WO2006054705A1 - 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液 - Google Patents

直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液 Download PDF

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WO2006054705A1
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dna
protein
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Natsuko Matsuda
Takanori Kigawa
Shigeyuki Yokoyama
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Riken
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a protein synthesis method using a cell-free protein synthesis system, and more particularly to a method for protein synthesis in a cell-free system using linear DNA as a cage, and a kit for the same.
  • Extracts for carrying out the translation reaction are commercially available from E. coli, from wheat germ, and from rabbit reticulocytes.
  • Escherichia coli extracts it is known that proteins can be synthesized from DNA through a coupling reaction between transcription and translation.
  • a method using an S30 extract of Escherichia coli has been systematically developed by Spey et al. 1).
  • the S30 extract contains ribosome, aminoacyl tRNA synthetase, polypeptide chain initiation factor (IF), elongation factor (EF) and termination factor necessary for translation of mRNA.
  • IF polypeptide chain initiation factor
  • EF elongation factor
  • DNA When DNA is used as a type of synthetic protein, DNA in which the target protein gene is placed downstream of a strong promoter (typically the T7 promoter) is used to couple both transcription and translation reactions.
  • T7 RNA polymerase and 4 types of ribonucleotides ATP, GTP, CTP and UTP are added to the system. Since ATP energy is required for the synthesis of aminoacyl tRNA and the translation reaction of mRNA, an energy regeneration system such as creatine kinase creatine phosphate is added to the cell-free system. With these components, the protein synthesis reaction that takes place inside the cell is reconstituted in a test tube.
  • the linear ⁇ DNA has been reported that susceptible to degradation by endogenous E exonuclease present in the E. coli extract (e.g., Non-Patent Documents 2 to 4 refer.) 0 or It is also known that the protein complex called degradonome reduces the expression efficiency because it recognizes and degrades RNA.
  • freeze and thaw operations are performed in the S30 extract preparation process to remove the degradosome (see, for example, Patent Document 3), or the endonuclease RNase E, which is an important component of the degradonome, is encoded.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 7-110236
  • Patent Document 2 JP-A-4-200390
  • Patent Document 3 International Publication No. 01Z83805 Pamphlet
  • Non-patent document 1 Geoffrey Zubay, “Annual Review of Genetics”, 1973, No. 7, p. 267—287
  • Non-patent Reference 2 Pratt et al, Nucleic Acids Res., 9, 4459-4474, (1981)
  • Non-Patent Document 3 Benzinger et al., J. Virol, 15, 861-871, (1975)
  • Non-Patent Document 4 Lorenz and Wackernagel, Microbiol Rev., 58, 563-602, (1994)
  • Non-Patent Document 5 Yang et al., PNAS 77, 7029-7033 (1980)
  • Non-Patent Document 6 Yu et al., PNAS, 97, 5978-5983, (2000)
  • the present invention has been made in view of the above problems, and in a protein synthesis method using a cell-free protein synthesis system, long-term continuous synthesis is performed using linear DNA as a cage.
  • the purpose is to provide a simple and efficient method for synthesizing a large amount of protein by reaction.
  • the present inventors conducted various studies on a cell-free protein synthesis system using Escherichia coli.
  • the protein synthesis yield is improved and stabilized, and a high synthesis yield can be obtained especially in continuous reactions such as dialysis and continuous flow.
  • the present invention has been completed.
  • the method for producing a protein according to the present invention comprises an extract of Escherichia coli cells cultured at any temperature of 18 ° C to 36 ° C, and a linear cage DNA encoding the protein.
  • a continuous synthesis reaction is performed for at least 1 hour, preferably 2 to 8 hours.
  • the culture temperature of the E. coli is preferably 20 ° C to 34 ° C, and more preferably 26 ° C to 32 ° C.
  • the protein synthesis method of the present invention is suitable for a continuous reaction for a long time, and is characterized by a continuous protein.
  • a dialysis system or a continuous flow system is particularly preferable.
  • a cell-free protein synthesis system using a dialysis system consists of a dialyzed internal solution containing an extract and linear linear DNA, a dialysis external solution containing a low-molecular substrate for protein synthesis, and the substrate can move through it. And a dialysis membrane.
  • the cell-free protein combination for linear rod-shaped DNA comprising an extract of Escherichia coli cells cultured at any temperature of 18 ° C to 36 ° C.
  • An adult kit is provided.
  • the culture temperature of the E. coli is preferably 20 ° C to 34 ° C, and more preferably 26 ° C to 32 ° C.
  • a large number of linear double-stranded DNAs prepared by means of PCR or the like are used as a cage and efficiently used in a continuous reaction system such as dialysis.
  • Protein synthesis can be performed. Although the amount of protein synthesis itself is slightly lower than when circular plasmid DNA is used, it is possible to process a large number of samples as soon as necessary to perform the claw-type DNA cloning operation. Suitable for sample preparation for screening and comprehensive analysis of proteins.
  • FIG. 1 shows the results of a protein synthesis reaction performed at 30 ° C for 5 hours using a S30 extract prepared by culturing E. coli BL21 codon plus strain at various temperatures. The amount of CAT protein synthesized was also calculated as a measure of CAT activity.
  • FIG. 2 shows the results of a protein synthesis reaction performed at 37 ° C. for 1 hour by the Notch method using S 30 extract prepared by culturing E. coli BL21 codon plus strain at various temperatures. The amount of CAT protein synthesized was also calculated as a measure of CAT activity.
  • FIG. 3 S30 extract prepared by culturing E. coli BL21 codon plus strain at various temperatures, and using a dialysis system for 30 hours at 30 ° C for protein synthesis reaction: L 1 SDS — The result analyzed by PAGE is shown.
  • the cell-free protein synthesis system refers to taking out a protein factor necessary for protein translation as a cell extract and reconstituting this reaction in a test tube.
  • the target protein is synthesized.
  • Cell-free systems can be constructed using extracts derived from various species, such as bacteria such as Escherichia coli and thermophilic bacteria, wheat germ, rabbit reticulocytes, mouse L cells, Ehrlich ascites tumor cells, Extracts of eukaryotic and prokaryotic cells with high protein synthesis activity, such as HeLa cells, CHO cells, and budding yeast can be used (Clemens, MJ, Transcription and Translation-A Practical Approach, ( 1984), pp. 231-270, Henes, BD et al. Eds., IRL Pres s, Oxford) 0
  • the eukaryotic cell or prokaryotic cell is cultured at a temperature lower than the optimum growth temperature, thereby preparing an extract for cell-free protein synthesis suitable for linear rod-shaped DNA.
  • the optimum growth temperature is around 37 ° C., so that the culture is carried out at any temperature of 18 ° C. to 36 ° C. in the method of the present invention. If it is lower than 18 ° C, the growth will be extremely slow, or reactions such as low temperature stress will occur. When culturing further E. coli, the growth rate is slow, but it is well known to those skilled in the art that the growth of E. coli can be seen even if the temperature is lowered to about 20 ° C. Incubate at C, more preferably at 26 ° C to 32 ° C.
  • the method of the present invention may vary depending on the genetic background of the E. coli strain used for the preparation of the extract, at least in Escherichia coli B strain, particularly BL21 strain and BL21 codon plus strain, The effect is recognized. Since the method of the present invention is a relatively simple method of lowering the culture temperature of E. coli. It is also possible to obtain a synergistic effect in combination with E. coli strains having various genetic mutations.
  • Escherichia coli extracts include Spey et al. (Supra) or Pratt et al. (Pratt, JM et al., Transcrition and Translation-A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, BD et al. eds., IRL Press, Oxford) can be used.
  • the E. coli S30 extract contains all the E. coli enzymes and factors required for transcription and translation. Furthermore, a supplementary mixture can be added.
  • Escherichia coli is cultured, and the cells are collected by centrifugation or the like.
  • the collected cells are washed, resuspended in a buffer solution, and crushed using a French press, glass beads, Waring renderer, etc. Crushed E. coli insoluble material is removed by centrifugation, mixed with the preincubation mixture and incubated.
  • endogenous DNA and RNA are degraded by this operation, endogenous nucleic acid may be further degraded by adding calcium salt, micrococcal nuclease, or the like. Subsequently, remove endogenous amino acids, nucleic acids, nucleosides, etc. by dialysis, dispense appropriate amounts, and store in liquid nitrogen or at 80 ° C.
  • DNA or RNA that becomes a transcription Z translation type a substrate amino acid, an energy source, various ions, a buffer solution, an ATP regeneration system, nucleolytic enzyme inhibition is performed on the cell extract.
  • agent, tRNA, a reducing agent, polyethylene glycol, C AMP, folates, if antimicrobial agents, also using DNA as ⁇ may comprise substrates for RNA synthesis, and the RNA polymerase and the like.
  • Tris acetate Tris acetate, DTT, NTPs (ATP, CTP, GTP, and UTP), phosphoenolpyruvate, pyruvate kinase, at least one amino acid (of 20 kinds of natural amino acids)
  • NTPs ATP, CTP, GTP, and UTP
  • phosphoenolpyruvate phosphoenolpyruvate
  • pyruvate kinase at least one amino acid (of 20 kinds of natural amino acids)
  • the remainder excluding the labeled amino acid is added.
  • Polyethylene glycol (PEG) Polyethylene glycol
  • folic acid folic acid
  • cAMP cAMP
  • tRNA Tris acetate
  • ammonium acetate potassium acetate
  • potassium acetate Add some or all of potassium glutamate, and magnesium acetate at the optimum concentration.
  • RNA-degrading enzyme complex can be removed by mixing and freezing and thawing (see pamphlet of International Publication No. WO0183805).
  • the cell extract of E. coli prepared by the above method for use in the method of the present invention is dispensed in a predetermined amount as used, and cell-free protein synthesis for linear vertical DNA is performed.
  • These products can be stored frozen or dried, and sold as kits in containers suitable for storage and transport.
  • An instruction manual, positive control DNA, vector DNA, etc. can be attached to the kit.
  • the linear vertical DNA used in the method of the present invention is a double-stranded DNA comprising an appropriate expression control region and a gene sequence that expresses the desired protein.
  • a strong promoter and terminator to promote transcription and to increase the affinity between mRNA and ribosome to increase translation efficiency.
  • T7 RNA polymerase derived from T7 phage has a very strong transcriptional activity and is known to produce recombinant proteins at high levels! /
  • introduction of a ribosome binding sequence (RBS), also called an SD sequence is important for improving translation efficiency.
  • the cage DNA in order to rapidly purify or detect the synthesized protein, can be designed so that a fusion protein incorporating a property tag sequence can be synthesized.
  • An improved method for efficiently producing such linear cage DNA has been disclosed by the present applicant in WO 03004703 pamphlet, the contents of which are also incorporated herein by reference. .
  • the cell-free protein synthesis system of the present invention can be applied with a conventionally known technique such as a batch method or a continuous flow method.
  • the method of the present invention is suitable for a long-time continuous reaction and has a small amount.
  • Suitable for continuous protein synthesis reaction of at least 1 hour, preferably 2-8 hours. Continuous synthesis of 18 hours or more is possible by devising the reaction system, such as exchanging the external dialysis solution with a fresh one during the synthesis reaction.
  • dialysis apparatus that can shake or stir the internal liquid and the external liquid separately through a dialysis membrane.
  • small-scale reaction apparatus examples include Dispo Dialyzer (registered trademark) (manufactured by Spectrum) and Slidealyzer (registered trademark) (manufactured by Pierce).
  • large scale An example of an apparatus for the reaction of a reagent is a Spectra / Por (registered trademark) dialysis tube (manufactured by Spectrum).
  • the dialysis internal solution ie, protein synthesis reaction solution
  • the dialysis internal solution includes DNA encoding the target protein, ATP (adenosine 5, -triphosphate), in addition to concentrated cell extracts such as E. coli S30.
  • GTP guanosine 5, triphosphate
  • CTP cytidine 5, triphosphate
  • UTP uridine 5, triphosphate
  • buffer salts, amino acids, RNase inhibitor, antibacterial agent, RNA Polymerase (eg, T7 RNA polymerase) and tRNA may be included.
  • ATP regeneration systems include phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase or creatine phosphate and creatine kinase, polyethylene glycol (eg # 8000), 3, 5, 5-cAMP, folic acid, RNase inhibitor Harmful agents, reducing agents (eg, dithiothreitol), and the like can be included.
  • the dialysis external solution (that is, the protein synthesis substrate solution) can be used except the dialysis internal solution composition, cell extract, RNase inhibitor, DNA or RNA, and RNA polymerase.
  • the dialysis internal solution composition can contain buffers, ATP, GTP, CTP, UTP, salts, amino acids, antibacterial agents, and the like.
  • the concentration of the additive component can be arbitrarily selected.
  • a buffer such as Hepes-KOH or Tris-OAc can be used.
  • salts are acetates (for example, ammonium salts, magnesium salts, etc.), glutamates, etc.
  • antibacterial agents are sodium azide and ampicillin.
  • Amino acids are the 20 amino acids that make up proteins.
  • pK7 a plasmid vector for CAT expression, is used as a vertical DNA for protein synthesis reaction.
  • the reaction conditions were initial denaturation at 94 ° C for 2 minutes, followed by 10 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 53 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, followed by 3 at 94 ° C.
  • the cycle between 0 seconds, 53 ° C for 30 seconds, 72 ° C (2 minutes + 5 seconds Z cycle) was repeated 20 times, and finally an extension reaction was performed once at 72 ° C for 5 minutes.
  • Total amount 50 I scale (Total amount 50 I scale) Using the thus-prepared linear saddle DNA and circular plasmid pK7-CAT, the solution having the composition shown in Table 2 below was used as an external dialysis solution having the composition shown in Table 3. Then, dialysis was performed, and the protein synthesis reaction was carried out for up to 18 hours while sampling at 30 ° C. reaction The scales were reaction solution 30 1 and dialysis external solution 300 1. The quantification of the synthesized CAT protein followed the method of Shaw et al. (See Methods Enzymol. 735-755, 1975).
  • acetylacetal reaction of chloramphenicol with CAT was performed using acetylcoenzyme A and chloramphene-chol as substrates, and the resulting reduced coenzyme A was converted to 5,5'-dithiopis 2-torobenzoic acid (DNTB) was used for color development quantification.
  • the activity of CAT was quantified from the increase in absorbance per unit time at 37 ° C and 412 nm, and the amount of CAT protein was determined using this as an index.
  • As a control experiment of the compositions shown in Table 2, only cysteine as amino acid was 3 mM, no sodium azide was added, T7 RNA polymerase was 133 ⁇ g / ml, E. coli S30 extract was 24% by volume of the reaction solution, and The type DNA was changed to 4 gZml each, and the synthesis reaction was carried out by batch method at 37 ° C for 1 hour.
  • Vertical DNA expression vector p K 7 —CAT or linear DN 1 ⁇ g / ml
  • FIG. 1 shows the results of measuring the CAT activity using the reaction solution 5 hours after the synthesis reaction by the dialysis method, and quantifying the amount of protein. 30 ° C At any temperature of 37 ° C, the amount of protein synthesis is larger when the plasmid DNA is in the saddle shape, and the S30 extract is prepared when the linear DNA is in the saddle shape. There was a large difference in the amount of protein synthesized depending on the culture temperature of E. coli. At a culture temperature of 37 ° C,
  • the total amount of protein synthesized is less than one-third that of plasmid DNA. Gradually increases as the culture temperature decreases, and is approximately the same as when plasmid DNA is used at a culture temperature of 30 ° C. Protein synthesis was observed.
  • FIG. 2 shows the results of protein synthesis by a batch method performed as a control experiment. Under these synthesis conditions, the synthesis reaction is almost completed at 37 ° C for 1 hour, so there is no significant difference in the amount of synthesis depending on the type of the cage DNA, but as shown in Fig. 2, the amount of CAT protein synthesized itself Is much lower than the amount synthesized by the dialysis method.
  • FIG. 3 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis using 1 ⁇ l of the reaction solution subjected to the synthesis reaction for 18 hours by the dialysis method as a sample.
  • the left half of Fig. 3 shows the protein synthesized at various culture temperatures of Escherichia coli when the plasmid DN ⁇ ⁇ ⁇ is in the vertical shape, and the right half is the same as when the linear DNA is in the vertical shape. Results are shown.
  • Molecular weight markers were run at both ends of the sample. As is apparent from Fig. 3, the molecular weight is detected around 23k Dalton (Da).
  • the CAT protein is not affected by the culture temperature of E. coli, but when linear DNA is used, the concentration of the protein band increases as the culture temperature of E. coli decreases. As shown in Fig. 1, the results agree well with the reproducibility.

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Abstract

　無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成方法において、直鎖状ＤＮＡを鋳型として用い、長時間の連続合成反応により大量のタンパク質を合成するための簡便かつ効率的な方法を提供する。１８°C乃至３６°Cの何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコードする直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも１時間連続的な合成反応を行う。連続的なタンパク質合成系としては、透析系又は連続フロー系であることが好ましい。透析系による無細胞タンパク質合成系は、抽出液と直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む透析内液と、タンパク質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可能な透析膜とを備える。

Description

明 細 書
直鎖状铸型 DNAを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細 胞抽出液
技術分野
[0001] 本発明は無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成方法、特に、直鎖状 DNAを铸型として無細胞系でタンパク質合成を行う方法、及びそのためのキット等 に関する。
背景技術
[0002] 無細胞タンパク質合成システムによるタンパク質の合成は、基礎的な研究だけでな ぐ分子診断やハイスループットな医薬品ターゲットの発見等の応用分野にまで急速 に進展している。近年、タンパク質合成量を飛躍的に増大させる技術 (例えば、特許 文献 1及び 2参照。）が開発されたことから、該システムは、 X線結晶解析や NMR等 による立体構造解析用のタンパク質の大量合成にも利用されるようになってきた。
[0003] 翻訳反応を行わせる抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ゥサギ 網状赤血球由来のものが市販されている。大腸菌の抽出液では、転写、翻訳の共役 反応により DNAからタンパク質を合成できることが知られ、例えば、ズペイらによって 大腸菌の S30抽出液を用いる方法が系統的に開発されている（例えば、非特許文献 1参照）。 S30抽出液〖こは、 mRNAの翻訳に必要なリボソーム、アミノアシル tRNA合 成酵素、ポリペプチド鎖開始因子 (IF)、同伸長因子 (EF)及び同終結因子が含まれ ている。合成タンパク質の铸型として DNAを用いる場合は、強力なプロモーター（一 般的には T7プロモーター）の下流に目的タンパク質遺伝子を配置した DNAが用い られ、転写と翻訳の両反応を共役させるために、系内に T7RNAポリメラーゼと 4種類 のリボヌクレオチド (ATP、 GTP、 CTP及び UTP)を添カ卩する。アミノアシル tRNAの 合成、及び mRNAの翻訳反応には ATPのエネルギーが必要であることから、クレア チンキナーゼークレアチンリン酸系等のエネルギー再生系を無細胞系に加える。この ような構成成分により、細胞内で起こるタンパク質合成反応を試験管内で再構成して いる。 [0004] S30抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系にお 、て、タンパク質の合成収率に 影響を与える種々の因子が知られている。例えば、抽出液中に存在するプロテア一 ゼは合成されたタンパク質を分解する。プロテアーゼによる分解を最小限にするため に、 ompTや Ionプロテアーゼを欠損させた種々の大腸菌株 (例えば、大腸菌 B株） が作製されている。
[0005] 一方、抽出液中に存在する種々のヌクレアーゼは、铸型 DNAや転写産物の mRN Aを分解する。無細胞タンパク質合成系の铸型 DNAとしては、プラスミドやラムダファ ージ等にクローンィ匕された環状 DNAを用いる方法と、 PCR産物等の直鎖状 DNAを 用いる方法とに大別される力 一般的に、環状 DNAの方が上記ヌクレアーゼによる 分解を受けにくぐタンパク質の合成収率が高い。しかしながら、近年のポストゲノム 研究において多種類のタンパク質の構造と機能を網羅的に解析することが行われる ようになり、タンパク質の生産性の向上や作業の効率ィ匕は必須の課題となっている。 このため、ゲノム DNAを铸型として PCRにより多種類の直鎖状 DNAを増幅合成し、 これらを用いて無細胞タンパク質合成系で効率よくタンパク質を合成するシステムが 強く望まれている。
[0006] この直鎖状铸型 DNAは、大腸菌抽出液中に存在する内在性のェキソヌクレアーゼ によって分解されやすいことが報告されている (例えば、非特許文献 2〜4参照。 )0ま た、デグラドノームと呼ばれるタンパク質複合体は、 RNAを認識して分解するため、 発現効率が低下することも知られている。これらの問題を解決するために、 S30抽出 液の調製工程において凍結融解操作を行い、デグラドソームを除いたり（例えば、特 許文献 3参照）、或いは、デグラドノームの重要成分であるエンドヌクレアーゼ RNase Eをコードする rne遺伝子に変異を導入した大腸菌株も作製されている（例えば、 BL 21- Star株、 Invitrogen社)。直鎖状 DNAを分解する酵素としては、 RecBCDのような DNAェキソヌクレアーゼが原因と考えられ、これらの分解酵素のいくつかを欠損した 種々の RecBCD変異体大腸菌株が作製されている (例えば、非特許文献 5参照)。し 力しながら、 RecBCD変異体大腸菌株は、直鎖状 DNAの分解活性は低下している ものの、同時に増殖能も低下している場合が多ぐ無細胞タンパク質合成用の抽出 液の製造には必ずしも適して 、な 、(例えば、非特許文献 6参照)。 [0007] 特許文献 1 :特公平 7— 110236号公報
特許文献 2：特開平 4— 200390号公報
特許文献 3：国際公開第 01Z83805号パンフレット
非特許文献 1 :ジエフリ一'ズべィ (Geoffrey Zubay)、「ァ-ユアル 'レビュ一'ォブ 'ジェ ネテイクス（Annual Review of Genetics)」 1973年、第 7卷、 p. 267— 287 非特許文献 2 : Pratt et al, Nucleic Acids Res., 9, 4459-4474, (1981)
非特許文献 3 : Benzinger et al., J. Virol, 15, 861-871, (1975)
非特許文献 4 : Lorenz and Wackernagel, Microbiol Rev., 58, 563-602, (1994) 非特許文献 5 : Yang et al., PNAS 77, 7029-7033 (1980)
非特許文献 6 : Yu et al., PNAS, 97, 5978-5983, (2000)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、無細胞タンパク質合成系を 用いたタンパク質の合成方法において、直鎖状 DNAを铸型として用い、長時間の連 続合成反応により大量のタンパク質を合成するための簡便かつ効率的な方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するために、本発明者らは大腸菌を用いた無細胞タンパク質合成 系につ ヽて種々の検討を行った結果、直鎖状 DNAを铸型として長時間の合成反応 を行う場合に、低温で培養した大腸菌細胞より調製した抽出液を用いるとタンパク質 合成収率が向上、安定し、特に、透析法や連続フロー法等の連続反応において高 い合成収率が得られることを見出して本発明を完成するに至った。
[0010] すなわち、本発明に係るタンパク質の製造方法は、 18°C乃至 36°Cの何れかの温 度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコードする直鎖状铸型 DNAとを 含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも 1時間、好ましくは 2〜8時間連続 的な合成反応を行うことを特徴とする。前記大腸菌の培養温度は、 20°C乃至 34°Cで あることが好ましぐさらに好ましい条件としては 26°C乃至 32°Cである。本発明のタン パク質合成方法は、長時間の連続反応に適していることを特徴とし、連続的なタンパ ク質合成系としては、特に、透析系又は連続フロー系であることが好ましい。透析系 による無細胞タンパク質合成系は、抽出液と直鎖状铸型 DNAとを含む透析内液と、 タンパク質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可 能な透析膜とを備えることを特徴とする。
[0011] 本発明の異なる視点において、 18°C乃至 36°Cの何れかの温度で培養した大腸菌 細胞の抽出液を含むことを特徴とする、直鎖状铸型 DNA用の無細胞タンパク質合 成キットが提供される。前記大腸菌の培養温度は、 20°C乃至 34°Cであることが好ま しぐさらに好ましい条件としては 26°C乃至 32°Cである。
発明の効果
[0012] 本発明の方法によれば、 PCR等の手段により調製された多種類の直鎖状の二本 鎖 DNAを铸型として、透析法等の連続反応系にお ヽて効率よく大量のタンパク質合 成を行うことができる。タンパク質の合成量自体は、環状のプラスミド DNAを用いた 場合と比較すると若干低下するが、铸型 DNAのクローユング操作を行う必要なぐ一 度に多数のサンプルを処理することができるため、ハイスループットのスクリーニング やタンパク質の網羅的な解析を行うためのサンプル調製に適している。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]大腸菌 BL21コドンプラス株を種々の温度で培養して調製した S 30抽出液を用 いて、透析系により 30°C、 5時間タンパク質合成反応を行った結果を示す。 CATタン パク質の合成量は、 CAT活性の測定値力も計算した。
[図 2]大腸菌 BL21コドンプラス株を種々の温度で培養して調製した S 30抽出液を用 いて、ノ ツチ法により 37°C、 1時間タンパク質合成反応を行った結果を示す。 CATタ ンパク質の合成量は、 CAT活性の測定値力も計算した。
[図 3]大腸菌 BL21コドンプラス株を種々の温度で培養して調製した S 30抽出液を用 いて、透析系により 30°C、 18時間タンパク質合成反応を行った反応液: L 1を SDS — PAGEにより分析した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明の方法において、無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要な タンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成すること で目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液 を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌 、小麦胚芽、ゥサギ網状赤血球、マウス L 細胞、エールリツヒ腹水癌細胞、 HeLa細 胞、 CHO細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及 び原核細胞の抽出液を用いることができる (Clemens, M.J., Transcription and Transla tion - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Pres s, Oxford)0
[0015] 本発明の方法において、これら真核細胞、又は原核細胞を至適生育温度よりも低 温で培養することにより直鎖状铸型 DNAに適した無細胞タンパク質合成用の抽出 液を調製することができる。例えば、大腸菌の場合、最適生育温度は 37°C付近であ るから、本発明の方法においては 18°C乃至 36°Cの何れかの温度で培養する。 18°C より低すぎると生育が極端に遅くなつたり、低温ストレスといった反応が起こるからであ る。さらの大腸菌を培養する場合、増殖速度は遅いものの 20°C程度まで温度を下げ ても大腸菌の増殖が見られることは当業者にとってよく知られていることから、好ましく は 20°C乃至 34°C、さらに好ましくは 26°C乃至 32°Cで培養する。
[0016] 大腸菌を低温で培養することにより、細胞内におけるプロテアーゼ、及び種々のヌ クレア一ゼの産生が抑制されると考えられる力 その機構については必ずしも明らか ではな 、。細胞内では様々なタンパク質が相互作用をしながら細胞の増殖を制御し ていること力 低温で培養することによって種々のプロテア一ゼゃヌクレアーゼタンパ ク質自体の発現が抑制されるだけでなぐ他のタンパク質の発現抑制や増強を通じ て間接的にこれらの活性や発現が制御されることも考えられる。ヌクレアーゼの作用 に対する影響としては細胞内の直鎖状 DNAを分解するェキソヌクレアーゼ活性と、 翻訳産物である mRNAの分解を促進するリボヌクレアーゼ活性の何れか又は両方 が抑制されると考えられる。また、大腸菌は最も遺伝的解析の進んだ生物でありこれ まで多くの変異株が作製されている。従って、抽出液の調製に用いる大腸菌株の遺 伝的背景によって、本発明の方法の効果が異なることも考えられるが、少なくとも大 腸菌 B株、特に、 BL21株及び BL21コドンプラス株において特段の効果が認められ る。本発明の方法は大腸菌の培養温度を下げるという比較的簡易な方法であるから 、種々の遺伝的変異を持った大腸菌株と組み合わせて相乗的な効果を得ることも可 能である。
[0017] 大腸菌の抽出液としては、ズペイら (前掲)又はプラットら (Pratt, J.M. et al.， Transcri ption and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)に記載された方法により調製された S30抽出液を用いる ことができる。大腸菌 S30抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と 因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方 法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収さ れた菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリング プレンダ一等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し 、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって 内在性の DNA、 RNAが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌク レアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性 のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は 80°Cに て保存する。
[0018] タンパク質合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写 Z翻訳铸型となる DNA 又は RNA、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、 ATP再生系、 核酸分解酵素阻害剤、 tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、 CAMP、葉酸類、 抗菌剤、また铸型として DNAを用いる場合には RNA合成の基質、及び RNAポリメ ラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の 種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌の S30抽出液の場合は、 Tri s 酢酸、 DTT、 NTPs (ATP, CTP, GTP,及び UTP)、ホスホェノールピルビン酸 、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸 (天然の 20種類のアミノ酸の外それ らの誘導体を含む。放射性同位元素でタンパク質を標識する場合には標識アミノ酸 を除いた残りを添カ卩する。）、ポリエチレングリコール（PEG)、葉酸、 cAMP、 tRNA、 酢酸アンモニゥム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネ シゥム等の一部あるいは全部を添加する。これらの補充的な混合液は、通常 S30抽 出液とは別に保存しておき、使用直前に混合するが、これらを S30抽出液とあらかじ め混合して凍結融解を行い、 RNA分解酵素複合体を除去することもできる（国際公 開 WO0183805号パンフレット参照）。
[0019] 本発明の方法に用いるために上記方法により調製された大腸菌の細胞抽出液は、 使用しゃす ヽように一定量ごと分注して、直鎖状铸型 DNA用の無細胞タンパク質合 成キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存するこ とができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには 取扱説明書や陽性コントロール DNA、ベクター DNA等を添付することができる。
[0020] 本発明の方法に用いられる直鎖状铸型 DNAは、適当な発現制御領域と、発現さ せた 、所望のタンパク質をコードする遺伝子配列とを含む二本鎖 DNAである。当該 タンパク質の発現効率を上げるためには強力なプロモーターやターミネータ一を用 V、て転写を促進すると共に、 mRNAとリボソームとの親和性を上げて翻訳効率を高 める必要がある。例えば、 T7ファージに由来する T7RNAポリメラーゼは極めて強力 な転写活性を有し、高 、レベルで組換えタンパク質を生成することが知られて！/、る。 さらに SD配列とも呼ばれるリボソーム結合配列 (RBS)を導入することが翻訳効率を 上げるために重要である。また、合成されたタンパク質を迅速に精製、若しくは検出 するためにはァフィユティー標識 (タグ)配列を組み込んだ融合タンパク質が合成でき るように铸型 DNAを設計することもできる。このような直鎖状铸型 DNAを効率的に製 造するための改善された方法は本出願人により国際公開第 03004703号パンフレツ トに開示されており、その内容も参照により本出願に組み込まれる。
[0021] 本発明の無細胞タンパク質合成系には、バッチ法、連続フロー法等、従来公知の 技術が適用可能であるが、本発明の方法は、長時間の連続反応に適しており、少な くとも 1時間、好ましくは 2〜8時間の連続的なタンパク質合成反応に適している。合 成反応の途中で透析外液を新鮮なものと交換する等、反応系を工夫することによつ て 18時間あるいはそれ以上の連続合成も可能である。
[0022] [透析装置]
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を 用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えば Dispo Dialyzer (登録商 標) (Spectrum社製)や Slidealyzer (登録商標) (Pierce社製)が挙げられる。また、大スケ ール反応用装置としては、 Spectra/Por (登録商標)透析用チューブ (Spectrum社製)を 例示できる。
[0023] [透析内液]
無細胞タンパク質合成系における透析内液 (すなわち、タンパク質合成反応液）に は、大腸菌 S30等の濃縮細胞抽出液の他に、 目的のタンパク質をコードする DNA、 ATP (アデノシン 5， -三リン酸）、 GTP (グアノシン 5， -三リン酸）、 CTP (シチジン 5， —三リン酸）、 UTP (ゥリジン 5，—三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、 RNァーゼ阻害 剤、抗菌剤、 RNAポリメラーゼ (例えば T7RNAポリメラーゼ等）および tRNA、など を含んでもよい。その他、 ATP再生系としてホスホェノールピルペートとピルビン酸キ ナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、 ポリエチレングリコール（例えば # 8000)、 3，， 5，—cAMP、葉酸類、 RNァーゼ阻 害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。
[0024] [透析外液]
一方、透析外液 (すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成カゝら細胞 抽出液、 RNァーゼ阻害剤、 DNAもしくは RNA、 RNAポリメラーゼを除いたものが 使用できる。例えば、緩衝液、 ATP、 GTP、 CTP、 UTP、塩類、アミノ酸、抗菌剤な どを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。緩衝液として は、例えば Hepes— KOH、 Tris— OAcのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、 酢酸塩 (例えばアンモ-ゥム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗 菌剤の例はアジィ匕ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成す る 20種のアミノ酸である。
[0025] 透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子 量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌 (回転 攪拌など)し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することがで きる。
[0026] 以下に本発明の実施例として、 CATタンパク質を用いて本発明の方法について詳 細に説明する力 本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例 [0027] [種々の温度で培養した大腸菌の S30抽出液を用いた CATタンパク質の合成] 大腸菌 BL21コドンプラス株を通常の液体培地を用いて一晩培養し、種培養を行つ た。この種培養液を 7Lの 2xYT培地（16gZlのバタトトリプトン、 lOgZlの酵母エキス 、及び 5gZlの NaCl)を含むフアーメンターに接種し、十分な通気を行いながら 400r pmの攪拌速度にて 30°C、 32°C、 34°C及び 37°Cのそれぞれの温度で培養を行った 。培養液の濁度 (600nmの吸光度)を指標として菌体数を推定し、対数増殖期後期（ 600nmの吸光度が約 3、菌体数では約 109個 Zmlのとき）に細胞を回収してズべィ ら (前掲)の方法に従って大腸菌 S30抽出液を調製した。
[0028] タンパク質合成反応の铸型 DNAとして、 CAT発現用プラスミドベクターである pK7
-CAT (Kim et al.， Eur. J. Biochem. 239, 881-886, 1996参照）、及びこれを铸型と して PCRで増幅した直鎖状二本鎖 DNAの両方を用いた。この直鎖状二本鎖 DNA の調製は、 5，プライマー M13— 45Fw: 5，— CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC— 3' ( 配列番号 1)及び 3 'プライマー Ml 3Rev: 5'- AATTTCACACAGGAAACAGCTATG AC-3' (配列番号 2)を用いて下記の表 1に示した組成の反応液中で通常のポリメラ ーゼ連鎖反応 (PCR)を行った。反応条件は、初期変性を 94°Cで 2分間行ったあと、 94°Cで 30秒間、 53°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間のサイクルを 10回、続いて 94°Cで 3 0秒間、 53°Cで 30秒間、 72°Cで（2分 + 5秒 Zサイクル）間のサイクルを 20回繰り返 し、最後に 72°Cで 5分間の伸長反応を 1回行った。
[0029] [表 1]
錶型 DNA (pK7— CAT)
1 0 x HiFi PCR buffer
5, プフ 、 I o M )
3'—プライマー（1 0 M )
2. Sm MdNTPs
Expand HiFi DNAポリメラ'
水で 50 Iとする。
(全量 50 Iスケール） このようにして調製した直鎖状铸型 DNA及び環状プラスミド pK7— CATを用い、 下記の表 2に示した組成の溶液を、表 3に示した組成の透析外液に対して透析し、 3 0°Cで途中サンプリングを行 、ながら 18時間までタンパク質合成反応を行った。反応 スケールは反応液 30 1、透析外液 300 1とした。合成された CATタンパク質の定 量は Shawらの方法 (Methods Enzymol.735-755, 1975参照)に従った。すなわち、ァ セチルコェンザィム Aとクロラムフエ-コールを基質として CATによるクロラムフエニコ ールのァセチルイ匕反応を行い、その結果生じた還元型コェンザィム Aを 5, 5'—ジチ オピス 2 -トロ安息香酸（DNTB)を用いて発色定量した。 37°C、 412nmにおけ る吸光度の単位時間当たりの増加量より CATの活性を定量し、これを指標として CA Tタンパク質量を決定した。なお、対照実験として、表 2に示した組成のうち、アミノ酸 としてシスティンのみ 3mMとし、アジ化ナトリウム無添加、 T7RNAポリメラーゼを 133 μ g/ml,大腸菌 S30抽出液を反応液の 24容量％、及び铸型 DNAをそれぞれ 4 gZmlとなるように変更して 37°C、 1時間バッチ法による合成反応を行った。
[0031] [表 2]
タンパク質合成反応液組成
組 成 濃 度
H E P E S - K OH p H 7. 5 58. OmM ジチオスレィ トール（D T T) 1.8m
A T P 1.2m
C T F、 G T F、 U T P 各 0.8m クレアチンリン酸 80. OmM クレアチンキナーゼ 0.25mg/ml ポリエチレングリコール 8 0 0 0 4.0%
3 ' 、 5 ' c AM P 0.64mM
L (-） - 5 -フオルミル- 5, 6, 7, 8, -テ トラ-ヒ ドロ葉酸 68 μ Μ 大腸菌トータル t R NA 175 μ g/ml グルタミン酸カリ ウム 20 OmM 酢酸アンモニゥム 27m 酢酸マグネシウム 10. 7m アミノ酸（2 0種類） 各 1. 5mM アジ化ナトリ ウム 0.05%
T7RNAポリメラーゼ 66.611 g/ml 大腸菌 S30抽出液 反応液の 30容量％ 銪型 D N A (発現ベクター p K 7 — C AT又は直鎖状 D N 1 μ g/ml
A)
[0032] [表 3] 透析外液組成
組 成 濃 度
Figure imgf000013_0001
C T P G T P U T P 8 m M ク レアチンリ ン酸 0 m M ポリエチレングリ コール 8 0 0 0 4 0 %
3 ' 5 c A M P 0 . 6 4 m M
L (一）— 5—フオルミル— 5 , 6, 7 , 8 ,ーテ ヒ ドロ葉酸 6 8 β M グルタ ミン酸カリ ウム 2 0 0 m M 酢酸アンモニゥム 2 7 m M 酢酸マグネシウム 1 4 9 m M アミノ酸（2 0種類） 各 1 5 m M アジ化ナト リ ウム 0 0 5 % トリス酢酸 （ ρ H 8 . 2 ) 3 m M 酢酸力リ ウム 1 8 m M
[0033] 図 1は、上記透析法による合成反応 5時間後の反応溶液を用いて CAT活性を測定 し、タンパク質量を定量した結果を示す。 30°C 37°Cの何れの温度においてもプラ スミド DNAを铸型とした場合の方がタンパク質合成量は多 ヽが、直鎖状 DNAを铸型 とした場合には、 S30抽出液を調製するための大腸菌の培養温度によって、タンパク 質の合成量に大きな差が生じた。培養温度 37°Cでは、直鎖状 DNAを铸型とした場
8
o o
合のタンパク質の合成量は、プラスミド DNAに比べて 3分の 1以下となった力 培養 温度が低下するに従って徐々に増加し、培養温度 30°Cではプラスミド DNAを用い た場合とほぼ同程度のタンパク質合成量が認められた。
[0034] 一方、図 2は対照実験として行ったバッチ法によるタンパク質合成の結果を示す。こ の合成条件においては 37°C 1時間でほぼ合成反応は終了するため、铸型 DNAの 種類によって合成量に大きな差は生じないが、図 2から明らかなように CATタンパク 質の合成量自体は、上記透析法による合成量よりもはるかに低いものである。
[0035] 図 3は、上記透析法により 18時間合成反応を行った反応液 1 μ 1を試料として SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果である。図 3の左半分はプラスミド DN Αを铸型とした場合の、大腸菌の各培養温度につ!ヽて合成されたタンパク質を示し、 右半分は直鎖状 DNAを铸型とした場合の同様の結果を示す。試料の両端には分子 量マーカーを流した。図 3から明らかなように、分子量 23kダルトン (Da)付近に検出 される CATタンパク質は、プラスミド DNAを用いた場合は、大腸菌の培養温度に影 響を受けないが、直鎖状 DNAを用いた場合には大腸菌の培養温度の低下に伴って タンパク質のバンドの濃さが増加していることが認められ、上記図 1に示した結果と再 現性よく一致した。

Claims

請求の範囲
[1] 18°C乃至 36°Cの何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコ ードする直鎖状铸型 DNAとを含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも 1時 間連続的な合成反応を行うことを特徴とするタンパク質の製造方法。
[2] 前記大腸菌の培養温度が 20°C乃至 34°Cである請求項 1に記載の方法。
[3] 前記無細胞タンパク質合成系が透析系又は連続フロー系である請求項 1又は 2〖こ 記載の方法。
[4] 前記透析系が、前記抽出液と前記直鎖状铸型 DNAとを含む透析内液と、タンパク 質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可能な透析 膜とを備えることを特徴とする請求項 3に記載の方法。
[5] 前記抽出液が S30抽出液である請求項 1〜4何れか一項に記載の方法。
[6] 前記直鎖状铸型 DNAが PCR増幅産物である請求項 1〜5何れか一項に記載の方 法。
[7] 前記大腸菌が BL21株、又は BL21コドンプラス株である請求項 1〜6何れか一項 に記載の方法。
[8] 18°C乃至 36°Cの何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液を含むことを特徴 とする、直鎖状铸型 DNA用の無細胞タンパク質合成キット。
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