cell structure, differentiation, and cell division.
- the system and method of the present embodiments can be used to induce cell death due to protein expression (eg, the role of huntingin in Huntington's disease) and protein level changes or aggregation. To determine whether they are symptoms of cell death (eg, an attempt by a cell to prevent cell death, not the cause of cell death itself). Or use it.
- the system and method of the present embodiment enables a single cell or a population of cells to be imaged in real time in a desired time, for example, in a relatively short time.
- imaging of cells can be performed quickly, and a relatively short period of time can be used. Since it is possible to perform imaging again by returning to the same cell field including the same individual cells, the conventional method could not be performed at all due to the length of time required to acquire each image. It became possible to observe.
- cellular phenomena for example, cell function, cell survival, and fate of individual cells in a population
- advancing phenomena eg, denaturation
- the same cell population and individual cells in the cell population can be accurately identified by removing the substrate from the system and then placing it again in the system. Analysis over a long period of time (eg, hours, days, weeks or longer) of cells and selected cell populations is also possible.
- a plurality of biological variables can be measured qualitatively or quantitatively almost simultaneously or at the same time.
- information on changes in cell morphology and molecular phenomena can be further obtained by imaging cells with a phase difference.
- the system and method of the present embodiment in another aspect, can image cells using a plurality of detectable markers.
- cells or cell populations in tissue culture can be placed in any desired period (eg, 2 hours, 5 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days, 4 days, 6 days, 7 days. For several weeks, the time to life of the cells of interest) It is also possible to do. Imaging of biological samples including cells can be performed at a certain time corresponding to the above period, or can be performed in another manner. The following are examples of such imaging. This embodiment is not limited to these. The following imaging example emphasizes certain advantages and features of this embodiment.
- Phototoxicity has always been an important limiting factor in imaging live samples, and phototoxicity is directly related to incident light intensity, irradiation time, and wavelength. Phototoxicity is particularly a problem when investigating slowly progressing processes because the same cell sample must be repeatedly irradiated. Therefore, the amount of incident light required to detect available signals is reduced using the system and method of this embodiment. In the present embodiment, the phototoxicity is significantly reduced by the method of re, depressing force. According to the system and method of this embodiment, the microscope is focused by irradiating low-intensity white light for an extremely short time, and then a high-resolution fluorescent image is acquired by irradiating higher-intensity light. be able to.
- the focusing is usually performed by continuously irradiating high-intensity fluorescence.
- the cells are about an order of magnitude longer than when automated with high-intensity light with phototoxicity. It can be irradiated over time.
- the system and method of the present embodiment are advantageous in reducing phototoxicity because a plurality of adjacent fluorescent images are acquired without refocusing after focusing once. .
- most of the cell field of view receives only the light necessary for image generation as significant light, so the system and method are optimized for obtaining fluorescent images. You can say that.
- the irradiation time of high-intensity light is substantially reduced by automation, so that light fading is less likely to occur, and the emitted fluorescence is bright, so a high-resolution image is generated. The excitation time required for this is further reduced.
- This embodiment can be implemented as follows, for example.
- a reporter gene preferably a luciferase derived from firefly or Renilla, etc.
- a promoter region of a gene whose expression is induced by stimulation of this contact when a substance is brought into contact with a cell.
- the gene is introduced into a predetermined number (for example:! To 1 ⁇ 10 9 , preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 ) of cells using the gene introduction method described above.
- a predetermined number of cells into which the reporter gene has been introduced are added to a desired nutrient medium (for example, D--) using a desired instrument capable of cell culture (for example, a petri dish or a multiplate having many wells). Incubate in MEM medium).
- a desired instrument capable of cell culture for example, a petri dish or a multiplate having many wells.
- MEM medium MEM medium
- the sample consisting of the predetermined number of cells is preliminarily kept at a temperature optimum for the cells (for example, 25 to 37 ° C, preferably 35 to 37 ° C), and water is added to prevent the sample from drying.
- the luminescence image is recorded with a digital camera through the objective lens in the sample observation part of the luminescence microscope.
- a substance for example, a compound to be stimulated by contact with cells is added to the sample at a desired concentration (for example, 1 ⁇ to 1 ⁇ , preferably 100 nM to lmM), and a desired time interval (for example, 5 minutes to 5 minutes).
- the luminescence image of the sample is recorded over a period of time, preferably 10 minutes to 1 hour.
- the luminance value in a desired area in the recorded light emission image is acquired using commercially available image analysis software (for example, MetaMorph (trade name); manufactured by Universal Imaging).
- the image analysis software is surprisingly provided with a function of superimposing the light emission image and the bright field image.
- a bright image such as a bright-field image, even if it is a blurred luminescence image due to fast-moving cells, etc. (for example, the whole tissue, specific cell groups, individual cells, partial areas of cells, etc.) Since the cells can be accurately recognized by using them, there is an advantage that the reliability of the analysis can be stably maintained.
- the image analysis software for performing the image analysis using the imaging method and apparatus according to the present embodiment is not limited to individual cells or the like (entire tissue, specific cell group, individual cell, cell) in at least the luminescent image.
- a recognition function that discriminates a certain area by contour information based on parameters such as shape and size, and a measurement function that measures the amount of luminescence generated by the recognized cell isotropic force preferably Measurement results are output in response to requests from the computer that controls the imaging device and input means by the operator (keyboard, mouse, numeric keypad, touch panel, etc.) It has the function to do. More preferably, the measurement result is output in association with the image information of the recognized cell or the like.
- the output format can be a pseudo image or a numerical value according to the amount of luminescence, and when analyzing a large number of cells, it can be a graphic expression such as normal distribution, histogram, line graph, bar graph, etc. Further, when outputting time-series analysis results regarding the same cells or the like, the output format may be a point distribution in which light emission amounts are arranged in order of elapsed time, or a waveform pattern in which lines are connected in order of time. The waveform pattern is particularly suitable for luminescence data showing periodicity such as a clock gene.
- the software for image analysis may be configured to analyze the output graph and waveform pattern as needed and analyze the correlation with other cells as necessary.
- the recall function for displaying an image of a corresponding cell or the like on the display when a portion of interest for the analysis result output on the display is designated through the input means. It is more preferable that the recall function has a screening mode in which moving image information is displayed for the entire period or a specific period when the specified cell is imaged.
- Live cells are usually cultured on tissue culture plastic.
- the health of the living cells eg, nerve cells
- imaging cells for a period of time in the same culture dish where the cells were originally grown will maintain cell health and minimize the level of power disturbance.
- Cells in tissue culture dishes can be imaged using an inverted microscope under sterile conditions, but in an inverted microscope, the image is passed through the substrate on which the cells are grown (eg, glass or plastic). Will be performed.
- Tissue culture plastics are less transparent than glass, depending on the wavelength (eg UV), causing light scattering and reducing image resolution.
- the goal of this embodiment is to provide a system equipped with an optical system that can obtain a high-quality image regardless of whether plastic or glass is transmitted. Is to provide a stem.
- an immersion lens typically collects more light than a non-immersion (air) objective lens, but an immersion lens requires an immersion solvent, and this solvent cannot be supplied for automatic imaging. It's not realistic.
- the refractive index of these substrates varies from product to product, and also differs from the refractive index of air that passes through until the emitted fluorescence is collected on the objective lens. Imaging through materials of different refractive indices results in chromatic and spherical aberration, which increases the numerical aperture of the lens.
- the system and method of the present embodiment are particularly useful for performing a high-throughput screening method.
- Examples of such access methods elicit the desired response of the cell (eg, regulation of mitor cell death, receptor internalization, regulation of signal transduction pathway activity (increase or decrease), regulation of transcriptional activity, etc.)
- Identification of substances, analysis of nucleic acids with functions that have not been known or investigated so far for example, analysis in which a coding sequence of interest is introduced into a target cell and expressed in the cell), etc. Yes, but limited to these It is not a thing.
- markers that can be distinguished during detection. For example, if the screening 'accessory method involves an assessment of the effect of a gene product encoded by a polynucleotide, one marker is used to identify cells that have been transfected with the target construct (e.g., of interest).
- the target construct e.g., of interest
- the second marker is used to detect the expression of the gene product (eg, in a detectable marker provided by a fusion protein generated from the gene product encoded by the polynucleotide) Detect the gene product) and use a third detectable marker Evaluate the effect of the child product on the target cell (eg, a promoter that is supposed to be regulated by the gene product of the candidate polynucleotide, or by expression of a reporter gene under the control of one or the gene of the candidate polynucleotide Cell viability can be assessed by factors regulated by the product). It is also possible to obtain information about changes in cell morphology (eg, cell differentiation and formation of cell structures (eg, ridges)) from a phase contrast image. It is possible to superimpose and compare with a fluorescent image acquired at a predetermined selected time.
- a detectable marker provided by a fusion protein generated from the gene product encoded by the polynucleotide
- the first marker is used to detect the binding of the substance to the receptor while the second marker is detected. It can be used to detect transcriptional activation of the reporter gene.
- a “detectable marker” includes molecules that emit a detectable signal when excited at a predetermined wavelength.
- FRET Fluorescence Fluorescence Polarization or Anisotropy
- TRF Time-Resolved Fluorescence
- FLM Fluorescence Lifetime Measurement
- FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
- FPR Fluorescence Fading Recovery
- the assembly method using these fluorescent lights can be changed to the assembly method using light emission that does not require optical excitation. If optical excitation is not required, it is possible to obtain measurement data that is sufficiently bright and excellent in quantification at an appropriate magnification according to the above-mentioned optical conditions, which can be achieved with the power if the optical apparatus can be simplified.
- the sample is a “polypeptide” or “protein”.
- polypeptides or “protein”. These terms are used interchangeably and refer to polymeric forms of amino acids of any length. Examples include genetically encoded and non-genetically encoded amino acids, chemically or biochemically modified (eg post-translationally modified and eg glycosinoylated) amino acids Or modified amino acids, polymer polypeptides, and polypeptides with modified peptide backbones.
- Polypeptides that can be screened include effusion proteins with heterologous amino acid sequences, fused with heterologous and homologous leader sequences, with an N-terminal methionine residue or Some do not have, some are immunologically labeled proteins.
- Polypeptide modification can also be performed, for example, to promote attachment to a substrate (eg, a solid support such as a bead, a porous substrate, or a capillary array).
- a substrate eg, a solid support such as a bead, a porous substrate, or a capillary array.
- the recombinant cell expressing the target gene product and the assembly method can be used, for example, binding to the target gene product, Of particular interest is making it suitable for the detection of candidate substances that interact with a target gene product by modulating expression or by modulating the biological activity of the target gene product.
- target gene product refers to various gene products including proteins that are the center of screening for candidate substances, and is not limited thereto.
- the target gene product can be used as a receptor, and the Atsy method can be adapted to identify substances that modulate the activity of the receptor.
- the substance is brought into contact with the cell in the process of the assembly process.
- the substance in the case of genetic material, the substance is placed in the cell.
- To detect one or more variables in the cell Measure changes in cellular parameter readings associated with the substance, normalize if possible, and evaluate by comparing these parameters with the reference readings. For this evaluation, use the results of verification, basic readings obtained in the presence and absence of various factors, and other substances (which may or may not contain known inhibitors of known pathways). As a result, the obtained reading value can be used.
- Analytes can include any biologically active molecule that has the ability to directly or indirectly modulate the cellular parameters of interest of the cells of interest.
- the substance is conveniently added to the cells in culture in the form of a solution or readily soluble in the cells.
- Substances can be added to the flow-through system either intermittently or in a continuous stream, and the compounds can be added to the static solution all at once or in small batches except when added.
- One example of a flow-through system uses two fluids, one with a physiologically neutral solution and the other with the test compound added in the same solution. A first fluid is passed over the cell followed by a second fluid. In a method that uses only one solution, the test compound is added to a specific volume of culture medium surrounding the cells. There should be no significant variation in the overall concentration of the components of the culture medium due to the addition of the test compound or between the two solutions in the flow-through method.
- the composition of the substance is added such that it can significantly affect the overall composition.
- ingredients such as preservatives.
- the composition of the substance consists essentially of the substance to be tested and a physiologically acceptable carrier (eg water, cell culture medium, etc.).
- a physiologically acceptable carrier eg water, cell culture medium, etc.
- the ability to include another substance in a screening 'accessory method can be used, such as a substance that allows static binding of a substance to a binding partner, non-specific Or a substance for reducing the background interaction.
- a substance that allows static binding of a substance to a binding partner such as a substance that allows static binding of a substance to a binding partner, non-specific Or a substance for reducing the background interaction.
- a plurality of assembly methods using different substance concentrations can be performed in parallel to obtain differential responses corresponding to various concentrations.
- a range of concentrations obtained by dilution with 1:10 or other logarithmic scale is usually used when determining the effective concentration of a substance.
- This concentration can be further refined, if necessary, by performing a second series of dilutions.
- one of these concentrations serves as a negative 'control, and this negative' control is below the mouth concentration, or below the substance detection level, or below a substance concentration that does not produce a phenotypic detectable change. Concentration.
- the imaging system and method of the present embodiment is adapted to a wide variety of access modes to screen for a desired biological effect of a candidate substance on target cells (eg, modulation of target cell parameters).
- This biological effect can be meaningful when the substance is used as a drug.
- various substances can be used for cell differentiation, cell death (eg, regulation of apoptosis), signal transduction (eg, signal transduction at G-binding protein receptors, GTP binding, detection of second messenger system, etc.), ion channels Activity (eg, by assessing influx using, for example, calcium 'imaging), transcription (eg, using reporter gene assembly methods to identify substances that affect the expression of target gene products, for example) You can check the adjustments.
- cell death eg, regulation of apoptosis
- signal transduction eg, signal transduction at G-binding protein receptors, GTP binding, detection of second messenger system, etc.
- ion channels Activity eg, by assessing influx using, for example, calcium 'imaging
- the screening assay is a binding assay that detects binding of a candidate substance to a binding partner in a cell, eg, an agonist or antagonist to a receptor; to identify a substance that acts as a ligand.
- the Atsy method can be, for example, an antagonistic binding assay that evaluates a candidate substance for inhibition of the activity of a known receptor 'ligand (eg, a known agonist or antagonist).
- a known ligand is labeled so that it can be detected, for example, as the activity of the known ligand decreases or binds, the detectable label of the known ligand also decreases. Can do.
- the culture can be performed at any suitable temperature, and usually at 4 to 40 ° C.
- Incubation time is the power to select the optimal activity.
- the optimal time can be selected for rapid and high-throughput screening.
- Incubation time is usually 0.1 to:! Time, but in some embodiments, it may be desirable to examine the cells after this incubation time or a long time.
- the inventor has also found that the variation pattern of gene expression is different among a plurality of cells cultured in the same petri dish. Furthermore, according to the optical condition investigated by the inventor, the optical condition represented by “the numerical aperture (NA) / the square of the projection magnification ()” is 0. It has been found that when it is 071 or more, it can provide a cell image that can be imaged within 5 minutes and can be analyzed.
- a light emission analysis system that observes these light emission images with a storage-type imaging device is called a light emission microscope.
- the light emission microscope preferably has a light shielding means having an opening / closing lid (or opening / closing window) for shielding light, and a necessary biological sample is set or exchanged by opening / closing the light shielding means.
- the operation of performing chemical or physical stimulation on the container holding the biological sample may be performed manually or automatically.
- the luminescence microscope is equipped with a known or unique culture device.
- the culture device is designed to allow temperature, humidity, pH, ambient air components, media components, culture media to enable long-term analysis within the system. It has a function to maintain the nutrient solution components optimally.
- Examples of the biological material from which the luminescent sample is derived include cells or tissues derived from eukaryotes and cyanobacteria.
- a sample containing cells excised by biopsy from a site to be examined in a mammal (particularly human) is particularly exemplified.
- biological samples at least partially artificially modified or synthesized are particularly exemplified and can be used for the purpose of examining whether biological activity is maintained well.
- the subject of the embodiment of the present invention is not limited to an animal-derived cell or living tissue, but may be a plant or insect-derived cell or living tissue. For fungi and viruses, analysis of parts in a container that could not be performed with a conventional luminometer can be targeted.
- a large amount of light is quickly obtained by stacking an infinite number of samples (for example, more than 1,000,000 per tool) in a container such as a tool or petri dish.
- a container such as a tool or petri dish.
- an image of each luminescent sample that cannot be seen with the naked eye is generated, individual cells or living tissues can be analyzed even if they are contained in a container at a density that allows individual cells to be identified.
- Such an individual analysis includes an analysis method in which only luminescent cells are statistically summed or averaged. This allows an assessment of the exact interaction per cell.
- Sample containers that contain sample 1A include petri dishes, glass slides, microplates, and flow cells.
- the bottom surface of the container is not only a light transmissive material (glass, plastic, etc.), but also a container having a wide (or flat) bottom surface so that two-dimensional data can be easily obtained. More preferably.
- the partition portion of each housing portion is formed entirely with a light-shielding material or dye.
- a liquid lid such as mineral oil is arranged on the upper surface of the sample in the container. You can put it on.
- the sample stage for placing the sample container may be moved in the X-axis direction and the Y-axis direction in order to change to a different field of view for imaging, if necessary, like a general microscope device.
- the objective lens 2A may be placed upside down below the sample 1A.
- the objective lens 2A can be heated with appropriate heating means (Peltier element, hot air heater, etc.) so that the living luminescent sample functions stably in a constant temperature environment such as culture conditions.
- the objective lens 2A may also be driven in the Z-axis direction, which is the optical axis direction (vertical direction in FIG. 26).
- the objective lens 2A is equipped with a Z-axis drive mechanism for the objective lens.
- Examples of the Z-axis drive mechanism of the objective lens include a rack and pinion mechanism and a friction roller mechanism.
- the objective lens 2A can be appropriately oil-immersed according to the desired magnification.
- the magnification to be selected is arbitrarily set according to the size of the sample to be evaluated (or analyzed). Specifically, the magnification is low enough to observe cells and tissues (for example, 5 to 20 times), or high enough to observe minute substances inside or outside cells (for example, 40 to 100 times). possible.
- the CPU 5A provides an analysis method for observing a change in activity of one or more desired cells with a real-time image by providing a configuration for displaying image information of a luminescent sample as a moving image. preferable. As a result, it is possible to observe the state of luminescence in cell units or tissue units in time series with realistic images.
- the method and apparatus for observing in time series are in the form of software for controlling or coordinating the required apparatus configuration, or a computer program characterizing the software. May be provided.
- a computer program characterizing the software May be provided.
- electrically connecting the method or apparatus of the present embodiment to a database that is the same as or separate from the apparatus it is possible to achieve high speed, reliability, and quality without being limited by image capacity or analysis information amount. It is possible to provide high analysis results.
- an objective lens having a high numerical aperture (high NA) and a projection magnification that includes the object in the observation field, and a low temperature (for example, a high temperature of 15 ° C or higher) at room temperature
- An image sensor CCD CMOS, etc.
- a light shielding means for ensuring light shielding during image generation is provided as a main component. If the CCD is small and can be controlled at a low temperature, it is compact as a total system, and even if all the components are housed in the same housing, it can be designed so that it can be looked down on the desk.
- the apparatus embodying the present embodiment is a very small and low-cost product.
- the internal space of the device becomes small, and it becomes easier to adjust the conditions of the biological environment (temperature, humidity, air components) in the device to a level suitable for culture and trace reactions.
- stimulation processing such as taking in and out of the luminescent sample and dispensing of the drug to the stored sample through the appropriate opening / closing window or cover from the top of the device. Yes.
- the present embodiment provides a method and apparatus for generating an image with a large number of pixels (preferably a large number of pixels) without performing optical scanning.
- Image analysis software for analyzing cells in addition to image analysis of the generated image can also provide products that can be used industrially as a part of this embodiment, alone or as a total system with a light emission microscope.
- the present embodiment relates to an imaging apparatus that captures a large number of imaging regions set in one or more biological samples using timelabs, and is particularly suitable for high-throughput imaging.
- the present invention relates to a throughput imaging apparatus.
- the present embodiment relates to software including a program that performs the function of such an imaging apparatus. This embodiment is suitable for research or clinical use in which many biological activities of biological samples such as cells derived from living organisms are efficiently examined.
- the temperature is 37 ° C of body temperature, and a medium that mimics the intercellular fluid is used.
- the medium contains carbonate buffer for pH adjustment.
- the carbonate buffer is equilibrated in the presence of air containing carbon dioxide with a partial pressure as high as 5%, and is used for culture in an open system such as a dish.
- a high humidity environment of 95 to 100% is required.
- a carbon dioxide incubator equipped with the above environmental conditions is used for cell culture. Furthermore, a phase contrast microscope or differential interference microscope is used to observe the state of cells, and a fluorescence microscope is used to observe the expression of GFP and the like. In addition, a CCD camera and a controller (personal computer) are used for taking and displaying microscopic images, and a culture microscope combining these is proposed (Patent Document; Japanese Patent Laid-Open No. 2003-29164).
- Timelabs is used to make it easier to check the state of cells that change over a long period of time by taking samples and storing images at regular intervals. For example, if one cell is first photographed for the required photographing time (camera exposure time), then one image is taken every hour, and then 24 hours are obtained, 25 images can be acquired. If these images are taken and played back continuously, cells every hour Can be easily confirmed. If the shooting interval is shortened to 30 minutes or 15 minutes, for example, fast-moving cells can be observed.
- the microscope or sample is moved to a target location using an electric stage attached to the microscope.
- the movement to the observation position is synchronized with Timelabs.
- Timelabs that sequentially observe multiple observation positions are called multipoint timelabs.
- a significantly shorter time for example, 30
- Emission images can be generated in less than one-minute time), so time series evaluation can be realized with weak light images in units of 5 to 20 minutes, less than 5 minutes under favorable conditions, and about 1 minute at the shortest.
- the high-throughput imaging apparatus of this embodiment includes an image acquisition means for acquiring an image of a biological sample existing in a plurality of imaging regions, and acquiring the sample image.
- An example of the conditions for interval imaging includes changing the imaging time as the timelabs condition according to the activity rate and reaction rate of the biological sample.
- an appropriate exposure time can be selected from an exposure time of 1 minute to 20 minutes or longer.
- a minimum exposure time within a range where a luminescent image of a level that can be image-analyzed is obtained.
- a long exposure time can be set to such an extent that the image capacity is not excessive.
- multiple exposure times eg, any combination of two or more from the group of 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes
- continuous time ranges For example, at an exposure time of :! to 30 minutes, by setting a division scale in increments of:!
- the high-throughput imaging apparatus of this embodiment captures a biological sample existing in a plurality of imaging regions by an image information extraction unit that extracts different image-related information.
- an interval imaging condition setting unit for setting an interval imaging condition based on the imaging time and the type of the image information extraction unit Even in such a configuration, since the imaging operation is efficiently executed according to the imaging conditions set by the control means, it is possible to capture a large number of imaging regions in a short time.
- the "biological sample” can be any living organism, and the biological activity of interest can be maintained as a container or life as an appropriate holding means in a state where it can be maintained. By holding it on the body, an imaging region to be imaged can be provided to the imaging means.
- the container includes any container that holds the sample in a state where it can be imaged by a desired imaging means, and specifically includes a well, a petri dish, a slide chamber, and a cuvette.
- living organisms include plants, mammals, fish, insects, bacteria, and viruses.
- the target sample is held by the living organism.
- the biological sample is a force containing any part derived from a living organism, preferably a biological cell, and more preferably a nucleated cell capable of developmental division or proliferation. For an organism that has built up multiple organs whose cells are separated into different functions, it may be any organ that exhibits the biological activity of interest.
- the biological activity can be one or more of physiological, genetic, immunological, biochemical, and hematological activities.
- “Plural imaging regions” means one or more biological samples held in the same holding means, or one or more types of imaging sites held in separate holding means.
- the high-throughput imaging apparatus can efficiently perform imaging work according to the imaging conditions set by the control unit, so that a large number of imaging areas can be imaged in a short time. .
- a large amount of timelabs data can be obtained at the same time even when the number of samples is very large, which greatly contributes to research and clinical practice related to biological activities.
- FIG. 30 is a conceptual diagram showing the overall configuration of the apparatus of this embodiment.
- the culture microscope main body 101C is composed of an incubator chamber for culturing cells and a microscope portion for observing cells.
- the culture microscope main body 101C incorporates a controller 102C to control each unit described later.
- the controller 102C is arranged inside the culture microscope main body 101C in order to make the space of the culture microscope compact.
- the controller 102C may be arranged outside the culture microscope main body 101C if there is an influence of heat generated by the controller 102C.
- the culture microscope main body 101C includes a warning buzzer 103C and a warning display device 104C.
- Warning buzzer 103C can beep when a problem occurs during the experiment. Further, the warning display device 104C can display a warning when a problem occurs, a work instruction, etc., in the same manner as the warning buzzer 103C.
- the warning display device 104C includes a touch panel 104aC having a function as an operation panel, and an operator can select an operation by touching the touch panel 104aC according to an instruction displayed on the warning display device 104C. .
- the focus handle 'joystick 105C is connected to the controller 102C, and the Z axis direction (that is, the direction to focus the sample) of the microscope section described later can be moved with the focus handle.
- the R stage and ⁇ stage can be moved.
- the ⁇ stage is an electric stage that can move in the rotational direction about an axis
- the R stage is an electric stage that can move in the direction of one axis perpendicular to the central axis of the ⁇ stage.
- the controller 102C and the temperature controller 106C are connected to a computer 109C (a computer in FIG. 30) through an interface such as RS-232C, for example, and can be controlled from the computer 109C. It also includes each means necessary for the interface (memory, arithmetic circuit, display unit, input unit, etc.).
- Mixed air supplied to the incubator room of the culture microscope main body 101C (temperature, humidity, and carbon dioxide concentration (carbon dioxide concentration) are controlled at 37 ° C, 95-100%, and 5%, respectively. Each numerical value is a general value and can be adjusted.)
- the tank 107C in which the accumulated value is stored is external as shown in the figure, and the mixed air can be supplied into the incubator chamber by opening and closing the electromagnetic valve 108C. In this embodiment, mixed air is put into the tank 107C.
- the tank 107C may be made of only carbon dioxide, and a water tank (not shown) for maintaining the humidity may be installed in the incubator chamber. It is also possible to supply carbon dioxide to the incubator chamber without maintaining the tank 107C at 37 ° C.
- the solenoid valve 108C may be controlled by the computer 109C.
- the computer 109C is connected to a network 110C such as a LAN or the Internet. Further, the network 110C is connected to a remote computer 111C, and from the remote computer 111C (the personal computer in FIG. 30) via the network 1 10C.
- the computer 109C can be controlled, and the time-lapse interval imaging performed by the culture microscope main body 101C can be monitored from the remote computer 111C, or the computer 109C can function as a searchable database by storing a large amount of imaging data. It is possible to do. Users of remote computer 111C may be interested parties, but in order to continue to use complex time-lapse imaging smoothly, it is preferable to cover it with a business contract with an external specialist who operates the system. .
- the remote computer 111C may be interested parties, but in order to continue to use complex time-lapse imaging smoothly, it is preferable to cover it with a business contract with an external specialist who operates the system. .
- the remote computer 111C may be interested parties, but in order to continue to use complex time
- the portable remote computer 111C it is a place other than the site of the equipment (laboratory, laboratory, etc.), it is a portable image receiver that is mainly intended for monitoring at any time during leaving, returning home, claiming, or vacation. Temoyore.
- the portable remote computer 111C With the portable remote computer 111C, it is possible to instantly respond to the desired image by calling it up or grasping the abnormality with a buzzer, lamp, abnormality mark, etc. It becomes.
- appropriate authentication means for example, PIN, person ID, electronic key, biometrics (fingerprint, iris, vein, etc.) It is preferable to restrict access according to.
- an access person who has been properly authenticated can be remotely controlled to change the interval imaging condition through the remote computer 111C.
- the remote computer 111C can be monitored and partly operated without going to the site of the equipment, greatly increasing the burden on the user (eg, man-hours, cost, travel time). Provide an excellent usage system to reduce.
- FIG. 31 is an internal block diagram of the culture microscope main body 101C of the present embodiment.
- the incubator chamber 20C is sealed from the outside by a lid 22C, and the temperature, humidity and carbon dioxide (CO 2) concentration of the culture environment inside the chamber are kept constant and actively controlled.
- Mixed air is sealed from the outside by a lid 22C, and the temperature, humidity and carbon dioxide (CO 2) concentration of the culture environment inside the chamber are kept constant and actively controlled.
- the lid 22C can be opened and closed by a handle 21C about a hinge 23C. When the lid 22C is open, the lid open / close sensor 28C is activated to notify the controller 102C of the opening / closing of the lid 22C.
- the heater 112C is installed inside the incubator chamber 20C, and automatically operates and maintains the temperature when it is detected by a temperature sensor (not shown) that the temperature is below the specified temperature (eg, 37 ° C). can do.
- a temperature sensor not shown
- the specified temperature eg, 37 ° C.
- the circular tray 26C has a plurality of sample installation holes 52C, and a plurality of sample containers 25C can be installed in these holes.
- the plurality of sample containers 25C are held by a circular tray 26C that functions as a holding table for the conveying means of the apparatus main body.
- a circular tray 26C that functions as a holding table for the conveying means of the apparatus main body.
- it may be referred to as a “substrate containing a plurality of sample containers”. it can.
- the sample container 25C can be taken upward with respect to the circular tray 26C.
- the bottom surface of the sample container 25C comes into contact with the ring-shaped protrusion 51C of the sample installation hole 52C of the circular tray 26C so that the sample container 25C does not fall down.
- the sample container 25 C can be positioned and installed with respect to the circular tray 26C.
- the bottom surface of the sample container 25C is made of transparent glass or resin and can be observed from the objective lens 33C.
- the center of the bottom surface of the sample container 25C corresponding to the imaging field of view or almost the entire surface is cut out, and this part is molded with high light transmittance and smoothness. It is preferable to use an improved container in which a transparent window such as glass is pasted.
- sample container 25C in order to prevent moisture from evaporating from the sample, cover the sample container 25C with an appropriate sample container lid 57C.
- sample container 25C is taken out of the incubator chamber 20C by exchanging the medium and placed in the incubator chamber 20C with the sample container 25C cooled, there is a possibility that the sample container lid 57C covered on the sample container 25C will dew There is.
- a space for storing the spare sample container lid 57C is provided in the incubator chamber 20C so that the condensed sample container lid 57C can be replaced when the sample container lid 57C is condensed.
- the sample container lid 57C placed in the storage space is still in the incubator chamber 20 C even during medium replacement, so it cannot be cooled.
- the sample container 25C is made of a transparent and observable bottom member and a top member such as glass, and two members (member A and member B) having a large heat capacity such as a metal. And the member A are fixed by bonding, and the upper surface member is bonded to the member B. Member A and member B are detachable. With such a structure, it is possible to prevent dew condensation between the top member and the bottom member.
- the circular tray 26C can be detached from the rotating base 34C.
- the circular tray attachment / detachment sensor 27C is activated and can notify the controller 102C that the circular tray 26C has been removed.
- the circular tray attachment / detachment sensor 27C is shown as a push button in Fig. 31, but any sensor that can detect the attachment / detachment of the circular tray 26C can be used.
- the circular tray 26C which also functions as a sample stage, preferably includes a mixing means (not shown) for appropriately mixing a predetermined solution such as a reagent added or exchanged in the sample container 25C.
- the liquid in a specific sample container 25C can be uniformly distributed in the container by shaking or vibration (ultrasonic vibration or tremor).
- the rotation base 34C is attached to the ⁇ rotation shaft 35C, and the rotation of the ⁇ stage motor 31C can intermittently stop rotating the circular tray 26C one tray at a time in a predetermined rotation direction.
- the rotation period consisting of rotation and stop of the circular tray 26C is driven and controlled through the controller 102C based on the conditions set by the interval imaging condition setting means of the apparatus of the present embodiment described later.
- the rotation period by performing a rotation stop period that stops at a rotation distance that is one tray more or less than the number of all sample containers 25C on the same circumference arranged in the circular tray 26C, Although it appears to stop intermittently by one sample container, almost every sample container 25C can be made to make one revolution each time it moves intermittently. It is also possible to monitor the quality of the culture state of the sample container 25C.
- the lead screw 38C is rotated by the R stage motor 30C and attached to the nut 53C, and the linear movement base 36C moves to the left and right.
- the linear movement base 36C has a linear guide 54C that can move only in the linear direction.
- the ⁇ rotation shaft 35C is rotatably attached to the linear movement base 36C.
- the rotation base 34C can also move to the left and right. This makes it possible to realize a stage that can move the sample in the R ⁇ polar coordinate system.
- the base 55C separates the incubator chamber 20C and the motor chamber 58C, and each part is sealed so that the high-humidity air in the incubator chamber 20C does not enter the motor chamber 58C.
- a flat sheet 50C is sandwiched between the rotating base 34C and the base 55C so as to be slidable.
- the bellows 56C is attached so as to surround the portion where the objective lens 33C is exposed in the incubator chamber 20, and the end surface of the objective lens 33C is fixed to the base 55C with an adhesive or the like and sealed. . As a result, the gap force between the base 55C and the objective lens 33C is prevented so that high-humidity air does not enter the motor chamber 58C.
- the objective lens 33C can be moved up and down by the Z stage motor 32C turning the lead screw 39C.
- the sample can be brought into focus by moving the objective lens 33C up and down. Even if the objective lens 33C is moved up and down, the bellows 56C is made of a soft resin such as rubber, so that it can expand and contract, and the sealing is maintained.
- the microscope chamber 59C maintains the temperature to such an extent that the optical system member does not expand due to a temperature change. A heater or the like (not shown) is used for maintaining the temperature.
- Controller 102C is installed in microscope room 59C, and wiring to each unit is connected.
- the LED illumination 41C is used for fluorescence observation, and illuminates the sample via the fluorescent cube 42C and the passing window 40C and the objective lens 33C.
- Light from the sample passes through the magnification changing lens 43C via the objective lens 33C, the passing window 40C, and the fluorescent cube 42C, and is incident on the CCD camera 45C with the optical path bent by 90 degrees by the mirror 44C.
- the mirror 44C is attached to secure the installation space for the CCD camera 45 C. If the installation space for the CCD camera 45C is sufficient, there is no need to bend the optical path.
- an optical fiber such as a mercury lamp (not shown) can be used as a light source.
- Mercury lamps cannot be turned on and off as fast as LED lighting 41C, so it is necessary to attach a shutter and turn on and off the incident light. These can also be controlled from the controller 102C.
- the light enters the CCD camera 45C without passing through the magnification changing lens 43C. That is, the magnification changing lens 43C may be appropriately inserted into and removed from the optical path extending from the objective lens 33C to the CCD camera 45C.
- the fluorescent cube 42C is rotatable around the axis 48C, and can be switched to fluorescent tubes having different wavelengths. Rotation can be done by driving a cube turret motor 47C. These can also be controlled from the controller 102C.
- the magnification changing lens 43C can be rotated around the axis 49C, and can be switched to a lens having a different magnification.
- the rotation can be performed electrically by driving the lens turret motor 46C. These can also be controlled from the controller 102C.
- the magnification changing lens 43C may be a single zoom lens incorporating a zoom function. Further, if necessary, a configuration in which a lens having a specification such as a desired magnification is simply replaced may be used.
- FIG. 32 is a block diagram showing a unit that can be controlled by the electrical method or the like using the units shown in FIGS. 30 and 31. Although the description of each unit described in FIGS. 30 and 31 is omitted, each unit is connected to the controller 102C and can be controlled by the observer from the user interface of the computer (personal computer) 109C.
- the CCD camera 4 5C is a high-sensitivity type using a cooled CCD and is directly connected to the computer 109C. Has been.
- the heater 112C is a force connected to the computer 109C via the temperature controller 106C. If the controller 102C has the function of the temperature controller 106C, the heater 112C may be controlled via the controller 102C.
- the characteristic configuration of Fig. 32 is that interval imaging condition setting means 70C for setting the imaging conditions for each set sample container 25 in the external control system 60 that controls the internal functions of the apparatus main body 101C from the outside. Is connected to the controller 102C via the computer 109C. Another feature is that the controller 102C is connected to control the driving of the imaging operation of the CCD camera 45C as the imaging means.
- the external control system 60C including various interfaces such as input means and display means attached to the computer 109C, the interval imaging condition setting means 70C, the controller 102C as the internal control system, and the CCD as the imaging means
- the camera 45C and various motors 30C and 31C for the circular tray 26C holding each sample container 25C can be linked.
- This interval imaging condition setting means 70C provides a device that supports assumptions in every scene as shown below.
- Apparatus 1 Image acquisition means for acquiring images of biological samples existing in a plurality of imaging regions and controlling the image acquisition means, and time lapse 'interval for each imaging region Control means for performing imaging, wherein the control means is for setting conditions for interval imaging for each imaging area based on an imaging time required for obtaining the sample image and the number of imaging areas.
- a high-throughput imaging apparatus comprising interval imaging condition setting means.
- Apparatus 2 The high-throughput imaging apparatus according to the apparatus described in the apparatus 1, wherein the interval imaging condition has a setting for switching a plurality of imaging areas a plurality of times for imaging.
- Device 3 A high-throughput imaging device that generates an image by adding up the image signals sent from the image acquisition means for each imaging region, compared with the device described in Device 2.
- Apparatus 4 The apparatus according to the apparatus 1, wherein the interval shooting condition includes a surplus time for performing another kind of processing in addition to a time required for imaging, a high-throughput imaging apparatus, .
- Device 5 Compared to the device described in Device 4, a light shielding unit that shields light from the outside in order to maintain the imaging region in a light environment that can be imaged by the image acquisition unit, and the light shielding unit
- a high-throughput imaging apparatus comprising: processing means for temporarily canceling the light environment and performing processing other than imaging by the image acquisition means.
- Apparatus 6 The high throughput imaging apparatus according to any one of the apparatuses 1 to 5, further comprising a moving unit that moves the image acquisition unit relative to the plurality of imaging regions.
- Device 7 In the device described in Device 6, a plurality of biological samples are sequentially arranged along the circumference of the circular tray, and the circular tray can be rotated and stopped according to the imaging conditions of the control means.
- a high-throughput imaging device characterized by that.
- Device 8 The high throughput imaging device according to the device described in the device 7, wherein the rotation period of the circular tray is stopped after passing through a plurality of imaging regions.
- Apparatus 9 The high throughput imaging apparatus according to the apparatus described in the apparatus 8, wherein the rotation period of the circular tray has a long-distance rotation mode corresponding to an imaging region of 1 rotation ⁇ 1.
- Device 10 The device according to Device 9, further comprising reference information acquisition means for acquiring different types of reference information regarding all imaging regions on the circular tray during long-distance rotation in the long-distance rotation mode. High-throughput imaging device.
- the image acquisition means has an imaging magnification changing means capable of changing an imaging magnification at the time of imaging, and the imaging magnification changing means A high-throughput imaging apparatus, characterized in that interval imaging conditions are set according to the imaging magnification.
- Apparatus 12 In the apparatus according to any one of the apparatuses 1 to 4, the image acquisition unit includes a light receiving element that receives an optical signal obtained from the imaging region, and sets an interval imaging condition according to the light receiving capability of the light receiving element.
- a high-throughput imaging apparatus In the apparatus according to any one of the apparatuses 1 to 4, the image acquisition unit includes a light receiving element that receives an optical signal obtained from the imaging region, and sets an interval imaging condition according to the light receiving capability of the light receiving element.
- Apparatus 13 Image acquisition means for acquiring biological images existing in a plurality of imaging regions by image information extraction means for extracting different image-related information, and acquiring the sample image; Control means for controlling the acquisition means and performing timelabs' interval imaging for each imaging region, the control means depending on the imaging time required to acquire the sample image and the type of the image information extraction means
- a high-throughput imaging apparatus comprising: interval imaging condition setting means for setting an interval imaging condition for each imaging area based on the interval imaging condition setting means.
- Apparatus 14 The high throughput imaging apparatus according to the apparatus described in the apparatus 13, wherein the image information extracting means extracts different pieces of image related information simultaneously or successively with respect to the same imaging area.
- Device 15 The high-throughput imaging device according to the device described in Device 14, further comprising: an image synthesis unit that synthesizes different image related information extracted by the image information extraction unit in association with a sample on an imaging region. .
- Apparatus 16 In the apparatus according to any one of the apparatuses 13 to 16, the image information extraction means is a combination of two or more of force transmission light, fluorescence, bioluminescence, chemiluminescence, Raman spectroscopy, and infrared. High-throughput imaging device.
- Device 17 The device according to any one of the devices 1 to 16, further comprising a culture means for continuously culturing cells in the biological sample, wherein the control means is present in a plurality of imaging regions.
- a high-throughput imaging apparatus characterized in that interval imaging conditions are set according to the imaging timing of each cell during each culture period.
- the sample information related to the sample container 25C set in each sample installation hole 52C is stored in the internal memory of the computer 109C, and is called up when setting the time imaging interval imaging conditions. Imaging by the controller 102C is executed. Information on the determined imaging conditions is notified to the computer 109C via the controller 102C, stored in the memory of the computer 109C in association with the sample information, and can be displayed on the user interface as appropriate. .
- the ID of the sample container 25C of the circular tray 26C is assigned to the user interface of the computer 109C. It is programmed to respond.
- the user interface input means optical mouse, keyboard, touch panel, electronic pen, etc.
- a GUI is displayed in the observation preparation state (S1), and stage origin search is executed (S2).
- stage origin search is executed (S2).
- the user can input the sample container to be observed and waits for input (S3), preferably press the directional arrow buttons in “StageZR ⁇ ” and “Stage / Z” on the GUI, While displaying the cell image as a live image window, a cell for which timelabs imaging is desired is searched, and the position is selected on the display screen by the input means. That is, in this example, first, a bright field image and / or a luminescent image as described above is displayed, and then a desired cell, cell group, tissue region, and then a specific part in the cell is designated. Yes.
- the current imaging result or analysis result at any imaging time, even during timelabs imaging.
- observation condition related to the selected observation position is waited (S4), and the user inputs a desired observation condition (S5).
- observation conditions that meet the requirements for example, weak emission wavelength, detection sensitivity, brightness in bright field observation, etc. according to the type of reagent used and experimental conditions
- the power to use LED-G (green) or LED-B (blue) can be selected, and the brightness of LED lighting 41C can be determined. To do.
- the “Cub e” button in the GUI to select the fluorescent cube corresponding to the selected wavelength
- the “Lens” button to determine the magnification changing lens corresponding to the numbered button.
- the “Camera Control” button in the GUI determines the camera's shooting conditions such as the exposure time of the CCD camera and whether or not to perform AE
- the “Image File Name” button determines the image after shooting. Select the file name to save the file, or use the “Time_lapse” button to set all the parameters necessary for the observation conditions such as the timelab interval time and experiment period settings.
- timelabs interval time is a multipoint time lapse (only one point This is the sum of the motorized stage moving time, the shooting time and the control time for shooting the first multi-point when shooting, and the waiting time until immediately before starting the second multi-point shooting. is there.
- Examples of bioluminescence or chemiluminescence include cells or tissues into which a DNA containing a luciferase gene has been introduced as a reporter gene linked downstream of a promoter in a specific gene region of interest. By using cells or tissues in which luciferase is expressed as a reporter, it is possible to detect temporal changes in transcription in real time by detecting luciferase activity at the desired expression site.
- a preferred embodiment is a cell or tissue derived from a vertebrate expressed so that the introduced luminescent gene has a circadian rhythm in peripheral tissues.
- Peripheral tissues include, but are not limited to, liver, lung, and skeletal muscle. These peripheral tissues have been reported to have a circadian rhythm with a phase difference of 7 to 12 hours. The delay pattern of circadian rhythm seems to reflect the normal coordination of biological rhythms of complex mammals composed of multiple organs.
- the information analyzed according to the present embodiment is a compound useful for elucidating the mechanism of jet lag or sleep disorder related to circadian rhythm and for treating circadian rhythm disorder. This is useful for developing mammalian models for use in product screening and testing.
- various tests or screenings can be performed using a transformant or a transgenic mammal containing the DNA of this embodiment that expresses a reporter gene.
- Stimulation includes temperature, light, movement, and other shocks.
- a compound that alters the expression induced by the promoter of a clock gene (for example, Period 1) introduced into the transformant or transgenic mammal of the present embodiment is used as the transformant or transformant. Applicable to methods of testing or screening using diene mammals.
- the central organs (CNS) and peripheral nervous system (PNS), including the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and the liver, lungs, and Other peripheral tissues are included, including but not limited to skeletal muscle. More specifically, it is useful for evaluating the phase relationship and synchronization mechanism of the expression of the clock gene “Period 1” in SCN and peripheral tissues.
- the weak light image for each different desired elapsed time is acquired continuously or intermittently by the light emission microscope according to the present embodiment, the light for each hour related to one or more identical cells.
- the cells have a certain light intensity and do not show the light distribution among the recognized cells, or if the cells are not subjected to a comprehensive evaluation, the cells that should not be analyzed are excluded, so Evaluation can be performed.
- the total value or average value of the light intensities of all the cells subjected to image analysis it becomes possible to perform the evaluation of the analyzed cells as well as the individual cells.
- temporal gene activity can be evaluated for each analyzed pattern. In some cases, it becomes possible to examine the details of changes in the activity of the time gene for each cell with a different pattern.
- analysis is performed with various combinations of fluctuation parameters such as waveform shape (amplitude length, period width, etc.) and waveform intensity (expression amount, activation rate, etc.) of the expression pattern of clock genes. be able to.
- the results of periodic waveform analysis of the expression pattern of the clock gene provide important information for research use such as diagnosis, treatment, growth (or biological development) and industrial (medicine, agricultural, etc.).
- the role played by the embodiment is significant.
- the apparatus of this embodiment accumulates optical data relating to the biological sample containing a large number of cells in a state in which an image can be acquired, and weak light emission generated by the biological sample.
- a weak light image acquisition means for acquiring image information capable of image analysis, and for recognizing individual cells by morphologically analyzing the image information and comprehensively evaluating the light intensity of the weak light for the recognized cells
- image analysis means can perform the evaluation between the plurality of wells within the same field of view or in a predetermined range. Since it can be performed in order, the apparatus of the present embodiment can compare and correlate the results of activity evaluation with different samples or different drugs.
- the holding means may be configured to hold a plurality of independent containers in an addressable manner, whereby the image analysis means is not limited to the field of view of the weak light image acquisition means, and many The above-mentioned evaluation can be performed for the other containers.
- the apparatus according to the present embodiment performs the evaluation according to the time when the image information is acquired.
- various time analysis such as analysis on the same cell for each elapsed time and comparison analysis of cells at different times (identical or different cells) showing specific activity can be performed. Become.
- the apparatus according to the present embodiment further includes a display unit that displays the analysis result of the image analysis unit in association with image information, so that an image corresponding to the analysis result desired to be viewed as an image from the analysis result can be displayed. It can be displayed.
- the display means has a configuration for displaying desired image information as a moving image
- the apparatus of this embodiment can observe a change in activity related to one or more desired cells with a real-time image. become able to.
- a moving image display it is more preferable to enhance the sense of reality by superimposing weak light images of the same cell for each time by image processing.
- multiple time-series images of the same cell are displayed in parallel by frame-by-frame (or even if they are only partially shifted), so that the entire image can be viewed every time. May be.
- illumination light for obtaining a transmitted light (bright field) image may be replaced with excitation light for inducing a fluorescence image.
- excitation light for inducing a fluorescence image it is possible to explain the process of capturing the fluorescent image induced after the illumination of the excitation light as the illumination light as the illumination image.
- a biopsy machine for example, endoscope, CT scan measuring machine equipped with the above-described imaging device.
- Aspect 2 Analytical apparatus (for example, luminometer, cytometer) provided with the above-described imaging apparatus.
- Aspect 3 A biochip manufacturing apparatus provided with the imaging device described above.
- Aspect 4 Image data analysis service using the above-described weak light imaging method.
- Aspect 5 Image information management system using the above-described weak light imaging method.
- Aspect 6 In the above-described weak light imaging method, two imaging cameras connected to an optical filter corresponding to two types (or three or more types) of wavelengths are arranged, and a light beam from the sample is separated by a light separation element. Divide equally (or n equal to or greater than 3) and simultaneously 2 types (or 3 types) depending on each camera.
- the weak light multi-imaging method that accumulates the weak light data of the above and obtains the weak light image for each wavelength that is completely synchronized.
- the light beam from the sample is divided into two equal parts (or three equal to or more than n equal parts) by a light separation element corresponding to two kinds (or three or more kinds) of wavelengths, and after separation
- a light separation element corresponding to two kinds (or three or more kinds) of wavelengths
- Each of the light beams for each wavelength is imaged in the imaging area for each wavelength set on the same (or separate) imaging device (eg, CCD), and two types (or three types) in the entire imaging area
- the weak light multi-imaging method that accumulates the weak light data of the above) at the same time and acquires the weak light image for each wavelength that is completely synchronized.
- Aspect 8 An imaging apparatus for executing the weak light multi-imaging method according to Aspect 6 or Aspect 7.
- Software 1 In the apparatus according to any one of the apparatuses 1 to 17 described above, the control means and the image acquisition means are caused to function so that interval imaging is performed according to the set interval imaging conditions.
- a software for a high-throughput imaging apparatus characterized by comprising a program.
- Software 2 Software for executing the apparatus, service, or system according to any one of the above-described aspects 1 to 8.
- Addendum 1B Linkage with optical conditions determined by high numerical aperture (NA) and magnification and the method or device to be applied, and optimization of the linkage with imaging using weak light Imaging method.
- NA numerical aperture
- Additional Item 2B The method of imaging a biological sample according to Additional Item 1B, wherein the imaging includes a step of setting an interval condition, and a plurality of images related to the biological sample are acquired at different times.
- a method for imaging a biological sample is
- Additional Item 3B An imaging apparatus using the biological sample imaging method described in Additional Item 1B or 2B.
- Additional Item 4B An imaging device that is controlled so as to cooperate with software for analyzing a cell that generates faint light compared to the imaging device according to Additional Item 3B.
- Additional Item 5B The biological sample imaging method according to Additional Item IB or 2B, wherein the biological sample imaging method includes a mode in which improvements or modifications are appropriately included.
- Additional Item 6B An imaging device including an aspect that includes an improved or modified example as appropriate in addition to the imaging device according to Additional Item 3B or 4B.
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Abstract
微弱光を発する生体試料を迅速かつ正確に画像解析する微弱光画像の解析方法などを提供することを課題とする。本発明は、微弱光を発する生体試料を画像解析するにあたり、生体試料の解析すべき対象部位に前記微弱光とは異なる種類の電磁エネルギーを用いて前記対象部位に関する少なくとも一つの基準位置を決定し、前記基準位置に対する前記対象部位に対応する微弱光用の焦点位置を決定し、決定された焦点位置に照準して前記微弱光による画像化を実行し、微弱光画像から必要な測定パラメータの数値を抽出し、抽出したパラメータ数値に基いて対象部位の評価を行うことを特徴とする。
Description
明 細 書
生体試料撮像方法および生体試料撮像装置
技術分野
[0001] 本発明は、微弱光を発する生体試料内の観察対象部位を適切な解像度で解析す るための解析方法および解析装置に関するものである。なお、本発明は、本出願人 による国際出願である PCT/JP2006/319589に記載の方法および装置をこの出 願で準用することにより、本発明においてその記載を取り込んだものとする。
本発明は、微弱光を発する生体試料内の観察対象部位を撮像する生体試料撮像 方法および生体試料撮像装置に関するものである。
本発明は、細胞や組織等の生体試料中における生物学的活性をその活性を極力 損なわないようにして長期間ないし連続的に検出する方法に関する。本発明は、そ の方法により実行される自動化装置のためのソフトウェアも包含する。
背景技術
[0002] [I]今日、蛍光を利用した生物試料のイメージング手法は生命科学の研究にとって、 大きな役割を担っている。特定のタンパク質をマーキングし発光を利用することにより 、細胞内外で起こっている種々の生命現象を観察することが可能となり、また、種々 の生命現象の動的な振る舞レ、などをリアルタイムで知ることができる。特に最近では、 GFP (Green Fluorescent Protein:緑色蛍光タンパク質)などの蛍光タンパク質 を用いることにより、細胞内の構造物のイメージングを安定に且つ容易に実現できる ようになつてきており、種々の生命現象の解明が着実に進みつつある。
[0003] また、生物発光性タンパク質(具体的にはルシフェラーゼゃェクオリンなど)を発現 する発光関連遺伝子を細胞内の種々の機能解析に役立てる(具体的には発光関連 遺伝子をタンパク質発現のレポーター分子として活用する)ことも、しばしば行なわれ るようになってきた。そして、このような機能解析を行なう上で、細胞内の特定の部位 にレンズのフォーカスを合わせて鮮明な画像を描出したり、細胞内に導入した特定の 生物発光性タンパク質からの発光を効率良く受光したりすることは、非常に重要であ る。ところ力 生物試料からの自家発光の光強度は一般に極めて微弱であるので、通
常、生物試料からの発光を肉眼で直接確認できないことが多い。このような微弱な光 を発する試料に対して光学素子(例えば検出系のレンズなど)を調整しても試料内の 特定の部位にレンズのフォーカスを合わせることは、当然、肉眼では困難である。
[0004] ここで、試料容器内の試料に光をフォーカスする方法についてはいろいろ開示され ている。ただし、その何れも、試料からの光を肉眼で(目視で)確認できる場合におけ る方法である。例えば、試料容器の底面位置を検出し、検出した位置情報を元にし て試料容器内の試料に光をフォーカスする方法については特許文献 1や特許文献 2 で開示されている。特許文献 1では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ照 射し、光の照射位置を上下に移動させながら試料容器の底面からの鏡面反射光の 強度を順番に検出し、検出した光の強度に基づいて試料容器の底面位置を検出し、 検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光を フォーカスする。また、特許文献 2では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ 下から斜めに照射し、試料容器の底面からの鏡面反射光の XY平面上でのずれ量を 光検出器で検出し、検出したずれ量に基づレ、て試料容器の光軸上での底面位置を 検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置 に光をフォーカスする。これにより、試料容器内の試料に対物レンズの焦点位置を合 わせることができる。
[0005] また、細胞などの位相物体を明視野で観察する顕微鏡を用いて、対物レンズの位 置を通常の合焦位置から前後にずらして固定してデフォーカスによる高いコントラスト の観察画像を得て細胞を観察する方法が、特許文献 3や特許文献 4に開示されてレ、 る。これにより、位相物体である細胞の観察画像を高いコントラストで得ることができる
[0006] [II]生物学分野や医学分野の研究において、細胞等の生体試料の生物学的活性を レポータアツセィにより検出する技術が広く利用されてきた。レポータアツセィを用い ると、視覚的に調べることが不可能な様様な生物学的活性を可視化することができる 。従来の臨床的な検査は、生体試料から調べたい生体関連物質 (核酸、血液、ホル モン、タンパク質等)のみを種々の分離方法により単離して、その単離した生体関連 物質の量や活性を試薬と反応させていた。しかし、生命体においては、多様な生体
関連物質同士の相互作用こそが真の生物学的活性を示すものである。近年、医療 用薬剤を研究または開発する場合、生きた生体試料中での生物学的活性に対して 最も効果的に作用する薬剤が決定的条件となっている。生きた生体試料を対象とし たレポータアツセィには、生体試料と調べたい生体関連物質とを画像化して、生体試 料内外における動的変化を経時的に観察する必要性が高まってきている。
[0007] 具体的には、レポーター物質としての発光(生物発光、化学発光)や蛍光を用いる 観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的な機能発現を捉える ためにタイムラブスや動画撮像が求められている。現状では、蛍光試料を対象として 撮像した画像による動的変化の観察 (例えば、蛍光を利用したタンパク質 1分子の動 画観察)が行われている。蛍光試料の撮像の場合、励起光を照射し続けることで蛍 光試料力 発せられる光量が時間の経過とともに減少するという性質があるため、定 量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ることが困難であつたが、しかし 、鮮明な、つまり、空間分解能の高い画像を短い露出時間で撮ることができた。一方 、発光試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察においては、発光試料か らの発光が極めて小さいので、発光試料の観察には、イメージ 'インテンシファイアを 装着した CCDカメラを用いて行われていた。発光試料の撮像の場合、励起光を照射 する必要がないため、定量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ること ができた。
[0008] これまで、発光試料の観察にぉレ、ては、発光試料からの発光量の測定が行われて いた。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞の観察では、ルシフェラーゼ 遺伝子の発現の強さ(具体的には発現量)を調べるために、ルシフェラーゼ活性に因 る細胞からの発光量の測定が行われていた。そして、ルシフェラーゼ活性に因る細胞 からの発光量の測定は、まず細胞を溶解した細胞溶解液とルシフヱリンや ATPやマ グネシゥムなどを含む基質溶液とを反応させ、っレ、で基質溶液と反応させた細胞溶 解液からの発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量する、という手順で 行われていた。つまり、発光量は細胞を溶解した後に測定されていた。これにより、あ る時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を細胞全体の平均値として測定すること ができた。ここで、ルシフヱラーゼ遺伝子などの発光遺伝子をレポーター遺伝子とし
て細胞に導入する方法には例えばリン酸カルシウム法ゃリポフエクチン法やエレクト 口ポーシヨン法などがあり、各方法は目的や細胞の種類の違いに応じて使い分けら れている。また、ルシフェラーゼ遺伝子がレポーター遺伝子として導入された細胞に おいてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さをノレシフェラーゼ活性に因る細胞からの 発光量を指標として調べる際、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流 に目的の DNA断片を繋ぐことで当該 DNA断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及 ぼす影響を調べることができ、また、細胞に導入するルシフヱラーゼ遺伝子の転写に 影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターに繋いでルシフェラ ーゼ遺伝子と共発現させることで当該遺伝子の遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子 の発現に及ぼす影響を調べることができる。
[0009] また、時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を捉えるには生きた細胞からの発光 量を経時的に測定する必要がある。そして、生きた細胞からの発光量の経時的測定 は、まず細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を付け、ついで培 養している全細胞集団からの発光量をルミノメーターで一定時間ごとに定量する、と レ、う手順で行われていた。これにより、一定の周期性をもった発現リズムなどを測定す ること力 Sでき、よって、細胞全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉 えることができた。一方、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞 での発現量に大きなばらつきがある。例えば、 HeLa細胞などのクローンィ匕した培養 細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばら つくことがある。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも数個の細胞は応 答している場合がある。このことから、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、 細胞全体からではなく個々の細胞から発光量を経時的に測定することが重要である 。そして、顕微鏡を用いた生きた個々の細胞からの発光量の経時的測定は、各細胞 の発光が極めて弱レ、ので、液体窒素温度レベルの冷却 CCDカメラで長時間露光し たり、イメージ'インテンシファイアを装着した CCDカメラとフオトンカウンティング装置 とを用いたりして行われていた。これにより、生きた個々の細胞における発光遺伝子 の発現量の経時的な変化を捉えることができた。
[0010] 以上の説明において、例えば蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として用いる遺伝
子発現の解析方法および装置は特許文献 5に開示されている。また、ルミノメーター を用いて生物発光による遺伝子発現の解析方法および装置は特許文献 6に開示さ れている。
[0011] 特許文献 1 : :特表 2002— ■541430号公報
特許文献 2 : :特表 2002— ■542480号公報
特許文献 3 : :特開 2004— ■354650号公報
特許文献 4 : :特開 2005— ■173288号公報
特許文献 5 : :特表 2004— ■500576号公報
特許文献 6 : :特開 2005— ■118050号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] [I]し力 ながら、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の 発光観察を行う場合、試料を設置した時点では試料からの発光が微弱あるいは未だ 起こってないので、従来の技術では、試料を設置した時点では当該観察対象部位に 合うような対物レンズの焦点位置を決定することができず、ゆえに、対物レンズの焦点 位置を当該観察対象部位に合わせることができず、生体試料の解析を迅速かつ正 確に行うことができな力、つた、という問題点があった。
[0013] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、微弱光による生体試料の 解析を迅速かつ正確に行う微弱光画像の解析方法および解析装置を提供すること を目的とする。
また、本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、微弱光による生体試 料の撮像を迅速且つ正確に行う生体試料撮像方法および生体試料撮像装置を提 供することを目的とする。
[0014] [II]しかしながら、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、発光試料からの発光量 が極めて少ないため、どうしても肉眼では見ることが出来ず、 CCDのような蓄積型の 撮像手段を用いて光量を蓄積しなければ画像生成することができない、とレ、う制約が 有る。しかも、単一の細胞ないし組織を構成する細胞群において、細胞 1個当りから 発生する微弱光は、あまりに弱過ぎるので、鮮明な画像を撮るのに必要な露出時間
が長くなる、という問題点があった。即ち、撮像の時間間隔は単位時間あたりの光量 に制約されるため、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、鮮明な画像を長い時間 間隔で、例えば 60分間隔で、経時的に撮ることができても、 10〜30分程度の短い露 光時間、ひいては 1〜5分の露光でリアルタイムに撮像することはできな力、つた、とい う問題点があった。特に生細胞を長時間(例えば、 50分以上)露光すると、培養容器 等の支持体上でさえ細胞自身が動レ、て鮮明な画像を形成できなレ、場合がある。一 般に、画像を用いた解析を行なうためには、正確な輪郭を認識できなければならなレ、 。従って、画像が不鮮明なときは解析結果が不正確である可能性が有る。
[0015] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、発光量の少ない発光試料 でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる生体 試料の撮像方法および撮像装置を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0016] [I]上述した課題を解決し、 目的を達成するために、本発明にかかる微弱光画像の 解析方法は、微弱光を発する生体試料を画像解析するにあたり、生体試料の解析す べき対象部位に前記微弱光とは異なる種類の電磁エネルギーを用いて前記対象部 位に関する少なくとも一つの基準位置を決定し、前記基準位置に対する前記対象部 位に対応する微弱光用の焦点位置を決定し、決定された焦点位置に照準して前記 微弱光による画像化を実行し、微弱光画像から必要な測定パラメータの数値を抽出 し、抽出したパラメータ数値に基いて対象部位の評価を行うことを特徴とする。また、 本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、前記基準位置の決定が、前記電磁エネ ルギ一による基準画像の取得を含むことを特徴とする前記に記載の微弱光画像の解 析方法である。また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、前記基準画像の取 得が、前記対象部位を含む試料領域について画像取得することを特徴とする前記に 記載の微弱光画像の解析方法である。また、本発明にかかる微弱光画像の解析方 法は、前記電磁エネルギーが、生体へのダメージが少ない可視光、近赤外線、超音 波、磁力線のいずれかであることを特徴とする前記に記載の微弱光画像の解析方法 である。
[0017] また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、直接的可視化が困難な微弱光
を発する生体試料に対し可視化容易な照射光を照射して可視化し、前記可視化さ れた生体試料がもたらす基準画像にっレ、て、前記基準画像からの光を受光する対 物レンズの近点側の焦点位置および/または対物レンズの遠点側の焦点位置を基 準位置として、前記生体試料の解析すべき対象部位から発する微弱光の画像化に 必要な距離に相当する位置を前記対物レンズによる微弱光用の焦点位置として決定 し、決定した微弱光用の焦点位置に前記対物レンズを照準して必要な画像が得られ るまで微弱光を蓄積することにより前記生体試料の微弱光画像を形成し、形成した 前記微弱光画像から前記対象部位における微弱光の有無または光強度を評価する ことを特徴とする。また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、直接的可視化 は、光学的画像形成のための露光時間が 10秒以上である場合に可視化が困難であ ると定義することを特徴とする前記に記載の微弱光画像の解析方法である。また、本 発明にかかる微弱光画像の解析方法は、前記照射光に基づく画像シグナルは透過 光または蛍光であることを特徴である前記に記載の微弱光画像の解析方法である。
[0018] ここで、本発明にかかる微弱光画像の解析方法として、前記に記載の微弱光画像 の解析方法において、前記微弱光用の焦点位置の決定は、前記生体試料の観察部 位ごとに行うのが好ましい。また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、前記基 準位置と前記焦点位置は、対物レンズの同一のビーム経路上で決定される前記に 記載の微弱光画像の解析方法である。
[0019] また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法として、前記に記載の微弱光画像の 解析方法において、前記微弱光画像の取得を検査項目に応じた複数の時刻におい て実行することにより複数の微弱光画像を蓄積し、蓄積された複数の前記微弱光画 像における観察対象部位を照合し、照合された複数の微弱光画像を時刻ごとに比較 するのが好ましい。
[0020] また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法として、前記に記載の微弱光画像の 解析方法にぉレ、て、前記基準画像と前記微弱光画像のそれぞれの焦点位置を比較 し設定された距離範囲を外れた場合には、基準画像および Zまたは微弱光画像の 取得を再度実行するのが好ましい。なお、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は 、前記微弱光画像の評価が、前記基準画像からの測定パラメータの取得をさらに含
んでおり、前記基準画像力 の測定データと関連付けて前記微弱光パラメータの評 価を行うことを特徴とする。また、変形例としての本発明にかかる微弱光画像の解析 方法は、前記基準画像における対象部位の輪郭情報に関連付けて前記微弱光画 像を評価することにより、 2以上の異なる種類の画像を用いた画像処理を組み合わせ ることによって、微弱光に関する評価能力を最大限に引き出すようにしてもよい。
[0021] また、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、評価が、前記対象部位の輪郭に 相当する面積当たりの微弱光強度である前記に記載の微弱光画像の解析方法であ る。また、評価は、本発明にかかる微弱光画像の解析方法として、前記対象部位の 輪郭における微弱光の位置または分布を決定することを特徴とする前記に記載の微 弱光画像の解析方法であってもよレ、。
[0022] また、本発明の別態様としての微弱光画像の解析方法は、前記生体試料が複数の 収容部に個別に収容されており、前記基準位置を個々の収容部ごとに実行すること を特徴とする前記に記載の微弱光画像の解析方法である。この収容部には、複数の 収容部であるゥエルを一体化したマイクロプレートが挙げられる。また、複数の収容部 が別体に載置され、必要により搬送されている場合も含まれる。本発明は、複数の収 容部に収容された生体試料力 の微弱光を評価するのに適した解析方法を提供す る。ここで、本発明にかかる微弱光画像の解析方法として、前記微弱光画像の取得 を複数の収容部を含む広角視野で実行することを特徴とする前記に記載の微弱光 画像の解析方法を用いれば、微弱光画像を収容部ごとに取得する必要がなくなるだ けでなく、収容部ごとの微弱光の変化を逃すことなく評価できる。本発明にかかる微 弱光画像の解析方法は、前記微弱光画像を光学的および/または電気的に拡大す ることにより、前記対象部位から測定パラメータの取得を行うことを特徴とする前記に 記載の微弱光画像の解析方法である。
[0023] 以上の本発明にかかる微弱光画像の解析方法においては、本発明にかかる微弱 光画像の解析方法として、前記生体試料は生きた細胞または組織であることを特徴 とし、これによつて、細胞学的ないし遺伝学的な解析を可能にする点で好ましい。ま た、本発明にかかる微弱光画像の解析方法は、前記微弱光が、生物発光性タンパク 質の発現に伴う発光であることを特徴とする前記に記載の微弱光画像の解析方法で
あり、これによつて、細胞ごとの遺伝子発現の解析を可能にする点で好ましい。
[0024] また、本発明は生体試料撮像方法に関するものであり、本発明に力かる請求項 1に 記載の生体試料撮像方法は、複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容され た微弱光を発する生体試料を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像方法であ つて、前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および /または前記対物レンズを移動し、前記対物レンズの近点側の焦点位置および Zま たは前記対物レンズの遠点側の前記焦点位置を計測し、計測した前記焦点位置に 基づいて、前記所望の前記収容部に収容された前記生体試料内の観察対象部位に 合うような前記対物レンズの前記焦点位置を決定し、決定した前記焦点位置に前記 対物レンズの前記焦点位置を合わせ、前記対物レンズを介して前記生体試料を撮 像することで当該生体試料の発光画像を取得すること、を特徴とする。
[0025] また、本発明にかかる請求項 2に記載の生体試料撮像方法は、請求項 1に記載の 生体試料撮像方法にぉレ、て、前記対物レンズの視野内に前記所望の前記収容部が 収まるまで前記基板および/または前記対物レンズを移動した際、当該基板および /または当該対物レンズの移動先での位置を計測し、計測した前記移動先での前 記位置に関する移動先位置情報を当該所望の前記収容部を識別するための収容 部識別情報と関連付けて記憶することを特徴とする。
[0026] また、本発明は生体試料撮像方法に関するものであり、本発明にかかる請求項 3に 記載の生体試料撮像方法は、複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容され た微弱光を発する生体試料を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像方法であ つて、前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および /または前記対物レンズを移動する移動ステップと、前記生体試料へ光を照射する 光照射ステップと、前記対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更ステップと、 前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を計測する焦点位置計測ステップと 、前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて、前記光照射ステップで光が 照射された前記生体試料を撮像する光照射試料撮像ステップと、前記光照射試料 撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて当該撮像画像を特徴付ける特徴量を 算出する特徴量算出ステップと、前記焦点位置変更ステップ、前記焦点位置計測ス
テツプ、前記光照射試料撮像ステップおよび前記特徴量算出ステップを繰り返し実 行する実行ステップと、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の前記焦点位置 から、前記実行して蓄積した複数の前記特徴量に基づいて、少なくとも 1つの前記焦 点位置を選出する焦点位置選出ステップと、前記焦点位置選出ステップで選出した 前記焦点位置に基づいて、前記所望の前記収容部に収容された前記生体試料内の 観察対象部位に合うような前記対物レンズの前記焦点位置を決定する焦点位置決 定ステップと、前記焦点位置決定ステップで決定した前記焦点位置に前記対物レン ズの前記焦点位置を合わせる焦点位置合わせステップと、前記対物レンズを介して 前記生体試料を撮像することで当該生体試料の発光画像を取得する発光画像取得 ステップと、を含むことを特徴とする。
[0027] また、本発明にかかる請求項 4に記載の生体試料撮像方法は、請求項 3に記載の 生体試料撮像方法において、前記移動ステップは、前記対物レンズの視野内に前 記所望の前記収容部が収まるまで前記基板および/または前記対物レンズを移動 し、当該基板および/または当該対物レンズの移動先での位置を計測し、計測した 前記移動先での前記位置に関する移動先位置情報を当該所望の前記収容部を識 別するための収容部識別情報と関連付けて記憶することを特徴とする。
[0028] また、本発明は生体試料撮像装置に関するものであり、本発明にかかる請求項 5に 記載の生体試料撮像装置は、複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容され た微弱光を発する生体試料を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像装置であ つて、前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および /または前記対物レンズを移動する移動手段と、前記試料へ光を照射する光照射手 段と、前記対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更手段と、前記対物レンズ の前記焦点位置を計測する焦点位置計測手段と、前記生体試料を撮像する試料撮 像手段と、前記試料撮像手段で撮像した撮像画像に基づいて当該撮像画像を特徴 付ける特徴量を算出する特徴量算出手段と、前記焦点位置変更手段、前記焦点位 置計測手段、前記試料撮像手段および前記特徴量算出手段を繰り返し実行させる よう、各々の手段を制御する制御手段と、前記制御手段で前記各々の手段を繰り返 し実行させたことにより蓄積した複数の前記焦点位置から、前記繰り返し実行させた
ことにより蓄積した複数の前記特徴量に基づいて、少なくとも 1つの前記焦点位置を 選出する焦点位置選出手段と、前記焦点位置選出手段で選出した前記焦点位置に 基づいて、前記所望の前記収容部に収容された前記生体試料内の観察対象部位に 合うような前記対物レンズの前記焦点位置を決定する焦点位置決定手段と、を備え たことを特徴とする。
[0029] また、本発明にかかる請求項 6に記載の生体試料撮像装置は、請求項 5に記載の 生体試料撮像装置において、前記移動手段で前記基板および zまたは前記対物レ ンズを移動した際の当該基板および Zまたは当該対物レンズの移動先での位置を 計測する移動先位置計測手段と、前記移動先位置計測手段で計測した前記移動先 での前記位置に関する移動先位置情報を、前記所望の前記収容部を識別するため の収容部識別情報と関連付けて記憶する記憶手段とをさらに備えたことを特徴とする
[0030] [II]上述した課題を解決し、 目的を達成するために、本発明に力かる生体試料の撮 像方法は、高開口数 (NA)と拡大倍率とで決まる光学条件と適用すべき方法又は装 置と連携して、微弱光による撮像との連携を最適化したことを特徴とする。ここで、前 記撮像がインターバル条件の設定を行う工程を含み、生体試料に関する複数の画像 を異なる時間において複数取得するのが好ましい。ここで、前記方法においては、微 弱光を発生する細胞を少なくとも含んでいることにより、細胞を含む画像解析も可能 になる。また、本発明は、上記方法を用いる撮像装置でもある。この装置は、微弱光 を発生する細胞を解析するためのソフトウェアと連携するのが好ましい。
[0031] なお、上記の撮像装置および撮像方法を具体化した発光試料撮像方法は、発光 試料を撮像する発光試料撮像方法にぉレ、て、開口数 (NA)および投影倍率 ( β )で 表される(NA÷ j3 )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上である対物レン ズを用いることを特徴とする。また、本発明は発光細胞撮像方法に具体化することが でき、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法にお いて、開口数 (NA)および投影倍率(/3 )で表される(NA÷ j3 )の 2乗の値が 0. 01 以上、好ましくは 0. 039以上である対物レンズを用いることを特徴とする。
[0032] また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明に力、かる対物レンズは、発
光試料を撮像する上記の発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、開口数(
NA)および投影倍率( )で表される(NA÷ )の 2乗の値が 0· 01以上、好ましくは 0. 039以上であることを特徴とする。
[0033] また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明に力、かる対物レンズは、ルシ フェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する上記の発光細胞撮像方法で用い る対物レンズにぉレ、て、当該対物レンズの開口数 (NA)および投影倍率( /3 )で表さ れる(NA÷ j3 )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上であることを特徴と する。
[0034] また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明に力、かる対物レンズは、発 光試料を撮像する上記の発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、当該対 物レンズおよび/または当該対物レンズを包装する包装容器に、開口数 (NA)およ び投影倍率( /3 )で表される(NA+ β )の 2乗の値を表記したことを特徴とする。
発明の効果
[0035] [I]本発明にかかる微弱光画像の解析方法によれば、生体試料の解析を迅速かつ 正確に行うことができる。また、本発明にかかる生体試料撮像方法および生体試料 撮像装置によれば、基板が有する各収容部(例えばマイクロプレートが有する各ゥェ ノレ)に収容された生体試料の撮像を、迅速且つ正確に行うことができる。また、本発 明に力かる生体試料撮像方法および生体試料撮像装置によれば、対物レンズの視 野内に所望の収容部が収まるまで基板および Ζまたは対物レンズを移動した際、当 該基板および/または当該対物レンズの移動先での位置を計測し、計測した移動先 での位置に関する移動先位置情報を当該所望の収容部を識別するための収容部識 別情報と関連付けて記憶するので、当該移動先位置情報および当該収容部識別情 報に基づいて、対物レンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および/また は対物レンズを移動することができる。
[0036] [II]本発明にかかる撮像装置および撮像方法を具体化した発光試料撮像方法では 、開口数 (ΝΑ)および投影倍率( )で表される(NA÷ j3 )の 2乗の値が 0· 01以上、 好ましくは 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上である対物レンズを用いる。これにより 、発光量の少ない発光試料 (例えば、発光タンパク質 (例えば、導入された遺伝子(
例えばノレシフェラーゼ遺伝子)から発現された発光タンパク質)や、発光性の細胞ま たは発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体 (例えば動物 や臓器など)など)でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮る こと力 Sできる、という効果を奏する。また、本発明にかかる撮像装置および撮像方法を 具体化した発光細胞撮像方法では、開口数 (NA)および投影倍率( β )で表される( ΝΑ+ /3 )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上である対物レンズを用い るので、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な画像を 短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる、という効果を奏する。
[0037] また、本発明にかかる撮像装置および撮像方法を具体化した発光試料撮像方法 および発行細胞撮像方法で用いる対物レンズは、開口数 (ΝΑ)および投影倍率( β )で表される(NA÷ j3 )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上であるので、 発光量の少ない発光試料 (例えば、発光タンパク質 (例えば、導入された遺伝子 (例 えばノレシフェラーゼ遺伝子)から発現された発光タンパク質)や、発光性の細胞また は発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体 (例えば動物や 臓器など)など)でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮るこ とができる、という効果を奏する。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光 細胞を撮像対象として、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮る こと力 Sできる、という効果を奏する。
[0038] また、本発明にかかる撮像装置および撮像方法を具体化した発光試料撮像方法 および発行細胞撮像方法で用いる対物レンズは、従来の対物レンズと比較して、開 口数が大きいことと、倍率が小さいことの両方を備えているので、この対物レンズを用 いれば広範囲を分解能よく撮像することができる。これにより、例えば移動する発光 試料や広い範囲に分布する発光試料を撮像対象とすることができる。また、この対物 レンズは、当該対物レンズおよび Zまたは当該対物レンズを包装する包装容器 (パッ ケージ)に、開口数 (NA)および投影倍率( /3 )で表される(NA+ β )の 2乗の値 (例 えば 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上)を表記した。これにより、例えば発光画像観 察を行う者は、表記された (ΝΑ+ /3 )の 2乗の値を確認すれば、発光試料を短い露 出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するのに適した対物レンズを容易に選択する
こと力 Sできる、という効果を奏する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、物点、光学系の入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、対物レンズを移動させながら CCDカメラで細胞を撮像した時の CCD力 メラの各画素の出力信号の変化の仕方の一例、および当該変化の仕方に対応させ て模式的に書いたシャーレの位置および細胞の位置を示す図である。
[図 3]図 3は、図 2の位置 αで細胞を撮像した時の CCDカメラの特定の画素列に含ま れる各画素の光強度の分布、および図 2の位置 で細胞を撮像した時の CCDカメラ の特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布を示す図である。
[図 4]図 4は、 2つの照明画像を撮像した時の対物レンズの光軸上での焦点位置およ び発光画像を撮像した時の対物レンズの光軸上での焦点位置に関する測定結果を 示す図である。
[図 5]図 5は、対物レンズの焦点位置がシャーレの外側底面の位置に合った時の対 物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。
[図 6]図 6は、近点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示す 図である。
[図 7]図 7は、図 6の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図で ある。
[図 8]図 8は、中心点で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示す 図である。
[図 9]図 9は、図 8の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図で ある。
[図 10]図 10は、遠点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示 す図である。
[図 11]図 11は、図 10の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す 図である。
[図 12]図 12は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の基本構成を示す図である。
[図 13]図 13は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の具体的一例を示す図
である。
園 14]図 14は、試料ステージ 17付近に配設された各部の構成の一例を示す図であ る。
[図 15]図 15は、開口ユニット 24の構成および対物レンズ 30の瞳における開口の投 影像の一例を示す図である。
[図 16]図 16は、開口ユニット 24の別の構成および対物レンズ 30の瞳における開口 の投影像の一例を示す図である。
園 17]図 17は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の別の具体的一例を示 す図である。
[図 18]図 18は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1が行う焦点位置決定処理の一 例を示すフローチャートである。
[図 19]図 19は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1が行う焦点位置再決定処理の 一例を示すフローチャートである。
[図 20]図 20は、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の具体的一例を示す図 である。
[図 21]図 21は、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の別の具体的一例を示 す図である。
[図 22]図 22は、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の別の具体的一例を示 す図である。
[図 23]図 23は、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の照明画像および蛍光画像 を示す図である。
[図 24]図 24は、プラスミドベクターを導入した HeLa細胞の照明画像および発光画像 を示す図である。
園 25]図 25は、選定した番号 1の HeLa細胞からの発光強度の時間変化を示す図で ある。
園 26]図 26は、本実施形態に力、かる発光試料撮像方法を実施するための装置の構 成の一例を示す図である。
[図 27]図 27は、 (NAZ β )の 2乗の値を表記した対物レンズ 2Αの一例を示す図であ
る。
園 28]図 28は、図 26に示した微弱光標本撮像装置を遮光装置内に配置して外部か ら自動制御を行う場合の構成を示す図である。
園 29]図 29は、図 28に示したサンプル 1Bを内部に保持し環境条件が可変な収容器 の構成を示す図である。
[図 30]図 30は、本実施形態の応用例としてのハイスループットな撮像装置に関する 全体構成を示す概念図である。
[図 31]図 31は、本実施形態に適用可能な培養装置と顕微鏡装置を一体化した本発 明の撮像装置の内部構成図である。
園 32]図 32は、ハイスループットな撮像装置における電気的に制御可能なユニットを ブロック図に示したものである。
[図 33]図 33は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装 置 1の構成の具体的一例を示す図である。
[図 34]図 34は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装 置 1の構成の具体的一例を示す図である。
[図 35]図 35は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装 置 1の構成の具体的一例を示す図である。
[図 36]図 36は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装 置 1の構成の具体的一例を示す図である。
園 37]図 37は、第 3実施形態に力かる検査システムの構成の具体的一例を示す図 である。
園 38]図 38は、第 3実施形態に力かる検查システムで用いるマイクロプレートの構成 の具体的一例を示す図である。
園 39]図 39は、第 3実施形態に力かる検查システムの変形例の構成の具体的一例 を示す図である。
[図 40]図 40は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装 置 1が行う生体試料撮像 '解析処理の一例を示すフローチャートである。
園 41]図 41は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装
置 1が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
符号の説明
[0040] 1 焦点位置決定装置
10 試料(生体細胞)
10a 観察対象部位
20 光照射部 (光源)
30 対物レンズ
40 焦点位置変更部 (対物レンズ z軸移動機構)
50 焦点位置計測部
60 試料撮像部(CCDカメラ)
70 情報処理装置(パーソナルコンピュータ)
70a 制御部
70al 特徴量算出部
70a2 焦点位置選出部
70a3 焦点位置決定部
70a4 特徴量比較部
70a5 焦点位置再決定部
70b 記憶部
70b 1 撮像画像データベース
70b2 焦点位置管理ファイル
80 励起光照射部 (励起用光源)
発明を実施するための最良の形態
[0041] [I]以下に、本発明にかかる微弱光画像の解析方法および解析装置ならびに生体試 料撮像方法および生体試料撮像装置の実施の形態 (第 1実施形態、第 2実施形態 および第 3実施形態)を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によ りこの発明が限定されるものではない。
[0042] [第 1実施形態]
[1.本発明の基本原理]
まず、本発明の基本原理について図を参照して詳細に説明する。本発明は、基準 となる対物レンズの焦点位置を決定し、決定した焦点位置を基準として対物レンズの 近点側の焦点位置(略焦点位置)および/または対物レンズの遠点側の焦点位置( 略焦点位置)を計測し、計測した焦点位置に基づいて試料内の観察対象部位に合う ような対物レンズの焦点位置を決定し、決定した焦点位置に対物レンズの焦点位置 を合わせる(移動する)。
[0043] 具体的には、本発明は、(1)試料へ光を照射し、(2)例えば試料の位置および/ま たは対物レンズの位置を光軸方向に移動および Zまたは対物レンズの焦点距離を 変更(この場合は可変焦点レンズを採用する。)することで、対物レンズの焦点位置を 例えば一定量だけ変更し、(3)変更した焦点位置を計測し、 (4)変更した焦点位置 にて、光が照射された試料を、 CCDカメラを用いて撮像し、(5)撮像した撮像画像に 基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量 (例えば、撮像画像のコントラスト、撮像画像 の輝度の積分値、撮像画像の輝度分布から得られる統計量、撮像画像における所 定の閾値を超えた輝度を有する画素数と全画素数との比など)を算出し、 (6) (2)〜( 5)を繰り返し実行し、 (7)実行して蓄積した複数の焦点位置 (対物レンズの焦点位置 を表す光軸上の座標値)から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくと も 1つの焦点位置(具体的には対物レンズの近点側の焦点位置および/または対物 レンズの遠点側の焦点位置)を選出し、(8)選出した焦点位置に基づいて、試料内 の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し、 (9)例えば試料の位 置および/または対物レンズの位置を光軸方向に移動および/または対物レンズの 焦点距離を変更 (この場合は可変焦点レンズを採用する。)することで、決定した焦 点位置に対物レンズの焦点位置を合わせる(移動する)。
[0044] ここで、本発明は、前記の(7)において、実行して蓄積した複数の焦点位置から、 実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、 2つの焦点位置 (具体的には対物レン ズの近点側の焦点位置(略焦点位置)および対物レンズの遠点側の焦点位置(略焦 点位置))を選出し、前記の(8)において、選出した 2つの焦点位置に基づいて、当 該 2つの焦点位置の中央位置(略中央位置)を、試料内の観察対象部位に合うような 対物レンズの焦点位置として決定してもよレ、。
[0045] また、本発明は、前記の(7)において、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実 行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、 1つの焦点位置 (具体的には対物レンズ の近点側の焦点位置(略焦点位置)または対物レンズの遠点側の焦点位置(略焦点 位置))を選出し、前記の(8)において、選出した 1つの焦点位置および予め定めた 距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、試料内の観察対 象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。
[0046] また、本発明は、(10)前記の(8)で決定した焦点位置にて、試料の発光画像を C CDカメラを用いて撮像し、(11)撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、 (12 )前記の(8)で決定した焦点位置を変更し、 (13)変更した焦点位置にて試料の発光 画像を CCDカメラを用いて撮像し、 (14)撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算 出し、 (15) (11)で算出した特徴量と(14)で算出した特徴量とを比較し、(16)比較 した結果、前記の(14)で算出した特徴量の方が大きかった場合には、(12)で変更 した焦点位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再 度決定してもよい。
[0047] また、本発明は、前記の(1)で用いる光源を含む照明光学系の瞳位置に開口を例 えば光軸に対して偏芯させて配置してもよぐまた、前記の(1)で用いる光源を含む 照明光学系に狭帯域通過フィルターを配置してもよい。また、本発明は、前記の(1) で用いる光源として、単色の可視光を発するものを用いてもよい。また、本発明は、試 料として、生体細胞や組織などを用いてもょレ、。
[0048] ここで、試料として生体細胞を用いた場合を一例として、生体細胞の位相分布に比 例したコントラストを撮像画像 (照明光による画像)に発生させる原理について、図 1を 参照して説明する。図 1は、物点、光学系の入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示 す図である。
[0049] 合焦位置に生体細胞(物体)を配置してから物体へ光を照射すると、図 1に示すよう に、物点から出た光は実線で示したように球面状に広がって入射瞳に入射し、入射 瞳に入射した光は射出瞳から射出し、射出瞳から射出した光は実線で示したように 球面状の収束光となって結像面に集光することで、最終的に物体の像が形成される 。なお、像が形成されるまでの過程で、光学系を通過する各光線の間に光路差 (位
相差)は生じず、像にボケは現れない。次に、物点を点線に示す位置に移動してから 物体へ光を照射すると、図 1に示すように、物点から出た光は点線で示したように球 面状に広がって入射瞳に入射し、入射瞳に入射した光は射出瞳から射出し、射出瞳 力 射出した光は点線で示したように球面状の収束光となって移動後の結像面に集 光することで、最終的に物体の像が形成される。以上より、移動後の結像面位置を観 察点として物体を観察すれば光学系を通過する各光線の間に光路差 (位相差)は生 じないが、当初の結像面位置を観察点として物体を観察すると各光線の間に光路差 (位相差)が生ずる。
[0050] また、生体細胞は、通常、光学的に位相物体として取り扱うことができる。生体細胞 は、通常、ほぼ同じような形状となっている。ゆえに、例えばシャーレ内に分布してい る培養生体細胞へ照明光を入射すると、生体細胞が回折格子のような役割を演じて 、生体細胞の形状に依存して特有の方向に照射光が回折し、回折光が観察される。 すなわち、シャーレ内の細胞へ特定の方向から照明光を入射すると、細胞に因り入 射光に回折が起こり、入射光の方向に 0次回折光 (透過光)が発生し、更に透過光に 対し特定の角度の方向に 1次回折光が発生する。
[0051] 以上より、生体細胞を光学系の合焦位置からずらした位置に配置して光学系を透 過する各光線の間に位相差を生じさせることができる。また、観察光学系の合焦位置 から前後に外れた位置で生体細胞を観察することにより、生体細胞を透過した光と生 体細胞で回折した光との間に、合焦位置からのずれ量 (デフォーカス量)に応じた位 相差を生じさせることができる。具体的には、対物レンズの焦点位置が通常の観察に おける合焦位置とされている位置に合うように対物レンズを光軸に沿って移動させ、 当該移動させた位置から対物レンズをさらに微小量だけ移動させることで、観察光学 系の透過する各光線の間に、移動量に比例した位相差を生じさせることができる。な お、この位相差は、対物レンズの最大 NAを通過する光線で最大となる。また、この時 、偏射照明により、回折光の一部は対物レンズの NA外に回折されて、観察光学系を 透過しなくなるので、屈折光の場合と同様、レリーフ感のあるコントラストの像を形成 すること力 Sできる。
[0052] つまり、これらの現象を利用して、生体細胞の鮮明な、照明光による画像(照明画
像)を得ることができ、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡と同じような観察を行うことが できる。また、結果として、生じた位相差量が位相差観察法で用いている位相膜と等 価な機能を果たし、生体細胞の位相分布に比例したコントラストを観察画像に与える ことができ、無色透明な生体細胞を高いコントラストで観察することができるようになる
[0053] なお、より高いコントラストで生体細胞を観察する場合、観察光学系の倍率を低くす れば、観察光学系を通過する回折光の角度が制限されるので、観察画像のコントラ ストを高くすることができる。
[0054] また、生体細胞などの位相物体を観察する場合、位相物体の位相分布に比例した コントラストは、位相物体の位相量および透過光と回折光との間に与える位相差量に 比例する。また、透過光と回折光との間の角度は位相物体の形状に依存して変わる 。さらに、透過光と回折光との間の角度が変わると、同じデフォーカス量でも 2つの光 束の間に発生する位相差量が異なってくる。そこで、顕微鏡の照明光学系の瞳位置 で開口を照明光学系の光軸に対して偏芯させて配置することにより、物体に対し特 定の角度で照射する照明光を生成することができる。そして、開口を偏芯させている 分、物体への入射光の方向に透過する透過光より角度を持たせた回折光を、光学系 の入射瞳に入射させることができるので、透過光と回折光との位相差をさらに大きく すること力 Sできる。換言すると、開口を照明光学系の光軸から偏芯させて配置するこ とにより、透過光より回折光にさらに角度を持たせることができるので、透過光と回折 光との位相差をより大きくすることができる(特開 2004— 354650号公報参照)。つま り、これらの方法で透過光と回折光との位相差を大きくすれば、観察画像のコントラス トをより高くすること力 Sできる。
[0055] また、デフォーカスによって生じる各光線間の位相差については、物体が観察光学 系の合焦位置力 近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合とで、その符号が変 わる。ゆえに、デフォーカスにより、物体の高コントラスト画像を光軸上の 2箇所で得る こと力 Sできる。また、画像のコントラストについては、培養細胞等の位相物体を観察光 学系の合焦位置力 近点側にずらして観察した画像と遠点側にずらして観察した画 像とで、当該位相物体の位相分布に相当して反転する。また、シャーレの底面に付
着したゴミ等からの光を吸収する物体は位相物体ではなくなるので、デフォーカスに よって当該物体に位相差を与えても画像のコントラストに変化は生じなレ、。従って、デ フォーカスによって、位相物体とそうでない物体との区別を明確に行なうことができる 。そこで、近点側にずらして撮像した画像および遠点側にずらして撮像した画像に対 して画像間演算を行うことにより、デフォーカスによって与えられる位相差に影響され ない画像成分を分離することができる。特に、 2つの画像の各画素間で差演算を行な うことにより、物体の位相分布に相当する画像成分のコントラストを 2倍にすることがで きるので、ゴミゃ異物、照明ムラなどの位相情報をもたない画像成分を無くすことがで きる。つまり、これらの方法で観察画像のコントラストをより高くすることができる。
[0056] つぎに、対物レンズを移動させながら CCDカメラで生体細胞を撮像した時の CCD カメラの各画素からの出力信号 (各画素が捉えた光の光強度に対応したディジタル 信号)の変化の仕方の一例、および当該出力信号の変化の仕方に基づく生体細胞 内の特定の部位 (観察対象部位)に合うような対物レンズの焦点位置の決定の仕方 の一例について、図 2や図 3を参照して説明する。試料容器 (シャーレ)に入れられた 培養液に生体細胞を浸した状態で、生体細胞へ照明光を照射し、対物レンズを光軸 (z軸)に沿ってシャーレの下側から上側へ移動させながら CCDカメラで生体細胞を 撮像すると、 CCDカメラの全画素からの出力信号 (光強度、光検出信号)の積分値と 対物レンズの焦点位置(z軸上の座標)との関係は、図 2の(このようになる。また、シ ヤーレの位置および生体細胞の位置を図 2の(A)と対応させて模式的に書くと、図 2 の(B)のようになる。
[0057] 具体的には、対物レンズを光軸に沿って上側へ移動させていくと、 CCDカメラの全 画素からの光強度の積分値は、まず、照射光が強く反射する試料容器の外側底面 の位置で極大且つ最大となる。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動 させていくと、 CCDカメラの全画素からの光強度の積分値は序々に低下し、試料容 器の内側底面の位置で再び極大となる。なお、試料容器の内側底面の位置での積 分値は、試料容器の内側底面とそれに接する培養液との屈折率差が試料容器の外 側底面と空気の接触面との屈折率差に比べて小さレ、ので、試料容器の外側底面の 位置での積分値に比べて小さい。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移
動させていくと、 CCDカメラの全画素からの光強度の積分値は急激に低下し、図 2の (A)で示す位置 αで再び極大となる。当該位置 α力 デフォーカスに因る高いコント ラストの撮像画像が得られる ζ軸上の位置である。また、当該位置 αでは、生体細胞 のほぼ下側の淵の部分(下側辺縁部)に対物レンズの焦点が合っている。そして、対 物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、 CCDカメラの全画素からの 光強度の積分値は低下し、図 2の (A)で示す位置 βで極小となる。当該位置 βでは 、生体細胞のほぼ中央の位置に対物レンズの焦点が合っている。そして、対物レンズ を光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、 CCDカメラの全画素からの光強度の 積分値は増加し、図 2の (A)で示す位置 γで再び極大となる。当該位置 Ίも、デフォ 一カスに因る高いコントラストの撮像画像が得られる ζ軸上の位置である。当該位置 yでは、生体細胞のほぼ上側の淵の部分(上側辺縁部)に対物レンズの焦点が合つ ている。
[0058] つまり、図 2の(A)で示す位置 α力 位置 γまでの領域 (位置 を含む)では、生体 細胞の内部に対物レンズの焦点が合っているので、当該位置 αおよび当該位置 γ に基づいて生体細胞内の特定の部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する こと力 Sできる。また、位置 を生体細胞内の所定の部位に合うような対物レンズの焦 点位置として決定してもよレ、。
[0059] ここで、図 2の(A)で示す位置 αで生体細胞を撮像した時の CCDカメラの各画素 力 の出力信号 (各画素がとらえた光の光強度に対応したディジタル信号)および図 2の(A)で示す位置 βで生体細胞を撮像した時の CCDカメラの各画素からの出力 信号から、予め定めた閾値を越えた出力信号のみを有効な出力信号としてそれぞれ 選択し、選択したそれぞれの出力信号の強度分布を求めた(図 3参照)。図 3は、図 2 の (A)で示す位置ひで生体細胞を撮像した時の CCDカメラの特定の画素列に含ま れる各画素の光強度の分布(図 3の (A) )、および図 2の (A)で示す位置 βで生体細 胞を撮像した時の CCDカメラの特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布( 細胞の内部の中央付近での出力信号の強度分布:図 3の(B) )を示す図である。な お、図 3において点線は閾値を示す。図 3に示す強度分布を統計処理することで、高 レ、コントラストの画像が得られる対物レンズの焦点位置を決定することができる。さら
に、図 3で示す閾値より高い閾値を超えた光強度の画素の数の計算、および計算し た画素の数の全画素数に対する割合 (計算した画素数 ÷全画素数)の算出を、対物 レンズの焦点位置を光軸上で動かしながら実行し、この割合が最も高かった時の対 物レンズの焦点位置を最も高いコントラストの画像が得られる対物レンズの焦点位置 として決定してあよレ、。
[0060] つぎに、高いコントラストの 2つの画像(照明画像)を撮像した時の対物レンズの焦 点位置に基づいて決定した対物レンズの焦点位置力 生体細胞内の中心部位(例 えば発光する部位)にどの程度合っているかを、細胞の発光画像を実際に撮像して 確認した。なお、ここで用いた生体細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子(pGL3 _ control vector :プロメガ社)を、 ImMのルシフェリンを添加して導入した HeLa細胞である 。なお、発光画像は、当該 HeLa細胞を室温で 1分間露出してから撮像したものであ る。
[0061] まず、対物レンズを光軸に沿って移動させながら HeLa細胞を照明光源で照明しな がら撮像し、対物レンズの遠点側で撮像したコントラストの最も高レ、撮像画像(照明画 像)と、対物レンズの近点側で撮像したコントラストの最も高い撮像画像(照明画像)と を選出した。一方、対物レンズを光軸に沿って移動させながら照明を行わずに HeLa 細胞を撮像し、コントラストの最も高い撮像画像 (発光画像)を選出した。そして、選出 した 2つの照明画像を撮像した時の対物レンズ(20倍、 40倍)の光軸上での焦点位 置と、選出した発光画像を撮像した時の対物レンズ (20倍、 40倍)の光軸上での焦 点位置とを計測した。計測結果を図 4に示す。なお、計測した焦点位置は、図 5に示 すように、対物レンズの焦点位置が試料容器 (シャーレ)の外側底面の位置に合った 時の対物レンズの光軸上での位置(基準位置)からの距離と同じである。
[0062] 図 4に示すように、選出した発光画像(図 8の(B) )を撮像した時の対物レンズの焦 点位置(図 4で示す「中心点」の欄に記載の 10. 507、 10. 506 :図 9で示す" Zb")は 、遠点側に対応する照明画像(図 10の (A) )を撮像した時の対物レンズの焦点位置( 図 4で示す「遠点側」の欄に記載の 10. 512、 10. 590 :図 11で示す" Za")および近 点側に対応する照明画像(図 6の (A) )を撮像した時の対物レンズの焦点位置(図 4 で示す「近点側」の欄に記載の 10. 500、 10. 503 :図 7で示す" Zc")の略中央であ
つた。これにより、選出した 2つの照明画像(図 6の(A)および図 10の(A) )を撮像し た時の対物レンズの焦点位置(図 7で示す" Zc"および図 11で示す" Za")に基づい て決定した対物レンズの焦点位置力 細胞内の略中央部位 (例えば発光する部位) に合っていることが確認できた。つまり、上述した計算により、細胞内の略中央部位( 例えば発光する部位)に対物レンズの焦点位置をあわせることができた。なお、図 6 は、近点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像 (A)と発光画像(B)とを示す 図である。図 7は、図 6の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す 図である。図 8は、中心点で撮像した最も高いコントラストの照明画像 (A)と発光画像 (B)とを示す図である。図 9は、図 8の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を 模式的に示す図である。図 10は、遠点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像 (A)と発光画像(B)とを示す図である。図 11は、図 10の画像を撮像した時の対物レ ンズの焦点位置を模式的に示す図である。
[0063] これにて、本発明の基本原理の説明を終了する。
[0064] [2·装置構成]
つぎに、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成について、図 12から図 17を参 照して詳細に説明する。まず、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の基本構成につ いて、図 12を参照して説明する。図 12は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の基 本構成を示す図である。焦点位置決定装置 1は、発光観察を行う際、生体細胞や組 織などの試料 10を設置した時点で、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物 レンズ 30の焦点位置を決定する。焦点位置決定装置 1は、図 12に示すように、光照 射部 20と、対物レンズ 30と、焦点位置変更部 40と、焦点位置計測部 50と、試料撮 像部 60と、情報処理装置 70と、で構成されている。
[0065] 光照射部(光源) 20は試料 10へ光を照射する。光照射部 20は、可視光領域の波 長の光(可視光)を発するインコヒーレント光源であり、具体的にはハロゲンランプ、 L ED、タングステンランプ、水銀ランプなどである。なお、光照射部 20としてレーザー などのコヒーレント光源を用いてもよい。ただし、この場合、コヒーレント光源から発せ られる光(レーザー光など)は、拡散板などを用いてインコヒーレントな光に変えてから 試料 10へ照射される。また、光照射部 20として赤外光を発する光源を用レ、てもよレ、
。この場合、赤外光による焦点決定は照明を行わない状態を維持したままで行えるの で、自家蛍光による画像ノイズの発生を防止することができると共に可視光よりも鮮明 な物体情報を得ることができる。つまり、赤外光による焦点決定には当該焦点決定を 精密に行えるという利点がある。また、検出しょうとする微弱光と波長が一部重複する 光又は当該微弱光と波長が同一の光であっても、当該微弱光に対して有意に強い 光強度で且つ短時間(例えば 0. 5秒以内)に検出可能な光であれば、焦点決定用 の照射光として用いてもょレ、。
[0066] 対物レンズ 30は試料 10の像を形成するためのものである。なお、対物レンズ 30と して可変焦点レンズを用いてもよい。なお、微弱光による画像化を可能にするために 対物レンズは開口数 (NA)および投影倍率( )で表される(NA+ β )の 2乗の値が 0. 01以上、とくに 0. 071以上とするのが好ましい。このような光学条件にすることに より、微弱光による画像を実用的な露光時間(1分〜 90分)で短時間で取得すること ができ、それ以上の露光によって得られる画像よりも鮮明な微弱光画像が得られるの で、微弱光画像による画像解析をより有利なものにする。
[0067] 焦点位置変更部 40は、具体的には試料 10の位置および/または対物レンズ 30の 位置を光軸方向に移動および/または対物レンズ 30の焦点距離を変更することで、 対物レンズ 30の焦点位置を変更する。
[0068] 焦点位置計測部 50は、焦点位置変更部 40と接続され、例えば試料 10の光軸上で の位置、対物レンズ 30の光軸上での位置、対物レンズ 30の焦点距離のうち少なくと も 1つに基づいて、対物レンズ 30の焦点位置を計測する。
[0069] 試料撮像部 60は試料 10を撮像する。試料撮像部 60は、具体的には撮像素子を 有する高感度の CCDカメラである。
[0070] 情報処理装置 70は、具体的には市販のパーソナルコンピュータであり、焦点位置 変更部 40、焦点位置計測部 50および試料撮像部 60と接続されている。情報処理装 置 70は、制御部 70aと記憶部 70bとを備えている。制御部 70aは、当該制御部 70a を統括的に制御する CPU等であり、 OS (Operating System)等の制御プログラム 、各種の処理手順等を規定したプログラムおよび所要データを格納するための内部 メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行するための情報処理
を行う。
[0071] 制御部 70aは、焦点位置変更部 40、焦点位置計測部 50、試料撮像部 60、後述す る特徴量算出部 70alを繰り返し実行するよう、これら各部を制御したり、当該制御部 70aが備える各部を制御したりする。また、キーボードやマウスなどの入力装置や TV モニタなどの出力装置が当該情報処理装置 70と接続されている場合には、制御部 7 Oaは、入力装置で入力された情報を取得したり、出力装置へ情報を出力したりする。 制御部 70aは、特徴量算出部 70alと、焦点位置選出部 70a2と、焦点位置決定部 7 0a3と、特徴量比較部 70a4と、焦点位置再決定部 70a5と、で構成されている。特徴 量算出部 70alは、試料撮像部 60で撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴 付ける特徴量 (例えば、撮像画像のコントラスト、撮像画像の輝度の積分値、撮像画 像の輝度分布から得られる統計量、撮像画像における所定の閾値を超えた輝度を 有する画素数と全画素数との比など)を算出する。焦点位置選出部 70a2は、制御部 70aで各部(具体的には、焦点位置変更部 40、焦点位置計測部 50、試料撮像部 60 、特徴量算出部 70al)を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の焦点位置 (焦 点位置計測部 50で計測した焦点位置)から、繰り返し実行させたことにより蓄積した 特徴量に基づいて、少なくとも 1つの焦点位置を選出する。焦点位置決定部 70a3は 、焦点位置選出部 70a2で選出した焦点位置に基づいて、試料 10内の観察対象部 位 10aに合うような対物レンズの焦点位置を決定する。特徴量比較部 70a4は、特徴 量算出部 70alで予め個別に算出した 2つの特徴量の大小を比較する。焦点位置再 決定部 70a5は、特徴量比較部 70a4で比較した結果に基づいて試料 10内の観察 対象部位 10aに合うような対物レンズの焦点位置を再度決定する。
[0072] 記憶部 70bは、ストレージ手段であり、具体的には、 RAMや ROM等のメモリ装置、 ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用い ること力 Sできる。記憶部 70bは、図示の如ぐ撮像画像データベース 70blと焦点位置 管理ファイル 70b2とを格納する。撮像画像データベース 70blは、撮像画像を一意 に識別するための画像識別情報と、撮像画像と、当該撮像画像を撮像した時の対物 レンズの焦点位置と、当該撮像画像の特徴量と、を相互に関連付けて格納する。焦 点位置管理ファイル 70b2は、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ
の焦点位置(具体的には焦点位置決定部 70a3で決定した焦点位置や焦点位置再 決定部 70a5で再度決定した焦点位置)を格納する。ここで、撮像画像には、照明画 像、発光画像、蛍光画像が含まれる。
[0073] つぎに、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の具体的一例について、図 1 3を参照して説明する。なお、上述した説明と重複するものについては、その説明を 省略する場合がある。図 13は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の具体 的一例を示す図である。図 13に示す焦点位置決定装置 1は、倒立型顕微鏡をべ一 スとする構成であり、図 12に示す焦点位置決定装置 1と同様、微弱光を発する生体 細胞の発光観察を行うために用レ、るものである。図 13に示す焦点位置決定装置 1は 、上述した各部(光照射部 20、対物レンズ 30、焦点位置変更部 40、焦点位置計測 部 50、試料撮像部 60、情報処理装置 70)に加えて、さらに、照明光学系、観察光学 系、接眼レンズ 43などを備えて構成されている。以下、当該焦点位置決定装置 1を 構成する各部を詳細に説明する。
[0074] 試料 10は、試料容器 11に入れた培養液に浸されている。
[0075] 試料容器 11は、具体的にはシャーレであり、少なくともその底面が光学的に透明な もの(通常の対物レンズで対応できるようなもの)である。なお、当該底面は、具体的 には顕微鏡用のカバーガラスと同じ素材で厚さが 0. 17mmのものである。ここで、試 料容器 11として、シャーレの他、スライドガラス、マイクロプレートなどを用いてもよレ、。 また、試料容器 11に対して、図 14に示すように、フタ 18を配設してもよレ、。再び図 13 に戻り、試料容器 11は、ノズル 13を通して供給された純水が張られた水槽 12内に配 置されている。なお、当該純水は、試料容器 11内の湿度を保つことを目的として水 槽 12内に入れられている。
[0076] 水槽 12には、ガスボンベ 14から排出された混合ガス(二酸化炭素(C〇)を 5%、酸
2 素(O )を 95%含むガス)が、ガス供給チューブ 15を通して、図示の如く水槽 12の上
2
方から、 50mL/minの流速で供給されている。なお、水槽 12の形状は、図 14に示 すような、試料容器 11全体を覆い隠す形状でもよい。この場合、水槽 12の上部には 着脱可能なフタ 19が配設される。再び図 13に戻り、水槽 12はヒートプレート 16の上 に配置されている。
[0077] ヒートプレート 16は環境温度の設定を行うものであり試料ステージ 17の上に配置さ れている。なお、ヒートプレート 16は、当該ヒートプレート 16と接続された温度コント口 一ラー(図示せず)の制御により、環境温度の設定を 0· 5°C間隔で行うことができる。
[0078] 試料ステージ 17は、試料 10などを設置するための板状のものであり、図示の如く 光軸(z軸)に直交するように配設されている。試料ステージ 17は、互いに直交する向 き(90° 方向)で当該ステージの所定の位置に取り付けられた 2個のステッピング'モ 一ター(図示せず)の駆動力に因り、当該ステージが配設された位置から光軸 (z軸) に直交する方向(例えば X方向や y方向)に移動可能である。なお、各ステッピング- モーターは、当該各モーターと接続された試料ステージコントローラー(図示せず)で 制御される。また、試料ステージコントローラ一は、情報処理装置 70と接続されており 、情報処理装置 70からの指令に基づいて各ステッピング ·モーターを適宜駆動し、試 料ステージ 17を移動する。
[0079] 照明光学系は、光源 20から発せられた照明光を試料 10へ導くためのものであり、 コレクターレンズ 21と、照明光の光軸を偏向する偏向ミラー 22と、光源 20の像を投 影するコンデンサーレンズ 23と、で構成されてレ、る。
[0080] ここで、コンデンサーレンズ 23の瞳位置には、図 15の(A)に示す開口ユニット 24が 着脱自在に配設されている。図 15は、開口ユニット 24の構成および対物レンズ 30の 瞳における開口の投影像の一例を示す図である。開口ユニット 24は、部分輪帯の開 口 24aと遮光性を有する遮光板 24bとで構成されている。開口 24aは、瞳の中心に対 して偏芯した状態になるように光軸に対して配設され、自在に横ずれを起こすことが できる構成となっている。開口 24aの開口径は、当該開口 24aの投影像が図 15の(B )に示すように対物レンズ 30の瞳の外周部分にほぼ内接するように決める。開口 24a の幅(図 15の(A)に示す" Ro_Ri")は、共役関係にある対物レンズ 30の瞳半径の 3 分の 1以下であることが望ましい。これにより、観察する生体細胞の種類によって対物 レンズ 30の移動量を適宜設定することで、最良のコントラストの像を得ることができる
[0081] なお、開口ユニット 24は、図 16の(A)に示すように、矩形の開口 24aを備えたもの でもよレ、。図 16は、開口ユニット 24の別の構成および対物レンズ 30の瞳における開
口の投影像の一例を示す図である。当該矩形の開口 24aは、瞳の中心位置から所 定の距離だけ離れた位置に、瞳の中心に対して偏芯した状態で配設されている。当 該矩形の開口 24aを備えた開口ユニット 24を用いて試料 10を偏射照明することで、 対物レンズ 30の瞳に開口 24aの像を投影させる。また、矩形の開口 24aは瞳の中心 に対して同心円状に配設されてないので、例えば観察する生体細胞が細長い場合 において高いコントラストの像を得ることができる。ここで、偏射照明光は、立体的な 大きさをもった生体細胞に入射され、透過光、屈折光および回折光に分離されて生 体細胞から射出される。生体細胞内において、球や楕円体に近い形状の輪郭である 部分からは屈折光が多くなり、扁平な部分からは透過光と回折光が多くなる。細胞内 の、球や楕円体に近い形状である部分で屈折した屈折光の一部は、対物レンズ 30 の NAより大きくなるので、対物レンズ 30には取り込まれなレ、。
[0082] また、図 17に示すように、偏向ミラー 22の下側に、光源 20を準単色とするための干 渉フィルター 25を配設してもよい。これにより、光源 20から発せられた照明光は偏向 ミラー 22で進行方向が偏向され、偏向された照明光は、干渉フィルター 25を通ること で波長帯域バンド幅の極めて狭レ、単色光となって、コンデンサーレンズ 23へ向かう。 なお、干渉フィルターに限らず、狭帯域バンドパス'フィルターを用いてもよい。
[0083] 再び図 13に戻り、観察光学系は、試料 10の像を形成するためのものであり、試料 ステージ 17の下方に倒立に配置されている。観察光学系は、対物レンズ 30以外に、 対物レンズ 30で形成された像 (試料 10の像)を結像面に結像させるリレーレンズ 31と 、対物レンズ 30からの光を偏向する偏向ミラー 32と、リレーレンズ 31と共に対物レン ズ 30で形成された像 (試料 10の像)を結像面に結像させるリレーレンズ 33と、で構成 されている。従って、前述及び後述する対物レンズに関する光学条件である「(NA÷ /3 )の 2乗」の値は、これら観察光学系における全てのレンズを総合した条件を意味 する。なお、本発明では、対物レンズを除く観察光学系が決定されている場合に、低 倍率ないし高倍率の対物レンズに交換する際の対物レンズの選定条件を説明するも のであり、対物レンズ単独で決定される光学条件ではない。本発明の実施形態では 、対物レンズ以外の観察光学要素として、例えば図 13に示されるリレーレンズ 31、 3 3や、図 26に示される集光レンズ 3Aが挙げられる。このような観察光学系を具備する
ことにより、高開口数 (NA)と拡大倍率とで決まる光学条件と適用すべき方法または 装置と連携して、微弱光による撮像との連携を最適化することが可能となる。
[0084] 焦点位置変更部 40は、具体的には、ラックピニオン機構(図示せず)で対物レンズ 30を光軸方向(z軸方向)に移動(駆動)させる対物レンズ z軸移動(駆動)機構である 。ラックピニオン機構に含まれるノブは、コンピュータ制御されたステッピング 'モータ 一(図示せず)で回転させる。なお、対物レンズ z軸移動機構は、ラックピニオン機構 の他、フリクションローラー機構で対物レンズ 30を光軸方向に移動させてもよレ、。また 、焦点位置変更部 40は、対物レンズ 30を光軸に沿って移動させる構成の他、試料ス テージ 17を光軸に沿って移動させる構成でもよい。対物レンズ z軸移動機構には、図 示の如ぐ対物レンズヒーター 41が備えられている。
[0085] 対物レンズヒーター 41は、図示の如ぐ対物レンズ 30に接触して対物レンズ 30の 周囲に取り付けられている。対物レンズヒーター 41は、当該対物レンズヒーター 41と 接続された温度調節装置(図示せず)により制御されている。対物レンズヒーター 41 は、対物レンズ 30の外側から対物レンズ 30の温度設定を 0. 5°C間隔で行うことで、 対物レンズ 30の温度を一定に保ってレ、る。
[0086] 接眼レンズ 43は、試料 10の像を拡大するものであり、観察者に試料 10の像を目視 で観察させるためのものである。
[0087] 切替ミラー 44は、図示の如ぐ接眼レンズ 43とリレーレンズ 33との間に配設されて いる。これにより、接眼レンズ 43による試料 10の目視での観察と、試料撮像部 60に よる試料 10の観察とを、任意に切り替えることができる。なお、切替ミラー 44として、 機械的に 2つの光路を切り替える形式のものの他、ハーフミラーを用いて 2つの光路 を分離する形式のものを用いてもよい。
[0088] 赤外線カットフィルター 45は、図示の如く試料撮像部 60の受光面の上方に着脱自 在に配設され、背景光となる赤外線を遮断する。換言すると、赤外線カットフィルター 45は、背景光となる赤外線が試料撮像部 60に入射するのを必要に応じて防ぐ。
[0089] 試料撮像部 60は、具体的には、その受光面に撮像素子 60aを有する CCDカメラで ある。当該撮像素子 60aの画素数は 1360 X 1024である。当該 CCDカメラには、試 料 10から発せられた微弱光を検出することができるよう、できるだけ高感度のものを
用いる。ここで、 CCDカメラとして、カラーの明視野像を撮像するために、 3板式カラ 一力メラを用いてもよい。また、試料撮像部 60は、 CCDカメラに限定することなぐ例 えば CMOSイメージセンサーや SITカメラなどを用いてもよい。試料撮像部 60は、情 報処理装置 70 (当該情報処理装置 70と接続された TVモニタ)と信号ケーブルを介 して接続されている。試料撮像部 60の底部には、 CCDカメラから発する喑電流を抑 えるために、冷却装置 61が配設されている。
[0090] 冷却装置 61は、ペルチェ素子から成るものであり、試料撮像部 60の温度を 0°C程 度に冷却して保温する。
[0091] 情報処理装置 70は、入出力装置 (TVモニタ、キーボード、マウスなど)をさらに備 えている。情報処理装置 70は、試料撮像部 60で撮像した撮像画像を TVモニタに描 出する。
[0092] 以上、図 13に示す焦点位置決定装置 1では、まず、光照射部 20から発せられた光 はコレクターレンズ 21で平行光にされ、この平行光がコンデンサーレンズ 23の瞳位 置に投影される。そして、光照射部 20から発せられた光の像は、コンデンサーレンズ 23によりケーラー照明として試料 10を照明する。つぎに、試料 10を照明した光は、 試料 10を透過して、対物レンズ 30に入射する。つぎに、対物レンズ 30に入射した光 (測定光)は、対物レンズ 30、リレーレンズ 31およびリレーレンズ 32により結像面に試 料 10の像を形成する。そして、結像面に形成された試料 10の像は、接眼レンズ 43 にそのまま入射すると共に、切替ミラー 44により CCDカメラ 60の撮像素子 60a上に 結像する。
[0093] これにて、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の説明を終了する。
[0094] [3.焦点位置決定装置 1の処理]
つぎに、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1が行う焦点位置決定処理について図 18を参照して説明する。図 18は、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1が行う焦点位 置決定処理の一例を示すフローチャートである。なお、ここでは、生体細胞の発光観 察を図 13に示す焦点位置決定装置 1を用いて行う場合における焦点位置決定処理 について説明する。
[0095] 観察者が、試料 10である生体細胞を入れた試料容器 11を試料ステージ 17上に設
置し、焦点位置決定装置 1および光源 20を起動させると、焦点位置決定装置 1は以 下の処理を行う。
[0096] まず、焦点位置決定装置 1は、光源 20から発せられた照明光を、生体細胞へ照射 する(ステップ SA_ 1)。
[0097] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより焦点位置変 更部 40である対物レンズ z軸移動機構を動作させ、対物レンズ z軸移動機構により対 物レンズ 30を初期位置から光軸に沿って一定量だけ移動させることで、対物レンズ 3 0の焦点位置を変更する(ステップ SA— 2)。
[0098] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより焦点位置計 測部 50を動作させ、焦点位置計測部 50により対物レンズ 30の焦点位置を計測する (ステップ SA_ 3)。
[0099] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより試料撮像部 60である CCDカメラを動作させ、 CCDカメラにより生体細胞を撮像する(ステップ SA 4)。
[0100] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより特徴量算出 部 70alを動作させ、特徴量算出部 70alにより、ステップ SA— 4で撮像した撮像画 像に基づいて当該撮像画像のコントラストを算出する(ステップ SA— 5)。
[0101] ここで、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、ステップ SA
3で計測した焦点位置、ステップ SA— 4で撮像した撮像画像およびステップ SA— 5で算出したコントラストを、相互に関連付けて、記憶部 70bの撮像画像データべ一 ス 70blに格納する。
[0102] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、ステップ S A- 2からステップ SA— 5を、ステップ SA— 2で変更した対物レンズ 30の焦点位置 が光軸上の予め定められた位置を越えるまで、繰り返し実行する(ステップ SA—6)。
[0103] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、焦点位置 選出部 70a2を動作させ、焦点位置選出部 70a2により、撮像画像データベース 70b 1に格納された複数のコントラストのうち極大となる 2つのコントラストを選出し、選出し たコントラストと対応付けられて撮像画像データベース 70blに格納されている焦点
位置を取得する (ステップ SA— 7)。換言すると、焦点位置決定装置 1は、焦点位置 選出部 70a2により、撮像画像データベース 70blに格納された複数の焦点位置から 、撮像画像データベース 70blに格納された複数の特徴量に基づいて、対物レンズ 3 0の近点側の焦点位置(略焦点位置)および対物レンズ 30の遠点側の焦点位置(略 焦点位置)を選出する。
[0104] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、焦点位置 決定部 70a3を動作させ、焦点位置決定部 70a3により、ステップ SA— 7で選出した 2 つの焦点位置に基づいて、当該 2つの焦点位置の中央の位置(略中央の位置)を、 生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定す る(ステップ SA— 8)。
[0105] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、対物レン ズ z軸移動機構を動作させ、対物レンズ z軸移動機構により、ステップ SA— 8で決定 した中央の位置(略中央の位置)に対物レンズ 30の焦点位置が合うように、対物レン ズ 30の位置を調整する(ステップ SA— 9)。このように調整された焦点位置を用いて 微弱光画像としての発光画像を取得し、発光画像を画像解析する(ステップ SA— 10 、 11)。この画像解析は、光照射して得た照明画像と一緒に画像解析することにより、 より迅速かつ正確な解析を行うことができる。
[0106] 以上、説明したように、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1は、光源 20により生体 細胞へ照射光を照射する。そして、焦点位置決定装置 1は、対物レンズ z軸移動機構 により対物レンズ 30を光軸に沿って一定量ずつ繰り返し移動させながら、移動させる 度に、焦点位置計測部 50により対物レンズ 30の焦点位置を計測し、 CCDカメラによ り生体細胞を照明して撮像し、特徴量算出部 70alにより、撮像した撮像画像のコント ラストを算出する。そして、焦点位置決定装置 1は、焦点位置選出部 70a2により、対 物レンズ 30を繰り返し移動させたことで蓄積した複数のコントラストのうち極大となるコ ントラストを 2つ選出し、選出したコントラストに対応する撮像画像を撮像した時の対物 レンズ 30の焦点位置を、対物レンズ 30を繰り返し移動させたことで蓄積した複数の 焦点位置から取得する。そして、焦点位置決定装置 1は、焦点位置決定部 70a3によ り、取得した 2つの焦点位置に基づいて、当該 2つの焦点位置の中央の位置(略中
央の位置)を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位 置として決定し、対物レンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30を移動させて、対物レ ンズ 30の焦点位置を、決定した焦点位置に合わせる。これにより、生体細胞内の特 定の部位を観察対象部位 10aとして当該観察対象部位 10aの発光観察を行う場合、 生体細胞を設置した時点で、当該観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦 点位置を決定することができ、その結果、対物レンズ 30の焦点位置を当該観察対象 部位 10aに合わせることができる。具体的には、焦点位置決定装置 1によれば、微弱 光を発する生体細胞をレンズを含む拡大結像光学手段を用いて観察したり、当該生 体細胞からの発光を測定したり、例えば、生体細胞内からの生物発光タンパク質によ る微弱発光を観察したりする顕微鏡にぉレ、て、生体細胞からの発光を確認しなくても 、生体細胞内の発光している部位(生物発光タンパク質が局在する部位)に対物レン ズの焦点を自動的に合わせることができる。ゆえに、レンズを含む拡大結像光学手段 を用いて微弱光を発する試料の観察を行う際に、対物レンズの焦点位置を、試料内 の目的とする部位に、手動で行う場合と比べて迅速に且つ精度よく設定することがで きる。また、焦点位置決定装置 1では、対物レンズの焦点位置を決定において試料 の照明画像を用いているが、当該照明画像は明るくし力もコントラストが高いので、試 料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置を、 目視で行う場 合と比べて容易且つ迅速に決定することができる。また、焦点位置決定装置 1では、 コントラストが高レ、、試料 10の照明画像を撮像した時の対物レンズ 30の焦点位置が 、試料 10のほぼ上下辺縁部に対応しているので、その中央位置(略中央位置)を、 試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定す ればよレ、。これにより、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦 点位置を容易且つ簡便に決定することができる。
ここで、生物(生体細胞など)による発光現象を測定する場合、試料を設置した時点 では、生物からの発光は、その強度が極めて微弱であるため、高性能の CCDカメラ でもほとんど検出することができない。すなわち、通常の顕微鏡観察のように生物内 の観察対象部位 (細胞など)を確認しながら対物レンズの焦点を合わせることができ ない。つまり、生物を設置した時点では、通常、生物の内部構造を観察することがで
きない。また、蛍光や発光 (ィ匕学発光または生物発光)を観察する顕微鏡においては 、細胞内の発光タンパク質が局在する部位 (微弱発光する部位)を細胞間で同時に 観察する際、細胞などの位相物体の照明画像に基づレ、て検出した対物レンズの焦 点位置では、細胞内に局在する発光タンパク質の発光部分に合わず、観察画像が ぼけてしまう。また、蛍光観察においては、蛍光励起光により蛍光を発している位相 物体について蛍光強度が最も大きい位置を焦点位置として決定している。ただし、こ の決定方法の場合、励起光に因る光毒性が強いため、生きた細胞など生物活性を 有する試料に対して繰り返し焦点位置を決定するのは望ましくないので、焦点位置 の決定回数をできるだけ少なくする必要がある。しかし、長期間の蛍光観察において は、焦点位置の決定回数を少なくすると、観察画像の鮮明度が不安定になる可能性 力 sある。そこで、焦点位置決定装置 1では、照明光による画像観察として、ハロゲンラ ンプなどの光源 20から発せられる光を生物に照射し、顕微鏡により生物の照明画像 を取得し、取得した照明画像に基づいて対物レンズ 30の焦点位置を決定する。つま り、生体細胞を照明下で撮像し、生体細胞の内部の位置を推定する。これにより、生 物を設置した時点で生物の内部構造を観察することができる。また、細胞内の発光タ ンパク質が局在する部位 (微弱発光する部位)を細胞間で同時に観察する際、細胞 内に局在する発光タンパク質の発光部分に対物レンズの焦点を合わせることができ る。また、蛍光で対物レンズの焦点位置を決定しないので、長期間の蛍光観察を行う こと力 Sできる。
なお、焦点位置決定装置 1は、ステップ SA— 7において、焦点位置選出部 70a2に より、撮像画像データベース 70blに格納された複数の焦点位置から、撮像画像デ ータベース 70b 1に格納された複数の特徴量に基づいて、対物レンズ 30の近点側の 焦点位置(対物レンズ 30の近点側においてコントラストの高い撮像画像が得られた 時の対物レンズ 30の焦点位置)を選出し、ステップ SA—8において、焦点位置決定 部 70a3により、選出した対物レンズ 30の近点側の焦点位置から予め測定した生体 細胞の厚みの半分の距離だけ光軸の上方に離れた位置を、生体細胞内の観察対 象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定してもよい。換言すると、 焦点位置決定装置 1は、照明下での観察による近点側の高コントラストの画像が得ら
れた時の対物レンズ 30の焦点位置を選出し、選出した焦点位置から細胞の厚さの 半分程度の距離だけ光軸の上方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位 10a に合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定してもよい。また、焦点位置決定装 置 1は、ステップ SA—7において、焦点位置選出部 70a2により、撮像画像データべ ース 70blに格納された複数の焦点位置から、撮像画像データベース 70blに格納さ れた複数の特徴量に基づレ、て、対物レンズ 30の遠点側の焦点位置(対物レンズ 30 の遠点側においてコントラストの高い撮像画像が得られた時の対物レンズ 30の焦点 位置)を選出し、ステップ SA— 8において、焦点位置決定部 70a3により、選出した対 物レンズ 30の遠点側の焦点位置力 予め測定した生体細胞の厚みの半分の距離だ け光軸の下方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レ ンズ 30の焦点位置として決定してもよい。換言すると、焦点位置決定装置 1は、照明 下での観察による遠点側の高コントラストの画像が得られた時の対物レンズ 30の焦 点位置を選出し、選出した焦点位置から細胞の厚さの半分程度の距離だけ光軸の 下方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の 焦点位置として決定してもよい。これにより、対物レンズ 30や試料 10を動力 て、近 点側と遠点側のデフォーカス位置を選出する場合に比べて、試料 10内の観察対象 部位 10aに合うような対物レンズの焦点位置を容易且つ簡便に決定することができる ここで、焦点位置決定装置 1は、以下の工程 1から工程 6を実行することで、試料容 器 11に配置された生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦 点位置を決定してもよい。
(工程 1)光源 20の電源を入れ、光源 20のシャッターを開閉して試料容器 11の上方 から照明光を照射する。
(工程 2)試料容器 11の底面(外側底面または内側底面)に合うような対物レンズ 30 の焦点位置(図 14の" Zd"に対応)を決定する。具体的には、対物レンズ z軸移動機 構により、対物レンズ 30を光軸に沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動さ せる度に、 CCDカメラにより生体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部 70alにより 、撮像した撮像画像の全画素からの光強度の積分値 (CCDカメラからの出力信号の
強度)を算出し、制御部 70aにより、算出した積分値が極大値であるか否力を確認し 、極大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像し た時に対物レンズ 30の焦点が試料容器 11の底面に合っていると見做して、当該撮 像した時の対物レンズ 30の焦点位置(図 14の" Zd"に対応)を焦点位置計測部 50で 計測する。つまり、対物レンズ 30を光軸に沿って動かしながら、試料容器 11の底面 からの反射光の極大値を照明画像で決定する。
(工程 3)対物レンズ 30の近点側において、コントラストの高い撮像画像を撮像した時 の対物レンズ 30の焦点位置(図 14の" Zc"に対応)を決定する。具体的には、対物レ ンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30を、 (工程 2)で移動させた位置からさらに光 軸に沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動させる度に、 CCDカメラにより生 体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部 70alにより、撮像した撮像画像のコントラ ストを算出し、制御部 70aにより、算出したコントラストが極大値であるか否かを確認し 、極大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像し た時に対物レンズ 30の焦点が生体細胞のほぼ下端面に合っていると見做して、当 該撮像した時の対物レンズ 30の焦点位置(図 14の "Zc"に対応)を焦点位置計測部 50で計測する。
(工程 4)対物レンズ 30の遠点側において、コントラストの高い撮像画像を撮像した時 の対物レンズ 30の焦点位置(図 14の" Za"に対応)を決定する。具体的には、対物レ ンズ z軸移動機構により対物レンズ 30を(工程 3)で移動させた位置からさらに光軸に 沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動させる度に、 CCDカメラにより生体 細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部 70alにより、撮像した撮像画像のコントラスト を算出し、制御部 70aにより、算出したコントラストが極大値であるか否かを確認し、極 大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像した時 に対物レンズ 30の焦点が生体細胞のほぼ上端面に合っていると見做して、当該撮 像した時の対物レンズ 30の焦点位置(図 14の" Za"に対応)を焦点位置計測部 50で 計測する。
(工程 5) (工程 3)で決定した焦点位置(図 14の "Zc"に対応)および(工程 4)で決定 した焦点位置(図 14の" Za"に対応)の略中央の位置(例えば、図 14の" Zb ( (Zc + Z
a) ÷ 2) "に対応)を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の 焦点位置として決定する。
(工程 6) (工程 5)で決定した中央の位置に対物レンズ 30の焦点位置が合うように、 対物レンズ 30を移動する。
[0110] なお、工程 4および工程 5において、対物レンズ 30を一定量移動させる度に CCD カメラで生体細胞を照明下で撮像すると共に当該撮像した時の対物レンズ 30の焦点 位置を計測し、対物レンズ 30を移動させながら撮像してきた複数の撮像画像のコント ラスト (複数の撮像画像の各画素からの出力信号の総和)を算出し、算出した各コント ラスト(各総和)を比較して極大のコントラスト(総和)を選出し、選出したコントラスト( 総和)に対応する撮像画像を撮像した時の対物レンズ 30の焦点位置を、対物レンズ 30を移動させながら計測してきた複数の対物レンズ 30の焦点位置の中から選択す ることで、図 14の" Zc"または" Za"に対応する対物レンズ 30の焦点位置を決定しても よい。また、焦点位置決定装置 1は、 CCDカメラの代わりにフォトダイオードを配設し てもよレ、。この場合、工程 4および工程 5において、対物レンズ 30を一定量移動させ る度に、フォトダイオードの出力電流を増幅して電圧信号に変換すると共に対物レン ズ 30の焦点位置を計測し、対物レンズ 30を移動させながら変換してきた複数の電圧 信号の強度を比較して極大の電圧信号の強度を選出し、選出した電圧信号の強度 に対応する対物レンズ 30の焦点位置を、対物レンズ 30を移動させながら計測してき た複数の対物レンズ 30の焦点位置の中から選択することで、図 14の" Zc"または" Za "に対応する対物レンズ 30の焦点位置を決定してもよい。また、焦点位置決定装置 1 において、対物レンズ 30や試料 10を移動させる量 (移動量)は、 CCDカメラで撮像し た像にボケが生じない範囲であることが望ましい。具体的には、当該移動量は、光源 20で発せられる光の波長を対物レンズ 30の NAの二乗で割った値(λ +NA2 : λは 波長、 ΝΑは開口数)以下であることが望ましい。
[0111] また、焦点位置決定装置 1において、光源 20として単色性の高い光源(レーザーな ど)を用いてもよい。ここで、光源の単色性が高いと、照明光を位相物体に照射したと きに、波長分散がほとんど無くなるので、シャープな回折光が得られる。従って、近点 側の撮像画像、遠点側の撮像画像のいずれにおいても、そのコントラストが、白色光
源を用いたときと比べて、非常に高くなる。これにより、コントラストが極大となる撮像 画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を容易に選出することができる。
[0112] また、焦点位置決定装置 1において、観察者 (オペレーター)が、対物レンズ z軸移 動機構のノブを手動で回しながら接眼レンズ 43を介して、生体細胞の像のコントラス トが高くなる 2箇所の対物レンズの位置を目視で決定し、焦点位置計測部 50により、 当該決定した時の対物レンズの焦点位置を計測し、焦点位置決定部 70a3により、計 測した 2つの焦点位置の中央位置(略中央位置)を、生体細胞内の観察対象部位 10 aに合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。
[0113] また、焦点位置決定装置 1によれば、対物レンズ 30の位置を通常の観察の合焦位 置から試料 10に対して微小量だけ前後に移動させることにより、位相差用の対物レ ンズを使用しなくても位相差観察法と同様なコントラストの像を得ることができる。また 、焦点位置決定装置 1によれば、対物レンズ 30とコンデンサーレンズ 23との瞳収差 を考慮する必要がないので、低倍率の対物レンズを使用することができる。つまり、焦 点位置決定装置 1によれば、位相差観察法では使えない、 1倍や 2倍の倍率の対物 レンズを使用しても、培養細胞のような位相物体を観察することができ、従来の観察 法では実現できなかった広い範囲での観察が可能になる。また、焦点位置決定装置 1によれば、偏射照明により、位相分布に陰影を付けたレリーフ感のある、高いコント ラストの像を得ることができる。また、焦点位置決定装置 1によれば、切替ミラー 44に より、 目視による観察と TVモニタによる観察とを切り替えて行うことができる。また、切 替ミラー 44としてハーフミラーを用いることで、 目視による観察と TVモニタによる観察 とを同時に行うことができる。また、焦点位置決定装置 1によれば、開口を取り外すこ とで、通常の顕微鏡として試料の観察を行うことができる。また、焦点位置決定装置 1 によれば、対物レンズ 30の焦点位置の決定を 2段階に分けて実施することにより、高 倍率の対物レンズを用いた場合でも焦点位置の決定を行うことができる。また、焦点 位置決定装置 1によれば、励起光を使用しないので、蛍光を発する生物学的試料に 対して繰り返し焦点位置決定処理を実行しても、光毒性の影響が殆どないとレ、う利点 がある。換言すると、生きた細胞に対して連続的 ·経時的に観察を行う場合において 、焦点位置決定処理を繰り返し行うことで鮮明な撮像画像を撮像し続けることができ
る。また、焦点位置決定装置 1によれば、赤外光を用いて焦点位置決定処理を行う 場合において、可視光での照明を行わない状態を維持したまま、対物レンズの焦点 位置を合わせることと試料の喑視野画像を撮像することの両方を行うことができるの で、自家発光により撮像画像にノイズが生じることを効果的に防止することができる。
[0114] また、焦点位置決定装置 1は、試料 10から発せられる発光の強度が CCDカメラで 検出できる程度になった場合には、試料 10を設置した時点で決定した、試料 10内 の観察対象部位 10aに合うような対物レンズの焦点位置を再度決定し直してもよい( 焦点位置再決定処理)。ここで、高倍率 (例えば 40倍以上)の対物レンズ 30で試料 1 0からの発光を観察する場合には、対物レンズ 30の倍率が高くなればなるほど、焦点 深度が極めて浅くなつていくので、対物レンズ 30の焦点位置が精確に試料 10内の 観察対象部位 10aに合ってないと試料 10の像がぼやける。上述した焦点位置決定 処理で決定した焦点位置は試料 10のほぼ中心に合っている力 さらに高精度で試 料 10からの発光を取得する場合には、より精度よく試料 10内の観察対象部位 10aに 合うような対物レンズ 30の焦点位置を決定する必要がある。そこで、焦点位置再決定 処理を実行することにより、試料 10を設置した時点だけでなぐ試料 10の発光観察 を開始してからも、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズの焦点位 置を決定し続けることができ、その結果、対物レンズの焦点位置を常に当該観察対 象部位 10aに合わせることができる。ここで、焦点位置決定装置 1が行う焦点位置再 決定処理について、図 19を参照して説明する。図 19は、第 1実施形態の焦点位置 決定装置 1が行う焦点位置再決定処理の一例を示すフローチャートである。
[0115] まず、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより CCDカメラを動作させ、 CCDカメ ラにより、焦点位置決定部 70a3で決定した焦点位置(上述した図 18におけるステツ プ SA—8で決定した、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の 焦点位置)にて、試料 10を照明を行わずに撮像する (ステップ SB— 1)。
[0116] つぎに、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより特徴量算出部 70alを動作させ 、特徴量算出部 70alにより、ステップ SB— 1で撮像した撮像画像 (発光画像)に基 づいて特徴量 (例えば発光画像の各画素からの発光強度、発光画像の発光強度分 布から得られる統計量、発光画像のコントラストなど)を算出する(ステップ SB_ 2)。
[0117] つぎに、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより対物レンズ z軸移動機構を動作 させ、対物レンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30を光軸に沿って一定量だけ移動 することで、焦点位置決定部 70a3で決定した焦点位置を変更する(ステップ SB— 3) 。なお、焦点位置の変更は、対物レンズ 30の移動の他、試料ステージ 17の移動で 行ってもよい。
[0118] つぎに、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより CCDカメラを動作させ、 CCD力 メラにより、ステップ SB— 3で変更した焦点位置にて試料 10を照明を行わずに撮像 する(ステップ SB— 4)。
[0119] つぎに、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより特徴量算出部 70alを動作させ 、特徴量算出部 70alにより、ステップ SB— 4で撮像した撮像画像 (発光画像)に基 づいて特徴量 (例えば発光画像の各画素からの発光強度、発光画像の発光強度分 布から得られる統計量、発光画像のコントラストなど)を算出する(ステップ SB_ 5)。
[0120] つぎに、焦点位置決定装置 1は、制御部 70aにより特徴量比較部 70a4を動作させ 、特徴量比較部 70a4により、ステップ SB— 2で算出した特徴量とステップ SB— 5で 算出した特徴量とを比較する(ステップ SB— 6)。なお、特徴量の比較においては、 試料 10の種類や特性に因りコントラストで比較した方が適当である場合と発光強度 分布から得られる統計量で比較した方が適当である場合とがある力 S、最終的には S /N (シグナル 'ノイズ比)で比較する。
[0121] つぎに、焦点位置決定装置 1は、ステップ SB— 6での比較結果がステップ SB— 5 で算出した特徴量の方が大きかった場合 (ステップ SB— 7 : Yes)には、制御部 70a により焦点位置決定部 70a5を動作させ、焦点位置決定部 70a5により、ステップ SB _ 3で変更した焦点位置を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ の焦点位置として決定する(ステップ SB _ 8)。
[0122] 一方、焦点位置決定装置 1は、ステップ SB_ 6での比較結果がステップ SB_ 5で 算出した特徴量の方が大きくな力、つた場合 (ステップ SB— 7 : No)には、制御部 70a により、ステップ SB— 3の実行回数が所定回数に達したか否か(ステップ SB— 3での 対物レンズ 30の移動量が所定量に達したか否力 を確認し、所定回数に達した場合 (ステップ SB— 9 : Yes)には、制御部 70aにより対物レンズ z軸移動機構を動作させ、
対物レンズ z軸移動機構により、ステップ SB— 3で変更した対物レンズ 30の焦点位 置を、焦点位置決定部 70a3で当初決定した焦点位置(上述した図 18におけるステ ップ SA— 8で決定した、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30 の焦点位置)に戻す (ステップ SB_ 10)。また、焦点位置決定装置 1は、所定回数に 達してない場合(ステップ SB— 9 : No)には、制御部 70aにより、ステップ SB— 3の処 理に戻る。
[0123] 以上、第 1実施形態の焦点位置決定装置 1の説明を終了する。
[0124] [第 2実施形態]
つぎに、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成について、図 20から図 22を参 照して詳細に説明する。なお、上述した第 1実施形態の説明と重複する説明を省略 する場合がある。
[0125] 図 20は、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の具体的一例を示す図であ る。図 20に示す焦点位置決定装置 1は、倒立型顕微鏡をベースとする構成であり、 微弱光を発する生体細胞の発光観察と蛍光観察とを同時に行うために用いるもので ある。焦点位置決定装置 1は、蛍光観察と発光観察とを同時に行う際、生体細胞や 組織などの試料 10を設置した時点で、試料 10内の観察対象部位 10aに合うような対 物レンズ 30の焦点位置を決定する。焦点位置決定装置 1は、図 20に示すように、励 起光照射部(励起用光源) 80、コリメートレンズ 81、偏向ミラー 82およびダイクロイツク ミラー 83からなる励起用光学系をさらに備えて構成されている。
[0126] なお、図 20に示す焦点位置決定装置 1において、試料 10が空気中に存在する (試 料 10が培養液などの液体に浸されてない)場合には、対物レンズ 30として開口数( NA)が 0. 9程度のものを用レ、、試料 10が液体に浸されている場合には、対物レンズ 40として開口数が 1. 0以上のものを用いる。また、試料 10は、蛍光色素(蛍光物質) であるローダミン ·グリーン(Rhodamine Green : RhG)で予め染色されている。ここ で、蛍光物質として、ローダミン'グリーンの他、例えば TMR (Tetramethylrhodami ne)、 5— amra (5— carboxytetramethylrhodamme) Λ ITし (Fluorescein— ι sothiocyanate)、 T〇T01、 Acridine― Orange^ Texas— Redなと 用レヽてもよ レ、。
[0127] 励起光照射部 80は、可視光領域の波長のレーザー光を発するガスレーザー(例え ばアルゴン.レーザー、ヘリウムネオン.レーザー(He 'Neレーザー)など)であり、具 体的には、波長 488nmで出力 10mWのアルゴン 'レーザーである。ここで、試料 10 を蛍光物質である TMRで染色した場合には、当該 TMRを励起するために、励起光 照射部 80として波長 514. 5nmのアルゴン.レーザーを用いる。また、試料 10を蛍光 物質である 5—Tamraで染色した場合には、当該 5 _Tamraを励起するために、励 起光照射部 80として波長 543. 5nmの He 'Neレーザーを用いる。
[0128] コリメートレンズ 81は、励起光照射部 80から発せられたレーザー光を、ビーム幅を 有する円形の平行光束に変換する。
[0129] 偏向ミラー 82は、コリメートレンズ 81で平行光束に変換されたレーザー光の光軸を 偏向する。
[0130] ダイクロイツクミラー 83は、具体的には切替式ダイクロイツクミラーであり、偏向ミラー 82で偏向されたレーザー光を対物レンズ 30へ入射させる。なお、切替式ダイクロイツ クミラーは、励起用光源 80の発振波長の光を反射し、蛍光信号および発光信号のス ベクトルを透過するスペクトル特性を持っている。ここで、ダイクロイツクミラー 83は、ホ ルダー(図示せず)に収められており、レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能 に配設されている。なお、励起光照射部 80から発するレーザー光の波長を変更する 必要がなければ、ダイクロイツクミラー 83として、切替式のものでなぐ通常のダイク口 イツクミラーを用いてもよい。
[0131] 以上、図 20に示す焦点位置決定装置 1では、試料 10から発せられた蛍光および 発光は、対物レンズ 30を通って、ダイクロイツクミラー 83に到達する。そして、ダイク口 イツクミラー 83に到達した蛍光および発光は、ダイクロイツクミラー 83を透過し、リレー レンズ 31およびリレーレンズ 33を通って、切替ミラー 44で反射し、 CCDカメラ 60の 受光面にある撮像素子 60aで焦点を結ぶ。なお、切替ミラー 44を光路から取り外した 場合、試料 10から発せられた蛍光および発光は、接眼レンズ 43に到達する。これに より、観察者が試料 10の像を直接観察することができる。
[0132] つぎに、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の別の具体的一例について、 図 21を参照して詳細に説明する。図 21は、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の
構成の別の具体的一例を示す図である。
[0133] 図 21に示すように、焦点位置決定装置 1の本体 (光学系部分)は本体架台 106に 固定されている。なお、本体架台 106は上下方向に移動できるような構成である。本 体架台 106は支柱 105に取り付けられている。支柱 105は底板 100の上に固定され ている。焦点位置決定装置 1の観察光学系や CCDカメラ 60などは鏡筒に収められ ている。鏡筒は、鏡筒上部 107および当該鏡筒上部 107と連結された鏡筒下部 108 で構成されている。鏡筒上部 107は本体架台 106に固定されている。鏡筒下部 108 はベース架台 104の上に固定されている。鏡筒は上下方向に移動可能に取り付けら れている。ベース架台 104は底板 100の上に固定されている。焦点位置決定装置 1 の本体は遮光性を有する遮光箱 101で覆われてレ、る。遮光箱 101は底板 100に固 定されている。遮光箱 101の上面には遮光蓋 102が取り付けられている。遮光蓋 10 2は、その一端が遮光箱 101と蝶番 103で連結されており、開閉できるように取り付け られている。
[0134] 試料 10を入れた試料容器 11は、試料ステージ 17上に配設されている。ここで、図 22に示すように、試料容器 11を水槽 12に入れて試料ステージ 17上に配設してもよ レ、。
[0135] 再び図 21に戻り、光照射部 20には例えばハロゲンランプ、メタルハライドランプな どを用レ、、光照射部 20から発せられた光は光ファイバ一 26を通して試料ステージ 17 上の試料 10を含む試料容器 11に照射される。
[0136] 観察光学系において、偏向ミラー 32は用いず、対物レンズ 30で形成された像 (試 料 10の像)を結像させるリレーレンズ 34が鏡筒下部 108に図示の如く配設されてい る。
[0137] ここで、図 21に示す焦点位置決定装置 1は、図 22に示すように、焦点位置変更部 40として、対物レンズ z軸移動機構ではなぐ試料ステージ 17を z軸に沿って移動さ せるステージ z軸移動機構を備えてもよい。ここで、図 22には、本体架台 106にステ ージ z軸移動機構を備えた Z軸移動ステージが設置されてレ、る。当該 Z軸移動ステー ジは、 XY方向に移動可能な XY試料ステージの下方に、当該 XY試料ステージを支 える形で取り付けられている。当該 Z軸移動ステージの上方には、試料容器 11が配
置されており、試料容器 11は z軸移動ステージの上下移動と共に上下に移動する。 z軸移動ステージはラックピニオン機構により上下運動する。なお、ラックピニオン機 構の動作は、ラックピニオン機構のノブ(図示しない)をステッピング 'モーターにより 回転駆動することにより実施される。そして、ステッピング 'モーターの駆動はコンビュ ータにより制御される。これにより、対物レンズ 30を上下移動させた場合と同様の操 作ができる。ここで、 Z軸移動ステージの上下移動は手動により行ってもよい。また、ラ ックビニオン機構の動作は、当該ラックピニオン機構のノブ(図示しない)を回転して 行なってもよレ、。
[0138] 再び図 21に戻り、 CCDカメラ 60は、その受光面の中心が光軸にほぼ合うように、配 設されている。試料 (生体細胞) 10から発せられた蛍光および発光は、ダイクロイツク ミラー 83を透過し、リレーレンズ 34を通って CCDカメラ 60の受光面に集光する。ここ で、赤外光を取り出す場合には、 CCDカメラ 60の前面に取り付けられた赤外線カット フィルター 45を、焦点位置決定装置 1を起動させる前に取り外す。 CCDカメラ 60は、 CCDカメラ 60からの出力信号を処理する情報処理装置 70とケーブルを介して接続 されている。
[0139] 情報処理装置 70は、 CCDカメラの出力信号力 発光画像を描出してそれを解析し たり、発光強度の時間変化を測定したり、出力信号を解析したりする。また、情報処 理装置 70は、対物レンズ 30の焦点位置が試料 10内の観察対象部位 10aに合った 後、試料 10からの蛍光および発光を受光するために、制御部 70aにより CCDカメラ を動作させる。
[0140] 励起光照射部 80は、波長 488nmで出力 10mWのアルゴン 'レーザーであり、図示 の如ぐ遮光箱 101の外に配設されている。なお、遮光箱 101には光ファイバ一を通 すレーザー入射口 84が設けられてレ、る。励起光照射部 80から発せられたレーザー 光はコリメートレンズ 81を通過して光ファイバ一内を伝播し、伝播したレーザー光は ダイクロイツクミラー 83に到達する。ダイクロイツクミラー 83に到達したレーザー光はダ ィクロイツクミラー 83で反射されて対物レンズ 30に下方から入射し、入射したレーザ 一光は集光して試料 10に照射される。ダイクロイツクミラー 83は、ホルダー 85に収め られており、レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に配設されている。
[0141] 以上、図 21に示す焦点位置決定装置 1では、試料 10から発せられた蛍光および 発光は、対物レンズ 30を通って、ダイクロイツクミラー 83に到達する。そして、ダイク口 イツクミラー 83に到達した蛍光および発光は、ダイクロイツクミラー 83を透過し、リレー レンズ 34を通って、 CCDカメラの受光面にある撮像素子 60aで焦点を結ぶ。
[0142] これにて、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の構成の説明を終了する。
[0143] つぎに、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1が行う焦点位置決定処理および焦点 位置再決定処理については、上述した第 1実施形態の説明と同様であるため、その 説明を省略する。
[0144] 以上、説明したように、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1は、励起用光学系をさ らに備えている。第 2実施形態の焦点位置決定装置 1は、光源 20により生体細胞へ 照射光を照射する。そして、焦点位置決定装置 1は、対物レンズ z軸移動機構により 対物レンズ 30を光軸に沿って一定量ずつ繰り返し移動させながら、移動させる度に 、焦点位置計測部 50により対物レンズ 30の焦点位置を計測し、 CCDカメラにより生 体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部 70alにより、撮像した撮像画像のコントラ ストを算出する。そして、焦点位置決定装置 1は、焦点位置選出部 70a2により、対物 レンズ 30を繰り返し移動させたことで蓄積した複数のコントラストのうち極大となるコン トラストを 2つ選出し、選出したコントラストに対応する撮像画像を撮像した時の対物レ ンズ 30の焦点位置を、対物レンズ 30を繰り返し移動させたことで蓄積した複数の焦 点位置から取得する。そして、焦点位置決定装置 1は、焦点位置決定部 70a3により 、取得した焦点位置に基づいて、当該 2つの焦点位置の中央の位置(略中央の位置 )を、生体細胞内の観察対象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決 定し、対物レンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30を移動させて、対物レンズ 30の 焦点位置を、決定した焦点位置に合わせる。これにより、生体細胞内の特定の部位 を観察対象部位 10aとして当該観察対象部位 10aの蛍光観察と発光観察とを同時に 行う場合、生体細胞を設置した時点で、当該観察対象部位 10aに合うような対物レン ズ 30の焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズ 30の焦点位置を当該 観察対象部位 10aに合わせることができる。
[0145] ここで、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1を用いて生体細胞の発光画像と蛍光
画像とを同時に観察しながら、生体細胞内の ATP量の測定を行う手法について、そ の幾つかを以下に説明する。ルシフェラーゼの発光反応 (発光の強度)は ATP量に 依存するので、ルシフェラーゼの発光反応を利用して ATPを定量することは以前か ら行われている。そして、バイオ、臨床検查、食品衛生などの分野では、ルシフェラー ゼを用いた細胞内の ATP量の測定が行なわれている。なお、 ATP (アデノシン 3リン 酸)は細胞内のエネルギーの供給源であり、生命現象に深く関わっている物質である 。一方、ホタルのルシフェラーゼは、 ATP、 O、 Mg2+の存在下で、 D-ノレシフェリンを
2
発光基質として、ォキシルシフヱリン、 CO、 AMP、ピロリン酸を生成する反応を触媒
2
し、当該反応により発光する。
[0146] 生体細胞内の ATP量の測定は、通常、以下の(1A)〜(: 1C)の工程で行われる(H . J. Kennedy, A. E. Pouli, E. K. Ainscow, L. S. Jouaville, R. Rizzut o, G. A. Rutter, "Glucose generates sub— plasma membrane ATP microdomains in single islet β—cells. , Journal of Biological Che mistry, vol. 274, pp. 13281— 13291 , 1999)。
(I A)細胞または細菌を溶解して ATPを抽出する。
(IB)その抽出液をルシフェリンおよびノレシフェラーゼを含む反応液に添加する。
(IC)抽出液が添加された反応液から生じる発光量を測定することで、細胞内の AT Pを定量する。
[0147] また、細胞内の ATP量の測定は、通常、以下の(2A)〜(2C)の工程で行われる。
(2A)ルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入して発現させる。
(2B)細胞を含む培養液中にルシフェリンを添加する。
(2C)ルシフェリンが加えられた培養液から生じる発光量を検出し、細胞内の ATPを 定量する。
[0148] さらに、生きた細胞内の所定の部位(具体的にはミトコンドリア)における ATP量の 経時的測定は、以下の(3A)および(3B)の工程で行われる(H. J. Kennedy, A. E. Pouli, E. K. Ainscow, L. S. Jouaville, R. Rizzuto, G. A. Rutter, Glucose generates sub— plasma membrane ATP microdomains in single islet β—cells.,,, Journal of Biological Chemistry, vol. 274,
pp. 13281 - 13291 , 1999)。
(3A)ルシフェラーゼ遺伝子にミトコンドリア移行シグナル遺伝子を融合し、その融合 した遺伝子を細胞に導入する。細胞に導入する融合遺伝子は、移行塩基配列およ び発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融 合したものである。
(3B)ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在しているということを前提とし、細 胞からの発光量を経時的に測定することで、細胞内のミトコンドリアにおける ATP量 の時間変動を測定する。具体的には、当該融合遺伝子が導入された細胞の蛍光画 像を撮り、得られた蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか 否かを判定する。判定結果が局在すると結論された場合、細胞からの発光量を検出 する。これにより、当該細胞の所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを 判定することができる。すなわち、融合遺伝子が導入された生きた細胞に対し発光タ ンパク質の局在を確認すると共に、当該細胞からの発光量を測定する。また、測定し た発光量が所定の部位からのものであることを確認することができる。
なお、融合遺伝子が導入された生きた細胞が撮像視野の範囲内に複数個存在す る場合、複数の細胞の蛍光画像および発光画像を撮り、その蛍光画像に基づいて 所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを細胞ごとに判定し、撮像した蛍光 画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定さ れた細胞の中から測定対象の細胞を選定し、選定した細胞からの発光量を測定する 。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞内の所定の部 位からの発光量を他と分離して測定することができる。また、蛍光画像および発光画 像を同時に取得することで、測定対象の細胞における発光タンパク質の局在と、当該 細胞から発せられる発光強度を同時に得ることができる。そのため、遺伝子の導入効 率や細胞周期による個々の細胞の生理的な状態の違いの影響を排除した解析を行 うことができる。ここで一例として、蛍光画像を撮像した後、発光タンパク質が所定の 部位に局在しているか否かの判定を行なレ、、局在すると判定された場合、発光画像 を撮像してもよレ、。さらに、蛍光画像および発光画像を撮像した後、局在の判定を行 なってもよレ、。
[0149] 以上、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1の説明を終了する。
[0150] [第 3実施形態]
[1.本発明の基本原理]
まず、本発明にかかる生体試料撮像方法および生体試料撮像装置の基本原理に ついて詳細に説明する。本発明は、複数の収容部を有する基板の収容部に収容さ れた微弱光を発する生体試料を、対物レンズを介して撮像する。本発明は、対物レ ンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および/または対物レンズを移動し 、対物レンズの近点側の焦点位置および/または対物レンズの遠点側の焦点位置 を計測し、計測した焦点位置に基づいて、所望の収容部に収容された生体試料内の 観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し、決定した焦点位置に対 物レンズの焦点位置を合わせ、対物レンズを介して生体試料を撮像することで当該 生体試料の発光画像を取得する。これにより、基板が有する各収容部(例えばマイク 口プレートが有する各ゥエル)に収容された生体試料の撮像を、迅速且つ正確に行う こと力 Sできる。
[0151] なお、本発明は、対物レンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および/ または対物レンズを移動した際、当該基板および/または当該対物レンズの移動先 での位置を計測し、計測した移動先での位置に関する移動先位置情報を当該所望 の収容部を識別するための収容部識別情報と関連付けて記憶してもよい。これにより 、対物レンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および/または対物レンズ を移動しょうとする際、当該所望の収容部に対応する収容部識別情報が記憶されて いれば、当該収容部識別情報と関連付けて記憶されている移動先位置情報に基づ いて基板および/または対物レンズを適切に移動することができる。
[0152] また、本発明は、(1)対物レンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および /または対物レンズを移動し、(2)生体試料へ光を照射し、(3)対物レンズの焦点位 置を変更し、(4)変更した焦点位置を計測し、(5)変更した焦点位置にて、光が照射 された生体試料を撮像し、 (6)撮像した撮像画像に基づレ、て当該撮像画像を特徴付 ける特徴量を算出し、(7)前記の"焦点位置の変更"、 "焦点位置の計測"、 "試料の 撮像"および"特徴量の算出"を繰り返し実行し、(8)繰り返し実行して蓄積した複数
の焦点位置から、当該繰り返し実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくと も 1つの焦点位置を選出し、(9)選出した焦点位置に基づいて、所望の収容部に収 容された生体試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し、 ( 10)決定した焦点位置に対物レンズの焦点位置を合わせ、(11)対物レンズを介して 生体試料を撮像することで当該生体試料の発光画像を取得する。これにより、基板 が有する各収容部(例えばマイクロプレートが有する各ゥエル)に収容された生体試 料の撮像を、迅速且つ正確に行うことができる。
[0153] なお、本発明は、前記の(1)の処理で、対物レンズの視野内に所望の収容部が収 まるまで基板および/または対物レンズを移動し、当該基板および/または当該対 物レンズの移動先での位置を計測し、計測した移動先での位置に関する移動先位 置情報を当該所望の収容部を識別するための収容部識別情報と関連付けて記憶し てもよレ、。これにより、対物レンズの視野内に所望の収容部が収まるまで基板および /または対物レンズを移動しょうとする際、当該所望の収容部に対応する収容部識 別情報が記憶されていれば、当該収容部識別情報と関連付けて記憶されている移 動先位置情報に基づいて基板および/または対物レンズを適切に移動することがで きる。
[0154] [2·装置構成]
つぎに、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装置 1の 構成の具体的一例について、図 33から図 39を参照して詳細に説明する。なお、上 述した第 1実施形態や第 2実施形態の説明と重複する説明を省略する場合がある。
[0155] まず、図 33および図 34はそれぞれ、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置とし ての焦点位置決定装置 1の構成の具体的一例を示す図である。図 33および図 34に 示す第 3実施形態の焦点位置決定装置 1はそれぞれ、図 13および図 17に示す第 1 実施形態の焦点位置決定装置 1において、試料容器 11、水槽 12および試料ステー ジ 17の所定の位置に取り付けられたステッピング 'モータの構成を変更したものであ る。また、図 35は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定 装置 1の構成の具体的一例を示す図である。図 35に示す第 3実施形態の焦点位置 決定装置 1は、図 20に示す第 2実施形態の焦点位置決定装置 1において、試料容
器 11、水槽 12および試料ステージ 17の所定の位置に取り付けられたステッピング · モータの構成を変更したものである。
[0156] ここで、図 33、図 34および図 35において、試料容器 11は、具体的には、複数のゥ エルを有するマイクロプレートである。マイクロプレートの底面(少なくともゥヱルに対応 する部分の底面)は、平らであり、光学的に透明なもの(通常の対物レンズで対応で きるようなもの)である。また、水槽 12は、図示の如ぐその底面を設けず、試料容器 1 1を囲うように構成されている。また、ステッピング 'モータ(図示せず)の数は 3個であ り、各ステッピング 'モータは互いに直交する向き(90° 方向)で試料ステージ 17の 所定の位置に取り付けられている。そして、試料ステージ 17は、これらステッピング' モータの駆動力に因り、当該ステージが配設された位置から光軸(z軸)方向や、それ に直交する方向(例えば X方向や y方向)に移動可能である。
[0157] つぎに、図 36は、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定 装置 1の構成の具体的一例を示す図である。図 36に示す第 3実施形態の焦点位置 決定装置 1は、図 21に示す第 2実施形態の焦点位置決定装置 1において試料容器 11および試料ステージ 17を変更したものである。
[0158] ここで、図 36において、試料容器 11は、具体的には、複数のゥヱルを有するマイク 口プレートである。マイクロプレートの底面(少なくともゥエルに対応する部分の底面) は、平らであり、光学的に透明なもの(通常の対物レンズで対応できるようなもの)であ る。また、試料ステージ 17は、当該ステージを光軸 (Z軸)に沿って移動させたり、そ れに直交する方向(XY方向)に移動させたりするステージ XYZ軸移動機構を備えて いる。
[0159] つぎに、図 37は、第 3実施形態にかかる検查システムの構成の具体的一例を示す 図である。図 37に示す検查システムは、複数の容器(特にマイクロプレートの多数の ゥエル)ごとの検体を網羅的に解析するのに適したスループットの高い構成を有して いる。
[0160] 図 37に示す検查システムには、多数のゥヱルをマトリックス状に配置した図 38に示 すマイクロプレートを格納するマイクロプレートチャンバ 111D力 電動ステージ 112 D上に取り外し可能に固定されている。
[0161] マイクロプレートチャンバ 11 IDの上方には、明視野観察を行うための照明系が配 置されている。一方、マイクロプレートチャンバ 111Dの下方には、マイクロプレートの 各ゥエルに収納されてレ、る細胞等の試料画像を接眼レンズ 113Dにより肉眼で明視 野観察するための観察系と、撮像装置 114Dで喑視野撮像するための撮像系と、が 配置されている。
[0162] ゥエル内に収容される細胞を含む試料ないし生体組織は、個々の細胞が認識でき る程度に、光路上で重ならない程度の低密度である。この点、ノレミノメータのようなゥ エル全体の発光量を解析するシステムのような重畳された高密度の細胞数による測 定とは異なる。
[0163] マイクロプレートチャンバ 111Dと照明系のレンズ要素は、細胞や抗原'抗体等の生 物学的試料を活性維持可能な温度に維持するための保温箱 115D内に格納されて いる。ここで、前述の観察系および撮像系の各種レンズ要素は、保温箱 115Dの外 部に配置され、さらに遮光性を有する断熱部材 (例えばアルミフィルム、セラミックス 筒体)により保護されている。
[0164] 電動ステージ 112Dは、コントローラ 132Dの制御で 3つのモータを適宜駆動させる ことで光軸方向(Z軸)やそれに直交する方向(XY方向)に移動可能である。対物レ ンズ 121Dには、当該対物レンズを光軸(Z軸)方向に移動する対物レンズ Z軸駆動 機構が備えられている。
[0165] マイクロプレートチャンバ 111D内の試料力 発した光は、適切な光学条件に設定 された対物レンズ 121Dを通過後、最下部の結像用ミラーで反射し、さらに結像用レ ンズを経て撮像装置 114Dに送られる。他方、図 37に示すような可動ミラーを選択的 に光路上に侵退させることで接眼レンズ 113Dを介した選択的な観察を実行すること によって、試料力 の微弱光を検出する場合の光損失を極力防止できると共に、観 察に最適な高反射性のミラーを接眼レンズ 113Dに採用できる。なお、可動ミラーの 駆動は、 自動切換え式であっても、スライド棒による手動操作式であってもよい。
[0166] 保温箱 115Dは、外部環境(光、気温、湿度、酸素等)からの影響を遮断するため の喑箱 116Dにさらに格納されており、これにより本検查システム全体は二重構造に なっている。喑箱 116Dには、内部の空調効率を適宜考慮した位置に、温風導入装
置 117D (図 37では暗箱の上部左側壁側)及び温風排出装置 118D (図 37では暗 箱の上部右側壁側)を設置している。また、保温箱 115D及び暗箱 116Dにはそれぞ れ内側扉及び外側扉を設けており、電動ステージ 112D上に設置するマイクロプレ ートを交換可能にしている。
[0167] 喑箱 116Dの外部には、熱的トラブルを回避するように配慮して、照明系のための 光源(図 37ではハロゲンランプ) 120Dと、撮像系のための撮像装置(図 37では C— CCDカメラ) 114Dとを配置している。撮像装置 114Dのための結像レンズと波長選 択用の回転フィルタホイールは、保温箱 115Dと喑箱 116Dの間に配置されている。
[0168] 図 37に示すように、マイクロプレート内の観察及び撮像を厳密に合焦するために、 赤外光又は可視光による指定点フォーカスを行うレーザ検出機構を設置してもよい。 指定点フォーカスを行う場合には、例えばマイクロプレートの底面からの反射を測定 するために、電動ステージ 112Dの下方に光分割ミラーを配置することとなる。このよ うな指定点フォーカスは、細密な画像分解能を要求する場合を除いて、必須な構成 ではない。なお、光分割ミラーに関しては、赤外線を用いることで、ダイクロックミラー により試料からの光損失を最小限にすることが好ましぐ可視光線を用いる場合には 、フォーカシングできる最小限の反射率からなるハーフミラーを使用する力、或いは 上述したような可動式のミラーにすることで同様に光損失を防止するのが好ましい。
[0169] 撮像装置 114Dから送出された画像データは、演算処理部 130Dにより統計解析 ないし形状解析されて、表示部 131Dに表示される。これにより、時系列での解析を ゥエルごとに行ったり、ゥエル間の比較を行ったりするような多様な解析を網羅的に実 行できる。表示部 131Dには、数値データを、時系列曲線でもってグラフィカルに表 示することが可能である。また、本検查システムは、コントローラ 132Dと接続した画像 データ記憶部 133Dに画像データを記憶すると共に、画像データ記憶部 133Dで記 憶した画像データを必要に応じて表示部 131Dに呼び出し映像として再生することが 可能となっていることが特徴である。従って、本検查システムによれば、グラフィカル な表示データのうち興味有るデータについてそのデータ部分 (測定点ないしデータ 領域)を適宜の指定手段(マウスポインタ、タツチペン、キーボード等)で指定すること により、その部分の時系列データを静止画像ないし動画像で再生するリコール機能
を発揮させることも可能である。本検査システムによれば、表示部 131Dに、画像デ ータのみを表示したり、画像データと数値データとの組合せを表示したりすることもで きる。なお、本検査システムによれば、この場合には、さらに、表示された画像のうち 興味有る画像の部位または領域を適宜の指定手段で指定することによって、対応す る数値やグラフを呼び出したり、特定の数値なレ、しグラフ部位を色別等で強調して確 認し易いようにしたりすることも可能である。さらに、本検查システムによれば、多数の 容器ごとに異なる検体 (例えば、臓器別、病態別、患者別、測定項目別)を収容する 場合には、検体別に所望の順番ないし相関関係を表示部 131Dに表現するように解 析させることも可能である。これら各種の多様な解析ないし表示形式は、交換可能な ソフトウェアないし内部プログラムによって、実行可能に設計することで実現できる。
[0170] 以上の構成において、各種の電気的制御および信号処理の管理及び制御は、コ ントローラ 132Dが一元的に行う構成となっている。コントローラ 132Dは、上述した多 数の検査装置や検査システムを通信回線 (無線でも有線でもよレ、)等で通信可能に 連携可能した遠隔システムによって、分散的に又はホストコンピュータの集中管理で 、データ共有化や診断等の医療連携をリアルタイムに行うようにしてもよい。また、種 々の有用な医学的データベースとコントローラ 132Dとを通信等で接続可能にするこ とにより、リアルタイムに最新データを入手しながら、生体システムとの関連を解析す るようにすることち可言である。
[0171] 図 39は、上述した検査システムの変形例であり、対物レンズで画像化する場合の 例を示す。電動制御される XYZステージ 201E上には、底面が平坦なガラス製ない しプラスチック製のマイクロプレート 203Eが固定されている。ここで、マイクロプレート 203Eに形成された全てのゥヱル 207Eが下方に露出するように、マイクロプレート 20 3Eの周囲のみを XYZステージ 201E上に接地させるようになってレ、る。マイクロプレ ート 203Eの上方には、各ゥエル 207E及び当該マイクロプレート上部を覆うように蓋 をし且つ当該マイクロプレートを XYZステージ 201E上に固定するためのプレート力 バー 202Eが配置している。プレートカバー 202Eには図示せぬ配管が形成され、プ レートカバー 202Eは、軟性のチューブ 209aEを通じて各ゥヱルに所定条件の気体( 例えば炭酸ガス、熱風)を給排するための気体供給部 210Eと接続している。また、
全体を格納するハウジング 206Eは、プレート交換、試薬分注、換気等を行うための 開閉式の上部ハウジング 206aEと、各手段を固定するためのベースとなる下部ハウ ジング 206bEと、を具備している。ハウジング 206E内全体の温度は、温風発生装置 208Eからチューブ 209bEを通じて当該ハウジング内に温風が送られることで、生物 活性に都合の良いように昇温される。なお、マイクロプレート 203E及び XYZステージ 201Eの温度は、温度センサ 211Eにより、図 37で示したようなコントローラを通じて 所望の温度となるように温度制御するのが好ましい。
[0172] 微弱光の例である発光(特に細胞内生物発光)の観察においては、低倍率 (例えば 2倍〜 20倍、特に 4倍〜 10倍)の対物レンズ 204Eで、個々の細胞を網羅的に認識 できる視野を得るのが好ましいので、マイクロプレート 203Eの移送を自在に行うのに 適している。いずれの倍率の対物レンズ 204Eにおいても、マイクロプレート 203Eの 接地誤差やロット差を考慮すべきである場合には、図示するような Z軸駆動機構 205 Eによって、マイクロプレート 203Eの底面との距離を適宜の距離に保つような調整を 行うのが好ましい。
[0173] これにて、第 3実施形態の各装置の構成の説明を終了する。
[0174] [3.焦点位置決定装置 1の処理]
つぎに、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装置 1が 行う生体試料撮像 ·解析処理について図 40等を参照して説明する。図 40は、第 3実 施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装置 1が行う生体試料撮 像'解析処理の一例を示すフローチャートである。なお、ここでは、生体細胞の明視 野観察および発光観察を図 33に示す焦点位置決定装置 1を用いて行う場合におけ る処理について説明する。
[0175] 観察者が、試料 10である生体細胞を各ゥエルに入れたマイクロプレートを試料ステ ージ 17上に設置し、焦点位置決定装置 1および光源 20を起動させると、焦点位置決 定装置 1は以下の処理を行う。
[0176] まず、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、生体細胞の タイムラブス観察を行う際の時間間隔(タイムラブス間隔)および当該タイムラブス観 察を行う回数 (タイムラブス回数)を、観察者に指定させる(ステップ SC _ 1 )。
[0177] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、マイクロプ レートが有するゥエルのうち観察対象とするゥエル (観察対象ゥエル)の数ならびに各 観察対象ゥエルの観察順序およびマイクロプレート上での位置を、観察者に指定さ せる(ステップ SC— 2)。
[0178] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、試料ステ ージ 17の所定の位置に取り付けられた各ステッピング 'モータを適宜動作させ、当該 ステッピング ·モータの動作により、ステップ SC— 2で指定された位置(具体的には、 観察対象ゥヱルのうち観察順の早いもののマイクロプレート上での位置)に基づいて
、当該位置に対応する観察対象ゥエルが対物レンズ 30の視野内に収まるまでマイク 口プレート(実際には試料ステージ 17)を移動することで、当該観察対象ゥエルの位 置決め(位置合わせ)を行う(ステップ SC— 3)。なお、ステップ SC— 3において、マイ クロプレートを移動し終わったら、当該マイクロプレートの移動先でのゥヱルの位置を 計測し、計測した移動先でのゥエルの位置に関する移動先位置情報を、当該ゥエル を識別するための収容部識別情報と関連付けて記憶してもよい。これにより、以前に 位置決めを行ったゥエルと同じゥエルの位置決めを再度行う際には、記憶している移 動先位置情報および収容部識別情報に基づいて速やか且つ適切に当該同じゥエル の位置決めを行うことができる。
[0179] つぎに、焦点位置決定装置 1は、明視野観察を開始するために、光源 20から発せ られた照明光の生体細胞への照射を開始する(ステップ SC— 4)。
[0180] つぎに、焦点位置決定装置 1は、ステップ SC— 3で位置決めした観察対象ゥエル に対応する明視野観察用の焦点位置を記憶してレ、なレ、場合 (ステップ SC— 5: No) には、情報処理装置 70の制御部 70aにより各処理部を適宜動作させて、図 41に示 す焦点位置決定処理を実行することにより、当該位置決めした観察対象ゥエルに対 応する明視野観察用の焦点位置を決定し記憶する (ステップ SC_6)。なお、ステツ プ SC— 3で位置決めした観察対象ゥエルに対応する明視野観察用の焦点位置を記 憶してレ、る場合(ステップ SC— 5: Yes)には、ステップ SC— 7に進む。
[0181] ここで、第 3実施形態にかかる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装置 1が行 う焦点位置決定処理について図 41を参照して説明する。図 41は、第 3実施形態に
力かる生体試料撮像装置としての焦点位置決定装置 1が行う焦点位置決定処理の 一例を示すフローチャートである。なお、ここでは、図 33に示す焦点位置決定装置 1 を用いて行う場合における処理について説明する。
[0182] まず、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより対物レンズ z軸 移動機構を動作させ、対物レンズ z軸移動機構により対物レンズ 30を、初期位置から 光軸に沿って一定量だけ移動させることで、対物レンズ 30の焦点位置を変更する(ス テツプ SD_ 1)。
[0183] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより焦点位置計 測部 50を動作させ、焦点位置計測部 50により対物レンズ 30の焦点位置を検出し記 憶する(ステップ SD— 2)。
[0184] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより CCDカメラ を動作させ、 CCDカメラにより、光が照射されている場合には生体細胞の明視野画 像を、光が照射されていない場合には生体細胞の発光画像を撮像し記憶する (ステ ップ SD— 3)。
[0185] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより特徴量算出 部 70alを動作させ、特徴量算出部 70alにより、ステップ SD— 3で撮像した撮像画 像(明視野画像または発光画像)に基づいて当該撮像画像のコントラストを算出する (ステップ SD— 4)。ここで、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70a により、ステップ SD— 2で検出した焦点位置、ステップ SD— 3で撮像した撮像画像 およびステップ SD— 4で算出したコントラストを相互に関連付けて、記憶部 70bの撮 像画像データベース 70b 1に格納する。
[0186] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、ステップ S D_ 1からステップ SD— 4を、ステップ SD_ 1で変更した対物レンズ 30の焦点位置 が光軸上の予め定められた位置を越えるまで、繰り返し実行する(ステップ SD_ 5)。
[0187] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより焦点位置選 出部 70a2を動作させ、焦点位置選出部 70a2により、撮像画像データベース 70bl に格納された複数のコントラストのうち極大となる 2つのコントラストを選出し、選出した 各コントラストと対応付けられている撮像画像データベース 70blに格納されている 2
つの焦点位置を取得し、そして情報処理装置 70の制御部 70aにより焦点位置決定 部 70a3を動作させ、焦点位置決定部 70a3により、取得した 2つの焦点位置に基づ いて、当該 2つの焦点位置の中央の位置(略中央の位置)を、生体細胞内の観察対 象部位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定する(ステップ SD— 6)。 換言すると、焦点位置決定装置 1は、焦点位置選出部 70a2により、撮像画像データ ベース 70blに格納された複数の焦点位置から、撮像画像データベース 70blに格 納された複数の特徴量に基づレ、て、対物レンズ 30の近点側の焦点位置(略焦点位 置)および対物レンズ 30の遠点側の焦点位置(略焦点位置)を選出し、焦点位置決 定部 70a3により、選出した近点側の焦点位置および遠点側の焦点位置に基づいて 、この 2つの焦点位置の中央の位置(略中央の位置)を、生体細胞内の観察対象部 位 10aに合うような対物レンズ 30の焦点位置として決定する。
[0188] これにて、焦点位置決定処理の説明を終了する。
[0189] 図 40に戻り、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより対物レ ンズ z軸移動機構を動作させ、対物レンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30の焦点 位置がステップ SC— 6で決定した明視野観察用の焦点位置 (又は記憶している明視 野観察用の焦点位置)に合うまで当該対物レンズを光軸に沿って移動させ、そして情 報処理装置 70の制御部 70aにより CCDカメラを動作させ、 CCDカメラにより、移動さ せた焦点位置において、生体細胞の明視野画像を撮像し記憶する (ステップ SC— 7 ) 0
[0190] つぎに、焦点位置決定装置 1は、明視野観察を終了するために、光源 20から発せ られた照明光の生体細胞への照射を終了する(ステップ SC— 8)。
[0191] つぎに、焦点位置決定装置 1は、ステップ SC_ 3で位置決めした観察対象ゥエル に対応する発光観察用の焦点位置を記憶してレ、なレ、場合 (ステップ SC _ 9: No)に は、情報処理装置 70の制御部 70aにより各処理部を適宜動作させて、上述した図 4 1に示す焦点位置決定処理を実行することにより、当該位置決めした観察対象ゥエル に対応する発光観察用の焦点位置を決定し記憶する(ステップ SC_ 10)。なお、ス テツプ SC_ 3で位置決めした観察対象ゥエルに対応する発光観察用の焦点位置を 記憶してレ、る場合 (ステップ SC _ 9: Yes)には、ステップ SC _ 11に進む。
[0192] つぎに、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより対物レンズ z 軸移動機構を動作させ、対物レンズ z軸移動機構により、対物レンズ 30の焦点位置 力 Sステップ SC— 10で決定した発光観察用の焦点位置 (又は記憶している発光観察 用の焦点位置)に合うまで当該対物レンズを光軸に沿って移動させ、そして情報処理 装置 70の制御部 70aにより CCDカメラを動作させ、 CCDカメラにより、移動させた焦 点位置にぉレ、て、生体細胞に関する微弱光画像としての発光画像を撮像し記憶す る(ステップ SC— 11)。
[0193] つぎに、焦点位置決定装置 1は、ステップ SC_ 2で指定された解析対象ゥエルの 数だけ明視野観察および発光観察が終了してレ、なレ、場合 (ステップ SC— 12: No) には、情報処理装置 70の制御部 70aにより各処理部を適宜動作させて、明視野観 察および発光観察が終了していない残りの解析対象ゥヱルに対してステップ SC_ 3 力 SC_ 11までの処理を繰り返し実行する。
[0194] 一方、焦点位置決定装置 1は、ステップ SC— 2で指定された解析対象ゥエルの数 だけ明視野観察および発光観察が終了した場合 (ステップ SC— 12 : Yes)には、情 報処理装置 70の制御部 70aにより、タイムラブス観察の実行済み回数を確認し、確 認した結果、ステップ SC— 1で指定されたタイムラブス回数が終了した場合 (ステップ SC— 13: Yes)にはステップ SC— 15に進む。
[0195] 一方、焦点位置決定装置 1は、ステップ SC— 1で指定されたタイムラブス回数が終 了してレヽなレ、場合 (ステップ SC— 13: No)には、情報処理装置 70の制御部 70aによ り、タイムラブス観察の開始からの経過時間を確認し、確認した結果、ステップ SC— 1で指定されたタイムラブス間隔が経過した場合 (ステップ SC— 14 : Yes)には、残り のタイムラブス観察を開始するためにステップ SC— 3へ戻る。
[0196] そして、焦点位置決定装置 1は、情報処理装置 70の制御部 70aにより、これまでに ステップ SC_ 11で取得した発光画像を画像解析すると共に、それを表示し記録す る(ステップ SC— 15)。なお、この発光画像の画像解析は、これまでにステップ SC— 7で取得した明視野画像と一緒に画像解析する(具体的には発光画像と明視野画像 との重ね合わせ画像に対して画像解析する)ことにより、より迅速かつ正確な解析を 行うことができる。
[0197] これにて、生体試料撮像'解析処理の説明を終了する。
[0198] 以上、第 3実施形態の説明を終了する。
[0199] [実施例]
本実施例では、第 2実施形態の焦点位置決定装置 1でプラスミドベクターを導入し た複数の HeLa細胞に対物レンズの焦点を合わせ、複数の HeLa細胞の中力 対象 とする HeLa細胞を選定し、選定した HeLa細胞内のミトコンドリアからの発光量およ び ATP量を経時的に測定した。まず、本実施例における実験を、以下の(手順:!)〜 (手順 7)に従って行った。
[0200] (手順 1)蛍光タンパク質(GFP)とミトコンドリア移行シグナルとルシフェラーゼとが繋 がった融合遺伝子を作製する。
(手順 2)融合遺伝子が入ったプラスミドベクターを HeLa細胞に導入する。
(手順 3)焦点位置決定装置 1により、 HeLa細胞内のミトコンドリアに対物レンズの焦 点位置を予め合わせて、 CCDカメラで HeLa細胞を照明下と照明無しのそれぞれで 撮像し、撮像した撮像画像(蛍光画像)に基づいて GFPがミトコンドリアに局在してい るか否かを判定することで、ルシフェラーゼがミトコンドリアに局在しているか否かを確 認する(図 23参照)。図 23はプラスミドベクターを導入した HeLa細胞の照明画像お よび蛍光画像を示す図である。
(手順 4) HeLa細胞にヒスタミンを投与し、 Ca2+を介したミトコンドリアの ATP量の変 動を引き起こす。
(手順 5) CCDカメラで HeLa細胞を照明下と照明無しのそれぞれで撮像することで、 HeLa細胞内のミトコンドリアからの発光を捉えた発光画像を経時的に取得する(図 2 4参照)。図 24はプラスミドベクターを導入した HeLa細胞の照明画像および発光画 像を示す図である。
(手順 6)撮像した照明画像、蛍光画像および発光画像を重ね合わせることで、対象 とする HeLa細胞を選定する。
(手順 7)選定した HeLa細胞内のミトコンドリアからの発光強度の時間変化を測定す ると共に、 ATP量の時間変動をモニタする。
[0201] つぎに、実験結果について説明する。図 23に示すように、番号 1の HeLa細胞にお
いては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフエ ラーゼが局在していることが確認できた。また、番号 2および番号 4の HeLa細胞にお いては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されていないことが確認できた。 さらに、番号 3の HeLa細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入 されているがミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していないことが確認できた。つま り、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラー ゼが局在していることが確認できた HeLa細胞は番号 1の HeLa細胞のみであつたの で、対象とする HeLa細胞は番号 1の HeLa細胞に選定された。また、図 24に示すよ うに、番号 3の HeLa細胞からの発光強度が最も大きぐついで番号 1の HeLa細胞か らの発光強度が大きぐついで番号 2および番号 4の HeLa細胞からの発光強度は同 等の大きさであることが確認できた。そして、図 25に示すように、番号 1の HeLa細胞 のミトコンドリアからの発光強度の経時変動をモニタすることができた。図 25は、選定 した番号 1の HeLa細胞からの発光強度の時間変化を示す図である。
[0202] 次に、以上で説明した本発明の微弱光画像の解析方法および解析装置にとって 有利な焦点位置の決定方法および装置を以下に付記項として述べる。上述した課 題を解決し、 目的を達成するために、本発明にかかる付記項 1に記載の焦点位置決 定方法は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦 点位置決定方法であって、対物レンズの近点側の焦点位置および/または対物レン ズの遠点側の焦点位置を計測し、計測した焦点位置に基づレ、て前記観察対象部位 に合うような対物レンズの焦点位置を決定することを特徴とする。
[0203] また、本発明にかかる付記項 2に記載の焦点位置決定方法は、試料内の観察対象 部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、試 料へ光を照射する光照射ステップと、対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変 更ステップと、前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を計測する焦点位置 計測ステップと、前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて、前記光照射 ステップで光が照射された試料を撮像する試料撮像ステップと、前記試料撮像ステツ プで撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量 算出ステップと、前記焦点位置変更ステップ、前記焦点位置計測ステップ、前記試料
撮像ステップおよび前記特徴量算出ステップを繰り返し実行する実行ステップと、前 記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複 数の特徴量に基づいて、少なくとも 1つの焦点位置を選出する焦点位置選出ステツ プと、前記焦点位置選出ステップで選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部 位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定ステップと、を含むこ とを特徴とする。
[0204] また、本発明にかかる付記項 3に記載の焦点位置決定方法は、付記項 2に記載の 焦点位置決定方法において、前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを 実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づ いて、 2つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選 出ステップで選出した 2つの焦点位置に基づレ、て、当該 2つの焦点位置の中央位置 を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴 とする。
[0205] また、本発明にかかる付記項 4に記載の焦点位置決定方法は、付記項 3に記載の 焦点位置決定方法において、前記 2つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点 位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
[0206] また、本発明にかかる付記項 5に記載の焦点位置決定方法は、付記項 2に記載の 焦点位置決定方法において、前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを 実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づ いて、 1つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選 出ステップで選出した 1つの焦点位置および予め定めた距離に基づレ、て、当該焦点 位置から当該距離だけ離れた位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの 焦点位置として決定することを特徴とする。
[0207] また、本発明にかかる付記項 6に記載の焦点位置決定方法は、付記項 5に記載の 焦点位置決定方法において、前記 1つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点 位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
[0208] また、本発明にかかる付記項 7に記載の焦点位置決定方法は、付記項 2から 6のい ずれ力、 1つに記載の焦点位置決定方法にぉレ、て、前記焦点位置決定ステップで決
定した焦点位置にて試料を撮像する決定位置試料撮像ステップと、前記決定位置試 料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定位置特徴量 算出ステップと、前記焦点位置決定ステップで決定した焦点位置を変更する決定後 焦点位置変更ステップと、前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置に て試料を撮像する決定後試料撮像ステップと、前記決定後試料撮像ステップで撮像 した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定後特徴量算出ステップと、前記決定 位置特徴量算出ステップで算出した特徴量と前記決定後特徴量算出ステップで算 出した特徴量とを比較する特徴量比較ステップと、前記特徴量比較ステップで比較し た結果、前記決定後特徴量算出ステップで算出した特徴量の方が大きかった場合に は、前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を、前記観察対象部位 に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定する焦点位置再決定ステップと、 をさらに含むことを特徴とする。
[0209] また、本発明にかかる付記項 8に記載の焦点位置決定方法は、付記項 2から 7のい ずれ力 1つに記載の焦点位置決定方法にぉレ、て、前記試料は生体細胞または組織 であることを特徴とする。
[0210] また、本発明は焦点位置決定装置に関するものであり、本発明にかかる付記項 9に 記載の焦点位置決定装置は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点 位置を決定する焦点位置決定装置であって、試料へ光を照射する光照射手段と、対 物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更手段と、対物レンズの焦点位置を計 測する焦点位置計測手段と、試料を撮像する試料撮像手段と、前記試料撮像手段 で撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量算 出手段と、前記焦点位置変更手段、前記焦点位置計測手段、前記試料撮像手段お よび前記特徴量算出手段を繰り返し実行させるよう、各々の手段を制御する制御手 段と、前記制御手段で前記各々の手段を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数 の焦点位置から、前記繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の特徴量に基づい て、少なくとも 1つの焦点位置を選出する焦点位置選出手段と、前記焦点位置選出 手段で選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部位に合うような対物レンズの 焦点位置を決定する焦点位置決定手段と、を備えたことを特徴とする。
[0211] また、本発明に力かる付記項 10に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9に記載 の焦点位置決定装置において、前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦 点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、 2つの焦点位置を選出し、前 記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した 2つの焦点位置に基づ いて、当該 2つの焦点位置の中央位置を、前記観察対象部位に合うような対物レン ズの焦点位置として決定することを特徴とする。
[0212] また、本発明にかかる付記項 11に記載の焦点位置決定装置は、付記項 10に記載 の焦点位置決定装置において、前記 2つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦 点位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
[0213] また、本発明にかかる付記項 12に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9に記載 の焦点位置決定装置において、前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦 点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、 1つの焦点位置を選出し、前 記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した 1つの焦点位置および 予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、前記 観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
[0214] また、本発明に力かる付記項 13に記載の焦点位置決定装置は、付記項 12に記載 の焦点位置決定装置において、前記 1つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦 点位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
[0215] また、本発明に力かる付記項 14に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 13 のいずれか 1つに記載の焦点位置決定装置において、前記特徴量算出手段で予め 個別に算出した 2つの特徴量を比較する特徴量比較手段と、前記特徴量比較手段 で比較した結果に基づいて前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を 再度決定する焦点位置再決定手段とをさらに備え、前記焦点位置決定手段で決定 した焦点位置にて前記試料撮像手段で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づい て前記特徴量算出手段で特徴量を算出し、前記焦点位置決定手段で決定した焦点 位置を前記焦点位置変更手段で変更し、変更した焦点位置にて前記試料撮像手段 で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づレ、て前記特徴量算出手段で特徴量を算 出し、前記決定した焦点位置に対応する特徴量と前記変更した焦点位置に対応す
る特徴量とを前記特徴量比較手段で比較し、比較した結果、前記変更した焦点位置 に対応する特徴量の方が大きかった場合には、前記焦点位置再決定手段で、前記 変更した焦点位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として 再度決定することを特徴とする。
[0216] また、本発明に力、かる付記項 15に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 14 のいずれか 1つに記載の焦点位置決定装置において、前記試料は生体細胞または 組織であることを特徴とする。
[0217] また、本発明に力、かる付記項 16に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 15 のいずれか 1つに記載の焦点位置決定装置において、前記光照射手段を含む照明 光学系の瞳位置に開口を配置したことを特徴とする。
[0218] また、本発明にかかる付記項 17に記載の焦点位置決定装置は、付記項 16に記載 の焦点位置決定装置において、前記開口を光軸に対して偏芯させて配置したことを 特徴とする。
[0219] また、本発明に力かる付記項 18に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 15 のいずれか 1つに記載の焦点位置決定装置において、前記光照射手段を含む照明 光学系に狭帯域通過フィルターを配置したことを特徴とする。
[0220] また、本発明にかかる付記項 19に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 18 のいずれか 1つに記載の焦点位置決定装置において、前記光照射手段は単色の可 視光を発することを特徴とする。
[0221] また、本発明にかかる付記項 20に記載の焦点位置決定装置は、付記項 9から 19 のいずれ力 1つに記載の焦点位置決定装置において、試料へ励起光を照射する励 起光照射手段をさらに備えたことを特徴とする。
[0222] 上述した付記項によれば、対物レンズの近点側の焦点位置(略焦点位置)および /または対物レンズの遠点側の焦点位置(略焦点位置)を計測し、計測した焦点位 置に基づいて試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する ので、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を 行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点 位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位
に合わせることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料内の発光部 位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光 部位に対物レンズの焦点を合わせることができるという効果を奏する。
[0223] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、 (1) 試料へ光を照射し、(2)対物レンズの焦点位置を変更し、 (3)変更した焦点位置を計 測し、 (4)変更した焦点位置にて、光が照射された試料を撮像し、(5)撮像した撮像 画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出し、 (6) (2)〜(5)を繰り返し実 行し、 (7)実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量 に基づいて、少なくとも 1つの焦点位置を選出し、 (8)選出した焦点位置に基づいて 、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定するので、試料 内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、 試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決 定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせ ることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料内の発光部位の発 光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に 対物レンズの焦点を合わせることができるという効果を奏する。
[0224] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、前記 の(7)では、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴 量に基づいて、 2つの焦点位置を選出し、前記の(8)では、選出した 2つの焦点位置 に基づいて、当該 2つの焦点位置の中央位置(略中央位置)を、試料内の観察対象 部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試料内の観察対象部 位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができるという効果を奏 する。
[0225] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、 2つ の焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置(略焦点位置)および対物レンズの 遠点側の焦点位置(略焦点位置)であるので、試料内の観察対象部位に合うような対 物レンズの焦点位置を容易かつ簡便に決定することができるという効果を奏する。
[0226] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、前記
の(7)では、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴 量に基づいて、 1つの焦点位置を選出し、前記の(8)では、選出した 1つの焦点位置 および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を 、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試 料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置をさらに容易に決定すること ができるとレ、う効果を奏する。
[0227] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、 1つ の焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置(略焦点位置)または対物レンズの 遠点側の焦点位置(略焦点位置)であるので、試料内の観察対象部位に合うような対 物レンズの焦点位置をさらに容易かつ簡便に決定することができるという効果を奏す る。
[0228] また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、 (9) 前記の(8)で決定した焦点位置にて試料を撮像し、 (10)撮像した撮像画像に基づ レ、て特徴量を算出し、(11)前記の(8)で決定した焦点位置を変更し、(12)変更した 焦点位置にて試料を撮像し、(13)撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、 ( 14) (10)で算出した特徴量と(13)で算出した特徴量とを比較し、(15)比較した結 果、(13)で算出した特徴量の方が大きかった場合には、(11)で変更した焦点位置 を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定する ので、試料を設置した時点だけでなぐ試料の発光観察を開始してからも、試料内の 観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し続けることができ、その結 果、対物レンズの焦点位置を常に当該観察対象部位に合わせることができるという効 果を奏する。ここで、生体試料が生体細胞または組織であるので、微弱光を発するも のを試料として用いることができるとレ、う効果を奏する。
[0229] また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、光照射手段(光源)を含む照明 光学系の瞳位置に開口を配置することにより、透過光と回折光との位相差を大きくす ること力 Sでき、その結果、撮像画像のコントラストを高くすることができるという効果を奏 する。開口を光軸に対して偏芯させて配置することにより、透過光と回折光との位相 差をさらに大きくすることができ、その結果、撮像画像のコントラストをより高くすること
力 Sできるという効果を奏する。また、光照射手段 (光源)を含む照明光学系に狭帯域 通過フィルターを配置することにより、光源から発せられた光を、波長帯域バンド幅の 極めて狭い単色光とすることができ、その結果、撮像画像のコントラストを高くすること ができるという効果を奏する。また、光照射手段(光源)は単色の可視光を発するので 、光源力 発せられた光を試料に照射したときに、波長分散がほとんど無くなり、シャ ープな回折光を得ることができ、その結果、撮像画像のコントラストを高くすることがで きるという効果を奏する。また、試料へ励起光を照射する励起光照射手段 (励起用光 源)をさらに備えることにより、試料の蛍光観察と発光観察とを同時に行うことができる という効果を奏する。
また、本発明によれば、以下の付記項に記載の発明を包含すると解することもでき る。
付記項 1 A:微弱光を発する生体試料を画像解析するにあたり、生体試料の解析す べき対象部位に前記微弱光とは異なる種類の電磁エネルギーを用いて前記対象部 位に関する少なくとも一つの基準位置を決定し、前記基準位置に対する前記対象部 位に対応する微弱光用の焦点位置を決定し、決定された焦点位置に照準して前記 微弱光による画像化を実行し、微弱光画像から必要な測定パラメータの数値を抽出 し、抽出したパラメータ数値に基いて対象部位の評価を行うこと、を特徴とする微弱 光画像の解析方法。
付記項 2A:前記基準位置の決定が、前記電磁エネルギーによる基準画像の取得を 含むことを特徴とする付記項 1Aに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 3A:前記基準画像の取得が、前記対象部位を含む試料領域について画像 取得することを特徴とする付記項 2Aに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 4A:前記電磁エネルギー力 S、生体へのダメージが少ない可視光、近赤外線、 超音波、磁力線のレ、ずれかであることを特徴とする付記項 1Aまたは 2Aに記載の微 弱光画像の解析方法。
付記項 5A:直接的可視化が困難な微弱光を発する生体試料に対し可視化容易な 照射光を照射して可視化し、前記可視化された生体試料がもたらす基準画像につい て、前記基準画像からの光を受光する対物レンズの近点側の焦点位置および Zまた
は対物レンズの遠点側の焦点位置を基準位置として、前記生体試料の解析すべき 対象部位力 発する微弱光の画像化に必要な距離に相当する位置を前記対物レン ズによる微弱光用の焦点位置として決定し、決定した微弱光用の焦点位置に前記対 物レンズを照準して必要な画像が得られるまで微弱光を蓄積することにより前記生体 試料の微弱光画像を形成し、形成した前記微弱光画像から前記対象部位における 微弱光の有無または光強度を評価すること、を特徴とする微弱光画像の解析方法。
[0231] 付記項 6A:直接的可視化は、光学的画像形成のための露光時間が 10秒以上であ る場合に可視化が困難であると定義することを特徴とする付記項 5Aに記載の微弱光 画像の解析方法。
付記項 7A:前記照射光に基づく画像シグナルは透過光または蛍光であることを特徴 である付記項 5Aに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 8A:前記微弱光用の焦点位置の決定は、前記生体試料の観察部位ごとに行 うことを特徴とする付記項 1Aから 7Aのいずれ力 1つに記載の微弱光画像の解析方 法。
付記項 9A:前記基準位置と前記焦点位置は、対物レンズの同一のビーム経路上で 決定されることを特徴とする付記項 1Aから 8Aのいずれ力 1つに記載の微弱光画像 の解析方法。
付記項 10A:前記微弱光画像の取得を検査項目に応じた複数の時刻において実行 することにより複数の微弱光画像を蓄積し、蓄積された複数の前記微弱光画像にお ける観察対象部位を照合し、照合された複数の微弱光画像を時刻ごとに比較するこ とを特徴とする付記項 1Aから 9Aのいずれ力 1つに記載の微弱光画像の解析方法。
[0232] 付記項 11A:前記基準画像と前記微弱光画像のそれぞれの焦点位置を比較し設定 された距離範囲を外れた場合には、基準画像および Zまたは微弱光画像の取得を 再度実行することを特徴とする付記項 2Aから 10Aのいずれ力、 1つに記載の微弱光 画像の解析方法。
付記項 12A:前記微弱光画像の評価が、前記基準画像からの測定パラメータの取得 をさらに含んでおり、前記基準画像からの測定データと関連付けて前記微弱光パラメ ータの評価を行うことを特徴とする付記項 11Aに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 13A:前記基準画像における対象部位の輪郭情報に関連付けて前記微弱光 画像を評価することを特徴とする付記項 12Aに記載の微弱光画像の解析方法。 付記項 14A:評価が、前記対象部位の輪郭に相当する面積当たりの微弱光強度で あることを特徴とする付記項 1Aから 13Aのいずれ力、 1つに記載の微弱光画像の解析 方法。
付記項 15A:評価が、前記対象部位の輪郭における微弱光の位置または分布を決 定することを特徴とする付記項 1Aから 13Aのいずれか 1つに記載の微弱光画像の 解析方法。
[0233] 付記項 16A:前記生体試料が複数の収容部に個別に収容されており、前記基準位 置を個々の収容部ごとに実行することを特徴とする付記項 1Aから 15Aのいずれか 1 つに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 17A:前記微弱光画像の取得を複数の収容部を含む広角視野で実行するこ とを特徴とする付記項 1Aから 16Aのいずれ力 1つに記載の微弱光画像の解析方法 付記項 18A:前記微弱光画像を光学的および/または電気的に拡大することにより 、前記対象部位から測定パラメータの取得を行うことを特徴とする付記項 17Aに記載 の微弱光画像の解析方法。
付記項 19A:前記生体試料は生きた細胞または組織であることを特徴とする付記項 1 Aから 17Aのいずれか 1つに記載の微弱光画像の解析方法。
付記項 20A:前記微弱光は、生物発光性タンパク質の発現に伴う発光であることを 特徴とする付記項 1Aから 19Aのいずれ力 1つに記載の微弱光画像の解析方法。
[0234] 以上の説明から、本発明にかかる微弱光画像の解析方法および解析装置ならび に生体試料撮像方法および生体試料撮像装置は、とくに生体細胞の発光観察、蛍 光観察、蛍光 ·発光同時観察において産業上の利用可能性が高いことが理解できょ う。
[0235] [II]以下に、本発明にかかる生体試料の撮像方法および撮像装置の実施の形態を 図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定され るものではない。
[0236] 第 1の実施形態
第 1の実施形態の発光試料撮像方法を実施するための装置の構成について図 26 を参照して説明する。図 26は、第 1の実施形態の発光試料撮像方法を実施するため の装置の構成の一例を示す図である。図 26に示すように、第 1の実施形態の発光試 料撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル 1Aを短い露出時間 で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、対物レンズ 2Aと集光レンズ 3 Aと CCDカメラ 4Aと CPU5Aとで構成されている。なお、当該装置は図示の如くズー ムレンズ 6Aをさらに備えてもよい。
[0237] サンプル 1 Aは、発光試料であり、例えば、発光タンパク質 (例えば導入された遺伝 子 (ノレシフェラーゼ遺伝子など)から発現された発光タンパク質)や、発光性の細胞や 、発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の臓器や、発光性の個 体(動物など)などである。また、サンプル 1Aは、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子 を導入した発光細胞でもよい。対物レンズ 2Aは、開口数 (NA)および投影倍率( ) で表される(NA÷ )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上のものである 。集光レンズ 3Aは、対物レンズ 2Aを介して到達したサンプル 1Aからの発光を集め る。 CCDカメラ 4Aは、 0°C程度の冷却 CCDカメラであり、対物レンズ 2Aや集光レン ズ 3Aを介してサンプル 1Aを撮像する。 CPU5Aは CCDカメラ 4Aで撮像した画像を 出力する。
[0238] そして、対物レンズ 2Aや対物レンズ 2Aの包装容器(パッケージ)には、(NA/ β ) の 2乗の値を表記する。ここで、 (NA/ iS )の 2乗の値を表記した対物レンズの一例 について図 27を参照して説明する。図 27は、(NA/ i3 )の 2乗の値を表記した対物 レンズ 2Aの一例を示す図である。従来の対物レンズには、レンズ種類(例えば" Plan Apo")、倍率 ZNA油侵(例えば" ΙΟΟ Χ Ζΐ . 40oil")および無限遠/カバーガラス 厚 (例えば "∞/0. 17")が表記されていた。しかし、本実施形態にかかる対物レンズ (対物レンズ 2A)には、レンズ種類(例えば" PlanApo")、倍率 ZNA油侵(例えば" 100 X /1. 40oil")、無限遠 Zカバーガラス厚(例えば"∞Ζθ. 17")の他に、さら に射出開口角(例えば、 "(NAZ J3 )の2乗:0. 05")が表記されている。
[0239] 以上、説明したように、第 1の実施形態の発光試料撮像方法を実施するための装
置において、対物レンズ 2Aは、開口数 (NA)および投影倍率( )で表される(NA ÷ β )の 2乗の値が 0. 01以上、好ましくは 0. 039以上である。これにより、発光量の 少なレ、発光試料 (例えば、発光タンパク質 (例えば、導入された遺伝子(例えばルシ フェラーゼ遺伝子)から発現された発光タンパク質)や、発光性の細胞または発光性 の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体 (例えば動物や臓器など) など)でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる 。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な 画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる。また、対物レンズ 2Αは従来の対物レンズと比較して開口数が大きく且つ倍率が小さいので、対物レン ズ 2Αを用いれば広範囲を分解能よく撮像することができる。これにより、例えば動き のある発光試料や移動する発光試料や広い範囲に分布する発光試料を撮像対象と すること力 Sできる。また、対物レンズ 2Αには、当該対物レンズ 2Αおよび Ζまたは当該 対物レンズ 2Αを包装する包装容器 (パッケージ)に、開口数 (ΝΑ)および投影倍率( i3 )で表される(ΝΑ÷ )の 2乗の値(例えば 0· 01以上、好ましくは 0. 039以上)を 表記した。これにより、例えば発光画像観察を行う者は、表記された (NA÷ )の 2 乗の値を確認すれば、発光試料を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像す るのに適した対物レンズを容易に選択することができる。
従来、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアツセィにおいては、細胞を溶解 した後に発光量を測定するため、ある時点での発現量しか捉えることができず、しか も細胞全体の平均値としての計測になってしまう。また、培養しながらの計測におい ては、細胞コロニーの経時的な発現量の変化を捉えることはできる力 個々の細胞で の発現量の変化を捉えることはできない。そして、個々の細胞の発光を顕微鏡で観 察するためには、生きた細胞からの発光量が極めて弱いため、液体窒素温度レベル の冷却 CCDカメラで長時間露光したり、イメージ'インテンシファイアを装着した CCD カメラでフオトンカウンティングをしたりしなければならなレ、。そのため、発光検出の力 メラは高価で大掛力 なものになってしまう。しかし、レポーター遺伝子産物としての ルシフェラーゼの活性を示す個々の細胞の発光を顕微鏡によって観察する際、第 1 の実施形態の発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、イメージ'ィ
ンテンシファイアを装着することなぐ 0°C程度の冷却 CCDカメラを用いて定量的な画 像を取得することができる。すなわち、第 1の実施形態の発光試料撮像方法を実施 するための装置を利用すれば、生きた状態で個々の細胞の発光を 0°C程度の冷却 C CDカメラによって観察することができるので、イメージ'インテンシファイアゃフオトン カウンティングのための装置が不要である。つまり、低コストで発光試料の撮像を行う こと力 Sできる。また、第 1の実施形態の発光試料撮像方法を実施するための装置を利 用すれば、個々の生きた細胞の発光を、培養しながら経時的に観察することができ、 さらにリアルタイムに観察することもできる。また、第 1の実施形態の発光試料撮像方 法を実施するための装置を利用すれば、同じ細胞について、異なった条件での薬剤 や刺激の応答をモニタすることができる。
[0241] ここで、第 1の実施形態の発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レン ズの理解を容易にするために、従来の対物レンズおよびそれを用いた発光画像観察 について簡単に説明する。
一般に、顕微鏡観察における空間分解能 εは、下記数式 1で表される。 ε =0. 61 X λ ÷ΝΑ · · · (数式 1)
(数式 1において、 えは光の波長であり、 ΝΑは開口数である。 )
また、観察範囲の直径 dは、下記数式 2で表される。
d=D÷M · · · (数式 2)
(数式 2において、 Dは視野数であり、 Mは倍率である。なお、視野数は一般に 22か ら 26である。)
従来、顕微鏡用対物レンズの焦点距離は国際規格で 45mmとされていた。そして、 最近では、焦点距離を 60mmとする対物レンズが使われはじめている。この焦点距 離を前提にして NAが大きい、つまり空間分解能が高いレンズを設計すると作動距離 (WD)は一般には 0. 5mm程度であり、また長 WD設計のものでも 8mm程度であつ た。このような対物レンズを用いた場合、観察範囲は 0. 5mm径程度である。
[0242] しかし、ディッシュやガラズボトムディッシュに分散した細胞群や組織、個体の観察 を行う場合、観察範囲が 1から数 cmに及ぶことがある。このような範囲を分解能よく観 察したいときには、低倍率でありながら NAを大きい値で維持しなければならなレ、。換
言すると、 NAはレンズ半径と焦点距離との比であるので、 NAが大きいまま広い範囲 を観察できる対物レンズは、低倍である必要がある。そして、結果的に、このような対 物レンズは大口径となる。なお、大口径の対物レンズの製作では、一般的に光学材 料の物性の均一性やコーティングの均一性において、また、レンズ形状においても 高い精度が求められる。
[0243] また、顕微鏡観察の場合、光学系の透過率や対物レンズの開口数や CCDカメラの チップ面での投影倍率や CCDカメラの性能などが、像の明るさに大きく影響してくる 。そして、像の明るさは、開口数 (NA)を投影倍率( /3 )で割った値の 2乗、すなわち( NA/ β )の 2乗で評価される。ここで、対物レンズには、一般に、入射開口角 ΝΑと 射出開口角 NA'との間に下記数式 3の関係があり、 NA'2が、観察者の目や CCD力 メラなどに届く明るさを示す値である。
ΝΑ' =ΝΑ÷ β · · · (数式 3)
(数式 3において、 ΝΑは入射開口角(開口数)であり、 ΝΑΊま射出開口角であり、 β は投影倍率である。 )
一般の対物レンズにおいて、 ΝΑΊま高々 0· 04であり、 NA'2は 0· 0016である。ま た、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズにおける像の明るさ((ΝΑ/ i3 )の 2乗の値)を調査したところ、 0. 0005力ら 0. 002の範囲であった。
[0244] ところが、現在市販されている対物レンズを装着した顕微鏡を用いて、例えば細胞 内でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ発光している細胞を観察しても、当該細胞から の発光を目視で観察することができないし、さらに 0°C程度に冷却した CCDカメラを 用いて撮像した発光画像を観察しても細胞からの発光を確認することができない。な お、発光試料を観察する場合には、蛍光観察に必要な励起光の投影は不要である。 例えば、落射蛍光観察では、対物レンズは、励起光投影レンズと蛍光を集光して画 像を形成するレンズとの両方の機能を満たしている。そこで、光量の少ない発光を画 像で観察するためには、大きな NAと小さい j3の特性を有する対物レンズが必要であ る。そして、結果的に、当該対物レンズは大口径となる傾向がある。なお、このような 対物レンズでは、励起光投影の機能を考慮することなく機能を単純化して設計、製 造し易くすることが求められる。
[0245] また、発光や蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的 な機能発現を捉えるために、タイムラブスや動画撮像が求められている。最近では、 蛍光を利用したタンパク質 1分子の動画観察が行われている。これらの撮像では、単 位時間の撮像フレーム数が多いほど、画像 1フレームあたりの露出時間は短くなる。 このような観察においては、明るい光学系、特に、明るい対物レンズが必要となる。し かし、蛍光に比べて発光タンパク質の光量は少ないので、 1フレームの撮像に、例え ば 20分の露出時間を要することが多レ、。このような露出時間でタイムラブス観察を行 うには、動的な変化が非常に遅い試料に限られる。例えば、約 1時間に一度***す る細胞では、その周期内の変化を観察することはできない。従って、シグナル 'ノイズ 比を高く維持しながら少ない光量を効率よく画像化するために、光学系の明るさを向 上することは重要である。
[0246] 以上の経緯を踏まえて製作された第 1の実施形態の対物レンズは、一般に市販さ れている対物レンズに比べて、大きな NAと小さい の特性を有している。ここで、 0 °C〜5°Cの弱低温の冷却型 CCDを用いた場合において、(NA/ β )の 2乗の値が 0 . 01〜0. 09の範囲の対物レンズで、個々の細胞の発光タンパク質による発光画像 を 5分以内で生成でき、且つ個々の細胞についての発光量の計測も可能であった。 これに対して、同様の場合において、(NA/ J3 )の2乗の値が0· 007以下の対物レ ンズでは、肉眼ないし画像解析ソフトウェアによる認識可能な発光画像を生成出来な 力 た。よって、発光画像を生成可能な第 1の実施形態の対物レンズの(ΝΑ/ β ) の 2乗の値ほたは ΝΑ は、従来使用されていた対物レンズのその範囲よりも有意 に大きな値である。つまり、第 1の実施形態の対物レンズは、従来使用されて来た条 件とは異なる条件において明るい対物レンズである、と言うことができる。これにより、 第 1の実施形態の対物レンズのような明るい対物レンズを用いれば、光量の少ない 発光試料からの発光を、画像で観察することができる。また、より暗い像を観察するた めに、開口数の大きい第 1の実施形態の対物レンズを実体顕微鏡に装着することで 、イメージ 'インテンシファイアを装着することなぐ 0°C程度に冷却した CCDカメラで も、細胞の発光を画像で観察することができる。また、液体窒素冷却を用いる CCD力 メラで感度を上げる方法があるが、この場合 CCDカメラが非常に高価に且つ大規模
になる。しかし、第 1の実施形態の対物レンズを用いれば、ペルチヱ冷却による CCD カメラでも、細胞の発光を画像で観察することができる。なお、イメージ 'インテンシフ アイァを装着した CCDカメラによる撮像を行うと、標本がモザイク状に撮像され、発光 する細胞を特定することは非常に困難である(文献「David K. Welshら、 Curren t Biology, Vol. 14 (2004) 2289— 2295」参照)。
[0247] また、第 1の実施形態の対物レンズは、 5cmから 10cm程度の大口径である。これ により、従来では撮像対象となり得なかった揺れ、変形、***、移動等の動きの有る 発光試料や広い範囲に分布する発光試料などを、撮像対象とすること力 Sできる。第 1 の実施形態によれば、例えば、細胞を含む培養試料 (組織または細胞群)において、 lcm角相当、好ましくは 2cm〜5cm角相当以上の視野範囲を観察できるので、種々 の重要な組織ないし器官 (例えば、脳、視交叉上核、瞎臓、腫瘍組織、線虫など)の 全体もしくは大部分を、適宜、薄切片等で広視野で観察および解析できる点で好ま しい。なお、上記の説明により、液体窒素のような極低温の冷却 CCDの第 1の実施 形態への適用は排除されない。第 1の実施形態によれば、極低温の冷却 CCDでも 得られなかった高速な撮像を、対物レンズを含む受光前の光学的構成だけで実現 するようにしたからである。従って、第 1の実施形態の方法および装置に対して、極低 温の冷却 CCDを組合せることによって、高感度化が図られ且つ S/N比が増すので 、画質を向上させるようにすることが出来る。
[0248] 対物レンズ 2Aおよび結像用の集光レンズ 3Aとして用いるレンズは、例えば、それ ぞれ「Oil、 20倍、 NA0. 8」および「5倍、 NA0. 13」の仕様である市販の顕微鏡用 対物レンズであり、倍率 Mgに対応する総合倍率は 4倍である。 CCDカメラ 4Aは、例 えば、 5。C冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「DP30BW (ォリンパス社製)」であり、 CC D素子は、 2/3インチ型、画素数 1360 X 1024、画素サイズ 6 μ m角である。
[0249] なお、上述した発光観察は室温(25°C)で行われている。標本がインキュベーター 内に載置される場合、あるいは、撮像ユニットまたは撮像装置の一部もしくは全部が インキュベーター内に収納される場合では、 37°Cの環境で発光観察が可能である。
[0250] また、この実施形態に力かる発光試料撮像方法を実施するための装置によれば、 例えば、 5°C冷却の冷却 CCDによって、フオトンカウンティングすることなぐ 1分間と
レ、う短い露光時間で、ルシフェラーゼ遺伝子が発する微弱光を撮像できる。
[0251] また、明視野像と自己発光による像とを重ね合わせることによって、発光するルシフ エラーゼ遺伝子の位置を鮮明な画像で観測することができるとともに、このルシフェラ ーゼ遺伝子を含む細胞を容易に特定することができる。
[0252] また、この実施形態に力かる発光試料撮像方法を実施するための装置によれば、 発光するルシフェラーゼ遺伝子の位置を特定して時系列に追跡し、発光現象の経時 変化を測定することもできる。
[0253] ところで、この実施形態にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置では、対 物レンズ 2Aと結像用の集光レンズ 3Aとからなる結像光学系を無限遠補正系とするこ とにより対物レンズ 2Aと結像用レンズ 3Aとの間に各種光学素子を配置して、サンプ ノレ 1Aを様々な方法で観察することができる。
[0254] また、この実施形態にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置は、 DNAマ イクロアレイや細胞アレイや蛋白アレイのようなバイオチップを、光学的に読み取るた めのバイオチップリーダーとして利用することができる。複数の収容部を有する基板と してのバイオチップとは、ガラスやポリスチレンなどの樹脂で作製された基板であって アドレス化された微小部位(その径は例えば 0· 05〜5. Omm)がその上に 2〜1000 個、 0. :!〜 1. Omm間隔で貼りつけられたものであり、その各微小部位に多種類の D NA (又は RNA)断片や合成オリゴヌクレオチドや細胞や蛋白質等を配置して遺伝子 の発現や特定遺伝子の存在などの分子生物学的に有用な情報を調べるために用い るものである。通常、このバイオチップ力 発せられる蛍光又は発光は、非常に微弱 なものである。この実施形態にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を用 いれば、従来の遺伝学的ないし免疫学的物質を固相化した微小なバイオチップへの 固相化量を大幅に減らしても、リアルタイムな検出が可能となる可能性がある点で優 れている。
[0255] 一般的なバイオチップリーダーは、バイオチップから発せられる光が蛍光の場合、 レーザー照射のコンフォーカル光学系と高速移動スキャニングステージとの組み合 わせであり、このバイオチップリーダーでの測光は、スポット励起光照射点の発光量 の和であるため、スキャニング幅が変わるとその都度測定光量も変化することになり、
絶対光量を測定することができない。そこで、この実施形態に力かる発光試料撮像方 法を実施するための装置を利用すると、例えば、 0. 5mm径の視野を有する対物レ ンズに対して 0. 6mmステップでバイオチップを保持するステージを移動させ、停止 する毎に測光することによって、絶対光量を測定することができる。特に、この実施形 態によれば、蛍光よりも微弱な光を発する発光 (ィ匕学発光、とくに生物発光)を十分に 検出できるだけの光学条件を有する撮像装置を、所定の倍率に応じて設計できるの で、バイオチップにおける定量的且つ高感度な発光解析を実行できる。
[0256] 第 2の実施形態
第 2の実施形態にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置 (微弱光標本撮 像装置)は、倒立型のものである。図 28の倒立型の微弱光標本撮像装置において は、外部からの光を遮断するチャンバ一等の遮光装置内に配置することによって、外 部の光の影響を受けることなく精度よく安定して微弱光を検出することができ、標本 1 Bの自己発光による像を鮮明に撮像することができる。ここで、図 28に示す遮光装置 はベース 41B、囲い 42Bおよび蓋 43Bによって暗室を形成し、微弱光標本撮像装置 は、この喑室内でベース 41B上に備えられている。この遮光装置では、ノブ 45Bを持 ち上げることによってヒンジ部 44Bを中心に蓋 43Bを開扉し、標本 1Bを交換すること ができる。
[0257] また、第 2の実施形態にかかる微弱光標本撮像装置を遮光装置内に配設した場合 、キーボード、マウス等の入力装置 47Bを有したコンピュータ等の制御装置 46Bによ つて、この微弱光標本撮像装置を遮光装置の外部から遠隔操作および自動制御で きるようにするとよく、特に、標本 1Bに対する焦点合わせ動作および位置合わせ動作 、カメラ 5B等の撮像動作、照明ファイバー 15Bによる照明光の調光などを、 自動制 卸できるようにするとよレ、。
[0258] ここで、標本 1Bに対する位置合わせ動作とは、対物レンズ 6aBおよび結像用レン ズ 10Bからなる結像光学系、カメラ 5Bおよび標本 1Bを保持する試料台 13Bの少なく とも 1つを光軸に略直交する方向に移動させて、対物レンズ 6aBの視野内に標本 1B を配設する動作である。なお、このような位置合わせ動作を利用して、結像用レンズ 1 0Bが形成したエアリーディスクのうち着目するエアリーディスク毎に、エアリーディスク
の中心と CCDの画素の中心とが合致するように処理してもよレ、。この場合、たとえば 、エアリーディスクと画素とを相対的に 2次元的に操作して、この画素に対応する出力 が最大となる位置を検出するようにすればよい。
[0259] また、制御装置 46Bは、図 28に示すように、表示装置 48Bを備え、当該表示装置 4 8Bに、標本 1Bの明視野像に対応する画像と標本 1Bの自己発光による像に対応す る画像とを重ね合わせて表示できるようにするとよい。さらに、制御装置 46Bは、これ らの画像を保存するメモリー等の記憶部を備えるとよい。
[0260] 一方、第 2の実施形態に力、かる微弱光標本撮像装置は、試料台 13Bに替えて、例 えば図 29に示すように、シャーレ 51B、区画 52Bおよび透明板 53B力もなる収容手 段としての密閉容器を備え、シャーレ 51B上に標本 1Bを保持するようにしてもよい。 ここで、この密閉容器は、図示しない空調装置によって生成される定温低湿の COを
2 この密閉容器内に給気する給気パイプ 54Bと、この密閉容器内の C〇を排気する排
2
気パイプ 55Bと、を備え、この密閉容器内の温度、湿度、気圧および CO濃度の少
2 なくとも 1つを調整できるようにしている。なお、 COを給排気する替わりに、この密閉
2
容器の内部にヒートシート等を設けて、電気的にこの密閉容器内の温度調整等を行 うようにしてもよい。
[0261] また、第 2の実施形態にかかる微弱光標本撮像装置は、標本 1Bを照明する照明手 段を設けてもよい。この場合、白色光源等から照明光を導光する照明ファイバーや、 白色 LEDと単レンズとを組み合わせてクリティカル照明を実現する照明装置や、コン デンサ一レンズを用いたケーラー照明装置である顕微鏡用 UCDなど、を用レ、ること ができる。また、第 2の実施形態にかかる微弱光標本撮像装置は、照明手段として、 微分干渉観察や位相差観察を行う照明装置を備えてもよい。ただし、この場合、専用 のリングストップ、プリズム、対物レンズ等を備える必要がある。
[0262] また、第 2の実施形態に力かる微弱光標本撮像装置を正立型の光学系とするか倒 立型にするかは、試料の種類や目的に応じて適宜選ぶのが好ましい。正立型にする 場合の利点は、試料容器への接地を良好にするためのメンブレンを用いた組織切片 の観察において、メンブレンが邪魔にならない上方からの観察を行い易くする点に有 る。組織切片の観察において、好適には 1層に近い薄さにスライスされた細胞層を有
する生体組織の切片を長期間培養しながらその発光画像を長期間かつ連続的に撮 像できることは、極めて重要な技術といえる。このような組織切片の例として、小脳、 視交叉上核のような中枢系組織や、勝臓、臓器腫瘍といった各種器官系組織が挙げ られる。なお、生体試料が線虫のような光透過性を有する小動物ないし昆虫類であ れば、当該生体試料をスライスせずに観察することも可能となる。第 2の実施形態に 力、かる微弱光標本撮像装置は、広視野を有する光学系をも提供するので、この装置 により、運動能力を維持した小動物ないし昆虫類等の生体試料を、無毒な発光画像 によって長期間観察できる利点は大きい。一方、倒立型にする場合の利点は、微弱 光をより厳重な遮光条件で測定したい場合に、試料台の下方に撮像系を全て配置 できるので、試料台における各種作業(例えば、シャーレ等の交換、薬剤等の注入、 その他保守点検のためにカバーを開けること)を、試料上方で行う作業とは光学的に 隔離しながら (なるべく外来光等の影響が介入しない状態で)行え、一定の撮像条件 を維持できる点に有る。
[0263] また、第 2の実施形態にかかる微弱光標本撮像装置では、撮像手段として CCDを 用いるようにしたが、これに限定されず、 CMOS等の撮像素子であって 0°C程度の冷 却 CCDと同等の撮像感度を有する撮像素子であってもよい。
[0264] 産業上の利用可能性に関する補足
以上のように、本実施形態にかかる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および 対物レンズは、例えば、ルシフェラーゼなどの発光遺伝子をレポーター遺伝子とし、 遺伝子発現を制御するプロモーターゃェンハンサ一の解析や、転写因子などのエフ ヱクタ一遺伝子や様々な薬剤の効果などを調べるレポーターアツセィにおレ、て、好適 に用いることができる。
[0265] 次に、本実施形態の主旨に基づいて、その適用可能な範囲を述べる。
画像解析用の細胞および試料の例
本実施形態のシステムおよび方法は、基板の種類に応じて、各種多様な形で提供 される各種の任意の細胞を画像化するよう容易に適合させることができる。例えば、 細胞は、細菌、原生動物、菌類の原核細胞、または真核細胞とすることができ、かつ 、鳥類、爬虫類、両生類、植物、または哺乳類 (例えば、霊長類 (例えば、ヒト)、齧歯
類 (例えば、マウス、ラット)、ゥサギ、有蹄類 (例えば、ゥシ、ヒッジ、ブタ等)など)に由 来する細胞とすることもできる。細胞は、一次細胞、正常および癌化した株化細胞、 遺伝子改変細胞、ならびに培養細胞とすることができる。これらの細胞には、 自発的 に誘導された各種の株化細胞や、個々の株化細胞から所望の生育特性または応答 特性にっレ、て選択された各種の株化細胞や、腫瘍の種類としては類似してレ、るもの の異なった患者または異なった部位力 誘導した複数の株化細胞が含まれている。 細胞の培養は、通常、保湿した 92〜95%の空気および 5〜8。/0の C〇の雰囲気を
2
含み且つその気温が例えば 37°Cに管理されたインキュベータ内において、滅菌環 境にて行う。細胞の培養は、成分未特定のゥシ胎児血清のような生物学的流体を含 有する栄養混合物中で行うことも、成分がすべて既知の無血清培地中で行うこともで きる。
[0266] 特に関心対象のものは、神経細胞および神経前駆細胞の画像化である。画像化を 行う細胞は、遺伝的に改変した細胞(例えば、組換え細胞)とすることもできる。特に 関心対象のものは、生細胞の画像化であるが、本実施形態は、態様によっては、細 胞膜浸透化または固定細胞の画像化も意図する。細胞は、通常、細胞の維持および /または生育を目的とした培養液を含む試料中で画像化される。
[0267] 本実施形態の多くの態様(特に、同一の細胞視野に戻る工程および/または細胞 視野中の同じ個別の細胞に戻る工程を含む態様)において、細胞は基板表面に十 分固定化され (例えば、基板 (例えば細胞に対して付着性の物質でコーティングする ことによって処理した基板)表面に付着させ)、基板の操作を行っても細胞が基板に 対して相対的に移動することのないようにしておく。例えば、細胞は基板 (例えば、ゥ エル中の組織培養用プラスチック)に直接付着させ、細胞の位置が基板に対して相 対的に固定されて基板に対する細胞の位置が移動することなく基板の操作を行える ようにしておく。こうすると、同一の細胞視野に正確に戻ることも、細胞視野中の同じ 個別の細胞に正確に戻ることも可能となる。
[0268] 本実施形態は、一般に単一細胞レベルの画像化を意図しており、特に生きた細胞 の画像化を意図する。細胞は、基板表面に孤立した単一細胞として分散していても よぐ例えば単層の場合のように他の細胞と接触していてもよぐまた、例えば組織切
片の場合のように薄層を形成していてもよい。画像化を行う細胞は、均質な細胞集団 であっても、異質な細胞集団(例えば混合細胞培養物)であってもよい。このように、 本実施形態は、単一細胞の画像化および細胞集団(この細胞集団は、場合によって は複数の異なった細胞を含んでいてもよい。 )の画像化を可能とするものである。
[0269] 細胞の画像化は、検出可能なマーカー(例えば蛍光ラベル又は発光(化学発光、 生物発光)ラベル)を利用して行ってもよぐまた、それらを利用せずに行ってもよい。 こうした検出可能なマーカーおよび当該検出可能なマーカーを細胞と共に利用する 方法は、当技術分野で周知である。検出可能なマーカーとしては、例えば、フルォロ フォアほたは蛍光)や化学発光体、他の適当な検出可能標識 (例えば FRET (蛍光 共鳴エネルギー転移)検出系や BRET (生物発光共鳴エネルギー転移)検出系で使 用する標識)などが挙げられる。
[0270] 本実施形態のシステムおよび方法は、細胞集団および個々の細胞の画像化を可 能とする。本実施形態のシステムおよび方法は、特に、細胞の生存度(例えば、細胞 の生存率や細胞の健康)や細胞の生理学的性質 (シナプスの生理学的性質)ゃシグ ナル伝達やオルガネラの位置および機能やタンパク質の位置および機能 (相互作用 およびターンオーバーを含む)や酵素活性やレセプターの発現および位置や細胞表 面の変化や細胞構造や分化や細胞***などを観察するための経時的な画像化を可 能とする。例えば、一つの態様において、本実施形態のシステムおよび方法を、タン パク質の発現(例えば、ハンティントン舞踏病におけるハンティンギン (huntingin)の 役割)及びタンパク質のレベル変化もしくは凝集が細胞死を引き起こしているのかを 判断する際に使用したり、それらが細胞死の症状 (例えば、細胞による、細胞死を防 止するための試みであって、細胞死自体の原因ではない)なのかを判断する際に使 用したりする。特に関心対象のものは、培養中における神経細胞の神経変性につい ての研究である。
[0271] 本実施形態のシステムおよび方法は、単一細胞または細胞の集団をリアルタイムで 所望の時間例えば、比較的に短い時間をおいて画像化することを可能とする。
[0272] 本実施形態のシステムおよび方法では、細胞の画像化 (例えば隣接したゥエルに 位置する細胞の画像化)を迅速に行うことができ、さらに、比較的短い時間をおいて、
同じ個別の細胞を含む同一の細胞視野に戻ることによって再度画像化を行うことが できるので、従来の方法では各画像の取得に要する時間の長さなどの事由ゆえに到 底行い得なかったような観察を行うことが可能となった。本実施形態では、細胞現象( 例えば、細胞の機能、細胞の生存、集団中の個々の細胞の運命)を、比較的短い時 間をおいて追跡することもできる。こうしたことは、特定の時点で撮影された画像しか 得られず、進行する現象 (例えば変性)について得られる情報の量に制限があり、ひ たすら時間が必要とされた従来の免疫細胞化学研究とは対照的である。具体的には
、例えば神経変性についての従来の免疫細胞化学研究で 300, 000個の細胞を分 析するには通常約 6週間を要していた力 本実施形態のシステムおよび方法を用い ると、この同じ分析を、半分にもはるかに満たない時間で完了させることができる。本 実施形態のシステムおよび方法を用いると、手動で行えば通常丸 6日力、かるような免 疫細胞化学的な分析や顕微鏡を用いた分析の作業を、顕微鏡およびコンピュータの 処理により 1時間で終えることができる。
[0273] また、本実施形態のシステムおよび方法では、基板をシステムから取り出し、その後 再度システムに載置しても、同じ細胞集団および細胞集団中の個々の細胞を正確に 特定できるので、単一細胞および選択された細胞集団の長期(例えば、数時間、数 日、数週間またはそれ以上といった期間)にわたる分析も可能となっている。
[0274] 本実施形態のシステムおよび方法では、複数の生物学的変数 (例えば、細胞機能 のパラメータまたは変数)を、略同時に又は全く同時に、定性的または定量的に測定 することもできる。例えば、本実施形態のシステムおよび方法にて、位相差も併用して 細胞を画像化することにより、細胞の形態や分子の諸現象の変化についての情報を さらに得ることができる。また、本実施形態のシステムおよび方法では、別の態様にお いて、複数の検出可能なマーカーを使用して細胞を画像化することができる。
[0275] 本実施形態のシステムおよび方法の適用事例
本実施形態のシステムおよび方法は、多種多様な細胞を用いた各種の設定にお いて有用である。本実施形態のシステムおよび方法では、組織培養中で細胞または 細胞集団を、任意の所望の期間(例えば、 2時間、 5時間、 12時間、 24時間、 2日、 4 日、 6日、 7日、数週間、関心対象の細胞の寿命に至るまでの期間)にわたつて追跡
することも可能である。細胞をはじめとする生体試料の画像化は、上記期間に対応す る一定の時間をおいて行うことも、他の態様で行うこともできる。以下はそうした画像 化の例である力 本実施形態はこれらに限定されるものではなぐ以下の画像化の例 では、本実施形態の特定の利点や特徴を強調する。
[0276] 光毒性を防止または低減するための細胞の画像化
光毒性は、生きた試料の画像化を行う上で常に重要な制限要因となっており、光毒 性は、入射光の強度、照射時間、波長と直接関連している。徐々に進行するプロセス を調べる場合、同一の細胞試料を繰り返し照射せねばならないので、光毒性は特に 問題になる。そこで、本実施形態のシステムおよび方法を使用して、利用可能な信号 を検出するために必要な入射光の量を低減する。本実施形態では、光毒性をレ、くつ 力、の方法によって有意に低減する。本実施形態のシステムおよび方法によれば、低 強度の白色光を極めて短時間照射することによって顕微鏡の焦点を合わせ、その後 、より高強度の光を照射することによって高解像度の蛍光画像を取得することができ る。なお、焦点合わせの自動化を行わない場合、焦点は、通常、高強度の蛍光を連 続照射することによって合わせることになる。しかし、顕微鏡の焦点を合わせに要する 時間やその後画像を取得するのに要する時間を考慮すると、細胞は、光毒性を有す る高強度の光に、 自動化を行った場合と比べ一桁程度長い時間にわたって照射され 得ることになる。
[0277] また、本実施形態のシステムおよび方法は、一度焦点を合わせた後、焦点を合わ せ直すことなく複数の隣接した蛍光画像を取得するので、光毒性を低減するうえで有 利である。本実施形態のシステムおよび方法では、細胞の視野の大半が画像の生成 に必要な光のみを有意な光として受け取るので、当該システムおよび当該方法は、 蛍光画像を取得するうえで最適化されたものであるといえる。最後に、本実施形態の システムおよび方法では、自動化によって高強度の光の照射時間が実質的に低減 するので、光褪色も生じにくくなり、発せられる蛍光が明るいので、高解像度の画像を 生成するのに必要な励起時間もさらに低減する。
[0278] 刺激による遺伝子発現の光学イメージング
本実施形態は例えば、下記のように実施することが出来る。
まず、例えば、物質を細胞に接触させた際のこの接触という刺激により発現が誘導 される遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子(好ま しくは蛍もしくはゥミシィタケなどに由来するルシフェラーゼ)を、前記の遺伝子導入 方法を用いて、所定数(例えば:!〜 1 X 109個、好ましくは 1 X 103〜1 X 106個)の細 胞に導入する。つぎに、前記レポーター遺伝子が導入された所定数の細胞を、細胞 培養が可能な所望の器具 (例えばシャーレ、多数のゥエルを有するマルチプレートな ど)を用いて、所望の栄養培地 (例えば D— MEM培地など)中で培養する。つぎに、 当該所定数の細胞からなる試料を、細胞にとって最適な温度(例えば 25〜37°C、好 ましくは 35〜37°C)に予め保温して、試料の乾燥を防ぐため水を注入して保湿した 発光顕微鏡の培養装置部に設置し、該発光顕微鏡の試料観察部にある対物レンズ を通してデジタルカメラで発光イメージを記録する。つぎに、細胞に接触させて刺激 を行なうための物質 (例えば化合物)を所望の濃度(例えば 1ρΜ〜1Μ、好ましくは 1 00nM〜lmM)で試料に加え、所望の時間間隔(例えば 5分間〜 5時間、好ましくは 10分間〜 1時間)で当該試料の発光イメージを記録する。そして、記録した発光ィメ ージ内の所望の領域における輝度値を、市販の画像解析ソフトウェア (例えば、 Met aMorph (商標名);ユニバーサルイメージング社製など)を用いて取得する。
さらに、本実施形態は、発光イメージと同視野において明視野イメージも撮像して 記録する構成を有する場合、画像解析ソフトウェアが発光イメージと明視野イメージと を重ね合わせる機能をさらに有することにより、意外に速く動いた細胞等(例えば組 織全体、特定細胞群、個々の細胞、細胞の一部の領域など)による不鮮明な発光画 像にっレ、ても、明視野画像のような鮮明な画像を利用してこの細胞等の認識を正確 に行なえるため、解析の信頼性も安定に維持できる利点がある。このように、本実施 形態による撮像方法および装置を用いた画像解析を行なうための画像解析用ソフト ウェアは、少なくとも発光画像において個々の細胞等(組織全体、特定細胞群、個々 の細胞、細胞の一部の領域など)を形状や大きさ等のパラメータによる輪郭情報によ り識別するような認識機能と、認識した細胞等力 発生する発光量を計測する計測機 能とを有し、好ましくは、撮像装置を制御するコンピュータや操作者による入力手段( キーボード、マウス、テンキー、タツチパネル等)からの要求に応じて計測結果を出力
する機能を有する。計測結果は、認識した細胞等の画像情報と対応付けて出力する のがさらに好ましい。出力の形式は、発光量に応じた擬似画像や数値であり得、多数 の細胞を解析する場合には、正規分布、ヒストグラム、折れ線グラフ、棒グラフ等のグ ラフィック表現でもよレ、。また、同じ細胞等に関する時系列の解析結果を出力する場 合には、その出力の形式は、経過時間順に発光量を並べた点分布や、時間順に線 で繋げた波形パターンでもよい。波形パターンは、特に時計遺伝子のような周期性を 示す発光データに適している。画像解析用のソフトウェアは、必要に応じて、出力後 のグラフや波形パターンを単独なレ、し他の細胞等との相関を解析するように構成され てもよレ、。さらに、ディスプレイ上に出力した解析結果について興味有る部分を上記 入力手段を通じて指定した時に、対応する細胞等の画像をディスプレイ上に表示す るリコール機能を具備するのが好ましい。このリコール機能は、指定された細胞等に 関して撮像した全期間ないし特定期間における動画情報を上映する上映モードを有 するのがさらに好ましい。
生細胞の長時間にわたる画像化
生細胞は、大抵、組織培養用プラスチック上で培養される。生細胞を調べる場合、 特に、生細胞を徐々に進行するプロセスにおいて調べる場合には、生細胞(例えば 神経細胞)の健康を、調べているプロセスをカバーするのに十分な期間にわたって維 持する必要がある。理想的には、細胞がもともと生育していたのと同じ培養皿で一定 時間をおいて細胞の画像化を行うと細胞の健康が保たれ、力べ乱の程度も最小限で 済む。組織培養皿中の細胞を、滅菌条件下で倒立顕微鏡を使用して画像化すること は可能であるが、倒立顕微鏡の場合、細胞が生育している基板 (例えば、ガラスまた はプラスチック)を通して画像化を行うことになる。組織培養用プラスチックは、ガラス と比較すると波長によっては (例えば紫外線)、透過性に劣り、光の散乱を生じ、画像 分解能が低減してしまう。しかし、神経細胞をはじめとする多くの細胞は、ポリリジンお よびラミニンで基板をコーティングして細胞の付着および分化を促した場合でも、ガラ スと比べて組織培養用プラスチックで生育させた場合の方が長期にわたって生存し、 健康な外観を示す。したがって、本実施形態の目標は、透過させるのがプラスチック であるかガラスであるかを問わずに高品質の画像が得られるような光学系を備えたシ
ステムを提供することにある。
[0281] ガラスまたはプラスチックを通して画像を自動的に取得する場合、使用が可能な対 物レンズについても重要な影響が及ぶ。すなわち、液浸レンズは通常、非液浸(空気 )対物レンズより多くの光を集光するが、液浸レンズは浸漬溶媒を必要とし、 自動画像 化の場合にはこの溶媒を供給することは現実的ではなレ、。非液浸レンズを使用して 各種の組成および厚さを有する基板を通して焦点を合わせる作業も問題が多レ、。こ れらの基板の屈折率は製品ごとに異なり、発せられた蛍光が対物レンズに集光され るまでの間通過する空気の屈折率とも異なっている。異なった屈折率の物質を通して 画像化を行うと色収差および球面収差が生じ、この収差によってレンズの開口数が 増大する。収差は、 20倍で顕在化し、 40倍で実質的となり、 60倍でほぼ克服不能と なる。最後に、試料によっては、培養脳切片のように組織培養皿の底面から比較的 離れて存在するものもあり、焦点面を自動的に判断するアルゴリズムを用いて Z軸に 沿った各種の平面から画像を取得する必要がある。このような場合、光学的なデコン ポリューション機能を本実施形態の発光撮像データに対して適用することが好ましい 。光学的なデコンボリューシヨン機能を採用することにより、切片に限らず、生体組織 や小型の生物(昆虫、動物、植物など)にも 3次元的な画像を提供し得る。 3次元的な 画像においては、検出光路に沿って重複するような複数の細胞等の試料を区別する のが容易であるば力りでなぐ検出光路上の異なる距離に相当する各位置に存在す るような別々の試料を高精度に定量できる。なお、焦点距離が極めて長い対物レンズ を使用すると、離れた対象物に焦点を合わせることが可能となり、自動焦点合わせの 間に対物レンズと組織培養プレートとが衝突することを防止することができる。
[0282] 高処理スクリーニング ·アツセィ法
本実施形態のシステムおよび方法は、高処理スクリーニング 'アツセィ法を行ううえ で特に有用である。こうしたアツセィ法の例としては、細胞の所望の応答(例えば、糸田 胞死の調節、レセプターの内部移行、信号伝達経路の活性の調節(上昇または低下 )、転写活性の調節、など)を惹起する物質の同定や、これまで知られていない又は 調べられていない機能を有する核酸の分析 (例えば、関心対象のコード配列を標的 細胞に導入し、細胞中で発現させて行うような分析)等があるが、これらに限定される
ものではない。
[0283] 複数のパラメータを評価する場合には、検出の際に区別が可能なマーカーを使用 して、異なった変数を検出することができる。例えば、スクリーニング 'アツセィ法が、 ポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物の影響の評価を含む場合、 1種の マーカーを使用して対象構築物でトランスフエタトされた細胞を同定し (例えば、関心 対象のポリヌクレオチドを含む構築物中にコードされた検出可能なマーカーの利用、 または関心対象の構築物と共に同時トランスフエクシヨンされた構築物上に存在する 検出可能なマーカーの利用により、関心対象の構築物におけるトランスフエタトされ た細胞を同定し)、第二のマーカーを使用して遺伝子産物の発現を検出し (例えば、 そのポリヌクレオチドによってコードされた遺伝子産物から生成された融合タンパク質 の提供する検出可能なマーカー中の遺伝子産物を検出し)、第三の検出可能なマ 一力一を使用して遺伝子産物の標的細胞に対する影響を評価する(例えば、候補ポ リヌクレオチドの遺伝子産物によって調節されていることが想定されているプロモータ 一の制御下にあるレポーター遺伝子の発現によって、または候補ポリヌクレオチドの 遺伝子産物によって調節されている因子によって、細胞の生存度を評価するなど)こ とができる。また、細胞の形態の変化 (例えば、細胞の分化や細胞構造 (例えば榭状 突起)の形成)についての情報を位相差画像から得ることもでき、この場合、位相差 画像を、例えば細胞ごとに所定の選択した時間をおいて取得した蛍光画像と重ね合 わせて比較することができる。
[0284] スクリーニング ·アツセィ法により標的細胞上のレセプターの活性を調節する物質を 同定する別の例において、第一マーカーを使用して物質のレセプターに対する結合 を検出し、その一方で第二マーカーを使用してレポーター遺伝子の転写による活性 化を検出することができる。本実施形態で使用する場合には、「検出可能なマーカー 」は、所定の波長で励起すると検出可能なシグナルを発するような分子を包含する。
[0285] 本実施形態では、同一アツセィ法で複数の蛍光標識を使用し、細胞を個々に定性 的または定量的に検出して、複数の細胞応答を同時に検出および/または測定す ることを可能とすることもできる。蛍光の独特の特性を利用すべく数多くの定量的技 術が開発されており、そうした技術として、例えば、直接蛍光測定法、蛍光共鳴エネ
ルギー移動(FRET)、蛍光偏光法または異方性法 (FP)、時間分解蛍光法 (TRF)、 蛍光寿命測定法 (FLM)、蛍光相関分光法 (FCS)、蛍光退色回復法 (FPR)が挙げ られる。特に関心対象のものは、生細胞に適用可能であり、かつ場合によっては所望 の時間をおいて使用することのできる(例えば何時間または何日かの間隔をおいて 撮影された画像同士の比較が可能な)標識技術である。本実施形態は、これらの蛍 光を用いたアツセィ法を、光励起が不要な発光を用いたアツセィ法に変更することが できる。光励起が不要であれば、光学機器を単純化できるば力 でなぐ上述した光 学的条件によって適切な倍率で十分に明るく且つ定量性に優れた測定データを取 得すること力 Sできる。
[0286] 試料としてのポリペプチド
態様によっては、試料は「ポリペプチド」または「タンパク質」である。これらの用語は 互換的に使用するものであり、任意の長さの重合体形態アミノ酸のことを称する。例と しては、遺伝的にコードされたアミノ酸および遺伝的にコードされていないアミノ酸、 化学的もしくは生化学的に修飾された (例えば翻訳後修飾された、また例えばグリコ シノレ化された)アミノ酸、または変性アミノ酸、重合体ポリペプチド、ならびに修飾ぺプ チド骨格を備えたポリペプチドが挙げられる。スクリーニングすることのできる「ポリべ プチド」としては、エフユージョン(effusion)タンパク質で、異種アミノ酸配列を有する もの、異種および同種リーダー配列と融合させたもの、 N末端メチォニン残基を有す るか又は有さないもの、免疫的に標識したタンパク質などがある。ポリペプチドの修飾 は、例えば、基材 (例えば、ビーズのような固相担体、多孔質基板、キヤビラリーアレ ィ)への付着を促すために行うこともできる。力かる基材を用いる場合、微量な物質の 検出を高表面積ないし微小ボリュームにより行うことが可能である。ポリペプチドが細 胞内に取り込まれない場合には、ポリペプチドは例えばマイクロインジヱクシヨンによ つて標的細胞に導入することができる。
[0287] スクリーニング ·アツセィ法に使用する細胞
本実施形態のスクリーニング 'アツセィ法に使用するのに適した細胞としては、上述 したものが挙げられる。態様によっては、標的遺伝子産物を発現する組換え細胞の アツセィおよびアツセィ法を、例えば標的遺伝子産物への結合、標的遺伝子産物の
発現の調節、または標的遺伝子産物の生物学的活性の調節によって、標的遺伝子 産物と相互作用を生じる候補物質の検出に適したものとすることが、特に関心対象で ある。本明細書で使用する場合、「標的遺伝子産物」は、候補物質のスクリーニング の中心となるタンパク質をはじめとする各種の遺伝子産物のことを称する力 それら に限定されるものではなレ、。例えば、標的遺伝子産物をレセプターとし、アツセィ法を 、レセプターの活性を調節する物質の同定に適合させることができる。
[0288] 一般的なアツセィ方法
何を目的としてスクリーニング ·アツセィ法を行うかに関わらずアツセィ法の工程にお レ、て物質と細胞とを接触させることになり、この工程では、遺伝物質のような場合、物 質を細胞内に導入し、細胞の 1以上の変数について検出を行うことになる。物質に対 応した細胞パラメータの読み取り値の変化を測定し、できれば標準化し、このパラメ ータを照合用の読み取り値と比較することによって評価する。この評価には、照合用 の読み取り結果、各種因子の存在下および不在下で得られた基礎読み取り値、他の 物質 (公知の経路の公知の阻害物質を含んでも含まなくてもよい)を用いることによつ て得られた読み取り値、などを用いることができる。分析対象物質としては、対象とな る細胞の対象の細胞パラメータを直接または間接的に調節する能力を備えた任意の 生物学的活性を有する分子を挙げることができる。
[0289] 物質は、細胞に溶液のかたちで又は易溶性の形態で、培養中の細胞の培養液に 加えるのが好都合である。物質はフロースルーシステムに間歇的もしくは連続したスト リームのかたちでカ卩えることもでき、添カ卩時以外は静的な溶液に化合物を一度にまた は少量ずつまとめて加えることもできる。フロースルーシステムの一例では 2種の流体 を使用し、一方は生理学的に中性の溶液とし、他方は同じ溶液で試験化合物を加え たものとする。第一の流体を細胞上に通過させ、その後第二の流体を通過させる。溶 液を 1種のみ使用する方法において、試験化合物を、細胞の周囲の特定量の培養 液にまとめて加える。培養液の成分の全体的濃度が、試験化合物の添加によって、 またはフロースルー法における 2種の溶液の間で、有意に変動するようなことがあつ てはならない。
[0290] 態様によっては、物質の組成は、全体の組成に有意な影響を及ぼし得るような追加
の成分 (例えば防腐剤など)を含有しない。この場合、物質の組成は、試験対象物質 および生理学的に許容される担体 (例えば、水、細胞培養液など)から本質的に構成 される。他の態様において、スクリーニング 'アツセィ法において別の物質を含有させ ること力 Sでき、こうした物質としては、例えば、物質の結合パートナーへの静的な結合 を可能とするための物質、非特異的な相互作用またはバックグラウンドでの相互作用 を低減するための物質などが挙げられる。こうした物質については、当然ながら、生 細胞のスクリーニングと適合するものを選択する必要がある。
[0291] 上述したように、異なる物質濃度を用いた複数のアツセィ法を並行して実施して、各 種の濃度に対応する示差的な応答を得ることができる。当技術分野で公知のように、 物質の有効濃度を決定する際には、通常、 1 : 10、または他の対数尺度を用いた希 釈によって得られたある範囲の濃度を使用する。この濃度は、必要に応じて、二度目 の一連の希釈を行うことによってさらに精緻化することができる。通常、これらの濃度 の 1つがネガティブ 'コントロールの役目を果たし、このネガティブ 'コントロールは、ゼ 口濃度、または物質の検出レベル未満、または表現型の検出が可能な変化が得られ ない物質濃度以下の濃度とする。
[0292] 本実施形態のシステムおよび方法の各種の側面や特徴を利用したアツセィ法の例 を以下に示すが、本実施形態はそれらに限定されるものではない。
[0293] 薬剤スクリーニング.アツセィ法
本実施形態の画像化システムおよび方法は、多岐にわたるアツセィ様式に適合さ せて、候補物質が標的細胞に対して及ぼす所望の生物学的効果 (例えば、対象細 胞パラメータの調節)に関してスクリーニングを行うことができ、この生物学的効果は、 物質を薬剤として使用する際に意味を持つようなものとすることができる。例えば、各 種の物質を、細胞分化、細胞死 (例えば、アポトーシスの調節)、シグナル伝達 (例え ば、 G結合タンパク質レセプターでのシグナル伝達、 GTP結合、第二メッセンジャー 系の検出など)、イオンチャネルの活性 (例えば、流入を、例えばカルシウム '画像化 を使用して評価することによって)、転写 (例えばレポーター遺伝子アツセィ法を使用 して、例えば標的遺伝子産物の発現に影響を及ぼす物質を同定する)などの調節に ついて調べることができる。特に関心対象のものは、生細胞と共に使用することので
きるアツセィ法である。
[0294] 一つの態様において、スクリーニング ·アツセィ法は、細胞中における候補物質の 結合パートナーに対する結合を検出する結合アツセィ法、例えばレセプターに対して ァゴニストまたはアンタゴニスト.リガンドとして作用する物質を同定するためのスクリー ニングとすること力できる。特定の態様において、アツセィ法は、例えば公知のレセプ ター'リガンド(例えば公知のァゴニストまたはアンタゴニスト)の活性の阻害について 候補物質を評価する拮抗結合アツセィ法とすることもできる。この後者の態様におい て、公知のリガンドを検出可能となるよう標識し、例えば公知のリガンドの活性の低下 または結合にともなって、その公知のリガンドの検出可能な標識も低減するようにして おくことができる。
[0295] 候補物質を標的細胞と共にインキュベートする際、培養は任意の適当な温度で行う ことができ、通常は 4〜40°Cで培養することができる。インキュベーション時間は活性 が最適となるように選択する力 迅速でハイスループットなスクリーニングを進行させ るうえで最適な時間を選ぶこともできる。インキュベーション時間は通常 0. 1〜:!時間 で十分であるが、態様によっては、細胞を、この培養時間ないしもつと長い適当な時 間をおいてから調べることが望ましい場合もある。
[0296] さらに、発明者は、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現 の変動パターンが異なることも発見した。さらに、発明者が追究した光学的条件によ れば、撮像装置の対物レンズにっレ、ての「開口数 (NA) /投影倍率( )の 2乗」で 表される光学的条件が 0. 071以上である場合に、:!〜 5分以内で画像化でき、画像 解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。これらの発光画像を蓄積型の 撮像装置により顕微鏡観察する発光解析システムを発光顕微鏡と呼ぶこととする。発 光顕微鏡は、好ましくは遮光のための開閉蓋 (ないし開閉窓)を具備する遮光手段を 有し、この遮光手段の開閉によって必要な生体試料をセットまたは交換するようにな つている。 目的に応じて、生体試料を収容する容器に対して化学的ないし物理学的 刺激を行なう操作を手動ないし自動で行なうようにしてもよい。最良の一形態では、 発光顕微鏡は公知または独自の培養装置を搭載している。培養装置は、システム内 での長期間の解析を可能にするように、温度、湿度、 pH、外気成分、培地成分、培
養液成分を最適に維持する機能を備えている。
[0297] 発光試料の元となる生物学的材料は、例えば、真核動物、シァノバクテリア由来の 細胞または組織が挙げられる。医学用途においては、哺乳類(特にヒト)における検 查すべき部位からバイオプシーにより切除した細胞を含む試料が特に例示される。 再生医療においては、少なくとも一部が人工的に改良ないし合成された生体試料が 特に例示され、生物学的活性を良好に維持するかどうかを検査する目的に利用でき る。他の一面において、本実施形態のアツセィ対象は、動物由来の細胞または生体 組織に限らず、植物や昆虫由来の細胞または生体組織であってもよい。菌、ウィルス におレ、ては、従来のルミノメータでは実行されなかった容器内の部分ごとの解析が対 象となり得る。ノレミノメータではゥヱルまたはシャーレ等の容器内に無数の試料 (例え ば 1ゥヱル当り: L00万個以上)を重積することで強大な発光量を迅速に得るようにして いる。本実施形態では、肉眼では全く見えない個々の発光試料の画像を生成するの で、個々の細胞が識別できる程度の密度で容器内に収容しても、個別の細胞ないし 生体組織を解析できる。このような個別の解析は、発光している細胞だけを統計的に 合計したり平均化したりする解析方法を含んでいる。これにより、細胞 1個当りの正確 な相互作用に関する評価が行なえる。また、多数の混在する発光試料において、同 様の発光量ないし発光パターンを有する細胞群ないし組織領域を識別することが可 能となる。
[0298] 第 1の実施形態に関する用語の補足説明および変形例
サンプル 1Aを収容する試料容器としては、シャーレ、スライドガラス、マイクロプレー ト、フローセルが挙げられる。ここで、容器底面は、光透過性の材料 (ガラス、プラスチ ックなど)であるのは勿論のこと、 2次元的データが得られやすいように、幅広(ないし 扁平)な底面を有する容器であるのがさらに好ましい。複数の収容部分を一体化した ゥエルゃキュベットにおいては、各収容部分の仕切り部分を遮光性の材料ないし染 料で全面的に成形するのが好ましい。また、シャーレ等の上部開口を有する容器に ついては、蒸発防止用のフタを覆い被せるのが好ましぐさらにフタの内面に反射防 止用の被膜ないし染色を施すのが S/N比を向上させる上で好ましい。このような硬 質のフタの代わりに、容器内の試料の上面にミネラルオイルのような液状のフタを配
置するようにしてもよレ、。試料容器を載置するための試料ステージを、必要に応じて 一般の顕微鏡装置のように、別の撮像用の視野に変更するために、 X軸方向および Y軸方向に移動させるようにしてもょレ、。
[0299] 対物レンズ 2Aは、サンプル 1 Aの下方に倒立形式で配置してもよレ、。対物レンズ 2 Aは、生きた発光試料を培養条件のような恒温環境で安定に機能するように、適宜の 加熱手段(ペルチェ素子、温風ヒーターなど)で加熱してもよレ、。対物レンズ 2Aは、さ らに、光軸方向である Z軸方向に駆動(図 26では上下方向)するようにしてもよレ、。対 物レンズ 2Aには対物レンズの Z軸駆動機構が備えられており、対物レンズ 2Aを Z軸
(光軸方向)に沿って自動的に駆動する。対物レンズの Z軸駆動機構としては、ラック ピニオン機構やフリクションローラー機構が例として挙げられる。
[0300] また、対物レンズ 2Aは、所望の倍率に応じて適宜、油浸式にすることができる。ま た、どの倍率を選択するかは、評価(ないし解析)すべき試料のサイズに応じて任意 に設定する。具体的には、細胞や組織を観察できる程度の低倍率 (例えば 5倍から 2 0倍)や、細胞内または細胞外の微小物質を観察できる程度の高倍率 (例えば 40倍 〜 100倍)であり得る。
[0301] CPU5Aは、発光試料の画像情報を動画で表示する構成を具備することにより、 1 以上の所望の細胞に関する活性の変化をリアルタイムな映像でもって観察するような 解析方法を提供するのが好ましい。これにより、細胞単位または組織単位での発光 の様子を臨場感有る映像でもって時系列で観察することが可能となる。
[0302] 本実施形態において、時系列で観察するための方法および装置は、必要とする装 置構成を制御したり連携したりするためのソフトウェア、または該ソフトウェアを特徴づ けるコンピュータプログラムの形態で提供されてもよい。また、本実施形態の方法また は装置を、装置と同一ないし別個に配置されたデータベースと電気的に接続すること により、画像容量ないし解析情報量に制限されることなぐ高速で且つ信頼性と質の 高い解析結果を提供することが可能になる。
[0303] 本実施形態においては、化学的励起試薬としての基質溶液による発光 (冷光)を用 レ、ることにより、検出工程において励起光照射のための構成を不要にする。さらに顕 微鏡を用いた観察において、肉眼で見えないような微弱光を発する発光試料に対し
て、高開口数の対物レンズを用いることにより、液体窒素を用いた極低温 (例えば 3 0 60°C)の冷却を必要とするような大型且つ高コストな超冷却 CCDを採用するこ となぐ高速に画像化できるようにした。具体的には、高開口数(高 NA)で且つ対象 物を観察視野内に含むような投影倍率を有する対物レンズと、弱低温 (例えば一 5°C かそれ以上の高温)で、たかだか室温 (ないし装置内温度)付近で、連続的に機能し 得る撮像素子(CCD CMOSなど)と、対象物を画像生成に適した位置に保持する 保持手段と、これら対物レンズ、撮像素子、保持手段をハウジングして画像生成時の 遮光を保障するための遮光手段と、を主要な構成として具備する。 CCDが小型で且 つ弱低温で制御できる場合、トータルシステムとしてコンパクトであり、同じハウジング 内に全ての構成要素を収容しても、机上で見下ろせるような高さに設計することも可 能である。従って、本実施形態を具現化した装置は、非常に小型で低コストの商品と なる。小型化することにより、装置内空間も小体積となるので装置内の生物学的環境 (温度、湿度、エアー成分)の条件を培養や微量反応に適したレベルに調節し易くな り、さらなる低コストと高い信頼性を有するという利点もある。また、装置全体の高さを 低くすることにより、発光試料の出し入れや収容済みの試料に対する薬剤の分注の ような刺激処理を、装置の上部から適宜の開閉窓ないし開閉カバーを介して簡単に 行なえる。
[0304] 他方、本実施形態は、光走査を行なわずに多数のピクセル (好ましくは多画素数) で画像生成する方法および装置を提供する。生成された画像の画像解析にぉレ、て、 細胞を解析するような画像解析ソフトウェアも本実施形態の一部として、単独、ないし 発光顕微鏡とのトータルシステムとして産業利用可能な製品を提供できる。
[0305] 以下のハイスループット撮像装置に関する説明もまた、本実施形態として単独ない し、以上の説明に記載された実施形態との組合せとして含まれる。但し、下記に示す 内容が共有出来る他の方法または装置については、以下の説明の範囲において、 本実施形態の要旨に限定されず、分割可能な実施形態の記載を含んでレ、る。
[0306] ハイスループット撮像装置の技術分野について
本実施形態は 1以上の生物学的試料に設定された多数の撮像領域をタイムラブス により撮像する撮像装置に関し、特にハイスループットな撮像を可能するためのハイ
スループット撮像装置に関する。また、本実施形態は、このような撮像装置の機能を 行わせるプログラムを含んでいるソフトウェアに関する。本実施形態は、生命体由来 の細胞などの生物学的試料の生物学的活性を多数効率良く検査するような研究な いし臨床用途に適している。
[0307] ハイスループット撮像装置の背景技術にっレ、て
生物は高度な複雑性を持っため、構造や機能を理解するのは容易なことではない 。そのため、近年、生命現象を再現できる最小単位である細胞(つまり培養細胞)を 用いた単純な実験系が用いられている。培養細胞を用いることで、ホルモンの応答な どの解析について、生体内の他要因による影響を受けることのない実験が可能となる 。つまり遺伝子の導入や阻害により遺伝子の機能解析を行うことが可能となる。
[0308] 細胞を培養するためには、生体内を真似た環境を用いる必要がある。そのため温 度は体温の 37°Cとし、また細胞間液を真似た培地が用いられる。培地にはアミノ酸な どの栄養源の他に、 PH調整のための炭酸バッファーが含まれる。炭酸バッファ一は 、 5%という高い分圧の炭酸ガスを含む空気の存在下で平衡状態になり、ディッシュ などの開放系の培養に利用される。また培地から水分の蒸発を防ぐため、 95〜: 100 %の高湿度の環境が要求される。
[0309] 細胞の培養には上記環境条件を備えた炭酸ガスインキュベータが用いられる。さら に、細胞の状態観察には位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡が用いられ、 GFPなどの 発現観察には蛍光顕微鏡が用いられる。また、顕微鏡画像の撮影および表示には C CDカメラとコントローラ (パソコン)が用いられ、これらを組合せた培養顕微鏡が提案 されてレ、る(特許文献;特開 2003— 29164号公報)。
[0310] ハイスループット撮像装置に係る解決すべき課題について
培養している細胞を長時間または長期的に顕微鏡で観察する場合、タイムラブス観 察方式で行われ時系列的に画像を取得している。タイムラブスとは一定間隔の時間 で試料の撮影、画像の保存を行い、長時間かけて変化する細胞の状態を確認し易く するために用いられる。例えば、始めに細胞 1個を所要撮影時間(カメラの露出時間 )で 1回撮影し、その後 1時間毎に 1回ずつ撮影し続け 24時間撮影すれば 25枚の画 像を取得できる。これら画像を撮影したあと連続的に再生すれば、 1時間ごとの細胞
の変化を容易に確認することができる。撮影間隔を例えば 30分、 15分と短くすれば 、動きの速い細胞の観察も行える。
[0311] また、細胞を複数箇所観察したい場合は、顕微鏡に付随する電動ステージを用い て目的の場所に顕微鏡または試料を移動して観察を行っている。観察位置への移 動はタイムラブスと同期して行っている。このような複数の観察位置を順次観察するタ ィムラブスを多点タイムラブスという。なお、上述した本実施形態の発光試料撮像方 法および発光試料撮像装置によれば、独自に究明された明るい開口数の対物レン ズを採用することによって、従来よりも顕著に短時間(例えば 30分の 1以下の所要時 間)で発光画像を生成できるので、 5〜20分単位、好適条件では 5分未満、最短で 約 1分単位の微弱光画像による時系列評価が実現する。このことは、従来、肉眼で観 察できるような輝度の蛍光画像に対して、肉眼で見えないような発光画像を代替ない し連携させることを可能とし、高速な反応ないし生体分子の動態の解析にも利用でき るという画期的技術を提供するものである。発光画像を得るには、励起光を必要とし ないので、概日リズムのような光感受性試験は勿論のこと、生物材料への過度な刺激 ないしダメージを無くして正確かつ長期安定な解析を実現する。再生医療において は、発光画像による解析により、何ら生物学的ダメージを受けていない生体材料を用 いた治療、診断、創薬等の医学利用が可能であるという可能性を有する。
[0312] し力 ながら、タイムラブスによる撮像を多数の細胞について行おうとすると、最初に 撮像した細胞と最後に撮像した細胞とで少なからず有意な時間差が生じる場合があ る。有意な時間差は、細胞同士の比較を行う場合にしばしば致命的である。また、任 意に指定した複数の細胞について時間差が生じないように撮像する有効な方法は 知られていない。従来は、複数の細胞について順次に撮像を行うように撮像間隔を 手作業で変更し、誤動作したら停止して再トライするような対応しか知られていない。 特に、昨今のセルベースアツセィのように、多数の細胞を自動的に解析するシステム においては、タイムラブスによる画像を用いるとスループットが激減する可能性がある
[0313] 以上のような実情に鑑みて本実施形態の方法および装置をタイムラブスの撮影作 業を効率的に行うように改良した応用例を、以下に説明する。なお、以下に説明する
ハイスループット撮像装置およびそのためのソフトウェアは、本実施形態の主旨に基 づき、さらなる特許性を有する優れた発明である。ここにおいて、以下に示す実施形 態は、多数の撮像対象からのタイムラブスデータを同時期に得ることが可能なハイス ループット撮像装置およびそのためのソフトウェアを提供することを目的とすることが できる。
課題を解決するためのハイスループット撮像装置の手段について
上記目的を達成するために本実施形態のハイスループット撮像装置は、複数の撮 像領域に存在している生物学的試料を撮像して試料画像を取得するための画像取 得手段と、前記画像取得手段を制御し、前記撮像領域ごとにタイムラブス 'インター バル撮影を行うための制御手段とを備え、前記制御手段は、前記試料画像の取得に 必要な撮像時間と前記撮像領域の数に基づいてインターバル撮影の条件を設定す るためのインターバル撮像条件設定手段を有していることを特徴としている。インター バル撮影の条件の一例として、生物学的試料の活性速度なレ、し反応速度に応じて、 タイムラブス条件としての撮像時間を変更することも含まれる。本実施形態のハイスル 一プット撮像装置によれば、 1分〜 20分の露光時間ないしそれ以上の時間から適当 な露光時間を選択することができる。反応(ないし活性)速度が速い試料については 、画像解析可能なレベルの発光画像が得られる範囲で最小の露光時間を設定する こと力 Sできる。逆に、反応(ないし活性)速度が遅い試料については、画像容量が余 分にならない程度に長い露光時間を設定することができる。好ましくは、同一ないし 異なる撮像視野において、複数段階の露光時間(例えば、 1分、 5分、 10分、 20分、 30分の群から 2以上の任意の組合せの段階)または連続的時間範囲(例えば、:!〜 3 0分の露光時間において、:!〜 3分単位の分割目盛または無段階で選ばれる任意の 露光時間)を設定することによって、試料ごと、ないし試料中の領域 (ないし部位)ごと の画像解析を実行できる。さらに、反応 (ないし活性)の速度が異なる発光画像にお いて、画像再生手段における再生速度を制御することによって擬似的に類似の速度 による動画映像を提供でき、診断などの評価を簡単且つ効率良いものとし、試料ごと に非特異的なばらつきがあった場合にも正確に解析できるので、最終的な評価結果 を早く出せるという利点もある。また、試料ごとに画像解析可能なレベルの発光画像
が得られる範囲で最小の露光時間を設定することができ、解析時間の短縮にも役立 ち、スループットを高める。露光時間の選択は、 自動でも手動でもよい。
[0315] また、本実施形態のハイスループット撮像装置は、複数の撮像領域に存在してレ、る 生物学的試料を、異なる画像関連情報を抽出する画像情報抽出手段により撮像して 試料画像を取得するための画像取得手段と、前記画像取得手段を制御し、前記撮 像領域ごとにタイムラブス 'インターバル撮影を行うための制御手段とを備え、前記制 御手段は、前記試料画像の取得に必要な撮像時間と前記画像情報抽出手段の種 類に基づいてインターバル撮影の条件を設定するためのインターバル撮像条件設 定手段を有していることを特徴としている。このような構成においても、制御手段によ り設定された撮像条件によって撮像の作業が効率的に実行されるので、多数の撮像 領域を短時間で撮像することが可能となる。
[0316] 本実施形態において「生物学的試料」はあらゆる生命体を対象とすることができ、関 心がある生物学的活性を、維持可能な状態で適当な保持手段としての容器または生 命体に保持することによって、撮像手段に対し撮像すべき撮像領域を提供することが できる。ここで、容器は、所望の撮像手段により撮像が可能な状態で試料を保持する あらゆる収容体を含み、具体的にはゥエル、シャーレ、スライドチャンバ一、キュベット が挙げられる。また、生命体としては、植物、哺乳類、魚類、昆虫類、細菌、ウィルス が挙げられる。生命体が生命を維持している状態で、必要に応じて生命体の一部を 撮像可能な状態に処置し、適宜の撮像手段により生命体の撮像領域にアクセスでき る場合には、生物学的試料が生命体に保持されていることになる。生物学的試料とし ては、生命体に由来するあらゆる部分を含む力 好ましくは生物学的な細胞であり、 さらに好ましくは発生学的な***または増殖が可能な有核細胞である。細胞が異な る機能に分離した複数の器官を構築している生命体については、関心ある生物学的 活性を示している任意の器官であってよい。生物学的活性としては、生理学的、遺伝 学的、免疫学的、生化学的、血液学的活性のうち 1以上の活性であり得る。 「複数の 撮像領域」は、同一の保持手段に保持された 1個以上の生物学的試料、または別々 の保持手段にぞれぞれ保持された 1種類以上の被撮像部位を意味する。
[0317] ハイスループット撮像装置の効果について
以上のように本実施形態のハイスループット撮像装置は、制御手段により設定され た撮像条件によって撮像の作業が効率的に実行されるので、多数の撮像領域を短 時間で撮像することが可能となる。また、多数のタイムラブスデータを試料の数が非 常に多い場合でも同時期に得ることができるので、生物学的活性に関する研究や臨 床において大きく寄与する。
[0318] 本実施形態の第一の実施例として、図 30を参照して説明する。図 30は本実施形 態の装置の全体構成を示す概念図である。培養顕微鏡本体 101Cは、細胞を培養 するインキュベータ室と細胞を観察する顕微鏡部分とがー体となっている。培養顕微 鏡本体 101Cには内部にコントローラ 102Cが内蔵されており、後述する各ユニットの 制御を行っている。コントローラ 102Cは培養顕微鏡のスペースをコンパクトにするた め培養顕微鏡本体 101C内部に配置したが、コントローラ 102Cの発熱による影響が ある場合は培養顕微鏡本体 101C外部に配置してもよい。さらに、培養顕微鏡本体 1 01Cは警告ブザー 103Cと警告表示装置 104Cとを備えている。警告ブザー 103C は、実験中に何か問題が発生した場合などに警告音を鳴らすことができる。また、警 告表示装置 104Cは、警告ブザー 103Cと同様に何か問題が発生した場合の警告 表示や、作業指示などの表示が可能である。特に、警告表示装置 104Cは、操作パ ネルとしての機能を持つタツチパネル 104aCを備えており、作業者が、警告表示装 置 104Cに表示される指示に従いタツチパネル 104aCに触れて操作を選択すること ができる。
[0319] コントローラ 102Cにはフォーカスハンドル 'ジョイスティック 105Cが接続されており 、フォーカスハンドルにて後述する顕微鏡部分の Z軸方向(即ち、試料にピントを合わ せる方向)を移動させることができ、ジョイスティックにて Rステージ、 Θステージを移 動させることができる。 Θステージは軸を中心に回転方向に移動可能な電動ステー ジであり、 Rステージは前記 Θステージの中心軸と垂直な 1つの軸の方向に移動可 能な電動ステージである。これらは装置サイズをコンパクトにするため使用した力 一 般的な XYステージでもよレ、。特に、図 31に示す Rステージモータ 30Cと Θステージ モータ 31Cは、後述する本実施形態の装置のインターバル撮像条件設定手段により 設定された条件に基づいて、コントローラ 102Cを通じて駆動制御される。
[0320] 培養顕微鏡本体 101Cはインキュベータ室内に温度制御用のヒータ 112Cを有し、 ヒータ 112Cをコントロールする温度コントローラ 106Cが装備されている。
[0321] コントローラ 102Cおよび温度コントローラ 106Cはコンピュータ 109C (図 30ではパ ソコン)に、例えば RS— 232Cなどのインターフェイスで接続されており、コンピュータ 109Cから制御が可能になっている。また、インターフェイスとして必要な各手段 (メモ リ、演算回路、表示部、入力部等)も含んでいる。
[0322] 培養顕微鏡本体 101Cのインキュベータ室内へ供給する混合エアー(温度、湿度 および炭酸ガス濃度(二酸化炭素濃度)をそれぞれ、例えば 37°C、 95〜100%およ び 5%に制御したもの。なお、各数値は一般的な値であり調整可能である。)を蓄積し てあるタンク 107Cが図示の如く外部にあり、電磁弁 108Cの開閉により混合エアーを インキュベータ室内へ供給できる。本実施形態ではタンク 107Cに混合エアーを入れ ているが、タンク 107Cを炭酸ガスのみとし、湿度を維持するための不図示の水槽を インキュベータ室内に設置してもよい。またタンク 107Cを 37°Cに維持しないで炭酸 ガスをインキュベータ室に供給することも可能である。電磁弁 108Cはコンピュータ 10 9Cにより制御するようにしても良い。
[0323] コンピュータ 109Cは LAN、インターネット等のネットワーク 110Cに繋がれており、 さらにネットワーク 110Cは遠隔地コンピュータ 111Cに接続されており、ネットワーク 1 10Cを介して遠隔地コンピュータ 111C (図 30ではパソコン)からコンピュータ 109C を制御することができ、ついては培養顕微鏡本体 101Cで行うタイムラプス'インター バル撮像を遠隔地コンピュータ 111Cから監視したり、撮像データを大量に蓄積して 検索可能なデータベースとしてコンピュータ 109Cを機能させたりすることが可能であ る。遠隔地コンピュータ 111Cのユーザは利害関係者であってよいが、複雑多岐に亘 るタイムラブス撮像の利用を順調に継続するために、システム運用を行う外部の専門 業者との業務契約でまかなうのが好ましい。また、遠隔地コンピュータ 111Cとしては
、装置の現場 (検査室、実験室等)以外の場所であれば、退室時、帰宅時、主張時、 休暇時の任意の時刻において主に監視を行う目的の携帯型の画像受信機であって もよレ、。携帯型の遠隔地コンピュータ 111Cによれば、所望の画像を呼び出したり、 警告時にブザー、ランプ、異常マーク等で異常を把握したりという即座の対応が可能
となる。いずれにしても、装置本体 101Cと通信手段で接続する遠隔地コンピュータ 1 11Cにおいては、適切な認証手段 (例えば、暗証番号、担当者 ID、電子鍵、バイオメ トリックス(指紋、虹彩、静脈等))によるアクセス制限を行うのが好ましい。また、適切 な認証が行われたアクセス者であれば、遠隔コンピュータ 111Cを通じて、インターバ ル撮像条件を変更するようにリモート 'コントロール出来るようにすることがさらに好ま しい。このように、遠隔地コンピュータ 111Cは、装置の現場に行かなくとも、監視や一 部の操作を可能にすることも出来るので、使用者の負担 (例えば工数、経費、移動時 間)を大幅に軽減する優れた利用システムを提供する。
[0324] 図 31は本実施形態の培養顕微鏡本体 101Cの内部構成図である。インキュベータ 室 20Cはフタ 22Cにより外部から密閉され、その内部の培養環境の温度と湿度と炭 酸ガス(CO )濃度とを一定に維持したり又積極的に制御したりする。混合エアーは
2
エアー配管 24Cを介してタンク 107Cから供給されている。不要なエアーは不図示の 配管から廃棄される。フタ 22Cはヒンジ 23Cを軸に把手 21Cにより開閉可能である。 フタ 22Cが開いている場合、フタ開閉センサー 28Cが作動し、コントローラ 102Cに 対しフタ 22Cの開閉を知らせることができる。
[0325] ヒータ 112Cは、インキュベータ室 20C内部に設置され、定められた温度(例えば 3 7°C)以下になったことを不図示の温度センサーにより検出した場合、 自動的に動作 し温度を維持することができる。図 31にはヒータ 112Cを 1個しか記載してレ、なレ、が、 フタ 22Cやベース 55C全体に取り付けインキュベータ室 20C内の温度ムラを小さくす るようにしてもよい。
[0326] 円形トレィ 26Cは複数の試料設置穴 52Cを有し、これらに複数の試料容器 25Cが 設置できる。複数の試料容器 25Cは、装置本体の搬送手段の保持台として機能する 円形トレィ 26Cに対し保持される。本発明では、円形トレイのような搬送手段における 板状の保持台における別々の位置に、複数個の試料容器が保持された場合にも、「 複数の試料容器を収容する基板」と称することができる。試料容器 25Cは円形トレィ 26Cに対し上方向に取出すことが可能である。試料容器 25Cを円形トレィ 26Cに設 置すると、試料容器 25Cの底面が円形トレィ 26Cの試料設置穴 52Cのリング状突起 51Cに接触し、試料容器 25Cが下に落ちないようになつている。さらに、試料容器 25
Cは円形トレィ 26Cに対し位置決め可能で設置できるようになっている。試料容器 25 Cの底面は透明のガラスまたは樹脂でできており、対物レンズ 33Cから観察可能であ る。ここで、試料容器 25Cの材質ないし表面形状によっては、撮像視野に対応する 試料容器 25Cの底面の中央付近またはほぼ全面を切り欠き状態とし、この部分に、 光透過性が高く且つ平滑に成形されたガラス等の透光窓を貼り合わせるようにした改 良型の容器を用いるのが好ましい。
[0327] また、試料からの水分の蒸発を防止するために試料容器 25Cを覆う程度の適宜の 試料容器フタ 57Cを被せてもょレ、。培地交換で試料容器 25Cをインキュベータ室 20 Cから外に出し、試料容器 25Cが冷えた状態でインキュベータ室 20Cに入れたときに 、試料容器 25Cに被せられている試料容器フタ 57Cが結露する可能性がある。試料 容器フタ 57Cが結露した場合に当該結露した試料容器フタを交換できるように、予備 の試料容器フタ 57Cを保管するスペースがインキュベータ室 20C内に設けてある。 保管スペースに置かれている試料容器フタ 57Cは培地交換中もインキュベータ室 20 C内にあるため冷えることはなレ、。さらに、試料容器 25Cは、例えばガラスのような透 明で観察可能な底面部材および上面部材、ならびに例えば金属のように熱容量の 大きい 2つの部材 (部材 Aおよび部材 B)からできており、底面部材と部材 Aは接着に より固定され、上面部材は部材 Bと接着されている。部材 Aと部材 Bは着脱可能にな つている。このような構造にすることで、上面部材と底面部材の結露を防止することが できる。
[0328] 円形トレィ 26Cは回転ベース 34Cから脱着可能で、円形トレィ 26Cを外した場合、 円形トレィ脱着センサー 27Cが作動し、コントローラ 102Cへ円形トレィ 26Cが外れて レ、ることを知らせることができる。円形トレィ脱着センサー 27Cは図 31では押しボタン 式を記載しているが、円形トレィ 26Cの脱着を検知できるセンサーならどのようなもの でもよレ、。また、試料台としても機能するこの円形トレィ 26Cは、試料容器 25C内に添 加ないし交換された試薬等の所定の溶液を適宜混和するための混和手段(図示せ ず)を具備するのが好ましぐこの混和手段により、揺動ないし振動 (超音波振動もし くは震蕩)でもって特定の試料容器 25C内の液体を万遍なく容器内に行渡らせるも のである。
[0329] 回転ベース 34Cは、 Θ回転軸 35Cに取り付けられており、 Θステージモータ 31Cの 回転により円形トレィ 26Cを所定の回転方向に 1トレイずつ間欠的に回転停止するこ とができる。この円形トレィ 26Cの回転と停止からなる回転周期は、後述する本実施 形態の装置のインターバル撮像条件設定手段により設定された条件に基づいて、コ ントローラ 102Cを通じて駆動制御される。回転周期の変形例として、円形トレィ 26C に配置した同一円周上の全ての試料容器 25Cの個数より 1トレィ分だけ多いか又は 少ない回転距離で停止するような回転停止の周期を行うことによって、見かけ上は 1 試料容器ずつ間欠的に進むような停止でありながら、間欠的移動するごとに殆ど全 ての試料容器 25Cを毎回 1周させることも可能となり、この各周回移動において、個 々の試料容器 25Cに関する培養状態の良否などの監視を行うことも可能となる。
[0330] Rステージモータ 30Cによりリードネジ 38Cが回転し、ナット 53Cに取り付けられて レ、る直線移動ベース 36Cが左右に移動する。直線移動ベース 36Cには直線ガイド 5 4Cがあり直線方向のみ移動可能になっている。 Θ回転軸 35Cは直線移動ベース 36 Cに対し回転可能に取り付けられており、直線移動ベース 36Cが左右に移動すると 回転ベース 34Cも左右に移動させることができる。これにより、試料を R Θ極座標系 で移動できるステージを実現できる。
[0331] ベース 55Cはインキュベータ室 20Cとモータ室 58Cとを分けており、インキュベータ 室 20C内の高湿のエアーがモータ室 58Cに進入しないように各部が密閉されている 。まず回転ベース 34Cとベース 55Cの間には平面状のシート 50Cを挟んであり滑動 可能になっている。
[0332] 蛇腹 56Cは、対物レンズ 33Cがインキュベータ室 20内に露出している部分を囲む ように取り付けてあり、対物レンズ 33C先端部分とベース 55Cにその端面を接着等で 固定し密閉されている。これによりベース 55Cと対物レンズ 33Cの隙間力 モータ室 58Cに高湿のエアーが入らなレ、ようにしてレ、る。
[0333] 対物レンズ 33Cは、 Zステージモータ 32Cがリードネジ 39Cを回すことにより上下さ せること力 Sできる。対物レンズ 33Cが上下することで試料にピントを合わせることがで きる。対物レンズ 33Cが上下しても蛇腹 56Cはゴムなどのやわらかい樹脂でできてい るため伸び縮みすることができ、密閉は維持される。
[0334] 顕微鏡室 59Cは温度変化による光学系部材の膨張がない程度に温度を維持する ようになってレ、る。温度維持には不図示のヒータ等が用いられる。
[0335] 顕微鏡室 59Cにはコントローラ 102Cが設置されており、各ユニットへの配線が接 続されている。 LED照明 41Cは蛍光観察用の照明で、蛍光キューブ 42Cを介して通 過窓 40C、対物レンズ 33Cを経由して試料を照明する。試料からの光は対物レンズ 3 3C、通過窓 40C、蛍光キューブ 42Cを介して、倍率変更レンズ 43Cを通過しミラー 4 4Cで光路を 90度曲げて CCDカメラ 45Cに入射される。ミラー 44Cは CCDカメラ 45 Cの設置スペースを確保するために付けたもので、 CCDカメラ 45Cの設置スペース 力あれば光路を折り曲げる必要は無レ、。
[0336] LED照明 41Cの代わりに、不図示の水銀ランプ等、光ファイバ一を用いて光源とし て用いることも可能である。水銀ランプの場合、 LED照明 41Cのように高速で点灯消 灯ができないため、シャッターを取り付けて光の入射をオン Zオフする必要がある。こ れらもコントローラ 102Cから制御可能である。なお、倍率変更レンズ 43Cを介さずに CCDカメラ 45Cに入射する場合もある。つまり、倍率変更レンズ 43Cは対物レンズ 3 3Cから CCDカメラ 45Cに延びる光路上に適宜挿脱されてよい。
[0337] 蛍光キューブ 42Cは軸 48Cを中心に回転可能になっており、波長の異なる蛍光キ ユーブに切換えることができる。回転はキューブターレットモータ 47Cの駆動により電 動で行える。これらもコントローラ 102Cから制御可能である。
[0338] 倍率変更レンズ 43Cは軸 49Cを中心に回転可能になっており、倍率の異なるレン ズに切換えることができる。回転はレンズターレットモータ 46Cの駆動により電動で行 える。これらもコントローラ 102Cから制御可能である。この倍率変更レンズ 43Cは、ズ ーム機能を内蔵した 1個のズームレンズであってもよい。また、必要に応じ、所望の倍 率等の仕様のレンズに交換するだけの構成でもよい。
[0339] 図 32は、図 30、図 31に記載したユニットで電気的方法などにより制御可能なュニ ットをブロック図に示したものである。図 30と図 31で説明した各ユニットについての説 明は省略するが、各ユニットは、コントローラ 102Cに接続され、コンピュータ(パソコン ) 109Cのユーザインターフェイスから観察者が制御可能になっている。 CCDカメラ 4 5Cは、冷却 CCDを用いた高感度タイプが用いられ、直接コンピュータ 109Cに接続
されている。ヒータ 112Cは温度コントローラ 106Cを介してコンピュータ 109Cに接続 されている力 温度コントローラ 106Cの機能がコントローラ 102Cにあればコントロー ラ 102Cを介してヒータ 112Cを制御してもよい。
[0340] 図 32の特徴的な構成としては、装置本体 101C内部の機能を外部より制御する外 部制御系 60において、セッティングされた各試料容器 25に関する撮像条件を設定 するインターバル撮像条件設定手段 70Cがコンピュータ 109Cを介してコントローラ 1 02Cに接続している点である。また、コントローラ 102Cが撮像手段としての CCDカメ ラ 45Cの撮像動作についても駆動制御するべく接続している点も特徴の一つである 。これにより、コンピュータ 109Cに付随する入力手段や表示手段のような各種インタ 一フェイスを含む外部制御系 60Cと、インターバル撮像条件設定手段 70Cと、内部 制御系としてのコントローラ 102Cと、撮像手段としての CCDカメラ 45Cと、各試料容 器 25Cを保持する円形トレィ 26Cのための各種モータ 30Cおよび 31Cと、を連携可 能にしている。
[0341] ここで、インターバル撮像条件設定手段 70Cによる設定内容について説明する。こ のインターバル撮像条件設定手段 70Cは、次に示すようにあらゆる場面での想定に 対応した装置を提供する。
装置 1:複数の撮像領域に存在している生物学的試料を撮像して試料画像を取得す るための画像取得手段と、前記画像取得手段を制御し、前記撮像領域ごとにタイム ラプス 'インターバル撮影を行うための制御手段とを備え、前記制御手段は、前記試 料画像の取得に必要な撮像時間と前記撮像領域の数に基づいて前記撮像領域ごと のインターバル撮影の条件を設定するためのインターバル撮像条件設定手段を有し ていることを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 2 :装置 1に記載の装置において、前記インターバル撮影の条件は、複数の撮 像領域を複数回切り換えて撮像する設定を有していることを特徴とするハイスループ ット撮像装置。
装置 3:装置 2に記載の装置にぉレ、て、前記画像取得手段から送出される画像信号 を撮像領域ごとに積算して画像を生成することを特徴とするハイスループット撮像装 置。
装置 4 :装置 1に記載の装置において、前記インターバル撮影の条件は、撮像に必 要な時間以外に別種の処理を行うための余剰時間を含んでいることを特徴とするノ、 イスループット撮像装置。
装置 5:装置 4に記載の装置にぉレ、て、前記撮像領域を前記画像取得手段による撮 像可能な光環境に維持するために外部との遮光を行う遮光手段と、前記遮光手段に よる光環境を一時的に解除して前記画像取得手段による撮像以外の処理を行うため の処理手段とを備えたことを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 6 :装置 1から 5のいずれかに記載の装置において、前記複数の撮像領域に対し て前記画像取得手段を相対的に移動する移動手段を備えることを特徴とするハイス ループット撮像装置。
装置 7 :装置 6に記載の装置において、複数の生物学的試料を円形トレイの円周に 沿って順次配置するとともに、この円形トレィを前記制御手段の撮像条件に応じて回 転および停止可能としたことを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 8 :装置 7に記載の装置において、前記円形トレイの回転周期を複数の撮像領 域を通過してから停止する構成としたことを特徴とするハイスループット撮像装置。 装置 9 :装置 8に記載の装置において、前記円形トレイの回転周期が、 1回転 ± 1個 の撮像領域分の長距離回転モードを有していることを特徴とするハイスループット撮 像装置。
装置 10 :装置 9に記載の装置において、前記長距離回転モードの長距離回転中に 前記円形トレィ上の全ての撮像領域に関する別種の参考情報を取得する参考情報 取得手段を備えたことを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 11:装置 1〜4のレ、ずれかに記載の装置にぉレ、て、前記画像取得手段は撮像 時の撮像倍率を変更可能な撮像倍率変更手段を有し、前記撮像倍率変更手段によ る撮像倍率に応じてインターバル撮像条件を設定することを特徴とするハイスループ ット撮像装置。
装置 12 :装置 1〜4のいずれかに記載の装置において、前記画像取得手段は撮像 領域から得られる光信号を受光する受光素子を備え、受光素子の受光能力に応じて インターバル撮像条件を設定することを特徴とするハイスループット撮像装置。
[0343] 装置 13 :複数の撮像領域に存在している生物学的試料を異なる画像関連情報を抽 出する画像情報抽出手段により撮像して試料画像を取得するための画像取得手段 と、前記画像取得手段を制御し、前記撮像領域ごとにタイムラブス 'インターバル撮 影を行うための制御手段とを備え、前記制御手段は、前記試料画像の取得に必要な 撮像時間と前記画像情報抽出手段の種類に基づいて前記撮像領域ごとのインター バル撮影の条件を設定するためのインターバル撮像条件設定手段を有していること を特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 14 :装置 13に記載の装置において、前記画像情報抽出手段が、同一の撮像領 域に対して同時または連続的に異なる画像関連情報を抽出することを特徴とするハ イスループット撮像装置。
装置 15 :装置 14に記載の装置において、前記画像情報抽出手段が抽出した異なる 画像関連情報を撮像領域上の試料に対応付けて合成する画像合成手段を有するこ とを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 16 :装置 13〜: 16のいずれかに記載の装置において、前記画像情報抽出手段 力 透過光、蛍光、生物発光、化学発光、ラマン分光、赤外線の 2組以上の組合せで あることを特徴とするハイスループット撮像装置。
装置 17 :装置 1〜: 16のいずれかに記載の装置において、前記生物学的試料中の細 胞を継続して培養するための培養手段を備え、前記制御手段が複数の撮像領域に 存在する細胞に関する各培養期間中の撮像時期に応じてインターバル撮像条件を 設定することを特徴とするハイスループット撮像装置。
[0344] 各試料設置穴 52Cにセットされた試料容器 25Cに関する試料情報は、コンビユー タ 109Cに内臓のメモリに記憶され、タイムラブスのインターバル撮像条件の設定時 に呼び出され、撮像条件を決定して、コントローラ 102Cによる撮像が実行される。決 定した撮像条件に関する情報は、コントローラ 102Cを介してコンピュータ 109Cに通 知され、試料情報と対応付けてコンピュータ 109Cのメモリに記憶されるとともに、適 宜、ユーザインターフェイスに表示することが可能である。
[0345] コンピュータ 109Cのユーザインターフェイスには、円形トレィ 26Cの試料容器 25C の個別 IDが付与されており、この IDを通じて撮像装置および円形トレイの動作が対
応するようにプログラミングされている。ユーザインターフェイスの入力手段(ォプティ カルマウス、キーボード、タツチパネル、電子ペン等)は、ユーザが前記 IDごとに選択 した情報に基づいた撮像条件を設定するようにコンピュータ 109Cを促がす。
[0346] 次の各ステップによって示される一連の工程において、まず、観察準備状態となつ て、 GUIが表示される(S1)とともに、ステージ原点出しが実行される(S2)。ここで、 ユーザが観察したい試料容器を入力可能となり入力待ち(S3)になった後、好ましく は GUIにおける「StageZR Θ」と「Stage/Z」にある各方向矢印ボタンを押し、試料 容器 25C内の細胞画像をライブイメージウィンドとして表示させながら、タイムラブス 撮像を希望する細胞を探して、入力手段により表示画面上で位置を選択する。即ち 、この例においては、最初に、上述したような明視野画像および/または発光画像を 表示した上で所望の細胞、細胞群、組織領域、ひいては細胞中の特定部位を指定 するようになつている。好ましくは、任意の撮像時期において、タイムラブス撮像の途 中でも、現在の撮像結果ないし解析結果を表示できるようにするのが好ましい。この ためには、タイムラブス撮像の継続中に得られた発光画像を逐次解析するようにして 、迅速な結果出しを行うような制御を実行するのがさらに好ましい。
[0347] 次に、選択した観察位置に関する観察条件の待ち状態となり (S4)、ユーザが所望 の観察条件を入力する(S5)。入力においては、例えば要求に沿った観察条件 (例 えば、使用する試薬の種類や実験条件に応じた微弱発光の波長や、検出感度、明 視野観察における明るさ等)を上記と同様に入力する。また、図 31のように蛍光測定 を併用する例においては、例えば LED— G (緑色)と LED— B (青色)のどちらを使う 力を選択したり、 LED照明 41Cの明るさを決定したりする。また、 GUIにおける「Cub e」ボタンにて、選択した波長に対応する蛍光キューブを選択したり、「Lens」ボタンに て、番号のボタンに対応する倍率変更レンズを決定したりする。さらに、 GUIにおける 「Camera Control」ボタンにて、 CCDカメラの露出時間や AEを実行するかどう力、 などカメラの撮影条件を決定したり、「Image File Name」ボタンにて、撮影後の画 像を保存するファイル名を決定したり、「Time_lapse」ボタンにて、タイムラブスのィ ンターバル時間や実験期間の設定など観察条件として必要なパラメータを全て設定 したりする。ここでタイムラブスのインターバル時間とは、多点タイムラプス(1点のみの
場合も含む)を行う場合の 1回目の多点を撮影するための電動ステージ移動時間、 撮影時間及び制御時間と、前記多点の 2回目を撮影開始する直前までの待機時間 を合計したものである。
[0348] 次に、入力された撮影条件を記憶(S6)すると、例えばタイムラブスのインターバル 時間に対してステージの移動時間やカメラの露出時間の合計時間が長い場合、正し くタイムラプス.インターバル撮像を行うことができないため、コンピュータがタイムラプ スのインターバル時間の再設定や撮像時間の再設定を行って、所望の数の撮像領 域を漏れなく撮像できるようにすることができる。例えば、 GUIにおける自動調整ボタ ンをクリックすることで、ステージの移動時間、カメラの露出時間の合計時間よりも多 少長くした時間を自動的に算出し、それをタイムラブスのインターバル時間として設 定すること力 Sできる。また、待機時間をゼロに近づけることで、連続性のあるタイムラブ ス撮像に切り換えることができる。こうして、特定の観察位置における設定が終了する と(S7)、観察準備が終了して、撮像が開始できる状態となる。なお、入力した条件の 記憶を中止して入力をやり直したい場合や別の観察位置についての設定を行いた い場合は、 S3に戻って、入力を繰返すこととなる。
[0349] 以上のように、この例に示した多点タイムラブスによれば、所望の観察対象のそれ ぞれに対して、ノ、イスループットで且つ適切な撮像条件で漏れなく自動観察できる。
[0350] 以上、上記の例では、蛍光顕微鏡をも兼用した例で説明したが、本実施形態は発 光画像を専用に撮像してもよぐその場合には、励起光を照射する必要が無いので、 照射光学系を除去することができる。蛍光標識した細胞等の観察を発光標識した細 胞等の画像と同時に又は別々に観察するようにしてもよい。発光標識の例としては、 顕微鏡下でも肉眼では見えなレ、ような微弱光を発する生物発光 (または化学発光)が 挙げられる。
[0351] 生物発光ほたは化学発光)の例として、特定の関心ある遺伝子領域のプロモータ 一の下流に連結したレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む DNAが 導入された細胞または組織が挙げられる。ルシフェラーゼをレポーターとして発現さ せた細胞または組織を用いることにより、所望の発現部位におけるルシフェラーゼ活 性を検出することによって、転写の経時的変化を実時間で検出することが可能である
[0352] 好ましい態様は、導入した発光遺伝子が末梢組織中で概日リズムを有するように発 現される脊椎動物由来の細胞または組織である。末梢組織には、肝臓、肺、および 骨格筋が含まれるが、これらに限定されることはなレ、。これらの末梢組織は、 7〜: 12 時間の位相差でもって概日リズムを刻んでいることが報告されている。概日リズムの 遅延パターンを示したことは、多器官から構成される複雑な哺乳動物の生物リズムの 正常な協調性を反映したものと考えられる。
[0353] これによれば、本実施形態により解析した情報が、概日リズムと関係のある時差ぼ け又は睡眠障害の機序を解明するため、ならびに概日リズム障害の治療に有用な化 合物のスクリーニングおよび試験を目的として用いる哺乳動物モデルを開発するた めに有用であるといえる。
[0354] また、レポーター遺伝子を発現する本実施形態の DNAを含む形質転換体またはト ランスジエニック哺乳動物を用いると、種々の試験またはスクリーニングを行うことがで きる。さまざまな任意の条件下でこれらの組織または細胞におけるレポーター遺伝子 の発現を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を調節する刺激もしくは化合 物の効果を評価すること、またはこれらをスクリーニングすることが可能である。刺激 には温度、光、運動、および他のショックが含まれる。使用する化合物に制限はない 。本実施形態は特に、本実施形態の形質転換体またはトランスジエニック哺乳動物 に導入された時計遺伝子(例えば Period 1)のプロモーターによって誘導される発 現を改変する化合物を、その形質転換体またはトランスジエニック哺乳動物を用いて 試験またはスクリーニングする方法に適用可能である。
[0355] 本実施形態において測定する器官に特に制限はなぐ視床下部の視交叉上核 (S CN)を含む中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)、ならびに肝臓、肺、およ び骨格筋を非制限的に含むような他の末梢組織が含まれる。より具体的には、 SCN および末梢組織における時計遺伝子" Period 1"の発現の位相関係および同調機 構を評価するために有用である。ここで、本実施形態による発光顕微鏡により、さらに 、異なる所望の経過時間ごとの微弱光画像を連続的ないし断続的に取得するように する場合には、 1以上の同一の細胞に関する時間ごとの光強度を網羅的に解析した
解析データに基づレ、て、例えば時間遺伝子の活性パターンや薬剤等による細胞内 物質の応答パターンを網羅的に評価することができるようになる。また、認識した細胞 のうち所定の光強度なレ、し光分布を示さなレ、細胞にっレヽては網羅的評価を行わなレ、 ことにより、解析すべきでない細胞を除外して正確な評価を実施できるようになる。ま た、画像解析した全ての細胞の光強度の合計値または平均値を算出することにより、 個々の細胞の評価の他に、解析した細胞全体の評価も実施できるようになる。また、 画像解析した 2以上の細胞を、その光強度および/または光強度パターンに応じて 同一または異なる細胞グループに分類することにより、解析したパターンごとに時間 遺伝子の活性を評価できるようになる。場合によっては、パターンが異なる細胞ごとに 時間遺伝子の活性度なレ、し活性変化の詳細を調べることができるようになる。本実施 形態によれば、時計遺伝子の発現パターンの周期の波形形状 (振幅長、周期幅など )や波形強度 (発現量、活性速度など)といった変動パラメータに関して、多様な組合 せでもって解析を行うことができる。時計遺伝子の発現パターンの周期の波形解析の 結果は、診断、治療、生育 (ないし生物学的発生)等の研究用途や産業上(医学、農 産など)用途に重要な情報をもたらすので、本実施形態の果たす役割は大きい。 また、本実施形態の装置は、多数の細胞を含む生物学的試料を画像取得可能な 状態に保持する保持手段と、前記生物学的試料力 発する微弱な発光に関する光 学的データを蓄積して画像解析可能な画像情報を取得する微弱光画像取得手段と 、前記画像情報を形態的に解析して個々の細胞を認識するとともに、認識した細胞 に関する微弱光の光強度を網羅的に評価するための画像解析手段とを備えたことを 特徴とする。ここで、前記保持手段を、複数のゥエルを一体化したプレートをアドレス 化可能に保持する構成とすることにより、前記画像解析手段は、複数のゥエル間の前 記評価を同一視野内または所定の順番で行えるようになるので、本実施形態の装置 は、異なる試料または異なる薬剤等による活性評価の結果を比較したり相関させたり すること力 Sできるようになる。この場合、前記保持手段を、複数の独立した容器をアド レス化可能に保持する構成としてもよぐこれにより、前記画像解析手段は、前記微 弱光画像取得手段の視野に限定されず、多数の容器について前記評価を行えるよ うになる。また、本実施形態の装置は、画像情報を取得した時刻に応じた前記評価を
行うように制御する制御手段を有することにより、経過時間ごとの同一細胞に関する 解析、特定の活性を示した異なる時間同士の細胞(同一または異なる細胞)の比較 解析といった多様な時間解析ができるようになる。また、本実施形態の装置は、前記 画像解析手段での解析結果を画像情報と関連付けて表示する表示手段をさらに有 することにより、解析結果の中から画像として見たい解析結果に対応する画像を表示 できるようになる。また、前記表示手段が所望の画像情報を動画表示する構成を有 することにより、本実施形態の装置は、 1以上の所望の細胞に関する活性の変化をリ アルタイムな映像でもって観察することができるようになる。動画表示としては、同一 細胞に関する時間ごとの微弱光画像を画像処理により重ね合わせて臨場感を向上さ せるようにするとさらに好ましい。また、動画表示としては、同一細胞に関する時系列 の複数画像を駒送りで並列(なレ、し一部ずらしただけでもよレ、)表示するようにして、 時間ごとの画像を全貌できるようにしてもよい。
[0357] また、本発明において、透過光(明視野)画像を得るための照明光を、蛍光画像を 誘起するための励起光に替えてもよい。この場合、照明光としての励起光の照明の 後に誘起された蛍光画像について撮像を行う工程を、照明画像の撮像として説明す ること力 Sできる。
[0358] また、本実施形態によれば、以下に示すような、本実施形態の微弱光撮像方法及 び/又は撮像装置に関する更なる態様ないし応用例、ならびに撮像装置のためのソ フトウェアの実施形態も包含する。
態様 1 :上述した撮像装置を具備した生体検査機 (例えば、内視鏡、 CTスキャン測定 機)。
態様 2 :上述した撮像装置を具備した分析装置 (例えば、ルミノメータ、サイトメータ)。 態様 3:上述した撮像装置を具備したバイオチップ製造装置。
態様 4:上述した微弱光撮像方法による画像データの解析サービス。
態様 5:上述した微弱光撮像方法による画像情報の管理システム。
態様 6:上述した微弱光撮像方法において、 2種 (又は 3種以上)の波長に対応した 光学フィルターと連結した 2台の撮像用カメラを配置し、試料からの光線を光分離素 子により 2等分 (又は 3以上の n等分)して、各カメラによって同時に 2種類(又は 3種類
以上)の微弱光データを蓄積し、完全に同期した波長ごとの微弱光画像を取得する ようにした微弱光マルチイメージング方法。
態様 7 :上述した微弱光撮像方法において、試料からの光線を、 2種 (又は 3種以上) の波長に対応した光分離素子により 2等分 (又は 3以上の n等分)し、分離後の各波 長ごとの光線の各々を同一(又は別個の)撮像素子 (例えば CCD)上に設定した波 長ごとの結像エリアに結像して、全結像エリアにおける 2種類(又は 3種類以上)の微 弱光データを同時に蓄積し、完全に同期した波長ごとの微弱光画像を取得するよう にした微弱光マルチイメージング方法。
態様 8:上記態様 6又は態様 7に記載の微弱光マルチイメージング方法を実行するた めの撮像装置。
[0359] ソフトウェア 1 :上述した装置 1〜: 17のいずれかに記載の装置において、設定したイン ターバル撮像条件によるインターバル撮像が実行されるように、前記制御手段および 前記画像取得手段を機能させるためのプログラムを有することを特徴とするハイスル 一プット撮像装置のためのソフトウェア。
ソフトウェア 2 :上述した態様 1〜8のいずれかに記載の装置、サービスまたはシステム を実行するためのソフトウェア。
[0360] また、本発明によれば、以下の付記項に記載の発明を包含すると解することもでき る。
付記項 1B :高開口数 (NA)と拡大倍率とで決まる光学条件と適用すべき方法又は装 置と連携して、微弱光による撮像との連携を最適化したことを特徴とする生体試料の 撮像方法。
付記項 2B :付記項 1Bに記載の生体試料の撮像方法において、前記撮像がインター バル条件の設定を行う工程を含み、生体試料に関する複数の画像を異なる時間に おいて複数取得することを特徴とする生体試料の撮像方法。
付記項 3B:付記項 1Bまたは 2Bに記載の生体試料の撮像方法を用いることを特徴と する撮像装置。
付記項 4B:付記項 3Bに記載の撮像装置にぉレ、て、微弱光を発生する細胞を解析 するためのソフトウェアと連携するように制御されたことを特徴とする撮像装置。
付記項 5B :付記項 IBまたは 2Bに記載の生体試料の撮像方法において、適宜改良 または変形例を含む態様を含むことを特徴とする生体試料の撮像方法。
付記項 6B:付記項 3Bまたは 4Bに記載の撮像装置にぉレ、て、適宜改良または変形 例を含む態様を含むことを特徴とする撮像装置。
Claims
[1] 複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容された微弱光を発する生体試料 を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像方法であって、
前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および/また は前記対物レンズを移動し、前記対物レンズの近点側の焦点位置および/または前 記対物レンズの遠点側の前記焦点位置を計測し、計測した前記焦点位置に基づい て、前記所望の前記収容部に収容された前記生体試料内の観察対象部位に合うよ うな前記対物レンズの前記焦点位置を決定し、決定した前記焦点位置に前記対物レ ンズの前記焦点位置を合わせ、前記対物レンズを介して前記生体試料を撮像するこ と、
を特徴とする生体試料撮像方法。
[2] 前記対物レンズの視野内に前記所望の前記収容部が収まるまで前記基板および /または前記対物レンズを移動した際、当該基板および/または当該対物レンズの 移動先での位置を計測し、計測した前記移動先での前記位置に関する移動先位置 情報を当該所望の前記収容部を識別するための収容部識別情報と関連付けて記憶 すること
を特徴とする請求項 1に記載の生体試料撮像方法。
[3] 複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容された微弱光を発する生体試料 を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像方法であって、
前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および/また は前記対物レンズを移動する移動ステップと、
前記生体試料へ光を照射する光照射ステップと、
前記対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更ステップと、
前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を計測する焦点位置計測ステップ と、
前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて、前記光照射ステップで光が 照射された前記生体試料を撮像する光照射試料撮像ステップと、
前記光照射試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて当該撮像画像を特
徴付ける特徴量を算出する特徴量算出ステップと、
前記焦点位置変更ステップ、前記焦点位置計測ステップ、前記光照射試料撮像ス テツプおよび前記特徴量算出ステップを繰り返し実行する実行ステップと、
前記実行ステップを実行して蓄積した複数の前記焦点位置から、前記実行して蓄 積した複数の前記特徴量に基づいて、少なくとも 1つの前記焦点位置を選出する焦 点位置選出ステップと、
前記焦点位置選出ステップで選出した前記焦点位置に基づいて、前記所望の前 記収容部に収容された前記生体試料内の観察対象部位に合うような前記対物レン ズの前記焦点位置を決定する焦点位置決定ステップと、
前記焦点位置決定ステップで決定した前記焦点位置に前記対物レンズの前記焦 点位置を合わせる焦点位置合わせステップと、
前記対物レンズを介して前記生体試料を撮像することで当該生体試料の発光画像 を取得する発光画像取得ステップと、
を含むことを特徴とする生体試料撮像方法。
[4] 前記移動ステップは、前記対物レンズの視野内に前記所望の前記収容部が収まる まで前記基板および/または前記対物レンズを移動し、当該基板および/または当 該対物レンズの移動先での位置を計測し、計測した前記移動先での前記位置に関 する移動先位置情報を当該所望の前記収容部を識別するための収容部識別情報と 関連付けて記憶すること
を特徴とする請求項 3に記載の生体試料撮像方法。
[5] 複数の収容部を有する基板の前記収容部に収容された微弱光を発する生体試料 を、対物レンズを介して撮像する生体試料撮像装置であって、
前記対物レンズの視野内に所望の前記収容部が収まるまで前記基板および/また は前記対物レンズを移動する移動手段と、
前記試料へ光を照射する光照射手段と、
前記対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更手段と、
前記対物レンズの前記焦点位置を計測する焦点位置計測手段と、
前記生体試料を撮像する試料撮像手段と、
前記試料撮像手段で撮像した撮像画像に基づいて当該撮像画像を特徴付ける特 徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記焦点位置変更手段、前記焦点位置計測手段、前記試料撮像手段および前記 特徴量算出手段を繰り返し実行させるよう、各々の手段を制御する制御手段と、 前記制御手段で前記各々の手段を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の前 記焦点位置から、前記繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の前記特徴量に基 づいて、少なくとも 1つの前記焦点位置を選出する焦点位置選出手段と、
前記焦点位置選出手段で選出した前記焦点位置に基づいて、前記所望の前記収 容部に収容された前記生体試料内の観察対象部位に合うような前記対物レンズの前 記焦点位置を決定する焦点位置決定手段と、
を備えたことを特徴とする生体試料撮像装置。
前記移動手段で前記基板および Zまたは前記対物レンズを移動した際の当該基 板および/または当該対物レンズの移動先での位置を計測する移動先位置計測手 段と、
前記移動先位置計測手段で計測した前記移動先での前記位置に関する移動先位 置情報を、前記所望の前記収容部を識別するための収容部識別情報と関連付けて 記憶する記憶手段と
をさらに備えたことを特徴とする請求項 5に記載の生体試料撮像装置。
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