JP2007263812A - 反応容器 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基板に、凹部状反応部を有し、かつ該反応部内に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を有してなる反応容器であって、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内であることを特徴とする反応容器
【選択図】 図1
Description
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
SNPの検出法としては、インベーダー法、タックマンPCR法をタイピング工程に用いる方法が知られている(特許文献1参照)。
試料中に含まれる微量のDNAを増加させる方法には種々の方法が知られているが、その代表的な方法として、PCR増幅反応が知られている。この方法は、試料中の二本鎖DNAの変性工程(一本鎖に解離)、アニーリング工程(一本鎖DNAとプライマーを結合)、伸長工程(プライマーからDNAを合成)から構成される3工程を1サイクルとし、このサイクルを繰り返して試料中のDNAを増加させる方法である。変性工程は約95℃、アニーリング工程は50〜60℃、伸長工程は60〜80℃で行われる。PCR増幅反応はこの熱サイクルを繰り返すことにより行われる。1サイクルに要する時間はせいぜい数分程度であり、このサイクルを繰り返して必要量のDNAを得る。
なお、PCR反応の前には前処理として95℃で数分〜5、6分加熱することもある。
また、これらの反応は約63℃で数十分〜4時間程度インキュベートすることにより行われる。
また、チップ上に設けたウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いることも知られている。ウェルは、半導体やガラスにエッチングで設けたり、穴のあいた板を積層することで形成されていた。
ウェルを用いる場合、試薬を基板上に固定する必要がなく、またPCR反応などにも適用できる。
また、内部に流路を設け、両端に開口部を有する、PCR反応用の装置も知られている(特許文献5参照)。
ここで、前述のウェルタイプのような、反応試薬が供給された凹部の開口部が開放状態の場合、反応試薬が外部に露出していることにより反応時の加熱により反応試薬が蒸発するのを防ぐため、反応液よりも比重の低いミネラルオイルなどの不揮発性液体を重層する手法がある。
また、化学分析分野や医学分野、農学分野において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床試験を行う反応容器として、解析に必要な各反応工程が1つの反応容器上で完結するような試薬キットが提供されている。ここで、試薬調製から反応、検出までを自動で連続的に行うために、反応場を開口部を有する凹部で形成し、反応液に不揮発性液体を重層する上述した手法が利用されている。
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内であることを特徴とする反応容器である。
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内であることを特徴とする反応方法である。
また、後述の反応液、液状蒸発防止体との接触角が前記範囲に入るようなものを選定することが重要である。
特にポリプロピレン系の樹脂を用いることが好ましい。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
この範囲より薄いと強度が低下し、この範囲より厚いと取り扱い性等の点で好ましくない。
凹形状の反応部の開口径は0.1〜3mmの範囲内、深さが0.1〜2.5mm範囲内であることが好ましい。前述のようにライフサイエンス分野では、微量試薬を用いて厳密な温度制御を行うことが多く、効率的に反応を行うためには、前記範囲内であることが好ましい。
また、反応部内には予め、反応に必要な試薬を収容しておいても良い。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が半球形状、U字形状、三角形状、四角形状になっているものでもかまわない。また、開口部が多角形で断面が台形形状でもかまわない。
保護フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。反応部内に予め試薬を収容しておく場合、ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
また、剥離する際も、接点が開口部を除いた基材全体ではなく、凸部上だけであるので剥離が容易にできる。
また、凸部を設けることにより反応部の容量を増やしてもよい。その場合、反応部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図8(b)に示すように2段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける2段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
また、凸部同士を凸部と同じ高さで連結させても良い。そのようにすることで、剥離する際に、引っ掛かりがなくスムーズに剥離ができる。
なお、溶液が水系の場合、表面処理は親水処理であることが好ましい。具体的には水との接触角が70°以下、好ましくは40°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
反応液としては、目的の反応を行うために必要なものを用いればよい。
そのため、反応液上には液状の蒸発防止体を有する。
微小容積の反応容器内に供給された内容液において、反応加熱による蒸発損失を防止し安定在籍させるためには、効率良く内容液表面を蒸発防止体で覆う必要がある。
液状蒸発防止体は、凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低いものである必要がある。
また、液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内である必要がある。
容器内壁に対する蒸発防止体の接触角が低いほど、蒸発防止体が容器内壁に広がりやすいため、少量で内容液表面を効率よく覆うことができる。蒸発防止体の接触角が限りなく0°に近づくと、内容液を覆いながら容器内壁に在籍するが、蒸発防止体が容器内壁をつたい易くなり蒸発防止体を容器凹部に留めるのが困難になる。
試薬収容部は、複数設けることもでき、試薬収容部を複数設ける場合、大きさが異なっていても良い。試薬収容部の数は、目的に応じて適宜設定できる。
また、試薬収容部は、予め一つの試薬を入れておき、後から別の試薬を入れ、混合させる混合場として用いることもできる。
窪みを有する試薬収容部の場合、窪みを除いた部分の底部が半球状になっていれば良い。窪みの底部も半球状になっていることが好ましい。微量試薬の液滴は収容されるとき、玉状で供給されるとすると、ちょうど試薬の液滴が半球状の窪みにはまり保持される構造になる。また、試薬の量が窪みの容量より大きい場合でも、半球状であれば、気泡の混入なく、試薬の一部が窪みに入り込み保持される。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が三角形状、四角形状、台形形状になっているものでもかまわない。
そのため、反応に用いる試薬などは多くても数百μl程度になり、前述の範囲内であることが好ましい。また、数百μl以上の試薬を用いる場合は試薬収容部を2つ以上用いてもよい。
試薬の量は、数百nl程度の極微量〜数百μl程度であり、また一般的な分注針や分注チップの径は数十μm〜数mm程度である、そのため、分注適性、目的容量を考慮すると、試薬収容部の開口径が1〜50mmの範囲内であることが好ましい。
蓋材としてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、試薬収容部内の試薬への熱的な影響を低減することができる。
また、凸部を設けることにより収容部の容量を増やしてもよい。その場合、収容部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図8(b)に示すように2段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける2段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
なお、溶液が水系の場合、表面処理は親水処理であることが好ましい。具体的には水との接触角が70°以下、好ましくは40°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
第二反応部としては、前述の凹形状の反応部と同様のものであっても良いし、開口部を有する空洞形状の反応部であってもよい。
この時、溝部の幅、高さはそれぞれ1mm〜5mmの範囲内であることが好ましい。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
また、底部形成用フィルムは、一部溝部へ食い込む形状であれば好ましい。基材と底部形成用フィルムの間に隙間が生じず、試薬や検査対象の漏れがないものとなるからである。
具体的には、凹形状反応部に、後述の反応に用いる反応液を入れ、その上に前述の液状蒸発防止体を配し、反応を行う。なお、第二反応部を有する場合は、第二反応部でも同様に液状蒸発防止体を用いて反応を行っても良い。
この場合、核酸プローブ、検体DNAが反応液となる。
なお、ここでいう遺伝子とはDNA、RNAなどのことをいう。また遺伝子増幅反応方法としては前記PCR法、LAMP法などがある。
例えば、インベーダー・アッセイ法(サードウェイブテクノロジーズ,Inc(米国ウィスコンシン州マディソン市)を用いても良い。これによりSNP解析の具現化を図ることが可能となる。
また、この場合、上記反応に用いる試薬を反応液とする。
以下、図面に基づき一例について説明する。図2に示したものは、反応容器1の断面図である。図2において、反応容器1は、基材2に凹部状反応部3が形成されてなる。凹部状反応部3の開口径はφ3mm、底径はφ1mm、深さ1.8mm、底面5と側面との成す角45.3°の多角形断面形状である。反応容器1(基材2)の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部3を形成した。凹部状反応部3の内壁4および底面5には、O2を3%含むHeガスを用いて、大気圧近傍下にてプラズマ処理を施すことによって、水系の反応液との親和性を高めた。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。5箇所測定した結果、得られた値の平均値は61.3°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
この凹部状反応部3の開口部より、調製された水系の反応液6を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体7を配置した。この蒸発防止体6として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが7.7°、比重0.97g/ml、粘度52mPa・sであるシリコンオイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して75℃で1時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部3の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を100%として、加熱後の残量を算出した。
上述した実施例1において、使用した蒸発防止体7以外は同様にして、蒸発防止体7として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが12.1°、比重0.84g/ml、粘度24mPa・sであるミネラルオイルを使用した。
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例1では初期配置量の約99%が残存していた。
一方、比較例1では、加熱1時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の76%しか残存していなかった。
図2に示したものは、反応容器1の断面図である。図2において、反応容器1は、基材2に凹部状反応部3が形成されてなる。凹部状反応部3の開口径はφ3mm、底径はφ1mm、深さ1.8mm、底面5と側面との成す角45.3°の多角形断面形状である。反応容器1(基材2)の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部3を形成した。凹部状反応部内壁4および底面5には、O2を3%含むHeガスを用いて、大気圧近傍下にてプラズマ処理を施すことによって、水系の反応液との親和性を高めた。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。5箇所測定した結果、得られた値の平均値は58.2°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
この凹部状反応部3の開口部より、調製された水系の反応液6を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体7を配置した。この蒸発防止体7として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが8.7°、比重1.06g/ml、粘度204mPa・sであるシリコンオイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して75℃で1時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部3の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を100%として、加熱後の残量を算出した。
上述した実施例2において、使用した蒸発防止体7以外は同様にして、蒸発防止体7として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが15.2°、比重0.99g/ml、粘度213mPa・sであるシリコンオイルを使用した。
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例2では初期配置量の約98%が残存していた。
一方、比較例2では、反応加熱15分経過時点で反応液内部および表面に多数の気泡が発生し、蒸発防止体であるシリコンオイルにより覆われた反応液表面のシリコンオイル膜を破裂させ、反応液表面を外部に露出させた。加熱1時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の47%しか残存していなかった。
図2に示したものは、反応容器1の断面図である。図2において、反応容器1は、基材2に凹部状反応部3が形成されてなる。凹部状反応部2の開口径はφ3mm、底径はφ1mm、深さ1.8mm、底面と側面との成す角45.3°の多角形断面形状である。反応容器1(基材2)の材質はポリプロピレン樹脂であり、射出成形により凹部状反応部3を形成した。凹部状反応部内壁4および底面5には、水系の反応液との親和性を高めるための表面処理は施さない。凹部状反応部内壁の接触角測定は困難であったため、凹部状反応部内壁の表面状態と同様の表面状態である同材質平面を用いて測定した値を接触角とした。5箇所測定した結果、得られた値の平均値は90.3°であった。なお、用いた測定装置はFACE自動固体エナジー解析装置CA−VE型である。
この凹部状反応部3の開口部より、調製された水系の反応液6を分注し気泡をかまないように配置し、この反応液界面に接触して、蒸発防止体7を配置した。この蒸発防止体7として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが7.6°、比重1.89g/ml、粘度56 mPa・sであるフッ素オイルを使用した。この反応容器を、ペルチェ素子による温度制御装置を使用して75℃で1時間加熱し、反応させた。蒸発防止効果の確認として、凹部状反応部3の真上から写真撮影し、開口部面積のうち内容液が占める面積から加熱前を100%として、加熱後の残量を算出した。
上述した実施例3において、使用した蒸発防止体7以外は同様にして、蒸発防止体7として、ポリプロピレン基材に対する接触角θが7.7°、比重0.97g/ml、粘度52mPa・sであるシリコンオイルを使用した。
上記の加熱反応後、反応容器中の反応液の残量を測定した結果、実施例3では初期配置量の100%が残存していた。
一方、比較例3では、反応加熱15分経過時点で反応液の減少が観察され、加熱1時間経過後の反応液残量を測定した結果、初期配置量の53%しか残存していなかった。
2 基材
3 凹部状反応部
4 凹部状反応部内壁
5 凹部状反応部底面
6 反応液
7 液状蒸発防止体
8 試薬収容部
9 第二反応部
9a 貫通孔開口部突出部
9b 底部形成用フィルム
10 流路
Claims (14)
- 基板に、凹部状反応部を有し、かつ該反応部内に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を有してなる反応容器であって、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内であることを特徴とする反応容器。 - 前記凹部状反応部の最大開口径が0.1〜3mmの範囲内であり、かつ最大深さが0.1〜2.5mmの範囲内であることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項1又は2に記載の反応容器。
- 前記液状蒸発防止体の20℃における粘度が、100mPa・s以上であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の反応容器。
- 前記液状蒸発防止体の沸点が180℃以上であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の反応容器。
- 前記液状蒸発防止体がミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の反応容器。
- 同一基板に、凹部状試薬収容部を有することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の反応容器。
- さらに第二反応部を備えることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の反応容器。
- 基板に凹部状反応部を有する反応容器の凹部状反応部に反応溶液及び反応溶液上に液状蒸発防止体を供給する工程、該凹部状反応部内で反応を行う工程を有する反応方法であって、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部の内壁を形成する物質との接触角が、該反応溶液と凹部状反応部を形成する物質との接触角より低く、
該液状蒸発防止体と凹部状反応部を形成する物質との接触角が、1〜9°の範囲内であることを特徴とする反応方法。 - 前記凹部状反応部の最大開口径が0.1〜3mmの範囲内であり、かつ最大深さが0.1〜2.5mmの範囲内であることを特徴とする請求項9記載の反応方法。
- 前記液状蒸発防止体が不揮発性液体であることを特徴とする請求項9又は10に記載の反応方法。
- 前記液状蒸発防止体の20℃における粘度が、100mPa・s以上であることを特徴とする請求項9〜11のいずれかに記載の反応方法。
- 前記液状蒸発防止体の沸点が180℃以上であることを特徴とする請求項9〜12のいずれかに記載の反応方法。
- 前記液状蒸発防止体がミネラルオイル、シリコンオイル又はフッ素油のいずれかであることを特徴とする請求項9〜13のいずれかに記載の反応方法。
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