WO2006008872A1 - Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ Download PDF

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Yasuhisa Asano
Atsushi Inoue
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Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.
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    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01004—Amidase (3.5.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to a novel L-form amino acid amide asymmetric hydrolase, DNA encoding the same, and use thereof. More specifically, a novel enzyme having at least the activity of stereoselectively hydrolyzing the amide bond of L-form amino acid amide, particularly L-form 2-alkylcysteine amide, DNA encoding the enzyme protein, and DNA
  • a novel enzyme having at least the activity of stereoselectively hydrolyzing the amide bond of L-form amino acid amide, particularly L-form 2-alkylcysteine amide, DNA encoding the enzyme protein, and DNA
  • Examples of a method for producing an optically active amino acid from an amino acid amide include, for example, a microorganism containing an enzyme that stereoselectively asymmetrically hydrolyzes the amide bond of a racemic amino acid amide or a treated product of the microorganism.
  • the method of making it act is known as an industrially excellent method (for example, refer patent document 1, 2).
  • an enzyme which is a catalyst derived from a living body, has an excellent characteristic that it produces a target product with mild reaction conditions and extremely high reaction specificity, it can catalyze a substrate.
  • there is a technical problem that a large amount of bacterial cells are required to carry out the reaction resulting in an economical disadvantage and cannot be adopted. It was.
  • Patent Document 3 discloses Variovorax-derived DNA amidase, DNA encoding the same, plasmids, vectors and microorganisms containing such nucleic acids, hybridizing nucleic acids, primers for producing nucleic acids, and the like.
  • Patent Document 4 discloses a modified amino acid amidase and a method for producing a D-form amino acid using the same. However, these methods only work on D-form amino acid amides, and cannot hydrolyze L-form amino acid amides.
  • Patent Document 5 discloses an enzyme that stereoselectively hydrolyzes the amide bond of L-form amino acid amides derived from Pseudomonas azotoformans. DNA encoding is disclosed. However, this enzyme has high activity against L-prolinamide, but low activity against other L-form amino acid amides.
  • Patent Document 6 discloses an enzyme protein derived from Comamonas acid side borane, DNA encoding the same, and a method for producing an optically active organic acid using the enzyme protein, including an amino acid amide. Asymmetric hydrolysis is also disclosed only when leucine amide or ferrolanamide is used as a substrate.
  • Patent Document 7 discloses a protein having amidase activity for stereoselectively hydrolyzing a amino acid amide and ⁇ -hydroxy acid amide and a DNA encoding the same. It is disclosed only when t-mouth icinamide is used as a substrate.
  • Patent Document 8 discloses a method for obtaining a microorganism containing a peptide amidase, a microorganism obtained thereby, a peptide amidase contained therein, and a method for using the same.
  • Amides have high activity against N-acetyl amino acid amides or protected amino acid amides, but do not have activity to hydrolyze unprotected amino acid amides.
  • Non-Patent Document 1 discloses an enzyme that stereoselectively hydrolyzes an amino acid amide having an alkyl group at the ⁇ -position, and disclosed here!
  • methyl valine It is limited to amino acids having a hydrocarbon side chain such as methyl leucine and methylphenolanine, and no description of 2-alkylcysteine having a mercapto group and an alkyl group in the side chain is allowed!
  • alkylcysteine which are special amino acids other than ordinary natural amino acids.
  • 2-Alkylcystine has an alkyl group at the ⁇ -position carbon atom and a plurality of highly reactive substituents such as a mercapto group, amino group and carboxyl group in the molecule.
  • Active substances are compounds that are expected to be widely used as raw materials for various industrial chemicals, pharmaceuticals, agricultural chemicals, etc., and as general-purpose chiral building blocks, and are extremely useful industrially, so they are industrially advantageous and inexpensive. Development of a new manufacturing method has been desired.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-293394
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-55097
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-225094
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-253256
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-250558
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 8-256771
  • Patent Document 7 International Publication No. 00 ⁇ 63354 Pamphlet
  • Patent Document 8 Patent No. 3112090
  • Non-Patent Document 1 H. F. M. Hermes et al., Applied and Environmental microbiol ogy, Vol. 60, Nol, p. 153—159, 1994
  • the object of the present invention is expected to be widely used as an intermediate for the production of various industrial chemicals, pharmaceuticals and agricultural chemicals, and is an industrially very useful compound, an optically active amino acid, particularly an optically active amino acid.
  • L-form amino acid amide asymmetric hydrolase, DNA encoding the same, and recombinant DNA containing the DNA, which can be suitably used for producing alkylcysteine It is an object of the present invention to provide a recombinant microorganism into which is introduced, and a method for producing an optically active amino acid, particularly an optically active 2-alkylcysteine, using them.
  • the inventors of the present invention are highly capable of stereoselectively hydrolyzing the amide bond of L-form amino acid amide, particularly L-form 2-alkylcysteine amide.
  • a novel microorganism having an enzyme activity was found, and an enzyme exhibiting the catalytic activity was first isolated and purified from this microorganism.
  • the DNA encoding this enzyme was isolated and obtained for the first time, and a recombinant DNA containing the DNA and a recombinant microorganism introduced with the recombinant DNA were successfully prepared and expressed.
  • the L-form amino acid amide asymmetric hydrolase of the present invention has not only the asymmetric hydrolysis activity of L-form 2-alkylcystine amide but also a very broad substrate spectrum.
  • Natural amino acids such as L-parin, L-sip Ishin, L-feruaranin, and other natural amino acids, L-2-aminobutyric acid, L-t-leucine, L-phenol glycine, L-p -Corresponds to so-called special amino acids such as black mouth glycine, L-alicine ethylene acetal, L-pecylamine, (4R) -5,5-dimethyl-1,3-thiazolidine-4 Various L-form amino acid amides can be asymmetrically hydrolyzed.
  • the enzyme of the present invention exhibits strict stereospecificity of selectively hydrolyzing the amide bond of L-form amino acid amide, and a property that reacts with a wide variety of L-form amino acid amides. It is a novel enzyme with excellent industrial applicability that is different from the conventionally known!
  • the present invention provides an L-form amino acid amide asymmetric hydrolase shown in the following (1), a DNA encoding the L-form amino acid amide asymmetric hydrolase shown in (2) to (3), Recombinant microorganisms shown in 4) to (5), a method for producing L-form amino acids from L-form amino acid amides using the enzyme shown in (6), and L-form 2-alkyl as shown in (7) to (9)
  • This invention relates to a method for producing L-type 2-alkyl cysteine.
  • L-form having an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 355 shown in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added from the amino acid sequence
  • An enzyme that stereoselectively hydrolyzes the amide bond of the amino acid amide An enzyme that stereoselectively hydrolyzes the amide bond of the amino acid amide.
  • R in formula 1 is hydrogen, lower alkyl group, substituted lower alkyl group, phenol group, substituted phenol.
  • examples of the lower alkyl group include an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • examples of the substituted lower alkyl group include one or more hydrogen atoms such as a hydroxy group, a methoxy group, a mercapto group
  • examples thereof include an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms substituted with a methyl mercapto group, an amino group, a guanyl group, a carboxyl group, a carboxamide group, a halogen group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, an imidazolyl group, and the like.
  • any hydrogen is a hydroxy group, a methoxy group, a mercapto group, a methyl mercapto group, an amino group, a gal group.
  • examples of the heterocyclic group include an indolyl group and an imidazolyl group.
  • an arbitrary hydrogen is a hydroxy group, a methoxy group, a mercapto group, a methyl mercapto group, an amino group, and a guar group.
  • heterocyclic groups such as the indolyl group and imidazolyl group substituted with a carboxyl group, a carboxamide group, a halogen group, etc.
  • Examples of the group capable of forming a nitrogen-containing heterocycle include a pyrrolidine ring, a pyrrole ring, a thiazolidin ring, an oxazolidine ring, and the like.
  • R is hydrogen or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R in Formula 2 represents a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the enzyme of the present invention has one or more amino acids deleted from the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 355 shown in SEQ ID NO: 8, unless the activity is lost. It may have a substituted or added amino acid sequence.
  • the number of the plurality of amino acids is preferably 2 to 20, preferably 2 to 10, particularly preferably 2 to 5.
  • the enzyme of the present invention has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and an amide bond of L-form amino acid amide It may have an enzyme action that hydrolyzes to stereoselection.
  • the DNA encoding the enzyme of the present invention hybridizes with a DNA having the base numbers 868 to 1932 of the base sequence of SEQ ID NO: 7 under stringent conditions, and is an L-form amino acid. It may be DNA encoding an enzyme that hydrolyzes the amide bond of nonacid amide to stereoselection.
  • stringent conditions for example, conditions in which DNAs having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more are hybridized to each other, specifically, for example, a hybridization reaction is performed.
  • stringent conditions for example, conditions in which DNAs having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more are hybridized to each other, specifically, for example, a hybridization reaction is performed.
  • ° C, 1 X SSC, 0. 1% SDS preferably ⁇ or 60 ° C, 0. 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS, particularly preferably ⁇ or 65 ° C, 0. 1 X
  • the microorganism that can be a donor of the DNA encoding the enzyme of the present invention is a microorganism having an enzyme activity that stereoselectively hydrolyzes the amide bond of L-form amino acid amide, particularly L-form 2-alkylcysteine amide. Good.
  • a method for finding such microorganisms there are a method of selecting from conserved strains such as type culture, and a method of separating from the natural world.
  • microorganisms having such enzyme activity include microorganisms belonging to the genus Protaminopactor, Mycoplana, and Xantapacter, more specifically, Protaminobacter alboflavus ( Protaminobacter alboflavus), Mycoplana ramose, Mycoplana dimo rpha, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, and other microorganisms such as Xanthobacter flavus.
  • Cultivation of the DNA donor microorganism is usually performed using a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt essential for each microorganism, nutrients, and the like that can be assimilated.
  • the temperature during culture is preferably in the range of 4-10, and the temperature is preferably 20-39 ° C.
  • the culture is aerobic for about 1 day to 1 week.
  • a normal enzyme purification method can be used for the purification of the enzyme. That is, microbial cells are collected from the culture broth after culturing by ordinary techniques such as centrifugation and membrane separation, and microbial cells are crushed by a mechanical method such as ultrasonic treatment. Thereafter, the residue is removed by centrifugation or the like to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution can then be purified by salting out, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, crystallization, and the like.
  • DNA extracted from X. flavus is partially degraded with an appropriate restriction enzyme (eg, EcoRI). Southern DNA and hybridization are performed using a DNA probe labeled with this DNA fragment. The DNA identified here is extracted and purified, bound to an appropriate plasmid vector, and transformed into E. coli.
  • an appropriate restriction enzyme eg, EcoRI
  • Colony hybridization is performed using the labeled DNA probe, and a clone plasmid containing the target DNA fragment is obtained.
  • This plasmid is used to determine the base sequence of DNA derived from X. flavus incorporated into the vector.
  • the L-amino acid amide asymmetric hydrolase gene amino acid sequence reading frame was found in the determined DNA base sequence, and the L-amino acid amide asymmetric hydrolysis was performed in the DNA fragment obtained in the above step. Confirm that the entire coding region of the enzyme gene is present.
  • a primer is designed based on the obtained DNA base sequence of the L-amino acid amide asymmetric hydrolase gene.
  • the DNA is amplified by PCR using the chromosome DNA extracted from X.
  • pMCAl flavus as a saddle and bound to a plasmid vector (pUC 19). This is named pMCAl.
  • pMCAl is transformed into E. coli (jM109), and the recombinant bacterium carrying the L-form amino acid asymmetric hydrolase gene is named PMCA1ZJM109.
  • the plasmid pMCA1 may be digested with a restriction enzyme that recognizes a sequence present in the multicloning site of pUC19 to obtain the DNA, or the plasmid pMCAl is converted into a cage and SEQ ID NO: 7
  • the DNA may be obtained by a PCR method using primers designed based on the nucleotide sequence.
  • the DNA of the present invention can also be obtained from other strains of Xantopactor flavus, or from chromosomes of microorganisms other than Xantopacter flavus.
  • a probe designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 a DNA encoding the enzyme derived from the microorganism is isolated from the chromosomal DNA force of the microorganism by a hybridization reaction. I can do it.
  • a vector for introducing the DNA of the present invention into a host microorganism either a plasmid vector (eg pUC18, pUC19, pUC118 etc.) or a phage vector (eg gtll etc.) may be used. It is also possible to integrate directly into the chromosome of the host microorganism without using a vector.
  • the host microorganism used for transformation is not particularly limited to the bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, Escherichia coli JM105 strain or ⁇ or M109 strain.
  • Non-radioactive such as piotin and fluorescein ⁇ Any of the compounds can be used.
  • Etc. V can be easily carried out using known methods described in Molecular Cloning 3rd edition etc.
  • Li-Cor DNA Sequenc It can be easily implemented by using equipment such as the er model 4000L according to the attached manual instructions.
  • Hybridization can be carried out according to the method described in Molecular Cloning 3rd Edition.
  • Culture of the transformed microorganism of the present invention is usually performed using a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt essential for the microorganism, nutrients, and the like that can be assimilated.
  • the preferred temperature during cultivation is in the range of 4 to 10 and the preferred temperature is 20 to 50 ° C.
  • the culture is aerobic for about 1 day to 1 week.
  • the enzyme of the present invention can be obtained from the transformed microorganism cultured in this manner by a conventional purification method. The enzyme thus obtained can be used in a reaction for producing L-form amino acids from L-form amino acid amides such as compounds represented by the formula (I) in a stereoselective manner.
  • a mixture of DL-form amino acid amides such as racemate is a substrate
  • a mixture of L-form amino acids and D-form amino acid amides is obtained.
  • the L-form amino acid and the D-form amino acid amide are obtained by separating them, and the D-form amino acid amide is obtained by separately hydrolyzing the separated D-form amino acid amide.
  • the microbial cell of a transformant, or the processed material of this microbial cell can also be used for the said reaction.
  • a culture solution containing the cells, isolated cells, disrupted cells, etc. can be used for the above reaction, and the cells or enzymes can be fixed and used according to a conventional method.
  • the concentration of the raw material amino acid amide in the reaction solution is 0.1 to 40 wt%.
  • Preferable dry bacteria of recombinant microorganisms 0.00001 to 3 times the weight of the raw material amino acid amide, usually 0.005 to 0.001 times more preferred! / ⁇ .
  • the reaction temperature is 10 to 70 ° C, preferably 20 to 60 ° C, and the pH is 4 to 13, preferably 5 to 10, and more preferably 6 to 9.
  • 2-alkylcysteamide and 2-alkylcystine are susceptible to acid oxidization, and when left in the presence of oxygen, disulfide is formed in two quantities.
  • the biochemical asymmetric hydrolysis reaction is preferably performed in an inert gas atmosphere such as nitrogen, but a method in which a reducing substance such as 2-mercaptoethanol coexists in the system is also possible. It is.
  • a reducing substance such as 2-mercaptoethanol coexists in the system.
  • the reaction proceeds favorably without generating by-products.
  • metal ions such as Mg, Cu, Zn, Fe, Mn, Ni, and Co are reacted.
  • the reaction rate can be further increased by adding to the reaction system.
  • the amount to be added differs depending on the type of metal ion and cannot be generally specified, but it is desirable to add metal ions at a concentration of preferably 1 to 50 ppm, more preferably 5 to 20 ppm.
  • metal ions when divalent Mn ions are added in an amount of 5 to 20 ppm, the reaction rate is greatly improved by 2 to 5 times compared to the case of no addition.
  • the cells used for the asymmetric hydrolysis reaction or the treated cells can be recovered by centrifugation or filtration and reused as an enzyme catalyst for the asymmetric hydrolysis reaction.
  • the amount of the enzyme relative to the amino acid amide is 3 times or less, which is the upper limit of the preferred range of the amount used, and the reaction is suitably carried out. Choose the ratio you can!
  • the L-form amino acid amide asymmetric hydrolase of the present invention is characterized by efficiently hydrolyzing the amide bond of the L-form 2 alkyl cysteamide, and the enzyme having a very wide substrate spectrum. By using it, it is possible to produce a variety of L-amino acids corresponding to the amino acid amide power of a variety of L-forms. Specifically, it is prepared from 2-methyl-L cysteine, proteinaceous amino acids such as L-alanine, L-parin, L-leucine, and L-ferranin, and also L-2-aminobutyric acid.
  • Xanthobacter flavus NR303 strain was inoculated into 3 L of medium having the composition shown in Table 2 below, cultured at 30 ° C for 170 hours, and the cells were obtained by centrifugation.
  • a cell-free extract was prepared by sonicating a wet weight of 240 g of cells and centrifuging.
  • ammonium sulfate was further added to the supernatant to 60% saturation.
  • the resulting precipitate was collected by centrifugation, dissolved in lOOmM potassium phosphate buffer, and dialyzed against 10 mM potassium phosphate buffer.
  • N-terminal amino acid sequence of the polypeptide purified according to Example 1 was analyzed using an automated Edman-degraded amino acid sequence HPG1005A Protein Sequencing System (manufactured by Hewlett-Packard). This amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Xantapactor flavus (X. flavus) was inoculated into 5.
  • Microbial cells were obtained by centrifugation, and the chromosomal DNA of the microorganism was obtained using the phenol black mouth method.
  • the primers of SEQ ID NOs: 2 (AF), 3 (BF), 4 (AR), 5 (BR) were designed, and among these four primers in the presence of heat-resistant DNA polymerase Then, PCR was performed with any two species added.
  • the chromosomal DNA of Xantho pactor flavus was obtained by the method described in Example 3. After digesting this DNA with EcoRI. Southern hybridization was performed using the 87 bp labeled DNA prepared in Example 3 as a probe. The method followed the 3rd edition of Molecular Cloning. As a result, a DNA band of about 5 kb was detected. This DNA was extracted and purified from an agarose gel, inserted into the Eco RI site of pBluescriptll SK (—) (Stratagene), and transformed by a transformation method using calcium chloride. It was introduced into E. coli (jM109). [0037] Example 5
  • the transformed strain of E. coli (jM109) obtained in Example 4 was mixed with LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin (1 g of Bacto Trypton, 10.0 g of Bacto Trypton, 5.0 g of Bacto Yea st Extract, (Including 10.0 g of sodium and 15 g of agar), and cultured at 37 ° C.
  • the resulting colonies were lifted to a -trocellulose membrane CELLULOSE NITRATE (manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.), and hybridization was performed using the DNA probe obtained in Example 3.
  • a plasmid was obtained from positive clones, and the base sequence was determined using Li-Cor DNA Sequencer model 4000L (SEQ ID NO: 7).
  • PCR was carried out using Primer MCA-F and MCA-R (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) using chromosome DNA extracted from X. flavus as a saddle type.
  • the resulting PCR reaction product was purified, digested with restriction enzymes Hindlll and Xbal, and ligated to pUC19 (Takara Shuzo Co., Ltd.) digested with the same enzymes to prepare pMCAl, and then E. coli Q M109) Was transformed by the calcium chloride method.
  • a transformant was applied to an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin, and a grown clone was obtained to obtain a transformant pMCAlZ JM109.
  • the cells were removed from the reaction solution by centrifugation to obtain a supernatant.
  • Activated carbon lg was added to the supernatant and stirred for 1 hour, and then the activated carbon was filtered off and water was distilled off under reduced pressure using an evaporator. 20 mL of 2pronol V was added thereto, and the mixture was heated and stirred, then cooled to 5 ° C and the precipitated crystals were collected by filtration. The crystals collected by filtration were recrystallized from ethanol to obtain 3.04 g (22.5 mmol) of 2-methyl L cysteine.
  • the isolated yield from 2-methyl-L-cystineamide in the racemic mixture charged in the reaction was 76.8 mol%, and the isolated yield from the racemic mixture of 2 methylcystamide was 38.4%. Further, this solid was analyzed under the conditions of HPLC in Table 4 below. As a result, the optical purity was 98% ee or higher.
  • Example 7 a biochemical asymmetric hydrolysis reaction was performed without adding an aqueous manganese chloride solution. Reaction was performed at 30 ° C for 24 hours, and the same post-treatment as in Example 7 was carried out. 1.50 g (l ll mmol) of 2-methyl L cysteine was obtained. The isolated yield from 2-methyl L cysteine amide was 37.9 mol%, the isolated yield from 2 methyl cysteine amide was 18.9 mol 1%, and the optical purity was 98% ee or higher.
  • a medium having the composition shown in Table 5 below was prepared, 200 mL of this medium was placed in a 1 L Erlenmeyer flask, sterilized, inoculated with Xantopaacter flavus (X. flavus), and cultured with shaking at 30 ° C for 170 hours. Next, viable cells corresponding to 0.1 lg of dry cells were obtained by centrifugation.
  • Comparative Example 2 a biochemical asymmetric hydrolysis reaction was performed without adding a salt-manganese aqueous solution. The reaction was carried out at 30 ° C for 24 hours. After the reaction, the bacterial cells were removed from the reaction solution by centrifugation, and the supernatant was analyzed under HPLC condition B. As a result, 1-3.9 mmo 1 of 2-methylcystine was produced. It was confirmed that Further analysis by HPLC condition A revealed that L-amino acid The optical purity was 98% ee or higher.
  • optically active amino acids particularly optically active 2-alkyl cysteines, which are expected to be widely used as intermediates for the production of various industrial chemicals, pharmaceuticals and agricultural chemicals, are industrially very useful compounds.
  • a suitable method for producing can be provided.

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Abstract

　Ｌ体のアミノ酸アミド、特にＬ体の２－アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素をコードする遺伝子を導入して組換え微生物を作製し、得られた微生物の菌体又は菌体処理物を用いて、Ｌ体のアミノ酸アミドからＬ体のアミノ酸を製造する。

Description

明 細 書
L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードする DNA 技術分野
[0001] 本発明は、新規な L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードする DNA 、並びにそれらの利用に関する。更に詳しくは、 L体のアミノ酸アミド、特に L体の 2— アルキルシスティンアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を少なくとも 有する新規な酵素、及び該酵素タンパク質をコードする DNA、並びに該 DNAを導 入した組換え微生物、及び該組換え微生物を使用することによって、酵素の培養生 産性を大幅に向上させると共に、そのようにして得られた酵素を用いることによって、 L体のアミノ酸アミドを効率的に L体のアミノ酸に変換する方法に関する。光学活性な アミノ酸やアミノ酸アミド、特に光学活性な 2—アルキルシスティンや 2—アルキルシス ティンアミドは、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として重要な物質である 背景技術
[0002] アミノ酸アミドから光学活性なアミノ酸を製造する方法としては、例えば、ラセミ体の アミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に不斉加水分解する酵素を含んだ微生物や 微生物の菌体処理物を作用させる方法が、工業的に優れた方法として知られている (例えば、特許文献 1, 2参照)。し力しながら、このような生体由来の触媒である酵素 は、穏和な反応条件で、し力も極めて高い反応特異性で目的産物を生成させると言 う優れた特徴を有する反面、触媒可能な基質の種類が限られたり、菌体の酵素産生 量そのものが少ないため、反応を行うに当たって多量の菌体を必要とし、結果的に、 経済的に不利となり採用できなくなると言う技術的問題点を抱えていた。
[0003] そこで、このような働きをする酵素の産生量を高める目的から、アミノ酸アミドを立体 選択的に加水分解する酵素の酵素タンパク質をコードする DNAを、遺伝子組換え 手法でクローン化して形質転換体となし、該形質転換体を用いてラセミ体のアミノ酸 アミドから光学活性アミノ酸を製造するという試みがなされた (例えば、特許文献 3〜8 、非特許文献 1参照)。 [0004] 例えば、特許文献 3には、 Variovorax由来の D アミダーゼ、それをコードする D NA、そのような核酸を含有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダィズする 核酸、核酸を製造するためのプライマー等が、また特許文献 4には改変型アミノ酸ァ ミダーゼとそれを用いた D体アミノ酸の製造方法が開示されている。し力しながら、こ れらの方法は D体のアミノ酸アミドにのみ作用するものであって、 L体のアミノ酸アミド を加水分解することはできな 、。
一方、 L体のアミノ酸アミドに作用する例としては、例えば、特許文献 5には、シユー ドモナス ァゾトフオルマンス由来の L体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に 加水分解する酵素とそれをコードする DNAが開示されている。しカゝしながら、この酵 素は L—プロリンアミドに対する活性は高いが、その他の L体のアミノ酸アミドに対する 活性は低い。
[0005] その他、特許文献 6は、コマモナス ァシドボランス由来の酵素タンパクとこれをコー ドする DNA並びにこの酵素タンパクを用いた光学活性有機酸の製造方法が開示さ れており、その中にアミノ酸アミドの不斉加水分解も開示されている力 ロイシンアミド 又はフエ-ルァラニンアミドを基質とした場合だけである。また、特許文献 7には、 a アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ 活性を有するタンパク質とこれをコードする DNAが開示されて 、るが、好ま 、ァミノ 酸アミドとして開示されているのは t一口イシンアミドを基質とした場合だけである。また 、特許文献 8には、ペプチドアミダーゼを含有する微生物の獲得方法、それにより得 られた微生物、その中に含有されるペプチドアミダーゼ及びその使用方法が開示さ れているが、この酵素は、ジペプチドアミドゃ N ァセチルアミノ酸アミド又は保護さ れたアミノ酸アミドに対して高い活性を有するが、未保護のアミノ酸アミドを加水分解 する活性を有していない。さらに、例えば非特許文献 1には、 α位にアルキル基を有 するアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素が開示されているが、ここで開 示されて!/、る例はメチルバリン、メチルロイシン及びメチルフエ-ルァラニン等の炭化 水素型の側鎖を有するアミノ酸に限られており、側鎖にメルカプト基とアルキル基を 有する 2—アルキルシスティンに関する記載は一切認められな!、。
[0006] 通常の天然型アミノ酸以外の特殊アミノ酸であるアルキルシスティンの誘導体であ る 2—アルキルシスティンは、 α位の炭素原子にアルキル基を有する他、メルカプト 基、アミノ基及びカルボキシル基と言った反応性に富む複数の置換基を分子内に有 しており、特にその光学活性体は各種工業薬品、医薬、農薬等の製造原料、汎用キ ラルビルディングブロックとして広範な活用が期待される化合物であり、産業上非常 に有用な化合物であるため、工業的に有利な、安価な製造方法の開発が望まれて いた。
[0007] し力しながら、上述したように、 L体の 2—アルキルシスティンアミドのアミド結合を立 体選択的に加水分解する活性を有する酵素は知られておらず、従って、このような方 法で光学活性な 2—アルキルシスティン、又は光学活性な 2—アルキルシスティンァ ミドを製造する方法も知られていな力つた。また、その他の L体のアミノ酸アミドに対す る基質スぺ外ルが広ぐ工業原料として有用な種々のアミノ酸アミド類に対応できる 高活性かつ高立体選択的な L体のアミノ酸アミド加水分解酵素、及び該酵素の効率 的な生産方法と利用方法が求められていた。
[0008] 特許文献 1：特開昭 61— 293394号公報
特許文献 2：特開昭 62— 55097号公報
特許文献 3：特開 2003 - 225094号公報
特許文献 4：特開 2002— 253256号公報
特許文献 5：特開 2003 - 250558号公報
特許文献 6 :特開平 8— 256771号公報
特許文献 7：国際公開第 00Ζ63354号パンフレット
特許文献 8：特許第 3112090号明細書
非特許文献 1 :H. F. M. Hermes他、 Applied and Environmental microbiol ogy、 Vol. 60、 Nol、 p. 153— 159、 1994
発明の開示
[0009] 本発明の目的は、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として広範な活用 が期待され、産業上、非常に有用な化合物である光学活性なアミノ酸、特に光学活 性な 2—アルキルシスティンを製造するために好適に使用できる、 L体アミノ酸アミド 不斉加水分解酵素及びそれをコードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA を導入した組換え微生物、並びにこれらを用いた光学活性アミノ酸、特に光学活性 な 2—アルキルシスティンの製造方法を提供することにある。
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 L体のアミノ酸ァ ミド、特に L体の 2—アルキルシスティンアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解 する高い酵素活性を有する微生物を新規に見出し、この微生物から当該触媒活性を 示す酵素を初めて単離'精製した。更に、この酵素をコードする DNAを初めて分離 取得し、該 DNAを含む組換え体 DNA、及び該組換え体 DNAを導入した組換え微 生物を調製し、発現させることに成功した。また、更に、このようにして得られた組換え 微生物を培養することによって、 DNA供与体として使用した野生株の場合と比較し て、顕著に高い比活性を有する菌体又は酵素溶液を調製することが可能になり、 L 体のアミノ酸アミド、特に L体の 2—アルキルシスティンアミドを極めて効率よく対応の L体の 2—アルキルシスティンに変換することができるようになった。
[0011] また、本発明の L体のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素は、 L体の 2—アルキルシス ティンアミドの不斉加水分解活性を有するだけではなぐ基質スペクトルが非常に広 ぐ Lーァラニン、 L—パリン、 L一口イシン、 L—フエ-ルァラニン等に代表される天然 型の通常アミノ酸、更には、 L— 2—ァミノ酪酸、 L— t—ロイシン、 L—フエ-ルグリシ ン、 L— p—クロ口フエ-ルグリシン、 L—ァリシンエチレンァセタール、 L—ぺ-シルァ ミン、（4R)— 5, 5—ジメチルー 1, 3—チアゾリジンー4一力ルボン酸等のいわゆる特 殊アミノ酸に対応する各種の L体のアミノ酸アミドを不斉加水分解することができる。こ のように本発明の酵素は、 L体のアミノ酸アミドのアミド結合を選択的に加水分解する と言う厳格な立体特異性と、幅広 、種類の L体のアミノ酸アミドに反応すると 、う性質 を併せ持った、従来知られて!/ヽる酵素と異なる産業的利用性に優れた新規な酵素で ある。
[0012] すなわち、本発明は、以下の（1)に示す L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素、 (2) 〜（3)に示す L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素をコードする DNA、（4)〜（5)に 示す組換え微生物、 (6)に示す当該酵素を用いた L体アミノ酸アミドから L体アミノ酸 を製造する方法、 (7)〜（9)に示す L体の 2—アルキルシスティンアミドカゝら L体の 2— アルキルシスティンを製造する方法に関するものである。 (1)配列番号 8に示されるアミノ酸番号 1〜355で表されるアミノ酸配列、又は該ァミノ 酸配列から 1個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列 を有する、 L体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
(2) (1)記載の酵素の酵素タンパク質をコードする DNA。
(3)配列番号 7に示される塩基配列の内の塩基番号 868〜 1932で表される塩基配 列、又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有す る、（2)記載の DNA。
(4) (2)又は（3)記載の DNAが導入された組換え微生物。
(5)組換え微生物がェシエリシァ コリ（Escherichia coli)である、（4)記載の組換 え微生物。
(6) (1)記載の酵素を L体のアミノ酸アミドに作用させ L体のアミノ酸に変換する、 L体 のアミノ酸の製造方法。
(7) L体のアミノ酸アミドが式 1に示すィ匕合物である、 (6)記載の製造方法。
[化 1]
Figure imgf000006_0001
)
式 1中の Rは水素、低級アルキル基、置換低級アルキル基、フエ-ル基、置換フエ
1
ニル基、複素環基、置換複素環基、又は Rが結合している炭素原子及び該炭素原
1
子に結合して ヽるァミノ基と一体となって含窒素複素環を形成し得る基である。ここで 、低級アルキル基としては、炭素数 1〜4のアルキル基などが挙げられ、置換低級ァ ルキル基としては、そのうちの 1又は複数の水素が、例えば、ヒドロキシ基、メトキシ基 、メルカプト基、メチルメルカプト基、アミノ基、グァニル基、カルボキシル基、カルボキ サミド基、ハロゲン基、フエニル基、ヒドロキシフエニル基、イミダゾリル基などで置換さ れた炭素数 1〜4のアルキル基などが挙げられる。置換フエ-ル基としては、任意の 水素がヒドロキシ基、メトキシ基、メルカプト基、メチルメルカプト基、アミノ基、グァ-ル 基、カルボキシル基、カルボキサミド基、ハロゲン基などで置換されたフエ-ル基など が挙げられる。また、複素環基としては、インドリル基、イミダゾリル基などが挙げられ 、置換複素環基としては、任意の水素がヒドロキシ基、メトキシ基、メルカプト基、メチ ルメルカプト基、アミノ基、グァ-ル基、カルボキシル基、カルボキサミド基、ハロゲン 基などで置換された前記のインドリル基、イミダゾリル基などの複素環基が挙げられる
。さらに、 Rが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体
1
となって含窒素複素環を形成し得る基としては、ピロリジン環、ピロール環、チアゾリジ ン環、ォキサゾリジン環などが挙げられる。
Rは水素、又は炭素数 1〜4の低級アルキル基である。
2
なお、 Rと Rが同時に水素である場合は化合物（1)からは除かれる。
1 2
[0014] (8) L体のアミノ酸アミドが式 2に示すィ匕合物である、（6)記載の製造方法。
[化 2]
Figure imgf000007_0001
(式 2中の Rは炭素数 1〜4の低級アルキル基を示す。 )
(9)式 2中の Rがメチル基である、 (8)記載の製造方法。
[0015] なお、本発明の酵素は、その活性が失われない限り、配列番号 8に示されるァミノ 酸番号 1〜355で表されるアミノ酸配列から、 1個若しくは複数個のアミノ酸が、欠損、 置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。複数個のアミノ酸の 数としては、好ましくは 2〜20個、好ましくは 2〜10個、特に好ましくは 2〜5個である 。また、本発明の酵素は、配列番号 8のアミノ酸配列に対して 80%以上、好ましくは 9 0%以上、より好ましくは 95%以上の相同性を有し、かつ L体のアミノ酸アミドのアミド 結合を立体選択に加水分解する酵素作用を有するものであってもよい。
[0016] また、本発明の酵素をコードする DNAは、配列番号 7の塩基配列の塩基番号 868 〜1932を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ L体のアミ ノ酸アミドのアミド結合を立体選択に加水分解する酵素をコードする DNAであっても よい。ストリンジェントな条件としては、例えば、 80%以上、好ましくは 90%以上、より 好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAが互いにハイブリダィズする条件、具体 的には、例えば、ハイブリダィズ反応を行い、 60°C、 1 X SSC、 0. 1%SDS、好ましく ίま 60°C、0. 1 X SSC、 0. 10/0SDS、特に好ましく ίま 65°C、 0. 1 X SSC、0. 1%SD Sで洗浄する条件が挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明の酵素をコードする DNAの 供与体となりうる微生物は、 L体のアミノ酸アミド、特に L体の 2—アルキルシスティン アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素活性を有する微生物であれば よい。そのような微生物を見出す方法としては、タイプカルチャー等の保存菌株の中 から選択する方法、或いは自然界から分離する方法がある。本発明者らは、まず保 存菌株について検討を行い、そのような酵素活性を有する微生物として、例えば、プ ロタミノパクター属、ミコプラナ属、及びキサントパクター属に属する微生物、より具体 的にはプロタミノバクタ一 ァルボフラバス（Protaminobacter alboflavus)、ミコプ ラナ ラモサ (Mycoplana ramose)、ミコプラナ ディモノレファ (Mycoplana dimo rpha)、キサントノ クタ一 オートトロビカス (Xanthobacter autotrophicus)、キサ ントパクター フラバス（Xanthobacter flavus)等の微生物が該当することを見出し た。
[0018] 次に、より好適な菌株を求め自然界からの分離を鋭意行った結果、キサントバクタ 一 フラバス (X. flavus)と同定される新たな菌株を分離することに成功した。本菌株 は、下記の菌学的性質 (表 1)に示すように、グラム染色陰性の非運動性桿菌であり、 多形態、カタラーゼ反応陽性、ォキシダーゼ反応陽性であることからキサントパクター 属に属する微生物と判断され、さらに 16SrDNA (16SrRNA遺伝子）の部分塩基配 列約 500bpを用いて帰属分類群を推定した結果、部分塩基配列が相同率 100%で キサントパクター フラバス (X. flavus)と一致し、分子系統樹上でもキサントパクター フラバス (X. flavus)と同じ場所に位置したことから、キサントパクター フラバス (X . flavus)と同定し、 NR303株と命名した。 表 1.菌学的件皙
細胞形態 桿菌
大きさ （0. 5 0. 6 X 2. O /z m) 多形態 あり
運動性 なし
胞子の有無 なし
グラム染色
コロニー形態 （栄養寒天、 30°C、 24時間) 円形
全縁滑らか
凸状
光沢あり
クリーム色
生育温度
37°C +
40°C
カタラーゼ +
ォキシダーゼ +
酸 Zガス生産 (ダルコース） Z—
OZFテスト（グルコース） Z—
硝酸塩還元 +
インドール生産
ブドウ糖 酸性化
アルギニンジヒドロラーゼ
ゥレアーゼ +
エスクリン加水分解
ゼラチン加水分解
β ガラクトシダーゼ チトクロームォキシダーゼ +
資化性
ブドウ糖
Lーァラビノース
D マンノース
D—マンニトール
N ァセチル— D—ダルコサミン ―
マノレトース ―
ダルコン酸カリウム +
n—力プリン酸
アジピン酸
dl リンゴ酸 +
クェン酸ナトリウム +
酢酸フエニル - 嫌気的生育性 +
[0020] 一例として、本発明者らが新たに分離した上記キサントパクター フラバス (X. flav us) NR303株のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子の単離方法、及び該遺伝 子のェシエリシァ コリ（E. coli)JM109株への導入方法を、以下に示す。
[0021] DNA供与体微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須 な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時の pHは 4〜10の 範囲が好ましぐ温度は 20〜39°Cが好ましい。培養は 1日〜 1週間程度好気的に行 われる。
[0022] 酵素の精製は、通常の酵素精製法を用いることができる。すなわち、培養終了後の 培養液から遠心分離や膜分離等の通常の手法によって菌体を集め、超音波処理等 の機械的方法等によって菌体を破砕する。その後、遠心分離等によって残渣を除き 粗酵素液を得る。次にこの粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、結晶化等によ り精製することがでさる。 [0023] 精製した酵素の N末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークェンサ一 H PG1005A protein sequencing system (ヒューレットノ ッカード社製)で決定し、 決定した N末端配列をもとに、 PCRで増幅するためのオリゴヌクレオチド (プライマー )を設計する。キサントパクター フラバス (X. flavus)より抽出した染色体 DNAを铸 型として PCRで DNAを増幅し、ラベルしてプローブとする。
[0024] キサントパクター フラバス (X. flavus)より抽出した DNAを適当な制限酵素（例え ば EcoRI等）で部分分解する。この DNA断片とラベルイ匕した DN Aプローブを用いて 、サザンノ、イブリダィゼーシヨンを行う。ここで特定された DNAを抽出精製し、適当な プラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。
[0025] ラベル化した DNAプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンを行い、 目的 の DNA断片を含むクローンのプラスミドを取得する。このプラスミドを用いて、ベクタ 一に組み込まれた、キサントパクター フラバス (X. flavus)由来の DNAの塩基配列 を決定する。決定された DNA塩基配列中に L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺 伝子のアミノ酸配列の読み枠を見出し、上記工程で得られた DNA断片中に、 L体ァ ミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子の全コード領域が存在することを確認する。 得られた L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子の DNA塩基配列を元に、プ ライマーを設計する。キサントパクター フラバス (X. flavus)より抽出した染色体 DN Aを铸型として PCRで DNAを増幅し、プラスミドベクター（pUC 19)と結合する。これ を pMCAlと命名する。 pMCAlを E. coli (jM109)に形質転換し、 L体アミノ酸アミ ド不斉加水分解酵素遺伝子を保有する組換え菌を PMCA1ZJM109と命名する。
[0026] なお、ここで得られた形質転換体 PMCA1ZJM109は、 2004年 5月 21日に独立 行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（干 305— 5466 日本国 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM AP— 20056として寄託され 、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP— 10334の受 託番号で寄託されている。したがって、この形質転換体に保持されるプラスミド pMC A1から本発明の酵素をコードする DNAを取得することもできる。例えば、プラスミド p MCA1を、 pUC 19のマルチクローユングサイトに存在する配列を認識する制限酵素 で消化して該 DNAを取得してもよいし、プラスミド pMCAlを铸型にし、配列番号 7 の塩基配列に基づ 、て設計したプライマーを用いた PCR法により該 DNAを取得し てもよい。
また、キサントパクター フラバスのその他の株、又はキサントパクター フラバス以 外の微生物の染色体から、本発明の DNAを取得することもできる。例えば、配列番 号 7の塩基配列に基づ 、て設計されたプローブを用い、ハイブリダィゼーシヨン反応 により、上記微生物由来の前記酵素をコードする DNAをその微生物の染色体 DNA 力ら単離することちできる。
[0027] 本発明の DNAを宿主微生物に導入するためのベクターとしては、プラスミドベクタ 一（例えば pUC18、 pUC19、 pUC118等）、ファージベクター（例えばえ gtl l等）の 何れでもよい。さらにベクターを用いずに宿主微生物の染色体へ直接組込むことも 可能である。また、形質転換に用いられる宿主微生物としては、エシ リヒア属細菌、 例えば、ェシヱリシァ コリ（E. coli)JM105株又 ίお M109株等が挙げられる力 特 にこれらに限定されるものではない。
[0028] なお、 DNA、組換え体宿主としての E. coliの取扱いなどに必要な操作は、当業者 間で通常行われているものであり、例えば Molecular Cloning : A Laboratory M anual、 3rd Ed. (ed. Sambrook J. and Russell D. W 、 Cold Spring H arbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、 New York、 2001 (以下、 モレキュラークロー-ング第 3版と記す）に従えば容易に実施できる。使用する酵素、 試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されてい る使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。該菌からの全 DN A抽出は、例えば Saitoら（Biochim. Biophys. Acta. , 72, 619— 629, 1963) の方法に準じて行うことができる。また、 DNAのラベルイ匕は従来力も汎用されている 放射性同位元素或いはジゴキシゲニン、ピオチン、フルォレセイン等の非放射性ィ匕 合物の何れも使用可能であり、 Rediprime™II Random Prime Labelling Sys te (アマシャムフアルマシアバイオテク（株）社製）や AlkPhosTM Direct Labellin g and Detection System (アマシャムフアルマシアバイオテク（株）社製）等を用 V、れば容易に実施できる。 DNA塩基配列の決定もモレキュラークローユング第 3版 等に記された公知の方法を用いることができる。例えば、 Li -Cor DNA Sequenc er model 4000L等の機器を付属のマ-ユアルインストラクションに従って使用す れば容易に実施できる。また、ハイブリダィゼーシヨンはモレキュラークローユング第 3 版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
[0029] 本発明の形質転換微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、微生物に 必須な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時の pHは 4〜1 0の範囲が好ましぐ温度は 20〜50°Cが好ましい。培養は 1日〜 1週間程度好気的 に行われる。このようにして培養した形質転換微生物から通常の精製法により本発明 の酵素を得ることができる。このようにして得られた酵素は立体選択的に式 (I)に示さ れる化合物などの L体のアミノ酸アミドから L体のアミノ酸を製造する反応に用いること ができる。ラセミ体等の DL体のアミノ酸アミドの混合物が基質である場合には、 L体の アミノ酸と D体のアミノ酸アミドの混合物が得られる。この場合これらを分離することに より、 L体のアミノ酸と D体のアミノ酸アミドがそれぞれ得られ、分離された D体のアミノ 酸アミドを別途加水分解することによって D体のアミノ酸が得られる。また、酵素反応 の基質力 体のアミノ酸アミドのみ力 なる場合には対応した L体のアミノ酸が得られ る。なお、形質転換体の菌体、又は該菌体の処理物を上記反応に用いることもできる 。例えば、該菌体を含む培養液、分離菌体、菌体破砕物などを上記反応に使用する ことができ、常法に従って菌体又は酵素を固定ィ匕して使用することもできる。
[0030] 反応条件は、反応液に含まれる L体アミノ酸アミドの種類及び量によっても異なるが 、反応液中の原料アミノ酸アミドの濃度としては 0. l〜40wt%、酵素量は、該酵素を 含む組換え微生物の乾燥菌体基準で、原料アミノ酸アミド重量の 0. 00001〜3倍、 通常 ίま 0. 00005〜0. 001倍力好まし!/ヽ。反応温度 ίま 10〜70°C、好ましく ίま 20〜6 0°C、 pHは 4〜13、好ましくは 5〜10、よりさらには 6〜9が好ましい。また、 2—アル キルシスティンアミド及び 2—アルキルシスティンは酸ィ匕を受けやすく、酸素存在下で 放置すると 2量ィ匕したジスルフイドとなる。これを防止するため、生化学的不斉加水分 解反応は窒素等の不活性ガス雰囲気下で行なうのが好ましいが、系内に 2—メルカ ブトエタノール等の還元性物質を共存させる方法も可能である。また、反応に用いる 全ての溶媒を反応実施前に脱気すると、副生成物を生成せず好適に反応が進行す る。なお、本反応を行う際に、 Mg、 Cu、 Zn、 Fe、 Mn、 Ni、 Co等の金属イオンを反 応系に加えることによって反応速度をより高めることができる。添加する量は金属ィォ ンの種類によって異なり一概には言えないが、好ましくは l〜50ppm、より好ましくは 5〜20ppmとなる濃度の金属イオンを添加することが望ましい。例えば、 2価の Mnィ オンを 5〜20ppmカ卩えた場合、反応速度は、無添加の場合に比較して 2〜5倍と大 幅に向上する。また、不斉加水分解反応に使用した菌体又は菌体処理物は、遠心 分離若しくは濾過操作などにより回収し、不斉加水分解反応用の酵素触媒として再 利用することができる。なお、原料のアミノ酸アミドの反応液中における濃度が高い場 合には、前記のアミノ酸アミドに対する酵素量は、使用量比が好ましい範囲の上限で ある 3倍以下であって、反応が好適に実施できる比率を適宜選択すればよ!ヽ。
[0031] DL体のアミノ酸アミドの不斉加水分解反応で生成した L体アミノ酸と未反応の D体 アミノ酸アミドとの分離は、反応終了液から、例えば遠心分離や濾過膜などの通常の 固液分離手段により微生物菌体を除いた後、減圧濃縮して力 有機溶媒を加えてァ ミノ酸を析出させる方法、再結晶やカラムクロマトグラフィー等の公知の方法を利用で き、特に制限はないが、イオン交換電気透析法や、イオン交換榭脂による吸脱着を 利用した分離方法も有効である。
[0032] 本発明の L体のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素は L体の 2 アルキルシスティンァ ミドのアミド結合を効率的に加水分解する特徴を有する他、基質スペクトルが非常に 広ぐ本酵素を用いることにより多種類の L体のアミノ酸アミド力 対応の L体のァミノ 酸を製造することができる。具体的には、 2—メチル—L システィンにカ卩え、 L ァラ ニン、 L—パリン、 L ロイシン、 L フエ-ルァラニン等に代表されるタンパク性ァミノ 酸、更には L— 2—ァミノ酪酸、 L— t ロイシン、 L フエ-ルグリシン、 L— p クロ口 フエニルグリシン、 L ァリシンエチレンァセタール、 L ぺ-シルァミン、 （4R)—5, 5 -ジメチル 1, 3 チアゾリジン 4 カルボン酸等の 、わゆる非タンパク性ァミノ 酸を挙げることができる力 S、これに限定されるものではない。
実施例
[0033] 本発明を実施例及び比較例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら例に 限定されるものではない。
実施例 1 アミノ酸アミド不吝加水分解酵素の単離
キサントパクター フラバス（Xanthobacter flavus) NR303株を、下表 2の組成を 有する培地 3Lに接種し、 30°Cで 170時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。 菌体湿重量 240gを超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
(NH ) SO 3g
4 2 4
KH PO 1. 4g
2 4
Na HPO 3g
2 4
NaHCO 0. 3g
3
MgSO - 7H O 0. 2g
4 2
2% CaCl lg
2
Yeast extract 0. 2g
ビタミン混液 lg
尿素 lg
グリセリン lOg
微量ミネラル 3. 5e
lL (pH7. 0)
これに 30%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを添加し、遠心分離して沈殿を除去 した後、上清液に 60%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを追加添加した。生成した 沈殿を遠心分離で集め、 lOOmMリン酸カリウム緩衝液に溶解し、 10mMリン酸カリ ゥム緩衝液で透析した。これを 1 OmMリン酸力リゥム緩衝液で平衡ィ匕した DEAE - T oyopearl榭脂 (東ソ一 (株)社製）に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、そ のアミノ酸アミド不斉加水分解活性を有する画分を順次硫酸アンモ-ゥムを用いた B utyl— Toyopearlカラム (東ソ一 (株)社製)、 Gigapiteカラム (生化学工業 (株)社製) を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。得られた精製酵素を SDS— PAGEにより 分離したところ単一バンドであり、分子量は 40000であった。
実施例 2
N末端アミノ酸配列の解析 実施例 1により精製したポリペプチドの N末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミ ノ酸シークェンサ一 HP G1005A Protein Sequencing System (ヒューレット ノ ッカード社製)を用いて分析した。このアミノ酸配列は配列番号 1で示される。
[0035] 実施例 3
本発明 DNA断片の取得
キサントパクター フラバス（X. flavus)を上記表 1の培地 5. OmLに接種し、 30°C で 48時間培養した。遠心分離により微生物菌体を取得し、フエノールクロ口ホルム法 を用いて該微生物の染色体 DNAを取得した。実施例 2で判明したアミノ酸配列から 、配列番号 2 (AF)、 3 (BF)、 4 (AR)、 5 (BR)のプライマーを設計し、耐熱型 DNA ポリメラーゼ存在下これら 4種のプライマーのうち、任意の 2種を添カ卩して PCRを行つ た。本 PCRの産物をァガロースゲル電気泳動したところ配列番号 3のプライマー BF と配列番号 4の ARを用いた反応液に 87bpの DNAが特異的に増幅されて!、たので 、これをァガロース電気泳動ゲル力も抽出精製した。その DNAの一部を pT7BlueT — Vector (Novagen社製)にクロー-ングして Li— CorDNA Sequencer model 4 000Lを用いて (操作方法は付属のマ-ユアルインストラクションに従った)塩基配列 を決定した（配列番号 6)。上記 DegenerPCRにより増幅した 87bpの精製 DNAの残 りを Rediprime™II Random Prime Labelling System (アマシャムファノレマシア バイオテク (株)社製）により標識した。
[0036] 実施例 4
キサントパクター フラバス（X. flavus)染色体 DNAライブラリーのサザンハイブリダ ィゼーシヨン
実施例 3記載の方法によりキサントパクター フラバス (X. flavus)の染色体 DNAを 取得した。本 DNAを EcoRIで消化した後。実施例 3で作製した 87bpの標識 DNAを プローブとして用いてサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。手法はモレキュラーク ローニング第 3版に従った。その結果、約 5kbの DNAバンドが検出され、本 DNAを ァガロースゲルから抽出精製し、 pBluescriptll SK (—）（Stratagene社製）の Eco RI部位に挿入し、塩ィ匕カルシウムを用いた形質転換方法により E. coli (jM109)に 導入した。 [0037] 実施例 5
コロニーハイブリダィゼーシヨン及びサブクローニング
実施例 4において得られた E. coli(jM109)の形質転換株を 50 μ gZmLアンピシ リンを含む LB寒天培地（1Lの水溶液中に Bacto Trypton 10. 0g、 Bacto Yea st Extract 5. 0g、塩ィ匕ナ卜リウム 10. 0g、寒天 15. Ogを含む）に塗布し、 37°C でー晚培養した。生じたコロニーを-トロセルロース膜 CELLULOSE NITRATE ( アドバンテック東洋 (株)社製）にリフティングし、実施例 3で取得した DNAプローブを 用い、ハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーシヨンの結果、陽性のクロー ンからプラスミドを取得し、 Li— Cor DNA Sequencer model 4000Lを用いて 、塩基配列を決定した (配列番号 7)。
[0038] 実施例 6
現用プラスミドの構签及び E. coliの形皙転橼
キサントパクター フラバス (X. flavus)より抽出した染色体 DNAを铸型として、プラ イマ一 MCA— Fと MCA— R (配列番号 9及び配列番号 10)を用いて PCRを行った 。得られた PCR反応生成物を精製し、制限酵素 Hindlll及び Xbalで消化し、同様の 酵素で消化した pUC19 (宝酒造 (株)社製）に連結して pMCAlを作製後、 E. coli Q M109)に塩化カルシウム法で形質転換した。 50 μ gZmLアンピシリンを含む LB寒 天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株 pMCAlZ JM109を得た。
[0039] 実施例 7
形皙転椽体を用いた 2—メチルシスティンアミドラセミ混合物の不吝加水分解〜塩化 マンガン添加
下表 3の組成の培地を調製し、この培地 200mLを 1Lの三角フラスコに入れ、滅菌 後、アンピシリン gZmLを添カ卩して力も形質転^ ¾pMCAlZjM109を接種し 、 37°Cで 15時間振とう培養を行った。次いで、培養液から遠心分離により乾燥菌体 0 . lgに相当する生菌体を得た。 pH 7. 0 トリプトン 1%
酵母エキス 0. 5%
塩化ナトリウム 0. 5%
2 メチルシスティンアミド塩酸塩のラセミ混合物 10. 0g (58. 6mmol)を 50mMリ ン酸緩衝液（pH7. 0) 300mLに溶力した後、 500mLフラスコに入れ、 2価の Mnィ オンの濃度が lOppmとなるように塩ィ匕マンガン水溶液をカ卩え、さらに乾燥菌体 0. 01 gに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、 30°Cで 24時間攪拌して加水分解反応 を行った。
反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去して上清を得た。この上清液に 活性炭 lgを加えて 1時間攪拌した後、活性炭を濾別して力もエバポレーターで減圧 にて水を留去した。ここに 2 プロノ V—ル 20mLをカ卩えて過熱攪拌後、 5°Cに冷却 して析出した結晶を濾取した。濾取した結晶をエタノールより再結晶して 2—メチル L システィン 3. 04g (22. 5mmol)を得た。反応に仕込んだラセミ混合物中の 2— メチルー L—システィンアミドからの単離収率は 76. 8mol%、 2 メチルシスティンァ ミドのラセミ混合物からの単離収率は 38. 4%であった。また、この固体を下表 4の H PLC条件 Aで分析した結果、光学純度は 98%e. e.以上であった。
表 4. HPLC条件 A
カラム： Sumichiral OA— 5000 ( (株）住化分析センター社製）
カラム温度： 60°C
溶離液： 3mM CuSO水溶液
4
流速： 1. OmL/ mm
検出： CD— 2095plus (Jasco)
試料: 0. 1%水溶液をホルマリン処理後、 50 L注入
実施例 8
形皙転椽体を用いた 2—メチルシスティンアミドラセミ混合物の不吝加水分解〜塩化 マンガン非添加
実施例 7において、塩化マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を 行った。 30°Cで 24時間反応を行い、実施例 7と同様の後処理を施し、 1. 50g(l l.l mmol)の 2—メチル L システィンが得られた。 2—メチル L システィンアミドか らの単離収率は 37. 9mol%、 2 メチルシスティンアミドからの単離収率は 18. 9mo 1%、光学純度は 98%e. e.以上であった。
比較例 1
野牛.卑』微生物（菌体 0. Olg)を用いた 2—メチルシスティンアミドラセミ混合物の不吝 加水分解
下表 5の組成を有する培地を調製し、この培地 200mLを 1Lの三角フラスコに入れ 、滅菌後、キサントパクター フラバス (X. flavus)を接種し、 30°Cで 170時間振とう 培養を行った。次いで、培養液力も遠心分離により乾燥菌体 0. lgに相当する生菌 体を得た。
5. %
(NH ) SO 3g
4 2 4
KH PO 1. 4g
2 4
Na HPO 3g
2 4
NaHCO 0. 3g
3
MgSO - 7H O 0. 2g
4 2
2% CaCl lg
2
Yeast extract 0. 2g
ビタミン混液 lg
尿素 lg
グリセリン lOg
微量ミネラル 3. 5e
lL (pH7. 0)
2 メチルシスティンアミド塩酸塩のラセミ混合物 10. 0g (58. 6mmol)を 50mMリ ン酸緩衝液（pH7. 0) 300mLに溶力した後、 500mLフラスコに入れ、 2価の Mnィ オンの濃度が lOppmとなるように塩ィ匕マンガン水溶液をカ卩え、さらに乾燥菌体 0. 01 gに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、 30°Cで 24時間攪拌して加水分解反応 を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液を下表 6の H PLC条件 Bで分析したところ、生成物である 2—メチルシスティンは認められなかった 表 6. HPLC条件 B
カラム: LiChrosorb 100 RP— 18 (関東ィ匕学 (株)社製）
カラム温度： 40°C
溶離液： 50mM HCIO水溶液
4
流速： 0. 5mL/ mm
検出: RI
試料: 0. 1%水溶液を5 注入
[0042] 比較例 2
野 』微 ^ (菌体5 用いた 2—メチルシスティンアミドラセミ混合物の不吝加 7k 比較例 1の培地組成で培養した 10Lの培養液力も遠心分離によりキサントパクター フラバス (X. flavus)の乾燥菌体 5gに相当する生菌体を得た。 2—メチルシスティ ンアミド塩酸塩のラセミ混合物 10. 0g (58. 6mmol)を 50mMリン酸緩衝液（pH7. 0 ) 300mLに溶力した後、 500mLフラスコに入れ、 2価の Mnイオンの濃度が lOppm となるように塩ィ匕マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体 5gに相当する生菌体を加え て、窒素気流下、 30°Cで 24時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液 力も遠心分離によって菌体を除去し、上清液を HPLC条件 Bで分析したところ、 2—メ チルシスティンが 28. 2mmol生成していることが確認された。さらに HPLC条件 Aで 分析したところ L体アミノ酸の光学純度が 98%e. e.以上であった。
[0043] 比較例 3
野牛.卑』微生物を用いた 2—メチルシスティンアミドラセミ混合物の不吝加水分解〜塩 化マンガン非添加
比較例 2にお ヽて、塩ィ匕マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を 行った。 30°Cで 24時間反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を 除去し、上清液を HPLC条件 Bで分析したところ、 2—メチルシスティンが 13. 9mmo 1生成して ヽることが確認された。さらに HPLC条件 Aで分析したところ L体アミノ酸の 光学純度が 98%e. e.以上であった。
[0044] 実施例 9
形皙転椽体を用いた糠々のアミノ酸アミドのラセミ化合物の不吝加水分解
実施例 7と同様に培養した形質転換株 PMCA1ZJM109の培養液を用いて、種々 のアミノ酸アミドのラセミ混合物を基質として酵素反応を行った。基質化合物を 50m Mリン酸緩衝液 (pH7. 0)に溶解し、基質濃度を 0. 1%に調製し、菌体を添加して 3 0°Cで酵素反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、立体 選択性と反応率 (反応率 =反応後のアミノ酸 mol量 Z (反応後のアミノ酸アミド mol量 +反応後のアミノ酸 mol量) X 100)を HPLC条件 A及び HPLC条件 Bによって分析 した。結果を表 7に示す。何れの反応も、加水分解の選択性は L体選択的であり、生 じた L体のアミノ酸の光学純度は、何れも 98%e. e.以上であった。
[0045] [表 1]
表 7 .—各種ァミノ酸アミ ドでの反応結果
基質 基質重量/乾燥菌体重量 反応時間 反応率 バリンアミ ド 0. 01 24hr 44. 3%
2-アミノ酴酸アミ ド 0. 1 5hr 49. 2% t -口イシンアミ ド 0. 1 24hr 44. 4% ァリシンアミ ドエチレンァセタール 0. 01 24hr 44. 3% フエニルダリシンアミ ド 0. 01 5hr 48. 8%
P-クロ口フエ二ノレグリシンアミ ド 0. 01 5hr 49. 6% フエ-ルァラニンァミ ド 0. 01 5hr 47. 8% ぺニシラミンァミ ド 0. 01 5hr 44. 9%
5, 5-ジメチルチアゾリジン- 4-カルボン酸ァミ ド 0. 1 24hr 47. 0% 産業上の利用の可能性
[0046] 本発明により、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として広範な活用が期 待され、産業上、非常に有用な化合物である光学活性なアミノ酸、特に光学活性な 2 —アルキルシスティンを製造する好適な方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 8に示されるアミノ酸番号 1〜355で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸 配列から 1個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を 有する、 L体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
[2] 請求項 1記載の酵素の酵素タンパク質をコードする DNA。
[3] 配列番号 7に示される塩基配列の内の塩基番号 868〜1932で表される塩基配列、 又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有する、 請求項 2記載の DNA。
[4] 請求項 2又は 3記載の DNAが導入された組換え微生物。
[5] 組換え微生物がェシエリシァ コリ（Escherichia coli)である、請求項 4記載の組換 え微生物。
[6] 請求項 1記載の酵素を L体のアミノ酸アミドに作用させ L体のアミノ酸に変換する、 L 体のアミノ酸の製造方法。
[7] L体のアミノ酸アミドが式 1に示す化合物である、請求項 6記載の製造方法。
[化 1]
Figure imgf000022_0001
ひ）
(式 1中の Rは水素、低級アルキル基、置換低級アルキル基、フエ-ル基、置換フエ
1
ニル基、複素環基、置換複素環基、又は R
1が結合している炭素原子及び該炭素原 子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成し得る基であり、 Rは
2 水素、又は炭素数 1〜4の低級アルキル基を示す。ただし、 Rと Rが同時に水素であ
1 2
る場合は除く）
[8] L体のアミノ酸アミドが式 2に示すィ匕合物である、請求項 6記載の製造方法。
[化 2]
Figure imgf000023_0001
(式 2中の Rは炭素数 1〜4の低級アルキル基を示す。 ) 2中の Rカ チル基である、請求項 8記載の製造方法。
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