JP4650421B2 - L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするdna - Google Patents
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Description
一方、L体のアミノ酸アミドに作用する例としては、例えば、特許文献5には、シュードモナス アゾトフォルマンス由来のL体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素とそれをコードするDNAが開示されている。しかしながら、この酵素はL−プロリンアミドに対する活性は高いが、その他のL体のアミノ酸アミドに対する活性は低い。
(1)配列番号8に示されるアミノ酸番号1〜355で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列から1個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する、L体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
(2)(1)記載の酵素の酵素タンパク質をコードするDNA。
(3)配列番号7に示される塩基配列の内の塩基番号868〜1932で表される塩基配列、又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、(2)記載のDNA。
(4)(2)又は(3)記載のDNAが導入された組換え微生物。
(5)組換え微生物がエシェリシア コリ(Escherichia coli)である、(4)記載の組換え微生物。
(6)(1)記載の酵素をL体のアミノ酸アミドに作用させL体のアミノ酸に変換する、L体のアミノ酸の製造方法。
(7)L体のアミノ酸アミドが式1に示す化合物である、(6)記載の製造方法。
R2は水素、又は炭素数1〜4の低級アルキル基である。
なお、R1とR2が同時に水素である場合は化合物(1)からは除かれる。
細胞形態 桿菌
大きさ (0.5−0.6×2.0μm)
多形態 あり
運動性 なし
胞子の有無 なし
グラム染色 −
コロニー形態 (栄養寒天、30℃、24時間)
円形
全縁滑らか
凸状
光沢あり
クリーム色
生育温度
37℃ +
40℃ −
カタラーゼ +
オキシダーゼ +
酸/ガス生産(グルコース) −/−
O/Fテスト(グルコース) −/−
硝酸塩還元 +
インドール生産 −
ブドウ糖 酸性化 −
アルギニンジヒドロラーゼ −
ウレアーゼ +
エスクリン加水分解 −
ゼラチン加水分解 −
β−ガラクトシダーゼ −
チトクロームオキシダーゼ +
資化性
ブドウ糖 −
L−アラビノース −
D−マンノース −
D−マンニトール −
N−アセチル−D−グルコサミン −
マルトース −
グルコン酸カリウム +
n−カプリン酸 −
アジピン酸 −
dl−リンゴ酸 +
クエン酸ナトリウム +
酢酸フェニル −
嫌気的生育性 +
得られたL体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子のDNA塩基配列を元に、プライマーを設計する。キサントバクター フラバス(X.flavus)より抽出した染色体DNAを鋳型としてPCRでDNAを増幅し、プラスミドベクター(pUC19)と結合する。これをpMCA1と命名する。pMCA1をE.coli(JM109)に形質転換し、L体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子を保有する組換え菌をpMCA1/JM109と命名する。
また、キサントバクター フラバスのその他の株、又はキサントバクター フラバス以外の微生物の染色体から、本発明のDNAを取得することもできる。例えば、配列番号7の塩基配列に基づいて設計されたプローブを用い、ハイブリダイゼーション反応により、上記微生物由来の前記酵素をコードするDNAをその微生物の染色体DNAから単離することもできる。
実施例1
アミノ酸アミド不斉加水分解酵素の単離
キサントバクター フラバス(Xanthobacter flavus)NR303株を、下表2の組成を有する培地3Lに接種し、30℃で170時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。菌体湿重量240gを超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
表2.培地組成
(NH4)2SO4 3g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 3g
NaHCO3 0.3g
MgSO4・7H2O 0.2g
2% CaCl2 1g
Yeast extract 0.2g
ビタミン混液 1g
尿素 1g
グリセリン 10g
微量ミネラル 3.5g
1L(pH7.0)
これに30%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して沈殿を除去した後、上清液に60%飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加した。生成した沈殿を遠心分離で集め、100mMリン酸カリウム緩衝液に溶解し、10mMリン酸カリウム緩衝液で透析した。これを10mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化したDEAE−Toyopearl樹脂(東ソー(株)社製)に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、そのアミノ酸アミド不斉加水分解活性を有する画分を順次硫酸アンモニウムを用いたButyl−Toyopearlカラム(東ソー(株)社製)、Gigapiteカラム(生化学工業(株)社製)を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。得られた精製酵素をSDS−PAGEにより分離したところ単一バンドであり、分子量は40000であった。
N末端アミノ酸配列の解析
実施例1により精製したポリペプチドのN末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサー HP G1005A Protein Sequencing System (ヒューレットパッカード社製)を用いて分析した。このアミノ酸配列は配列番号1で示される。
本発明DNA断片の取得
キサントバクター フラバス(X.flavus)を上記表1の培地5.0mLに接種し、30℃で48時間培養した。遠心分離により微生物菌体を取得し、フェノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体DNAを取得した。実施例2で判明したアミノ酸配列から、配列番号2(AF)、3(BF)、4(AR)、5(BR)のプライマーを設計し、耐熱型DNAポリメラーゼ存在下これら4種のプライマーのうち、任意の2種を添加してPCRを行った。本PCRの産物をアガロースゲル電気泳動したところ配列番号3のプライマーBFと配列番号4のARを用いた反応液に87bpのDNAが特異的に増幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのDNAの一部をpT7BlueT−Vector(Novagen社製)にクローニングしてLi−CorDNA Sequencer model 4000Lを用いて(操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った)塩基配列を決定した(配列番号6)。上記DegenerPCRにより増幅した87bpの精製DNAの残りをRediprimeTMII Random Prime Labelling System(アマシャムファルマシアバイオテク(株)社製)により標識した。
キサントバクター フラバス(X.flavus)染色体DNAライブラリーのサザンハイブリダイゼーション
実施例3記載の方法によりキサントバクター フラバス(X.flavus)の染色体DNAを取得した。本DNAをEcoRIで消化した後。実施例3で作製した87bpの標識DNAをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。手法はモレキュラークローニング第3版に従った。その結果、約5kbのDNAバンドが検出され、本DNAをアガロースゲルから抽出精製し、pBluescriptII SK(−)(Stratagene社製)のEcoRI部位に挿入し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりE.coli(JM109)に導入した。
コロニーハイブリダイゼーション及びサブクローニング
実施例4において得られたE.coli(JM109)の形質転換株を50μg/mLアンピシリンを含むLB寒天培地(1Lの水溶液中にBacto Trypton 10.0g、 Bacto Yeast Extract 5.0g、塩化ナトリウム 10.0g、寒天15.0g を含む)に塗布し、37℃で一晩培養した。生じたコロニーをニトロセルロース膜CELLULOSE NITRATE(アドバンテック東洋(株)社製)にリフティングし、実施例3で取得したDNAプローブを用い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、陽性のクローンからプラスミドを取得し、Li−Cor DNA Sequencer model 4000Lを用いて、塩基配列を決定した(配列番号7)。
発現用プラスミドの構築及びE.coliの形質転換
キサントバクター フラバス(X.flavus)より抽出した染色体DNAを鋳型として、プライマーMCA−FとMCA−R(配列番号9及び配列番号10)を用いてPCRを行った。得られたPCR反応生成物を精製し、制限酵素HindIII及びXbaIで消化し、同様の酵素で消化したpUC19(宝酒造(株)社製)に連結してpMCA1を作製後、E.coli(JM109)に塩化カルシウム法で形質転換した。50μg/mLアンピシリンを含むLB寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株pMCA1/JM109を得た。
形質転換体を用いた2−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン添加
下表3の組成の培地を調製し、この培地200mLを1Lの三角フラスコに入れ、滅菌後、アンピシリン50μg/mLを添加してから形質転換株pMCA1/JM109を接種し、37℃で15時間振とう培養を行った。次いで、培養液から遠心分離により乾燥菌体0.1gに相当する生菌体を得た。
表3.培地組成
pH 7.0
トリプトン 1%
酵母エキス 0.5%
塩化ナトリウム 0.5%
2−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物10.0g(58.6mmol)を50mMリン酸緩衝液(pH7.0)300mLに溶かした後、500mLフラスコに入れ、2価のMnイオンの濃度が10ppmとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体0.01gに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、30℃で24時間攪拌して加水分解反応を行った。
反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去して上清を得た。この上清液に活性炭1gを加えて1時間攪拌した後、活性炭を濾別してからエバポレーターで減圧にて水を留去した。ここに2−プロパノール20mLを加えて過熱攪拌後、5℃に冷却して析出した結晶を濾取した。濾取した結晶をエタノールより再結晶して2−メチル−L−システイン3.04g(22.5mmol)を得た。反応に仕込んだラセミ混合物中の2−メチル−L−システインアミドからの単離収率は76.8mol%、2−メチルシステインアミドのラセミ混合物からの単離収率は38.4%であった。また、この固体を下表4のHPLC条件Aで分析した結果、光学純度は98%e.e.以上であった。
表4.HPLC条件A
カラム:Sumichiral OA−5000((株)住化分析センター社製)
カラム温度:60℃
溶離液:3mM CuSO4水溶液
流速:1.0mL/min
検出:CD−2095plus(Jasco)
試料:0.1%水溶液をホルマリン処理後、50μL注入
形質転換体を用いた2−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン非添加
実施例7において、塩化マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を行った。30℃で24時間反応を行い、実施例7と同様の後処理を施し、1.50g(11.1mmol)の2−メチル−L−システインが得られた。2−メチル−L−システインアミドからの単離収率は37.9mol%、2−メチルシステインアミドからの単離収率は18.9mol%、光学純度は98%e.e.以上であった。
野生型微生物(菌体0.01g)を用いた2−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解
下表5の組成を有する培地を調製し、この培地200mLを1Lの三角フラスコに入れ、滅菌後、キサントバクター フラバス(X.flavus)を接種し、30℃で170時間振とう培養を行った。次いで、培養液から遠心分離により乾燥菌体0.1gに相当する生菌体を得た。
表5.培地組成
(NH4)2SO4 3g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 3g
NaHCO3 0.3g
MgSO4・7H2O 0.2g
2% CaCl2 1g
Yeast extract 0.2g
ビタミン混液 1g
尿素 1g
グリセリン 10g
微量ミネラル 3.5g
1L(pH7.0)
2−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物10.0g(58.6mmol)を50mMリン酸緩衝液(pH7.0)300mLに溶かした後、500mLフラスコに入れ、2価のMnイオンの濃度が10ppmとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体0.01gに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、30℃で24時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液を下表6のHPLC条件Bで分析したところ、生成物である2−メチルシステインは認められなかった。
表6.HPLC条件B
カラム:LiChrosorb 100 RP−18(関東化学(株)社製)
カラム温度:40℃
溶離液:50mM HClO4水溶液
流速:0.5mL/min
検出:RI
試料:0.1%水溶液を5μL注入
野生型微生物(菌体5g)を用いた2−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解
比較例1の培地組成で培養した10Lの培養液から遠心分離によりキサントバクター フラバス(X.flavus)の乾燥菌体5gに相当する生菌体を得た。2−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物10.0g(58.6mmol)を50mMリン酸緩衝液(pH7.0)300mLに溶かした後、500mLフラスコに入れ、2価のMnイオンの濃度が10ppmとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体5gに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、30℃で24時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液をHPLC条件Bで分析したところ、2−メチルシステインが28.2mmol生成していることが確認された。さらにHPLC条件Aで分析したところL体アミノ酸の光学純度が98%e.e.以上であった。
野生型微生物を用いた2−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン非添加
比較例2において、塩化マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を行った。30℃で24時間反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液をHPLC条件Bで分析したところ、2−メチルシステインが13.9mmol生成していることが確認された。さらにHPLC条件Aで分析したところL体アミノ酸の光学純度が98%e.e.以上であった。
形質転換体を用いた種々のアミノ酸アミドのラセミ化合物の不斉加水分解
実施例7と同様に培養した形質転換株pMCA1/JM109の培養液を用いて、種々のアミノ酸アミドのラセミ混合物を基質として酵素反応を行った。基質化合物を50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、基質濃度を0.1%に調製し、菌体を添加して30℃で酵素反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、立体選択性と反応率(反応率=反応後のアミノ酸mol量/(反応後のアミノ酸アミドmol量+反応後のアミノ酸mol量)×100)をHPLC条件A及びHPLC条件Bによって分析した。結果を表7に示す。何れの反応も、加水分解の選択性はL体選択的であり、生じたL体のアミノ酸の光学純度は、何れも98%e.e.以上であった。
Claims (9)
- 配列番号8に示されるアミノ酸番号1〜355で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列から1個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する、L体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
- 請求項1記載の酵素の酵素タンパク質をコードするDNA。
- 配列番号7に示される塩基配列の内の塩基番号868〜1932で表される塩基配列、又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、請求項2記載のDNA。
- 請求項2又は3記載のDNAが導入された組換え微生物。
- 組換え微生物がエシェリシア コリ(Escherichia coli)である、請求項4記載の組換え微生物。
- 請求項1記載の酵素をL体のアミノ酸アミドに作用させL体のアミノ酸に変換する、L体のアミノ酸の製造方法。
- 式2中のRがメチル基である、請求項8記載の製造方法。
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