WO2018198543A1 - 無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キット - Google Patents

無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キット Download PDF

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WO2018198543A1
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cell
acid
reaction mixture
protein synthesis
free protein
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俊将 本間
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a reaction mixture for cell-free protein synthesis, a cell-free protein synthesis method using the same, and a cell-free protein synthesis kit.
  • Recombinant protein production methods include in vivo methods including culturing transformed cells and in vitro using cell-derived extracts (cell extracts) called so-called cell-free protein synthesis methods. The method is known.
  • in vitro cell-free protein synthesis methods (1) can direct resources for protein synthesis to the exclusive production of the protein of interest ( 2) Since it does not relate to cell growth or survival, the synthesis environment can be flexibly changed, such as conditions such as tRNA level changes reflecting the codon usage of genes, redox potential, pH, or ionic strength, 3) A protein product that has been purified and properly folded can be easily recovered as it is, (4) A non-naturally-isotopically labeled amino acid can be incorporated, and (5) In vivo unstable, insoluble or cellular The ability to synthesize proteins that are toxic, (6) proteins that are difficult to make in vivo because they require unique cofactors Point may be synthesized, and (7) is believed to have the advantages of cloning, such that it is possible to avoid the process of transformation, such as the cell for expression in vivo. For this reason,
  • cell extracts used in cell-free protein synthesis methods cell extracts prepared from plants, animals, cultured cells, microorganisms and the like are known, and kits are currently commercially available from several companies. ing.
  • the cell-free protein synthesis method has a low production efficiency because the reaction duration for synthesizing the protein is short.
  • a continuous flow system using a dialysis membrane has been developed that supplies the substrate consumed by the translation reaction and removes by-products that inhibit the reaction by dialysis.
  • it is necessary to continuously add a reagent in order to increase the amount of protein synthesis by this continuous flow system, it is necessary to continuously add a reagent, and there is a problem that the cost of the reagent increases.
  • the reagents used in the cell-free protein synthesis method include ATP and GTP necessary for protein synthesis reaction, and UTP and CTP necessary for the synthesis of mRNA when DNA is used as a template nucleic acid. Since it is a rather expensive reagent, the cell-free protein synthesis method is very expensive.
  • a cell-free protein synthesis method using a nucleotide cheaper than the above-mentioned nucleoside triphosphates such as AMP, GMP, UMP and CMP (Patent Document 1), or a nucleoside such as adenosine, guanosine
  • Patent Document 2 a cell-free protein synthesis method using uridine and cytidine
  • these reagents are also considerably more expensive than reagents used for in vivo methods.
  • Adenosine, guanosine and the like are not suitable for industrial use because of their low solubility in water.
  • Non-Patent Document 3 a certain result has been obtained by reviewing the energy regeneration system in the in vitro reaction (Patent Document 3, Non-Patent Document 2), and granulocyte macrophage colony stimulation Succeeded in synthesizing 700 mg / L of factor in 10 hours (Non-patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a novel approach for inexpensive protein synthesis in a cell-free protein synthesis method.
  • inosinic acid is an alternative to nucleotides and nucleosides corresponding to ATP, GTP, UTP and CTP. It has been found that proteins can be synthesized at low cost by a cell-free protein synthesis method by using the method, and the present invention has been completed.
  • a reaction mixture for cell-free protein synthesis comprising a cell extract and inosinic acid.
  • the cell extract is a cell extract derived from at least one cell selected from the group consisting of plants, animals and microorganisms.
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of E. coli and yeast.
  • reaction mixture according to any one of [1] to [5], further comprising a template nucleic acid, a substrate for target protein synthesis, and an energy source.
  • the template nucleic acid comprises DNA encoding at least one promoter and a target protein.
  • the energy sources are ATP, GTP, glucose, ribose, pyruvate, phosphoenolpyruvate, carbamoyl phosphate, acetyl phosphate, creatine phosphate, phosphopyruvate, glyceraldehyde-3-phosphate, 3-phosphoglycerate and glucose-6 -At least one selected from the group consisting of phosphate, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, glyoxylic acid and glutamic acid, The reaction mixture according to [6].
  • a cell-free protein synthesis kit comprising a cell extract and inosinic acid, a template nucleic acid, a substrate for protein synthesis, and / or an energy source.
  • the reaction mixture for cell-free protein synthesis of the present invention contains a cell extract and inosinic acid that can be industrially mass-produced, so that it can be produced at the same productivity as AMP, GMP, UMP, and CMP at low cost. Proteins can be synthesized. Inosinic acid also has the advantage of being easy to handle due to its high solubility compared to adenosine and guanosine. Furthermore, according to the cell-free protein synthesis method of the present invention, the cost of protein synthesis in the method can be reduced by using the reaction mixture for cell-free protein synthesis of the present invention, and the protein can be efficiently and industrially produced. Production can be done.
  • Test Example 1 a growth curve (black triangle) of BL21 strain cultured in a modified 2 ⁇ YTPG medium using glycerol as a carbon source and a growth curve of BL21 strain cultured in a normal 2 ⁇ YTPG medium using glucose as a carbon source It is a graph which shows the comparison of (black circle). In Test Example 2, it is a graph showing the results of measuring the fluorescence intensity of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method over time.
  • Example 1 it is a graph which shows the result of having compared the fluorescence intensity of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method.
  • the black bars show the results for the reaction mixture containing AMP, GMP, UMP and CMP, and the shaded bars show the results for the reaction mixture containing inosinic acid.
  • reaction mixture for cell-free protein synthesis contains a cell extract and inosinic acid.
  • Cell extract As long as the cell extract according to the present embodiment can generate a protein encoded by the template nucleic acid, those skilled in the art appropriately use those derived from any cell such as plants, animals, cultured cells, microorganisms, and the like. Can be selected and used.
  • plant-derived cell extracts include gramineous plants such as wheat, barley, rice, and corn, and cell extracts derived from seed germs such as spinach.
  • cell extracts derived from seed germs such as spinach.
  • commercially available cell extracts derived from plants include wheat germ-derived wheat extract (manufactured by Promega), PROTEIOS (manufactured by Cell Free Science).
  • animal-derived cell extracts include cell extracts derived from blood cells and gonad-derived cells of mammals such as rabbits, humans, rats, mice, and monkeys.
  • animal-derived cell extracts include rabbit reticulocyte lysate systems (manufactured by Promega).
  • cell extracts derived from cultured cells include lymphoma (lymphoma) -derived cells, tumor cells, stem cells, and insect culture cells such as High Five (manufactured by Invitrogen) and Sf21 (manufactured by Invitrogen). And cell extracts derived from silkworm tissue and the like.
  • lymphoma lymphoma
  • insect culture cells such as High Five (manufactured by Invitrogen) and Sf21 (manufactured by Invitrogen).
  • cell extracts derived from silkworm tissue and the like cell extracts derived from silkworm tissue and the like.
  • insect cell-derived cell extracts commercially available insect cell-derived cell extracts such as Transdirect insect cell (manufactured by Shimadzu Corporation) can also be used.
  • a cell extract derived from microorganisms for example, a cell extract derived from yeast, Escherichia coli or the like can be used.
  • a cell extract of yeast for example, Yeast, 1986, Vol. 2, pp. 35-52, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1991, Vol. 36, pp. 2548-2554, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-208640, and the like.
  • any of spore yeast, basidiomycetous yeast, and incomplete yeast can be used, but spore yeast is preferred.
  • Fission yeast is preferable as the spore yeast. Examples of the fission yeast include Schizosaccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, and the like.
  • preparation of a cell extract derived from yeast can be performed, for example, as follows.
  • the yeast cells are rapidly frozen using an inert gas such as liquid nitrogen, acetone-dry ice or the like, and the cells are crushed with the cells frozen.
  • an inert gas such as liquid nitrogen, acetone-dry ice or the like
  • a method of crushing the frozen yeast cells As a method of crushing the frozen yeast cells, a method of crushing the yeast cells using a pestle in a mortar, a method of using a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) using a metal cone as a crushing medium, etc. Can be mentioned.
  • a solution for extracting yeast cells can be prepared by adding an extraction solution to the crushed yeast cells.
  • the extraction liquid a liquid containing a protease inhibitor in the liquid for extraction is preferable, and a liquid containing at least a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol and a buffer is more preferable.
  • potassium salt examples include potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate, potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate and the like. Potassium acetate is preferred.
  • the potassium salt content is preferably 1 mM to 500 mM, more preferably 10 mM to 300 mM.
  • magnesium salt examples include magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, magnesium lactate, magnesium nitrate, and magnesium oxalate, with magnesium acetate being preferred.
  • the content of the magnesium salt is preferably 0.01 mM to 10 mM, and more preferably 0.1 mM to 5 mM.
  • the content of dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is preferably 0.01 mM to 10 mM, and more preferably 0.1 mM to 5 mM.
  • the buffer examples include HEPES-KOH, Tris-HCl, acetic acid-sodium acetate, citric acid-sodium citrate, phosphoric acid, boric acid, MES, and PIPES.
  • a buffer that maintains the pH of the extraction solution at 4 to 10, more preferably a pH of 6 to 8.
  • the content of the buffer is preferably 5 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM.
  • the cell extract of E. coli can be obtained, for example, according to a known method described in Non-Patent Document 1 or Non-Patent Document 3, for example, 1) a step of culturing E. coli, 2) recovering E. coli, and It can be obtained through a step of obtaining an extract.
  • the gene associated with the endogenous protein may be removed from the E. coli used in advance by a known genetic engineering technique. Good.
  • a medium for culturing Escherichia coli it is a liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by Escherichia coli. It may be used.
  • the carbon source for example, glucose, sucrose, maltose, glycerol can be used.
  • glucose and glycerol are preferable, and glycerol is more preferable.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • the medium for culturing Escherichia coli include, for example, a modified 2 ⁇ YTPG medium (Table 1) in which the glucose in the 2 ⁇ YTPG medium and the 2 ⁇ YTPG medium are replaced with glycerol.
  • a known antifoaming agent examples include ADEKA (registered trademark) LG-295S.
  • the addition amount of the antifoaming agent may be, for example, 0.5 to 2 ml / L, and preferably 1 ml / L.
  • the pH of the medium may be 6 to 8, for example, and is preferably pH 7.
  • the pH of the medium can be adjusted using NaOH or the like.
  • T7 RNA polymerase or the like when E. coli capable of expressing T7 RNA polymerase or the like is used, a cell extract containing T7 RNA polymerase or the like in advance can be obtained.
  • an inducing agent such as IPTG
  • an inducing agent such as IPTG may be added to the medium.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature can be, for example, 15 to 40 ° C.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH during culture can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • Cultivation may be performed, for example, until the initial to late logarithmic growth is reached, and is preferably performed until the middle phase of logarithmic growth is reached.
  • the culture time is within these ranges, a cell extract with better protein synthesis efficiency can be obtained.
  • the middle phase of logarithmic growth is usually reached by culturing at a culture temperature of 36 ° C. for 4 to 6 hours.
  • fed-batch culture in which a medium (feed solution) is fed into the culture solution continuously or intermittently according to the passage of the culture time may be performed.
  • the fed-batch culture may be performed in E. coli according to a known method.
  • the carbon source mentioned in the above culture medium can be used as the carbon source in the feed solution.
  • glycerol when used in the culture medium, it is preferable to use glycerol as the carbon source of the feed solution.
  • a feed solution prepared by adjusting the concentration of the carbon source according to the growth of the cells may be prepared. However, a feed solution containing 30 to 70% of the carbon source is cultured in an appropriate amount according to the growth of the cells. It may be added inside.
  • Step 2 Step of recovering cultured E. coli and obtaining cell extract
  • the step of recovering E. coli cultured in step 1) and obtaining the cell extract from the recovered E. coli is used in the art for the purpose of cell-free protein synthesis. Can be carried out by known methods. For example, it can be performed according to the protocols described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2. Specific methods for obtaining the cell extract include, for example, the following method of recovering cultured E. coli cells and destroying the recovered E. coli cells.
  • the cells are collected from the culture solution and kept at a low temperature until a cell extract is obtained. Specifically, it can be carried out at a low temperature of, for example, 0 to 15 ° C., preferably 2 to 10 ° C.
  • Examples of the method for recovering E. coli cells from the E. coli culture solution include a centrifugation method and a filtration method.
  • E. coli cells can be recovered by centrifuging at 4 ° C. and 7,000 to 14,000 ⁇ g for 20 to 50 minutes.
  • the washing solution a solution containing an inorganic salt and a compound having a buffering action, for example, an S30 buffer solution or the like is used.
  • the S30 buffer can be prepared as follows. For example, 6.06 g of 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 15.0 g of magnesium acetate tetrahydrate and 29.4 g of potassium acetate were added to about 450 ml of pure water, preferably milli-Q or the like. Dissolves in ultrapure water.
  • the obtained S30 buffer solution can be stored at 4 ° C., diluted 10-fold with ultrapure water immediately before use, and added with 1M DTT aqueous solution to a final concentration of 2 mM.
  • the step of washing E. coli cells using a solution containing the above-mentioned inorganic salt and a compound exhibiting a buffering action is performed by, for example, suspending the recovered cells in the solution and centrifuging.
  • the recovering step can be performed by repeating, for example, 2 to 3 times.
  • the suspension can be efficiently homogenized by using a homogenizer or the like.
  • the cells can be collected from the homogenized suspension by, for example, centrifuging for 10 to 50 minutes at 4 ° C. and 9,000 to 14,000 ⁇ g.
  • the washed cells can be stored at -80 ° C. Freezing at ⁇ 80 ° C. is preferably performed by rapid cooling using liquid nitrogen or the like.
  • Examples of means for destroying E. coli cells include means using a lytic enzyme such as an ultrasonic crusher, a French press, a high-pressure homogenizer, a dynomill, a mortar, glass beads, and lysozyme.
  • a lytic enzyme such as an ultrasonic crusher, a French press, a high-pressure homogenizer, a dynomill, a mortar, glass beads, and lysozyme.
  • a lytic enzyme such as an ultrasonic crusher, a French press, a high-pressure homogenizer, a dynomill, a mortar, glass beads, and lysozyme.
  • a lytic enzyme such as an ultrasonic crusher, a French press, a high-pressure homogenizer, a dynomill, a mortar, glass beads, and lysozyme.
  • it may be performed at a pressure of 600 to 1,700 bar and a flow rate of about 1 ml / min. From a
  • the state of destruction can be confirmed by analyzing the liquid before and after destruction with a particle size distribution meter. It is preferable to add DTT to the bacterial cell disruption solution so that the final concentration is 1 mM.
  • a cell suspension obtained by resuspending the collected cells in a solution (for example, S30 buffer) containing the above-described inorganic salt and a compound having a buffering action is used. It is preferable.
  • the bacterial cell suspension include a bacterial cell suspension obtained by adding a solution such as 1 to 2 mL of S30 buffer per 1 g of recovered bacterial cells.
  • a solution such as 1 to 2 mL of S30 buffer per 1 g of recovered bacterial cells.
  • a cell extract from which cell debris and genomic DNA have been removed It is preferable to use a cell extract from which cell debris and genomic DNA have been removed.
  • the removing method include a centrifugal separation method and a filtration method. For example, the process of centrifuging for 20 to 50 minutes at 4 ° C under conditions of 10,000 to 30,000 xg and obtaining the supernatant is repeated 2 to 3 times, for example, to remove cell debris and genomic DNA. can do.
  • a cell extract excluding endogenous nucleic acids Insoluble components generated by the treatment with the activated mix added can be removed by a centrifugal separation method or the like under the same conditions as described above. By this operation, endogenous RNA can be removed. Endogenous nucleic acid can be decomposed by further adding a nuclease or the like. In that case, it is preferable to add a nuclease inhibitor after the nucleic acid degradation. Endogenous amino acids, nucleic acids, nucleosides and the like can also be removed by dialysis.
  • the cell extract can be stored at ⁇ 80 ° C. Freezing at ⁇ 80 ° C. is preferably performed by rapid cooling using liquid nitrogen or the like.
  • the content of the cell extract in the reaction mixture according to this embodiment may be 5 to 70% (volume / volume) or 10 to 50% (volume / volume) based on the total amount of the reaction mixture. It may be 20-40% (capacity / capacity) or 20-30% (capacity / capacity).
  • the wet cell (g) / reaction mixture (mL) ratio used to obtain the cell extract may be 0.01-1 g / mL, and may be 0.05-0.3 g / mL. .
  • the reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present invention contains inosinic acid as an energy source and a substrate supply source required for mRNA synthesis.
  • Examples of the energy source include ATP, GTP, glucose, ribose, pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP), carbamoyl phosphate, acetyl phosphate, creatine phosphate, phosphopyruvate, glyceraldehyde-3-phosphate, 3-phospho Examples include glycerate, glucose-6-phosphate, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, glyoxylic acid, and glutamic acid. In the case of an energy source that does not contain a phosphate group, it is preferable to add inorganic phosphoric acid to the reaction mixture.
  • inosinic acid has an industrial production process established as an umami component, and is very cheap compared to nucleotides used for normal cell-free protein synthesis. Furthermore, it is more than 1000 times more soluble in water than adenosine and guanosine, which can be nucleotide precursors. Therefore, the reaction mixture for cell-free protein synthesis according to the present invention can be easily used not only as a reaction mixture in a batch method but also as an external liquid component in a permeation method.
  • inosinic acid as a salt to the reaction mixture according to the present embodiment.
  • the salt of inosinic acid include a sodium salt, such as disodium inosinate.
  • the content of inosinic acid in the cell-free protein synthesis reaction mixture according to this embodiment may be 0.1 to 10 mM, 0.5 to 8 mM, or 1 to 8 mM based on the total amount of the reaction mixture. It may be 5 mM and may be 2-4 mM.
  • the inosinic acid when used as a source of ATP, GTP, UTP and CTP necessary for mRNA synthesis, the inosinic acid is added to the reaction mixture containing the cell extract and the energy source before the template nucleic acid is added. Is preferably added.
  • the reaction mixture for cell-free protein synthesis can contain at least one of the following components (i) to (viii) as necessary.
  • Template nucleic acid The template nucleic acid only needs to contain DNA or RNA encoding the target protein to be expressed and DNA or RNA containing an appropriate expression control region, and can be in either linear or circular form. May be. Examples of the expression control region include a promoter sequence, terminator sequence, enhancer sequence, poly A addition signal, and ribosome binding sequence.
  • the template nucleic acid preferably contains at least one promoter and DNA encoding the target protein.
  • the amount of template nucleic acid to be added is preferably 0.1 to 50 ⁇ g / mL, more preferably 1 to 20 ⁇ g / mL, based on the total volume of the reaction mixture.
  • the template nucleic acid may be designed so that a fusion protein incorporating a tag sequence can be synthesized so that the synthesized protein can be easily detected or purified.
  • a tag sequence for example, an affinity tag such as a histidine tag (His tag) utilizing specific affinity (binding, affinity) with other molecules, glutathione that specifically binds to glutathione-S- Examples include tag sequences such as transferase (GST) and maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose.
  • GST transferase
  • MBP maltose binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction may be used. Examples of the epitope tag include HA (peptide sequence of influenza virus hemagglutinin) tag, myc tag, and FLAG tag. Further, a tag sequence that can be separated with a specific protease can also be used.
  • RNA polymerase When the template nucleic acid is DNA, RNA polymerase can be included. As the RNA polymerase, an RNA polymerase that recognizes one or more transcription factors targeting the template nucleic acid can be used.
  • the reaction mixture of the present invention preferably contains T7 RNA polymerase from the viewpoint of improving the production efficiency of the target protein. T7 RNA polymerase may be added when preparing the reaction mixture. As described above, T7 RNA polymerase is added to the cell extract using a strain such as BL21 (DE3) capable of expressing T7 RNA polymerase. It may be included.
  • the reaction mixture according to this embodiment may contain amino acids necessary for synthesizing the target protein.
  • the amino acids may include all 20 types of amino acids constituting the protein, and may be appropriately selected from 20 types in consideration of the target protein, the reagent to be used, and the like. Unnatural amino acids may also be used. When an unnatural amino acid is used, it is necessary to add factors such as tRNA and aminoacylated tRNA synthetase that have been modified to introduce the unnatural amino acid into a protein.
  • a substrate for RNA synthesis can be included in order to further increase the amount of protein synthesis.
  • the substrate for RNA synthesis include ribonucleotides such as ribonucleotide triphosphate (rNTP) and ribonucleotide monophosphate (rNMP), and ribonucleosides such as adenosine.
  • the reaction mixture according to the present embodiment can contain polyamines.
  • polyamines that can be included in the reaction mixture include spermine, spermidine, and putrescine.
  • (V) Salt The reaction mixture according to this embodiment can contain a salt.
  • Salts that can be included in the reaction mixture include, for example, potassium, magnesium, ammonium, and manganese salts of acetic acid, glutamic acid, or sulfuric acid.
  • the reaction mixture according to this embodiment can include an oxidation / reduction regulator.
  • the oxidation / reduction regulator include DTT, ascorbic acid, glutathione, and / or oxides thereof.
  • ribosome transfer RNA
  • optional translation factors eg, translation initiation factor, elongation factor termination factor, ribosome recycling factor, etc.
  • cofactors thereof aminoacyl tRNA synthetase (ARS), methionyl tRNA formyl transfer Enzyme (MTF), polymer compound (eg, polyethylene glycol, dextran, diethylaminoethyl dextran, quaternary aminoethyl and aminoethyldextran), nuclease, nuclease inhibitor, protein stabilizer, chaperone, solubilizer, non-denaturing interface
  • An active substance for example, Triton X100 or the like may be added to the reaction mixture as necessary.
  • the cell-free protein synthesis method according to the present invention can be carried out using the reaction mixture according to the present invention in both dialysis methods and batch methods.
  • protein synthesis is performed in a closed system consisting of an internal solution containing the above reaction mixture and an external solution containing a substrate and an energy source for synthesis of the target protein separated by a dialysis membrane such as an ultrafiltration membrane.
  • a dialysis membrane such as an ultrafiltration membrane.
  • a substrate for synthesizing a target protein, an energy source, and the like are supplied from an external solution to the reaction mixture via a dialysis membrane, and extra by-products in the reaction mixture can be diffused into the external solution. Therefore, the reaction can be continued for a longer time.
  • the batch method is a synthesis method in which the reaction mixture containing all the components necessary for protein synthesis is mixed with the reaction solution and uniformly contained in the reaction solution, and the reaction is performed.
  • the reaction time is shorter than that of the dialysis method. The result is immediately available.
  • Protein synthesis may be performed at 20 to 40 ° C., for example, and is preferably performed at 30 ° C.
  • the reaction time for protein synthesis by the batch method is preferably 2 hours or more after mixing the cell extract and inosinic acid, regardless of whether or not the template nucleic acid is added.
  • the reaction time is preferably 3 to 40 hours, more preferably 5 to 25 hours after mixing the cell extract and inosinic acid.
  • the kit for cell-free protein synthesis according to the present invention contains a cell extract obtained from E. coli and inosinic acid. Inosinic acid may be pre-mixed with the cell extract (cell extract obtained from E. coli) and included in the kit as a cell extract containing inosinic acid, and independently of the cell extract. It may be included in this kit.
  • the kit may contain a cell extract and inosinic acid obtained from E. coli, a template nucleic acid, a substrate for target protein synthesis, and / or an energy source.
  • the template nucleic acid, the substrate for synthesizing the target protein, and the energy source may be mixed in advance with the cell extract, and may be included in the kit independently of the cell extract.
  • This kit may further contain the above-mentioned RNA polymerase, polyamines, salt, oxidation / reduction regulator, and other additives. These additives may be mixed in advance with the cell extract, and may be included in the kit independently of the cell extract.
  • E. coli culture (effect of carbon source)
  • Escherichia coli BL21 strain (Novagen Co., Ltd.) was cultured in a flask with 2 ⁇ YT medium (1.6% Bacto Tripton, 1% Yeast Extract, 0.5% NaCl) until OD 600 was 4.2.
  • the culture solution was modified 2 ⁇ YTPG medium with the composition of Table 1 using glycerol as a carbon source (Adeka (registered trademark) LG-295S was added as an antifoaming agent at 1 ml / L and adjusted to pH 7 with NaOH). 500 mL OD 600 was added to a 0.05 is entered a 1L jar fermenter.
  • the same strain was cultured in the same manner using a normal 2 ⁇ YTPG medium using glucose (18 g / L) as a carbon source.
  • the culture temperature was maintained at 36 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 7.0.
  • the dissolved oxygen concentration was maintained at 2.4 mg / L or more.
  • the growth curve is shown in FIG. Modified 2 ⁇ YTPG medium and specific growth rate when cultured in a conventional 2 ⁇ YTPG medium was respectively 1.08H -1 and 0.74h -1. This result is presumed to suggest that ribosomes in cells cultured with glycerol and enzymes of the energy regeneration system have higher activity.
  • a culture solution having a preferable cell concentration can be obtained in a shorter time than culturing using glucose as a carbon source, so that a cell extract can be obtained in a shorter time. It was shown that there is.
  • the culture solution 2L of the BL21 strain was centrifuged under conditions of 7,000 ⁇ g, 4 ° C., and 20 minutes to recover 31 g of wet cells.
  • the cells were washed with an S30 buffer solution (pH 8.2) containing 10 mM Tris-acetic acid, 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium acetate and 2 mM DTT, and then rapidly cooled to ⁇ 80 ° C. using liquid nitrogen.
  • the microbial cell crushed material was centrifuged twice under the conditions of 20,400 ⁇ g, 4 ° C. and 30 minutes to remove the microbial cell residue.
  • 20 types comprising 300 mM Tris-acetic acid, 13.2 mM magnesium acetate, 13.2 mM ATP, 4.4 mM DTT, 6.7 U / mL pyruvate kinase, 84 mM phosphoenolpyruvate and protein in 200 ⁇ L of the centrifugation supernatant 60 ⁇ L of an activation mix containing all of the amino acids (0.04 mM each) was added and incubated at 30 ° C. for 150 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 20,400 ⁇ g, 4 ° C. for 30 minutes, and the insoluble fraction was removed to obtain 230 ⁇ L of cell extract.
  • a DNA fragment (2) containing the replication origin and the ampicillin resistance gene sequence was prepared by the PCR method.
  • DNA fragment (1) and DNA fragment (2) were fused by a known In-Fusion reaction and transformed into E. coli HST08. After culturing the transformed E. coli, the plasmid was extracted using QIAGEN Plasmid Kit (manufactured by Qiagen).
  • a DNA fragment (3) containing the T7 promoter, RBS, T7 terminator, origin of replication and ampicillin resistance gene sequence was prepared by PCR.
  • a DNA fragment (4) containing a Holly-GFP gene was prepared by PCR using T5-HollyGFP (Cosmo Bio Inc.).
  • DNA fragment (3) and DNA fragment (4) were fused by a known In-Fusion reaction and transformed into E. coli HST08. After culturing the transformed E. coli, pUC-GFP was extracted using QIAGEN Plasmid Kit (manufactured by Qiagen) and used as a template nucleic acid for cell-free protein synthesis reaction.
  • PUC-GFP for template nucleic acid has high purity (A 260 / A 280 is 1.8 or more, A 260 / A 230 is 2.0 or more) using a spectrophotometer, and further, a DNA sequencer is used. The nucleotide sequence was read and it was confirmed that no unnecessary mutation was introduced.
  • Cell-free protein synthesis reaction 10 ⁇ L of the master mix containing the compound of Table 2, 6 ⁇ L of the prepared cell extract, 1 ⁇ L of 40 mM DTT aqueous solution, 2 ⁇ L of 0.2 g / L pUC-GFP (template nucleic acid) and 1 ⁇ L of 1000 U / ⁇ L T7 RNA polymerase were added to the reaction in a total volume of 20 ⁇ L.
  • a mixture (liquid) was prepared.
  • a negative control (NC) prepared by adding 2 ⁇ L of RO water instead of pUC-GFP was prepared.
  • the reaction mixture was transferred to a 384-well microplate, and the amount of GFP synthesis was compared by measuring the fluorescence intensity over time while incubating at 30 ° C. using a microplate reader TECANinfinite F200 (manufactured by Tecan Japan Co., Ltd.).
  • FIG. 2 shows the measurement result of the fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity of GFP in the case of using a cell extract derived from E. coli cultured in a medium containing glycerol as a carbon source is a cell derived from E. coli cultured in a medium containing glucose as a carbon source.
  • the value was about 2 times higher than the fluorescence intensity of GFP when the extract was used (FIG. 2).
  • the amount of GFP synthesized by the cell-free protein synthesis method using cell extracts derived from E. coli cultured in a medium containing glycerol as a carbon source is the same as the cell extract derived from E. coli cultured in a medium containing glucose as a carbon source. Compared with the cell-free protein synthesis method using, it was shown to be about twice as much.
  • Example 1 Cell-free protein synthesis method
  • the BW25113 strain lacking the rna gene was prepared by the method of Datsenko and Wanner, and the deletion was introduced into the T7 Express strain (New England Biolabs) by P1 transduction to prepare the T7 Express strain lacking the rna gene.
  • the rna gene is a gene involved in the synthesis of ribonuclease I and is involved in the stability of mRNA.
  • the T7 Express strain lacking the rna gene was cultured in a flask in 2 ⁇ YT medium (1.6% Bacto Tripton, 1% Yeast Extract, 0.5% NaCl) until the OD 600 was 3.5.
  • the culture broth contained 2.1 L of modified 2 ⁇ YTPG medium (added 1 ml / L of ADEKA (registered trademark) LG-295S as an antifoam agent and adjusted to pH 7 using NaOH) with the composition shown in Table 1
  • the 3 L jar fermenter was added to an OD 600 of 0.05 and main culture was performed.
  • the main culture was performed while maintaining the culture temperature at 36 ° C., controlling the pH of the medium to be constant at 7.0, and maintaining the dissolved oxygen concentration of the medium at 2.4 mg / L or more.
  • OD 600 reached 2
  • 1 mM IPTG was added to the medium to induce T7 RNA polymerase. Thereafter, the culture was continued until the mid-log OD 600 reached 12.
  • the microbial cell crushed material was centrifuged twice under the conditions of 20,400 ⁇ g, 4 ° C. and 30 minutes to remove the microbial cell residue.
  • the obtained supernatant was used as a cell extract.
  • FIG. 3 shows the measurement result of the fluorescence intensity.

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Abstract

本発明は、細胞抽出物とイノシン酸とを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物に関する。本発明はまた、当該反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法にも関する。本発明は更に、細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キットに関する。

Description

無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キット
　本発明は、無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キットに関する。
　組換えタンパク質の生産方法としては、形質転換された細胞を培養することを含む、インビボでの方法と、いわゆる無細胞タンパク質合成方法と呼ばれる、細胞由来の抽出物（細胞抽出物）を用いるインビトロでの方法が知られている。
　工業規模でのタンパク質の生産方法としては、現段階ではインビボでの方法が優れていると考えられている。しかしながら、インビボでの方法と比較して、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、（１）タンパク質の合成のための資源を、目的とするタンパク質の独占的な産生に向けることができる点、（２）細胞の増殖又は生存に関わることがないため、遺伝子のコドン使用を反映させたｔＲＮＡレベルの変更、酸化還元電位、ｐＨ、あるいはイオン強度といった条件等、合成環境を柔軟に変更できる点、（３）精製されて適切に折りたたまれたタンパク質産物をそのまま簡単に回収できる点、（４）非天然で同位体標識されたアミノ酸を組み入れことができる点、（５）インビボで不安定、不溶性又は細胞毒性であるタンパク質を合成することができる点、（６）独特の補因子を必要とするためにインビボでは作ることが難しいタンパク質を合成することができる点、及び（７）インビボにおける発現のためのクローニング、細胞の形質転換等のプロセスを回避することができる点等の利点を有すると考えられる。このため、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、この分野の基盤技術になりつつあり、ある程度、確立された方法となっている（非特許文献１）。
　また、無細胞タンパク質合成方法に用いられる細胞抽出物としては、植物、動物、培養細胞、微生物等から調製した細胞抽出物が知られており、現在、キット化されたものが数社から市販されている。
　しかしながら、インビボでの方法と比較して、無細胞タンパク質合成方法は、タンパク質を合成するための反応持続時間が短いため、生産効率が低い。この反応持続時間を増加させるため、翻訳反応により消費される基質を供給するとともに、反応を阻害する副産物を透析により除去する透析膜を使用した連続的流系が開発された。しかしながら、この連続的流系によりタンパク質合成量を増加させるためには連続的に試薬を追加することが必要となり、試薬等のコストが嵩む等の問題があった。
　特に、無細胞タンパク質合成方法に用いられる試薬には、タンパク質合成反応に必要なＡＴＰ及びＧＴＰ、並びに、ＤＮＡを鋳型核酸として使用した場合にｍＲＮＡの合成に必要なＵＴＰ及びＣＴＰなどがあり、これらはかなり高価な試薬であるため、無細胞タンパク質合成方法はコストが極めて高い。この点に対して、上記のヌクレオシド三リン酸等より安価なヌクレオチド、例えば、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを使用した無細胞タンパク質合成方法（特許文献１）、又はヌクレオシド、例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン及びシチジンを使用した無細胞タンパク質合成方法（特許文献２）が報告されているが、それらの試薬もインビボでの方法に使用する試薬と比較して、かなり高価なものである。また、アデノシン、グアノシン等は水への溶解度が低いため、工業利用には適していない。
　また、反応持続時間を増加させる別のアプローチとして、インビトロでの反応におけるエネルギー再生系を見直すことにより、一定の成果が得られており（特許文献３、非特許文献２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を１０時間で７００ｍｇ／Ｌ合成することに成功している（非特許文献３）。
　しかしながら、工業規模での生産においては、生産量及びコストを更に改善することが求められている。
特許第５０７４７６８号公報 国際公開第２０１３／１８３６２７号 特許第５２５９０４６号公報
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６７，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．１６９－１８２ Ｍｏｌ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂｉｏｌ．，２００８年，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２２０，ｐｐ．１－１０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１１年，ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．７，ｐｐ．１５７０－１５７８
　本発明は、無細胞タンパク質合成方法において安価にタンパク質合成を行うための新規なアプローチを提供することを目的とする。
　本発明者らは、タンパク質合成のコストを低下させることを狙って無細胞タンパク質合成方法に関する反応条件を鋭意検討した結果、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰに対応したヌクレオチド及びヌクレオシドの代替物質としてイノシン酸を用いることにより、無細胞タンパク質合成方法により、安価にタンパク質を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　細胞抽出物とイノシン酸とを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。
［２］
　上記細胞抽出物が、植物、動物及び微生物からなる群より選択される少なくとも１種の細胞由来の細胞抽出物である、［１］に記載の反応混合物。
［３］
　上記微生物が大腸菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、［２］に記載の反応混合物。
［４］
　上記大腸菌が、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、［３］に記載の反応混合物。
［５］
　上記細胞抽出物が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物である、［１］～［４］のいずれかに記載の反応混合物。
［６］
　鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、［１］～［５］のいずれかに記載の反応混合物。
［７］
　上記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、［６］に記載の反応混合物。
［８］
　上記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド－３－ホスフェート、３－ホスホグリセレート及びグルコース－６－ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ－アコニット酸、イソクエン酸、α－ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［６］に記載の反応混合物。
［９］
　［１］～［８］のいずれかに記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
［１０］
　細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
［１１］
　［９］に記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
　本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、細胞抽出物と、工業的に大量生産可能なイノシン酸とを含むことにより、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを用いるときと同等の生産性で安価にタンパク質を合成することができる。イノシン酸は、アデノシン及びグアノシンと比較して、溶解度が高いため取扱いが容易であるという利点もある。さらに、本発明の無細胞タンパク質合成方法によれば、上記本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いることにより、当該方法におけるタンパク質合成のコストを削減することができ、効率よく工業的にタンパク質生産を行うことができる。
試験例１において、グリセロールを炭素源とした改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒三角）と、グルコースを炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒丸）の比較を示すグラフである。 試験例２において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。白三角は、改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果、白丸は通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果を示し、黒三角及び黒丸はｐＵＣ－ＧＦＰの代わりに水を加えたネガティブコントロールの結果を示す（黒三角：改変２×ＹＴＰＧ培地、黒丸：通常の２×ＹＴＰＧ培地）。 実施例１において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を比較した結果を示すグラフである。黒棒は、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ及びＣＭＰを含む反応混合物の結果を示し、斜線棒は、イノシン酸を含む反応混合物の結果を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施態様に限定されるものではない。
〔無細胞系タンパク質合成用反応混合物〕
　本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物（以下、単に「反応混合物」ともいう。）は、細胞抽出物とイノシン酸とを含む。
（細胞抽出物）
　本実施形態に係る細胞抽出物は、鋳型核酸にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば、例えば、植物、動物、培養細胞、微生物等の任意の細胞由来のものを、当業者が適宜選択し用いることができる。
　植物由来の細胞抽出物としては、例えば、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科植物、ホウレンソウ等の種子の胚芽由来の細胞抽出物を挙げることができる。市販されている植物由来の細胞抽出物としては、例えばコムギ胚芽由来のｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ（プロメガ社製）、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（株式会社セルフリーサイエンス製）等を挙げることができる。
　動物由来の細胞抽出物としては、例えば、ウサギ、ヒト、ラット、マウス、サル等の哺乳動物の血球細胞及び生殖巣由来細胞等由来の細胞抽出物を挙げることができる。市販されている動物由来の細胞抽出物としては、例えばｒａｂｂｉｔ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）等を挙げることができる。
　培養細胞由来の細胞抽出物としては、例えば、リンパ腫（リンホーマ）由来細胞、腫瘍細胞、幹細胞等、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（インヴィトロジェン株式会社製）及びＳｆ２１（インヴィトロジェン株式会社製）等の昆虫培養細胞、カイコ組織等由来の細胞抽出物を挙げることができる。また、昆虫細胞由来の細胞抽出物としては、Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ（島津製作所製）等の市販の昆虫細胞由来の細胞抽出物を利用することもできる。
　微生物由来の細胞抽出物としては、例えば、酵母、大腸菌等由来の細胞抽出物を用いることができる。酵母の細胞抽出物としては、例えば、Ｙｅａｓｔ，１９８６，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．３５－５２、蛋白質核酸酵素，１９９１，Ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５４８－２５５４、特開２００４－２０８６４０号公報等に記載の方法で調製することができる。
　酵母としては、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母のいずれも用いることができるが、有胞子酵母が好ましい。有胞子酵母としては***酵母が好ましい。***酵母としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等を挙げることができる。
　また、酵母由来の細胞抽出物の調製は、例えば以下のように行うことができる。
　酵母菌体を、液体窒素などの不活性ガス、アセトン－ドライアイス等を用いて急激に凍結させ、菌体が凍結した状態で細胞の破砕を行う。
　当該凍結した酵母菌体を破砕する方法としては、乳鉢中で乳棒を用いて当該酵母菌体をすり潰す方法、メタルコーンを破砕媒体としてマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いる方法などを挙げることができる。
　当該破砕した酵母菌体に、抽出用液を添加することにより酵母菌体抽出用液を調製することができる。抽出用液としては、当該抽出用液にプロテアーゼインヒビターを含有するものが好ましく、少なくともカリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール及び緩衝剤を含有するものがより好ましい。
　上記カリウム塩としては、酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウム等を挙げることができ、酢酸カリウムが好ましい。当該カリウム塩の含有量は、１ｍＭ～５００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ～３００ｍＭであることがより好ましい。
　上記マグネシウム塩としては、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム等を挙げることができ、酢酸マグネシウムが好ましい。当該マグネシウム塩の含有量は、０．０１ｍＭ～１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ～５ｍＭであることがより好ましい。
　上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）の含有量は、０．０１ｍＭ～１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ～５ｍＭであることがより好ましい。
　上記緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸－酢酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ等を挙げることができる。具体的には、当該緩衝剤は、上記抽出用液のｐＨが４～１０に保持されるようなものを使用することが好ましく、ｐＨが６～８に保持されるようなものがより好ましい。当該緩衝剤の含有量は、５ｍＭ～２００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ～１００ｍＭであることがより好ましい。
　大腸菌の細胞抽出物は、例えば、非特許文献１又は非特許文献３に記載の公知の方法に準じて行うことができ、例えば、１）大腸菌を培養する工程、２）大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程を経て得ることができる。
１）大腸菌を培養する工程
　細胞抽出物の作製に用いる大腸菌としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリ　Ａ１９、ＢＬ２１（ノバジェン株式会社）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ株式会社）、ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、ＤＨ１、ＧＩ６９８、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｋ５（ＡＴＣＣ２３５０６）、Ｋ－１２、ＫＹ３２７６、ＭＣ１０００、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）、ＮＭＲ２、Ｎｏ．４９、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン株式会社）、ＴＢ１、Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン株式会社）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン株式会社）、Ｗ１４８５、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等の株を挙げることができる。
　また、細胞抽出物中にタンパク質合成に不利益を及ぼす内因性タンパク質が含まれる場合には、公知の遺伝子工学的手法により、使用する大腸菌から当該内因性タンパク質に関連する遺伝子を予め除去してもよい。
　大腸菌を培養するための培地としては、大腸菌が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有する液体培地であり、培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、マルトース、グリセロールを用いることができる。炭素源としては、グルコース及びグリセロールが好ましく、グリセロールがより好ましい。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌を培養するための培地の具体例としては、例えば、２×ＹＴＰＧ培地、２×ＹＴＰＧ培地のグルコースをグリセロールに替えた、改変２×ＹＴＰＧ培地（表１）等を挙げることができる。培養時の発泡を防ぐために、当該培地に公知の消泡剤を添加することが好ましい。消泡剤としては、例えばアデカ（登録商標）ＬＧ－２９５Ｓ等が挙げられる。消泡剤の添加量としては、例えば、０．５～２ｍｌ／Ｌであってよく、１ｍｌ／Ｌであることが好ましい。培地のｐＨは、例えば、６～８であってよく、ｐＨ７であることが好ましい。培地のｐＨの調整は、ＮａＯＨ等を用いて行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能な大腸菌を用いた場合には、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ等を予め含んだ細胞抽出物が得られる。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ等の発現がＩＰＴＧのような誘導剤により惹起される場合には培地にＩＰＴＧ等の誘導剤を加えればよい。
　培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、例えば、１５～４０℃で行うことができる。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養中のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　培養は、例えば、対数増殖初期～後期に達するまで行ってよく、対数増殖中期に達するまで行うのが好ましい。培養時間がこれらの範囲にあることで、タンパク質合成効率がより優れる細胞抽出物を得ることができる。培養培地として改変２×ＹＴＰＧ培地を用いる場合には、培養温度３６℃で、４～６時間培養することで通常対数増殖中期に達する。
　高濃度の菌体培養液を得るために、培養時間の経過に応じて連続的又は断続的に培地（フィード液）を培養液中へ流加する流加培養を行ってもよい。流加培養は大腸菌において公知の方法に準じて行えばよい。また、この流加培養において、フィード液中の炭素源としては、上記培養培地で挙げた炭素源を用いることができる。例えば、培養培地においてグリセロールを用いた場合には、フィード液の炭素源としてグリセロールを用いることが好ましい。炭素源の濃度を菌体の増殖に応じて調製したフィード液を準備してもよいが、３０～７０％の炭素源を含むフィード液を、菌体の増殖に合わせて適切な量で培養液中へ添加してもよい。
２）培養した大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程
　１）の工程で培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程は、無細胞タンパク質合成の目的のために当該分野において既知の方法により行うことができる。例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載のプロトコルに準じて行うことができる。細胞抽出物を得るための具体的な方法としては、例えば以下のような、培養した大腸菌の菌体を回収し、回収した大腸菌の菌体を破壊する方法等を挙げることができる。
　２）の工程において、培養液から菌体を回収し、細胞抽出物を得るまでは低温に保って行うことが好ましい。具体的には、例えば、０～１５℃、好ましくは２～１０℃の低温に保って行うことができる。
　大腸菌培養液から大腸菌の菌体を回収する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、７，０００～１４，０００×ｇの条件で２０～５０分間、遠心分離することにより大腸菌の菌体を回収することができる。
　回収後に、培地成分等を除去するため、回収した大腸菌の菌体を洗浄する工程を含むことが好ましい。洗浄溶液としては、無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液、例えば、Ｓ３０緩衝液等が用いられる。Ｓ３０緩衝液は以下のように調製することができる。例えば、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール６．０６ｇ、酢酸マグネシウム四水和物１５．０ｇ及び酢酸カリウム２９．４ｇを約４５０ｍｌの純水、好ましくはｍｉｌｌｉ－Ｑ等の超純水に溶解する。溶解後、酢酸でｐＨ８．２に調整し、５００ｍｌにメスアップし、０．２２μｍのフィルターで滅菌する。得られたＳ３０緩衝液は４℃で保存することができ、使用直前に超純水で１０倍に希釈し、最終濃度が２ｍＭになるよう１Ｍ　ＤＴＴ水溶液を加えたものを使用する。
　上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）を用いて大腸菌の菌体を洗浄する工程は、例えば、回収した菌体を、当該溶液に懸濁し、遠心分離で回収する工程を例えば２～３回繰り返すことにより行うことができる。懸濁はホモジナイザー等を用いることにより効率的に均質化できる。均質化した懸濁液からの菌体の回収は、例えば４℃、９，０００～１４，０００×ｇの条件で１０～５０分間遠心分離することにより行うことができる。
　当該洗浄した菌体は－８０℃で保存することができる。－８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
　大腸菌の菌体を破壊する手段としては、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、高圧ホモゲナイザー、ダイノミル、乳鉢、ガラスビーズ及びリゾチーム等の溶菌酵素を用いる手段を挙げることができる。例えば、高圧ホモゲナイザーを用いて菌体を破砕する場合には、６００～１，７００ｂａｒの圧力で、約１ｍｌ／分の流速の条件で行えばよい。実用的な観点では、６００～１０００ｂａｒの圧力で数回破砕を繰り返すことが好ましい。
　破壊前後の液を粒度分布計で分析することにより破壊の状況を確認することができる。菌体破壊液にはＤＴＴを最終濃度１ｍＭになるように添加することが好ましい。
　大腸菌の菌体を破壊する方法においては、上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）に、回収した菌体を再懸濁した、菌体懸濁液を用いることが好ましい。菌体懸濁液としては、例えば、回収した菌体１ｇあたり１～２ｍＬのＳ３０緩衝液等の溶液を添加することにより得た菌体懸濁液を挙げることができる。－８０℃で保存した当該菌体を用いる場合には氷上で融解させて懸濁液を作製することが好ましい。
　細胞抽出物としては、細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去したものを用いることが好ましい。除去する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、１０，０００～３０，０００×ｇの条件で２０～５０分間、遠心分離し、上清を取得する工程を、例えば２～３回繰り返すことにより細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去することができる。
　また、細胞抽出物としては、１／３～１／４容量の活性化ミックス（３００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸、ｐＨ８．２、１３．２ｍＭ　酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ　ＡＴＰ、４．４ｍＭ　ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ　ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを指す。以下同様である。）（各０．０４ｍＭ））を加え、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、１０～３００分、好ましくは３０～１８０分間インキュベートしたものを用いることができる。このような処理をした細胞抽出物を用いることにより効率よくタンパク質合成を行うことができる。
　さらに、細胞抽出物としては、内在性の核酸を除いたものを用いることが好ましい。上記活性化ミックスを加えた処理によって発生した不溶性成分は上記と同条件の遠心分離法等で除去できる。当該操作によって内在性のＲＮＡを除去できる。内在性の核酸は、ヌクレアーゼ等を更に添加することにより分解できる。その場合、核酸の分解後にヌクレアーゼ阻害剤を加えて処理することが好ましい。また、透析により内在性のアミノ酸、核酸及びヌクレオシド等を除くこともできる。
　当該細胞抽出物は－８０℃で保存することができる。－８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
（細胞抽出物の含有量）
　本実施形態に係る反応混合物中の細胞抽出物の含有量は、反応混合物全量を基準として、５～７０％（容量／容量）であってよく、１０～５０％（容量／容量）であってよく、２０～４０％（容量／容量）であってよく、２０～３０％（容量／容量）であってよい。細胞抽出物を得るために用いた湿菌体（ｇ）／反応混合物（ｍＬ）の割合は、０．０１～１ｇ／ｍＬであってよく、０．０５～０．３ｇ／ｍＬであってよい。
（イノシン酸）
　本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、エネルギー源及びｍＲＮＡの合成に必要な基質の供給源として、イノシン酸を含有する。
　上記エネルギー源としては、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド－３－ホスフェート、３－ホスホグリセレート、グルコース－６－ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ－アコニット酸、イソクエン酸、α－ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸等が挙げられる。また、リン酸基を含まないエネルギー源の場合、反応混合物に無機リン酸を加えることが好ましい。
　また、イノシン酸は、旨味成分として工業生産プロセスが確立されており、通常の無細胞タンパク質合成に用いられるヌクレオチドと比較して非常に安価である。さらに、ヌクレオチドの前駆体となりうるアデノシンやグアノシンより１０００倍以上、水に溶けやすい。従って、本発明に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、バッチ法の反応混合物のみならず、透過法の外液成分としても容易に使用することができる。
　本実施形態に係る反応混合物には、イノシン酸を塩として添加することが好ましい。イノシン酸の塩としては、ナトリウム塩を挙げることができ、例えばイノシン酸二ナトリウム等を挙げることができる。
（イノシン酸の含有量）
　本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物中のイノシン酸の含有量は、反応混合物全量を基準として、０．１～１０ｍＭであってよく、０．５～８ｍＭであってよく、１～５ｍＭであってよく、２～４ｍＭであってよい。
　また、上記イノシン酸をｍＲＮＡの合成に必要なＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰの供給源として利用する場合には、鋳型核酸を入れる前に、細胞抽出物、エネルギー源を含む反応混合物に当該イノシン酸を添加することが好ましい。
（反応混合物のその他の成分）
　本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、必要に応じて以下の（ｉ）～（ｖｉｉｉ）の成分の少なくとも１種を含むことができる。
（ｉ）鋳型核酸
　鋳型核酸は、発現させたい目的タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと、適当な発現調節領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいればよく、直鎖状及び環状の何れの形態であってもよい。発現調節領域としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナル及びリボソーム結合配列などを挙げることができる。また、鋳型核酸は、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含むことが好ましい。添加する鋳型核酸の量は、反応混合物全体の容量を基準として、０．１～５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１～２０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。
　合成されたタンパク質を容易に検出又は精製できるよう、タグ配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型核酸を設計してもよい。タグ配列としては、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用した、例えばヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のようなアフィニティタグ、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用してもよい。エピトープタグとしては、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。さらに、タグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも利用できる。
（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
　上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、上記鋳型核酸を対象とする１つ又は複数の転写因子を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。本発明の反応混合物は、目的タンパク質の生産効率を向上させる観点から、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含むことが好ましい。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物を調製する際に添加してもよく、上述したように、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能なＢＬ２１（ＤＥ３）等の株を用いて細胞抽出物にＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが含まれるようにしてもよい。
（ｉｉｉ）目的タンパク質合成のための基質
　目的タンパク質合成のための基質として、本実施形態に係る反応混合物は、目的タンパク質を合成するために必要なアミノ酸を含むことができる。アミノ酸としては、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸を含んでもよく、目的タンパク質や用いる試薬等を考慮して２０種類から適宜選択して用いてもよい。また、非天然アミノ酸を用いてもよい。非天然アミノ酸を用いる場合、非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために必要な改変がなされたｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素等の因子を添加する必要がある。
　上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、更なるタンパク質合成量の増強を狙ってイノシン酸の他に、ＲＮＡ合成のための基質を含むことができる。ＲＮＡ合成のための基質としては、例えば、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、リボヌクレオチド一リン酸（ｒＮＭＰ）等のリボヌクレオチド、アデノシン等のリボヌクレオシドが挙げられる。
（ｉｖ）ポリアミン類
　本実施形態に係る反応混合物は、ポリアミン類を含むことができる。反応混合物に含め得るポリアミン類としては、例えば、スペルミン、スペルミジン及びプトレシン等が挙げられる。
（ｖ）塩
　本実施形態に係る反応混合物は、塩を含むことができる。反応混合物に含め得る塩としては、例えば、酢酸、グルタミン酸、又は硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、及びマンガン塩が挙げられる。
（ｖｉ）酸化／還元調整剤
　本実施形態に係る反応混合物は、酸化／還元調整剤を含むことができる。酸化／還元調整剤としては、例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、及び／又はそれらの酸化物が挙げられる。
（ｖｉｉ）その他の添加物
　また、必要に応じて本実施形態に係る反応混合物に、下記の成分を補充又は添加してもよい。
　すなわち、リボソーム、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、任意選択の翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子終結因子、リボソームリサイクリング因子等）及びその補因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素（ＭＴＦ）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチル及びアミノエチルデキストラン等）、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン、可溶化剤、非変性界面活性物質（例えば、トリトンＸ１００）等を必要に応じて上記反応混合物に添加してもよい。
　上記反応混合物の成分に関しては、例えば米国特許第７，３３８，７８９号及び同第７，３５１，５６３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号及び米国特許出願公開第２０１０／００９３０２４号の記載を参考とすることができる。
〔無細胞タンパク質合成方法〕
　本発明に係る無細胞タンパク質合成方法は、本発明に係る反応混合物を用いて、透析法及びバッチ法いずれも行うことができる。透析法の場合は、上記反応混合物を含む内液と限外濾過膜のような透析膜により隔離した目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等を含む外液からなる閉鎖系でタンパク質の合成が行われる。透析法では、透析膜を介して、目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等が外液から反応混合物に供給されるとともに、反応混合物中の余計な副産物を外液中に拡散させることができるため、より長時間、反応を持続させることができる。バッチ法は、タンパク質合成に必要な成分すべてを含む上記反応混合物を反応溶液と混合し、反応溶液中に均一に含ませ、反応を行う合成法であり、透析法と比較すると反応時間は短いが、結果がすぐに得られる。
　タンパク質の合成は、例えば、２０～４０℃で行えばよく、３０℃で行うのが好ましい。
　バッチ法によるタンパク質合成の反応時間は、鋳型核酸の添加の有無に関わらず、細胞抽出物とイノシン酸を混合してから２時間以上であることが好ましい。反応時間は、細胞抽出物とイノシン酸を混合してから、３～４０時間であることが好ましく、５～２５時間であることがより好ましい。
〔無細胞タンパク質合成用キット〕
　本発明に係る無細胞タンパク質合成用キット（以下、「本キット」とも表す。）は、大腸菌から得られた細胞抽出物及びイノシン酸を含む。イノシン酸は、上記細胞抽出物（大腸菌から得られた細胞抽出物）と予め混合され、イノシン酸を含む細胞抽出物として本キットに含まれていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。また、本キットは、大腸菌から得られた細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含むものであってもよい。鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。本キットは、上述したＲＮＡポリメラーゼ、ポリアミン類、塩、酸化／還元調整剤、その他の添加物をさらに含んでいてもよい。これらの添加物は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔試験例１：大腸菌の培養（炭素源の影響）〕
　大腸菌ＢＬ２１株（ノバジェン株式会社）を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ６００が４．２になるまでフラスコ培養した。
　当該培養液を、グリセロールを炭素源とした、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ－２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）５００ｍＬが入った１ＬジャーファメンターにＯＤ６００が０．０５になるように添加した。
　比較として、グルコース（１８ｇ／Ｌ）を炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地を用いて、同じ株を同様に培養した。培養温度は３６℃に保ち、培地のｐＨ７．０で一定に制御して培養した。溶存酸素濃度は２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持した。増殖曲線を図１に示す。改変２×ＹＴＰＧ培地と通常の２×ＹＴＰＧ培地で培養した際の比増殖速度は、それぞれ１．０８ｈ－１と０．７４ｈ－１であった。この結果は、グリセロールで培養した細胞内のリボソームやエネルギー再生系の酵素群がより高い活性を有することを示唆していると推察される。
　グリセロールを炭素源として用いた培養により、グルコースを炭素源として用いた培養よりもより短時間で好ましい菌体濃度の培養液が得られることから、より短時間で細胞抽出物を得ることが可能であることが示された。
〔試験例２：無細胞タンパク質合成（細胞抽出物の影響）〕
（細胞抽出物の調製）
　上記試験例１と同様の方法により、改変２×ＹＴＰＧ培地及び通常の２×ＹＴＰＧ培地のそれぞれにおいて、対数中期ＯＤ６００が１２になるまで培養したＢＬ２１株を用いて、下記の方法で細胞抽出物を調製した。
　当該ＢＬ２１株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸、１４ｍＭ　酢酸マグネシウム、６０ｍＭ　酢酸カリウム及び２ｍＭ　ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて－８０℃に急冷した。
　菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ．Ｎｉｒｏ　ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。
　次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。
　当該遠心分離上清２００μＬに、３００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ　ＡＴＰ、４．４ｍＭ　ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ　ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（各０．０４ｍＭ）を含む活性化ミックス６０μＬを加え、３０℃で１５０分間インキュベートした。
　インキュベート後、２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心分離を行い、不溶性画分を取り除くことで細胞抽出物２３０μＬを得た。
（ｐＵＣ－ＧＦＰの作製）
　ｐＥＴ３ａ（ノバジェン株式会社）を利用し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）及びＴ７ターミネーターの配列を含むＤＮＡ断片（１）をＰＣＲ法によって調製した。
　ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）を利用し、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（２）をＰＣＲ法によって調製した。
　ＤＮＡ断片（１）及びＤＮＡ断片（２）を公知のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、プラスミドを抽出した。
　抽出したプラスミドを利用し、Ｔ７プロモーター、ＲＢＳ、Ｔ７ターミネーター、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（３）をＰＣＲ法によって調製した。
　Ｔ５－ＨｏｌｌｙＧＦＰ（コスモバイオ株式会社）を利用し、Ｈｏｌｌｙ－ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４）をＰＣＲ法によって調整した。
　ＤＮＡ断片（３）及びＤＮＡ断片（４）を公知のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、ｐＵＣ－ＧＦＰを抽出し、無細胞タンパク質合成反応の鋳型核酸として利用した。
　鋳型核酸用のｐＵＣ－ＧＦＰは、分光光度計を用いて高純度（Ａ２６０／Ａ２８０が１．８以上、Ａ２６０／Ａ２３０が２．０以上）であること、さらに、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を読み取り、不必要な変異が入っていないことを確認した。
（無細胞タンパク質合成反応）
　表２の化合物を含むマスターミックス１０μＬ、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ　ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ　ｐＵＣ－ＧＦＰ（鋳型核酸）２μＬ及び１０００Ｕ／μＬ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてｐＵＣ－ＧＦＰの代わりにＲＯ水２μＬを加えたものを用意した。３８４ウェルマイクロプレートに反応混合物を移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（テカンジャパン株式会社製）を使用して３０℃でインキュベートしながら、経時的に蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図２に蛍光強度の測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　反応を開始して５時間後、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度よりも約２倍高い値を示した（図２）。これにより、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの合成量は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法と比較して、約２倍多いことが示された。
〔実施例１：無細胞タンパク質合成方法〕
（グリセロールを炭素源とした培養）
　Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法によりｒｎａ遺伝子を欠損したＢＷ２５１１３株を作製し、Ｐ１トランスダクションによってＴ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ株（ニューイングランドバイオラボ社）に欠損を導入し、当該ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ株を作製した。ｒｎａ遺伝子はリボヌクレアーゼ　Ｉの合成に関わる遺伝子であり、ｍＲＮＡの安定性に関与する。
　上記ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ株を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ６００が３．５になるまでフラスコ培養した。
　次いで、当該培養液を、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ－２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）２．１Ｌが入った３ＬジャーファメンターにＯＤ６００が０．０５になるように添加し、本培養を行った。
　本培養は、培養温度を３６℃に保ち、培地のｐＨを７．０で一定に制御し、培地の溶存酸素濃度を２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持して行った。ＯＤ６００が２に達した時点で、培地に１ｍＭ　ＩＰＴＧを加え、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを誘導した。その後、対数中期ＯＤ６００が１２になるまで培養を継続した。
（細胞抽出物の調製）
　上記のように培養したＴ７　Ｅｘｐｒｅｓｓ株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－酢酸、１４ｍＭ　酢酸マグネシウム、６０ｍＭ　酢酸カリウム及び２ｍＭ　ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて－８０℃に急冷した。
　菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ．Ｎｉｒｏ　ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。
　次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。得られた上清を細胞抽出物とした。
（鋳型核酸：ｐＵＣ－ＧＦＰ）
　鋳型核酸として、試験例２で作製したｐＵＣ－ＧＦＰを用いた。
（無細胞タンパク質合成反応）
　表２に示したマスターミックス、並びに当該マスターミックスに含まれているＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰの代わりに、０．２Ｍイノシン酸二ナトリウム水溶液を終濃度２ｍＭになるように添加したマスターミックスの２種類のマスターミックスを調製した。当該マスターミックス１０μＬに、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ　ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ　ｐＵＣ－ＧＦＰ２μＬ及び超純水１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。
　上記反応混合物を調製する際、観察前のタンパク質合成反応の進行を防ぐため、氷上で調製した。
　上記反応混合物２０μＬを３８４ウェルマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を使用して３０℃でインキュベートした。３０時間後蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図３に蛍光強度の測定結果を示す。
　図３に示すとおり、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ無添加の反応混合物であっても、これらの代替物質としてイノシン酸を単独で添加することにより、無細胞タンパク質合成方法によりタンパク質合成が可能であることが確認できた。イノシン酸は、安価に入手でき、また水への溶解度が高くて扱いやすいため、本無細胞タンパク質合成方法は、工業的なタンパク質生産に好適に利用可能である。

Claims (11)

  1. 　細胞抽出物とイノシン酸とを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。
  2. 　前記細胞抽出物が、植物、動物及び微生物からなる群より選択される少なくとも１種の細胞由来の細胞抽出物である、請求項１に記載の反応混合物。
  3. 　前記微生物が、大腸菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の反応混合物。
  4. 　前記大腸菌が、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、請求項３に記載の反応混合物。
  5. 　前記細胞抽出物が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の反応混合物。
  6. 　鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の反応混合物。
  7. 　前記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項６に記載の反応混合物。
  8. 　前記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、グリセロール、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド－３－ホスフェート、３－ホスホグリセレート及びグルコース－６－ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ－アコニット酸、イソクエン酸、α－ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸、グルタミン酸及びグルタミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６に記載の反応混合物。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
  10. 　細胞抽出物及びイノシン酸、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
  11. 　請求項９記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
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