JP2005110657A - α−糖化ジペプチドの製造法及びα−糖化ジペプチドの測定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
(1)N末端が糖化されたペプチド又はN末端が糖化された蛋白質に、プロテアーゼを作用させることを特徴とするα−糖化ジペプチドの製造法。
(2)項目(1)記載の製造法により得られたα−糖化ジペプチドにフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とするα−糖化ジペプチドの測定法。
【効果】本発明により、簡単、かつ、迅速に糖化蛋白質又は糖化ペプチドから効率よくα−糖化ジペプチドを製造ができるα−糖化ジペプチドの製造法が提供された。また本発明により、短時間に、精度よくα−糖化ジペプチドを定量することができるα−糖化ジペプチドの測定法が提供された。
【選択図】なし。
Description
糖化蛋白質は、生体内の血液等の体液又は毛髪等の生体試料中に含有されている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に強く依存している。糖尿病状態では糖化蛋白質の生成が亢進しており、赤血球に含まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖化アルブミンの濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映していることから、それらの糖化蛋白質を測定することは、糖尿病の症状の診断あるいは症状管理に重要となっている。
糖化ヘモグロビン(以下、HbA1cと略称する。)は、ヘモグロビンβ−サブユニットのN末端アミノ酸にグルコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転移により結果的にフルクトースが結合した構造を有するフルクトシル蛋白質である。このHbA1cは、臨床的に過去1〜2ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病管理の指標として重要であり、迅速且つ正確な定量法が求められている。
そこで、操作が簡単で安価、かつ精度よくHbA1cを測定する方法として、酵素的方法が提案されている。酵素的方法とは、糖化蛋白質をプロテアーゼで分解し、遊離した糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法である。この酵素的測定方法に用いられるオキシダーゼとして、コリネバクテリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特許文献1、特許文献2参照)、アスペルギルス属菌の生産するオキシダーゼ(特許文献3参照)、ギベレラ属菌の生産するオキシダーゼ(特許文献4参照)、フサリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特許文献4、特許文献5参照)、ペニシリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特許文献6参照)さらには、ケトアミンオキシダーゼ(特許文献7)等が開示されている。さらに、これまでにN末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンから、α−糖化アミノ酸(アミノ酸のα−アミノ基が糖化されたもの)を遊離した例としては、以下の(a)〜(i)が知られている。
(a)グリコヘモグロビンに8M尿素を加え20分煮沸変成後、トリプシン処理、ペニシリウム属由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)にて定量する方法(特許文献6参照)。
(b)グリコヘモグロビンをプロテアーゼ処理して、アスペルギルス属由来FAODにて定量する方法(特許文献8、特許文献9参照)。
(c)エンド型及びエキソ型プロテアーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法(特許文献10参照)。
(d)N末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質をセリンカルボキシペプチダーゼを用いて酵素処理する方法(特許文献11参照)。
(e)HbA1cのβ鎖N末端から3番目のロイシンのカルボキシル基側を切断できるプロテアーゼで処理し、ついで生成したフルクトシルバリルヒスチジルロイシンからヒスチジルロイシンを切り取ることができるプロテアーゼで処理するヘモグロビンA1cの測定方法(特許文献12参照)。
(f)糖化蛋白質からαアミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させるコリネバクテリウム属及びシュードモナス属由来新規酵素を用いて糖化アミノ酸を遊離させ、これを定量する方法(特許文献13参照)。
(g)糖化蛋白質からαアミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させるスフィンゴバクテリウム属、スフィンゴモナス属、コマモナス属、ムコー属及びペニシリウム属由来新規酵素を用いて糖化アミノ酸を遊離させ、これを定量する方法(特許文献14参照)。
(h)蛋白質を含む試料を、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理し、得られた蛋白質分解物とFAOXを反応させ、糖化蛋白質量を迅速に測定する方法(特許文献15参照)。
(i)N末端が糖化されたペプチド又は蛋白質を含有する被検液にデブロッキングアミノペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、N−アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ又はヘミセルラーゼを作用させ、N末端の糖化アミノ酸を遊離させ、生成した糖化アミノ酸を定量する方法(特許文献16参照)。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
(1)N末端が糖化されたペプチド又はN末端が糖化された蛋白質に、プロテアーゼを作用させることを特徴とするα−糖化ジペプチドの製造法。
(2)N末端が糖化されたペプチドが、フルクトシルVal−His−Leu−Thr−Pro−Gluである項目(1)記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
(3)N末端が糖化された蛋白質が、糖化ヘモグロビンである項目(1)記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
(4)プロテアーゼが、アスペルギルス属、バチルス属、リゾパス属、トリチラチウム属、スタフィロコッカス属及びストレプトマイセス属等の微生物、ブタ及びウシ等の動物並びにパパイヤ、イチジク及びパイナップル等の植物が生産するプロテアーゼから選ばれた1種以上のプロテアーゼである項目(1)、(2)又は(3)記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
(5)プロテアーゼが、サチライシン、プロナーゼ、ディスパーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼK、パパイン、フィシン、ブロメライン、パンクレアチン、Glu−C及びカテプシンから選ばれた1種以上のプロテアーゼである項目(1)、(2)又は(3)記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
(6)α−糖化ジペプチドがフルクトシルバリルヒスチジンである項目(1)〜(5)記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
(7)項目(1)〜(6)記載の製造法により得られたα−糖化ジペプチドにフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とするα−糖化ジペプチドの測定法。
本発明におけるN末端が糖化された蛋白質は、蛋白質がグルコース等のアルドースと非酵素的に結合し、生成したものであれば如何なるものでもよい。
生体由来の糖化蛋白質としては、例えば、糖化アルブミン、HbA1c等であり、本発明は、例えば、HbA1c等の測定に好適に用いられる。また、本発明におけるN末端が糖化されたペプチドは、試料中に含まれるペプチドがグルコース等のアルドースと非酵素的に結合して、生成したものだけでなく、上記N末端が糖化された蛋白質が酵素的(プロテアーゼ、ペプチダーゼ等)もしくは非酵素的(物理的な衝撃、熱等)により切断を受けたものを含む。これら、糖化蛋白質又は糖化ペプチドは、食品一般、例えば、ジュース、キャンデー、調味料、粉末食品等にも含まれている。本発明における糖化蛋白質又は糖化ペプチドを含有する試料としては、上記糖化蛋白質又は糖化ペプチドを含有する試料であれば如何なるものでもよく、例えば、生体内では、血液、唾液等の体液あるいは毛髪等、そして上記食品等が挙げられる。これらの試料は、そのままあるいは濾過、透析処理等の後に測定に供してもよく、また、例えば、測定すべき糖化蛋白質又は糖化ペプチドを、適宜、濃縮、抽出、さらには水、緩衝液等で希釈してもよい。
α−糖化ジペプチドを測定することが可能であれば、如何なる方法でもよく、簡単な操作で、安価に短時間で、しかも精度よくα−糖化ジペプチドを測定するための好ましい方法としては、例えば、オキシダーゼを作用させる方法あるいはHPLCを用いる方法等が挙げることができる。
まず、α−糖化ジペプチドにオキシダーゼを作用させる方法について説明する。
上記α−糖化ジペプチドにオキシダーゼを作用させ、その作用による生成物または消費物を測定することにより、酵素的方法で糖化ジペプチドを測定する。このようなオキシダーゼとしては、α−糖化ジペプチドに特異的に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であれば如何なる酵素でも用いることができる。
そのような酵素としては、例えば、特開2001−95598号公報に記載されている大腸菌DH5α(pFP1)(FERM P−17576)の生産するフルクトシルペプチドオキシダーゼあるいは特開2003−235585号公報に記載されているフルクトシルペプチドオキシダーゼ等のオキシダーゼを挙げることができる。
またこれらの他にも、α−糖化ジペプチドに特異的に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素は、自然界の微生物より探索して得ることができ、また動物あるいは植物由来の酵素を探索して得ることもできる。さらに、探索して得られたこれらの酵素を遺伝子組換え技術を用いて得たものでも好適に用いることもできる。一方、既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等を改変することにより、得ることもできる。例えば、既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等としては、コリネバクテリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特公平5−33997号公報、特公平6−65300号公報)、アスペルギルス属菌の生産するオキシダーゼ(特開平3−155780号公報)、ギベレラ属菌の生産するオキシダーゼ(特開平7−289253号公報)、フサリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特開平7−289253号公報、特開平8−154672号公報)、ペニシリウム属菌の生産するオキシダーゼ(特開平8−336386号公報)さらには、ケトアミンオキシダーゼ(特開平5−192193号公報)等を挙げることができる。
既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等を改変することにより、α−糖化ジペプチドに作用するオキシダーゼを得るためには、上記既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等の生産能を有する微生物に、紫外線、X線、放射線等を照射したり、もしくは、エチルメタンサルフォネート、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の変異誘発剤を接触させることにより、変異処理をする。得られた変異処理微生物から、α−糖化ジペプチドに作用するオキシダーゼを生産する微生物を選抜する。しかし、一般的には、上記既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等の遺伝子(以下、野生型遺伝子と言う)に変異を導入することにより、α−糖化ジペプチドに作用するオキシダーゼを得ることができる。変異を導入するために用いられる野生型遺伝子は、例えば、上記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及び類似のオキシダーゼ等の野生型遺伝子で、変異を導入することにより、α−糖化ジペプチドに作用するオキシダーゼを得ることができる野生型遺伝子であれば、如何なる遺伝子でも用いることができる。
(1)試薬の調製
試薬1(R1):1.0kUのパーオキシダーゼ(以下、PODと略称する。キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(以下、4AAと略称する。東京化成社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶解し、1Lに定容する。
試薬2(R2):500mgのTOOS(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイジン、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mLに定容する。
試薬3(R3):フルクトシルVal−His(MW416、製造方法は後述)1.25gをイオン交換水に溶解し、10mLに定容する。
(2)測定
2.7mLのR1に、100μLのR2を加え、さらに、100μLのフルクトシルペプチドオキシダーゼを含む酵素液を加えて混和し、37℃で、5分間予備加温する。
その後、100μLのR3を加えてよく混合したのち、分光光度計(U−2000A、日立社製)を用い、37℃、5分間の555nmにおける吸光度の変化を測定する。なお、対照液は、100μLのR3の代わりに、100μLのイオン交換水を加える以外は前記と同様に操作する。予め調製した過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成する色素量(吸光度)との関係より得られたグラフから、吸光度の変化に相当する過酸化水素量を求め、この数値を酵素液中の活性単位とする。1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uとする。
作用時間は、例えば、1〜120分間、好ましくは1〜30分間であり、基質となる糖化ペプチドの量にもよるが、フルクトシルペプチドオキシダーゼが、それらのペプチドに作用するのに充分な時間であればよい。作用温度は、例えば、20〜45℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
本発明に用いられる緩衝剤としては、例えば、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、HEPES等が挙げられる。発色基質としては、4−アミノアンチピリンの他に、例えば、ADOS(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−アニシジン)、ALOS(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン)、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3、7−ビス(ジメチルアミノ)−フェノシアジン(DA−67)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4、4’−ビス(ジメチルアミノ)−ジフェニルアミン(DA−64)等が挙げられる。さらに必要により、本発明の目的を損なわない範囲で、種々の添加物、例えば、溶解補助剤、安定化剤等として、界面活性剤(トリトンX−100、ブリッジ35、ツイーン80、コール酸塩等)、還元剤(ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、L−システイン等)、牛血清アルブミン、糖類(グリセリン、乳糖、シュークロース等)等を適宜添加してもよい。
この過酸化水素の測定を行なう際、一般に、オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成する工程を同時に行なうことが好ましいため、本発明では、前述の過酸化水素を測定するための試薬に、フルクトシルペプチドオキシダーゼを、例えば、0.1〜50U/mL、好ましくは1〜10U/mL添加することが好ましい。
次いで、遊離した糖化ペプチドをHPLCを用いて測定する方法について述べる。
遊離した糖化ペプチドを含むプロテアーゼ処理液をそのまま、もしくは必要により、処理液を遠心濾過あるいは膜濾過した濾過液を、適宜、濃縮・希釈した後、HPLC測定に用いる。本発明に用いるHPLCは、上記糖化ペプチドを測定することが可能なHPLCであれば、如何なるHPLCでも用いることができる。
用いる逆相HPLCカラムとして、例えば、CAPCEL−PAK C−18(資生堂社製)、TSKgel ODS80Ts(東ソー社製)、Shodex RSpak RP18−415(昭和電工社製)、イオン交換HPLCカラムとしては、例えば、TSKgel SP−2SW、TSKgel CM−2SW(東ソー社製)等が挙げられる。これらのカラムにプロテアーゼ処理液を吸着させた後、溶離液を用いて、目的とする糖化ペプチドを溶出する。溶離液としては、本発明の測定に適した溶離液であれば、如何なる溶離液でもよく、例えば、逆相カラムではトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルと水との混合液、リン酸緩衝液とアセトニトリルとの混合液、アンモニア水溶液とアセトニトリルとの混合液等、イオン交換カラムでは、例えば、リン酸緩衝液とNaCl溶液との混合液、酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合液等が用いられる。これらの溶離液を用いて、ステップワイズに溶離してもよく、グラジエントに溶離してもよい。好ましい溶離液として、例えば、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)/水−0.1%TFA/30%アセトニトリルのグラジエント溶離液等を挙げることができる。本発明では、用いるカラム、溶離液、溶離条件(溶離方法、溶離液の流速、温度等)等を適宜、組み合せ、目的のα−糖化ペプチドの溶出ピークが、できる限り他の成分のピークと良好に分離する条件に設定することが好ましい。
溶離液により溶出された糖化ペプチドを検出する方法としては、糖化ペプチドを検出することのできる検出方法であれば如何なる方法でも用いることができ、例えば、波長210nm、215nm等における吸光度を検出する方法、各検出ピークを分取した後、マススペクトロメトリー分析に供して目的分子量のピークを決定する方法、薄層クロマトグラフィーに供する方法、あるいは、経時的に分取した溶出画分をニンヒドリン法や糖発色法で比色定量する方法等が用いられる。一例として、例えば、吸光度を検出する方法を用いる場合、モニターにより検出された糖化ペプチドの溶出ピーク面積を算出して、標準物質の溶出ピーク面積と比較して、その糖化ペプチドの量及び糖化蛋白質を測定することができる。
製造例(糖化ジペプチドの製造)
本発明において使用するα−糖化ジペプチドは、以下に示す方法で製造した。
市販のジペプチド〔バリルヒスチジン(Val−His)、スイス、BACHEM社製〕7.0g(27.6mmol)を14mLの水に溶解し、酢酸5.8mLを加え、約50℃で溶解、清澄化させた。次いで、エタノール120mLを添加し混合した後、グルコース14g(77.8mmol)を添加し、充分混合した。
その後、密閉容器内で80℃、6時間、ときどき撹拌を行ないつつ加温処理を行なった。反応液は、経時的に褐変した。反応溶液を経時的に分取し、適宜希釈後、逆相高速液体クロマトグラフィー分析、薄層クロマトグラフィー分析、あるいはマススペクトロメトリー分析に供することにより、目的の糖化ジペプチドの生成を検定した。通常、6〜10時間の加温処理により、良好な収率で糖化ジペプチドを得ることができる。次いで、反応溶液を回収し、ロータリーエバポレーターを用いて、15〜30倍に濃縮した。濃縮物を、99.5%エタノールで平衡化したシリカゲルカラム(容量2000mL)に吸着させ、カラムの2倍量の99.5%エタノールで洗浄し、未反応のグルコース等の夾雑成分を除去した後、3倍量の95%エタノール、3倍量の90%エタノール、3倍量の85%エタノール、3倍量の80%エタノールで順次溶出を行なった。各溶出画分を薄層クロマトグラフィー分析、逆相高速液体クロマトグラフィー分析等で分析し、目的のフルクトシルVal−Hisを含む95〜90%エタノール溶出画分を回収した。ロータリーエバポレーターを用いて回収物を濃縮乾固させ、約3gの部分精製物を得た。マススペクトロメトリー分析の結果、この精製物の分子量は、MW416であり、フルクトシルVal−Hisの分子量と一致し、また、核磁気共鳴スペクトル分析により、その構造を確認した。この部分精製物を、常法により、イオン交換樹脂を用いて吸脱着し、精製度を高め、以後の実験に用いた。更にValを用いて、上記と同様の方法で、フルクトシルValの部分精製物を得た。
α−糖化ジペプチドを効率よく切り出すプロテアーゼをスクリーニングする目的で、α−糖化ヘキサペプチド(フルクトシルVal−His−Leu−Thr−Pro−Glu;ペプチド研究所社製)に表1に記載のプロテアーゼを作用させ、生成する産物をフルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで測定した。
<プロテアーゼ反応試料作成>
1.8 mM α−糖化ヘキサペプチド 12μl
20 mg/ml プロテアーゼ溶液(この濃度が作成できない場合は可能な限り濃い濃度、また液体状のものはそのままの濃度) 8μl
100 mM リン酸カリウムバッファーpH8.0(プロテアーゼの至適pHに合せてpHは適宜変更) 4μl
これらを良く混合し、37℃で2時間反応させたのち、90℃で3分間の熱処理を行ない、遠心をかけ、上清をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水で同様の操作を行ない、ブランク試料とした。
<プロテアーゼ反応試料中の糖化ジペプチド及び糖化アミノ酸の反応測定溶液>
100 mM リン酸カリウムバッファーpH8.0
45 mM 4AA
0.5 mM TOOS
1 U/ml POD(キッコーマン社製)
0.1 U/ml フルクトシルペプチドオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
上記の糖化ジペプチド及び糖化アミノ酸測定反応液145μlをマイクロタイタープレートのウェルに分注し、上記プロテアーゼ反応試料5μlを加え充分混合したのち、555nmを測定する(A0)。次いで、30℃で20分間インキュベーションしたのち、555nmを測定する(A1)。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用い同様の操作を行ないA0ブランク、A1ブランクを測定する。プロテアーゼのα−糖化ヘキサペプチドへの作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔA =(A1−A0)−(A1ブランク−A0ブランク)
なお、上記糖化物測定反応液中のオキシダーゼとして次の4つを用いた。フルクトシルペプチドオキシダーゼとしてはFPOX−C,FPOX−E(共にキッコーマン社製)、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしてFAOX(キッコーマン社製)、FLOD(旭化成工業社製)である。これらのオキシダーゼは基質特異性が異なっており、つまりFPOX−C,FPOX−Eは、フルクトシルVal−His及びフルクトシルValの両方に作用するのに対し、FAOX,FLODは、フルクトシルValのみに作用する。従って、上記プロテアーゼ処理でフルクトシルVal−Hisが切り出されている時には、FPOX−C,FPOX−Eにおいて吸光度変化が見られ、もしフルクトシルValが切り出された場合、FPOX−C,FPOX−E,FAOX,FLODのすべてにおいて吸光度変化が見られると予想された。
結果を表1に示す(単位;mAbs)。
まず検出のプロテアーゼをFAOX、FLODで行なった場合(フルクトシルValの検出)では、検討を行なったすべてのプロテアーゼについて吸光度変化は、ほぼ0に近い値だった。このことは、これまでに糖化蛋白質又は糖化ペプチドからフルクトシルValを切り出すと言われてきた様々なプロテアーゼ[ロイシンアミノペプチダーゼ、デブロッキングアミノペプチダーゼ、Nアシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ、カテプシン C(以上 特開2002−315600号公報)、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、サチライシン、プロテイナーゼ K、パパイン、カテプシンB、ペプシン、サーモリシン、リジルエンドペプチダーゼ、プロレザー、ブロメライン(以上 国際公開第97/13872号パンフレット)、セリンカルボキシペプチダーゼ(以上 特開2001−57897号公報)]のフルクトシルVal切り出し活性は、極めて弱いことを示唆している。
さらに弱い吸光度変化は、アスペルギルス由来酵素として、モルシン、スミチームLPL、スミチームAP、バチルス由来酵素として、プロレザーFG−F、スタフィロコッカス由来酵素として、Glu−C、植物由来酵素として、ブロメラインにおいて認められた。以上のことから、上記のプロテアーゼ処理を行なうことで、α−糖化ヘキサペプチドから効果的にα−糖化ジペプチドを切り出すことができることが判った。
より短い反応時間でα−糖化ジペプチドを効率良く切り出すプロテアーゼをスクリーニングする目的で、実施例1に行なった実験と同様の実験を、各種条件は変えずに、プロテアーゼの反応時間のみを2時間から5分間に短縮し、反応後のα−糖化ジペプチド及びα−糖化アミノ酸を測定した。結果は、実施例1と同様に
ΔA=(A1−A0)−(A1ブランク−A0ブランク)
で表し、表2にまとめた(単位;mAbs)。
上記α−糖化ヘキサペプチドを水に溶解し、5mMの溶液とした。この溶液0.1mLに、プロテアーゼ溶液〔パパイン(ロシュ社製)、フィシン(シグマ社製)、ディスパーゼ(ロシュ社製)〕0.01mL及び緩衝液(0.1M) 0.09mLを添加、混合してプロテアーゼ処理を行なった。上記混合物を37℃で60分間反応処理した。その後、処理液を夫々、適宜濃縮、希釈し、HPLCにて測定した。HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)として、CAPCEL−PAK C−18(資生堂社製)を用いた。溶離液として、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)/水−0.1%TFA/30%アセトニトリルを用い、グラジエントで溶離した。標準物質として、α−糖化ジペプチド(フルクトシルVal−His)を用いた。その結果、パパイン、フィシン、ディスパーゼの何れのプロテアーゼ処理によっても、処理液中にα−糖化ジペプチド(フルクトシルVal−His)が遊離していることを確認した。
実施例1及び2でスクリーニングされたプロテアーゼ及びフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いて、糖化ヘキサペプチド量の測定が可能かどうか、以下の実験で検討した。
<プロテアーゼ反応>
1.8 mM α−糖化ヘキサペプチド
3 U/ml パパイン(ロシュ社製) 8μl
水 (全体で24μlにする)
上記α−糖化ヘキサペプチドを0、1、2、3、4、5、6、7μlと反応に用いる量を変え、パパイン8μlと水を加え全体で24μlとした。37℃で10分間反応させたのち、90℃で5分間熱処理し、遠心をかけ上清をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行ない、ブランク試料とした。
<プロテアーゼ反応試料中の糖化ジペプチドの反応測定溶液>
100 mM リン酸カリウムバッファーpH8.0
45 mM 4AA
0.5 mM TOOS
1 U/ml POD(キッコーマン社製)
0.1 U/ml フルクトシルペプチドオキシダーゼ、FPOX−C(キッコーマン社製)
上記の糖化ジペプチドの反応測定溶液145μlをマイクロタイタープレートのウェルに分注し、上記プロテアーゼ反応試料5μlを加え充分混合したのち、555nmを測定する(A0)。次いで、30℃で20分間インキュベーションしたのち、555nmを測定する(A1)。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用い同様の操作を行ないA0ブランク、A1ブランクを測定する。プロテアーゼのα−糖化ヘキサペプチドへの作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔA=(A1−A0)−(A1ブランク−A0ブランク)
各濃度のα−糖化ヘキサペプチドの測定結果を図1に示す。図1から、ΔAとα−糖化ヘキサペプチドの濃度との間には直線的な相関のあることが示された。すなわち上記プロテアーゼ処理によりα−糖化ジペプチドを切り出すことで、α−糖化ヘキサペプチドを短時間でかつ精度よく測定できることが判った。
以上のことから、HbA1cのエンドプロテアーゼGlu−C処理で得られることが示されているα−糖化ヘキサペプチドは、キャピラリー電気泳動あるいは質量分析を行なわなくても、本発明のプロテアーゼ処理をα−糖化ヘキサペプチドに対し行なうことにより、酵素的により簡便にHbA1c測定が可能となることが示唆された。
HbA1cにGlu−C及び中性プロテアーゼを作用させ、α−糖化ジペプチドが生成するかどうか、以下の実験で確認した。
<プロテアーゼ反応>
14.4% HbA1c溶液(協和メディックス社製) 44μl
0.5mg/ml Glu−C(和光純薬社製) 36μl
150mM 酢酸アンモニウム (pH4.0) 8μl
この混合液を37℃で一晩インキュベートした。その後、中性プロテアーゼ(ディスパーゼ,2.4U/ml; ロッシュ社製)を352μl加えて攪拌し、更に、37℃で一晩インキュベートした。これを92℃、5分間の熱処理をしたのち、12000回転で5分間遠心分離し、得られた上清をサンプル試料とした。一方、Glu−C及びディスパーゼの代わりに蒸留水を用い同様の操作を行なったものを、ブランク試料とした。
<プロテアーゼ反応試料に含まれるα−糖化ジペプチドの反応測定>
反応測定溶液は、以下のようにして調製した。なお、R1のFAOX、カタラーゼは、サンプル中に夾雑する糖化アミノ酸を除去するためのものである。
R1:
50 mM POPSOバッファー (pH7.5)(同仁化学社製)
5 U/ml FAOX (キッコーマン社製)
300 U/ml カタラーゼ (キッコーマン社製)
R2:
100 mM Tris-HClバッファー(pH7.5)(ナカライテスク社製)
0.1 mM DA-64 (和光純薬社製)
10 mM Ca-EDTA(同仁化学社製)
150 U/ml POD (キッコーマン社製)
0.15% NaN3(和光純薬社製)
40 U/ml フルクトシルペプチドオキシダーゼ、FPOX−E(キッコーマン社製)
サンプル試料30μlにR1−216μlを加え5分間処理したのち、R2−80μlを添加、混合し、37℃、5分間反応させた。R2の反応の前後における750nmの吸光度増加量(ΔAbs)を日立自動分析装置7070形にて測定したところ、0.007であった。これに対し、ブランク試料でのΔAbsは0であった。また、フルクトシルペプチドオキシダーゼとして、FPOX−C(キッコーマン社製)を用いても同様の結果が得られた。
以上のことから、HbA1cのGlu−C及び中性プロテアーゼ処理によりα−糖化ジペプチドが生成すること、及び生成したα−糖化ジペプチドは、FPOX−E、−Cによる測定が可能であることが確認された。
実施例5ではHbA1cにGlu−C及び中性プロテアーゼを作用させたが、ここでは中性プロテアーゼのみを作用させてα−糖化ジペプチドが生成するかどうかを、以下の実験で検討した。
<プロテアーゼ反応>
14.4% HbA1c溶液(協和メディックス社製) 88μl
2.4 U/ml 中性プロテアーゼ(ディスパーゼ ;ロッシュ社製) 352μl
この混合液を37℃で一晩インキュベートした。これを92℃、5分間の熱処理をしたのち、12000回転で5分間遠心分離し、得られた上清をサンプル試料とした(ここで用いたHbA1c量は、実施例5の2倍である)。一方、中性プロテアーゼの代わりに蒸留水を用い同様の操作を行なったものを、ブランク試料とした。
<プロテアーゼ反応試料に含まれるα−糖化ジペプチドの反応測定>
R1、R2は、実施例5と同様のものを用いた。
サンプル試料30μlにR1−216μlを加え、5分間処理したのち、R2−80μlを添加、混合し、37℃、5分間反応させた。その結果、R2の反応の前後における750nmの吸光度増加量(ΔAbs)は、0.007であった。これに対し、ブランク試料でのΔAbsは0であった。ここでプロテアーゼ処理に用いたHbA1c量は、実施例5の2倍であるが、実施例5と同等のΔAbs(=0.007)が見られた。また、フルクトシルペプチドオキシダーゼとして、FPOX−C(キッコーマン社製)を用いても同様の結果が得られた。以上のことから、HbA1cに対する中性プロテアーゼ単独の処理でもα−糖化ジペプチドが生成し、生成したα−糖化ジペプチドは、FPOX−E、−Cで検出できることが確認された。
HbA1cコントロール(デターミナーHbA1c測定用キャリブレーター;協和メディックス社製)を検体希釈液(協和メディックス社製)で溶解させ、濃度の異なる5つのHbA1c溶液(0.0%、4.1%、7.8%、11.3%、14.4%)を調製した。これらの溶液を用いて以下の操作を行なった。
<プロテアーゼ反応>
各HbA1c溶液 44μl
2.4 U/ml 中性プロテアーゼ(ディスパーゼ;ロッシュ社製) 176μl
この混合液を37℃で一晩インキュベートした。これを92℃、5分間の熱処理をしたのち、12000回転で5分間遠心分離し、得られた上清をサンプル試料とした。一方、中性プロテアーゼの代わりに蒸留水を用い同様の操作を行なったものを、ブランク試料とした。
<プロテアーゼ反応試料に含まれるα−糖化ジペプチドの反応測定>
R1、R2は、実施例5と同様のものを用いた。
サンプル試料30μlにR1−216μlを加え、5分間処理したのち、R2−80μlを添加、混合し、37℃、5分間反応させた。R2の反応の前後における750nmの吸光度増加量(ΔAbs)を測定した。この方法によって得られたHbA1c濃度とΔAbsとの関係を、図2に示す。図2は、HbA1c濃度と過酸化水素の発生量が相関関係にあることを示している。なお、ブランク試料として、各濃度のHbA1c溶液に対して中性プロテアーゼの代わりに蒸留水を加えたサンプルでは、同様の操作でΔAbsは、全て0であった。
Claims (7)
- N末端が糖化されたペプチド又はN末端が糖化された蛋白質に、プロテアーゼを作用させることを特徴とするα−糖化ジペプチドの製造法。
- N末端が糖化されたペプチドが、フルクトシルVal−His−Leu−Thr−Pro−Gluである請求項1記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
- N末端が糖化された蛋白質が、糖化ヘモグロビンである請求項1記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
- プロテアーゼが、アスペルギルス属、バチルス属、リゾパス属、トリチラチウム属、スタフィロコッカス属及びストレプトマイセス属等の微生物、ブタ及びウシ等の動物並びにパパイヤ、イチジク及びパイナップル等の植物が生産するプロテアーゼから選ばれた1種以上のプロテアーゼである請求項1、2又は3記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
- プロテアーゼが、サチライシン、プロナーゼ、ディスパーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼK、パパイン、フィシン、ブロメライン、パンクレアチン、Glu−C及びカテプシンから選ばれた1種以上のプロテアーゼである請求項1、2又は3記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
- α−糖化ジペプチドがフルクトシルバリルヒスチジンである請求項1〜5記載のα−糖化ジペプチドの製造法。
- 請求項1〜6記載の製造法により得られたα−糖化ジペプチドにフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とするα−糖化ジペプチドの測定法。
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