WO2007034796A1 - 複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム - Google Patents

複数の観察手法を用いた顕微鏡細胞観察・検査システム Download PDF

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WO2007034796A1
WO2007034796A1 PCT/JP2006/318546 JP2006318546W WO2007034796A1 WO 2007034796 A1 WO2007034796 A1 WO 2007034796A1 JP 2006318546 W JP2006318546 W JP 2006318546W WO 2007034796 A1 WO2007034796 A1 WO 2007034796A1
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slide glass
prism
glass
light
slide
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PCT/JP2006/318546
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Hideo Mogami
Yohei Sato
Yutaka Kazoe
Original Assignee
National University Corporation Hamamatsu University School Of Medicine
Keio University
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Publication date
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    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Definitions

  • the present invention is a banule! ⁇ Left chain wrapping and scrubbing.
  • TI RF Internal Internal Reflection Fluorescence
  • ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ! It is possible to detect a large number of hundreds of J3 ⁇ 4 ⁇ on the same slide glass with high sensitivity and at high speed, and can be incorporated into the IAI SCREEN JUNGING 3 ⁇ 4 ⁇ . is there.
  • TI RF viewing Bakuto Ayari has a high signal-to-noise ratio that enables local nanoscale imaging! ⁇ Last. While it is widely used for fine SI properties and single-preferred cultivating Yodokoro 1) in Tsunago, the electrochemical characteristics of colloidal particles ) 'Or Brown ⁇ (
  • nescent wave is used as a source of light, which is accompanied by the S dimension of light at the 2 ⁇ interface with different refractive indices.
  • Fig. 3 shows the number of nescent waves; fi ?, but light is reflected on the interface between the refractive index ⁇ 1 and the material 2 with the refractive index n 2 from the side ⁇ 2 where the refractive index is large, with ⁇ Rh.
  • the light is squeezed at the interface, but the refracted side of the interface has a nesting wave on the side with a small refractive index. Since the evanescent wave is a light that oozes slightly from the total reflection interface to the extent of several tens to several hundreds of nanometers, when removing the TI RF view, the glass and cover glass (hereinafter referred to as the slide glass) 3 ⁇ 4 ⁇ )
  • the slide glass 3 ⁇ 4 ⁇
  • the most commonly used after being converted to TlfS is the TI RF isolation lens, as shown in Fig. 14 (a). In other words, it is a defeat.
  • the laser beam for ⁇ NeS ⁇ is obliquely tilted from the bottom of the slide glass by ⁇ through the lens, and the net on the slide glass near the interface where im is placed. It is what makes waves.
  • the space above the through-lens can be handled freely, so it is excellent in life and rareness, and 'bright in the gap: ® image can be obtained.
  • you use a high numerical aperture drip lens if you use a high numerical aperture drip lens,
  • the magnification is limited to 60% 13 ⁇ 4 ⁇ . ,
  • a prism-type TIRF medium as shown in Fig. 14 (b), in which the laser is ⁇ through a prism is also widely used. This is done by sandwiching the word between two glass slides, placing a prism on the upper glass slide, and passing through that prism, the laser beam for ND In the vicinity of the interface in contact with the surface of the slide glass, a nascent wave is generated. 'With this arrangement, the laser beam can be ⁇ ! Sized for effective work, so it is possible to scrape high-S sparrows, and since there is no fold of magnification, the low magnification summary is also a forehead. However, 3 ⁇ 4 ⁇ or 3 ⁇ 4 above the lens is slipped off, and Xie's operability is not very flexible.
  • the ⁇ ⁇ prism and thigh prism are made into slide glass ®, and laser light is introduced into the slide glass from the incident prism to make it larger in the slide glass.
  • a nesting wave is generated near the upper surface of the slide glass, and the laser beam that has been engraved with various dimensions is passed through the dimension prism to be moved out or with M3 ⁇ 4SU.
  • the edge of the slide glass is machined and a laser beam is introduced into the slide glass from this side as a width slope to cause multiple shots in the slide glass.
  • ⁇ Nescent wave is generated near the upper surface of the slide glass, and ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ is thighed, and the laser beam that has been subjected to multiple S ⁇ skinning goes out of the side opposite to 3 ⁇ 4to «and is tested in the afternoon.
  • the top of the specimen is free, low magnification, and friction is forehead, but because the slide glass thickness is limited and thin (the former is 0 ⁇ I 7 mm, i3 ⁇ 43 ⁇ 4tt 0.2 mm), many The number of dimensions is increased, and the tongues L3 ⁇ 4 of all dignity, Difficult; color is likely to occur, SN ratio There is a problem of power reduction.
  • the laser beam has a fixed ⁇ position and a large position, and the laser beam is difficult.
  • per sample Since it is necessary to apply rhythm to the slide glass or to apply force to the slide glass, it is time-consuming and low in versatility.
  • the present invention has been made in view of such a problem of the present technology, and its purpose is to freely and freely position the object on any slide glass without using a special slide glass. It is possible to use Saito with a high S / N ratio of scattered light, and with a brilliant total excitation and light device, with the same sliding force, several hundred or more on the lath ⁇ ( This is to share the separation and packaging system that uses high-sensitivity and high-speed detection of the fine-grained S of this material.
  • It has a slide glass position shifting mechanism that positions the slide glass in the direction along its surface.
  • mm Lens thread The rule is that, in the middle of one element through the split element, the ⁇ system and the elephant element are in the other, and the other is in the middle.
  • the source is faced, and the laser for the self-net centent ⁇ to the self-slide crow; ⁇ in the optical path leading to the entrance, and the ⁇ 3 ⁇ 4 source and miam ⁇ split element for tii ⁇ i3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ Or a shutter device that illuminates the illumination light between
  • deliberation device that controls the switching of the illumination light source by opening and closing each shutter device, and the slide glass by the 11 slide glass position u mechanism
  • the self-sliding glass position mechanism can be removed, and Tt Saitou's detection position on the slide glass is restored, and the opening / closing of each shutter device can be opened and closed by the editing device.
  • Another system of the present invention is a package that uses 1 ⁇ left! ⁇ .
  • the network system is equipped with a light source for the net 3 ⁇ 4 ⁇ and introduces laser light from the light source into the slide glass. In this way, we will introduce a full-l W illumination device that illuminates the fine S3 ⁇ 4 on the top surface of the slide glass with the nescent wave. And have
  • the illuminator 1 has a refraction prism slidable glass 3 ⁇ 4 ⁇ slidable prism in the plane through the liquid and a 3 ⁇ 4 inch prism.
  • the ⁇ inch prism is fixed to the dragon ⁇ prism, and the dragon ⁇ prism is arranged in the Tti T laser ⁇ ⁇ ⁇ direction with respect to the edited ⁇ inch prism.
  • Part 10 Between the self-dimension prism of the lighting system and the 1 3 ⁇ 43 ⁇ 4-inch prism, the dragon 3 is placed in a position perpendicular to the slide glass at the position where the self slide glass is placed. Thread Yarn! ! There is an elephant system and an ff elephant element in one 3 »through a split element, and an oscillating base in the other. To the middle and m, of! A shutter device that illuminates the illumination light between the original and the 1 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 split element.
  • J # ⁇ and Fujiwari elements consist of dichroic mirrors, and the light of the wavelength of the illumination light from the source for the knitting net 3 ⁇ 4 ⁇ and the light of the skin length of the illumination light from the source of the light for ⁇ ⁇ ⁇ It is enviable that iaih will lead to the leaked asi iridescent elements and only 5fii iridescent elements that originated from the details.
  • tl ⁇ source and ⁇ of kitchen ⁇ are filter device or five location you ⁇ the ⁇ peel length between 1 ⁇ split element, by the from ⁇ It is preferable that the starting wavelength is scaled.
  • the laser beam from the light source is introduced into the slide glass and is echoed in multiple dimensions in the slide glass.
  • the rule of swelled lens is that one of the two elements through the splitting element; m) is the first filter with the wavelength of the illumination light from the light source for the first In the other half of the thread, the separation scanner for the separation kitchen is placed,
  • 1 ⁇ and 2nd elephant elements are arranged respectively, and the laser for the til ⁇ slide glass from fiJlHJ Nescent 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ ; ⁇ Illumination light or m3 ⁇ 4 respectively in the optical path leading to the entrance, between the editing s-equal scanner and the 33 ⁇ 4 ⁇ splitting element, and between the tam ⁇ splitting element and the first quadrant I iif .returned chatter device or IH
  • the ⁇ 3 ⁇ 4 « ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ image is taken into the ⁇ ⁇
  • Yet another aspect of the present invention is a display mirror using a plurality of observations 3 ⁇ 4 ⁇ .
  • the system is equipped with a source for the centric ⁇ 3 ⁇ 4 and introduces laser light from the fence into the slide glass. In the glass slide, it is echoed by a large size, generating a ⁇ wave on the top surface of the glass slide, and illuminating the fiber si ⁇ ⁇ located on the top surface of the glass slide with a:! ⁇ Nessent wave.
  • ⁇ 3 ⁇ 4f r is equipped with lighting equipment, '
  • the lighting device is equipped with a ⁇ ! sizing prism and a 3 ⁇ 4 sizing prism that can be moved in the plane through the ⁇ liquid.
  • the Dragon ⁇ prism is fixed to the magic light source, and the flB prism is arranged in the direction of rf laser 3 ⁇ 4 ⁇ with respect to the t! HAi prism.
  • the surface of the self-sliding glass of the ⁇ -sized prism and the surface of the sliding glass of the ⁇ -prism are arranged so that they are the same surface and the same surface regardless of the ⁇ 11 position of the orchid prism.
  • the Si filter is a filter that ffiihs the light of the wavelength of the illumination light from the light source for the til e ⁇ nocent 3 ⁇ And the first thread elephant system and the first iff elephant element, while the other is a female separate scanner,
  • the solitary point scanner has an illuminator on the illumination side; ⁇ ⁇ , and the m rn ⁇ scanner has an imaging system and a first image element on the output side.
  • Henji From the source for Nescent? ⁇ to the flEAI prism, in the light path between the scanner and the la 1 ⁇ splitting element, and the Henmi light 3 ⁇ 4 ⁇ splitting element! ! ⁇ ⁇ ⁇
  • the steel illuminator can be arbitrarily placed on a slide glass without using a special slide glass, and can squeeze a high S ratio with little scattered light. Because it is possible and is a shocking magnetic field, hundreds of fine details are gathered at high speed with high sensitivity on the same slide glass. » ⁇ You can go to Kuratacho screening etc. Brief explanation of ⁇
  • Fig. 1 (Morning ⁇ »Column Saito. This is a 1 ⁇ ⁇ sag of all 3 ⁇ 4j3 ⁇ 4i lighting devices used in the Nebell system.
  • FIG. 2 is a plan view of the all-in-one illumination device of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a wrapping system that can use both TI RF box scouring and drop-off scouring as an example of the present invention.
  • Figure 4 This is a diagram showing the findings of rotinkinase C and life war evening protein introduced into the thread-wrapping bag by Yuunko Yuan. ⁇
  • Fig. 5 is a diagram showing 1 »of the change in the translation image corresponding to the upper and lower graphs in Fig. 4. '
  • Figure 6 is a diagram showing ⁇ of the change in the T I RF image corresponding to the upper and lower figures in Fig. 4.
  • Fig. 7 is a diagram showing the text of F u ra 2 Calcium and skin length: ⁇
  • Fig. 8 shows Fura 2's 2 purple color depending on the skin length: ⁇ ⁇ changes using Fig. 3's translation example, and GFP's translation M ⁇ using Fig. 3's TIRF profession. It is a figure which shows the leg change of the deposited value.
  • Fig. 9 shows the TI RF separation image corresponding to Fig. 8 (a),) 3 ⁇ 43 ⁇ 4 length at 3 4 O nm, and 3 ⁇ 4.
  • Fig. 10 is a diagram showing the change in the W separation image (c).
  • Fig. 10 Other inventions! 3 ⁇ 4fe example: TI RF ⁇ i rub and ⁇ detach rub can be used together ⁇ A diagram showing the system. .
  • FIG. 11 is a diagram showing a configuration of a two-bow confocal scanner. .
  • Fig. 12 is a diagram showing the difficulty of the glucose transporter.
  • Fig. 13 is a diagram showing 3 ⁇ 4 ⁇ of the centenary wave at T I RFMi?
  • FIG. 14 is a diagram showing the 'Necent 3 ⁇ 43 ⁇ 4 sato in the ⁇ 3 ⁇ 4 through lens type T I RF ⁇ ⁇ ⁇ and the prism type T I RF ⁇
  • Fig. 15 is a diagram showing a 3 ⁇ 4-shaped synthesizer with a multitude of S ⁇ S dimensions in a glass slide with a 5 ⁇ ⁇ o jii * ⁇ .
  • FIG. 1 is a vertical el of the entire body of the whole body used in the fine-line system of the present invention
  • FIG. 2 is a plan view thereof.
  • This ⁇ ! H ⁇ device is provided with a ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ stand 1, which has an opening 1 or ⁇ [facing to the opening 2 and ⁇ 3 ⁇ 4 prism 3 is @ 3 ⁇ 4 The Yes.
  • the wisteria prism 4 faces the ⁇ -size prism 3 across the aperture 2 and the distance between the ⁇ -size prism 3 and Suruga Noh (attached to the moving table 5.
  • This moving table 5 is the position II screw, 6 ⁇ ⁇ Direction of ⁇ -dimension prism 3 in relation to mounting table 1 ( «» is magnetized by the function.
  • the i-surface 3 3 of dimension prism 3 and the iS-surface 4 '1 of dimension prism 4 Is the same height and the same surface regardless of the position of the movable table 5, and the movement of the I-shaped prism 3 and the thigh prism 4 is moved between the dog and the movable table 5. .
  • inch prism 3 is 2 through the laser 1 1 ⁇ the surface of the laser beam for the nascent difficulty 1 0 3 ⁇ , and the measured laser light 1 0 tT. M 3 2, m ⁇ 2
  • the laser beam 10 is emitted from a reflection prism having a surface 3 3 which emits 0, and the 'small prism 4 is a slide glass chamber 20 with a glass slide 2 1 in 1
  • the laser beam 10 that has been covered with a large size of the laser beam 10 that guides 0 to the outside of the slide glass 2 1 and the surface that emits the laser beam 10 emitted from the translating surface 4 1 to the outside.
  • the slide glass ft ⁇ i structure is mounted on the upper surface of the 1 ⁇ placement table 1 through the X-Y stage 50.
  • slide glass chamber 20 is supported through slide pad 5 6 by means of bow unity that works in the direction of sandwiching it.
  • the position of the lake size prism 4 can be adjusted so that there is no scattered light by moving the moving table 5 in the X direction (by moving the position i-joint screw 6). I can do it.
  • ⁇ screws 5 2 to adjust the slide glass S ⁇ i structure 5 5 is the surface 3 3 of the A dimension prism 3 and the dimension dimension.
  • Rhythm 4 surface 4 1 or 7 ⁇ ⁇ — ⁇ Flat The surface of slide glass chamber 20 can be moved arbitrarily in the plane to move the position of the center of loading age 1 TI is based on the fact that the position of the lens on the slide glass 21 in the direction orthogonal to the transition of the active lens 61 facing the 2 can be transferred. «The whole body dish illuminator used in the system is the same as that shown in Figs.
  • the slide glass 2 1 can be made by using a slide glass thicker than the usual thickness of 0.17 to 0.2 mm. The number of dimensions can be kept to a minimum, and the S / N ratio can be prevented from decreasing during a battle.
  • ⁇ 1 self ⁇ ,% Ride Glass 2 The number of total reflections on the top surface of the word S 1 or 3 is 4, so the command light illuminated by the nascent wave E v is shown in Fig. 2. There are four places. ' ⁇ .
  • the position of the thigh prism 4 can be used as a joint so that the tongue L3 ⁇ 4 based on the laser beam.
  • a slide glass chamber 20 for fine culture such as ⁇ 1 self HSfe example can be used, and since the power of the slide glass is " ⁇ : ⁇ 3 ⁇ 4", it is highly versatile.
  • the position on the slide glass 21 can be arbitrarily freely boiled through the ffimp mechanism, the position of the stage 0- ⁇ stage 50 can be freely adjusted. It is possible to change the mms at high speed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the dissatisfaction of the Saito system that makes it possible to use both T I RF Tengfuji and knowledge as one difficult example. The trap is explained below. ..
  • Fig. 1 Opening 2 is placed in the center of the table 1, and underneath it 6 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ! Lens 6 1 «Shell shell (This is placed on the dichroic mirror 6 2, and the dichroic mirror 6 2 is placed in the optical path of the dichroic mirror 6 2, and the woven lens is placed on the thread surface.
  • the Si elephant element 6 4 or 1 is placed ':..., While the dichroic mirror 6 2 placed diagonally has a 5 x IH drop such as a xenon ramp.
  • ⁇ of Oriaki Akira 65 and Dichroic Mira 6.2 there is a 1 «longer file 6”.
  • the shutter device 7 1 and 7 2, the fino letter device 6 6, and the view of the rope S on the slide glass 2 1 are transferred to MP.
  • Motors 5 3 and 5 4 (Fig. 2) are assigned to personal computer 80, and they can be switched or recognized! It is designed to be performed by the PC 8 0, and based on their gratitude, the image of Ito Itoi S! The screen is configured to be displayed.
  • the step motors 53 and 54 are driven to place the thread ffl ⁇ f S on the slide glass 21 at about I while one of the shutter device 71 and the shirt evening device 72 is closed at a high speed. Open and select either ⁇ I RF displayed iM illumination or ⁇ illumination! ⁇ (Light up the standing thin r 1l S and « ⁇ When the thigh is measured ' In this case, the filter device 66 is operated to measure the wavelength from the reflection field 65 ′, so that the ⁇ I RF. Can be switched to 3 ⁇ 4S at high speed.
  • the entire screen used in the concealment and thin film system according to the present invention is not limited to the slide glass chamber 20 or the slide glass 21, which can be used for any general purpose. Can be used, and without moving the laser 11 of the light source or the concealed 3 ⁇ 4 l lens 61, Saito Kaneto on the slide glass chamber 20 or the slide glass 21. ⁇ Since S can be moved to any position at high speed, for example, the thread on the slide glass 21 ffl wrap ⁇ Difficult to add to S The action of ⁇ on can be detected at high speed.
  • Fig. 4 shows the result of gene transfer of protein kinase Ca (PKCa), which is one of the many machine-positives, and green fluorescent protein (GFP) into the yarn ffl wrap.
  • PKCa protein kinase Ca
  • GFP green fluorescent protein
  • delocalization shifts the localization from the rope C to the fine silk PM, and is activated by the rope PM.
  • the arrow pointing in the direction of the dimension around the nucleus N is the moving direction of P KCa, and the dark blue sound in FIG.
  • Fig. 4 (a) .s (b) they are the upper call force diagram and the lower call shell diagram. It is possible to monitor PKC activity as a change in GFP activity in a live rope, using this local change as a basis for PKC activation.
  • Figures 5 and 6 show the changes in the ⁇ ⁇ ⁇ image and TI RF micrograph corresponding to the upper and lower figures in Fig. 4, respectively, and are shown in (a) to (c) of each figure. It is a figure which shows the fruit »J when the ion K + for 1% of defragmentation fibers is put in using the sickle shelf.
  • the graphs on the right of Fig. 5 and Fig. 6 show the change of Seki ' ⁇ ((a) (Dm v) in the figure! It can be seen that the difference in the change h is about 10 times greater due to chain eclipse and TI RF extraction.
  • Fig. 8 shows the change in the length of this F ura 2: 2 skin length using the mirror of Fig. 3 and GF p (m i m 3 ⁇ i RF ⁇ ⁇ Fig. 8 shows the change in the value of the reciprocal value at intervals of ⁇ seconds, as shown in Fig. 8.
  • the administration of ij (tetraethylammonium) for TEAOi splitting fiber is shown. '
  • FIG. 3 first, the step motors 5 3. Then, open the shirt evening device 7 1, close the shutter device 7 2, select the TI RF lf lighting ⁇ , and place the yarn shelf ⁇ S in the standing glass 2 1 in the laser beam Illuminate with a centennial EV that counts while 0 is many s ⁇ 3 ⁇ 4i, and the phantom image P KC a-GF P3 ⁇ 43 ⁇ 4 image through the lens 6 1 and the dike mouth mirror 6 2 3 In the ⁇ image element 6 4 ⁇ (Create an image on the ⁇ icon and transfer it to the computer 80.
  • PKC a localization change power is increased when calcium release increases, but just because calcium concentration increases does not necessarily mean that PKC H localization change power.
  • Fig. 9 shows TI RF m (a) corresponding to the text size in Fig. 8, a page image (b) at a skin length of 3400 nm, and a screen image at a skin length of 3800 nm.
  • This shows the change in the sculpture (c), the left is the resting before detaching (right), and the right is the stubble when stimulating (sti mu 1 ation).
  • ⁇ is “” with the description of Ri: ⁇ ''' ⁇ ' Next, Fig. 10 shows the other 3 ⁇ 4 »j as TI
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a separation / rubbing system that can be made. The configuration is described below.
  • Fig. 1 and Fig. 2 (opened in the center of m ⁇ , and underneath the ⁇ lens 6 1 or 3 6
  • half mirror 8 1 is placed in the first half
  • half mirror 8 1 is in 3 ⁇ 3 ⁇ 4 in the cut-and-fore evening 8 2 and shutter device 8 5 and Itoyoshi statue lens 6 3 or 3 is placed
  • an image element 64 such as a CCD is placed on the line plane.
  • the reflecting side of the half mirror 8 1 arranged obliquely is ⁇ scanner 9 0 and the laser 1 2 0 or 5 that illuminate it, and the tree lens 1 2 9 is placed on the output side of the common honor scanner 90, Iff elephant such as CCD 1 5 1 or 3 ⁇ 4 Self-placed.
  • the swell lens 61 is in the directional position or W3 ⁇ 4T by the piezo element 86.
  • the laser beam 10 is inserted into the optical path between the laser 11 that emits the laser beam 10 for the sensation ⁇ 1 of the all-weighing illumination device shown in FIGS. Further, a shutter device 71 is obtained, and a shirter device 83 for sharpening and concentrating the lens is disposed between the separation scanner 90 and the half mirror 81.
  • the laser light passes through the Nipo-type ⁇ 3 ⁇ 4 scanner 90 and is flattened through the relay lens 8 4. It is intimidated by the half mirror 81 and is difficult to be placed on a predetermined main surface in the summary 4S on the slide glass 11 1 through the display lens 61.
  • Thread from laser beam 3 ⁇ 4 ⁇ S from S is returned to scanner 9 0 via ⁇ swell lens 6 1, half mirror 8 1 and relay lens 8 4, ⁇ ⁇ scanner 9 0
  • the dichroic mirror 1 2 4 in the middle ⁇ ! Is dimensioned, passed through the Itoyoshi image lens 1 2 9, and the image power of the predetermined Ji surface of the yarn shelf ⁇ S is placed on the iti image element 1 5 1.
  • K's ⁇ Scanner 9 0 is, for example, as shown in Figure 11.
  • the laser light 1 2 1 from the laser 1 2 0 is constrained by individual microlenses 1 2 3 placed on the microlens disk 1 2 2 and is dichroic mirror 1 2 4
  • pinhole disc (also called double-bow disc) 1 2 5 Individual pinholes provided in 1 2 6 are passed through, relay lens 8 4 and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ lens 6 1 through It is difficult to meet the specified fH of iHS.
  • a single pinhole 1 1 6 is reflected by a dichroic mirror 1 2 4 and is projected onto a fif elephant element 1 5 1 such as a CCD by a focusing lens 1 1 9; I hate it.
  • the Dyke mouth mirror 1 2 4 that is ⁇ ffl is allowed to transmit m ⁇ 2 1 and reflect the light from the thread fflSI ⁇ S.
  • the microlens disk 1 2 2 and the pinhole disk 1 2 5 are connected to W3 ⁇ 4 at 1 2 7 and rotate around the rotating 1 2 8 in a single row.
  • 'Individual microlenses 1 2 3 and pinholes 1 1 6 are positioned so that the surface of the excitation or shelf ⁇ S from the individual pinholes 1 2 6 formed on the pinhole disc 1 1 5 Have been '.
  • the plane where the pinholes 1 2 6 are lined up, and the small ⁇ S trap! Since the surface and the jii elephant element 1 5 1 of the Si lock are placed in a cage that can be transported to each other, a shelf ⁇ [S. awakening image of S. , ⁇ Image power. '
  • Fig. 10 Separation of Shelves Since the system is like this, the step machine 5 3 and 5 4 are slaughtered by the r from the PC 80 and the thread on the slide glass 2 1 While placing the fflSI material S around, close the shutter devices 7 1 and 8 2 and the shirt unit 8 3 with ⁇ i and open the other, so you can purchase TI RF! ⁇ And ⁇ ⁇ »Choose one of the mirrors! ⁇ When standing 8 is illuminated and ⁇ mm ⁇ is retracted, the piezo element 8 6 is attached to the base and the position in the direction of the separation lens 6 1 is set to the bidet rate. ⁇ Change the face ⁇ ffliS M »(Zeolite 1 5 1, take 1 ⁇ image into PC 8.0 and fine S; 3D image.
  • i3 ⁇ 4 chooses I m of T I RF lM.
  • Nested wave shining in the light 1 ⁇ 2 image is engraved on the object element 6 4 with the lens 6 1 through the lens 6 1, Hafmira 1 8 1, Mj t! Import to PC 8 0.
  • ⁇ ⁇ imitates the city in Tsunago, and TI RF fiber knives ras S "protein
  • the movement of the team can be captured using protein.
  • the original lasers 11 and 120 are of a single wavelength, and the single wavelength is also assumed to be a single wavelength. Alternatively, superimpose them at the same time, and the skin length [corresponding to a different wavelength; to image an optical image.
  • CCD camera read lens 63 + tii image element 64, thread lens 129+ imaging element
  • Difficult before 151 Multi-color image power may be maximized by distributing equipment or using a color CCD camera.
  • Fig. 12 is a figure showing the glucose transporation evening pods as legs. There is a glucose transpor ter as a place to put the UK into the yarn shelf. ⁇ ⁇ ⁇ ! ⁇ Is incorporated into the glucose transporte (Glut 4) force ffl package, and as shown in Fig. 12, it is thighed by the stringiness from the Golgi book of the thread ffl package. The number of G 1 ut 4 localization changes to Tsunano-ri in Insulin, which increases the avoidance of sugar uptake. At this time, as shown in FIG.
  • the ⁇ bell system it is possible to simultaneously squeeze and squeeze multiple small packets and biologically related nanoscale jobs at a low magnification.
  • the cocoon package it is possible to change the protein / mechanism of the protein, the mechanism of the protein, and the protein translocation J ⁇ or the protein translocation J3 ⁇ 4 or cell because that enables to 1 raw detection mosquitoes, can greatly Mitsuguminami Rukoto in research ⁇ screening ⁇ thereof.
  • the glass slide chamber which is the same as that used for the marking device, can be used, so it is highly versatile. In addition, by detecting a large number of hundreds of knitting on the same slide glass with high sensitivity, it can be used as a Kura Ito screening device.

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Abstract

本発明は、特別なスライドガラスを用いることなく観察位置を自由に変更可能で、高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な全反射試料照明装置を用いて、同一スライドガラス上で多数の細胞反応を高感度で高速に検出可能な顕微鏡細胞観察・検査システムに関するものであり、パソコン（８０）からの指令によって、ステップモータ（５３）、（５４）を駆動してスライドガラス（２１）上の細胞試料（Ｓ）の観察位置を順に走査しながら、シャッター装置（７１）とシャッター装置（７２）の一方を高速で閉じ他方を開くことにより、ＴＩＲＦ顕微鏡の照明光路と落射蛍光顕微鏡の照明光路の何れかを選んでその観察位置の細胞試料（Ｓ）を照明し、落射蛍光顕微鏡が選択されたときには、フィルター装置（６６）を駆動して落射蛍光照明光源（６５）からの励起光の波長を選択するようにすることで、細胞試料（Ｓ）のＴＩＲＦ顕微鏡観察・検査と落射蛍光顕微鏡観察・検査とを交互に高速に切り換えて行うことができる。

Description

明 細 書 ネ の観^去を用いた ®離竟側包観察 . システム
技 術 分 野
本発明は、ネ撤の養！^去を用いた鎖纖竟侧包養擦.該システムに関し、特に、飯 身概 (Total Internal Reflection Fluorescence： T I RF)驟纖と識 房謹 、 ^^^厨^!の他の^ の顕 とを組み合わせて同一スライドガラス 上で数百 J¾±の多数の細¾ ^を高感度で高速に検出でき、倉 I藤スクリ一ユング装 ¾^ の組み込みか可能な匿 »瑚包 . システムに関するものである。
'背 景 術
T I RF显房藤黃去は、ナノスケ ルの局所驅を可能とする高 S N比の！^^去である 。綱胜 予において細 SI 性や単好養の養藤 隱棚 1 ) に広く用いられ る一方、電気化学^ «予でもコロイド粒子の電翅勺特性
Figure imgf000003_0001
) 'やブラウン麵（
Kihm, K. D. et al.， Exp. in Fluids, 37, pp.811-824, (2004) ) の^^ 军明に大きく 貢献してきた。 この雜の默の^は、觀霍擦の際に、 Ί¾^6?原として、屈折率の異 なる 2 Ψ纏界面での光の^ S寸に伴い胜する ネッセント波を用いる点にある。図 1 3にその ネッセント波の数の; fi?を示すが、屈折率 の觀 1と屈折率 n2 の物 質 2の界面に、屈折率の大きい觀 2側から臣^ ^Rhで光が AitTるとその界面で光は 鋼寸されるが、界面から屈折率の小さい觀 1側は識関辦勺に ί する ネッセン ト波が する。 エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百 nm程度の領減に僅かに 染み出す光であるため、 T I RF显厨編去においては、 した觀とスライドガラ スあるいはカバーガラス （以下、スライドガラスと ¾ ^る。 ） の界面で ネッセント波 を させることで、言 ¾の極 H¾した高 S N比の; ¾¾¾か可能となる。
現在、 TlfS化されて に多く用いられているのは、主に図 1 4 ( a) に示すような対 物レンズ T I RF蹰離竟である。 すなわち、倒Ϊ にし #勿レンズをスライドガラス の下方に滴曼オイルを介して位置させ、その»レンズを経て^ ネッセント¾ ^用の レーザ光をスライドガラス下方から斜めに λΐ寸させ、スライドガラス上の imが載置され た界面近傍に ネッセント波を させるものである。 この配置で〖ま、通レンズ上方 の空間が自由に扱えるため 生と稀更性に優れており、 'また、 隙に明るい: ®像を 得ることができる。 しかし、高開口数滴數彌レンズを用いるとし、ぅ驟肚の斜約により
、倍率が 6 0倍 1¾±の 咅率 «に制限されてしまう。、
一方、プリズムを介してレーザを ΛΙ ·る図 1 4 (b ) に示すようなプリズム式 T I R F蹯媒竟も広く用いられている。 この は、言 を 2枚のスライドガラス間に挟み、上 方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経て ネッセント ¾ ^用 のレーザ光を上方のスライドガラスの上方に斜めに Λ寸させ、そのスライドガラスの ΐ¾ と接する界面近傍に 、'ネッセント波を胜させるものである。 'この配置では、 レーザ光 を効職勺に λ!寸できることから高 S 匕の雀擦か可能であり、倍率の 购がないため低倍 率纏も額である。 しかしながら、纖レンズ上方の ¾^か ¾がれてしまい、謝の操 作性ゃ標 の自由度か しく乏しい。
± したように、翻犬では、例え (纖の週呈 «々な難を し T ffl包が示す を謙の@(本で同時に]:嫩すると つたニーズを T I RF顕 ^力 こしていると W い 難い。言謝の ¾ra生と標本の自由度に優れ、他の 去との併用力 でかつ低倍 率摩を可能とする T I RF蹰謹システムの開発か雷寺されている。 . .
の職では、図 1 5 ( a) に示すように、 ΛΙ寸プリズムと腿プリズムをスライド ガラス ®に して、入射プリズムからスライドガラス内にレーザ光を導入してスライ ドガラス内で多 寸させ、その多 應の際にスライドガラス上面近傍に ^ネッ セント波を胜させ を腿し、多 威寸で藉皮されたレーザ光を觸寸プリズムを 経て外へ出 «か M¾SUで «され、 また、図 1 5 (b ) に示すように、スライ ドガラスの端を加工して幅斜 ¾としてこの豫 からスライドガラス内にレーザ光を 導入してスライドガラス内で多 射させ、その多 寸の際にスライドガラス上面 近傍に ιι ネッセント波を雖させ Τ¾·を腿し、多 S^ 顧皮されたレーザ光を ¾斗«に対向する»から外へ出 か^^午 で験されている。 これらの方 式は、標本上方の が自由であり低倍率,擦も額であるが、スライドガラス厚が制限 されていて薄いため（前者は 0 · I 7 mm、 i¾¾tt 0 . 2 mm)、多 寸回数が多く なり、全威寸による散舌 L¾の 、
Figure imgf000004_0001
難の; 色が起きやすく、 S N比 力 ¾下するという問題がある。 さらに、 レーザ光の Λ寸位置と抛寸位置が固定されており 、 レーザ光の か灘しく、 また、難爾立置の频には、纖レンズの移動が必 要であり、標 ¾ί乍力^でない。 さらに、標本每にフ。リズムをスライドガラスに し たり、 スライドガラスに力 を施す必要があることから、 '手間がかかり、汎用性も低い。
〔編午細〕 、
Axelrod, D.， Traffic, Vol.2, pp.764-774, (2001)
〔欄棚 2〕
Prieve, D. C. and Frej, N. k , Langmuir, 6， pp. 396-403, (1990) 〔扁棚 3〕 ノ · ·
Con i bear, P. B. and Bagshaw, C. R , Journal of Microscopy, Vol. 200, Pt 3, pp.218-229, (2000) ·
〔漏灘 4〕
Teruel, M. N. and Meyer, T.， Science, Vol. 295, pp. 1910—1912， (2002) 発 日月 の 開 '示
本発明〖ぉ絲技術のこのような問歸、に鑑みてなされたものであり、その目的は、特別 なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラス上の観 立置を任意に自由に ¾g5J能で、散乱光の數カゆなく高 SN比の霍藤か可能で、翻の顯輝な全励 照、明装置を用いて、,同一スライド力、、ラス上で数百以上め^ (の細 ¾¾Sを高感度で高 速に検出可能な、徵の養!^去を用いた蹰離竟镧包霍擦 ·脑システムを 共すること である。 ' ■
±1己目的を^ ¾する本発明の 1つのネ鐵の観^去を用いた顕纖竟侧键擦 . シス テムは、 ネッセント^^用の を備え、その 原からのレーザ光をスライドガラ スに導入してスライドガラス内で多 寸により驚皮させて 1 己スライドガラスの上面 に s'ネッセント波を させ、 ti己スライドガラスの上面に位^ る綱鳕^ fをそのェ ノ ネッセント波で照明する: ¾J^照明装置を備えており、
繭己スライドガラスをその面に沿った 方向に位 g¾iするスライドガラス位翻 節機構を備えており、 .
龍¾：¾^照明装置の前記スライドガラスを貝込む位置に、龍己スライドガラスに 対して垂直方向に環膨働レンズか ffi置され、
mm レンズの糸 劍則には、 割素子を介して一方の舰中には衞象;^ 系と ίΐί象素子が、他方の «中には翻 t ^厨 Mfflの！^源か面置されており、 漏己 ネッセント^^用の 原から 1 己スライドカラスのレーザ;^入部に至る光 路中と、 tii^i¾ ¥ 纖竟用の厉 ¾源と miam^割素子との間にそれぞれ照明光を 靡斤' するシャッター装置か己置されており、 ~
各々の t 己シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、 11己スライドガラス位 u機構によるスライドガ、ラス ί立 uとを制御する芾議装置を備えており、
t H^ 喫置からの により 己スライドガラス位 機構を缶卿し Tt 己スライ ドガラス上の細 權藤 '検出位置が還尺され、かつ、編 啣装置からの により 齒己シャッター装置各々の開閉が制御され、 ッセント¾ ^用の光源の照明光 路と編 謹用の！^源の照明駕とが 勺に開かれ、 t 己スライドガラ ス上の邀尺された綱^ H擦 ·検 立置の^ ΙτΙ^房纖竟像と 竟像とが 籠 象素子'を介し rt iJt隨〖 り込まれ、そ (^威 «§厨纖像と 頁 ί纖像とから,侧 を検出することを■とするものである。
本発明の別の »の1 ^^去を用いた 包!^ .ネ«システムは、 · ネッセン ト¾ ^用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してスライド ガラス内で多藤蹄寸により導皮させ rtl己スライドガラスの上面に ネッセン卜波を 胜させ、歲己スライドガラスの上面に位財る細 S¾をその 'ネッセント波で照明 する全^ l W照明装置を備えており、 '
歲己全反身 1 照明装置は、 t 己スライドガラスを した屈折 ¾ ^液を介してその 面内で移動可能に 寺する 寸プリズムと ¾1寸プリズムとを備え、
ΙΙΗ 寸プリズムは龍己遞に対して固定され、龍纖寸プリズムは編 Η 寸プリズム に対し Tti己レーザ 亍方向に位 能に配置されており、 '
Ι ΙΗΛΙ寸プリズムの スライドガラスの 寺面と、 fiH 寸フ。リズムの媚3スライド ガラスの 寺面とは、 t 蘭寸プリズムの鼸 ΐ位置に係わらずに同一高さで同一面になる ように配置され、
ιΐΒλ寸プリズムと t awプリズムとの上に ¾ί寺される 11己スライドガラスをキ酸し て、鏰己スライドガラスをその面に沿った 2¾ ^方向に位§¾5するスライドガラス位置 謹機構を備えており、 己レーザ光は、 己 λ!寸プリズムを経 Tfil己 寺面から出てその上に^ τされている iia/a折 ¾ ^液を介してその上に 寺されている編3スライドガラス内に入って多 励により壤皮され、.簡職プリズムの歳己 寺面の上に^ τされている鲴掘折輕 夜を介し Ttiia 寸プリズムの媚3 寺面から龍 ¾¾ιプリズム内に入り、髓纖プ -リズムから外部へ腿されるように漏己全威養照明装置力職され、
編 照明装置の謹己 寸プリズムと 1 ¾¾1寸プリズムの間の 10!己スライドガ ラスを む位置に、龍 3スライドガラスに対して垂 向に躪膨働レンズか配置さ 認 2§厨離纖レンズの糸 纏！！には、 割素子を介して一方の 3»ΐには 象 系と f f象素子が、他方の 中には翻 離翩の厉 原か 置されており、 編己 ネヅセント 用の 原から iia 寸プリズムに至る 中と、 m , の！^原と 1 己¾^割素子との間にそれぞれ照明光を · ¾するシャ ッタ一装置か ¾己置されており、'
各々の 己シャッター装置の開閉による照明光源の切り換えと、龍己スライドガラス位 機構によるスライドガラス位 节とを $1脚する 嗨喫置を備えており、
ft己制 JtP¾置からの^により 1 己スライドガラス位 を 1御し Tt 己スライ ドガラス上の綱^ 41藤'検出位置が邀尺され、かつ、 t B 脚装置からの により 龍 3シャッ夕一装置各々の開閉力，脚され、編 S ネッセント¾¾用の翅の照明光 路と の厉 ii^原の照明 とが還 勺に開かれ、 1 己スライドガラ ス上の 尺された細 ^11擦 ·検 tbf立置の^ 繊像と 像とが iatf象素子を介し 膦喫顰 ( り込まれ、そ 竟像と！ e ^頁 S ^像とから を検出することを とするものである。 '
これらの J#^、藤 割素子がダイクロイツクミラーからなり、編己 ネッセン ト¾ ^用の 原から照明光の波長の光と、擺^ 竟用の厉 ^原とから照明 光の皮長の光とを、漏 asi象素 ^則通へ至ることを iaihし、細 から生じた の みか 5fii象素 至るようにすることか Ήましい。
また、 tl纖 ^^厨 銦の厉職源と認己; 1^割素子との間に厉磨皮長を邀尺す るフィルター装置か 5置されており、廳己帘 喫置からの により 己フィルタ一装置 を »する厉 i起波長が 尺されることか ましい。
本発明のもう 1つのネ鐵の Ϊ ^去を用いた闞纖葡簡包養藤. 鐘システムは、 ネ ツセント^ 4用の 3 ^原を備え、その光源からのレーザ光をスライドガラスに導入してス ライドガラス内で多 寸により響皮させ Tf 己スライドガラスの上面に: ι^、ネッセン ト波を させ、調己スライドガラスの上面に位 "る細鳕¾をその！^ネッセント波 で照明する全威漏照明装置を備えており、 ：
' 前記スライドガラスをその面に沿った 2汐 方向に位 ^ ittするスライドガラス位置調 節機構を備えており、
11己全 ^照明装置の 己スライドガラスを^む位置に、 己スライドガラスに 対して垂直方向に レン ：か 15置さ
編 厨膨働レンズの貓劍則には、 割素子を介して一方の; m中には、 己ェ ) ネッセント« ^用の光源からの照明光の波長の光を ¾hするフィルタ一と第 1の糸 象 體系と第 1の ¾ί象素ギとが、他方の¥½中には、離 簾房纖竟用の離点スキャナ か爾されており、 '
Figure imgf000008_0001
また、編己離 スキャナの出力側に〖嫌 の織象；)1^系と第 2の »ί象素子がそれぞれ配置されており、 fiJlHJ ネッセント¾¾^用の 原から til^スライドガラスのレーザ;^入部に至る光 路中と、編 s共等 スキャナと 3¾^割素子の間の 中と、 t am^割素子と前 記第 1の 象素子の間の 中とに、それぞれ照明光あるいは m¾を; i iif .還するシ ャッ.ター装置か IH置されており
各々の ft己シャツ夕一装置の開閉による照明: と ^(象光路の切り換えと、 f 己スライ ドガラスィ立 βΐϊ« (こよるスライドガラス立^ ϋと、齒 厨 レンズの 向の位漏节をする焦 j¾織構とを制脚する 脚装置を備えており、 '
漏 膦薛置からの (こより I己スライドガラス位翻節機構を带卿し T 己スライ ドガラス上の細鳕綱藤 ·検出位置が露尺され、かつ、廳 柳装置からの により 擺己シャッ夕一装置各々の開閉カ 啣され、編己 ネッセント ^用の光源の照明光 路と t ¾^M^酉謹用の離点スキャナの照明 とが邀 i¾勺に開かれ、
用の^! ^スキャナの照明 が開かれたときには、 m ^m m 御して ii^厨 レンズの «方向の位置を戶リ淀の ίί立置に uすることにより、 til己スライドガラス上の 尺された綱^ M¾ .検出位置の^ 厨離竟像と^!
^¾«ί¾Ι竟像とがそれぞれ USi象素子、 j|^ 2¾i象素子を介し Τ^| ι 装置 に取り込まれ、そ 箫離竟像と離^^厨維像とから細 »δを検出する ことを漏とするものである。
本発明のさらにもう 1つの複数の観^去を用いた显厨激鏡倒 ¾^ . システムは、 ネッセント ^¾用の 原を備え、その駕からのレ一ザ光をスライドガラスに導入 じてスライドガラス内で多 寸により響皮させ スライドガラスの上面に J ^'ネ ッセント波を発生させ、 tfi己スライドガラスの上面に位 »る繊 si^抖をその:!^ネッセ ント波で照明する^ ¾fris照明装置を備えており、 '
t!3^l«照明装置は、 11己スライドガラスを ¾Tした屈 ί)«β·液を介してその 面内で移動可能に 寺する λ!寸プリズムと¾寸プリズムとを備え、
龍 ΗΛ寸プリズムは魔己光源に対して固定され、 flB 寸プリズムは t!HAi寸プリズム に対し rf 己レーザ¾亍方向に位^ 能に配置されており、 ■
ίίΙΗλΙ寸プリズムの 1 己スライドガラスの 寺面と、 寸プリズムの スライド ガラスの; ¾寺面とは、 蘭寸プリズムの讁 11位置に係わらずに同 ~¾さで同一面になる ように配置され、
Ι Ξλ寸プリズムと 11¾¾1寸プリズムとの上に 寺される編己スライドガラスを 寺し て、育循己スライドガラスをその面に沿った 2汐 方向に位^ 11!するスライドガラス位:置 嫌機構を備えており、 ' .
歲己レ^"ザ光は、 t axitプリズムを経て ti3 寺面から出てその上に滴下されている tiims折 ¾ ^液を介してその上に支持されている 己スライドガラス内に入って多 励により纖され、簡纖プリズムの龍己； ¾寺面の上に ¾τされている編掘折纏 合液を介し rt 2 寸プリズムの 11己 寺面から編 ¾¾!寸プリズム内に入り、認删寸プ
Figure imgf000009_0001
ドガ ラスを む位置に、媚己スライドガラスに対して垂直方向に躪»働レンズか己置さ れ、
t 房膨働レンズの糸 Si謝則には、 ^^割素子を介して一方の翅中には、 til己ェ ノ ネッセント¾ ^用の光源からの照明光の波長の光を ffiihするフィルタ一と第 1の糸 象 系と第 1の iff象素子とが、他方の 中には、雌 の離 スキャナ か爾されており、
謂己離点スキャナの照明側には離 房謹用の厉；^原が、 また、 m rn^ スキヤナの出力側に〖錄 2の結像 系と第 1の躕象素子がそれぞれ配置されており、 編己: ネッセント?^^用の 原から flEAI寸プリズムに至る 中と、離己離 スキャナと前記ラ1 ^割素子の間の光路中と、編己光 ¾^割素子と！！碟 1の衞象素子の Γの 中とに、それぞれ照明光あるいは ¾¾¾を磨折 .■するシャツ夕一装置が ¾Ξ置 されており、
' 各々の 1 己シャツ夕一装置の開閉による照、明光路と Si象光路の切り換えと、籠 Sスラィ ドガラス ί立 機構によるスライドガラス立^ iiJと、 tia^房 レンズの «方 向の位 ϋϊをする焦^ M 構とを $卿する 脚装置を備えており、
fii ijt際置からの により til己スライドガラス位 ¾ί機構を^ ttlし スライ ドガラス上の細 ^權藤.検出位置力蒙され、かつ、編己带卿装置からの により 龍 3シャツター装置各々の開閉力，脚され、 11己 ネッセント^ ¾用の麵の照明光 路と t a^^M 用の共尊^スキャナの照明 とが ¾RS勺に開かれ、 m^m, 用の^^スキャナの 明 が開かれたときには、 m ^m^mm
Figure imgf000010_0001
( り込まれ、そ 房膽像と無^ 纖竟像とから編滅を検出する ことを とするものである。
本発明においては、鋼舊照明装置が、特別なスライドガラスを用いることになく 任意のスライドガラス上の霍廳立置を任意に自由に 能で、散乱光の 少なく高 S Ν比の養擦か可能で、言 の衝乍カ な磁となっているので、同一スライドガラス 上で数百 の多数の細 を高感度で高速に 纏去、 ^mmm 等のネ ϋ (の養!^去を用いて » · ることができ、倉蝶スクリ一ニング等に^ る ことかできる。 酾の簡単な説明
図 1 (お 明の躏»欄鵠藤 .ネ鐘システムで用いる全 ¾j¾i照明装置の 1 ^\ の垂 である。
図 2は図 1の全威«照明装置の平面図である。
図 3は本発明の 1 ^例として T I RF函纖蘼擦と落身¾^房離蘿擦を併用できる ようにした薩纖竟細包 . システムの を示す図である。 図 4はフ。ロティンキナ一ゼ C と life戦夕ンパクとの蛤タンパクを糸画包に遠云子導 入し 明にて霍擦した所見を 勺〖こ表した図である。 ·
図 5は図 4の上の ϋと下の図に対応する翻^ 灘像の変化の 1 » を示す図で ある。 '
図 6は図 4の上の図と下の図に対応する T I RF躪纖像の変化の ^^を示す図で ¾る。
図 7は F u r a 2のカルシウム と厉 皮長に文 Tる:^^生を示す図である。
図 8は F u r a 2の 2紫タ jf«皮長による：^鍍の変化を図 3の翻¾¾謹を用 レヽて、 また、 G F Pの翻 ¾M匕を図 3の T I R F顕職を用レヽて預啶した値の,脚勺 変化を示す図である。
図 9は図 8に対応する T I RF騮離竟像 ( a) と、 )¾¾長3 4 O nmでの翻^ ¾. ί鐘像 (b ) と、磨皮長 3 8 O nmでの翻^ W離竟像 ( c ) の変化を示す図である 図 1 0 発明の他の! ¾fe例として T I RF驟^ i擦と^ 厘離靡擦を併用 できるようにした顕纖竟侧键擦 · システムの を示す図である。 .
図 1 1は二ボウ方式の共焦点スキャナの構成を示す図である。 .
図 1 2はグルコーストランスポータの纖をネ難勺 ί した図である。 ' 図 1 3は T I RFMi ?去における ネッセント波の ¾ ^の を示す図である。 図 1 4は ϊ¾の通レンズ式 T I RF颼纖竟とプリズム式 T I RF§|¾における ' ネッセント ¾¾ ϊ里を示す図である。 '
図 1 5·〖お jii* ^されているスライドガラス内で多 S^S寸させて ネッセント波を させる ¾を示す図である。 発明を するための; 態
以下に、本発明の複数の観^去を用いた显酉 欄键!^■ システムを ¾WJに基 づぃ T|½明する。 その説明の前に、本発明の显厨 «補 システムの最も な 咅盼である全滅腿照明装置を難例に基づい Τ|½明する。 図 1は、本発明の驟纖竟細 m ·ネ鐘システムで用いる全反身 « P明装置の 1戴綱の垂直 elであり、図 2 はその平面図である。 この^! H 朋装置は、 ΐ¾ ϋ置台 1を備えており、その中 、 に開口 1か殳【ナらており、開口 2に面し Τ ¾¾置台 1には Λ寸プリズム 3が @¾されて いる。 また、開口 2を挟んで Λ寸プリズム 3に面して藤プリズム 4が Λ寸プリズム 3と の間隔を讖河能 ( 動台 5に取り付けられている。 この移動台 5は位謹 IIネジ, 6によ り ΐί ^載置台 1に対して Λ寸プリズム 3方向 ( « »Τ能に磁されている。 そして、 寸プリズム 3の^ i面 3 3と ！寸プリズム 4の iS 面 4' 1とは、移動台 5の位置に係わ 'らずに同一高さで同一面になるように、 Ι寸プリズム 3と腿プリズム 4の开^ I犬と移動台 5の移 力 «されている。
そして、 ΛΙ寸フ。リズム 3の iS 面 3 3と ¾S寸フ。リズム 4の^ i面 4 1との上に、糸 料 3を 寺するスライドガラス、 この例ではスライドガラスチヱンバー 2 0が^ i面 3 3 と廳面 4 1上に i Tした涵曼オイル 2 5を介して自由に載せられる。
ここで、 寸プリズム 3は、
Figure imgf000012_0001
2を介してレーザ 1 1からの^^ネッセント難 生用のレーザ光 1 0を ΛΙ寸させるための 面 3 1と、 寸したレーザ光 1 0を威 tTる . m 3 2と、 m^ 2で されたレーザ光 1 0を射出する^!面 3 3とを有する反 射プリズム开 犬のものであり、 '觸寸プリズム 4は、 スライドガラスチヱンバ一 2 0の麵 のスライドガラス 2 1中を多 寸により碧皮されたレーザ光 1 0をスライドガラス 2 1の外へ導く^ 面 4 1と、翻面 4 1からス射したレーザ光 1 0を外へ放射する邏面
4 2とを有する^ iプリズム幵^ (犬のものである。
また、 1^載置台 1の上面には、 X— Yス ージ 5 0を介してスライドガラス ft^ i構
5 5力穀けられており、 この例では、パッド 5 6を介してスライドガラス ¾ί纖構 5 5が その挟む方向に働く弓単 '性によりスライドガラスチヱンバー 2 0を支持しており X—Yス テージ 5 0の X方向 ί立^ 11节ネジ 5 1によりスライドガラスチェンバ一 2 0をレーザ光 1
0の ΛΙ寸方向に 亍な X方向 ^^謹河能としており、 また、 Χ—Υステージ 5 0の Υ - 方向位 ®iネジ 5. 2によりスライドガラスチェンバー 2 0をレーザ光 1 0のス射方向と 麵な Y方向 (；： ^謹何能としている。 そして、 X方向位應 1!ネジ 5 1、 Y方向位置 講ネジ 5 2の回転はそれぞれステップモータ 5 3、 5 4によって所 ¾*だけ芾 1脚される ようになつている。
このような ^であるので、 AI寸プリズム 3の 面 3 3と d寸プリズム 4の腿面 4 1の上に?曲曼オイル 2 5を介して載せるスライドガラスチェンバー 2 0あるいはスライド ガラス 2 1を別の禾 のものに雄しても、 ネッセント ¾用のレーザ光 1 0の;^寸位置は何ら 11 する i¾がない。 したがって、その; ^原であるレーザ 1 1の位 置も調節する必要がない。 ただし、スライドガラス 2 1の厚みが異なることにより、 スラ ィドガラス 1 1の 1®での 寸位置か変化するので、位 i節ネジ 6を して移動台 5 を X方向 ( 動させることで、湖寸プリズム 4の位置を にして散乱光が しないよ うにすること力できる。
そして、ステツフ。モータ 5 3、 5 4を所 ¾¾ϋ転させて'それぞれ X— Υステージ 5 0のX方向位 !ネジ 5 1と Y方向位: ϋΐίネジ 5 2を調節して、スライドガ'ラス S^i構 5 5を A寸プリズム 3の 面 3 3と觸寸フ。リズム 4の邏面 4 1とか 7^成する Χ—Υ平 面内で任意〖こ移動させてスライドガラスチェンバー 2 0の面内位置を任意に移 する ことにより、言 ¾載齢1中心の開口 2に面している躕 働レンズ 6 1の遷に対し て直交方向のスライドガラス 2 1上の細鳕 の観 立置を移觀鋼節することができる の に基づい TI兌明した本発明の鎖 棚键 . «システムで用いる全反 身皿照明装置は、スライドガラス≥ 1内でレーザ光 1 0を多數威寸させる点では、図 1 5 ( a)、 (b )で矛、したお採の多 S^ I寸の のものと共種しているが、スライド ガラ 2 1として通常の厚さ 0 . 1 7〜 0 . 2 mmより厚いスライドガラスを用いること で、多 ！寸の回数を最小限に抑えることができ、戦霍擦の際の S N比の低下を防ぐ ことができる。 ±1己^^では、 %ライドガラス 2 1の言 Sか ¾つている上面での全反 射回数は 4回で、そのため ネッセント波 E vで照明される令戲は、図 2に示 ぴ飛 びの 4か所となっている。 '· .
また、腿プリズム 4の位置を継に講して多 機にスライドガラス 2 1から 出ていくレーザ光.1 0に基づく散舌 L¾を胜しないようにすることができる。
そして、上からの imの衝乍力 で、他め 去との併用及び高 S N比の低倍 率藤か可能とな 。標 には、 ±1己 HSfe例のような細 音養用スライドガラスチェ ンバー 2 0も麵可能であり、スライドガラスに力 Π も"^: ϋ¾であることから、汎用性 高い。
また、 Χ—Υステージ 5 0の位 ffimp機構を介してスライドガラス 2 1上の観 立置を 任意に自由に麵で "能であるので、 スライドガラス 2 1の面内に位 る多くの細 mmsを高速で切り換えて霍擦することか可能となる。
なお、スライドガラス 2 1の厚みか変化する場合には、 スライドガラス 2 1の上面での 寸位置も変化する。結果として、展房 彭倫レンズ 6 1の 由から ネッセント波 E Vで照明される令 力 れてしまことがある。 そのため、 スライドガラス 2 1の厚みを変 化させた に養藤を行うためには、 ネッセント波 E vの照射位置のずれに合わせて
、言 ¾4載置台 載置台 1、 «»f iレンズ 6' 1、 1 2の何れかを X方向：^動 ϊさせる必要がある。
さて、本発明〖¾Lhのような 照明装慮を用いて、スライドガラス 2 1 -上の同じ綱 Sに対して、 T I RF騮繊藤と菌^ 藤あるいは離点 を ΐ ^で七刀り換えて行うようにするものである。
図 3は、その 1難例として T I RF騮騰藤と識«¾纖癱擦を併用できるよ うにした蹰藤擁鵠藤 . ί鐘システムの嫌を示す図である。 その麵を以下に説明す る。 . . . . '
図 1、 ,図 2の^ 1 «置台 1の中央に開口 2か殳けられており、その下に倒翅の躕纖 ¾ί勿レンズ 6 1か 置され、その顧離! レンズ 6 1の |«貝 ϋ中 (こはダイクロイツ クミラー 6 2力 斗めに配置されてい 。 そして、 ダイクロイツクミラー 6 2を した光 路中に織象レンズ 6 3か ¾Η置され、その糸 象面に C C D等の Si象素子 6 4か 1Ξ置されてい る。 ' ： . . , 一方、斜めに配置されたダイクロイックミラ一 6 2の A 則にはキセノンランフ等の落 m 5か IH置されている。 そして、織 明駕 6 5とダイクロイツク ミラ一6 .2の Γには、 1«長を 尺するフイ レ夕"^置 6 6か 置されている。： さらに、図 1、図 2の^! 照明装置の!^ネッセント？^^用のレーザ光 1 0を するレーザ 1 1とス射プリズム 3の間の 中にレーザ光 1 0を適折 .腿するシャ ッ夕一装置 7 1か ¾己置され、 また、 明光源 6 5とダイクロイツクミラー 6 2の 間には、翻 を藤 . するシャッター装置 7 2か己置されている。
また、 ダイクロイツクミラー 6 2と糸謅レンズ 6 3の間には、 な波長の:^ ^をブ 口ックするノ リアフィルター 6 7か匿されている。
そして、 のシャッター装置 7 1、 7 2、 フイノレター装置 6 6、 スライドガラス 2 1 上の綱 抖 Sの観 i立置を移 MPするステツフ。モータ 5 3、 5 4 (図 2 ) はパソコン 8 0に赚されており、それらの切り換えあるいは位識！御がパソコン 8 0からの に よって行われるようになっており、それらの謝乍に基づいて iff象素子 6 4で 象された糸田 廳 it! Sの慨像がパソコン 8 0に取り込ま^所要の画麵里カ 亍われるように構成さ れている。
図 3
Figure imgf000014_0001
· システムはこのような であるので、パソコン 8 0から の によって、ステップモータ 53、 54を馬働してスライドガラス 21上の糸 ffl^f Sの 立置を I頃に しながら、 シャッター装置 71とシャツ夕一装置 72の一 を高 速で閉じ他方を開くことにより、 τ I RF显 iMの照明 と 厨纖の照明 の何れかを選んでその霍! ^(立置の細 r1l Sを照明し、 «^厨腿カ徵尺されたとき 'には、 フィルター装置 66を馬働して翻 明 原 65'からの の波長を 尺す るようにすることで、糸 ffl ¾ sの τ I RF .ホ錢と翻 厨纖蘼擦 .検 查とを ¾Sに高速に切り換えて行うことができる。
しかも、本発明の匿離竟細键 . システムで用いている全反 ¾Jt^4照、明装置は、 キ寺別なスライドガラスチヱンバー 20あるはスライドガラス 2 1を用いなくても任意の汎 用のものを用いることができ、かつ、光源のレーザ 1 1や匿 の ¾ lレンズ 6 1を移動 さ ないで、 スライドガラスチヱンバー 20あるはスライドガラス 21上の霍藤 鐘対. 毅棚鵠 抖 Sを高速に任意の位置に^^できるので、例えばスライドガラス 21上の糸 ffl包 讓 Sに加える難 ijの鍵あるい 顧を位置毎に異なるように投与することで、同じ培 棚包に対する^^の作用を高速に検出することができる。
以下、図 3の蹰藤細包養擦 .難システムを用いた検出例を説明する。
図 4は、多機肯瞧の 1つであるプロテインキナーゼ Ca (PKCa) と,籠 タン パク （green fluorescent protein ： GFP) との鬲给タンパクを糸 ffl包に遺伝子導入して 議^¾*6^明にて雀摩した所見をネ 勺〖 した図である。 PKCaは、図 4 (a)から
(b) に示すように、脱分繊嗷により綱包質 C内から細鹏 PMへとその局在を移動さ せ、.綱讓 PMにて活性化される。 図 4 (b) の核 Nを中心に抛寸方向へ向かう矢印が P KCaの移動方向であり、 また、図 4の色の濃ヽ音盼は P KCaの ¾¾か レヽ音盼を示す . 。 なお、図 4 (a).s (b) において、上の図力呼面図、下の図力貝腼図である。 この局 在の変化を PKC活性化の廳として、生きた綱包にて GFPの ¾ ^的翻鍍の変化と して纏 勺に PKC活性をモニタ一することか可能である。
藤は、図 4 (a)の上の図から （b)の上の図へのife難の移動として、議寸 では 勺に!^される。 の変匕としては、 m cc
度の減少と細纖 P Mの 艘の増加という励方向の変化として捉えられる。 これに対して、 TIRF躏纖では、同じ職を、図 4 (a)の下の図から （b)の下 の図への の移動として、糸画包の下方の瑚刨莫 PM近傍（ ネエツセント場の生 ずるガラス面より約 10 Onmの範囲） の GFPの ί識関難勺麵鍍の増加として捉え ることになり、 S N比も格段に良くなる。
図 5、図 6はそれぞれ図 4の上の図と下の図に対応する ^厨謹像と T I RF顕 ί 像の変化を示しており、それぞれの図の（a)〜（c ) にわたつて鎌の糸棚包を用い て脱分繊 1撒のためのイオン K+ を入れたときの実 »Jを示す図である。 図 5、図 6の右 のグラフはそれぞれ関'匚« (図の（a) (Dm v )における！^艘の変化を示して おり、同じ職を見ているが、異なる孭啶雄（翻 鎖食出、 T I RF蹰纖鏃 出） により約 1 0倍の変ィ h の違い力 ずることが分かる。
ところで、 カルシウム感受性^ F u r a 2を用いたカルシウム は、 F u r a 2が 3 4 0 nm、 3 8 0 nmの 2 賺で腿されときの難波長である 5 1 0 nm付近の 値の変化の比として孭症される。 図 7に F u r a 2のカルシウム ¾Sと厉 ^波長 に文付る^ (^生を示す。 図中、 Emは： 波長である。すなわち、脱分繊嗷による細. 月納のカルシウム鍵の上昇によりミ 3 8 0 nmで醒された細包内に負荷された F u r a 2の 5 1 0 nm:¾¾波長は減少し、逆に 3 4 0 nmで された F u r a 2の 5 1 0 n m慨波長〖お曽加する。 したがって、糸闺包内カルシウム離の上昇に伴い、 ( 3.4 Ο ηιίι で厉l ^された F u r a 2の 5 1 0 nm麵艘） / ( 3 8 0 nmで J¾ ^された F u r a 2 の 5 1 O nm! ^艘） 直 ίϋ:昇する。 .
図 8は、 この F u r a 2の： 2 皮長にょる麵鍍の変化を図 3の翻 敖 鏡を用レヽて、 また、 G F p ( m mi m 3の τ i R F驟鱲を用 、て ι秒間隔で交 互に很啶した値の翻勺変化を示してある。 図 8中、 TEAOi兌分繊隞のための凝 ij ( テトラェチルアンモニゥム）の投与^:示している。 '
すなわち、 まず、図 3において、パソコン 8 0力ヽらの ί^·によってステップモータ 5 3 . 、 5 4を馬睡してスライドガラス 2 1上の細 Sl^抖 Sの特定の Ϊ ^ [立置を選び、次いで、 シャツ夕一装置 7 1を開き、シャッター装置 7 2は閉じて、 T I RF lf の照明舰を 選び、その観 立置の糸棚^ Sをスライドガラス 2 1中をレーザ光 1 0が多 s^¾i る間に数する ッセント波 E Vで照明し、その號像である P KC a-GF P¾¾ 像を 勿レンズ 6 1とダイク口イツクミラー 6 2を介じて糸 象レンズ 6 3で ί象素 子 6 4上に§(象して »ί象し、パソコン 8 0に取り込む。
次に、 シャッター装置 7 1を閉じ、 シャツ夕"^置 7 2を開くと同時に、 フィルター装 置 6 6を馬 ®¾して 明 原 6 5カヽらの厉 ¾7 5の?皮長を 3 4 0 nmに 尺し、 显厨離獄#勿レンズ 6 1を経てその厉職7 5でその養廳立置の細 ¾|il Sを翻寸照明し、 その!^ (立置からの:^ 7 6を显房»働レンズ 6 1とダイクロイツクミラー 6 2を介し て糸吉像レンズ 6 3で ¾ί象素子 6 4上に fif象し、 3 4 0 nmの厉 で厉 された 5 1 0 n m¾¾波長の 像をパソコン 8 0 (3¾り込む。
次に、今度はシャッター装置 7 1を閉じま、 シャッター装置 7 2を開いたまま、 フィル •夕一装置 6 6を馬働して翻 t ^明光源.6 5からの厉 i¾ 67 5の?皮長を 3 8 0 nmに選 択し、匿騰備レンズ 6 1を経てその ]«¾7 5で の ϋ ^立置の綱 を翻寸照 明し、その I ^(立置からの: ¾7 6を显 働レンズ 6 1とダイクロイツクミラー 6 2 を介して糸吉像レンズ 6 3で ¾ί象素子 6 4上に 象し、 3 8 0 nmの厉 i¾½で厉起された 5 1 0 nm¾¾波長の; ^像をパソコン 8 0に取り込む。
この週呈を特定の Ι¾ί立置に対し 喿り返すことにより、図 8のような御変化力 ら れる。 · '
このように全く異なるパラメ一ター（多機倉隱とカルシウム纖） の穩を孭症する ことにより、細包の^ aこ文付る感度と特異性を上昇させることか可能となる。 なお、図
8では、 カルシウム離が上昇すると PKC aの局在変化力性じているが、 カルシウム濃 度が上昇するからと言つて P K Cひの局在変化力性ずるとは限らず、 _fc|纖は棚包の状 態、投与する翳 |Jの鍵 廳に ί婼する。'
図 9は図 8に文寸応する T I RF m ( a) と、厉 ¾皮長 3 4 0 nmでの 頁 ί孅竟像 (b) と、厉 皮長 3 8 0 nmでの謹 厨纖竟像 ( c ) の変化を示しており、 左が脱分灘 ι»Τる前（r e s t i n g) ,右が脱分嫌 ι徽したとき （s t i mu 1 a t i o n)の難像を示している。 ^^内の変化が Ri:の説明と" ¾していることカ汾か る。 ■ ' ' ' · ' 次に、図 1 0は、他の ¾»jとして T I
Figure imgf000017_0001
できるようにした蹰離竟镧键擦 .纖システムの構成を示す図である。 その構成を以下 に説明する。
図 3の » ^と赚に、図 1、図 2 ( m ιの中央に開口 か けられており、 その下に倒週の蹰纖歙 レンズ 6 1か ¾己置され、その顕» 勿レンズ 6 1の画則 中にはハーフミラー 8 1カ 斗めに配置されている。 そして、ハーフミラ一 8 1を羅 した 3¥¾中に カツトフイノレ夕一 8 2とシャッター装置 8 5と糸吉像レンズ 6 3か ¾己置 され、その線象面に C C D等の蕭象素子 6 4か 置されている。
一方、斜めに配置されたハーフミラー 8 1の反射側にはリレーレンズ 8 4を介してニポ ゥ ¾の^^スキャナ 9 0とそれを照明するレーザ 1 2 0とか 5置されており、共尊 スキャナ 9 0の出力側には樹象レンズ 1 2 9か 置され、その糸 Si象面に CC D等の iff象素 子 1 5 1か ¾己置されている。
'また、顕膨彌レンズ 6 1はピエゾ素子 8 6により 方向位置か W¾T能になって
'いる。 '
さらに、図 1、図 2の全威擺照明装置の ネッセント^^用のレ一ザ光 1 0を するレーザ 1 1と ΛΙ寸プリズム 3の間の光路中にレーザ光 1 0を 斤 . するシャ ッ夕ー装置 7 1か ¾¾され、 また、離 スキャナ 9 0とハーフミラ一 8 1の間には、共 焦 を磨斤 ·邏するシャツタ一装置 8 3か ¾己置されている。
ここで、 シャッター装置 8 3が開いているとき、 レーザ 1 2 0から ¾¾レた 1¾¾とし てめレーザ光は、ニポゥ方式の^ ¾スキャナ 9 0を通り、 リレーレンズ 8 4を通って平 となり、ハーフミラ一 8 1で威寸され、显房纖 レンズ 6 1を介してスライド ガラス 1 1上の纏 ¾4S中の所定 本面上に難される。 レーザ光により され概 した糸 ¾^ Sからの戮は、:颼膨働レンズ 6 1とハーフミラー 8 1とリレーレンズ 8 4を経由して^ スキャナ 9 0に戻ってきて、 ^^スキャナ 9 0中のダイクロイツ クミラー 1 2 4で^!寸されて、糸吉像レンズ 1 2 9を経て iti象素子 1 5 1上に糸棚^ Sの 所定 Ji本面の 像力 られる。
二ボウ: Kの^^スキャナ 9 0は、例えば図 1 1に示すような^である。 図 1 1に おいて、 レーザ 1 2 0からの であるレーザ光 1 2 1は、マイクロレンズディスク 1 2 2に配置された各マイクロレンズ 1 2 3により個別の棘に難され、 ダイクロイツク ミラー 1 2 4を 麦、 ピンホールディスク （二ボウディスクとも言う。 ） 1 2 5に設け られた個々のピンホール 1 2 6を適過し、 リレーレンズ 8 4と §厨 勿レンズ 6 1を経 て細 iH Sの所定 ff本面に難される。
糸 ras^抖 sから した は再び房離 «吻レンズ 6 1とハーフミラー 8 1 (mi 0
) とリレーレンズ 8 4を通り、 ピンホールディスク 1 1 5の個々のピンホール 1 2 6上に される。ィ固々のピンホール 1 1 6を した はダイクロイツクミラー 1 2 4で反 射され、結像レンズ 1 1 9により、 tifig置の C CD等の fif象素子 1 5 1上に; ¾β像を 嫌する。
ここで ^fflされるダイク口イツクミラー 1 2 4は、 m \ 2 1を透過し、糸 fflSI 抖 S からの 光を反射するように 十されている。 マイクロレンズディスク 1 2 2とピンホールディスク 1 2 5は咅附 1 2 7で W¾勺に連 結され、回謹 1 2 8の周りを ^本で回転する。'個々のマイクロレンズ 1 2 3とピンホ一 ル 1 1 6は、 ピンホールディスク 1 1 5上に形成された個々のピンホール 1 2 6からの励 か棚^ Sの 面を ί¾するように配置されて'いる。 また、 ピンホール 1 2 6 が並んでいる平面と、細^ Sの霍！ ^面と、 Si鍵置の jii象素子 1 5 1とが互いに光 勺に搬な隱に配置されているため、籣象素子 1 5 1上には棚 ^ [S.の 勺醒 像、すなわち、 ^^画像力 象される。 '
そして、 のシャツ夕一装置 7 1、 8 3、 8 5、ニポゥ の離点スキャナ 9 0、 吻レンズ 6 1の綱 siiti sに财る物体面 &m ) ί立置を謙 ΐするピエゾ素 子 8 6、 スライドガラス 2 1上の細 S|^ Sの ΪΙ^ (立置を移 |»节するステップモー夕 5 3、 5 4 (図 2 ) はパソコン 8 0に赚されており、それらの切り換えあるいは位識 I胸 がパソコン 8 0からの によって行われるようになつており、それらの ΙΜ乍 ( づぃて 躕象素子 6 4、 1 5 1で籣象された細 ¾fr^ Sの戦像がパソコン 8 0〖 り込まれ、所 要の画11¾里カ ΐわれるように « ^されている。
図 1 0の藏離 棚包観察 · システムはこのような^であるので、パソコン 8 0か らの^ rによって、 ステップモー夕 5 3、 5 4を屠瞻してスライドガラス 2 1上の糸 fflSI式 料 Sの 立置を ί頃に趙しながら、 シャッター装置 7 1及び 8 2とシャツタ一装置 8 3 の'」方を^ iで閉じ他方を開くことにより、 T I RF購離竟の!^ と^^ ΐ» 鏡の 何れかを選んでその！^立置の„ 8を照明し、 ^ mm^ 還尺されたときには、 ピエゾ素子 8 6を芾 I脚して顕離教働レンズ 6 1の 由方向の位置 をビデ才レート して^ «だけ^^面を変えて^ ffliS M内の 像を »(象素 子 1 5 1で撮り、 1腼の 像をパソコン 8.0に取り込んで細 Sの； 像を 3次 »する。
T I RF lMの霍 mを選んだ i¾は、図 3の と同様に、その I»立置の綱包 i¾ Sをスライドガラス 2 1中をレーザ光 1 0が多！^ る間に赃する ネッセ ント波 Ε νで照、明し、その:！ ½像を騮離彭倫レンズ 6 1、ハ一フミラ一8 1、 Mj t! ットフイノレ夕一 8 2を介して糸識レンズ 6 3で躕象素子 6 4上に織象して躕象し、バソコ ン 8 0に取り込む。
このようにして、例えば^^ 纖で綱包内の都腼を躕象し、 T I RF蹰繊 で糸 ras ^傍を i ることで、綱納 /J 官ゃ細頓内と綳蕭を移 S "るタンパク 難団の動きを タンパクを用いて捉えることができる。
なお、 の ¾Wでは、 原のレーザ 11、 120として単波長のものを用い、 戮波長も単波長を想定しているが、 レーザ一コンバインナ一を用いて嫌の厉羅長を ,御 勺にあるいは同時に重ね合わせ、 また、名 皮長【こ対応する異なる波長の； 光像を 備象す.るために、 CCDカメラ （糸識レンズ 63+tii象素子 64、糸識レンズ 129+撮 像素子 151)の前に難: 置を配財るか、 カラー CCDカメラを用いることによ り、マルチカラ一イメージ力最れるようにしてもよい。
以下に、図 10の藏騰侧包霍藤 '猶システムを用いた検出例を ί½明する。ただし、 ¾の 皮 象を同時に衞象可能にしてある J ^である。
図 12は、 グルコーストランスポ一夕の纖を脚勺に表した図である。体内の糸棚包へ の UKり込 置としてグルコーストランスポ一夕 （glucose transpor t e r)がある。鹏ゃ脂!^は、 glucose transporte (Glu t 4)力 ffl包に組み込まれており、図 12に示すように、糸 ffl包内/』 官のゴルジ 本から の果厳により腿される。 ィンスリン朿臌にて綱納ょり綳龌へと多数の G 1 u t 4が 局在変化することにより、糖の取り込み避が上昇する。 このとき、図 12に示すように 、 Glut4とi¾ 3I6タンパク'（GFP) との鬲拾タンパクを遺伝子導入しておき、 ま た、 この G 1 u t 4を謡 ¾する言»¾(本を予め ^fe色素 (a 1 exa 568等)でラベル をじておき、 g lucose t r ansp or t e r言想磁体を糸棚敏に配置しておく 。 ィンスリン棘敫にて細 »Jiへ G lut 4が出現すると、 G F Pの翻艘の上昇と共 に、 . &键でラベルした言 21職体が G 1 ut 4に糸給し、'確かに細^ IJiに G 1 u t 4 か移動したということが、 TIRF繭謹で礴忍できる。 それと共に、再び細包内に戻つ て行く G 1 u t 4の »も^¾¥¾«でK5J能となる。 G 1 u t 4の出て行く場 所と戻っていく場所を I：嫩することか可能である。 その際、 ネッセント波の被する T I RF面で G 1 ut 4とその調|^体との糸給を觸忍、 Ϊ擦することができる。 また、 厨辦竟で fflSIHSr る G 1 114と、糸蘭灘から戻ってくる G 1 u t 4の 霧を例えば離 面 1〜10等で養藤する。 このような概像を連織 象するには、 図 10の装置力 ¾ 用となる。
なお、図 3の装置と、図 10の装置を組み合わせて（例えば、図 3の躪麟倫レンズ 61とダイクロイツクミラ一 62の間にハーフミラ一 81を配 S1~ることにより）、 TI R F显 ¾¾M ^と mi^酉 と^^^！ をィ并用できるようすること もできる。
の; φ¾明の撤の！^^去を用いた躕離竟侧包養擦 . ψ鐘システムを用いると、複 数の細包や生体 に関連したナノスケールの職を低倍率で同時に霍擦 ·ネ鐘するこ とか可能である。 纖の綳包においてその綳納 /J 官、 ffl包内タンパク輸 J¾あるいは細 胞 タンパクの局在変イ^を同時あるいは略同時に · «することにより、形態よ ϋ 、 タンパク纖メカニズム 酉樣活 I1生の検出カ に行えるため、綳胜物 の研 究 蟝スクリーニングに大きく貢南 ることができる。 また、標將器には趙されて いる, のスライドガラスチヱンバーを■することができることから、汎用性は 高い。 また、同一スライドガラス上で数百 の多数の編 を高感度で繊に検出で きることにより、倉 I藤スクリーニング装置として用いることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
〔 1〕 コソ ネッセント^ ¾用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライド ガラスに導入してスライドガラス内で多數励により纖させ Tf 己スライドガラスの 上面に ネッセント波を させ、編己スライドガラスの上面に位 * る糸胡 ^ f をそ の: n/ ネッセント波で照明する^! ^1·照明装置を備えており、
t 己スライドガラスをその面に沿った 2汐 方向に位 ¾ϊするスライドガラス位 腿構を備えており、 ·
tlB^¾| 照、明装置の 11己スライドガ'ラスを貝込む ί立置に、 f記スライドガラスに 対して垂直方向に颼纖彭働レンズか ¾己置され、
編 厨膨彌レンズの織纏 ijにほ、 割素子を介して一方の細中には^ (象 系と Si象素子が、他方の幾中には翻 房纖竟用の！^源か ¾己置されており、 f fl己エバ、ネッセント? ^^用の 原から 1 3スライドガラスのレーザ: ^入部に至る 路中と、 tl^l»^曹離竟用の厉 原と龍己;)^割素子との間にそれぞれ照明光を 斤 . するシャツ夕 ~¾置か 1H置されており、
各々の 1 己シャッター装置め開閉による照明 原の切り換えと、編己スライドガラス位 ^ϋΙϊ機構によるスライドガラス位^ ϋϊとを制御する 脚装置を備えており.、
ti己 $yt ¾置からの ¾¾^rにより t i己スライドガラス位 §¾ϊ機構を制御し 己スライ ドガラス上の綱 權藤 ·検出位置が邀尺され、かつ、擺 啣装置からの により 3シャツ夕一装置各々の開閉力，御され、編己！!^ネッセント^ ^用の光源の照明光 路と龍^ 1^育謹用の厉 原の照明 とが邀 勺に開かれ、 til己スライドガラ ス上の邀尺された細^! ¾擦 ·検 立置の:^ 房 像と 像とが tiatf象素子を介し Tti 卿装置 ( り込まれ、そ 房繊竟像と翻^ ¾ ί謹像とから細減を検出することを纖とする嫌の霍|^去を用いた蹰纖棚包観 察 · システム。
〔 2〕 エバネッセント¾¾用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライド ガラスに導入してスライドガラス内で多 寸により籍皮させ m己スライドガラスの 上面に ネッセント波を数させ、媚己スライドガラスの上面に位 »る綱鍾 をそ の s、ネッセン
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
認己スライドガラスを滴 ίΤした屈折率^液を介してその 面内で移動可能に 寺する Λ寸プリズムと ¾¾1寸プリズムとを備え、 .
編 ΗΛ寸プリズムは齒己 に対して固定され、龍綱寸プリズムは龍 寸プリズム に対し t¾Eレーザ：^亍方向に位 能に配置さ ήており、
籠 3ΛΙ寸プリズムの■己スライドガラスの 寺面と、繭纖プリズムの籠己スライド ガラスの 寺面とは、編 ¾¾寸プリズムの調節位置に わらずに同一高さで同一面になる ように配置され、
t ax寸プリズムと ti¾¾i寸プリズムとの上に 寺される編己スライドガラスを ίΕϊ寺し て、 t 己スライドガラスをその面に沿った 2 方向に位 するスライドガラス位置 灘漏を備えており、
¾|己レーザ光は、肯ilHA寸プリズムを経 Tf 3 寺面から出てその上に されている · 漏 aia折^^液を介してその上に されている龍己スライドガラス内に入って多^: 励により壤皮され、編 プリズムの編己 寺面の上に^ Tされている編 HIS折雜 合液を介し Tf a¾fci寸プリズムの ft己 寺面から繭纖プリズム内に入り、 iy リズムから外部へ腿されるように HB^I ¾照明装置力職され、 .
照明装置の編 ΗΛ寸プリズムと 1 2¾1寸プリズムの間の 1 3スライドガ ラスを む位置に、 スライドガラスに对して垂直方向に躕膨働レンズか觀さ れ、 + ·
mmmmレンズの織纏 uには、；)1 ^割素子を介して一方の幾中には 象 系、と »ί象素子か 他方の¥¾中には^ の JM ^原か己置されており、 儘己 ネッセント^^用の 原から龍 3λ寸プリズムに至る幾中と、 m .
Figure imgf000023_0002
ッ夕" «置か己置されており、
各々の繭己シャツ夕"^置の開閉による照明麵の切り換えと、籠己スライドガラス位 機構によるスライドガラスィ とを带卿する i P装置を備えており、
t l l®置からの により 11己スライドガラス位 を tPし Tf 己スライ ドガラス上の細^ W藤'検出位置が顧され、かつ、編己 $ι脚装置からの により 編 3シャッ夕 置各々の開閉が制御され、 t!H^ ネッセント¾¾用の光源の照明光 路と編 厨 用の 源の照明 ¾とが邀 勺に開かれ、龍己スライドガラ ス上の邀尺された細^ »藤 ·検出位置の^ 厨離竟像と 厨謹像とが f atf象素子を介し Ttil己帘啣装置に取り込まれ、そ ^厨職像と織 鶴 象とから綱 SRisを検出することを纖とするネ徽の 去を用いた显房纖募侧包観 察 · システム。
〔3〕 tta ^割素子がダイクロイツクミラーからなり、編 Β ネッセント波 用の遞から照明光の波長の光と、肅^ の厉 原とから照明光の 波長の光とを、 tiati象素？f則 へ至ることを し、細 から生じた^;のみが 尉象素 則 至るようにしたことを とする請求項 1又は 1 tm^ m を用いた显厨激織棚包 u システム。
〔 4〕 龍纖 纖用の 源と龍 am^割素子との間に厉»皮長を選 択するフィルター装置か 置されており、龍 卿装置からの により離己フィルタ一 装置を する厉¾皮長が還尺されることを mとする請求項 1から 3め何れか' 1 ^ のネ の観^去を用いた 棚键擦 . システム。
〔 5〕 ネッセント¾¾用の駕を備え、その駕からのレーザ光をスライド ガラスに導入してスライドガラス内で多 寸により させ Ttl己スライドガラ の 上面に s'ネッセント波を胜させ、 1 己スライドガラスの上面に位射る綱^をそ の: S、ネッセント波で照明する全 照明装置を備えており、
113スライドガラスをその面に沿った 2汐 方向に位^)！節するスライドガ ス位置調 臓構を備えており、 . . .
繩 3^SI腿照明装置の編己スライドガラスを む位置に、編 3スライドガラスに 対して垂 ϋ¾向に騮膨働レンズ力、¾己置され、 '
編 房纖獄彌レンズの糸^ iti則には、 割素子を介して一方の纖中には、 tl己ェ ノ ネッセント¾ ^用の 原からの照明光の波長の光を Sitするフィルターと第 1の結像 系と第 1の躕象素子とが、他方の舰中には、離 腳厨離竟用の離点スキャナ か爾されており、
謹己撥点スキャナの照明側には離 編用の厉 原が、 また、漏己離点 スキャナの出力側に〖塘 の糸 Si象;^系と第 1の衞象素子がそれぞれ配置されており、 fgSjiAネッセント 用の光源から 1 己スライドガラスのレーザ^入部に至る光 路中と、歲 3離 スキャナと編 ©m^割素子の間の) m中と、龍 割素子と前 言 1の iii象素子の の 中とに、それぞれ照明光あるいは^ ¾を 斤 ·雇するシ ャッ夕一装置か 置されており、 各々の 己シャッター装置の開閉による照明舰と躕象通の切り換えと、編己スライ ドガ'ラス ί立 によるスライドガラス立^ IUと、 Ι Ι»¾»¾ιレンズの: »方 向の位 )¾をする焦 搬冓とを $卿する $卿装置を備えており、
認 |谁喫置からの ^により 11己スライドガラス位 ΛΙΜを 御し Tfiii己スライ 'ドガラス上の綳 穆擦'検出位置が顧され、かつ、龍 卿装置からの により 龍己シャッタ一装置各々の開閉が芾啣され、 ッセント^^用の の照明光 路と 1 己^ 厘謹用の ¾¾¾スキャナの 明 とが邀 勺に開かれ、 m ^¾¾¾«用の^^スキャナの照、明»が開かれたときには、 ^mm u 御し 房 働レンズの; 1^方向の位置を所定のネ鐵位置に識15することにより、 113スライドガラス上の 尺された細^ .検出位置の ^lj^W^像と共焦 ^Mi^像とがそれぞれ tiiam i 象素子、 fia^2» (象素子を介し 装置 に取り込まれ、そ c½¾f¾ ^厨謹像と 竟像とから細滅を検出する ことを mとするネ徽の 去を用いた鎖離竟侧缠膝 .驗システム。
〔 6 ) ネウセント 用の光源を備え、その光源からのレーザ光をスライド ガラスに導入してスライドガラス内で多 S^M寸により響皮させ T I己スライドガラスの 上面に ネッセント波を胜させ、應己スライドガラスの上面に位 "る,镧 ¾をそ の ネッセント波で照明する^！^照明装置を備えており、
tf¾^l 照明装置は、 tl己スライドガラスを した屈折 ¾ ^液を介してその 面内で移動可能に 寺する A t リズムと プリズムとを備え、
己 ½fプリズムは編 3光源に対して @¾され、龍續プリズムは 2^寸プリズム に対し r |3レーザ:^亍方向に位 能に配置されており、
Ελ寸プリズムの 己スライドガ'ラスの 寺面と、 t ¾fcl寸プリズムの t 己スライド ガラスの 寺面とは、認 3¾|寸プリズムの纖 1!位置に係わらずに同一高さで同一面になる ように配置され、
籠 ΞΑΙ寸プリズムと龍¾|寸プリズムとの上に支持される 1 己スライドガラスを ϊ 寺し て、 101己スライドガラスをその面に沿った 2汐 方向に位置調節するスライドガラス位:置 謹機構を備えており、
己レーザ光は、 ΙΐίΕλ寸プリズムを経 TfiJf己 ま寺面から出てその上に ¾Τされている 折 液を介してその上に 寺されている儘己スライドガラス内に入って多 寸により 皮され、 ti3¾寸プリズムの t 己 寺面の上に ¾τされている ¾iais折率整 夜を介し Ttii¾fcl寸プリズムの編己 寺面から t 己腿プリズム内に入り、編 3¾1寸プ リズムから外部へ觸寸されるように t9IB^I«照曰藤置力 «され、
己^ 1»照明装置の tiilSA寸プリズムと儘 寸プリズムの間の儘己スライドガ ラスを む位置に、 11己スライドガラスに対して垂 it^向に 勿レンズか爾さ u - 龍¾ [離鼓輪レンズの織纏 Uには、 嗉子を介して一方の «中には、編己ェ バネッセント^^用の 原からの照明光の波長の光を ISihするフィルターと第 1の織象 系と第 1の籣象素子とが、他方の避中には、離 細房纖竟用の離 スキャナ 力 1Ξ置されており、 -
■己^^スキャナの照、 s 則には^ 用の 原が、 また、 ΙΐΙΞ±^ ス^ャナの出力側に〖嫌 2 «i象; ^系と第 2の »f象素子がそれぞれ配置されており、 觸己 ネッセント^¾用の光源から t a^寸プリズムに至る避中と、誦己離 スキャナと歲 am^f嗉子の間の通中と、 mm i- m \の蕭象素子の 間の 中どに、それぞれ照明光あるいは m¾を靡斤， するシャツ夕一装置か ¾己置 されており、
各々の USシャツター装置の開閉による照明 «と ¾(象«の切り換えと、籠己スライ ドガラス位 g¾«冓による ライドガラス位 ϋΐと、 t »»fif勿レンズの光軸方 向の； (立^ iをする 構とを 御する 脚装置を備えており、 - 認己^ t喫置からの i^rにより 1 己スライドガラス位 ίϊ機構を缶卿し τ| ^己スライ ドガラス上の細 »H擦'検出位置が 尺され、かつ、 ΙΐίΙ 卿装置からの により 編己シャツ夕一装置各々の開閉が制脚ざれ、編 ネッセント ¾¾¾用の の照明光 路と歲己^ 纖竟 の共焦 スキ ナの照明 とが »勺に開かれ、 m^ 点^ 用の スキャナの 明¥¾が開かれたときには、 m ^mm 御し rf li纖獻働レンズの遷方向の位置を所定のネ徽位置に！！节することにより、 t 己スライドガラス上の 尺された糸 ·検出位置の^ ^ΐ Ι^竟像と^! 竟像とがそれぞれ 1513^ 1 象素子、 Ι13^2 象素子を介し TflS Jfp装置 に取り込まれ、そ (^威^ 1 ^厨纖竟像と爾^^房離竟像とから細滅を検出する ことをキ纖とする »の霍! ^去を用いた 竟観包養擦 . システム。
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