WO2006098435A1 - 検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法 - Google Patents

検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法 Download PDF

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Tomoyuki Ozawa
Hiroyuki Kuroki
Nobuhiro Hanafusa
Koretsugu Ogata
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Toppan Printing Co., Ltd.
Shimadzu Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a detection chip used, for example, for antigen detection and DNA detection by an antigen-antibody reaction and a substance detection method using the same.
  • a minute hole or a depression called a well is usually formed and used as a reaction field.
  • the tool was made by etching semiconductors or glass, or by laminating plates with holes.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-027984
  • the present invention has been made in consideration of such circumstances, and in a detection chip having a well-like reaction part, a detection chip that can be easily filled with a reaction solution and that can be easily and highly sensitively detected. And a method for detecting a substance using the same.
  • the detection chip of the present invention is a detection chip having a well-like reaction part on a substrate, wherein the well-like reaction part has a bottom part having a planar shape, and a side part spreading from the bottom part toward the opening. It is characterized by having.
  • the angle formed between the side portion and the bottom portion of the well-like reaction portion is 100 ° to 1 °.
  • the diameter of the opening of the tool-like reaction part is 5 mm or less and the depth is 5 mm or less C, &).
  • the contact angle of the inner surface of the well-like reaction part with pure water may be less than 60 degrees.
  • the substrate may be a resin.
  • a substrate has a plurality of well-like reaction parts each having a planar bottom part and side parts extending from the bottom part toward the opening.
  • the process of injecting the recognition substance into the cell and injecting the detection substance into each well reaction part Characterized in that either the recognition substance or the detection substance is fluorescently labeled, and the presence or absence of a reaction between the recognition substance and the detection substance is detected from the bottom side of the well-like reaction part.
  • the detection substance may be a nucleic acid.
  • the detection chip of the present invention since the side portion of the well-like reaction part spreads from the bottom toward the opening, when filling the well-like reaction part with the reaction solution as a reagent, Can be injected from the side, and it can be avoided that the gas present in the well-like reaction part is replaced or immediately mixed with bubbles in the reaction liquid. Since the bottom surface has a planar shape, even if light emission is detected from the back surface, it is possible to perform simple and highly sensitive detection without light being refracted.
  • the angle formed between the side and the bottom of the well-like reaction part is set within a range of 100 degrees to 140 degrees, so that the reaction liquid can be filled immediately. Since the side surface is inclined from the bottom to the opening in the radial direction of the bottom surface, the light emission area is enlarged, and the backside force light emission analysis can be performed with high sensitivity.
  • the diameter of the opening of the well-like reaction part is within 5 mm and the depth is within 5 mm, a small amount of sample and reagent are required for detection. This reduces the number of strikes and can use valuable samples and reagents without waste.
  • the substrate is made of a resin
  • the substrate is combined with a resin having different properties that are excellent in heat resistance, chemical resistance, molding processability and the like. Can be created.
  • the side portion of the well-like reaction part spreads from the bottom toward the opening, when filling the well-like reaction part with the reaction solution as the reagent, Can be injected from the side, and it can be avoided that the gas present in the well-like reaction part is replaced with a gas or that bubbles are immediately mixed in the reaction solution.
  • the bottom surface of the reaction part has a planar shape when detecting the backside force light emission of the detection chip, it is possible to perform highly sensitive detection without refracting light sources such as ultraviolet rays.
  • the presence or absence of a reaction can be visually confirmed by the fact that the recognition substance is labeled.
  • the detection substance is a nucleic acid
  • detection thereof can be used for diagnosis and treatment of a disease.
  • FIG. 1 is a perspective view showing the shape of a well-like reaction part according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing a detection chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a side view showing the shape of a conventional well.
  • FIG. 4 is a side view showing another shape of a conventional well.
  • FIG. 2 is a diagram showing an embodiment of the present invention, and shows a detection chip 1 to which the present invention is applied.
  • this detection chip 1 a plurality of well-like reaction portions 3 for reacting a sample and a reagent are formed on a substantially rectangular plate-like substrate 2.
  • the substrate 2 is made of plastic or the like and has a substantially rectangular shape as a whole.
  • the vertical and horizontal dimensions of the substrate 2 are such that a predetermined number of the reaction-like reaction parts 3 can be arranged, and further easy during use. It is formed with a thickness that does not bend.
  • the plastic for forming the substrate PC (polycarbonate), PP (polypropylene), cycloolefin-based polymer, fluoropolymer, silicon resin and the like can be used.
  • Producing the substrate 2 using such a synthetic resin is advantageous in terms of heat resistance, chemical resistance, moldability, and the like. Further, two or more types of coagulants may be joined and used.
  • the material can be divided into the upper half and the lower half of the substrate 2. Glass may be used as the material for the substrate 2.
  • a predetermined number of well-like reaction portions 3 are formed on the substrate 2 from the flat upper surface 2a along the thickness direction by, for example, resin molding or resin cutting. As shown in FIGS. 1 and 2, the well-like reaction part 3 has a central axis perpendicular to the upper surface 2a of the substrate 2 and gradually decreases in diameter from the opening 6 opening in the upper surface 2a. It is formed to be smaller.
  • the bottom surface 9A of the bottom 9 of the well-like reaction unit 3 is formed in a planar shape, and is horizontal and parallel to the upper surface 2a of the substrate 2.
  • the side surface 4 of the side portion 10 of the well-like reaction section 3 is inclined at an angle ⁇ (an angle inside the opening formed by the side surface 4 and the bottom surface 9A) within a range of 100 degrees to 140 degrees with respect to the bottom surface 9A.
  • the opening cross-sectional area is increased from the bottom 9 toward the opening 6 (the upper surface 2a of the substrate 2).
  • the opening 6 should have a diameter and inner space depth of 5 mm or less, especially 0. Olmn! Within the range of ⁇ 5mm is preferable.
  • the surface in the well-like reaction part 3 is smooth. This is because the filling of the liquid becomes easy.
  • the substrate 2 when forming the well-like reaction part 3 on the substrate 2, if the substrate 2 is composed of a hard resin such as PC (polycarbonate), a resin cutting method should be used. Is preferred ⁇ . On the other hand, when the substrate 2 is made of a soft material such as PP (polypropylene), it is preferable to form the well-like reaction part 3 using a resin molding method.
  • a hard resin such as PC (polycarbonate)
  • a resin cutting method Is preferred ⁇ .
  • the substrate 2 is made of a soft material such as PP (polypropylene)
  • Such a substrate 2 is subjected to a hydrophilization treatment in order to facilitate filling of the reagent solution into the well-like reaction section 3.
  • the hydrophilization treatment is performed by atmospheric pressure plasma treatment, and the inner surface of the barrel reaction part 3 is set so that the contact angle with pure water is less than 60 degrees, preferably less than 30 degrees.
  • the reaction solution filled in the well-like reaction part 3 is not ball-shaped but spreads uniformly on the bottom surface 9A, so that detection is easy.
  • the reaction liquid does not splash from the well-like reaction part 3, but spreads quickly on the side face 4 and onto the bottom face 9A. Soon after, the bubbles will escape smoothly and no bubbles will be mixed into the reaction solution.
  • the contact angle is measured using a known contact angle meter, and the reaction solution is filled using a dispenser, syringe, syringe, or the like.
  • Hydrophilic treatment is atmospheric pressure plasma treatment
  • the present invention is not limited thereto, and may be performed by corona treatment or coating treatment.
  • a plurality of accommodation holes 13 having a larger diameter than the well-like reaction part 3 are formed on one side in the longitudinal direction of the substrate 2.
  • the accommodation holes 13 serve as accommodation places for injecting reagents, and are formed in a number corresponding to the type of reagent used for detection.
  • a flow path that connects the well-like reaction parts 3 to each other may be provided on the substrate 2.
  • the well-shaped reaction portions 3 are formed not only by the well-shaped reaction portions 3 but also by forming the flow passages connecting the well-shaped reaction portions 3 and the well-shaped reaction portions 3. It is possible to inject the reaction solution into the flow path and allow the reaction to continue in the flow path. As a result, the test time can be shortened and various analyzes can be performed with a small amount of sample and reagent, thereby realizing cost reduction.
  • the resin to be used is divided between at least two parts of the substrate 2, that is, the part with the well-like reaction part 3, the accommodation hole part 13, and the part with the flow path. It can be done.
  • the side portion 10 is expanded from the bottom portion 9 toward the opening portion 6, so that the light emission area is enlarged and highly sensitive detection can be performed.
  • the detection chip 1 of the present invention can be used for detection of antigen-antibody reaction and DNA reaction.
  • a sample containing an antigen as a recognition substance is previously placed in each well-like reaction part 3 of the detection chip 1, and a reagent containing an antibody is added as a detection substance later.
  • the presence or absence of a reaction can be detected by attaching a labeling substance to either the recognition substance or the detection substance.
  • a fluorescent substance such as fluorescence is generally used as the labeling substance.
  • a nucleic acid probe is prepared in advance as a recognition substance in the well-like reaction part 3 of the detection chip 1, and then the DNA extracted from blood isotropic force is used as a specimen substance. DNA can be detected by rediZation. At that time, if a labeling substance is attached to either the detection substance or the recognition substance, the labeling substance Detection is possible by detecting the presence or absence of. In addition, by preparing a plurality of nucleic acids having different sequences as nucleic acid probes that are recognition substances, it is possible to detect the sequence of DNA as a sample substance.
  • the detection chip 1 can also be used for single nucleotide polymorphism (SNP) analysis.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the detection chip 1 when there are a plurality of recognition substances and the detection substance is not fluorescently labeled, one of the recognition substances only needs to be labeled. Thus, in the case of a plurality of recognition substances, it is possible to use the detection chip 1 even when a plurality of recognition substances are prepared and SNP is detected by performing a multi-step reaction.
  • the detection chip 1 can be analyzed in combination with the invader method developed by Third Wave Technologies, Inc. (Madison, Wisconsin, USA). This makes it possible to implement SNP analysis.
  • the recognition substance may be fixed in the well-like reaction unit 3 or may be held without being fixed.
  • the bottom surface 9A force of lmm diameter is also directed toward the opening 6 with a diameter of 3mm by mechanical cutting, and the diameter of the bottom surface 9A is at a gentle angle ⁇ of 130 degrees with respect to the bottom surface 9A.
  • It consists of a side wall 4 that inclines so that it expands outward in the direction, and has a substrate made of 24 well-like reaction parts 3 with a capacity of about 101, and a polycarbonate plate with a thickness of 6 mm.
  • a single detection chip was obtained by bonding the substrate with the receiving hole 13 having a depth of 5 mm. This detection chip was subjected to atmospheric pressure plasma treatment using nitrogen for 3 minutes and measured using a FACE contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.). The contact angle was about 90 degrees before treatment. It became 22 degrees later.
  • a reagent containing fluorescent sample DNA is injected into the receiving hole 13 having a diameter of 6 mm in the above-described polycarbonate detection chip, and the 24 tubular reaction parts 3 having a diameter of 3 mm are injected into the receiving hole 13 having a diameter of 6 mm.
  • a biochip was prepared by dripping different probe DNAs and dried, and hybridization was performed.
  • a 6mm diameter, 6mm deep substrate is formed on a 2mm-thick polycarbonate plate with a substrate 4 on which side 4 is vertical and a well-shaped reaction zone 3 with a capacity of about 10 ⁇ 1.
  • a detection chip was formed by bonding the substrate with the 5 mm receiving hole 13 formed thereon. As described above, this detection chip was subjected to atmospheric pressure plasma treatment using nitrogen for 3 minutes and measured using a FACE contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.). The contact angle was 23 degrees after treatment.
  • a reagent containing fluorescent sample DNA is injected into a receiving hole 13 having a diameter of 6 mm of such a polycarbonate detection chip, and each of the 24 well-like reaction parts 3 has a different probe DNA.
  • a biochip dried by dropping was dried and hybridized.
  • the bottom 9A has a hemispherical shape, the opening 6 has a diameter of 3mm, and the volume of the reaction part 3 is 24mm. Then, the 2mm-thick polycarbonate substrate and the receiving hole 13 with a diameter of 6mm and a depth of 5mm are provided.
  • the 6 mm thick polycarbonate substrate was attached to form one detection chip. This detection chip was subjected to atmospheric pressure plasma treatment using nitrogen for 3 minutes and measured with a FA CE contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.). The contact angle was about 90 degrees before the treatment. After processing, it became 22 degrees.
  • a reagent containing fluorescent sample DNA is injected into the receiving hole 13 having a diameter of 6 mm of the above-described polycarbonate detection chip, and each of the 24 well-like reaction parts 3 having a diameter of 3 mm is different.
  • a biochip was prepared by dripping and drying the probe DNA, and hybridization was performed.
  • Example 1 was superior in all of the operability at the time of dropping the reagent, how to remove bubbles in the well-like reaction part 3, and the detection intensity of fluorescence detection.
  • the detection method colorimetry, chemiluminescence, precipitation, exothermic method, etc. that can be performed only by a method using fluorescence detection can be used.
  • the side part 10 of the well-like reaction part 3 spreads from the bottom part 9 toward the opening part 6, so that the reaction liquid as the reagent is passed through the well-like reaction part.
  • the reaction solution can be injected from the side surface 4, and the gas present in the well-like reaction unit 3 is replaced with a gas or bubbles are mixed into the reaction solution immediately.
  • the bottom surface 9A of the well-like reaction part 3 has a planar shape, so that even if the back surface force is detected, light is not refracted and the detection is simple and highly sensitive. It becomes pretty.
  • the angle between the side portion 10 and the bottom portion 9 of the well-like reaction portion 3 is set within the range of 100 degrees to 140 degrees ⁇ , and the reaction solution is filled immediately.
  • the light emitting area is enlarged because it is tilted toward the outside in the radial direction, so that the light emitted from the back surface of the detection chip 1 can be reflected with high sensitivity.
  • the diameter of the opening 6 of the reaction chamber 3 is 5 mm or less and the depth is 5 mm or less, analysis can be performed quickly and effectively with a very small amount of reagent and sample.
  • reagents and samples are required for detection, costs can be reduced and valuable samples and reagents can be used without waste.
  • the contact angle of the inner surface of the well-like reaction part 3 with pure water is 30 degrees or less, the reaction solution, for example, the probe DNA can be reliably held in the well-like reaction part 3.
  • the substrate 2 is made of resin, the substrate 2 can be formed by combining resins having excellent heat resistance, chemical resistance, molding processability, etc., and different properties. Therefore, handling can be facilitated.
  • the reaction liquid is added to the side face 4 It can be injected as if it were free, and it can be easily replaced with the gas present in the well-like reaction section 3, and it is possible to avoid air bubbles from being mixed into the reaction solution, and the back surface of the detection chip 1
  • the bottom surface 9A of the well-like reaction part 3 has a planar shape, and therefore, highly sensitive detection is possible without refracting light sources such as ultraviolet rays.
  • the presence or absence of reaction can be visually confirmed because the recognition substance is labeled.
  • the detection substance is a nucleic acid, detection thereof can be used for diagnosis and treatment of diseases.

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Abstract

　基板に、ウェル状反応部を有する検出チップにおいて、ウェル状反応部は、平面形状を成す底部と、この底部から開口部に向かって広がる側部とを有する。

Description

明 細 書
検出チップ及びこれを用レ、た物質の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、例えば抗原抗体反応による抗原の検出及び DNAの検出等に用いられ る検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法に関するものである。
本願は、 2005年 3月 18日に出願された特願 2005— 079010号に基づき優先権 を主張し、その内容をここに援用する。
背景技術
[0002] 近年、化学反応や DNA反応、たんぱく質反応などをチップ上にて行う μ -Total Analysis System技術や Lab— on— Chip技術が研究され実現してきており、今ま で大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下のチップ で少量の試薬で行えるようになってきて!/ヽる。
[0003] このようなチップ上には、通常、ゥエルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応 場として用いられる。ゥヱルは、半導体やガラスにエッチングで作られたり、穴のあい た板を積層することで形成されて 、た。
[0004] 例えば、チップ基板と、チップ基板に積層される薄膜部材とを備え、薄膜部材のチ ップ基板への積層状態においてチップ基板と協働して試料を収容するための開孔部 を薄膜部材に設けるマイクロリアクタチップが開示されている（特許文献 1参照)。 特許文献 1：特開 2002— 027984号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 従来のマイクロチップの多くにおいて、半導体やガラスにエッチングで作られたり穴 の開 、た板を積層することでゥエルが作られて 、たため、その形状が図 3に示すよう な側部 17が垂直な垂直穴のゥエル 16や、図 4に示すような、側部 18が傾斜し、底部 19は球面状と成っているすり鉢型のゥヱル 20、あるいはコーン型のゥヱルなどがあつ た。垂直穴形状の場合、試薬充填の際に気泡を巻き込んでしまう。また、気泡の混入 を防ぐためには、充填方法に工夫をする必要があり煩雑である等の問題があった。 例えば、直径 2mn！〜 3mmの垂直穴に試薬の充填を試みると、気泡と試薬との入れ 替わりが起きず、気泡を含んだ状態になる。この状態において、熱による反応を利用 する場合、反応のための熱をかけると気泡の膨張により試薬があふれるなどの不具 合が生じる。
[0006] また、コーン型、すり鉢型形状の場合、垂直穴形状の場合と違って、側面が傾斜し ているため、反応液が側面からつたっていき、ゥエル内に存在する気体と入れ替わり 、気泡の混入は避けることができる。しかし、これらマイクロチップでは、反応の有無を 蛍光などの発光検出などにより検出することが多ぐチップの裏面からの発光検出す る際、この形状により光が屈折してしまい、精度の高い検出が困難である等の問題が あった。具体的には、底部が丸まっているため、光が拡散する。そのため、蛍光の検 出はゥエルの上方力も行わなければならないという制約がある等の問題があった。
[0007] 本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、ゥエル状反応部を有する検出 チップにおいて、反応液の充填が容易で、簡便かつ高感度な検出が可能な検出チ ップ及びこれを用いた物質の検出方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明の検出チップは、基板に、ゥエル状反応部を有する検出チップにおいて、ゥ エル状反応部は、平面形状を成す底部と、この底部から開口部に向力つて広がる側 部とを有することを特徴とする。
[0009] この検出チップにおいて、ゥエル状反応部の側部と底部との成す角度が 100度〜 1
40度の範囲内であってもよい。
[0010] この検出チップにおいて、ゥヱル状反応部の開口部の直径が 5mm以下、深さが 5 mm以下 C、&)っ飞 よ ヽ。
[0011] この検出チップにおいて、ゥエル状反応部の内面の、純水との接触角が 60度未満 であってもよい。
[0012] この検出チップにおいて、基板が、榭脂であってもよい。
[0013] 本発明の物質の検出方法は、基板に、平面形状の底部と該底部から開口部に向 かって広がる側部とを有するゥエル状反応部を複数有した検出チップの各ゥエル状 反応部内に認識物質を注入する工程と、各ゥエル状反応部に検出物質を注入する 工程とを有し、認識物質又は検出物質のいずれかが蛍光標識されており、認識物質 と検出物質との反応の有無をゥエル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有 することを特徴とする。
[0014] この検出方法において、検出物質が核酸であってもよい。
発明の効果
[0015] 本発明の検出チップによれば、ゥエル状反応部の側部が底部から開口部に向かつ て広がっているので、試薬である反応液をゥエル状反応部に充填する際、反応液を 側面からつたわるようにして注入させることができ、ゥエル状反応部内に存在する気 体と入れ替わりやすぐ反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができると 同時に、ゥエル状反応部の底面が平面形状を成しているので、裏面から発光検出し ても、光が屈折してしまうことがなぐ簡便かつ高感度な検出が可能になる。
[0016] また、この検出チップによれば、ゥエル状反応部の側部と底部との成す角度を 100 度〜 140度の範囲内に設定しておくことにより反応液を充填しやすぐまた、底部から 開口部に向力つて底面の径方向外側に側面が傾斜しているため発光面積が拡大し 、裏面力もの発光分析も感度よく行うことができる。
[0017] また、この検出チップによれば、ゥエル状反応部の開口部の直径が 5mm以下で深 さが 5mm以下の範囲内であるので、検出に必要な試料及び試薬が少量で済み、コ ストの削減が図れるとともに貴重な試料及び試薬を無駄なく使用することができる。
[0018] また、この検出チップによれば、ゥエル状反応部の内面の、純水との接触角が 60度 未満なので、反応液である例えばプローブ DNA等を反応部内に確実に保持させる ことができる。
[0019] 本発明の検出方法によれば、基板が榭脂でできているため、耐熱性、耐薬品性、 成形加工性などに優れているだけでなぐ特性の異なる榭脂を組み合わせて基板を 作成することができる。
[0020] また、この検出方法によれば、ゥエル状反応部の側部が底部から開口部に向かつ て広がっているので、試薬である反応液をゥエル状反応部に充填する際、反応液を 側面からつたわるようにして注入させることができ、ゥエル状反応部内に存在する気 体と入れ替わりやすぐ反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができるとと もに、検出チップの裏面力 発光検出する際、反応部の底面が平面形状を成してい るため、紫外線等の光源が屈折することがなぐ高感度な検出が可能となる。また、認 識物質が標識されていることによって、反応の有無を視認することができる。
[0021] また、この検出方法によれば、検出物質が核酸であるので、これを検出することによ り、疾病の診断及び治療のために役立てることができる。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]本発明における一実施形態のゥエル状反応部の形状を示す斜視図である。
[図 2]本発明における一実施形態の検出チップを示す平面図である。
[図 3]従来のゥエルの形状を示す側面図である。
[図 4]従来のゥエルの他の形状を示す側面図である。
符号の説明
[0023] 1 検出チップ 2 基板 3 ゥエル状反応部 6 開口部 9 底部 10 側部
発明を実施するための最良の形態
[0024] 以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図 2は、本発明における一実施形態を示す図であって、本発明を適用した検出チッ プ 1を示す。この検出チップ 1は、略長方形の板状の基板 2に、試料及び試薬を反応 させるためのゥエル状反応部 3が複数形成されている。
[0025] この基板 2は、プラスチック等を用いて作成され、全体的に略長方形状を呈しており 、その縦横寸法はゥエル状反応部 3を所定個数配置可能なものとし、さらに使用中に 容易に折れ曲がることのない厚みをもたせて形成される。ここで、基板 2を形成するた めのプラスチックとしては、 PC (ポリカーボネート）、 PP (ポリプロピレン）、シクロォレフ イン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコン榭脂などを用いることができる。このような合 成榭脂を用いて基板 2を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに有利で ある。さらに、 2種類以上の榭脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの榭脂 の特徴を活力ゝして基板 2を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様 な基板 2とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板 2 の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。なお、基板 2の素材とし てガラスを用いてもよい。 [0026] 基板 2には、その平坦な上面 2aからその厚さ方向に沿って、ゥエル状反応部 3が、 例えば榭脂成型或いは榭脂切削によって所定の数形成されている。このゥエル状反 応部 3は、図 1及び図 2に示すように、基板 2の上面 2aに直交する中心軸線を有し、 上面 2aに開口する開口部 6から下方に向力つて径が徐々に小さくなるように形成され ている。ゥエル状反応部 3の底部 9の底面 9Aは平面形状に形成され、水平であるとと もに基板 2の上面 2aに対して平行になっている。このゥエル状反応部 3の側部 10の 側面 4は、底面 9Aに対して 100度〜 140度の範囲内の角度 Θ (側面 4と底面 9Aとが 成す開口内部側の角度)で傾斜しており、底部 9から開口部 6 (基板 2の上面 2a)に 向かって開口断面積が拡大するように形成されている。この開口部 6は、その直径及 び内部空間の深さが 5mm以下であればよぐ特に 0. Olmn！〜 5mmの範囲内が好 ましい。
これにより、反応液の注入がしゃすぐ反応液内に気泡が混入してしまうことを防ぐ ことができる。又、ゥエル状反応部 3内の表面は、平滑である事が好ましい。液の充填 が容易になるためである。
[0027] また、基板 2にゥエル状反応部 3を形成する際、基板 2が PC (ポリカーボネート）など のような硬質の榭脂で構成されて 、る場合には、榭脂切削法を用いることが好まし ヽ 。一方、基板 2が PP (ポリプロピレン)などの軟質な材料で構成されている場合には、 榭脂成型法を用いてゥエル状反応部 3を形成することが好ま ヽ。
[0028] このような基板 2には、ゥエル状反応部 3内への試液の充填を行いやすくするため に、親水化処理を施工する。ここでは大気圧プラズマ処理により親水化処理を行い、 ゥ ル状反応部 3の内面の、純水との接触角が 60度未満、好ましくは 30度未満とな るように設定する。この範囲内であれば、ゥエル状反応部 3に充填した反応液が、玉 状にならず底面 9Aに均一に広がるため検出を行いやすい。また、ゥエル状反応部 3 内に反応液を充填する際、反応液がゥエル状反応部 3内からはねたりせず、その側 面 4をったわって速やかに底面 9A上に広がるため充填しやすぐさらに、気泡がうま く逃げていき、反応液内に気泡が混入してしまうことがなくなる。
[0029] なお、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定し、反応液の充填には、分 注器、注射器、シリンジ等を用いて充填する。又、親水化処理は大気圧プラズマ処理 に限られず、コロナ処理や、コーティング処理で行っても良い。
[0030] さらに、基板 2の長手方向一側には、ゥエル状反応部 3よりも大径を成す収容穴部 1 3が複数形成されている。この収容穴部 13は、試薬を注入しておく収容場となり、検 出に用いる試薬の種類に応じた数だけ形成されて 、る。
[0031] また、基板 2上にゥエル状反応部 3同士を繋ぐ流路を設けてもよい。またゥエル状反 応部 3同士だけではなぐ上記収容穴部 13及びこれら各ゥエル状反応部 3を接続す る流路を形成することにより、収容穴部 13から送液によって各ゥエル状反応部 3へと 反応液を注入することができるとともに流路の中で連続した反応を行わせることが可 能となる。これにより、検査時間の短縮が図れるとともに微量な試料及び試薬で各種 の分析を行うことができ、コストの削減を実現することができる。
また、榭脂を複数種用いる場合、基板 2における、ゥエル状反応部 3のある部位と、 収容穴部 13と、流路のある部位との少なくとも 2つの部位間で、使用する榭脂を分け ることがでさる。
[0032] なお、基板 2、特に底部 9の底面 9Aの部分には、透明度の高!、素材を選定するこ とが好ましいが、素材が透明でなくても、上記のようなゥエル状反応部 3の形状によれ ば、側部 10が底部 9から開口部 6に向力つて広がっているため発光面積が拡大し、 感度の高い検出を行うことができる。
[0033] 本発明の検出チップ 1は、抗原抗体反応及び DNA反応の検出などに用いることが できる。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め検出チップ 1の各ゥエル状反 応部 3内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗 体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付け ておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が 一般的に用いられる。
[0034] DNAの検出の場合、例えば、予め検出チップ 1のゥエル状反応部 3内に認識物質 として核酸プローブを用意しておき、その後、血液等力 抽出した DNAを検体物質 とし、ノ、イブリダィゼーシヨンさせることにより、 DNAの検出を行うことができる。その際 、検出物質または認識物質のいずれかに標識物質を付けておけば、その標識物質 の有無を検出することにより検出が可能となる。また、認識物質である核酸プローブと して配列の異なる核酸を複数用意することで検体物質としての DNAがどのような配 列であるかを検出することができる。また、検出チップ 1は、一塩基遺伝子多型（SNP )の解析にも用いることができる。なお、認識物質は複数あってもよぐ検出物質が蛍 光標識されていない場合には、認識物質のひとつが標識されていればよい。このよう に、複数の認識物質からなる場合には認識物質を複数種用意し、多段階反応を行つ て SNPを検出する場合にも、検出チップ 1を用いることが可能である。
[0035] 例えば、検出チップ 1をサードウェイブテクノロジーズ， Inc (米国ウィスコンシン州マ ディソン巿）が開発したインベーダー法と組み合わせて解析を行うことができる。これ により SNP解析の具現ィ匕を図ることが可能となる。
[0036] ここで、認識物質はゥエル状反応部 3内に固定してもよいし、固定させずに保持さ せておくだけでもよい。
[0037] 次に、上述した検出チップ 1を実際に試験に用いる場合について、説明する。
[0038] (実施例 1)
厚さ 2mmのポリカーボネートの板に、機械的切削加工により、直径 lmmの底面 9A 力も直径 3mmの開口部 6に向力つて、底面 9Aに対して 130度の緩やかな角度 Θで 、底面 9Aの径方向外側に拡大するようにして傾斜する側面 4からなり、容量が 10 1 程度のゥエル状反応部 3を 24個設けて作成した基板と、厚さ 6mmのポリカーボネー トの板に、直径 6mm、深さ 5mmの収容穴部 13を形成した基板とを貼り合わせて 1枚 の検出チップとした。この検出チップに、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を 3分間 施し、 FACE接触角計 (協和界面科学株式会社製)を用いて測定したところ、処理前 には 90度前後だった接触角が処理後には 22度になった。
[0039] このような上記ポリカーボネート製の検出チップにおける直径 6mmの収容穴部 13 に、蛍光付検体 DN Aの入った試薬を注入し、直径 3mmを成す 24個のゥ ル状反 応部 3にそれぞれ異なったプローブ DNAを滴下して乾燥させたバイオチップを製造 してハイブリダィゼーシヨンを行った。
そして、 24個のゥエル状反応部 3それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温 度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。 [0040] (比較例 1)
厚さ 2mmのポリカーボネートの板に、側面 4が垂直を成し、容量が 10 μ 1程度のゥ エル状反応部 3を形成した基板と、厚さ 6mmのポリカーボネートの板に、直径 6mm、 深さ 5mmの収容穴部 13を形成した基板とを貼り合わせて 1枚の検出チップとした。こ の検出チップに、上記同様、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を 3分間施し、 FAC E接触角計 (協和界面科学株式会社製)を用いて測定したところ、処理前には 90度 前後だった接触角が処理後には 23度になった。
[0041] このような上記ポリカーボネート製の検出チップの直径 6mmの収容穴部 13に、蛍 光付検体 DNAの入った試薬を注入し、 24個のゥエル状反応部 3にそれぞれ異なつ たプローブ DNAを滴下して乾燥させたバイオチップを製造してハイブリダィゼーショ ンを行った。
そして、 24個のゥエル状反応部 3それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温 度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。
[0042] (比較例 2)
底面 9Aが半球状で開口部 6が直径 3mm、容量が 10 1程度のゥヱル状反応部 3 を 24個設けた厚さ 2mmのポリカーボネートの基板と、直径 6mm、深さ 5mmの収容 穴部 13を設けた厚さ 6mmのポリカーボネートの基板とを貼り合わせて 1枚の検出チ ップとした。この検出チップに、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を 3分間施し、 FA CE接触角計 (協和界面科学株式会社製)を用いて測定したところ、処理前には 90 度前後だった接触角が処理後には 22度になった。
[0043] このような上記ポリカーボネート製の検出チップの直径 6mmの収容穴部 13に、蛍 光付検体 DNAの入った試薬を注入し、直径 3mmを成す 24個のゥエル状反応部 3 にそれぞれ異なったプローブ DNAを滴下して乾燥させたバイオチップを製造してハ イブリダィゼーションを行つた。
そして、 24個のゥエル状反応部 3それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温 度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。
[0044] 以上の実験結果は、以下のようになった。
[表 1] 【表 1】
Figure imgf000011_0001
試薬の滴下時の操作性、ゥエル状反応部 3内での気泡の抜け方、蛍光検出の検出 強度の全てにおいて実施例 1は優位であった。
[0045] なお、検出方法には、蛍光検出を用いた方法だけでなぐ比色、化学発光、沈殿、 発熱法等も利用することができる。
[0046] 以上に述べた本実施形態によれば、ゥエル状反応部 3の側部 10が底部 9から開口 部 6に向カゝつて広がっているので、試薬である反応液をゥエル状反応部 3に充填する 際、反応液を側面 4からったわるようにして注入させることができ、ゥエル状反応部 3 内に存在する気体と入れ替わりやすぐ反応液内に気泡が混入してしまうことを避け ることができると同時に、ゥエル状反応部 3の底面 9Aが平面形状を成しているので、 裏面力も発光検出しても、光が屈折してしまうことがなぐ簡便かつ高感度な検出が 可會 になる。
[0047] ゥエル状反応部 3の側部 10と底部 9との成す角度 Θを 100度〜 140度の範囲内に 設定しておくことにより反応液を充填しやすぐまた、側面 4は底面 9Aの径方向外側 に向力つて傾斜しているため発光面積が拡大し、検出チップ 1の裏面力もの発光分 祈ち感度よく行うことができる。
[0048] ゥ ル状反応部 3の開口部 6の直径が 5mm以下で深さが 5mm以下の範囲内であ るので、微量な試薬及び試料で迅速且つ効果的に分析を行うことができる。その上、 検出に必要な試薬及び試料が少なくて済むので、コストを抑えることができるとともに 貴重な試料及び試薬を無駄なく使用することができる。
[0049] ゥエル状反応部 3の内面の、純水との接触角が 30度以下なので、反応液である例 えばプローブ DNA等をゥエル状反応部 3内に確実に保持させることができる。 [0050] 基板 2が榭脂でできて 、るため、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れて 、る だけでなぐ特性の異なる榭脂を組み合わせて基板 2を作成することができるので、 取り扱 、の容易化を図ることができる。
[0051] ゥエル状反応部 3の側部 10が底部 9から開口部 6に向力つて広がっているので、試 薬である反応液をゥエル状反応部 3に充填する際、反応液を側面 4からったわるよう にして注入させることができ、ゥエル状反応部 3内に存在する気体と入れ替わりやすく 、反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができるとともに、検出チップ 1の 裏面から発光検出する際、ゥエル状反応部 3の底面 9Aが平面形状を成して 、るため 、紫外線等の光源が屈折することがなぐ高感度な検出が可能となっている。また、 認識物質が標識されていることによって、反応の有無を視認することができる
[0052] 検出物質が核酸であるので、これを検出することにより、疾病の診断及び治療のた めに役立てることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 基板に、ゥエル状反応部を有する検出チップにおいて、
前記ゥエル状反応部は、平面形状を成す底部と、該底部から開口部に向力つて広 力 ¾側部とを有することを特徴とする検出チップ。
[2] 前記ゥエル状反応部の側部と底部との成す角度が 100度〜 140度の範囲内である ことを特徴とする請求項 1記載の検出チップ。
[3] 前記ゥエル状反応部の前記開口部の直径が 5mm以下、深さが 5mm以下であるこ とを特徴とする請求項 1に記載の検出チップ。
[4] 前記ゥエル状反応部の内面の、純水との接触角が 60度未満であることを特徴とす る請求項 1に記載の検出チップ。
[5] 前記基板が、榭脂であることを特徴とする請求項 1に記載の検出チップ。
[6] 基板に、平面形状の底部と該底部から開口部に向力つて広がる側部とを有するゥ エル状反応部を複数有した検出チップの各ゥエル状反応部内に認識物質を注入す る工程と、
各ゥエル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、
前記認識物質又は前記検出物質の 、ずれかが蛍光標識されており、前記認識物 質と前記検出物質との反応の有無を前記ゥ ル状反応部の底部側力 蛍光検出す る工程を有することを特徴とする物質の検出方法。
[7] 前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項 6記載の物質の検出方法。
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