JP2013120239A - 撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】光学顕微鏡により撮影される画像の輝度のリニアリティを良好に検証することのできる撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置を提供すること。
【解決手段】撮影画像のリニアリティ評価方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
【選択図】図7
【解決手段】撮影画像のリニアリティ評価方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
【選択図】図7
Description
本技術は、撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置に関する。
生物組織などの、微細な粒子を分析、分取する手法としてフローサイトメトリーがある。フローサイトメトリー装置(フローサイトメータ)は、細胞などの粒子1個ずつから、大きさなどの形態の情報、DNA/RNA蛍光染色や、タンパクなどを蛍光抗体で染色した蛍光の情報を高速に取得し、それらの相関を解析し、目的の細胞集団などを分取することが可能な装置である。また、細胞の蛍光画像からサイトメトリーを行う手法としてはイメージングサイトメトリーが知られる。イメージングサイトメトリーでは、スライドガラスやシャーレ上の生体サンプルの蛍光像を拡大して撮影し、当該蛍光像中の一つ一つの細胞の情報、例えば細胞を蛍光標識する輝点の強度(輝度)やサイズなどの定量・数値化、細胞周期の解析などが行われる。(例えば、特許文献1参照。)。
蛍光顕微鏡により撮影された画像中で蛍光標識された輝点の強度(輝度)を測定するためには、撮影された画像の輝度のリニアリティが重要である。光学系と撮像素子を用いて撮影された画像の輝度のリニアリティは撮像素子の変換特性などに依存しており、測定系の特性と整合しているとは限らない。そこで光学系と撮像素子を用いて撮影された画像の輝度のリニアリティを評価する方法が求められるが、これまでこれといった方法は知られていない。
ところで、蛍光の輝点の強度が段階的に設定された蛍光ビーズを用いて画像のリニアリティを評価する方法などが存在する。しかし、この蛍光ビーズは焦点深度が比較的深い(焦点をあわせることが比較的やさしい)光学系を用いることが一般的であるフローサイトメトリー装置用に開発されたものである。焦点深度が浅い(焦点を合わせることが比較的難しい)光学系が用いられる光学顕微鏡においては、焦点が合っていない場合にも輝度が低下するので、上記の蛍光ビーズを用いて輝度のリニアリティを検証することは困難であった。
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、光学顕微鏡により撮影される画像の輝度のリニアリティを良好に検証することのできる撮影画像のリニアリティ評価方法、画像取得方法及び画像取得装置を提供することにある。
上述の課題を解決するため、本技術の一形態に係る撮影画像のリニアリティ評価方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
本技術では、焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて撮影画像を得るので、略楕円状の輝点像を得ることができ、この輝点像の輝度分布より撮影環境のガンマ値を評価することができ、実撮影画像のリニアリティを良好に検証することができる。
本技術では、焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて撮影画像を得るので、略楕円状の輝点像を得ることができ、この輝点像の輝度分布より撮影環境のガンマ値を評価することができ、実撮影画像のリニアリティを良好に検証することができる。
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価してもよい。
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)をV1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数としてV2=(A2+B2)/2C2から求め、
前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価してもよい。
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)をV1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数としてV2=(A2+B2)/2C2から求め、
前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価してもよい。
本技術の他の形態に係る画像取得方法は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する。
本技術の更に他の形態に係る画像取得装置は、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部とを具備する。
以上のように、本技術によれば、撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
[本実施形態の概要]
本実施形態は、光学顕微鏡により撮影される実撮影画像のリニアリティを評価し、この評価結果に基づいて実撮影画像を補正する画像取得方法に関する。
蛍光顕微鏡により撮影された画像中で蛍光標識された輝点の強度(輝度)を測定するためには、撮影された画像の輝度のリニアリティが重要となる。例えば、撮影画像の輝度のリニアリティ評価方法として、ガンマ値を変えて複数枚の実撮影画像を取得し、評価者が、これら複数枚の実撮影画像と、光学系を通した生体サンプルの目視による観察結果とを比較して、撮影画像の輝度のリニアリティを評価することが考えられる。しかしながら、この評価方法では、複数枚の撮影画像が必要なため評価に時間がかかるうえ、目視では微妙な違いを評価することが困難である。
[本実施形態の概要]
本実施形態は、光学顕微鏡により撮影される実撮影画像のリニアリティを評価し、この評価結果に基づいて実撮影画像を補正する画像取得方法に関する。
蛍光顕微鏡により撮影された画像中で蛍光標識された輝点の強度(輝度)を測定するためには、撮影された画像の輝度のリニアリティが重要となる。例えば、撮影画像の輝度のリニアリティ評価方法として、ガンマ値を変えて複数枚の実撮影画像を取得し、評価者が、これら複数枚の実撮影画像と、光学系を通した生体サンプルの目視による観察結果とを比較して、撮影画像の輝度のリニアリティを評価することが考えられる。しかしながら、この評価方法では、複数枚の撮影画像が必要なため評価に時間がかかるうえ、目視では微妙な違いを評価することが困難である。
このような点を改善するために、本実施形態の画像取得方法では、光学系と撮像素子を用いて撮影された1枚の実撮影画像の一輝点像の輝度分布から、撮像素子の特性や撮影時の周辺温度等の撮影環境のガンマ値を求める。
具体的には、光学系と撮像素子を用いて、光学系の焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて実撮影画像を得、この実撮影画像の輝度分布から輝度評価値を求める。また、この実撮影画像の輝度評価値とは別に、ガンマを変数として撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求め、この理論輝点画像の輝度分布から輝度評価値を予め求めておく。そして、1つの実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と、予め求めていたガンマ値が異なる複数の理論輝点画像の輝度評価値とを比較することにより、実撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
具体的には、光学系と撮像素子を用いて、光学系の焦点位置を光軸方向と光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させて実撮影画像を得、この実撮影画像の輝度分布から輝度評価値を求める。また、この実撮影画像の輝度評価値とは別に、ガンマを変数として撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求め、この理論輝点画像の輝度分布から輝度評価値を予め求めておく。そして、1つの実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と、予め求めていたガンマ値が異なる複数の理論輝点画像の輝度評価値とを比較することにより、実撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
更に、実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と近似する輝度評価値を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値から、撮影環境のガンマ値を求め、この求めた撮影環境のガンマ値をもとに、光学系と撮像素子を用いて撮影された実撮影画像を補正する。この補正により得られる撮影画像は、撮影対象となる生体サンプルの蛍光標識された輝点の強度をより正確に再現したものとなっている。従って、補正された撮影画像は、リニアリティをもっているので、撮影画像の輝点像の輝度を定量化して評価することが可能となる。
以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。
[画像取得装置の構成]
図1は、一実施形態に係る画像取得装置100を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置100は、顕微鏡10と、データ処理部20とを有する。
[画像取得装置の構成]
図1は、一実施形態に係る画像取得装置100を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置100は、顕微鏡10と、データ処理部20とを有する。
[顕微鏡10の構成]
顕微鏡10は、ステージ11、光学系12、光源13及び撮像素子14を有する。
ステージ11は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルSPLを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向(x−y平面方向)及び垂直方向(z軸方向)へ移動可能とされている。
顕微鏡10は、ステージ11、光学系12、光源13及び撮像素子14を有する。
ステージ11は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルSPLを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向(x−y平面方向)及び垂直方向(z軸方向)へ移動可能とされている。
図2は、上記ステージ11に載置される生体サンプルSPLをステージ11の側面方向から示した図である。同図に示すように、生体サンプルSPLは、Z方向に例えば数μmから数十μmの厚さを有し、スライドガラスSG及びカバーガラスCGに挟まれて所定の固定手法により固定されている。生体サンプルSPLは蛍光染色剤によって染色されている。蛍光染色剤は同一の光源から照射される励起光によって蛍光を発する染色剤である。蛍光染色剤としては、例えば、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、SpAqua、SpGreenなどを挙げることができる。
図1に戻り、ステージ11の上方には光学系12が配置される。光学系12は、対物レンズ12A、結像レンズ12B、ダイクロイックミラー12C、エミッションフィルタ12D及び励起フィルタ12Eを有する。光源13は、例えば水銀ランプ等の電球やLED(Light Emitting Diode)など、蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射するものである。
励起フィルタ12Eは、生体サンプルSPLの蛍光像を得る場合に、光源13から出射された光のうち蛍光色素を励起する励起波長の光のみを透過させることで励起光を生成する。ダイクロイックミラー12Cは、当該励起フィルタで透過されて入射する励起光を反射させて対物レンズ12Aへ導く。対物レンズ12Aは、当該励起光を生体サンプルSPLへ集光する。そして対物レンズ12A及び結像レンズ12Bは、生体サンプルSPLの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像を撮像素子14の撮像面に結像させる。
生体サンプルSPLに励起光が照射されると、生体サンプルSPLの各組織に結合している染色剤が蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ12Aを介してダイクロイックミラー12Cを透過し、エミッションフィルタ12Dを介して結像レンズ12Bへ到達する。エミッションフィルタ12Dは、上記対物レンズ12Aによって拡大された、発色光以外の光(外光)を吸収する。当該外光が喪失された発色光の像は、上述のとおり、結像レンズ12Bにより拡大され、撮像素子14上に結像される。
撮像素子14としては、例えばCCD(Charge Coupled Device)やCMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサ等が用いられる。撮像素子14は、RGB(Red、Green、Blue)の色別に光を受けて電気信号に変換する光電変換素子を有し、入射光からカラー画像を得るカラーイメージャである。
光源駆動部16は、後述するデータ処理部20の光源制御部36からの指令に従って、光源13を駆動する。ステージ駆動部15は、後述するデータ処理部20のステージ制御部31からの指令に従って、ステージ11を駆動する。撮像制御部17は、後述するデータ処理部20の画像取得部32からの指令に従って、撮像素子14の露光を制御し、また、撮像素子14から取得した像を画像取得部32に提供する。
[データ処理部20の構成]
図3は、データ処理部20のハードウェア構成を示すブロック図である。
データ処理部20は、例えばPC(Personal Computer)により構成され、撮像素子14より取得した生体サンプルSPLの蛍光像(実撮影画像)を、例えばJPEG(Joint Photographic Experts Group)等の任意形式のデジタル画像データとして保存する。
図3は、データ処理部20のハードウェア構成を示すブロック図である。
データ処理部20は、例えばPC(Personal Computer)により構成され、撮像素子14より取得した生体サンプルSPLの蛍光像(実撮影画像)を、例えばJPEG(Joint Photographic Experts Group)等の任意形式のデジタル画像データとして保存する。
同図に示すようにデータ処理部20は、CPU(Central Processing Unit)21、ROM(Read Only Memory)22、RAM(Random Access Memory)23、操作入力部24、インターフェイス部25、表示部26及び記憶部27を有し、これら各ブロックがバス28を介して接続されている。
ROM22は、各種の処理を実行するためのファームウェア等の複数のプログラムやデータを固定的に記憶する。RAM23は、CPU21の作業用領域として用いられ、OS(Operating System)、実行中の各種アプリケーション、処理中の各種データを一時的に保持する。
記憶部27は、例えばHDD(Hard Disk Drive)や、フラッシュメモリ、その他の固体メモリ等の不揮発性メモリである。当該記憶部27には、OSや各種アプリケーション、各種データが記憶される。特に本実施形態では、記憶部27には、撮像素子14から取り込まれた蛍光像(実撮影画像)データ、蛍光像(実撮影画像)データを画像処理する画像補正アプリケーション、後述する理論輝点画像の評価値テーブル29、後述する補正撮影画像データも記憶される。
図10は、理論輝点画像の評価値テーブル29を示す図である。
図10に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル29には、ガンマ(γ)毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。ここで、理論輝点画像とは、撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる像である。輝度評価値の求め方については、後述する。
図10に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル29には、ガンマ(γ)毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。ここで、理論輝点画像とは、撮像素子を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる像である。輝度評価値の求め方については、後述する。
図3に戻って、インターフェイス部25は、顕微鏡10のステージ11、光源13及び撮像素子14をそれぞれ駆動するコントロール基板(ステージ駆動部15、光源駆動部16、撮像制御部17)とそれぞれ接続され、所定の通信規格により当該コントロール基板とデータ処理部20との間で信号のやり取りを行う。
CPU21は、ROM22や記憶部27に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部24から与えられる命令に対応するプログラムをRAM23に展開し、当該展開されたプログラムにしたがって、表示部26及び記憶部27を適宜制御する。CPU21は、RAM23に展開されたプログラム(画像取得プログラム)に基づいて生体サンプル像取得処理を実行する。
操作入力部24は、例えばマウス等のポインティングデバイス、キーボード、タッチパネル、その他の操作装置である。
表示部26は、例えば液晶ディスプレイ、EL(Electro-Luminescence)ディスプレイ、プラズマディスプレイ、CRT(Cathode Ray Tube)ディスプレイ等である。当該表示部26は、データ処理部20に内蔵されていてもよいし、データ処理部20に外部接続されていてもよい。
[データ処理部20の機能的な構成]
図4は画像取得装置100の生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
図4に示すように、データ処理部20は、記憶部27と、画像取得部32と、輝点検出部33と、算出・評価部37と、補正部38と、データ記録部34と、データ記憶部35と、ステージ制御部31と、光源制御部36とを有する。
図4は画像取得装置100の生体サンプル像取得処理のための機能ブロック図である。
図4に示すように、データ処理部20は、記憶部27と、画像取得部32と、輝点検出部33と、算出・評価部37と、補正部38と、データ記録部34と、データ記憶部35と、ステージ制御部31と、光源制御部36とを有する。
同図において、ステージ制御部31(移動制御部)は、ステージ駆動部15に指令を出して、生体サンプルSPLの対象とすべき部位(以下、これをサンプル部位とも呼ぶ)が撮像範囲に位置するようステージ11を順次移動させて、例えば図5に示すように、該撮像範囲ARに対して生体サンプルSPLを割り当てる。
また、ステージ制御部31は、対象とすべきサンプル部位が撮像範囲ARに移動されるごとに、ステージ11をz軸方向(対物レンズ12Aの光軸方向)に移動させてサンプル部位に対する焦点を厚み方向に移動させると同時に、xy平面(対物レンズ12Aの光軸方向と直交する平面)上で移動させるように制御を行う。ステージ制御部31は、露光の間、ステージ11を移動させる。
図6は、露光時のステージ11移動による焦点位置変化による撮像素子14に撮像される像の形状と位置の経時変化を示す図である。像の位置変化は軌跡41として示す。
図6に示すように、ステージ制御部31は、ステージ11をz軸方向に図上、上から下へ等速で移動させ、これと同時にxy平面を等速で円移動させる。露光開始から露光終了の間、特定の遺伝子に結合した蛍光マーカに対して対物レンズの焦点が合っていない状態から、焦点があった状態となり、再び焦点が合っていない状態へと変化していく。
詳細には、露光開始位置では、撮像素子14には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像(Defocused image)40が撮像される。
そして、露光時間が経過していくにつれ徐々に焦点があっていき、露光開始位置における像のz軸座標をzstart、露光終了位置における像のz軸座標をzendとし、露光時間をtexとしたとき、像のz軸座標が(zend+zstart)/2、露光時間がtex/2となるときに、焦点があった像(Focused image)41が撮像素子14に撮像される。
更に露光時間が経過すると再び焦点がぼやけた像となり、露光終了位置では、撮像素子14には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像(Defocused image)43が撮像される。
図6に示すように、ステージ制御部31は、ステージ11をz軸方向に図上、上から下へ等速で移動させ、これと同時にxy平面を等速で円移動させる。露光開始から露光終了の間、特定の遺伝子に結合した蛍光マーカに対して対物レンズの焦点が合っていない状態から、焦点があった状態となり、再び焦点が合っていない状態へと変化していく。
詳細には、露光開始位置では、撮像素子14には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像(Defocused image)40が撮像される。
そして、露光時間が経過していくにつれ徐々に焦点があっていき、露光開始位置における像のz軸座標をzstart、露光終了位置における像のz軸座標をzendとし、露光時間をtexとしたとき、像のz軸座標が(zend+zstart)/2、露光時間がtex/2となるときに、焦点があった像(Focused image)41が撮像素子14に撮像される。
更に露光時間が経過すると再び焦点がぼやけた像となり、露光終了位置では、撮像素子14には、蛍光マーカから発光される円形状のぼやけた発色光の像(Defocused image)43が撮像される。
図4に戻って、データ記憶部35は、撮像素子14から取り込まれた蛍光画像データ、蛍光画像データを画像処理する画像補正アプリケーション、理論輝点画像の評価値テーブル29を記憶する。理論輝点画像の評価値テーブル29は、後述する算出・評価部37で予め作成される。
図9は、理論輝点画像の評価値テーブル29を示す。
図9に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル29には、ガンマ(γ)毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。
図9に示すように、理論輝点画像の評価値テーブル29には、ガンマ(γ)毎の計算上の理論輝点画像の輝度評価値が登録される。
図4に戻って、画像取得部32(露光制御部)は、対象とすべきサンプル部位をステージ制御部31が撮像範囲ARに移動するごとに、z軸方向及びxy平面上のステージ11の移動が開始された時点から終了する時点まで撮像素子14を露光させるように撮像制御部17に指令を送る。画像取得部32は、ステージ11におけるz軸方向及びxy平面上の移動が終了する時点で、当該移動終了時点と移動開始時点との間の露光により得られるサンプル部位の像を撮像制御部17を介して撮像素子14から取得する。そして画像取得部32は、各撮像範囲ARに割り当てられるサンプル部位の像を、所定の連結アルゴリズムを用いて連結することによって全体の生体サンプル像(実撮影画像)を生成する。
輝点検出部33は、画像取得部32により生成された生体サンプル像(実撮影画像)から、蛍光を発する輝点を検出する。
ここで、生体サンプル像は、焦点位置を生体サンプルSPLの厚さの方向に移動させつつ該生体サンプルSPLの厚さ方向と直交する方向に移動させる間に、撮像素子14を露光させることによって得られたものであることから、生体サンプル像において蛍光マーカはそれぞれ円形状や図7に示すような円弧状のぼけた輝点像として標識される。
算出・評価部37は、理論輝点画像の評価値テーブル29を作成し、データ記憶部35に記憶させる。更に、算出・評価部37は実撮影画像の輝度評価値を算出し、実撮影画像の輝度評価値と理論輝点画像の輝度評価値を比較、評価する。
まず、理論輝点画像の評価値テーブル29の作成について説明する。
算出・評価部37は、予め撮像素子14を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求める。更に、算出・評価部37は、計算によって求められた理論輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値V2を算出し、ガンマ値と輝度評価値とからなる理論輝点画像の評価値テーブル29(図9参照)を作成する。
算出・評価部37は、予め撮像素子14を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像を求める。更に、算出・評価部37は、計算によって求められた理論輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値V2を算出し、ガンマ値と輝度評価値とからなる理論輝点画像の評価値テーブル29(図9参照)を作成する。
図8(b)〜(i)はそれぞれガンマ値を0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.2、2.5として計算して求めた理論輝点画像を示す。各図において、画像上部に示される数値は後述する計算方法によって求めた輝度評価値である。図8(b)〜(i)に示すように、ガンマ値を変化させることにより、理論輝点画像の円弧形状が変化する。
図9は、図8(b)〜(i)の理論輝点画像におけるガンマ値と輝度評価値V2との関係をテーブル化した理論輝点画像の評価値テーブル29を示す図である。図10は、図9に示す理論輝点画像の評価値テーブル29をグラフ化したものであり、横軸にガンマ値、縦軸に輝度評価値をとっている。図10に示すように、ガンマ値と輝度評価値とはほぼ一次関数の関係となっている。
次に、実撮影画像の輝度評価値の求め方について説明する。
算出・評価部37は、実撮影画像の1つ或いは複数の輝点画像のうちの一輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値V1を求める。図8(a)は実撮影画像の一輝点画像の形状の一例を示し、画像上部に示される数値は後述する計算方法によって求めた輝度評価値V1である。
算出・評価部37は、実撮影画像の1つ或いは複数の輝点画像のうちの一輝点画像の輝度分布から後述する計算方法で輝度評価値V1を求める。図8(a)は実撮影画像の一輝点画像の形状の一例を示し、画像上部に示される数値は後述する計算方法によって求めた輝度評価値V1である。
実撮影画像の輝点画像の輝度評価値V1及び理論輝点画像の輝度評価値V2は例えば次のように求められる。
図7は実撮影画像の一輝点画像(理論輝点画像)の一例である。
図7に示すように、実撮影画像の輝点画像50(理論輝点画像60)は円弧状を有する。以下、実撮影画像の輝点画像50は、単に輝点画像50と称す。
図7は実撮影画像の一輝点画像(理論輝点画像)の一例である。
図7に示すように、実撮影画像の輝点画像50(理論輝点画像60)は円弧状を有する。以下、実撮影画像の輝点画像50は、単に輝点画像50と称す。
輝点画像50(理論輝点画像60)のうち輝度が最大となる位置54(64)の輝度をC1(C2)とする。輝点画像50(理論輝点画像60)の中心53(63)を基点にして輝点画像50(理論輝点画像60)の輝度が最大となる位置54(64)から90度回転した輝点画像50(理論輝点画像60)の中心53(63)を介して対向する輝点画像50(理論輝点画像60)上の2点51(61)、52(62)それぞれの輝度をA1(A2)、B1(B2)とする。輝点画像50(理論輝点画像60)の輝度評価値V1(Value1)(V2(Value2))は、
式 V1=(A1+B1)/2C1(V2=(A2+B2)/2C2)
から求める。
式 V1=(A1+B1)/2C1(V2=(A2+B2)/2C2)
から求める。
次に、実撮影画像の輝度評価値V1と理論輝点画像の輝度評価値V2の比較、評価について説明する。
算出・評価部37は、輝点画像50の輝度評価値V1と理論輝点画像60の輝度評価値V2とを比較し、輝点画像50の輝度評価値V1と近似する理論輝点画像60の輝度評価値V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
例えば、実撮影画像の輝点画像50の輝度評価値V1が0.3767であった場合、図8及び図9に示すように、この輝度評価値V1の値は、理論輝点画像60のガンマ値が1.75のときの輝度評価値V2である0.3486と、ガンマ値が2.0のときの輝度評価値場V2である0.3976との間にあり、算出・評価部37は、撮影環境のガンマ値が2.0に近似すると判断し、更に1.75〜2.0の間にあると判断する。
上述したように、ガンマ値と輝度評価値とは、ほぼ一次関数の関係にあるので、算出・評価部37は、ガンマ値が1.75のときの輝度評価値V2と、ガンマ値が2.0のときの輝度評価値V2とから、ガンマ値と輝度評価値との関係を表す
一次関数の式 y=0.196x+0.0056(式中、xはガンマ値、yは輝度評価値)を求める。そして、この一次関数式と、実撮影画像の輝点画像50の輝度評価値V1である0.3767とから、撮影環境のガンマ値を約1.89と算出する。
算出・評価部37は、輝点画像50の輝度評価値V1と理論輝点画像60の輝度評価値V2とを比較し、輝点画像50の輝度評価値V1と近似する理論輝点画像60の輝度評価値V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに撮影環境のガンマ値を評価する。
例えば、実撮影画像の輝点画像50の輝度評価値V1が0.3767であった場合、図8及び図9に示すように、この輝度評価値V1の値は、理論輝点画像60のガンマ値が1.75のときの輝度評価値V2である0.3486と、ガンマ値が2.0のときの輝度評価値場V2である0.3976との間にあり、算出・評価部37は、撮影環境のガンマ値が2.0に近似すると判断し、更に1.75〜2.0の間にあると判断する。
上述したように、ガンマ値と輝度評価値とは、ほぼ一次関数の関係にあるので、算出・評価部37は、ガンマ値が1.75のときの輝度評価値V2と、ガンマ値が2.0のときの輝度評価値V2とから、ガンマ値と輝度評価値との関係を表す
一次関数の式 y=0.196x+0.0056(式中、xはガンマ値、yは輝度評価値)を求める。そして、この一次関数式と、実撮影画像の輝点画像50の輝度評価値V1である0.3767とから、撮影環境のガンマ値を約1.89と算出する。
補正部38は、算出・評価部37により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、撮像素子から出力される電気信号を補正することによって、画像取得部32によって取得されたサンプル部位毎の生体サンプル像をそれぞれサンプル部位毎に補正し、補正撮影画像を生成する。
データ記録部34は、補正部38により補正されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して1つの生体サンプル画像を生成し、JPEG(Joint Photographic Experts Group)など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部35に記憶させる。
光源制御部36は、光源13の照射のタイミングを制御し、光源駆動部16に対して光源13の照射の有無の指令を出す。
[生体サンプル像取得方法(画像取得方法)]
次に、上述の画像処理装置100を用いた生体サンプル像取得方法について説明する。
まず、算出・評価部37は、撮像素子14を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像60を求め、この理論輝点画像60の輝度分布から上述した計算方法で輝度評価値V2を算出し、理論輝点画像の評価値テーブル29(図9参照)を予め作成する。算出・評価部37は、作成した理論輝点画像の評価値テーブル29をデータ記憶部35に記憶させる。
次に、上述の画像処理装置100を用いた生体サンプル像取得方法について説明する。
まず、算出・評価部37は、撮像素子14を除く実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって理論輝点画像60を求め、この理論輝点画像60の輝度分布から上述した計算方法で輝度評価値V2を算出し、理論輝点画像の評価値テーブル29(図9参照)を予め作成する。算出・評価部37は、作成した理論輝点画像の評価値テーブル29をデータ記憶部35に記憶させる。
画像取得部32は、ステージ上に載置される蛍光標識された生体サンプルSPLに励起光を照射し、蛍光マーカから発光される発色光の像を撮像素子14に露光させ、露光により得られるサンプル部位の実撮影画像を撮像制御部17を介して撮像素子14から取得する。露光中、ステージ制御部31は、ステージ11をz軸方向(対物レンズ12Aの光軸方向)に移動させ、これと同時にxy平面上で移動させる。
次に、輝点検出部33は、画像取得部32により生成された生体サンプル像(実撮影画像)から、蛍光を発する輝点を検出する。算出・評価部37は、検出した一輝点画像50の輝度分布から上述した計算方法で輝度評価値V1を算出する。
次に、算出・評価部37は、輝点画像50の輝度評価値V1と、データ記憶部35に記憶されている理論輝点画像60の輝度評価値V2とを比較し、輝点画像50の輝度評価値V1と近似する理論輝点画像60の輝度評価値V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに撮影環境のガンマ値を算出する。撮影環境のガンマ値の算出は上述のとおりである。
次に、補正部38は、算出・評価部37により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、画像取得部32によって取得されたサンプル部位毎の生体サンプル像を補正し、補正撮影画像を生成する。
データ記録部34は、補正部38により補正されたサンプル部位毎の生体サンプル像を連結して1つの生体サンプル画像を生成し、JPEG(Joint Photographic Experts Group)など所定の圧縮形式のサンプルデータに符号化してデータ記憶部35に記憶させる。
以上のように、本実施形態の構成によれば、1つの実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と、予め求めていたガンマ値が異なる複数の理論輝点画像の輝度評価値とを比較することにより、実撮影画像の輝度のリニアリティを良好に検証することができる。
更に、本実施形態においては、実撮影画像の一輝点像の輝度評価値と近似する輝度評価値を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値から、撮影環境のガンマ値を求め、この求めた撮影環境のガンマ値をもとに、光学系と撮像素子を用いて撮影された実撮影画像を補正する。この補正により得られる撮影画像は、撮影対象となる生体サンプルの蛍光標識された輝点の強度をより正確に再現したものとなっている。従って、補正された撮影画像は、リニアリティをもっているので、撮影画像の輝点像の輝度を定量化して評価することが可能となる。
また、上述の実施形態では、焦点位置を移動させるためにステージ11を移動させることとしたが、光学系12の対物レンズ12Aを移動させるようにしてもよい。
なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。
(1)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(2)前記(1)に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(3)前記(2)に記載の画像取得装置であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)をV1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数としてV2=(A2+B2)/2C2から求め、
前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(4)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、
前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する
画像取得方法。
(5)前記(4)に記載の画像取得方法であって、
前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
(6)前記(5)に記載の画像取得方法であって、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)を
式 V1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数として
式 V2=(A2+B2)/2C2
から求め、前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに、前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
(7)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、
前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部と
を具備する画像取得装置。
(1)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(2)前記(1)に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(3)前記(2)に記載の画像取得装置であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)をV1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数としてV2=(A2+B2)/2C2から求め、
前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。
(4)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、
前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する
画像取得方法。
(5)前記(4)に記載の画像取得方法であって、
前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
(6)前記(5)に記載の画像取得方法であって、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)を
式 V1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数として
式 V2=(A2+B2)/2C2
から求め、前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに、前記撮影環境のガンマ値を求める
画像取得方法。
(7)蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、
前記撮像素子により得られる撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、
前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値をもとに、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部と
を具備する画像取得装置。
本発明はこの実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において変更され得る。
SPL…生体サンプル
10…顕微鏡
11…ステージ
12…光学系
12A…対物レンズ
13…光源
14…撮像素子
31…ステージ制御部
32…画像取得部
37…算出・評価部
38…補正部
50…実撮影画像の輝点像
60…理論輝点画像
100…画像取得装置
10…顕微鏡
11…ステージ
12…光学系
12A…対物レンズ
13…光源
14…撮像素子
31…ステージ制御部
32…画像取得部
37…算出・評価部
38…補正部
50…実撮影画像の輝点像
60…理論輝点画像
100…画像取得装置
Claims (5)
- 蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。 - 請求項1に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、前記撮像素子を除く前記実撮影画像の撮影環境を模擬した撮影条件でガンマを変数として計算によって求められる理論輝点画像の輝度分布と、前記実撮影画像の輝度分布とを比較し、前記実撮影画像の輝度分布と近似する輝度分布を有する理論輝点画像の計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。 - 請求項2に記載の撮影画像のリニアリティ評価方法であって、
前記撮影環境のガンマ値の評価では、
前記一輝点像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC1とし、前記一輝点像の中心を基点にして前記輝度が最大となる位置から90度回転した前記一輝点像の中心を介して対向する前記一輝点像上の2点それぞれの輝度をA1、B1として、前記撮影画像の評価値V1(Value1)をV1=(A1+B1)/2C1から求め、
前記理論輝点画像のうち輝度が最大となる位置の輝度をC2とし、前記理論輝点画像の中心を基点にして前記理論輝点画像の輝度が最大となる位置から90度回転した前記理論輝点画像の中心を介して対向する前記理論輝点画像上の2点それぞれの輝度をA2、B2として、前記理論輝点画像の評価値V2(Value2)を、ガンマを変数としてV2=(A2+B2)/2C2から求め、
前記撮影画像の評価値V1と前記理論輝点画像の評価値V2を比較し、前記V1と近似する前記V2を求めたときの計算上のガンマ値をもとに前記撮影環境のガンマ値を評価する
撮影画像のリニアリティ評価方法。 - 蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射し、対物レンズを含む光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら撮像素子を露光させ、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに当該撮影環境のガンマ値を求め、
前記求めたガンマ値をもとに前記撮像素子から出力される電気信号を補正して撮影画像を生成する
画像取得方法。 - 蛍光標識が付された生体サンプルに当該蛍光標識に対する励起光を照射する光源と、
前記生体サンプルの撮像対象を拡大する対物レンズを含む光学系と、
対物レンズにより拡大される撮像対象の像が結像される撮像素子と、
前記光学系の焦点位置を移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を光軸方向と当該光軸方向に対して直交する方向に移動させながら前記撮像素子を露光させる露光制御部と、
前記撮像素子により得られる実撮影画像の中の一輝点像の輝度分布をもとに撮影環境のガンマ値を算出する算出部と、
前記算出部により算出された撮影環境のガンマ値を基に、前記撮像素子から出力される電気信号を補正する補正部と
を具備する画像取得装置。
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