WO2006062434A1 - Modified 5'- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations - Google Patents

Modified 5'- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations Download PDF

Info

Publication number
WO2006062434A1
WO2006062434A1 PCT/RU2005/000249 RU2005000249W WO2006062434A1 WO 2006062434 A1 WO2006062434 A1 WO 2006062434A1 RU 2005000249 W RU2005000249 W RU 2005000249W WO 2006062434 A1 WO2006062434 A1 WO 2006062434A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
azt
azido
groups
azidothymidine
phosphonate
Prior art date
Application number
PCT/RU2005/000249
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006062434A8 (fr
Inventor
Marina Konstantinovna Kukhanova
Anastasiya Lvovna Khandajinskaya
Maxim Vladimirovich Yasko
Elena Anatolievna Shirokova
Alexander Valerievich Shipitsyn
Andrey Georgievich Pokrovsky
Original Assignee
Kukhanova Marina Konstantinovn
Khankajinskaya Anastasiya Lvov
Maxim Vladimirovich Yasko
Elena Anatolievna Shirokova
Shipitsyn Alexander Valerievic
Andrey Georgievich Pokrovsky
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kukhanova Marina Konstantinovn, Khankajinskaya Anastasiya Lvov, Maxim Vladimirovich Yasko, Elena Anatolievna Shirokova, Shipitsyn Alexander Valerievic, Andrey Georgievich Pokrovsky filed Critical Kukhanova Marina Konstantinovn
Priority to EP05763842.1A priority Critical patent/EP1829885B1/en
Priority to CN2005800467450A priority patent/CN101115765B/zh
Priority to KR1020077013688A priority patent/KR101323698B1/ko
Priority to ES05763842.1T priority patent/ES2550136T3/es
Priority to US11/720,250 priority patent/US7999099B2/en
Publication of WO2006062434A1 publication Critical patent/WO2006062434A1/ru
Publication of WO2006062434A8 publication Critical patent/WO2006062434A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • Modified AZT 5'-phosphonates are potential antiviral drugs.
  • the invention relates to the field of molecular biology, virology and medicine, namely, to new derivatives of nucleosides, namely to substituted 5'-phosphates of AZT. These compounds have an antiviral effect and can be used to suppress the reproduction of the human immunodeficiency virus.
  • nucleoside and non-nucleoside inhibitors are distinguished.
  • nucleoside derivatives the most commonly used are Z'-azido-Z'-deoxythymidine (AZT, Zidovudine®), 2 ', 3'-didesoxycycididine (ddC, Zalcitabine®), 2', 3'-didezoxyhydroxyinosine (ddl, Didanosine® ), 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydro-thymidine (d4T, Stavudin®) and 2 ', 3'-dideoxy-3'-thiacytidine (3TC, Lamivudin®) [De ⁇ concession batterqu, E., 2002 .New development and ip apti-ShV scheoteraru. BIOSHIT. Biorhus. Assa, 1587 258-275].
  • N-phosphonate AZT (Nikavir®), approved in Russia for the treatment of AIDS, is less toxic than AZT [Iptracacellular metabolism and appharmacophosphate 5f-hydrophosphate ap 3f-azido-2 ', 3diridephide Of Z'-azido-g ⁇ Z'-dideohuhutididpe. Aptiviral Resource 63 (2004), 107-113].
  • the action of Nikavir is based on the ability to release AZT, which after intracellular conversion to AZT-5'-triphosphate inhibits HIV replication.
  • Nikavir According to pharmacokinetic studies, the clinical benefits of Nikavir are explained by a slower and smoother increase in the concentration of AZT in the blood than when taking AZT itself; wherein C max AZT from Nikavir ⁇ C max AZT from Zidovudine, and T w AZT from Nikavir> T 1/2 AZT from Zidovudin [Y. Skolov et al. / Apptiviral Resecarch 63 (2004) 107-113].
  • the toxicity of Nikavir remains quite high. Another disadvantage is the emergence of resistance to Nikavir.
  • This invention solves the problem of creating low toxic derivatives of AZT, with the ability to penetrate into the cell and gradually release the active nucleoside (AZT). This will maintain an intracellular concentration of the drug sufficient for the manifestation of a therapeutic effect for a long time and, thus, reduce a single dose of the drug and / or frequency of administration and reduce side effects.
  • R alkyl groups, including those containing halogen atoms, carboxy, hydroxy, alkoxy and acyloxy groups, as well as substituted amino carbonyl groups.
  • the new compounds inhibit the reproduction of type 1 human immunodeficiency virus in a culture of transplantable MT-4 lymphocytes, protect the cells from the cytopathogenic effect of the virus, and do not show toxicity to host cells up to extremely high concentrations (Table 1). From the obtained experimental data, it can be seen that the tested compounds, without exerting toxic effects on cells at effective concentrations (50% toxic doses are 2-4 orders of magnitude higher than 50% inhibitory doses), inhibit the reproduction of type 1 immunodeficiency virus to a high degree in MT-4 cell culture.
  • the therapeutic indices of the studied compounds (IS), defined as the ratio of the toxic dose of the drug to its effective dose, are comparable to those for AZT N-phosphonate. Virological tests are carried out in accordance with the previously described protocols.
  • Target phosphonates were prepared as follows:
  • the target fractions were evaporated, the residue was diluted with water (3 ml) and further purified on a LiChhorr RP-18 column, eluting with water.
  • the solution was applied to a column with DEAE cellulose in an HCO 3 "form, eluting with a linear gradient of NH 4 HCO 3 (0—" -15 mM, pH 7.5).
  • Target fractions were evaporated and re-evaporated with water (3 times 5 ml) , the residue was diluted with water (3 ml) and chromatographed on a column of LiChroper RP-18, eluting with water, and the target fraction was lyophilized to obtain 238 mg (66%) of phosphonate (Ic).
  • ⁇ '-Methoxymethylphosphonyl-3'-azido-3'-deoxythymidine was synthesized from 3'-azido-3'-deoxythymidine and methoxymethylphosphonic acid according to the method described for compound Ic.
  • a study of the inhibition of HIV reproduction involves culturing primary infected lymphoid cells of the MT-4 line in the presence of test compounds, the final concentrations of which in the culture medium are 0.001-100 ⁇ g / ml, over a passage of 4 days.
  • Inhibition of HIV reproduction in a culture of sensitive cells is determined by a decrease in the accumulation of virus-specific protein p24 (according to enzyme-linked immunosorbent assay), as well as an increase in cell viability in the presence of the drug compared to the control determined on the 4th day of cultivation when stained with 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT )
  • the cytotoxicity of the drug is assessed by adding dilutions in serum-free RPMI-1640 medium to the MT-4 cell suspension, placed in the wells of a 96-night plate (Cell-Cult, Epglapd), to final concentrations of 0.001-100 ⁇ g / ml (three wells each) per dose), followed by cultivation at 37 ° C for 4 days.
  • the inoculum concentration is 0.5 x 10 6 cell particles per milliliter.
  • Cells are used as control without the addition of a drug, instead of which the same amount of serum free medium is added. Cell viability is counted on the 4th day of cultivation using the formazan method (intravital staining of MTT cells).
  • the toxicity of various doses of the drug is determined by the viability of the cells relative to the control, a dose-dependent curve is constructed from the obtained results, and the concentration is determined that reduces cell viability by 50% (CD 50 ).
  • the studied compounds do not have toxic effects on MT-4 cells in effective concentrations. It should also be noted that 50% of toxic doses are 5-6 orders of magnitude higher than those effective for HIV-1 doses (Table 1).
  • the therapeutic index, or selectivity index (IS) is considered as the ratio of the 50% toxic concentration of the compound to its 50% effective dose (the results are presented in table 1). Based on these quantitative indicators of inhibition, one can judge the effectiveness of the antiviral effect of the claimed compounds, which consists in a high degree of suppression of HIV-1 replication in MT-4 cell culture, comparable to the efficiency of Nikavir.
  • a dog weighing 12 kg was injected with 250 mg of the test substance orally (mixed with cottage cheese).
  • blood samples (1 ml) were taken from the femoral vein.
  • Samples were centrifuged (10 minutes, 2000 rpm), the supernatant was separated. Aliquots (0.25 ml) were taken from the supernatant, oxetane (0.25 ⁇ g as an internal standard) and methanol (0.75 ml) were added.
  • the resulting mixture was centrifuged for 3 minutes at 5000 rpm.
  • the supernatant was separated and evaporated in a stream of air at 40 0 C, water (1 ml) was added to the residue.
  • the claimed compounds have low toxicity, are able to effectively inhibit the reproduction of type 1 immunodeficiency virus in a MT-4 cell culture and generate AZT in mammals, providing a smooth increase in its concentration in the blood.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Модифицированные 5'-фocфoнaты АЗТ - потенциальные противовирусные препараты.
Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно, к новым производным нуклеозидов, а именно, к замещенным 5'-фocфoнaтaм АЗТ. Эти соединения обладают противовирусным действием и могут быть применены для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ. Среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются З'-азидо-З'-дезокситимидин (АЗТ, Зидовудин®), 2',3'-дидeзoкcицитидин (ddС, Зальцитабин®), 2',3'-дидeз- оксиинозин (ddl, Диданозин®), 2',3'-дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин (d4T, Ставудин®) и 2',3'-дидeзoкcи-3'-тиaцитидин (3TC, Ламивудин®) [De Сlеrсq, E., 2002. Nеw dеvеlорmепt iп апti-ШV сhеmоthеrару. Вiосhiт. Вiорhуs. Асtа, 1587 258-275].
Механизм действия указанных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилиро- ванию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транс- криптазой ВИЧ. Высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Grоsсhеl, В., Сiпаtl, J. H., and Cinatl J. Jr., 1997. Virаl апd сеllulаr fасtоrs fоr rеsistапсе аgаiпst апtirеtrоvirаl аgепts. Iпtеrvirоlоgу, 40, 400-407; Апtопеlli, G, Тurriziапi, О., Vеrri, А., Nаrсisо, Р., Fеrгi, F., D'Оffizi, G., апd Diапziпi, F., 1996. Lопg-tеrm ехроsurе tо zidоvudiпе аffесts iп vitrо апd iп vivо thе еffiсiепсу оf thуmidiпе кiпаsе. AIDS Rеs Нит Rеtrоvir., 12, 223-228], и, следовательно, к необходимости смены препарата. К тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.
Следствиями токсичности АЗТ являются подавление деятельности клеток спинного мозга, нарушения функции печени и миопатия [Сhаriоt, Р., Drоgоu, L, De Lасrоiх-Szmапiа, L, Еliеzеr-Vапеrоt, M. С, Сhаzаud, В., Lоmbеs, А., Sсhаеffеr, А., апd Zаfrапi, E.S., 1999. Zidоvudiпе-iпduсеd mitосhопdriаl disоrdеr with mаssivе livеr stеапоsis, mуораthу, lасtiс асidоsis, апd mitосhопdiаl DNA dе- рlеtiоп. J. Нераtоl. 30, 156-160; Кеllаm, Р., Воuсhеr, C.A., апd Lаrdеr, B.A., 1992. Fifth mutаtiопs iп ШV rеvеrsе trапsсriрtаsе сопtributеs tо thе dеvеlорmепt оf high lеvеl rеsistапсе tо zidоvudiпе. Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. U.S.А, 89, 1934-1938; Rеп, J., Еsпоuf, R.M., Норkiпs, A.L., Jопеs, E. Y., Кirbу, L, Кееliпg, J., Rоss, C.K., Lаrdеr, В. А., Stuаrt, D. L, апd Stаmmеrs, D. К., 1998. З'-Аzidо-З'-dеохуthуmidiпе drug rеsistапсе mutаtiопs iп FПV-1 rеvеrsе trапsсriрtаsе сап iпduсе lопg rапgе сопfоrmаtiопаl сhапgеs. Рrос. Nаtl. Асаd. ScL U.S.А, 95, 9518-9523]. Быстрое выведение АЗТ из организма требует частого приема препарата. Кроме того, при длительном применении АЗТ достаточно быстро вырабатываются резистентные штаммы вируса и лечение теряет эффективность. Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, АЗТ по-прежнему остается наиболее широко применяемым анти-ВИЧ препаратом.
Известен Н-фосфонат АЗТ (Никавир®), одобренный в России для терапии СПИД, менее токсичен, чем АЗТ [Iпtrасеllulаr mеtаbоlism апd рhаrmа- соkiпеtiсs оf 5'-hydroheпphosphoпate оf 3'-azido-2',3'-dideoxythymidiпe, а рrоdrug оf З'-аzidо-г^З'-didеохуthутidiпе. Апtivirаl Rеsеrсh 63 (2004), 107-113] . Действие Никавира основано на способности высвобождать АЗТ, который после внутриклеточного превращения в AЗT-5'-тpифocфaт ингибирует репликацию ВИЧ. По данным фармакокинетических исследований клинические преимущества Никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации АЗТ в крови, чем при приеме собственно АЗТ; при этом Cмaкc АЗТ из Никавира < Cmкc АЗТ из Зидовудина, а Tш АЗТ из Никавира > T1/2 АЗТ из Зидо- вудина [Y. Skоblоv еt аl./Апtivirаl Rеsеаrсh 63 (2004) 107-113]. Тем не менее, токсичность Никавира остается достаточно высокой. Другим недостатком является возникновение резистентности к Никавиру.
Раскрытие изобретения
Данным изобретением решена задача создания низко токсичных производных АЗТ, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид (АЗТ). Это позволит поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата достаточную для проявления терапевтического действия в течение длительного времени и, таким образом, снизить разовую дозу препарата и/или частоту приема и уменьшить побочные эффекты.
Задача решена созданием соединений, 5'-фocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcи- тимидин, общей формулы:
Figure imgf000005_0001
R = алкильные группы, в том числе содержащие атомы галогенов, кар- бокси-, гидрокси-, алкокси- и ацилокси- группы, а также замещенные амино- карбонильные группы.
Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре перевиваемых лимфоцитов MT-4, обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (Табл. 1). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50%-е токсические дозы на 2-4 порядка превышают 50%-е ингибиру- ющие дозы) в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток MT-4. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для Н-фосфоната АЗТ. Вирусологические тесты проведены в соотвествии с описанными ранее протоколами.
Показано, что заявляемые фосфонаты АЗТ в организме собак медленно высвобождают АЗТ, таким образом, представляя собой, латентные формы АЗТ (Пример 7, табл. 2). Исследования показывают, что для всех заявляемых фосфонатов единственным продуктом метаболизма, детектируемым в крови животных, является АЗТ. Фармакокинетические параметры, приведенные в тaбл.2, были определены по генерированному АЗТ и зависели от структуры фосфоната.
Лучшие варианты осуществления изобретения
Целевые фосфонаты получали по следующей схеме:
Figure imgf000007_0001
где X = Cl или ОН Ia: R=ClCH2
Ib: R=ICH2
Ic: R=HOCH2
Id: R-CH3OCH2
Ie: R=H2NC(O)
Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.
Пример 1.
5'-Xлopмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcитимидин (Ia).
К раствору З'-азидо-З'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в триэтилфос- фате (10 мл), охлажденному до O0C, добавляли хлорметилфосфонилдихлорид (0,92 мл, 9 ммоль). Смесь перемешивали 18 часов при 180C, разбавляли охлажденной смесью пиридина (10 мл) и воды (10 мл), перемешивали 30 минут и выливали в воду (700 мл). Раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой, элюировали в линейном градиенте NH4HCO3 (О— Я 5 мМ, рН 7,5). Целевые фракции упаривали, остаток разбавляли водой (3 мл) и дополнительно очищали на колонке с LiСhгорrер RP-18, элюируя водой. Целевую фракцию лиофили- зовали, получали 1 г (90%) фосфоната (Ia). 1H ЯМР (D2O): 7,72 кв (IH, J=O, 5 Гц, Н-б), 6,27 т (IH, J=6 Гц, H-I'), 4,55 м (IH, H-3'), 4,21 м (ЗН, H-4' и H-5'), 3,58 д (2H, J=8,5 Гц, CH2-P), 2,54 м (2H, H-2'), 1,95 д (ЗН, J=0,5 Гц, CH3). 31P ЯМР: 16,03 с.
Пример 2.
5'-Иoдмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcитимидин (Ib).
5'-Иoдмeтилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcитимидин (Ib) синтезировали из З'-азидо-З'-дезокситимидина и иодметилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ia. Выход 54%. 1H ЯМР (D2O): 7,55 с (IH, H-6), 6,07 т (IH, J=6 Гц, H-I'), 4,37 м (IH, H-3'), 4,00 м (ЗН, H-4' и H-5'), 2,89 (2H, J=9 Гц, CH2-P), 2,34 м (2H, H-2'), 1,75 с (ЗН, CH3).31P ЯМР: 17,00 с.
Пример 3.
5'-Гидpoкcимeтилфocфoнил-3' -азидо-З'-дезокситимидин (Ic).
Раствор пиридиниевой соли ацетоксиметилфосфоновой кислоты (1,2 ммоль) в пиридине (3 мл) прибавляли к раствору З'-азидо-З'-дезокситимидина (267 мг, 1 ммоль) в пиридине (2 мл), прибавляли при перемешивании дицикло- гексилкарбодиимид (520 мг, 2,5 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 10 часов и разбавляли водой (5 мл). После 30 минут дополнительного перемешивания отделяли осадок, раствор упаривали, остаток растворяли в IM KOH (5 мл) и перемешивали при комнатной температуре 5 часов. Раствор упаривали, остаток растворяли в воде (100 мл). Раствор наносили на колонку с DEAE целлюлозой в HCO3"-фopмe, элюировали в линейном градиенте NH4HCO3 (0— »-15 мМ, рН 7,5). Целевые фракции упаривали и переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и хроматографиро- вали на колонке с LiСhrорrер RP- 18, элюируя водой. Целевую фракцию лиофи- лизовали, получали 238 мг (66%) фосфоната (Ic). 1H ЯМР (D2O): 7,68 кв (IH, J=0,5 Гц, Н-б), 6,22 т (IH, J=6 Гц, H-I '), 4,48 м (IH, H-3'), 4,16 м (ЗН, H-4' и H-5'), 3,77 д (2H, J=7 Гц, CH2-P), 2,51 т (2H, J=б Гц H- 2'), 1,93 д (ЗН, J=0,5 Гц, CH3).31P ЯМР: 16.03 с.
Пример 4.
δ'-Метоксиметилфосфонил-З'-азидо-З'-дезокситимидин (Id) синтезировали из З'-азидо-З'-дезокситимидина и метоксиметилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ic.1H ЯМР (D2O): 7,66 кв (IH, J=0,5 Гц, H- 6), 6,21 т (IH, J=6 Гц, H-I'), 4,48 м (IH, H-3'), 4,15 м (ЗН, H-4' и H-5'), 3,68 кв (2H, J=8 Гц, CH2-P), 2,52 т (2H, J=6 Гц H-2'), 1,94 д (ЗН, J=0.5 Гц, CH3).31P ЯМР: 16,03 с.
Пример 5.
5'-Aминoкapбoнилфocфoнил-3'-aзидo-3'-дeзoкcитимидин (Ie).
5'-Aминoкapбoнилфocфoнил-3 '-aзидo-3 '-дезокситимидин (Ie) синтезировали из З'-азидо-З'-дезокситимидина и аминокарбонилфосфоновой кислоты по методу, описанному для соединения Ic Получили 70 мг (94%) соединения Ie. 1H ЯМР (DMSO-dб): 7,82 с (IH, H6), 7,17 с и 7,13 с (2H, NH2), 6,12 т (IH, J 6,9, Hl'), 4,5 м (IH, НЗ'), 3,95 м (ЗН, H4' и H5'), 2,30 м (2H, H2'), 1,81 с (ЗН, CH3). 31P ЯМР (DMSO-d6): -1,56 с. Масс-спектр: m/е 374,3 [M+].
Пример 6.
Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии MT-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культу- ральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.
Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка p24 (по дан- ным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-димeтилтиaзoл- 2-ил)-2,5-дифeнилтeтpaзoлия (MTT).
Оценка цитотоксичности соединений.
Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в бессывороточной среде RPMI- 1640 к клеточной суспензии MT-4, помещенной в лунки 96-лyнoчнoгo планшета ("Сеl-Сult", Епglапd), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 370C в течение 4 суток. Посевная концентрация составляет 0,5x106 клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток MTT). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строят дозо- зависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD50). Исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки MT-4 в эффективных концентрациях. Следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 5-6 порядков превышают эффективные в отношении BИЧ-1 дозы (таблица 1).
Влияние исследуемых соединений на репродукцию BИЧ-1 в культуре клеток MT-4 исследовано по известной методике.
Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-нoй токсической концентрации соединения к его 50%-нoй эффективной дозе (результаты представлены в таблице 1). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации BИЧ-1 в культуре клеток MT-4, сравнимой с эффективностью Никавира. Пример 7.
Собаке весом 12 кг вводили 250 мг исследуемого вещества орально (в смеси с творогом). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. Пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. Из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). Полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. Супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 400C, к остатку добавляли воду (1 мл). Аликвоты (20 мкл) анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Gупkоtес, Германия; аналитическая колонка Ultrаsрhеrе ODC "Весkmап" USA. Элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% H3PO4 (рН 2,1) в присутствии 0,15% триэтиламина. Детекция при λmax 265 нм, температура 300C. Фар- макокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в таблице 2.
Таблицаl . Противовирусная активность фосфонатов АЗТ против BИЧ-1 ГKB-4046:
Figure imgf000011_0001
Таблица 2. Фармакокинетические параметры азидотимидина после введения собаке внутрь 250 мг субстанций АЗТ, Никавира, Ia и Ie в эквиваленте 250 мг АЗТ
Figure imgf000013_0001
Таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток MT -4 и генерировать АЗТ в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. 5'-Фocфoнaты АЗТ, имеющие общую формулу
Figure imgf000014_0001
где R = алкильные группы, в том числе содержащие атомы галогенов, карбокси, гидрокси, алкокси и ацилокси- группы, а также замещенные аминокарбонильные группы
2. 5'-Фocфoнaты АЗТ, имеющие общую формулу
Figure imgf000014_0002
где R = алкильные группы, в том числе содержащие атомы галогенов, карбокси, гидрокси, алкокси и ацилокси- группы, а также замещенные аминокарбонильные группы как антивирусные препараты.
PCT/RU2005/000249 2004-11-25 2005-05-06 Modified 5'- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations WO2006062434A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05763842.1A EP1829885B1 (en) 2004-11-25 2005-05-06 Modified 5'- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations
CN2005800467450A CN101115765B (zh) 2004-11-25 2005-05-06 修饰的叠氮胸苷的5’-膦酸酯—潜在的抗病毒制剂
KR1020077013688A KR101323698B1 (ko) 2004-11-25 2005-05-06 Ａｚｔ의 변형된 5'-포스포네이트 - 잠재적 항바이러스제
ES05763842.1T ES2550136T3 (es) 2004-11-25 2005-05-06 Preparaciones anti-víricas potenciales de 5'-fosfanato azidotimidina modificado
US11/720,250 US7999099B2 (en) 2004-11-25 2005-05-06 Modified 5′-phosphonate azidothymidine—potential anti-viral preparations

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004134388/04A RU2322450C2 (ru) 2004-11-25 2004-11-25 Модифицированные 5'-фосфонаты азт в качестве активных компонентов для потенциальных противовирусных препаратов
RU2004134388 2004-11-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006062434A1 true WO2006062434A1 (en) 2006-06-15
WO2006062434A8 WO2006062434A8 (fr) 2007-11-01

Family

ID=36578174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2005/000249 WO2006062434A1 (en) 2004-11-25 2005-05-06 Modified 5'- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7999099B2 (ru)
EP (1) EP1829885B1 (ru)
KR (1) KR101323698B1 (ru)
CN (1) CN101115765B (ru)
ES (1) ES2550136T3 (ru)
RU (1) RU2322450C2 (ru)
WO (1) WO2006062434A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013055252A1 (ru) 2011-10-14 2013-04-18 Закрытое Акционерное Общество " Производственно-Коммерческая Ассоциация Азт" Соли эфиров карбомоилфосфоновой кислоты, являющиеся селективными ингибиторами продукции вируса иммунодефицита человека вич-1

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1548182A1 (ru) * 1987-12-29 1990-03-07 Институт молекулярной биологии АН СССР 5 @ -Фосфонаты 3 @ -азидо-2 @ ,3 @ -дидезоксинуклеозидов, вл ющиес специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ
WO1991019727A1 (en) * 1990-06-19 1991-12-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research 5'-hydrogenphosphonates and 5'-methylphosphonates of sugar modified nucleosides, compositions and uses thereof
WO1992000988A1 (en) * 1990-07-13 1992-01-23 Bodor Nicholas S Targeted drug delivery via phosphonate derivatives

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4824850A (en) * 1982-05-18 1989-04-25 University Of Florida Brain-specific drug delivery
US4968788A (en) * 1986-04-04 1990-11-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Biologically reversible phosphate and phosphonate protective gruops
US5002935A (en) * 1987-12-30 1991-03-26 University Of Florida Improvements in redox systems for brain-targeted drug delivery
JP2005525358A (ja) * 2002-02-28 2005-08-25 ビオタ インコーポレーティッド ヌクレオチド模倣体およびそのプロドラッグ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1548182A1 (ru) * 1987-12-29 1990-03-07 Институт молекулярной биологии АН СССР 5 @ -Фосфонаты 3 @ -азидо-2 @ ,3 @ -дидезоксинуклеозидов, вл ющиес специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ
WO1991019727A1 (en) * 1990-06-19 1991-12-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research 5'-hydrogenphosphonates and 5'-methylphosphonates of sugar modified nucleosides, compositions and uses thereof
WO1992000988A1 (en) * 1990-07-13 1992-01-23 Bodor Nicholas S Targeted drug delivery via phosphonate derivatives

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5'-hydrogenphosphonate of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine, a prodrug of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 63, 2004, pages 107 - 113
ANTONELLI, G; TURRIZIANI, O.; VERRI, A.; NARCISO, P.; FERRI, F.; D'OFFIZI, G.; DIANZINI, F.: "Long-term exposure to zidovudine affects in vitro and in vivo the efficiency of thymidine kinase", AIDS RES HUM RETROVIR., vol. 12, 1996, pages 223 - 228
CASARA P.J. ET AL.: "Synthesis of acid stable 5'-O-fluoromethyl phosphanates of nucleosides. Evaluation as inhibitors of reverse transcriptase", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 2, no. 2, 1992, pages 145 - 148, XP008112220 *
CHARIOT, P.; DROGOU, I.; DE LACROIX-SZMANIA, I.; ELIEZER-VANEROT, M.C.; CHAZAUD, B.; LOMBES, A.; SCHAEFFER, A.; ZAFRANI, E.S.: "Zidovudine-induced mitochondrial disorder with massive liver steanosis, myopathy, lactic acidosis, and mitochondrial DNA depletion", J. HEPATOL., vol. 30, 1999, pages 156 - 160
DATABASE CA [online] ORLOV V.M. ET AL.: "Investigation of nucleoside and nucleotide derivatives by plasma desorption mass spectrometry", XP008112355, accession no. STN Database accession no. 121:7716 *
DATABASE CA [online] SHIROKOVA E.A. ET AL.: "Uncharged AZT and D4T Derivatives of Phosphonoformic Phosphonoformic and Phosphonoacetic Acids as Anti-HIV Pronucleosides", XP008112392, accession no. STN Database accession no. (141:140705) *
DATABASE CHEMCATS [online] 9 August 2004 (2004-08-09), XP008112398, accession no. STN Database accession no. (RN 724696-86-0) *
DE CLERCQ, E.: "New development in anti-HIV chemotherapy", BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1587, 2002, pages 258 - 275
DYATKINA N.B. ET AL.: "Sintez 5'-ftoralkilfosfonatov nukleozidov-soedineny s potentsialnymi protivovirusnymi svoistvami", BIOORGANICHESKAYA KHIMIYA, vol. 18, no. 1, 1992, MOSCOW, pages 100 - 105, XP008112333 *
GROSCHEL, B.; CINATL, J.H.; CINATL J. JR.: "Viral and cellular factors for resistance against anti-retroviral agents", INTERVIROLOGY, vol. 40, 1997, pages 400 - 407
JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 47, no. 14, 11 August 2004 (2004-08-11), pages 3606 - 3614 *
KELLAM, P.; BOUCHER, C.A.; LARDER, B.A.: "Fifth mutations in HIV reverse transcriptase contributes to the development of high level resistance to zidovudine", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A, vol. 89, 1992, pages 1934 - 1938
KRAEVSKY A. ET AL.: "Novye 5'-fosfonaty modifitsrovannykh po sakharnomy ostatku nukleosidov kak ingibitory produktsii VICH", MOLEKULYARNAYA BIOLOGIYA, vol. 28, no. 3, 1992, MOSCOW, pages 624 - 633, XP008112338 *
KUKHANOVA M.K. ET AL.: "Gidroliz 5'-fosfonatov i fosfatov nykleozidov fosfatazami razlichnogo proiskhozhdeniya i syvorotkami krovi cheloveka I telenka", MOLEKULYARNAYA BIOLOGIYA, vol. 26, no. 5, 1992, MOSCOW, pages 1148 - 1159, XP008112336 *
MAMAEVA O.A. ET AL.: "Izuchenie anti-HIV aktivnosti 5'-fosfonatov azidotimidina", MOLEKULYARNAYA BIOLOGIYA, vol. 28, no. 1, 1994, MOSCOW, pages 137 - 142, XP008112335 *
MOL. BIOL., vol. 28, no. 3, 1994, MOSCOW, pages 708 - 713 *
REN, J.; ESNOUF, R.M.; HOPKINS, A.L.; JONES, E.Y.; KIRBY, I.; KEELING, J.; ROSS, C.K.; LARDER, B.A.; STUART, D.I.; STAMMERS, D.K.: "3'-Azido-3'-deoxythymidine drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase can induce long range conformational changes", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A, vol. 95, 1998, pages 9518 - 9523
See also references of EP1829885A4
SHIROKOVA E.A. ET AL.: "Novye proizvodnye 3'-azido-3'dezoksitimidina i fosfonomuraviinoi kisloty", MOSCOW, BIOORGANICHESKAYA KHIMIYA, vol. 30, no. 3, May 2004 (2004-05-01) - June 2004 (2004-06-01), pages 273 - 280, XP008112334 *
SOMOGYI G. ET AL.: "Metabolic properties of phosphonate esters", PHARMAZIE, vol. 59, no. 5, 12 November 2004 (2004-11-12), pages 378 - 381, XP008112292 *
TARUSOVA N.B. ET AL.: "Ingibirovannye reproduktsii virusa immunodifitsita cheloveka v kulture kletok 5'-fosfonatami 3'-azido-2'3'-didezoksinukleozidov", MOLEKULYARNAYA BIOLOGIYA, vol. 23, no. 6, 1989, MOSCOW, pages 1716 - 1724, XP008112337 *
Y. SKOBLOV ET AL., ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 63, 2004, pages 107 - 113
YANYAREV D.V. ET AL.: "Aminokarbonilfosfonilnye proizvodnye 3'-azido-3'-dezoksitimidina kak potentsialnye anti-VICH preparaty. Materialy Mezhdunarodnoi konferentsii studentov i aspirantov po fundamentalnym naukam "Lomonosov 2003"", SEKTSIYA KHIMIYA, MOSCOW, IZD-VO KHIM. FAK. MGU, vol. 1, 15 April 2003 (2003-04-15) - 18 April 2003 (2003-04-18), pages 151 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101115765A (zh) 2008-01-30
RU2322450C2 (ru) 2008-04-20
EP1829885A4 (en) 2013-07-10
EP1829885B1 (en) 2015-07-15
US7999099B2 (en) 2011-08-16
RU2004134388A (ru) 2006-05-20
EP1829885A1 (en) 2007-09-05
US20090111979A1 (en) 2009-04-30
WO2006062434A8 (fr) 2007-11-01
KR20070116580A (ko) 2007-12-10
ES2550136T3 (es) 2015-11-04
CN101115765B (zh) 2012-10-10
KR101323698B1 (ko) 2013-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107148424B (zh) 用于诱导细胞因子的环状二核苷酸
KR102656571B1 (ko) 아르기나아제 억제제
EP0642528B1 (fr) Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters
JP2020532532A (ja) 化合物、組成物、及び疾患の治療方法
Gerhart et al. 2-(4-Amino-4-carboxybutyl) aziridine-2-carboxylic acid. A potent irreversible inhibitor of diaminopimelic acid epimerase. Spontaneous formation from. alpha.-(halomethyl) diaminopimelic acids
WO2014032481A1 (zh) 一种替诺福韦前药及其在医药上的应用
JP2005508305A (ja) ガンマ／デルタｔ細胞を活性化するための有機リン化合物
TW200844108A (en) Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of liver disorders
EA019419B1 (ru) Фосфонатные аналоги соединений ингибиторов вич, фармацевтическая композиция и набор, их включающие, и способ лечения нарушений, ассоциированных с вич
CN103764604A (zh) 茋类似物和治疗癌症的方法
Tatar et al. Synthesis, characterization and screening of antimicrobial, antituberculosis, antiviral and anticancer activity of novel 1, 3-thiazolidine-4-ones derived from 1-[2-(benzoylamino)-4-(methylthio) butyryl]-4-alkyl/arylalkyl thiosemicarbazides
Mehellou et al. An investigation into the anti-HIV activity of 2′, 3′-didehydro-2′, 3′-dideoxyuridine (d4U) and 2′, 3′-dideoxyuridine (ddU) phosphoramidate ‘ProTide’derivatives
AU607965B2 (en) Use of nucleosides for the manufacture of medicament for treatment of diseases caused by retrovirus or hepatitis b virus
WO2006062434A1 (en) Modified 5&#39;- phosphonate azidothymidine-potential anti-viral preparations
JPH10502655A (ja) ジヌクレオシド−５’，５’−ピロリン酸
Gosselin et al. 5′-Hydrogenphosphonates of anti-HIV nucleoside analogues revisited: controversial mode of action
RU2373218C2 (ru) 5&#39;-фосфорсодержащие производные 2&#39;,3&#39;-дидезокси-3&#39;-тиацитидина новые противовирусные агенты
RU2418795C2 (ru) Производные диоксолана для лечения рака
RU2187509C1 (ru) Производные 5&#39;-h-фосфоната 3&#39;-азидо-3&#39;-дезокситимидина и фармацевтические композиции на их основе
RU2430104C1 (ru) Новые депо-формы зидовудина и ламивудина на основе производных фосфоновых кислот
RU2430103C1 (ru) Уретановые производные азт - потенциальные противовирусные препараты
RU2642426C1 (ru) 1-Этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2Н-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота, обладающая противотуберкулезной активностью
Schott et al. Synthesis and in vitro anti-HIV activities of amphiphilic heterodinucleoside phosphate derivatives containing the 2', 3'-dideoxynucleosides ddC, AZT and ddI
RU2304145C1 (ru) Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты и ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека
RU2243972C1 (ru) Фосфорамидаты нуклеозидных аналогов - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020077013688

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005763842

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580046745.0

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005763842

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11720250

Country of ref document: US