JP2003250558A - 新規アミダーゼ及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用
な化合物である光学活性カルボン酸類またはアミド類の
製造方法を提供すること。 【解決手段】 シュードモナス・アゾトフォルマンスＩ
ＡＭ１６０３由来の新規立体選択的アミド加水分解酵素
とそれをコードするＤＮＡを提供する。このアミド加水
分解酵素を用いてアミドを立体選択的に加水分解し、キ
ラルカルボン酸またはアミド（Ｎ−アルキルアミドを含
む）、特にキラル含窒素複素間化合物カルボン酸または
そのアミド（Ｎ−アルキルアミドを含む）を生産するこ
とができる。本発明によるアミド加水分解酵素は、活性
と立体選択性に優れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な立体選択的アミダ
ーゼ活性を有するポリペプチド、そのペプチドをコード
するＤＮＡ、それらのＤＮＡを組み込んだ組み換えベク
ター、並びに上記ＤＮＡ又は組み換えベクターを保有す
る組み換え体生物に関する。さらに本発明は、当該ポリ
ペプチドをカルボン酸アミド類に作用させ、医・農薬中
間原料として有用なキラルカルボン酸類及び／又はキラ
ルカルボン酸アミド類を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】ラセミ体の含窒素複素環含有カルボキサミ
ド類を生物工学的に加水分解し、医・農薬中間体として
有用なキラルなカルボン酸類及び／又はカルボキサミド
類を製造する方法としては以下の手法が知られている。

【０００３】（Ｒ）−含窒素複素環含有カルボン酸アミ
ド類を選択的に加水分解する方法としては、特開平１０
−２７６７９４号公報には、シュードモナス アゾトフ
ォルマンス ＩＡＭ１６０３株又はその処理物を、特開
平１０−３２７８９０号公報には、シュードモナス エ
スピー ＭＣＩ３４３３株又はシュードモナス エスピ
ー ＭＣＩ３４３４株あるいはそれらの処理物をラセミ
体Ｎ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミド
に作用させ、高い光学純度の（Ｒ）−ピペラジン−２−
カルボン酸及び／又は（Ｓ）−Ｎ−ピペラジン−２−カ
ルボン酸アミドを取得する方法が知られている。

【０００４】一方、（Ｓ）−含窒素複素環含有カルボン
酸アミド類を選択的に加水分解する手法としては、特開
平８−５６６５２号公報には、シュードモナス プチダ
種、シュードモナス フルオレッセンス種、クレブシエ
ラ テリゲナ種又はクレブシエラ ニューモニア種に属
する微生物の菌体あるいはその処理物をラセミ体のプロ
リンアミド、ピペラジン−２−カルボキサミド又はピペ
コール酸アミドに作用させ、高い光学純度の（Ｓ）−カ
ルボン酸類及び／又は（Ｒ）−カルボン酸アミド類を取
得する方法が記載されており、特開平１０−１２７２８
０号公報には、マイコプラナ属細菌の菌体又はその処理
物をラセミ体のピペリジン−２−カルボキサミド又はＮ
−アルキルピペリジン−２−カルボキサミドに作用さ
せ、高い光学純度の（Ｓ）−ピペリジン−２−カルボン
酸及び／又は（Ｒ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カ
ルボキサミドを取得する方法が記載されており、特開平
１０−２７６７９４号公報には、ロイコバクター属、リ
ゾビウム属、またはミコバクテリウム属細菌の菌体、ま
たはその処理物をＮ−ｔｅｒｔブチルピペラジン−２−
カルボキサミドに作用させ、高い光学純度の（Ｓ）−ピ
ペラジン−２−カルボン酸、及び／又は（Ｒ）−Ｎ−ｔ
ｅｒｔブチルピペラジン−２−カルボキサミドを取得す
る方法が記載されている。

【０００５】しかしながら、これらの手法では菌体又は
その処理物を加水分解触媒として用いているが、目的の
反応を触媒する酵素の含量が少ない又は酵素自体が不安
定性であり、十分に反応を触媒するには多量の菌体を用
意する必要があるため、経済的に有利な手法ではなかっ
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、含窒
素複素環含有カルボン酸アミド類を立体選択的に加水分
解する能力を有する新規アミダーゼ及びそれをコードす
るＤＮＡを取得すること、並びに該アミダーゼを用いて
光学純度の高い含窒素複素環含有カルボン酸類及び／又
はそのアミド類を製造する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、（Ｒ）−Ｎ−アル
キルピペラジン−２−カルボキサミドを選択的に加水分
解する立体特異的アミダーゼの活性を有することで知ら
れているシュードモナス アゾトフォルマンスＩＡＭ１
６０３株から（Ｓ）−Ｎ−アルキルピペラジン−２−カ
ルボキサミドを選択的に加水分解する酵素を単離し、そ
れをコードするＤＮＡを取得した。このＤＮＡを用いて
製造される立体選択的アミダーゼに富んだ組み換え体生
物又は高濃度アミダーゼ溶液により、より高い生産性で
より高い立体選択的なカルボン酸アミド類の加水分解反
応が進行すること見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明によれば、以下の理化学的性
質を有する立体選択的アミダーゼが提供される。 （１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であ
り、ゲル濾過で測定した場合に３２０００； （２）サブユニット構成：モノマー （３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミ
ダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近 （４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で
反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付
近 （５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である （６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害す
る化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ²⁺、Ａｇ⁺、Ｃｄ
²⁺、Ｈｇ²⁺ （７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添
加することにより酵素活性が促進される。

【０００９】本発明の別の側面によれば、下記の何れか
のポリペプチドが提供される。 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド； （２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有す
るポリペプチド；又は （３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、立体選択的アミ
ダーゼ活性を有するポリペプチド；

【００１０】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかの
ＤＮＡが提供される。 （１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ； （２）配列番号２で表される塩基配列において１から複
数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列
を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ；又は （３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、立体選
択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ：

【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明
のＤＮＡまたは組換えベクターを有する形質転換体が提
供される。

【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、下記一
般式（Ｉ）

【化４】 （式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、ア
ルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選
ばれる置換基により置換されていてもよいアルキル基又
はＡが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合して
いるアミノ基と一体となって、含窒素複素環を形成しう
る基であり、Ｒは、水素原子、置換されていても良いア
ルキル基又は置換されていても良いアリール基を示
す。）で表されるカルボン酸アミド類に、本発明のアミ
ダーゼ、ポリペプチド、又は形質転換体を作用させるこ
とにより、（Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解
させた後、下記一般式（ＩＩ）

【化５】 （式中、Ａは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−
体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）

【化６】 （式中、Ａ及びＲは前記と同義である。）で表される
（Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを含
む、光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製
造方法が提供される。

【００１３】好ましくは、Ａは、Ａが結合している炭素
原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体とな
って含窒素複素環を形成しうる基である。好ましくは、
エチレンジアミン４酢酸の共存下で反応を行う。

【００１４】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のＤＮＡと、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を
示す１種以上のＤＮＡとをランダムリコンビネーション
することを特徴とする立体選択的アミダーゼ活性を有す
る新規なポリペプチドの製造方法が提供される。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を詳
細に説明する。（Ｉ）本発明のアミダーゼ及びポリペプチド 本発明は、以下の理化学的性質を有する立体選択的アミ
ダーゼに関するものである。 （１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であ
り、ゲル濾過で測定した場合に３２０００； （２）サブユニット構成：モノマー （３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミ
ダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近 （４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で
反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付
近 （５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である （６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害す
る化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ²⁺、Ａｇ⁺、Ｃｄ
²⁺、Ｈｇ²⁺ （７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添
加することにより酵素活性が促進され、好ましくは１．
１倍以上、より好ましくは１．５倍以上促進される。

【００１６】本発明のアミダーゼの具体例としては、配
列番号１記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
そのホモログであって立体選択的アミダーゼ活性を有す
るポリペプチド、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列
又はそのホモログのアミノ酸配列を分子内に含むポリペ
プチドである。

【００１７】本発明のポリペプチドのホモログとは、配
列番号1で表されるアミノ酸配列において１から複数個
（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、
さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７
個、特に好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、
置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、立体選
択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド；又は配列番
号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは
８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好まし
くは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を
有するアミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性
を有するポリペプチド；が挙げられる。

【００１８】また、「配列番号１のアミノ酸配列を分子
内に含むポリペプチド」とは、該ポリペプチドのＮ末端
やＣ末端に蛋白質相互作用、リガンド結合機能又は別の
特殊な機能を有するポリペプチドを結合させた融合ポリ
ペプチドを意味する。

【００１９】ちなみに上記ポリペプチドのホモロジー検
索は、例えば、ＦＡＳＴＡプログラムやＢＬＡＳＴプロ
グラムなどを用いて行うことができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩ
Ｒ）などのアミノ酸配列データベースを対象としてＢＬ
ＡＳＴプログラムを用いて配列番号１に記載のアミノ酸
配のホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の
中で高いアミノ酸アイデンティティーを示したのは、シ
ノリゾビウム メリオティ （Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏ
ｌｉｎｅ ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ（６６％）、及びメソリゾビウム ロティ（Ｍｅｓ
ｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）のプロリンイミノペ
プチダーゼ（５８％）であった。

【００２０】融合ポリペプチドの例としては、例えば、
通常の分子遺伝学的手法を用いて、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．、４、７５９−７６７、（１９９０）におい
てＧｉｌｂｅｒｔ Ｈ．Ｊ．らが報告している又は米国
特許５４９６９３４号公報においてＳｈｏｓｅｙｏｖ
Ｏ．らが報告しているようなセルロース結合機能を有す
るアミノ酸配列を本願ポリペプチドのＮ末端やＣ末端に
付加したもの、ニッケル結合機能を有するヒスチジンの
ヘキサマーを結合させて該ポリペプチドに特異的結合能
を与えたもの、またＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅ
ｎｇ．、６８、２１１−２１７、（２０００）において
Ｋｉｍ Ｇ．Ｊ．らが報告しているような手法により本
発明のポリペプチドを他の機能を有するポリペプチドと
融合させたもの等が挙げられる。

【００２１】本発明のポリペプチドは立体選択的アミダ
ーゼ活性を有するものであり、ここで、立体選択的アミ
ダーゼ活性とは、化合物中のアミド結合を立体選択的に
加水分解して光学活性なカルボン酸及び／又はカルボン
酸アミドを生産する活性をいう。

【００２２】該ポリペプチドは、本発明によりそのアミ
ノ酸配列が明らかになったので、後述するように配列番
号１のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配
列を基にして作成したＤＮＡプローブを用いることによ
り、立体選択的アミダーゼ活性を有する任意の微生物か
ら立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを単離する、あるいはＤＮＡ合成装置を
用いて立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡを合成することにより、それを用い
て分子遺伝学的手法により多量の該ポリペプチドを製造
し、そこから通常の方法により単離することができる。
また、上記ＤＮＡを有する微生物、例えばシュードモナ
ス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３株の培養菌体
より精製することもできる。

【００２３】尚、シュードモナス・アゾトフォルマンス
ＩＡＭ１６０３株は公知の微生物であり、東京大学分子
細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションより入
手可能である。

【００２４】微生物の培養菌体から本願ポリペプチドを
単離する方法としては、一般的な蛋白質の精製方法が応
用できる。例えば、上記微生物を一般的な微生物用栄養
培地、好ましくは窒素源としてニュートリエントブロス
及び炭素源としてリンゴ酸を含む培地で培養することで
十分に増殖させた後に遠心分離により回収し、超音波破
砕処理やフレンチプレス処理により無細胞抽出液とす
る。この無細胞抽出液から、遠心分離、カラムクロマト
グラフィー、電気泳動、などの操作により蛋白質の物理
化学的な性質の差異を利用して求めるポリペプチドを単
離することができる。より推奨される手法としては、無
細胞抽出液を調製し、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動
からのゲルの切り出し、等を用いて本願ポリペプチドを
精製できる。別法として、後述するように配列番号２記
載のＤＮＡを適当な発現プロモーターとリボゾーム結合
配列の下流に保有するベクターを組み込んだ組み換え体
生物、好ましくはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ；以下、Ｅ．ｃｏｌｉ）、の培養菌
体から、超音波破砕処理及び遠心分離により無細胞抽出
液を調製し、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ
ー、及び疎水クロマトグラフィーを用いて本願ポリペプ
チドを単離する。

【００２５】以下に、シュードモナス・アゾトフォルマ
ンスＩＡＭ１６０３株より単離された、配列番号１に記
載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの物理学的、及
び酵素学的性質を示す。 １．分子量： ３４０００（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅと略記する。）、３２０００（ゲル濾過） ２．サブユニット構成： モノマー ３．アミダーゼ反応至適ｐＨ： ｐＨ９ ４．アミダーゼ反応至適温度： ４５℃ ５．耐熱性：４５℃以下で安定である。 ６．本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害する
化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ²⁺、Ａｇ⁺、Ｃ
ｄ²⁺、Ｈｇ²⁺。 ７．ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添加
することにより酵素活性が約１．８倍促進される。

【００２６】さらに、本発明のポリペプチドは、Fmoc法
(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−
ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても
製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced
Chem Tech社製)、パーキンェルマージャバン(米国Perki
n Elmer社製)、アマシャムファルマシアバイオテク(Ame
rsham Pharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein T
echnology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell
-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国Per
Septive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し
て化学合成することもできる。

【００２７】（II）本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡとは上記ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ又はそのホモログである。上記ポリペプチドをコード
するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載される
アミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、その具体
例としては配列番号２で表される塩基配列を含むものが
挙げられる。

【００２８】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
のホモログとは、配列番号２で表される塩基配列におい
て１から複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加され
た塩基配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は配列番号２で表
される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、立体選択的アミダーゼ活性を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ：が挙げられ
る。

【００２９】上記ＤＮＡホモログは、配列番号２記載の
ＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４
４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ２ｎｄＥｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９）、ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９
１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付
加変異を導入することにより当業者であれば得ることが
可能である。

【００３０】本明細書において「ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション
法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザ
ンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることに
より得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロ
ニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断
片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍ
のＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行
った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成
は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナト
リウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する
ことにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。

【００３１】ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．（ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋＪ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｓｅｌ Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ２００１、以後 "モルキュ
ラークローニング第３版" と略す）等に記載されている
方法に準じて行うことができる。

【００３２】該ＤＮＡホモログとしては、配列番号２に
記載の塩基配列を有するＤＮＡと６０％以上、好ましく
は７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好まし
くは９０％以上の相同性を有するものが挙げられる。

【００３３】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、例えば、以下のような方法によって取得することが
できる。まず、立体選択的アミダーゼ活性を有する微生
物から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法により
プラスミドライブラリー又はファージライブラリーを作
製する。次に、該ポリペプチドの部分アミノ酸配列の情
報を用いて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの部分
断片を取得し、常法によりＤＮＡプローブを作製する。
このＤＮＡプローブで上述染色体ＤＮＡライブラリーか
ら本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを特定し、
適当なＤＮＡをサブクローニングすることにより該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを取得できる。

【００３４】より具体的には、以下の方法により本発明
に係るＤＮＡを取得できる。 １．シュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６
０３から本願のアミダーゼを精製し、該アミダーゼのＮ
末端及び内部アミノ酸配列の情報を基に、シュードモナ
ス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６０３の染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ（ポリメ
ラーゼチェインリアクションの略）を行い、求める立体
選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡの部分断片を得る。これを放射性同位元素を含
む核酸により標識し、ＤＮＡプローブを作製する。 ２．シュードモナス アゾトフォルマンス ＩＡＭ１６
０３から染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例え
ばＦｂａＩなど）で部分分解する。 ３．２で得られたＤＮＡ断片と、１で作製したＤＮＡプ
ローブを用い、サザンハイブリダイゼーションを行う。 ４．３で特定されたＤＮＡを抽出精製し、適当なプラス
ミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。 ５．１で作製したＤＮＡプローブを用いてコロニーハイ
ブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ配列を含むク
ローンのプラスミドを取得する。 ６．５で得られたプラスミドを用いて、ベクターに組み
込まれたシュードモナスアゾトフォルマンス ＩＡＭ１
６０３由来のＤＮＡの塩基配列を決定する。 ７．決定されたＤＮＡ塩基配列中に立体選択的アミダー
ゼのアミノ酸配列の読み取り枠を見いだし、上記工程で
得られたＤＮＡ断片中に、アミダーゼの全コード領域が
存在することを確認する。

【００３５】上記工程中でＤＮＡ、及び組み換え体宿主
としてのＥ．ｃｏｌｉの取り扱いに必要な一般的な操作
は、当業者間で行われているものであり、例えばモルキ
ュラークローニング第３版に従えば容易に実施できる。
使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることが
でき、特に断らない限り製品で指定されている使用条件
に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。
特に、上記１．において該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例
えばＳａｉｔｏら［Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ａｃｔａ，７２，６１９−６２９（１９６３）］
の方法に準じて行うことができる。また、ＤＮＡの標識
化は従来から汎用されている放射性同位元素あるいはジ
ゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン等の非放射性
化合物のいずれも使用可能であり、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ
^TMＩＩ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｌａｂｅｌｌｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク
（株）社製）やＡｌｋＰｈｏｓ^TM Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａ
ｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社
製）等を用いれば容易に実施できる。また、上記４．に
おけるベクターとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、等を使用
することができる。さらに、上記６．におけるＤＮＡ塩
基配列の決定もモルキュラークローニング第３版等に記
された公知の方法を用いることができる。例えば、Ｌｉ
−ｃｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ
４０００Ｌ等の機器を付属のマニュアルインストラクシ
ョンに従って使用すれば容易に実施できる。

【００３６】（III）本発明の組み換えベクター及び形
質転換体 上記の（II）で取得された本発明のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することによ
り、立体選択的アミダーゼ発現ベクターが提供される。
また、この発現ベクターで形質転換した組み換え体生物
を培養することにより、立体選択的アミダーゼを取得す
ることができる。

【００３７】本発明の立体選択的アミダーゼを発現させ
るための形質転換の対象となる宿主細胞としては、宿主
自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されるこ
とはなく、宿主ベクター系が確立されている細菌、放線
菌、酵母、カビなどの微生物、昆虫細胞、植物細胞、動
物細胞が好適に利用できる。具体的には以下に示すよう
な微生物、及び高等生物細胞を挙げることができる。

【００３８】エシェリヒア属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キ
ャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、蚕、菜種、大豆など。

【００３９】上記で宿主細胞として好ましくは、エシェ
リヒア属、バチルス属、シュードモナス属、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属、及びロドコッカス
属微生物であり、特に好ましくは、エシェリヒア属、シ
ュードモナス属、ブレビバクテリウム属及びコリネバク
テリウム属微生物である。

【００４０】本発明のポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで
製造するには、宿主生物中において安定に存在するベク
ター中に本発明のＤＮＡを導入するか、もしくは、直接
宿主ゲノム中に相同組み換え等の手法により本発明のＤ
ＮＡを導入して組み換えＤＮＡ分子を作成し、その遺伝
情報を転写・翻訳させる必要がある。

【００４１】このとき、プロモーター及びリボゾーム結
合部位（ＲＢＳ）を本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、
より好ましくは転写終結因子を３’側下流にそれぞれ組
み込むことが好ましい。このプロモーター、ＲＢＳ及び
転写終結因子としては、宿主として利用する細胞中にお
いて機能することが知られているプロモーター、ＲＢＳ
及び転写終結因子であれば特に限定されず、これら各種
生物において利用可能なベクター、プロモーター、ＲＢ
Ｓ、及び転写終結因子に関しては、例えばモルキュラー
クローニング第３版や「微生物学基礎講座８遺伝子工学
・共立出版」などに詳述されている。

【００４２】具体的には、例えばエシェリヒア属、特に
Ｅ．ｃｏｌｉについては、べクターとしてｐＢＲ、ｐＵ
Ｃ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ(β−ガラクトシダ
ーゼ)、ｔｒｐ(トリプトファンオペロン)、ｔａｃ、 ｔ
ｒｃ、ｌｐｐ、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプ
ロモーターなどが挙げられる。また、転写終結因子とし
ては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、リボゾーマルＲＮ
Ａ由来、及びｌｐｐ由来などが挙げられる。このように
Ｅ．ｃｏｌｉをポリペプチド合成系として用いる場合に
は、目的ポリペプチドは本発明のＤＮＡを含むベクター
の組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉの生育に伴い構成的に、ある
いはイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下Ｉ
ＰＴＧ）などのポリペプチド合成誘導剤の添加により誘
導的に製造される。

【００４３】上記記載の方法によりｉｎ ｖｉｖｏで立
体選択的アミダーゼを製造できるほか、Ｅ．ｃｏｌｉや
小麦胚芽の無細胞蛋白質合成系を用いてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでも該アミダーゼを製造することができる。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉではＫｉｇａｗａら［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ、４４２、１５−１９（１９９９）］、小麦胚芽
を用いた該合成系についてはＭａｄｉｎら［Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、５５９−
５６４（２０００）］の方法に準じて行うことができ
る。

【００４４】本発明のＤＮＡを有する形質転換体を培養
し、培養物から公知の方法で本発明のアミダーゼを単離
精製することができる。本発明のＤＮＡを有する形質転
換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の
方法に従って行うことができる。本発明の形質転換体が
大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、
これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る
炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培
養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の
いずれでもよい。培養は、振盪培養または深部通気撹拌
培養などの好気的条件下で行うことが好ましく、培養温
度は通常15〜40℃であり、培養時間は、通常５時間〜７
日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持す
る。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行
う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサ
イクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００４５】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているRP
M11640培地〔The Journal of the American Medical As
sociation,199,519(1967)〕、EagleのMEM培地〔Scienc
e, 122, 501(1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396(19
59)〕、199培地〔Proceeding of the Society for theB
iological Medicine, 73, 1(1950)〕またはこれら培地
に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養
は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ₂存在下
等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じ
て、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添
加してもよい。

【００４６】形質転換体の培養物から、本発明のアミダ
ーゼを単離精製するには、前述のように、通常のタンパ
ク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明の
アミダーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、
培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に
懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウ
リンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕
し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離す
ることにより得られた上清から、通常のタンパク質の単
離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱
塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(D
EAE)セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等レ
ジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Se
pharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イ
オン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、
フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマ
トグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニ
ティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング
法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独ある
いは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【００４７】また、本発明のアミダーゼが細胞内に不溶
体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕
し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、
通常の方法により該アミダーゼを回収後、該アミダーゼ
の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液
を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変
性剤の濃度がアミダーゼが変性しない程度に希薄な溶液
に希釈、あるいは透析し、該アミダーゼを正常な立体構
造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製
標品を得ることができる。

【００４８】（IV）本発明のアミダーゼを用いた光学活
性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製造 また、本発明は、下記一般式（Ｉ）

【化７】 （式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、ア
ルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選
ばれる置換基により置換されていてもよいアルキル基、
又は、Ａが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合
しているアミノ基と一体となって、含窒素複素環を形成
しうる基であり、Ｒは、水素原子、置換されていてもよ
いアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を示
す。）で表されるカルボン酸アミド類に、本発明のアミ
ダーゼ、ポリペプチド又は形質転換体を作用させること
により、（Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解さ
せた後、下記一般式（ＩＩ）

【化８】 （式中、Ａは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−
体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ）

【化９】 （式中、Ａ及びＲは前記と同義である。）で表される
（Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを特徴
とする光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類を
製造する方法にも関する。

【００４９】上記一般式（Ｉ）中、置換基Ａは、水酸
基、アルコキシ基、チオール基、アルキルチオ基、アリ
ール基及びヘテロアリール基から選ばれる置換基により
置換されていてもよいアルキル基、又は、Ａが結合して
いる炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と
一体となって含窒素複素環を形成する基であり、形成さ
れる含窒素複素環基としては、窒素原子以外のヘテロ原
子が含まれていてもよい。

【００５０】上記アルキル基の具体例としては、メチル
基、エチル基、プロピル基、１−メチルプロピル基、ブ
チル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、
ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒ
ドロキシエチル基、チオメトキシメチル基、２−（４−
ヒドロキシフェニル）エチル基、２−（３−インドリ
ル）エチル基等の上述の置換基により置換されていても
よい炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。

【００５１】また、上記含窒素複素環基として好ましく
は５〜７員の含窒素複素環であり、より好ましくは窒素
原子を１又は２個含有し、それ以外のヘテロ原子を含有
しない含窒素複素環基が挙げられる。上記含窒素複素環
基の好ましい具体例としては、ピペリジル基、ピペラジ
ル基、ピラジル基、ピロリジル基が挙げられる。

【００５２】また、上記含窒素複素環基は反応を阻害し
ない限りにおいて置換基を有していてもよく、上記置換
基の具体例としては、ハロゲン原子、アルキル基、アリ
ール基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボン酸基、
アルコキシ基等が挙げられ、このうち好ましくは炭素数
１〜４のアルキル基が挙げられる。

【００５３】上記一般式（Ｉ）中の置換基Ｒとしては、
水素原子、置換されていてもよいアルキル基又は置換さ
れていてもよいアリール基を示す。

【００５４】上記アルキル基は、直鎖、分岐鎖或いは環
状のアルキル基が挙げられ、このうち好ましくは炭素数
１〜６のものであり、上記アリール基としてはフェニル
基又はナフチル基が挙げられる。

【００５５】上記アルキル基又はアリール基の置換基と
しては、上記Ａの含窒素複素環の置換基として記載した
のと同様の基が挙げられる。

【００５６】上記置換されていてもよいアルキル基又は
アリール基として好ましい具体例としては、メチル基、
エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イ
ソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジ
ル基、トリフルオロメチル基、１−ヒドロキシカルボニ
ルエチル基、フェニル基、トリル基、ニトロフェニル基
等が挙げられる。

【００５７】上記Ｒとして好ましくは、水素原子又は置
換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基又は
置換基を有するフェニル基であり、より好ましくは水素
原子又は炭素数１〜４のアルキル基及びｐ−ニトロフェ
ニル基である。

【００５８】この製造方法においては、本発明のポリペ
プチドを蓄積している組み換え体生物、組み換え体生物
処理物、本発明のポリペプチドが蓄積した無細胞蛋白質
合成系反応液及び／又はその処理物が酵素触媒として反
応系に添加される。具体的には、上記組み換え体生物を
培養して得られた細胞そのまま、あるいはトルエン、界
面活性剤などの有機化合物による処理、凍結乾燥処理、
物理的破砕処理など公知の手法にて処理した処理物、上
記無細胞蛋白質合成系の反応液、さらには上記組み換え
体生物処理物、及び無細胞蛋白合成反応液から本願の立
体選択的アミダーゼ活性画分を粗精製画分、又は精製物
として取り出して用いることも可能である。さらには、
このようにして得られた組み換え体生物、組み換え体生
物処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラ
ギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いること
も可能である。以下、「高濃度酵素調製物」という用語
を、上記組み換え体生物、無細胞蛋白質合成系反応物、
それらの処理物、酵素画分、及び固定化物の全ての概念
を包含する言葉として用いる。

【００５９】本反応において、反応原料であるラセミ体
のカルボン酸アミド類は、基質濃度が高すぎると酵素が
基質阻害を受ける可能性もあるため、通常、０．１ｍＭ
−１Ｍの濃度で、より好ましくは１０−１００ｍＭの濃
度で反応液に添加する。これらは、反応開始時に一括し
て添加しても良いが、生成物の蓄積濃度を向上させため
に連続的もしくは間欠的に添加することもできる。

【００６０】本反応は、水性媒体中もしくは該水性媒体
と有機溶媒との混合液中で行われ、上記、水性媒体とし
ては、水、あるいは、リン酸カリウム水溶液、トリス−
塩酸水溶液等の緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒とし
ては、エタノール、プロパノール等のアルコール類；ア
セトン等のケトン類；テトラヒドロフラン等のエーテル
類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；トルエン
等の芳香族炭化水素類；クロロホルム等のハロゲン化炭
化水素類；ｎ−ヘキサン等脂肪族炭化水素類；ジメチル
スルホキシド等の有機化合物が使用できる。

【００６１】反応液のｐＨはアルカリ状態で反応が好適
に進行するが、ｐＨ６．０−９．５であることが好まし
く、ｐＨ７．０−９．５がより好ましい。この条件を満
たすために、反応中、必要に応じて、希薄な酸またはア
ルカリ溶液を随時添加してｐＨを希望の範囲に維持する
こともできる。

【００６２】反応温度は０−５０℃で反応は進行する
が、２５−４５℃で維持することがより好ましい。

【００６３】また、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を反応液に添加することにより、酵素活性を促進す
ることができる。この場合、ＥＤＴＡは０．００１−１
００ｍＭ、より好ましくは０．５−１０ｍＭの濃度で添
加される。反応液は必要に応じ攪拌混合される。

【００６４】上記反応で製造された（Ｓ）体のカルボン
酸及び／又は残存した（Ｒ）体のアミド化合物は、溶媒
抽出、クロマトグラフィー等、通常の分離・精製方法に
より単離することができる。

【００６５】（Ｖ）ランダムリコンビネーションによる
新規ポリペプチドの製造 さらに本発明は、配列番号２に表される塩基配列を有す
るＤＮＡ又はそのＤＮＡホモログと、該ＤＮＡと相同性
が５０％以上のＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでランダムに組換えることにより、アミダーゼ
活性を有する新しい塩基配列のＤＮＡを取得する方法に
関する。

【００６６】ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＤＮＡをランダム
に組み換える方法としては、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．、１７、３３３−３３４（１９９９）〕におい
て、Ｃｈｅｒｒｙ Ｊ．Ｒ．らにより報告された方法が
挙げられる。

【００６７】また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＤＮＡを
ランダムに組み換える方法としては、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１０７４７−１
０７５１（１９９４）において、Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｗ．
Ｐ．Ｃ．らが報告した方法、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．、１６、２５８−２６１（１９９８）において、
Ｚｈａｏ Ｈ．らが報告した方法、及びＮａｔｕｒｅ、
３９１、２８８−２９１（１９９８）において、Ｃｒａ
ｍｅｒｉ Ａ．らが報告した方法が挙げられ、このうち
Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ．らの方法が特には好ましい。

【００６８】上述の方法に従えば、お互いに相同性の高
い、加水分解酵素をコードするＤＮＡを数種用いてｉｎ
ｖｉｔｒｏで組み換えを行い、新規な加水分解酵素活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを取得する
ことが当業者であれば可能である。また、得られたＤＮ
Ａを、本明細書中上記した方法に準じて、好適な発現系
に導入して、コードされるポリペプチドを発現させるこ
とにより、アミダーゼ活性を有する新規なポリペプチド
を製造することが可能である。以下、実施例により本発
明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定される
ものではなく、その要旨を越えない限り本発明の技術分
野における通常の変更をすることができる。

【００６９】

【実施例】実施例１：立体選択的アミダーゼの単離 シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株
を下記の組成を有するＢＭ培地２５．０リットルに接種
し、３０℃で１２時間培養し、遠心分離により菌体を取
得した。菌体１２５ｇを超音波破砕し、遠心分離により
無細胞抽出液を調製した。

【００７０】

【表１】

【００７１】これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹
脂（東ソ−（株）社製）に吸着させイオン交換クロマト
グラフィーを行い、その５０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む溶出画分の立体アミダーゼ活性を有する画分を順次硫
酸アンモニウムを用いたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌカラム（東ソー（株）社製）、Ｇｉｇａｐｉｔｅカラ
ム（生化学工業社製）、ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２
００（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、Ｍｏ
ｎｏＱ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、及
び再度Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムファルマシ
アバイオテク社製）を用いてカラムクロマトグラフィー
を行い、そこから得られた活性画分で最終的にグラジエ
ントゲルＮＰＧ−５２０Ｌ（アトー（株）社製）を用い
たＮａｔｉｖｅ−電気泳動を行い、活性の存在する部分
をゲルから切り出すことにより本発明のポリペプチドを
単離した。該ポリペプチドの分子量を決定するべく、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ
（東ソー（株）社製）によるサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより決定したところ、それぞれ３４０００（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）、及び３２０００（サイズ排除クロマト
グラフィー）であり、サブユニット構成はモノマーであ
ると推定された。

【００７２】実施例２：部分アミノ酸配列の解析 実施例１で得られた精製立体特異的アミダーゼをペプチ
ダーゼにより消化し、高速液体クロマトグラフィー条件
Ａ（ＨＰＬＣ）により部分ペプチドを２種類分取した。 ＨＰＬＣ条件Ａ； カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー
（株）社製） 溶離液：水／トリフルオロ酢酸／アセトニトリルによる
グラジエント溶出 流量：１．０ｍＬ／分 検出：ＵＶ２１０ｎｍ吸光度 得られたペプチド断片及び実施例１により精製したポリ
ペプチドのＮ−末端のアミノ酸配列を、自動エドマン分
解アミノ酸シークエンサー ＨＰ Ｇ１００５Ａ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ヒ
ューレットパッカード社製）を用いて分析した。それぞ
れのアミノ酸配列は、配列番号３、４、５で示される。

【００７３】実施例３：本発明ＤＮＡの部分断片の取得 シュードモナス・アゾトフォルマンスＩＡＭ１６０３株
を上述のＢＭ培地５．０ｍＬに接種し、３０℃で１２時
間培養した。遠心分離により微生物菌体を取得し、フェ
ノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体ＤＮＡ
を取得した。実施例２で判明したアミノ酸配列から、配
列番号６−１０（ＡＦ１、ＢＦ１、ＢＲ１、ＣＦ１、Ｃ
Ｒ１）のＰＣＲプライマーを設計し、耐熱型ＤＮＡポリ
メラーゼ存在下これら５種のプライマーのうち任意の２
種を添加してＰＣＲを行った。本ＰＣＲの産物をアガロ
ースゲル電気泳動したところ、プライマーＡＦ１とＣＲ
１を用いた反応液に０．２ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増
幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから
抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−
Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし
てＬｉ−ｃｏｒＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅ
ｌ ４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアル
インストラクションに従った）塩基配列を決定した（配
列番号１１）。上記Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲによ
り増幅した０．２ｋｂｐの精製ＤＮＡの残りをＲｅｄｉ
ｐｒｉｍｅ^TMＩＩ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ ｌａｂ
ｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシア
バイオテク（株）社製）により標識した。

【００７４】実施例４：シュードモナス アゾトフォル
マンス ＩＡＭ１６０３ 染色体ＤＮＡライブラリーの
サザンハイブリダイゼーション 実施例３記載の方法によりシュードモナス アゾトフォ
ルマンス ＩＡＭ１６０３の染色体ＤＮＡを取得した。
本ＤＮＡをＦｂａＩで消化した後、実施例３で作製した
０．２ｋｂｐの標識ＤＮＡをプローブとして用いてサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。手法はモルキュラ
ークローニング第３版に従い、ハイブリダイゼーション
は４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを
含む緩衝液中、４２℃で行った。その結果、約２ｋｂｐ
のＤＮＡバンドが検出され、本ＤＮＡをアガロースゲル
から抽出精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入
し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりＥ．ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９株に導入した。

【００７５】実施例５：コロニーハイブリダイゼーショ
ン及びサブクローニング 実施例４において得られたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の
形質転換株を８０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地（１Ｌの水溶液中にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ
１０．０ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃ
ｔ ５．０ｇ、塩化ナトリウム １０．０ｇ、寒天１
５．０ｇを含む）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生
じたコロニーをニトロセルロース膜Ｈｙｂｏｎｄ^TM Ｅ
ＣＬ^TM（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社
製）にリフティングし、実施例３で取得したＤＮＡプロ
ーブを用い、４０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳを含む緩衝液中、４２℃でハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションの結果、陽性の
クローンからプラスミド（ｐＳＴＢ１０）を取得し、Ｌ
ｉ−ｃｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ
４０００Ｌを用いて、塩基配列を決定した（配列番号
１２）。

【００７６】実施例６：発現用プラスミドの構築 上記実施例５で得られたｐＳＴＢ１０を鋳型として、プ
ライマーＳＴＢ−ＦとＳＴＢ−Ｒ（配列番号１３及び１
４）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成
物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消
化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株）
社製）に連結してｐＳＴＢ２０を作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９に塩化カルシウム法で形質転換した。８０
μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換
株を塗布し、生育したクローンを取得して、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を得た。

【００７７】実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐ
ＳＴＢ２０）からの立体選択的アミダーゼ活性を有する
ポリペプチドの精製 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ
／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地２．５Ｌで培養後、
遠心分離により約１０．０ｇの菌体を得た。これを１０
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超
音波破砕及び遠心分離により無細胞抽出液を得た。これ
に硫酸アンモニウムを添加し、５０−７０％飽和の硫酸
アンモニウム画分を得た。さらにこれを１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解・透析後、同緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに吸
着させ、０−２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（直線濃度勾配）で
溶出した。目的の活性を含む画分に３０％飽和になるよ
う硫酸アンモニウムを加え、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌを用いた疎水カラムクロマトグラフィーを行い、
３０−０％飽和硫酸アンモニウムの直線濃度勾配法で溶
出した。溶出後、活性を含む画分を選択し、脱塩・濃縮
し精製標品とした。

【００７８】実施例８：精製立体選択的アミダーゼの酵
素学的性質 基質としてＬ−プロリンアミドを用いて、実施例７で取
得した精製酵素のアミド加水分解反応の至適ｐＨ、及び
至適温度、また本酵素の温度耐性や１ｍＭ阻害剤の影響
を、加水分解反応により生じるＬ−プロリンをＨＰＬＣ
で定量することにより行った。至適温度、温度耐性、及
び阻害剤の影響についての測定は１００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）中で行なった。至適ｐＨの測定はｐ
Ｈの異なる各種緩衝液中で行なった。反応は３０℃で５
分行い、反応はエタノールの添加により停止し、ＨＰＬ
Ｃのサンプルとした。なお、温度耐性を測定するための
熱処理は、各温度において５分のインキュベーションを
行い、３０℃に調温後その活性を測定した。また阻害剤
については、酵素を１ｍＭ阻害剤存在下で３０℃、３分
間インキュベートした後、Ｌ−プロリンアミドを添加し
３０℃で５分間インキュベーションした後、エタノール
の添加により反応を停止して下記ＨＰＬＣ条件Ｂを用い
て生成したＬ−プロリンの定量をした。

【００７９】ＨＰＬＣ条件Ｂ カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００
（（株）住化分析センター社製） カラム温度：３０℃ 溶離液：２ｍＭＣｕＳＯ₄ 水溶液 流速：１．０ｍＬ／分 検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度 その結果を以下の表２及び表３にまとめた。

【００８０】

【表２】

【００８１】

【表３】

【００８２】また、本酵素のＬ−プロリン−ｐ−ニトロ
アニリドに対するＫｍ及びＶｍａｘも同様に１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で測定し
た結果、Ｋｍ値、Ｖｍａｘ値はそれぞれ０．５８３ｍ
Ｍ、及び８０．９Ｕ／１ｍｇ・ポリペプチドであった
（１Ｕは本酵素が１分間に１μｍｏｌｅのＬ−プロリン
−ｐ−ニトロアニリドを加水分解するのに必要な酵素量
である）。

【００８３】実施例９：基質選択性の検討 実施例７で取得した精製酵素を用いて、基質選択性を検
討した。基質化合物は２０ｍＭの濃度で添加し、１００
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中、３０℃で酵素反応
し、分析は下記ＨＰＬＣ条件Ｃで行った。 ＨＰＬＣ条件Ｃ； カラム：Ｓｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００、または
ＯＡ−５０００Ｌ（（株）住化分析センター社製） カラム温度：３０℃ 溶離液：２ｍＭ ＣｕＳＯ₄水溶液 流速：１．０ｍＬ／分 検出：ＵＶ２５４ｎｍ吸光度 Ｌ−プロリンアミドに対する活性を１００として、その
相対活性を以下の表４に示す。

【００８４】

【表４】

【００８５】本発明のポリペプチドのアミダーゼ活性
は、Ｌ−プロリンアミドまたはＬ−プロリン−ｐ−ニト
ロアニリドに特に強い活性を示し、その他ピペラジン−
２−カルボキサアミド、Ｌ−アラニンアミド、などに弱
い活性を示した。また、Ｎ−アルキルアミド化合物に対
しても有意な活性を示した。

【００８６】実施例１０：組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用
いた立体特異的アミド加水分解反応 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ／
ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ
培地３．０ｍＬに接種し、３７℃で１２時間攪拌培養し
た。３０００×ｇ、１０分の遠心分離により菌体を取得
し、３．０ｍＬの０．９％ＮａＣｌで懸濁後、再度同様
の遠心分離により菌体を分離した。この菌体を１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、３．６
ｍＬの細胞懸濁液を得た。このうち、４００μＬを４０
０μＬの４０ｍＭラセミ体プロリンアミド、またはラセ
ミ体ピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と混合後、３０℃で
インキュベートした。２時間後、エタノールで反応を停
止し、上記ＨＰＬＣ条件Ｃにおいて、加水分解により生
成したプロリンまたはピペラジン−２−カルボン酸の光
学純度を測定した。その結果、Ｄ−プロリンまたは
（Ｒ）−ピペラジン−２−カルボン酸の生成は全く見ら
れず、Ｌ−プロリンまたは（Ｓ）−ピペラジン−２−カ
ルボキサミドの光学純度はほぼ１００％であった。

【００８７】実施例１１：組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用
いた（ＲＳ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−
カルボキサミドの加水分解反応 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＴＢ２０）を８０μｇ／
ｍＬのアンピシリン及び０．５ｍＭＩＰＴＧを含むＬＢ
培地で培養し、菌体を遠心分離により得た。これの湿菌
体重量を測定し、２００ｍＭのラセミ体−Ｎ−ｔｅｒｔ
−ブチルピペラジン−２−カルボキサミドを含む１００
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍＬにそ
れぞれ０．２８％、１．４１％、及び２．８３％になる
よう添加し３０℃でインキュベートした。一定時間ごと
にサンプリングを行い、エタノールで反応を停止後、上
記ＨＰＬＣ条件Ｂにより生成したピペラジン−２−カル
ボン酸の定量及び光学純度の測定を行った。結果を図１
に示す。図１の結果から分かるように、生成した（Ｓ）
−ピペラジン−２−カルボン酸の光学純度は９５．５％
ｅ．ｅ．であった。

【００８８】

【発明の効果】本発明により、含窒素複素環含有カルボ
ン酸アミド類を立体選択的に加水分解する能力を有する
新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供され
る。本発明のアミダーゼを、カルボン酸アミド類に作用
させることにより、医・農薬中間原料として有用なキラ
ルカルボン酸類及び／又はキラルカルボン酸アミド類を
製造することが可能になる。

【００８９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> A novel amidase and a gene encoding it <130> A21129A <160> 14

【００９０】 <210> 1 <211> 310 <212> PRT <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 1 Met Glu Phe Ile Glu Lys Ile Arg Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Gln Thr Trp Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ser Ser Gly Arg Thr 20 25 30 Pro Leu Val Val Ile His Gly Gly Pro Gly Cys Thr His Asp Tyr Val 35 40 45 Asp Ala Phe Lys Asp Val Ala Ala Ser Gly His Ala Val Ile His Tyr 50 55 60 Asp Gln Leu Gly Asn Gly Arg Ser Thr His Leu Pro Asp Lys Asp Pro 65 70 75 80 Ser Phe Trp Thr Val Gly Leu Phe Leu Glu Glu Leu Asn Asn Leu Leu 85 90 95 Asp His Leu Gln Ile Ser Asp Asn Tyr Ala Ile Leu Gly Gln Ser Trp 100 105 110 Gly Gly Met Leu Gly Ser Glu His Ala Ile Leu Gln Pro Lys Gly Leu 115 120 125 Arg Ala Phe Ile Pro Ala Asn Ser Pro Thr Cys Met Arg Thr Trp Val 130 135 140 Ser Glu Ala Asn Arg Leu Arg Lys Leu Leu Pro Glu Gly Val His Glu 145 150 155 160 Thr Leu Leu Lys His Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Gln Asp Pro Glu Tyr 165 170 175 Leu Ala Ala Ser Arg Val Phe Tyr Asp His His Val Cys Arg Val Ile 180 185 190 Pro Trp Pro Glu Glu Val Ala Arg Thr Phe Ala Ala Val Asp Ala Asp 195 200 205 Pro Thr Val Tyr His Ala Met Ser Gly Pro Thr Glu Phe His Val Ile 210 215 220 Gly Ser Leu Lys Asp Trp Lys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ala Ile Asn 225 230 235 240 Val Pro Thr Leu Val Ile Ser Gly Arg His Asp Glu Ala Thr Pro Leu 245 250 255 Val Val Lys Pro Phe Leu Asp Glu Ile Ala Asp Val Arg Trp Ala Leu 260 265 270 Phe Glu Asp Ser Ser His Met Pro His Val Glu Glu Arg Gln Ala Cys 275 280 285 Met Gly Thr Val Val Lys Phe Leu Asp Glu Val Cys Ser Ala Lys Tyr 290 295 300 Lys Val Leu Lys Ala Ser 305 310

【００９１】 <210> 2 <211> 933 <212> DNA <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 2 atg gaa ttc atc gaa aaa atc cgc gaa ggg tat gcg gcg ttt ggc gcc 48 Met Glu Phe Ile Glu Lys Ile Arg Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Ala 1 5 10 15 tac caa acc tgg tac cgc gtc acc ggt gac ctc tcc agc ggt cgc acg 96 Tyr Gln Thr Trp Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ser Ser Gly Arg Thr 20 25 30 ccc ctg gtg gtt atc cac ggc ggc ccc gga tgc acc cac gat tac gtt 144 Pro Leu Val Val Ile His Gly Gly Pro Gly Cys Thr His Asp Tyr Val 35 40 45 gac gcg ttc aag gat gtc gcc gcc agc ggc cac gcc gtg atc cac tac 192 Asp Ala Phe Lys Asp Val Ala Ala Ser Gly His Ala Val Ile His Tyr 50 55 60 gac caa ctg ggc aac ggc cgc tcc act cat ctg ccc gac aaa gac cca 240 Asp Gln Leu Gly Asn Gly Arg Ser Thr His Leu Pro Asp Lys Asp Pro 65 70 75 80 tcc ttc tgg acc gta ggc ctg ttt ctc gaa gaa ctg aac aac ctg ctg 288 Ser Phe Trp Thr Val Gly Leu Phe Leu Glu Glu Leu Asn Asn Leu Leu 85 90 95 gac cat ctg cag atc agc gat aac tac gcg atc ctc ggc cag tcc tgg 336 Asp His Leu Gln Ile Ser Asp Asn Tyr Ala Ile Leu Gly Gln Ser Trp 100 105 110 ggc ggc atg ctc ggc agc gaa cac gcg atc ctg caa ccc aaa ggc ctg 384 Gly Gly Met Leu Gly Ser Glu His Ala Ile Leu Gln Pro Lys Gly Leu 115 120 125 cgt gcg ttc atc ccg gcc aat tcg cca aca tgc atg cgc act tgg gtc 432 Arg Ala Phe Ile Pro Ala Asn Ser Pro Thr Cys Met Arg Thr Trp Val 130 135 140 agc gaa gcc aac cgc ctg cgc aaa tta ttg cct gaa ggc gtg cat gaa 480 Ser Glu Ala Asn Arg Leu Arg Lys Leu Leu Pro Glu Gly Val His Glu 145 150 155 160 acc ctg ctc aag cac gaa acc gcc ggc acc tat cag gac ccg gaa tac 528 Thr Leu Leu Lys His Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Gln Asp Pro Glu Tyr 165 170 175 ctc gcc gca tcg cgg gtg ttc tat gac cat cac gtg tgc cgg gtc atc 576 Leu Ala Ala Ser Arg Val Phe Tyr Asp His His Val Cys Arg Val Ile 180 185 190 cca tgg ccc gag gaa gtg gcg cgc acc ttc gcc gcg gtc gac gcc gac 624 Pro Trp Pro Glu Glu Val Ala Arg Thr Phe Ala Ala Val Asp Ala Asp 195 200 205 ccg acg gtg tac cac gcc atg agc ggc ccg acc gag ttc cat gtg atc 672 Pro Thr Val Tyr His Ala Met Ser Gly Pro Thr Glu Phe His Val Ile 210 215 220 ggc agc ttg aaa gac tgg aaa tcc act ggc cgc cta tcg gcg atc aac 720 Gly Ser Leu Lys Asp Trp Lys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ala Ile Asn 225 230 235 240 gta ccg acc ctg gtg atc tca ggc cgg cac gac gag gcc acg cca ctg 768 Val Pro Thr Leu Val Ile Ser Gly Arg His Asp Glu Ala Thr Pro Leu 245 250 255 gta gtc aag ccg ttc ctg gat gaa atc gcc gat gtg cgc tgg gcg ctg 816 Val Val Lys Pro Phe Leu Asp Glu Ile Ala Asp Val Arg Trp Ala Leu 260 265 270 ttt gaa gac tcc agc cac atg ccc cat gtg gaa gaa cgc cag gcg tgc 864 Phe Glu Asp Ser Ser His Met Pro His Val Glu Glu Arg Gln Ala Cys 275 280 285 atg ggg act gtg gtg aag ttt ctg gat gag gtg tgt tcg gca aaa tac 912 Met Gly Thr Val Val Lys Phe Leu Asp Glu Val Cys Ser Ala Lys Tyr 290 295 300 aaa gtg ctc aag gcc agc tga 933 Lys Val Leu Lys Ala Ser Stop 305 310

【００９２】 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 3 Met Glu Phe Ile Glu Lys Ile Arg Glu Gly 1 5 10

【００９３】 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 4 Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ala Ile Asn Val 1 5 10

【００９４】 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 5 Asp Val Ala Ala Ser Gly His Ala Val Ile 1 5 10

【００９５】 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 atggagttca tcgagaagat c 21

【００９６】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 wssacsggsm gsytswssgc 20

【００９７】 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 acgttgatsg csswsarsck scc 23

【００９８】 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 gacggtsgcs gcswssggsc acgc 24

【００９９】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 10 gatsacsgcg tgsccsswsg c 21

【０１００】 <210> 11 <211> 186 <212> DNA <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 11 atg gag ttc atc gag aag atc cgc gaa ggg tat gcg gcg ttt ggc gcc 48 Met Glu Phe Ile Glu Lys Ile Arg Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Ala 1 5 10 15 tac caa acc tgg tac cgc gtc acc ggt gac ctc tcc agc ggt cgc acg 96 Tyr Gln Thr Trp Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ser Ser Gly Arg Thr 20 25 30 ccc ctg gtg gtt atc cac ggc ggc ccc gga tgc acc cac gat tac gtt 144 Pro Leu Val Val Ile His Gly Gly Pro Gly Cys Thr His Asp Tyr Val 35 40 45 gac gcg ttc aag gat gtc gcc gcc acc ggc cac gcc gtc atc 186 Asp Ala Phe Lys Asp Val Ala Ala Thr Gly His Ala Val Ile 50 55 60

【０１０１】 <210> 12 <211> 2104 <212> DNA <213> Pseudomonas Azotoformans <400> 12 tgatcacccc ttcggtgctg caactgcgca acaccccgcc cgactggcat gccttgtggt 60 gcagcgaagg gttctaccag atcgacccgg tgcaacatct ggccctgagc cgggtgtcgc 120 cgttcgtgtg gtcctacgac gtcaaggccg acaccccgct gcaaaagatc atcgacccct 180 gccacgcgcc ggtttcatcc tacctacatg accagcaatt gacctgcggg gtcagcgtgc 240 cgatccacct gccccgcggt ggctttgcct cgctgaccgg cctgcgtacc ggcaatgccc 300 gcaacgtgct gcaggatgcg cagcagaccc tgtcggattt cggcctgatt tcccatgcgt 360 tacaggaggc cgcctacccg ctgttcagca aagagctgcg cacttacccg catatccacc 420 tgaccaaacg cgaacgtgag tgcctcaaat gggctgccga cggcctgact gcggccgaaa 480 ttgccacaca actgagccgt tccctggcgg tagtcaccct gcacctggcc tcggccatgc 540 acaagctggg ggccaagaac cgcgtgcaag cggtggtgcg cgccacccat taccgcctgc 600 tcgacgattg accgccgggc aaaacctagc tgttttgcta gttacttaaa tttctttcac 660 ccattatcgt gtccccgatc cttttttcag agcagggcac gaa atg gaa ttc atc 715 Met Glu Phe Ile 1 gaa aaa atc cgc gaa ggg tat gcg gcg ttt ggc gcc tac caa acc tgg 763 Glu Lys Ile Arg Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Ala Tyr Gln Thr Trp 5 10 15 20 tac cgc gtc acc ggt gac ctc tcc agc ggt cgc acg ccc ctg gtg gtt 811 Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ser Ser Gly Arg Thr Pro Leu Val Val 25 30 35 atc cac ggc ggc ccc gga tgc acc cac gat tac gtt gac gcg ttc aag 859 Ile His Gly Gly Pro Gly Cys Thr His Asp Tyr Val Asp Ala Phe Lys 40 45 50 gat gtc gcc gcc agc ggc cac gcc gtg atc cac tac gac caa ctg ggc 907 Asp Val Ala Ala Ser Gly His Ala Val Ile His Tyr Asp Gln Leu Gly 55 60 65 aac ggc cgc tcc act cat ctg ccc gac aaa gac cca tcc ttc tgg acc 955 Asn Gly Arg Ser Thr His Leu Pro Asp Lys Asp Pro Ser Phe Trp Thr 70 75 80 gta ggc ctg ttt ctc gaa gaa ctg aac aac ctg ctg gac cat ctg cag 1003 Val Gly Leu Phe Leu Glu Glu Leu Asn Asn Leu Leu Asp His Leu Gln 85 90 95 100 atc agc gat aac tac gcg atc ctc ggc cag tcc tgg ggc ggc atg ctc 1051 Ile Ser Asp Asn Tyr Ala Ile Leu Gly Gln Ser Trp Gly Gly Met Leu 105 110 115 ggc agc gaa cac gcg atc ctg caa ccc aaa ggc ctg cgt gcg ttc atc 1099 Gly Ser Glu His Ala Ile Leu Gln Pro Lys Gly Leu Arg Ala Phe Ile 120 125 130 ccg gcc aat tcg cca aca tgc atg cgc act tgg gtc agc gaa gcc aac 1147 Pro Ala Asn Ser Pro Thr Cys Met Arg Thr Trp Val Ser Glu Ala Asn 135 140 145 cgc ctg cgc aaa tta ttg cct gaa ggc gtg cat gaa acc ctg ctc aag 1195 Arg Leu Arg Lys Leu Leu Pro Glu Gly Val His Glu Thr Leu Leu Lys 150 155 160 cac gaa acc gcc ggc acc tat cag gac ccg gaa tac ctc gcc gca tcg 1243 His Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Gln Asp Pro Glu Tyr Leu Ala Ala Ser 165 170 175 180 cgg gtg ttc tat gac cat cac gtg tgc cgg gtc atc cca tgg ccc gag 1291 Arg Val Phe Tyr Asp His His Val Cys Arg Val Ile Pro Trp Pro Glu 185 190 195 gaa gtg gcg cgc acc ttc gcc gcg gtc gac gcc gac ccg acg gtg tac 1339 Glu Val Ala Arg Thr Phe Ala Ala Val Asp Ala Asp Pro Thr Val Tyr 200 205 210 cac gcc atg agc ggc ccg acc gag ttc cat gtg atc ggc agc ttg aaa 1387 His Ala Met Ser Gly Pro Thr Glu Phe His Val Ile Gly Ser Leu Lys 215 220 225 gac tgg aaa tcc act ggc cgc cta tcg gcg atc aac gta ccg acc ctg 1435 Asp Trp Lys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ala Ile Asn Val Pro Thr Leu 230 235 240 gtg atc tca ggc cgg cac gac gag gcc acg cca ctg gta gtc aag ccg 1483 Val Ile Ser Gly Arg His Asp Glu Ala Thr Pro Leu Val Val Lys Pro 245 250 255 260 ttc ctg gat gaa atc gcc gat gtg cgc tgg gcg ctg ttt gaa gac tcc 1531 Phe Leu Asp Glu Ile Ala Asp Val Arg Trp Ala Leu Phe Glu Asp Ser 265 270 275 agc cac atg ccc cat gtg gaa gaa cgc cag gcg tgc atg ggg act gtg 1579 Ser His Met Pro His Val Glu Glu Arg Gln Ala Cys Met Gly Thr Val 280 285 290 gtg aag ttt ctg gat gag gtg tgt tcg gca aaa tac aaa gtg ctc aag 1627 Val Lys Phe Leu Asp Glu Val Cys Ser Ala Lys Tyr Lys Val Leu Lys 295 300 305 gcc agc tgaatgctca agctggatgc attccaattg tgggaggggg cttgcccccg at 1685 Ala Ser 310 gacgggggat cagctgagtg atgggttgct gacacaccgc tatcgggggc aagccccctc 1745 ccacattcag acctcagtgg tttgaggctt tgcggccttc ttcgacactt ccgccaccaa 1805 cgggatttcc ctgccctgcg catcaaacaa cttgccgccc ttgaagtaat ccccatcacg 1865 cagttccgac acatcgcgaa agcacaagct acgctcggtc cccgccacaa ataccgactg 1925 ctggtccgag ttaccggcgg tgaaatggtt gaacgccagg ttcagcagga tcgccatgat 1985 tgccgatgag ctgatccccg agtggaaaat agtcgcgaac caagtcggga agtgatcgta 2045 gaagctcggt gccgcaatcg ggatcatgcc aaaaccgatg gaagtggcga cgatgatca 2104

【０１０２】 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 cgatccaagc tttaaggagg aataggaaat ggaattcatc gaaaaaatcc g 51

【０１０３】 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 14 tgcatccatc tagagcattc agc 23

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、組み換え体Ｅ．ｃｏｌｉを用いた（Ｒ
Ｓ）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−２−カルボキ
サミドの加水分解反応の測定結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 41/00 5/00 Ａ (72)発明者 上田 誠 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA11 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AE03 AE35 CA21 CB05 CD27 4B065 AA26X AA41Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA31

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する立体選択的
   アミダーゼ。 （１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
   アミドゲル電気泳動で測定した場合に３４０００であ
   り、ゲル濾過で測定した場合に３２０００； （２）サブユニット構成：モノマー （３）Ｌ−プロリンアミドを基質として用いた時のアミ
   ダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ９付近 （４）Ｌ−プロリンアミドを基質として用い、ｐＨ８で
   反応を行なった時のアミダーゼ反応至適温度：４５℃付
   近 （５）ｐＨ８における耐熱性：４０℃以下で安定である （６）本ポリペプチドのアミダーゼ活性を完全に阻害す
   る化合物：フェニルヒドラジン、Ｚｎ²⁺、Ａｇ⁺、Ｃｄ
   ²⁺、Ｈｇ²⁺ （７）ＥＤＴＡの影響：反応液に１ｍＭのＥＤＴＡを添
   加することにより酵素活性が促進される。
2. 【請求項２】 下記の何れかのポリペプチド。 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチド； （２）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１か
   ら複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
   アミノ酸配列を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有す
   るポリペプチド；又は （３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上
   の相同性を有するアミノ酸配列を有し、立体選択的アミ
   ダーゼ活性を有するポリペプチド；
3. 【請求項３】 請求項２に記載のポリペプチドをコード
   するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 下記の何れかのＤＮＡ。 （１）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ； （２）配列番号２で表される塩基配列において１から複
   数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列
   を有し、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ；又は （３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡと
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、立体選
   択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
   ＤＮＡ：
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載のＤＮＡを有する
   組み換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項３又は４に記載のＤＮＡあるいは
   請求項５記載の組換えベクターを有する形質転換体。
7. 【請求項７】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ａは、水酸基、アルコキシ基、チオール基、ア
   ルキルチオ基、アリール基及びヘテロアリール基から選
   ばれる置換基により置換されていても良いアルキル基又
   はＡが結合している炭素原子及び該炭素原子に結合して
   いるアミノ基と一体となって、含窒素複素環を形成しう
   る基であり、Ｒは、水素原子、置換されていても良いア
   ルキル基又は置換されていても良いアリール基を示
   す。）で表されるカルボン酸アミド類に、請求項１に記
   載のアミダーゼ、請求項２に記載のポリペプチド、又は
   請求項６に記載の形質転換体を作用させることにより、
   （Ｓ）−体のアミド結合を選択的に加水分解させた後、
   下記一般式（ＩＩ） 【化２】 （式中、Ａは前記と同義である。）で表される（Ｓ）−
   体のカルボン酸類または／及び下記一般式（ＩＩＩ） 【化３】 （式中、Ａ及びＲは前記と同義である。）で表される
   （Ｒ）−体のカルボン酸アミド類を単離することを含
   む、光学活性なカルボン酸類及び／またはアミド類の製
   造方法。
8. 【請求項８】 Ａが、Ａが結合している炭素原子及び該
   炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素
   複素環を形成しうる基である、請求項７に記載の製造方
   法。
9. 【請求項９】 エチレンジアミン４酢酸の共存下で反応
   を行う、請求項７又は８に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項３又は４に記載されたＤＮＡ
    と、該ＤＮＡと５０％以上の相同性を示す１種以上のＤ
    ＮＡとをランダムリコンビネーションすることを特徴と
    する、立体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド
    又はそれをコードするＤＮＡの製造方法。