WO2005108592A1 - 光学活性プロパルギルアルコールの製造方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
Definitions
- the present invention relates to a method for producing optically active propargyl alcohol, which is useful as an optically active raw material for various pharmaceuticals, particularly as a raw material for an ⁇ side chain essential for a prostaglandin compound.
- the method for producing the optically active propargyl alcohol represented by Formula 2 or Formula 5 as defined herein includes the following:
- the method (1) requires a low yield and an expensive resolving agent
- the method (2) has a low optical purity
- the method (3) requires an expensive optical resolution column
- the method (4) requires an expensive asymmetric reduction catalyst, cryogenic temperature
- the method (5) has low yield and low optical purity.
- the method (6) has low productivity
- the method (7) requires an expensive resolving agent and requires complicated steps, which is problematic as an industrial production method. Disclosure of the invention
- the present invention relates to an optically active propargyl alcohol represented by the formula (2) or (5), in particular, (S) -1-cyclohexyl-2-propyne-11-ole represented by the formula (4) or (R) represented by the formula (6)
- An object of the present invention is to provide a method for producing 1-cyclohexyl-2-propyne-11-ol, which can provide a product with high optical purity in good yield.
- the present inventors did not use a resolution method in which the theoretical yield does not exceed 50%, but instead used a 100% raw material available, and obtained propargyl ketone by an asymmetric reduction reaction using a highly stereoselective enzyme.
- a method for producing optically active propargyl alcohol with high optical purity was studied.
- CHPN (1-cyclohexylpropynone, hereafter abbreviated as CHPN) as a substrate, using an enzyme that asymmetrically reduces a large number of phenols, 1-cyclohexylone 2-propyne-1 1-onole (1-cyclohexyl- 2 -propyn- 1- ol, hereafter abbreviated as CHP0).
- TdCRl protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
- (S) -specific secondary alcohol dehydrogenase derived from Candida parapsilosis can asymmetrically reduce ethyl acetate acetate to give (S) -3 — Has been reported to produce ethyl ethyl butyrate, but has virtually no activity against CHPN.
- ScYDRl having a homology of 61% to TdCRl Japanese Patent Application No. 2003-113402 had substantially no activity against CHPN.
- NAD + generated from NADH to NADH accompanying the above reaction and NADPH
- the regeneration of NADPH produced from methane to NADP + can be carried out by, for example, dalkose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase, etc.
- dalkose dehydrogenase formate dehydrogenase
- alcohol dehydrogenase amino acid dehydrogenase
- organic acid dehydrogenase etc.
- (c) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added, and reduced by reducing a propargyl ketone derivative represented by the formula 1.
- R represents a C 1 -C 10 substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl group, alkenyl group or alkynyl group, or C 6 -C 20 aryl group.
- a method for producing an optically active propargyl alcohol derivative comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
- a protein encoded by the polynucleotide according to any of the above, a microorganism or a transformant functionally expressing the protein, or a processed product thereof is expressed by the following formula 1:
- R represents a C 11 -C 10 substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl group, alkenyl group or alkynyl group, or a C 6 -C 20 aryl group.
- a method for producing an optically active propargyl alcohol derivative comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
- a propargyl ketone derivative represented by the formula 1 is represented by the formula 3:
- An optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula 5 is 1-cyclohexyl 2-propyne 11-one represented by the formula 3,
- Figure 1 shows the construction of ScGRE2 expression plasmid P SE- Y0L1.
- FIG. 2 shows the construction of the co-expressed plasmid pSG-SCR1 with ScGRE2 and glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis.
- the present invention provides the following) to (e);
- one or more amino acids are A protein consisting of substituted, deleted, inserted and / or added amino acids, which has the activity of reducing a propargyl ketone derivative represented by the formula 1 to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula 2
- the present invention relates to a method for producing an optically active polyester pargylic alcohol derivative represented by Formula 2.
- the protein described in SEQ ID NO: 2 includes, for example, (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia Finlandandi force.
- the enzyme can be prepared from Pichia-Finlandi-powered cells by the method described in WO 01Z61014.
- Pichia Finlandia DSM 70280 strain can be suitably used as the Pichia Finlandia force.
- DNA encoding the protein described in SEQ ID NO: 2 which is the amino acid sequence of the (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia's Finlandi force DSM 70280 strain, and Pichia's Finlandy force DSM 70280 strain, etc.
- (R) -2-octanol using a recombinant cloned from E. coli or chemically synthesized from a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and expressed in a heterologous host such as Escherichia coli.
- the enzyme can also be obtained from a recombinant by expressing a dehydrogenase.
- the measurement of the enzyme activity of the (R) -2-octanol dehydrogenase used in the present invention can be confirmed as follows.
- the present invention provides the following (a) to (e);
- the present invention relates to a method for producing an oral pargylic alcohol derivative.
- the carbohydrate reductase ScGRE2 used in the present invention can be prepared from baker's yeast by the method described in J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998).
- the fragility described in SEQ ID NO: 3 encoding ScGRE2 derived from Saccharomyces cerevisiae was cloned from Saccharomyces cerevisiae (for example, strain X2180-1B) (Yeast Genetic Stock Center) by PCR or the like, and transferred to a heterologous host such as Escherichia coli.
- the enzyme can also be obtained from the recombinant by expressing ScGRE2 using the recombinant introduced in an expressible form.
- the measurement of the enzyme activity of SGGRE2 used in the present invention can be confirmed as follows.
- NADPH reduced-cotinamide adenidine dinucleotide phosphate
- 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of NADPH by ⁇ per minute.
- the carbonyl reductase ScYGD9 used in the present invention is a DNA described in SEQ ID NO: 5 encoding ScYGD9 derived from Saccharomyces cerevisiae, for example, as described in Japanese Patent Application No. 2003-113304.
- Saccharomyces' Celevige By way of Saccharomyces' Celevige
- the carbonyl reductase TdCRl used in the present invention can be obtained by the method described in Japanese Patent Application No. 2003-113134.
- TdCRl derived from Torulaspora delpreckii was cloned from Torulaspora delprezkie (eg, strain IF0381) by PCR or the like, and used for TdCRl can be expressed using a recombinant introduced in a form that can be expressed in a heterologous host, and the enzyme can be obtained from the recombinant.
- the measurement of the enzymatic activity of TdCRl according to the present invention can be confirmed as follows. Reaction at 30 ° C in a reaction mixture containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 5 mM 3,4-dimethoxyphenylacetone, and enzyme. Measure the decrease in absorbance at 340 nm. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the reduction of l / z mol of NADPH per minute.
- the yeast Sacharomyces cerevisiae, Torrasbora del Delpreky
- a common medium used for culturing yeast such as a YM medium.
- the cells are collected, crushed in a buffer solution containing a reducing agent such as 2-mercaptoethanol / phenylmethanemethanefluonyl fluoride or a protease inhibitor, and combined with a cell-free extract. I do.
- Protein-free fractionation from cell-free extracts eg, precipitation with organic solvents or salting out with ammonium sulfate, etc.
- cation exchange anion exchange
- gel filtration hydrophobic chromatography
- chelate dye
- roasting using such antibodies - for example c can be purified by combining tee one chromatography scratch as appropriate, Hue - Lou Sepharose hydrophobic chromatography using anion-exchange chromatography using M ono Q, butyl- It can be purified to a single band electrophoretically through hydrophobic chromatography using Sepharose, adsorption chromatography using hydroxyapatite, and the like.
- amino acid sequence in which one or more (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably about 1 to 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the present invention is a method for site-directed mutagenesis of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 (Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp. 448 (1983), Using mutations such as substitution, deletion, insertion, and Z or addition, as appropriate, using Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PGR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991)) It is possible to obtain by doing.
- the polynucleotide homolog of the present invention is a protein having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
- the homology search of proteins can be performed, for example, on the database of amino acid sequences of proteins such as SWISS-PR0T, PIR, and DAD, on the database of DNA sequences such as DDBJ, EMBL, or Gene-Bank, and on amino acid sequences predicted based on DNA sequences. It can be performed on a database or the like by using a program such as BLAST or FASTA, for example, through the Internet.
- the homology of the present invention refers to, for example, a numerical value represented by identity using the BLAST program.
- a polynucleotide that can hybridize under stringent conditions with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 is any polynucleotide described in any of the polynucleotide SEQ ID NOs.
- DNA which is one or more selected from 0, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 continuous sequences, is used as a probe DNA, for example, ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham The polynucleotides that hybridize under the conditions described in the manual (for example, wash: 42 ° C, primary wash buffer containing 0.5x SSC) using Pharmaica Biotech. More specific “stringent conditions” are, for example, usually 42. C, 2X SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C, 2X SSC, 0.1% SDS, more preferably 65 ° C, 0.1X The conditions are SSC and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions. Factors that affect the stringency of the hybridization can be considered as multiple factors such as temperature and salt concentration, and those skilled in the art will realize the optimal stringency by appropriately selecting these factors. It is possible.
- an expression vector for each enzyme is provided.
- the transformation transformed with this expression vector By culturing the recombinant, an alcohol dehydrogenase and a carbohydrate reductase usable in the present invention can be obtained from the recombinant.
- the microorganism to be transformed is transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding each enzyme, and the activity of each enzyme is reduced. There is no particular limitation as long as it can express the organism. Examples of usable microorganisms include the following microorganisms.
- Genus Escherichia Genus Bacillus, Genus Pseudomonas, Genus Serratia, Genus Brevibacterium, Genus Corynebacterium, Streptococcus
- Bacteria for which a host vector system has been developed such as the genus (Streptococcus) and the genus Lactobacillus;
- Actinomycetes whose host vector system has been developed, such as the genus Rhodococcus and the genus Streptomyces;
- Yeasts that have been developed as a host vector system such as genus (Trichosporon), genus Rhodosporidium, genus Pichia, and genus Candida; genus Neurospora, genus Aspergillus Fungi that have been developed in a host vector system such as genus, Cephalosporium, and Trichoderma genus:
- Procedures for producing a transformant and construction of a recombinant vector suitable for a host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, see Sambrook et al.). , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories).
- NADPH NADPH
- a promoter corresponding to a unit for controlling transcription and translation may be incorporated upstream of the 5′-side of the DNA strand of the present invention, and more preferably, a terminator may be incorporated downstream of the 3′-side.
- a promoter and terminator it is necessary to use a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host.
- promoters, and terminators that can be used in these various microorganisms, see “Basic Lectures on Microbiology, 8 Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan”. Especially for yeast, see Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990). ), Yeast 8, 423-488 (1992), and so on.
- An optically active propargyl alcohol derivative can be produced by bringing a transformant into contact with a reaction solution to carry out a desired enzyme reaction.
- the contact form between the enzyme and the reaction solution is not limited to these specific examples.
- the processed products of microorganisms containing alcohol dehydrogenase or carbonyl reductase according to the present invention include microorganisms whose cell membrane permeability has been changed by treatment with an organic solvent such as a surfactant or toluene.
- an organic solvent such as a surfactant or toluene.
- a cell-free extract obtained by disrupting cells by glass beads or enzyme treatment, or a partially purified extract thereof is included.
- R represents a C 1 -C 10 substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl, alkenyl or alkynyl group, or C 6- Represents an aryl group of C 20.
- R methinole, ethinole, propinole, petitinole, pentinole, hexinole, heptinole, octyl, noel, decyl, isopropyl, isoptyl, t-butyl, 2-methylpentinole, 3-methinolehexinole, cyclopentinole, cyclohexinole
- substituents may be further substituted with chlorine, bromine, iodine, trialkylsilyl, trialkyltin and the like.
- a protein having (R) -2-octanol dehydrogenase activity, a microorganism producing the enzyme or protein, or a processed product of the microorganism is treated with 1-cyclohexyl represented by the formula (3).
- (S) -propynone (CHPN) to produce (S) 1-1-cyclohexyl-2-propyne-1-1-ol ((S) -CHP0) represented by Formula 4; 1)
- a method for producing 1-cyclohexyl 2-l-open pin is provided.
- a protein having a potent luponyl reductase activity selected from ScGRE2, ScYGD9, TdCRl or a mutant thereof, a microorganism producing the enzyme or protein, or a processed product of the microorganism is converted into 1-cyclo represented by Formula 3.
- Regeneration of NAD + or NADP + generated from NADH or NADPH in association with the above reduction reaction to NADH or NADPH depends on the ability of microorganisms to reduce NAD +, NADP + (glycolysis system, methylotroph C 1 compound utilization pathway, etc.) Can be performed. These NAD + and NADP + reducing ability can be enhanced by adding glucose, ethanol, etc. to the reaction system. Alternatively, the reaction can be carried out by adding a microorganism capable of producing NADH and NADPH from NAD + and NADP +, a processed product thereof, and an enzyme to the reaction system.
- NADPH can be regenerated.
- the components constituting the reaction necessary for the regeneration of NADH and NADPH can be added to the reaction system for producing the optically active alcohol according to the present invention, immobilized components can be added, or exchange of NADH and NADPH is possible. Contact can be made through a membrane.
- the present invention can include a step of culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide usable in the present invention.
- a step of culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide usable in the present invention when live cells of a microorganism transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention are used in the method for producing an optically active alcohol, an additional method for regenerating NADH and NADPH is required. In some cases, unnecessary reaction systems can be eliminated.
- an efficient reaction can be performed in a reduction reaction using a transformant without adding an enzyme for regenerating NADH and NADPH.
- genes such as glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, and organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase) that can be used for NADH and NADPH regeneration,
- glucose dehydrogenase alcohol dehydrogenase
- formate dehydrogenase amino acid dehydrogenase
- organic acid dehydrogenase malate dehydrogenase
- two or more of these genes can be introduced into a host by transforming the host with a recombinant vector in which the genes have been separately introduced into multiple vectors of different origins of replication.
- a method of introducing both genes into a single vector, a method of introducing both genes, or a method of introducing one gene into a chromosome can be used.
- the expression control region such as promoter and terminator must be linked to each gene, or expressed as an operon containing multiple cistrons such as the lactose operon. It is also possible.
- enzymes for regenerating NADH and NADPH Bacillus subtilis
- glucose dehydrogenase derived from Thermoplasma acidophilum are available.
- formate dehydrogenase derived from Mycopacterium 'pakje and its mutants can be suitably used.
- the reduction reaction using the enzyme of the present invention is carried out in an organic solvent that is hardly soluble in water or water, for example, ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane, methyl isobutyl ketone, methyl tertiary peptide.
- an organic solvent soluble in water such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, acetone, and dimethyl sulfoxide.
- the reaction of the present invention can be carried out using an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
- the reaction of the present invention is carried out at a reaction temperature of 4 to 60 ° C, preferably 10 to 40 ° C, pH 3 to 9, preferably pH 5 to 7, and a substrate concentration of 0.01 to 50%, preferably 0.1 to 10%. %, More preferably 0.1-5%.
- a reaction temperature 4 to 60 ° C, preferably 10 to 40 ° C, pH 3 to 9, preferably pH 5 to 7, and a substrate concentration of 0.01 to 50%, preferably 0.1 to 10%. %, More preferably 0.1-5%.
- propargyl ketone represented by the formula 1 as a substrate for the reaction of the present invention is generally unstable in water, particularly on the alkali side, it is desirable to carry out the reaction at a low temperature in a weakly acidic region.
- the reaction system may contain coenzyme NAD +, NADH, NADP + or NADPH at 0.001 mM 0 mM, preferably 0.101 to 10 mM can be added.
- the substrate can be added all at once at
- NADH and NADPH for regeneration of NADH and NADPH, for example, glucose when using glucose dehydrogenase, ethanol or isopropanol when using alcohol dehydrogenase, formic acid and amino acid dehydrogenation when using formate dehydrogenase
- Amino acids when using enzymes, malic acid when using malate dehydrogenase, and glycerol when using glycerol dehydrogenase are added to the reaction system. These compounds can be added in a molar ratio of 0.1 to 20 and preferably 1 to 5 times in excess with respect to the substrate ketone.
- enzymes for regenerating NADH and NADPH such as glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, malate dehydrogenase, and glycerol dehydrogenase, are used in the present invention. It can be added 0.1 to 100 times, preferably 0.5 to 20 times as much as the enzyme activity compared to NADH and NADPH-dependent enzymes.
- Propargyl ketone as a substrate can be synthesized, for example, by the method described in Literature. Org. Chem., 52, 2860 (1987).
- optically active propargyl alcohol produced by the reduction of propargyl ketone of the present invention can be purified by appropriately combining bacterial cells, protein, centrifugation, separation by membrane treatment, solvent extraction, distillation and the like.
- an organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, tonolen, hexane, benzene, methyl isobuty / leketone, methino-lethalate butynooleate is added directly to the reaction solution containing the microbial cells.
- Butanol, hexane, heptane and the like are added and extracted, and then concentrated under reduced pressure to obtain optically active propargyl alcohol.
- silica gel column chromatography, distillation, crystallization, etc. can be used to further purify the product.
- the cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli exhibited (R) -2-octanol oxidation activity in a NAD + -dependent manner, with a specific activity of 35.9 U / mg-protein.
- the measurement of CHPN reduction activity was performed at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADH, 1% dimethyl sulfoxide, 2 mM CHPN and enzyme. The decrease in absorbance at 340 nm due to the decrease in NADH was measured. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 ⁇ mol NADH per minute.
- the cell-free extract obtained from the recombinant Escherichia coli showed NADH-dependent CHPN reduction activity, and the specific activity was 8.01 U / mg protein.
- Glucose dehydrogenase activity was measured by reacting at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 2.5 mM NAD +, 100 mM D-glucose and enzyme. The increase in absorbance at 340 nm due to the increase in the absorbance was measured. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 mol NADH per minute.
- the specific activity of the cell-free extract obtained from recombinant E. coli was 1.18 U / mg protein.
- the transformed E. coli obtained in Example 1 was cultured in 50 mL of 2X YT medium (Dco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2). After induction of gene expression with ImM IPTG, cells were collected. One half of the obtained cells was diluted with 50 mL of 400 mM phosphate buffer (pH 6.5), 1% CHPN (73 mM), 1% dimethyl sulfoxide, 1.6% glucose (88 mM). In addition to the reaction solution, the reaction was started at 20 ° C with shaking. One hour after the start of the reaction, half of the collected cells was further added, and the reaction was continued overnight.
- 2X YT medium Dco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2. After induction of gene expression with ImM IPTG, cells were collected. One half
- the reaction solution prepared in Example 3 was extracted three times with 150 mL of hexane. A portion of this hexane extract was taken, and the conversion was measured by gas chromatography.
- FFAP 20% Chromosorb W (AW), 80-100 mesh (0.32 x 210 cm in diameter, Shinwa Kako) was used.
- the column chamber temperature and inlet temperature were 200 ° C
- the detector temperature was 230 ° C
- nitrogen was used as carrier gas
- a flame ionization detector was used for detection.
- the retention time of each compound was 5.0 minutes for CHPN and 8.5 minutes for CHP0. As a result of the quantification, the conversion was 100%.
- the organic layer was filtered to remove insoluble components, the solvent was distilled off under reduced pressure.
- the optical purity was measured by high performance liquid chromatography using an optical resolution column.
- CHIRALCEL 0D ⁇ 0.46 ⁇ 25 cm, Daicel Chemical Industries
- Column chamber temperature is 40.
- elution was hexane 2-propanol (97/3, flow rate 1 mL / min), and detection wavelength was 220 nm.
- the retention time of each enantiomer was 13.0 minutes for the (S) form and 14.9 minutes for the (R) form.
- the optical purity of the product was 100% ee (S).
- the cell-free extract obtained in Example 6 was measured.
- the cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli showed (R) -2-octanol oxidation activity in a NAD + -dependent manner, with a specific activity of 18.2 U / mg-protein.
- the formate dehydrogenase activity was measured at 30 ° C. in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 2.5 mM to 100 mM sodium formate, and the enzyme. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 / Z mol of NADH per minute.
- the specific activity of the cell-free extract obtained from the recombinant E. coli was 1.11 U / mg protein.
- Example 8 Synthesis of (S) -CHP0 by Pichia-Finlandi-derived (R) -2-octanol dehydrogenase and formate dehydrogenase from Mycobacterium pakae Transformation obtained in Example 6 Cultured Escherichia coli in 50 mL of 2X YT medium (Dif Co-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / NaCl 10 g / pH 7.2), and induced gene expression with 0.1 mM IPTG After that, the cells were collected.
- 2X YT medium Dif Co-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / NaCl 10 g / pH 7.2
- One half of the obtained cells was diluted with 400 mM phosphate buffer (pH 6.5), 1% CHPN (73 mM), 1% dimethyl sulfoxide, 1.6% glucose (88 mM), 1 mM NAD + was added to 25 mL of the reaction solution, and the reaction was continued at 20 ° C with shaking.
- the reaction solution was extracted twice with 75 mL of ethyl acetate, and quantitatively determined by gas chromatography. As a result, the conversion was 84%.
- Saccharomyces cerevisiae X2180-IB (Yeast Genetic Stock Center) was cultured in YM medium to prepare cells. Purification of chromosomal DNA from the cells was performed by the method described in Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975).
- Y0L-ATG1 GACACATGTCAGTTTTTGTTTCAGGTGCTAAC
- Y0L-XbaIF CTGTCTAGAGGAGAATCGTGACTCTGTAAAATTC SEQ ID NO: 12
- Y0L-TAA1 GTCGAATTCCTCTATTAAATACGGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGGAG
- the amplification product was treated with phenol, it was double-digested with restriction enzymes BspLUllI and Xbal, and the obtained fragment was purified.
- primers Y0L-XbalF and Y0L-TAA1 were added to each of 25 pmo1, dNTP10 nmo1, Saccharomyces cerevisiae-derived chromosomal DNA 50 ng, Pfu DNA polymerase buffer (manufactured by STRATAGENE), Pfu DNA polymerase 2 U Using a 50 reaction mixture containing (STRATAGENE), denaturation (95 ° C, 45 seconds), anneal (55 ° C, 30 seconds), elongation (72 ° C, 1 minute 20 seconds) ) For 30 cycles using GeneAmp PCR System 2400 (manufactured by PerkinElmer), and specific amplification products were obtained.
- the obtained two PCR-amplified DNA fragments digested with the restriction enzymes were ligated with a vector pSE420D (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-189170) that was double-digested with restriction enzymes Ncol and EcoRI and a TAKARA Ligation Kit.
- Escherichia coli JM109 strain was transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the plasmid was purified from the resulting transformant by FlexiPrep.
- FlexiPrep As a result of analyzing the nucleotide sequence of the inserted DNA portion of the obtained plasmid, it was completely identical to the nucleotide sequence registered in DDBJ except for the primer portion.
- plasmid was designated as pSE-Y0L1.
- Figure 1 shows the process of plasmid construction. Construction of Example 1 1] Plasmid P SG- SCR1 coexpressing glucose dehydrogenase gene derived from Karuponiru reductase ScGRE2 and Bacillus subtilis
- PSE-Y0L1 was double-digested with Nhel and Csp45I, and a DNA fragment consisting of 719 bp was purified. Further, the plasmid was double digested with Csp45I and EcoRI to purify a 469 bp DNA fragment. Plasmid pSE-BSGl containing the glucose dehydrogenase gene from Bacillus subtilis
- E. coli HB101 E. coli HB101 (pSG-SCRl)
- pSG-SCR1 obtained in Example 11
- IPTG IPTG
- the cells were crushed with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio), and the supernatant was centrifuged to obtain a cell-free extract.
- Example 12 Using the cell-free extract obtained in Example 12, the enzyme activity was measured. The measurement of CHPN reduction activity was performed at 25 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 2 mM CHPN, l ° / o dimethyl sulfoxide and enzyme. Reacted. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 ⁇ MDH per minute.
- the cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli showed CHDP reduction activity in a NADPH-dependent manner, and its specific activity was 10.8 U / mg-extract. W
- the reaction solution prepared in Example 14 was extracted with twice the volume of ethyl acetate.
- the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was dissolved in 1-fold volume of hexane / 2-propanol (97/3).
- the optical purity of this sample was measured using high performance liquid chromatography using an optical resolution column. The analysis was performed by the method described in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.8% ee (R).
- Example 14 Using the sample prepared in Example 14, the conversion rate was measured by gas chromatography according to the method described in Example 4. The conversion rate calculated from the peak area was 28.4%.
- the amplified product was double-digested with the restriction enzymes BspHI and Nhel, and ligated with the vector pSE420D, which was double-digested with the restriction enzymes Ncol and Xbal, using the TAKARA Ligation Kit.
- Escherichia coli strain J1109 was transformed with the ligated DNA, grown in an LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and plasmid was purified from the resulting transformant by FlexiPrep.
- the nucleotide sequence of the inserted DNA portion of the plasmid was analyzed, and the results are shown in SEQ ID NO: 15. The obtained nucleotide sequence completely matched the nucleotide sequence registered in DDBJ.
- the obtained plasmid was designated as pSE-YGD9.
- PSE-YGD9 is double-digested with two restriction enzymes, EcoRI and Hindlll, and glucose dehydrated from the plasmid pSE-BSG1 (JP-A-2000-189170) containing the glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis.
- the DNA fragment containing the gene was ligated with Takara Ligation Kit.
- Escherichia coli JM109 strain was transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the plasmid was purified from the resulting transformant by FlexiPrep, and glucose dehydrogenase and YGL039w were simultaneously purified. to obtain a P SG-YGD9 is expressible plasmids.
- E. coli HB101 strain E. coli HB101 (pSG-YGD9) transformed with pSG-YGD9 obtained in Example 17 was cultured overnight in an LB medium containing 50 mg / L of ampicillin. It was added to induce gene expression, and the cells were further cultured for 4 hours. After collecting the obtained cells, the cells were broken with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (Cosmo Bio) and centrifuged. Clarified as cell-free extract
- Example 18 Using the cell-free extract obtained in Example 18, the enzyme activity was measured according to the method of Example 13.
- the cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli showed CHDP reduction activity in a NADPH-dependent manner, and its specific activity was 22.7 U / mg-extract.
- reaction solution containing 1 U of the enzyme solution was reacted at 25 ° C. with shaking.
- the optical purity of the reaction solution prepared in Example 20 was measured in the same manner as in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.3% ee (R).
- Example 20 Using the sample prepared in Example 20, the conversion was measured in the same manner as in Example 4. As a result, the conversion rate calculated from the peak area was 11.6%.
- the obtained PCR product was recovered as ethanol precipitate after phenol-chloroform extraction. After digestion of Td-PCR2 with Xbal, agarose gel electrophoresis was performed to cut out the target band, which was then purified using Sephaglas BandPrep Kit (Pharmacia).
- the restriction enzyme-digested Td-PCR2 was ligated with pUC18 (manufactured by Takara Shuzo) digested with Xbal using Takara Ligation Kit to transform Escherichia coli JM109 strain.
- the transformed strain was grown on LB medium containing ampicillin, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was analyzed.
- the plasmid obtained here was designated as pUC-TDX.
- the plasmid pUC-TDX is digested with the restriction enzyme Xbal, precipitated with ethanol, and subjected to agarose gel electrophoresis to cut out a band of about 0.8 bp containing a part of the TdCRl gene. Purification and recovery by SephaglasBandPrep (Amersham Pharmacia Biotech) did. The obtained DNA fragment was digested with the same restriction enzymes, treated with alkaline phosphatase, and then subjected to phenol extraction, phenol-chloroform extraction, chloroform extraction, ethanol-precipitated plasmid pSG-TDX, and TaKaRa Ligation Kit. And ligated.
- Escherichia coli JM109 strain was transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and plasmid was purified from the resulting transformant by FlexiPrep.
- pSG-TDRl a plasmid capable of simultaneously expressing glucose dehydrogenase and TdCRl, was obtained.
- E. coli HB101 strain E. coli HB101 (pSG-TDRl) transformed with pSG-TDRl obtained in Example 23 was cultured overnight in an LB medium containing 50 mg / L of ampicillin. It was added to induce gene expression, and the cells were further cultured for 4 hours. After collecting the obtained cells, the cells were cleaved with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio), and the supernatant was centrifuged to obtain a cell-free extract.
- UCD-200TM manufactured by Cosmo Bio
- Example 24 the enzyme activity was measured according to the method of Example 13.
- the cell-free extract obtained from the recombinant Escherichia coli showed NADPH-dependent CHPN reduction activity, and the specific activity was 5.7 U / mg-protein.
- reaction solution containing 0.5 U of the TdCRl enzyme solution was reacted at 25 ° C. with shaking.
- the optical purity of the reaction solution prepared in Example 26 was measured in the same manner as in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.7% ee (R).
- Example 26 Using the sample prepared in Example 26, the conversion was measured in the same manner as in Example 4. As a result, the conversion rate calculated from the peak area was 9.0%. Industrial applicability
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Abstract
本発明の目的は、医薬品合成の中間体として有用な光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法を提供することである。本発明によれば、２級アルコール脱水素酵素又はカルボニル還元酵素を用いて、プロパルギルケトンを不斉還元し、光学活性プロパルギルアルコールを製造する。
Description
明細書
光学活性プロパルギルアルコールの製造方法 技術分野
本発明は、 各種医薬品の光学活性原料として、 特に、 プロスタグランジン系化 合物に必須な ω側鎖の原料として有用な光学活性プロパルギルアルコールを製造 する方法に関する。 背景技術
本明細書に定義する式 2もしくは式 5で示される光学活性プロパルギルアルコ ールの製造方法としては、
(1) 式 2もしくは式 5で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物を フタル酸モノエステルとして光学活性アミンを光学分割剤として分割する方法 (J. Am. Chem. Soc.， 94, 7827 (1972)) 、
(2) 式 2もしくは式 5で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物の エステルをリパーゼ又はパン酵母などを用いた加水分解反応により反応速度論的 分割を行い、 光学活性プロパルギルアルコールを得る方法 （特開平 3— 2 5 90 94号公報） 、
(3) 式 2もしくは式 5で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物を 光学分割カラムにより分割し、 光学活性プロパルギルアルコールを得る方法 （特 開 200 3— 6400 9号公報） 、
(4) 本明細書に定義する式 1で示されるプロパルギルケトンを不斉還元触媒を 用いて不斉還元する方法 (J. Am. Chem. Soc.， 101, 5843 (1979)) 、
(5)式 1で示されるプロパルギルケトンを微生物により不斉還元する方法 （J. Am. Chem. Soc, 97, 865 (1975)) 、
(6)式 1で示されるプロパルギルケトンの α -ハロゲン置換体をラタトバチルス {Lactobacillus) 由来のアルコール脱水素酵素を用いて不斉還元し、 光学活性な
W α -ハロゲン置換されたプロパルギルアルコールを得る方法 (WO 0 2 / 6 4 5 7 9号公報） 、
( 7 ) γ—ヨウ化ァリルアルコールをシャープレス光学分割法によって光学活性 γ—ョゥ化ァリルアルコールを得、脱ョゥ化水素を経て光学活性プロパルギルァ ルコールを得る方法 (Tetrahedron Lett. , 30, 7083 (1989) ) 、
などが知られている。
しかしながら、 （1 ) の方法は低収率でかつ高価な分割剤が必要である、 （2 ) の方法は光学純度が低い、 未反応のエステルと加水分割されたアルコールの分離 が困難である、 （3 ) の方法は高価な光学分割カラムが必要であり、 （4 ) の方 法は高価な不斉還元触媒が必要、 極低温が必要、 （5 ) の方法は収率、 光学純度 共に低い、 （6 ) の方法は生産性が低い、 （7 ) の方法は高価な分割剤が必要か つ工程が複雑、など工業的な製造方法としては問題がある。 発明の開示
本発明は、 式 2もしくは式 5で示される光学活性プロパルギルアルコール、 と りわけ、 式 4で示される （S ) — 1ーシクロへキシルー 2—プロピン一 1ーォー ルもしくは式 6で示される （R) — 1ーシクロへキシルー 2—プロピン一 1—ォ ールの製造において、 光学純度の高い生成物を収率良く与えることができる製造 方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、理論収率が 5 0 %を越えない分割手法ではなく、原料を 1 0 0 % 利用可能な、 プロパルギルケトンを立体選択性の高い酵素を利用して不斉還元反 応により高い光学純度の光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法を検討 した。
式 1の Rがシク口へキシル基である 1ーシクロへキシルプロピノン
(1-cyclohexylpropynone,以下 CHPNと略す）を基質として多くの力ルポ二ルを不 斉還元する酵素を用い、 1ーシクロへキシノレ一 2一プロピン一 1ーォーノレ (1 - cyclohexyl- 2- propyn- 1- ol、以下 CHP0と略す）合成を検討した結果、ピキア ·
フィンランディ力 Pichia finlandica) 由来の （R) — 2—ォクタノール脱水素 酵素 （配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質） が （S) - CHP0を生 成し、 サッカロマイセス 'セレビジェ {Saccharomyces cerevisiae) 由来の力ノレポ ニル還元酵素 ScGRE2 (配列番号 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質） 及び ScYGD9 (配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、並びにト ノレラスポラ 'テノレブレッキー ( Torulaspora delbrueckii) 由来のカノレポエノレ還元 酵素 TdCRl (配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質） がいずれも (R)-CHPOを 9 9 % e e以上の極めて高い立体選択性で生成することを見いだし、 本宪明を完成するに至った。
(R) 一 2 _ォクタノール脱水素酵素は、ァセト酢酸ェチルを不斉還元し、 （R) 一 3—ヒドロキシ酪酸ェチルを生成することが知られているが （WO0 1/6 1 0 1 4号公報） 、 CHPNに対して活性を有するか否か、 どの程度の立体選択性を持 つて還元するか、 いずれの立体を生成するかは予測不可能であり、 9 9%e e以 上の高い選択性で (S) - CHP0を生成したことは驚くべき結果であった。
同様に、 ScGRE2 (J. Org. Chem. 63， 4996-5000 (1998)) 、 ScYGD9及び TdCRl (いずれも特願 200 3— 1 1 340 2号）は、ァセト酢酸ェチルを不斉還元し、 (S) _ 3—ヒドロキシ酪酸ェチルを生成することが報告されているが、 （R) 一 2—ォクタノール脱水素酵素の場合と同様、 CHPNに対して活性を有するか否力、 どの程度の立体選択性を持つて還元するか、 いずれの立体を生成するかは予測不 可能であり、 9 9 % e e以上の高い選択性で (R)- CHP0を生成したことは驚くべき 結果であった。 例えば、 キャンディダ 'パラプシロシス由来の （S) 特異的 2級ァ ルコール脱水素酵素 （特開平 0 7— 2 3 1 78 5号公報） は、 ァセト酢酸ェチル を不斉還元し、 （S) — 3—ヒドロキシ酪酸ェチルを生成することが報告されて いるが、 CHPNに対して実質的に活性を示さなかった。また、 TdCRlに対して 6 1% のホモロジ一を有する ScYDRl (特願 2003— 1 1 340 2号） もまた、 CHPN に対して実質的に活性を有しなかった。
また、上記反応に付随して NADHから生成する NAD+の NADHへの再生、及び、 NADPH
から生成する NADPHの NADP+への再生は、 例えばダルコース脱水素酵素、 ギ酸脱 水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素などに よって行うことができるが、 本発明者らは、 これらの遺伝子を本発明で用いるァ ルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素をコードする DNAと同時に宿主 に導入することによって、 アルコール脱水素酵素もしくはカルボニル酵素と NAD (P) H再生酵素を同時に発現し、 該形質転換株またはその処理物を用レ、て還元 反応を行うことにより、 より効率的に光学活性プロパルギルアルコール誘導体を 製造できることを見いだした。
即ち、 本発明によれば、 以下の発明が提供される。
( 1 ) 下記 （a ) から （e ) ；
( a ) 配列番号 1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチド；
( c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、揷入および/または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プ 口パルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポ リヌクレオチド；
( d ) 配列番号 1に記載された塩基配列からなる D N Aとストリンジ ントな条 件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示されるプロパル ギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プロパルギルアルコール誘 導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
( e ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示され る光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質を コードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ
ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式 1
(式中、 Rは、 C 1一 C 1 0の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアル キル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいは C 6 - C 2 0のァリール基を表 す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式 2 ：
0H
式 2
(式中、 Rは、 式 1の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、 光学 活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
( 2 ) 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体が式 3 ：
(3) (a) から （e) のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質を、 対応する補酵素、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チド（NADH)もしくは還元型ニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸
(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは 該形質転換株の処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトンを還元し、 式 2で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、 （1) 又は （2) に記載の方法。
(4) NADHもしくは NADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵 素若しくはギ酸脱水素酵素である、 （3) に記載の方法。
(5) 下記 （a) から （e) ；
( a ) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレオチド；
(c) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数の ァミノ酸が置換、欠失、揷入およぴ /または付加したアミノ酸からなるタンパク質 であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される 光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコ
(d) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジ ヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示され るプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルァ ルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド；又は
( e ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列と 70 %以上の相同性を有す るアミノ酸配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式
5で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタ ンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式 1 ：
式 1
(式中、 Rは、 C 1一 C 1 0の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアル キル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいは C 6— C 2 0のァリール基を表 す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式 5 ：
(式中、 Rは、 式 1の場合と同義である）
で示される光学活性プ口パルギルアルコール誘導体を製造することを含む、 光学 活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
( 6 ) 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体が式 3 ：
式 3 で示される 1—シクロへキシルー 2—プロピン一 1一オンであり、 式 5で示され る光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式 6 ：
式 6 で示される（R) - 1ーシク口へキシルー 2—プロピン一 1一オールである、 （5) に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
(7) (a) から （e) のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質を、 対応する捕酵素、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チド (NADH)もしくは還元型ニコチンァミ ドアデニンジヌクレオチドリン酸
(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは 該形質転換株の処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトンを還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、 （5) 又は （6) に記載の方法。
(8) NADHもしくは NADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵 素若しくはギ酸脱水素酵素である、 （7) に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 ScGRE2発現プラスミ ド PSE- Y0L1の構築を示す。
図 2は、 ScGRE2及びバチルス 'サブチリス由来のグルコース脱水素酵素との共 発現プラスミ ド pSG- SCR1の構築を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 下記 ) から （e) ；
( a ) 配列番号 1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチド；
(c) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が
置換、欠失、揷入および または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プ 口パルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポ リヌクレオチド；
( d ) 配列番号 1に記載された塩基配列からなる D NAとストリンジェントな条 件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示されるプロパル ギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プロパルギルアルコール誘 導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
( e ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示され る光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質を コードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プ 口パルギルアルコール誘導体を製造する方法に関するものである。
配列番号 2に記載の蛋白質としては、 例えば、 ピキア ·フィンランディ力由来 の （R)- 2 -ォクタノール脱水素酵素が挙げられる。 該酵素は、 WO O 1 Z 6 1 0 1 4号公報に記載の方法により、 ピキア 'フィンランディ力の菌体より調製する ことができる。 ピキア ' フィンランディ力としては、特に、 ピキア'フィンランデ イカ DSM 70280株が好適に利用できる。また、ピキア'フィンランディ力 DSM 70280 株由来の （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素のアミノ酸配列である配列番号 2 に記載のタンパク質をコードする D NAを、 ピキア'フィンランディ力 DSM 70280 株などからクローニングし、 若しくは配列番号 2に記載のァミノ酸配列をコード する D N Aを化学合成し、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入 した組換え体を用いて、 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素を発現し、 組換え 体より該酵素を得ることもできる。
本発明で用いる （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素の酵素活性の測定は次の ように確認することができる。 100 mM トリス一塩酸緩衝液 (pH 9. 0) 、 2. 5 酸 化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド、 5 mM (R) 一 2—ォクタノール及 ぴ酵素を含む反応液中、 30°Cで反応させ、 NADHの増加に由来する 3 4 0 n mの吸 光度の増加を測定する。 1 Uは、 1分間に Ι μ ηιοΐの NADH の生成を触媒する酵素 量とした。
さらに本発明は、 下記 （a ) から （e ) ；
( a ) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレオチド；
( c ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数の ァミノ酸が置換、欠失、揷入およぴ /または付加したアミノ酸からなるタンパク質 であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される 光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド；
( d ) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列からなる D NAとス トリンジ ヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示され るプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルァ ルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド；又は
( e ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有す るアミノ酸配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタ ンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プ
口パルギルアルコール誘導体を製造する方法に関するものである。
本発明で利用されるカルボ-ル還元酵素 ScGRE2は、 J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998)に記載の方法によりパン酵母より調製することができる。また、 サッカロマイセス.セレビジェ由来の ScGRE2をコードする配列番号 3に記載の 脆を、 サッカロマイセス 'セレビジェ （例えば X2180- 1B株） （Yeast Genetic Stock Center)などから PCRなどによりクローユングし、大腸菌など異種の宿主に 発現可能な形態において導入した組換え体を用いて ScGRE2を発現し、組換え体よ り該酵素を得ることもできる。
本発明で用いる SGGRE2の酵素活性の測定は次のように確認することができる。 100 mM リン酸カリゥム緩衝液 ( H 6. 5) 、 0. 2 mM還元型-コチンアミ ドアデニ ンジヌクレオチドリン酸 （以下、 NADPH と略す） 、 20 mM ァセト酢酸ェチル及ぴ 酵素を含む反応液中で 30°Cで反応させ、 NADPHの減少に由来する 340nmの吸光度 の減少を測定する。 1Uは、 1分間に Ι μ ηιοΐの NADPH の減少を触媒する酵素量と した。
本発明で利用されるカルボニル還元酵素 ScYGD9は、 サッカロマイセス 'セレビ ジェ由来の ScYGD9をコードする配列番号 5に記載の D N Aを、例えば、特願 2 0 0 3— 1 1 3 4 0 2号に記載の方法などにより、 サッカロマイセス 'セレビジェ
(例えば X2180- 1B株） (Yeast Genetic Stock Center) などから PCRなどにより クローユングし、 大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換 え体を用いて ScYGD9を発現し、組換え体より該酵素を得ることにより調製できる。 本発明で用いる ScYGD9の酵素活性は、 ScGRE2と同じ方法により確認することが できる。
本発明で利用されるカルボニル還元酵素 TdCRlは、 特願 2 0 0 3— 1 1 3 4 0 2に記載の方法により トルラスポラ'デルプレッキー （ Torulaspora
delbrueckii) より調製することができる。 また、 トルラスポラ'デルプレッキー 由来の TdCRlをコードする配列番号 7に記載の DNAを、トルラスポラ.デルプレツ キー （例えば IF0 0381株） などから PCRなどによりクローニングし、 大腸菌な
ど異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いて TdCRlを発現 し、 組換え体より該酵素を得ることもできる。
本発明による TdCRlの酵素活性の測定は次のように確認することができる。 100 mM リン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5) 、 0. 2 mM NADPH、 5 mM 3， 4 -ジメ トキシフエ 二ルァセトン及び酵素を含む反応液中で 30°Cで反応させ、 NADPHの減少に由来す る 3 4 0 n mの吸光度の減少を測定する。 1 Uは、 1分間に l /z molの NADPHの減 少を触媒する酵素量とした。
上記酵母（サッカロマイセス 'セレビジェ、 トルラスボラ'デルプレッキー）は、 YM培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養される。十分に增殖させ た後に菌体を回収し、 2—メルカプトェタノールゃフエニルメタンフルホニルフ ルォリ ド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽 出液とする。 無細胞抽出液から、 タンパク質の溶解度による分画 （有機溶媒によ る沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、 疎水性クロマトグラフィーや、 キレート、 色素、 抗体などを用いたアブイ-ティ 一クロマトグラフィ一などを適宜組み合わせることにより精製することができる c 例えば、 フエ-ルーセファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、 M o n o Q を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、 ブチルーセファロースを用いた疎水 クロマトグラフィー、 ハイドロキシァパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー 等を経て電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。
本発明における 1もしくは複数 （好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および /または付加されたアミノ酸配列は、 配列番号 1、 3、 5又は 7に記載のポリヌ クレオチドに部位特異的変異導入法 （Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982) ， Methods in Enzymol. 100， pp. 448 (1983)， Molecular Cloning 2ndEdt.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)， PGR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991) ) などを用いて、 適宜置換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付加などの変異 を導入することにより得ることが可能である。
本発明におけるポリヌクレオチドのホモログとは、 配列番号 2、 4、 6又は 8 に示されるアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %、 好ましくは少なくとも 8 0 %、 より 好ましくは 9 0 %以上のホモロジ一を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドを含む。 タンパク質のホモロジ一検索は、 例えば SWISS- PR0T， PIR，DADな どのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、 EMBL、 あるいは Gene-Bankなどの DNA配列に関するデータベース、 DNA配列を元にした予想ァミノ 酸配列に関するデータベースなどを対象に、 BLAST, FASTAなどのプログラムを利 用して、 例えば、 インターネットを通じて行うことができる。 本発明のホモロジ 一とは、 例えば、 BLASTプログラムを用いて identity で示される数値を指す。 本発明における配列番号 1、 3、 5又は 7に示される塩基配列からなるポリヌ クレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチド とは、いずれかのポリヌクレオチド配列番号に記載中の任意の少なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 3 0個、 例えば 4 0、 6 0または 1 0 0個の連続した配列 を一つまたは複数選択した D NAをプローブ D N Aとし、 例えば ECL direct nucleic acia labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社 製）を用いて、 マニュアルに記載の条件 （例えば、 wash： 42°C、 0. 5x SSCを含む primary wash buffer) において、 ハイブリダイズするポリヌクレオチドを示す。 より具体的な 「ストリンジヱントな条件」 とは、 例えば、 通常、 42。C、 2 X SSC、 0. 1%SDSの条件であり、 好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0. 1%SDSの条件であり、 さ らに好ましくは、 65°C、 0. 1 X SSCおよび 0. 1%SDSの条件であるが、 これらの条 件に特に制限されない。 ハイブリダィゼーシヨンのス トリンジエンシーに影響す る要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら 要素を適宜選択することで最適なストリンジエンシーを実現することが可能であ る。
本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素又はカルボニル還元酵素をコ ードするポリヌクレオチドを、 公知の発現ベクターに挿入することにより、 各酵 素の発現ベクターが提供される。 また、 この発現ベクターで形質転換した形質転
換体を培養することにより、 本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素、 カルボ-ル還元酵素を組換え体から得ることができる。 本発明においてアルコー ル脱水素酵素、 カルポニル還元酵素を発現させるために、 形質転換の対象となる 微生物は、 それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター により形質転換され、 それぞれの酵素活性を発現することができる生物であれば 特に制限はない。 利用可能な微生物としては、 例えば以下のような微生物を示す ことができる。
ェシエリヒア（Escherichia)属、 パチノレス（Bacillus)属、 シユードモナス (Pseudomonas)属、セラチア（Serratia)属、ブレビノくクテリゥム（Brevibacterium) 属、 コリネバタテリィゥム（Corynebacterium)属、 ストレプトコッカス
(Streptococcus)属、 及びラタトバチノレス（Lactobacillus)属など宿主ベクター系 の開発されている細菌；
ロ ドコッカス（Rhodococcus)属、及ぴストレプトマイセス（Streptomyces)属など 宿主ベクター系の開発されている放線菌；
サッカロマィセス (Saccharomyces)属、クライべロマイセス (Kluyveromyces)属、 シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces)属、 チゴサッカロマイセス
(Zygosaccharomycesノ属、 ャロウ ァ (Yarrowia)禹、 トリコスホロン
(Trichosporon)属、 ロ ドスポジジゥム（Rhodosporidium)属、 ピキア（Pichia)属、 及ぴキヤンディダ (Candida)属などの宿主べクタ一系の開発されている酵母； ノイロスポラ（Neurospora)属、ァスペルギノレス（Aspergillus)属、セファロスポ リゥム（Cephalosporium)属、及びトリコデノレマ（Trichoderma)属などの宿主べクタ 一系の開発されているカビ：
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築 は、 分子生物学、 生物工学、 遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準 じて行うことができる（例えば、 Sambrookら、モレキュラー ·クロー-ング、 Cold Spring Harbor Laboratories) 。 微生物中などにおいて、 本発明で用いる NADPH を電子供与体とする力ルポニル還元酵素遺伝子を発現させるためには、 まず微生
物中において安定に存在するプラスミ ドベクターやファージベクター中にこの
DNAを導入し、 その遺伝情報を転写 ·翻訳させる必要がある。 そのためには、 転 写 ·翻訳を制御するュニットにあたるプロモーターを本発明の DNA鎖の 5' -側上 流に、より好ましくはターミネータ一を 3' -側下流に、それぞれ組み込めばよい。 このプロモーター、 ターミネータ一としては、 宿主として利用する微生物中にお いて機能することが知られているプロモーター、 ターミネータ一を用いる必要が ある。 これら各種微生物において利用可能なベクター、 プロモーター、 ターミネ 一ターなどに関して 「微生物学基礎講座 · 8遺伝子工学 ·共立出版」 、 特に酵母に 関しては、 Adv. Biochem. Eng. 43, 75—102 (1990)、 Yeast 8， 423—488 (1992)、 などに詳細に記述されている。
また、 微生物以外でも、 植物、 動物において様々な宿主 ·ベクター系が開発さ れており、 特に蚕を用いた昆虫 （Nature 315, 592-594 (1985) ) や菜種、 トウモ 口コシ、 ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発 されており、 好適に利用できる。
本明細書に記載の式 2もしくは式 5に示される光学活性プロパルギルアルコー ル誘導体の製造の好ましい態様においては、 酵素分子、 その処理物、 酵素分子を 含む培養物、 あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応溶液と接触さ せることにより、 目的とする酵素反応を行わせることによって、 光学活性プロパ ルギルアルコール誘導体の製造を行うことができる。 なお、 酵素と反応溶液の接 触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
本発明におけるアルコール脱水素酵素も.しくはカルボニル還元酵素を含む微生 物の処理物には、 具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって 細胞膜の透過性を変化させた微生物、 あるいはガラスビーズや酵素処理によって 菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
本発明における式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体において、 Rは、 C 1 - C 1 0の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニ ル基又はアルキニル基、 あるいは C 6— C 2 0のァリール基を表す。 Rとしては
例えば、 メチノレ、 ェチノレ、 プロピノレ、 プチノレ、 ペンチノレ、 へキシノレ、 へプチノレ、 ォクチル、 ノエル、 デシル、 イソプロピル、 イソプチル、 t -プチル、 2—メチル ペンチノレ、 3ーメチノレへキシノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロペン チルメチル、 シクロへキシルメチル、 フエニルなどが挙げられ、 これらの置換基 は更に、 塩素、 臭素、 ヨウ素、 トリアルキルシリル、 トリアルキル錫などにより 置換されていてもよい。
本発明の好ましい態様においては、 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素活性 を有するタンパク質、 該酵素またはタンパク質を産生する微生物、 もしくは該微 生物の処理物を式 3に示される 1—シクロへキシルプロピノン （CHPN) に作用さ せ、 式 4に示される ( S ) 一 1—シク口へキシルー 2—プロピン一 1一オール ( (S) - CHP0)を製造することを特徴とする、 （S ) — 1—シクロへキシルー 2—プ 口ピン一 1一オールの製造方法が提供される。 また、 ScGRE2， ScYGD9、 TdCRl又 はそれらの変異体から選択される力ルポニル還元酵素活性を有するタンパク質、 該酵素またはタンパク質を産生する微生物、 もしくは該微生物の処理物を式 3に 示される 1ーシクロへキシルプロピノン （CHPN) に作用させ、 式 6に示される
(R)— 1ーシク口へキシルー 2—プロピン一 1—オール （（R) - CHP0)を製造する ことを特徴とする、 （R) — 1—シクロへキシル一2—プロピン一 1一オールの 製造方法が提供される。
上記還元反応に付随して NADHもしくは NADPHから生成する NAD+もしくは NADP +の、 NADHもしくは NADPHへの再生は、微生物の持つ NAD+， NADP+還元能（解糖系、 メチロトローフの C 1化合物資化経路など） を用いて行うことができる。 これら NAD+, NADP+還元能は、反応系にグルコースやエタノールなどを添加することによ り増強することが可能である。 また、 NAD+, NADP+から NADH, NADPHを生成する能 力を有する微生物やその処理物、 酵素を反応系に添加することによつても行うこ とができる。 例えば、 グルコース脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、 ギ酸脱水 素酵素、 アミノ酸脱水素酵素、 有機酸脱水素酵素 （リンゴ酸脱水素酵素など） な どを含む微生物、 その処理物、 ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いて NADH
もしくは NADPHの再生を行うことができる。 これらの NADH， NADPH再生に必要な 反応を構成する成分は、 本発明による光学活性アルコールの製造のための反応系 に添加する、 固定化したものを添加する、 あるいは NADH、 NADPHの交換が可能な 膜を介して接触させることができる。
また本発明は、 本発明に利用可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む ことができる。 本方法において、 本発明のポリヌクレオチドを含む組換えべクタ 一で形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アルコールの製造方法に利用す る場合には、 NADH， NADPH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合があ る。 すなわち、 NADH, NADPH再生活性の高い微生物を宿主として用いることによ り、 形質転換体を用いた還元反応において、 NADH， NADPH再生用の酵素を添加す ることなく効率的な反応が行える。 さらに、 NADH、 NADPH再生に利用可能なグル コース脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、 ギ酸脱水素酵素、 アミノ酸脱水素酵 素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明の NADH もしくは NADPH依存性アルコール脱水素酵素もしくはカルポニル還元酵素をコー ドする DNAと同時に宿主に導入することによって、 より効率的な NADH, NADPH再 生酵素と NADPH依存性カルポニル還元酵素の発現、 還元反応を行うことも可能で ある。 これらの 2つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、 不和合性を 避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換 えベクターにより宿主を形質転換する方法や、 単一のベクターに両遺伝子を導入 する方法、 両方、 もしくは、 片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用 することができる。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、 プロモーター、 ターミ ネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクト ースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも 可能である。
例えば、 NADH及ぴ NADPH再生用酵素として、 バシラス ·サブチルス （Bacillus
subtilis) やサーモプラズマ 'ァシドフィラム （Thermoplasma acidophilum) に 由来するグルコース脱水素酵素が利用可能である。また、 NADH再生用酵素として、 マイコパクテリゥム'パッカェ由来のギ酸脱水素酵素およぴその変異体が好適に 利用可能である。
具体的には、 （S)- CHP0合成には、 ピキア'フィンランディ力由来の （R) —2 ーォクタノール脱水素酵素の遺伝子とマイコパクテリゥム 'パッカェ由来のギ酸 脱水素酵素の遺伝子を共に導入した共発現プラスミ ド、 PSF-PF02 (WO01/6 1014号公報） や、 バシラス 'サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を 共に導入した共発現プラスミ ド pSG- PF01 (WOO 1/6 1014号公報） 、 PSG-PF02 (WO 01/6 1014号公報） が挙げられる。 また、 （R) - CHP0合成 には、 ScGRE2、 ScYGD9 TdCRlのいずれかのカルポニル還元酵素の遺伝子とバシ ラス ·サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラス ミ ド (それぞれ、 pSG-YOLl (本発明実施例に記載）， pSG-YGD9 (特願 2003- 113402) , pSG - TDR1 (特願 2003 - 113402)) が挙げられる。
本発明の酵素を用いた還元反応は、 水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、 例えば、 酢酸ェチル、 酢酸ブチル、 トルエン、 クロ口ホルム、 n—へキサン、 メ チルイソブチルケトン、 メチルターシャリ一プチルエステルなどの有機溶媒中、 もしくは、 水性媒体との 2相系、 もしくは水に溶解する有機溶媒、 例えば、 メタ ノール、 エタノール、 イソプロピルアルコール、 ァセトニトリル、 アセトン、 ジ メチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。 本発明の反応は、 固定化酵素、 膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明の反応は、反応温度 4一 60 °C、好ましくは 10— 40 °C、 p H 3 _ 9、 好ましくは pH5— 7、 基質濃度 0. 01— 50%、 好ましくは 0. 1— 10%、 さらに好ましくは 0. 1— 5%で行うことができる。 本発明の反応の基質である 式 1に示されるプロパルギルケトンは一般に水中、 特に、 アルカリ側で不安定な ため、 反応は弱酸性領域で低い温度で実施することが望ましい。 また、 反応系に は必要に応じて補酵素 NAD+, NADH, NADP+もしくは NADPHが 0. 001 mM— 10
0 mM、 好ましくは、 0 · 0 1— 1 0 mM添加できる。 また、 基質は反応開始時に 一括して添加することも可能であるが、 反応液中の基質濃度が高くなりすぎない ように連続的、 もしくは非連続的に添加することが望ましい。
NADH, NADPHの再生のために、 例えば、 グルコース脱水素酵素を利用する場合 のグルコース、 アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソ プロパノール、 ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、 アミノ酸脱水素酵素を利 用する場合のアミノ酸、 リンゴ酸脱水素酵素を利用する場合のリンゴ酸、 グリセ ロール脱水素酵素を利用する場合のグリセロールなどが反応系に添加される。 こ れらの化合物は、 基質ケトンに対してモル比で 0 . 1〜2 0、 好ましくは 1〜5 倍過剰に添加することができる。 一方、 グルコース脱水素酵素、 アルコール脱水 素酵素、 ギ酸脱水素酵素、 アミノ酸脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素、 グリセ口 ール脱水素酵素などの、 NADH, NADPH再生用の酵素は、 本発明の NADH, NADPH依 存性酵素に比較して酵素活性で 0 . 1〜 1 0 0倍、 好ましくは 0 . 5〜 2 0倍程 度添 口することができる。
基質であるプロパルギルケトンは、例えば文献 ひ. Org. Chem. , 52， 2860 (1987) . ) に記載の方法などで合成することができる。
本発明のプロパルギルケトンの還元により生成する光学活性プロパルギルアル コールの精製は、 菌体、 タンパク質の遠心分離、 膜処理などによる分離、 溶媒抽 出、 蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
例えば、 (S) -CHPO合成では、微生物菌体を含む反応液に直接有機溶媒、例えば、 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 トノレェン、 へキサン、 ベンゼン、 メチルイソブチ/レケ トン、 メチノレターシャリーブチノレエーテノレ、 ブタノーノレ、 へキサン、 ヘプタンな どを添加して抽出後、 これを減圧濃縮することにより、 光学活性プロパルギルァ ルコールとして、採取することができる。さらに反応生成物の純度を上げるには、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー、 蒸留、 結晶化などを行うことにより、 さ らに高度に精製することができる。
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれに限定され
るものではない。 実施例
[実施例 1 ]ピキア · フィンランディ力由来 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素 とバチルス.サブチルス由来グルコース脱水素酵素の同時発現
特許文献 （WO O 1 / 6 1 0 1 4号公報） に示された方法で得たピキア · フィ ンランディ力由来の（R)—ォクタノール脱水素酵素とバチルス ·サブチリス由来 のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミド pSG- PF01を保持する大腸菌 HB101株（HB101 (pSG-PFOl) ) を 2 XYT培地 (D;ifco- Tryptone 20g/L、 Difco- Yeast extract 10g/L、 NaCl 10g/L、 pH 7. 2) 50mLで培養し、 0. ImM IPTGで遺伝子の発 現を誘導した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置 UCD- 200TM (コスモ バイオ） で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[実施例 2 ]ピキア ' フィンランディ力由来 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素 とバチルス.サブチルス由来グルコース脱水素酵素の酵素活性
実施例 1で得られた無細胞抽出液を用い、 酵素活性を測定した。 （R) — 2— ォクタノール脱水素酵素活性の測定は、 50 111¾1 13-11 緩衝液 （PH 8. 5) 、 2. 5 mM NAD+、 5 mM (R) 一 2—ォクタノール及び酵素を含む反応液中、 30 °Cで反応さ せ、 NADHの増加に由来する 340 nmの吸光度の増加を測定した。 1Uは、 1分間に 1 μ molの NADHの生成を触媒する酵素量とした。 組換え大腸菌から得た無細胞抽 出液では、 NAD+依存的に （R) — 2—ォクタノール酸化活性を示し、 その比活性 は、 35. 9 U/mg—タンパク質であった。 また、 CHPN還元活性の測定は、 100 mMリ ン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5)、 0. 2 mM NADH、 1%ジメチルスルホキシド、 2 mM CHPN 及ぴ酵素を含む反応液中で 30 °Cで反応させ、 NADHの減少に由来する 340 nmの吸 光度の減少を測定した。 1Uは、 1分間に 1 μ molの NADHの生成を触媒する酵素量 とした。 組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、 NADH依存的に CHPN還元活性 を示し、 その比活性は、 8. 01 U/ mg—タンパク質であった。
グルコース脱水素酵素活性の測定は、 100 mMリン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5)、 2. 5 mM NAD+、 100 mM D—グルコース及び酵素を含む反応液中で 30 °Cで反応させ、 NADHの増加に由来する 340 nmの吸光度の増加を測定した。 1Uは、 1分間に l mol の NADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、 その比活性は、 1. 18 U/ mg—タンパク質であった。
[実施例 3 ]ピキア 'フィンランディ力由来 （R) _ 2—ォクタノール脱水素酵素 とバチルス 'サプチルス由来グルコース脱水素酵素による（S) - CHP0の合成
実施例 1で得られた形質転換した大腸菌を 2 X YT培地 (D co- Tryptone 20 g/L、 Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7. 2) 50mLで培養し、 0. ImM IPTG で遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。 得られた菌体の半量を 400 mM リン酸力 リウム緩衝液 (pH 6. 5) 、 1% CHPN (73 mM) 、 1%ジメチルスルホキシド、 1. 6%グ ルコース（88mM)を含む 50 mLの反応液に加えて、振盪下 20 °Cで反応を開始した。 反応開始から 1時間後に集菌体の半量を更に添加し、 一晩反応を継続した。
[実施例 4 ]反応液からの（S) -CHPOの単離
実施例 3で調製した反応液に対し、 150 mLのへキサンを用いて 3回抽出を行つ た。 このへキサン抽出液の一部を取り、 ガスクロマトグラフィーで変換率の測定 を行った。分析には、 FFAP 20% Chromosorb W (AW) , 80— 100メッシュ （直径 0. 32 X 210cm, 信和化工） を用いた。 カラム室温度と注入口温度は 200 °C、検出器温度 は 230 °C、 キャリアガスには窒素、 検出には水素炎イオン化検出器を用いた。 各 化合物の保持時間は、 CHPNで 5. 0分、 CHP0で 8. 5分であった。定量の結果、変換率 は 100%であった。 有機層をろ過して不溶成分を除去した後、 減圧下に溶媒を留 去した。得られた油状物を冷却することにより、結晶が析出した。析出した結晶を ろ過によって回収し、目的物である（S) - CHP0の結晶 380 mgを得た。 収率は 75%で あった。
[実施例 5 ]合成した（S) -CHP0の光学純度
実施例 4記載のへキサン抽出液を用い、光学分割カラムを用いた高速液体クロ マトグラフィーを用いて光学純度の測定を行った。 分析には、 CHIRALCEL 0D ( φ 0. 46 X 25cm、 ダイセル化学工業） を用いた。 カラム室温度は 40。C、溶出はへキサ ン 2—プロパノール （97/3、 流速 l mL/分） 、 検出波長は 220 nmとした。 各対 掌体の保持時間は、 （S)体で 13. 0分、（R)体で 14. 9分であった。 その結果、生成物 の光学純度は 100%ee (S)であった。
[実施例 6 ]ピキア ' フィンランディ力由来 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素 とマイコバクテリゥム ·パッカェ由来ギ酸脱水素酵素の同時発現
特許文献 （WO O 1 / 6 1 0 1 4号公報） に示された方法で得たピキア ·フィ ンランディ力由来の（R)—ォクタノール脱水素酵素とマイコパクテリゥム .バッ カェ由来のギ酸脱水素酵素を共発現するプラスミ ド PSF - PF03を保持する大腸菌 HB101株 (HB101 (pSF - PF03) )を 2 X YT培地 (Difco-Tryptone 20 g/L、 Difco- Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7. 2) 50 mLで培養し、 0. 1 mM IPTGで遺伝子 の発現を誘導した。 得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破枠装置 UCD - 200TM (コ スモバイオ） で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[実施例 7 ]ピキア ' フィンランディ力由来 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素 とマイコバクテリゥム ·パッカェ由来ギ酸脱水素酵素の酵素活性
実施例 6で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。組換え大腸菌か ら得た無細胞抽出液では、 NAD+依存的に （R) — 2—ォクタノール酸化活性を示 し、 その比活性は、 18. 2 U/ mg—タンパク質であった。
ギ酸脱水素酵素活性の測定は、 100 mMリン酸カリゥム緩衝液 （pH 7. 0) 、 2. 5 mM ΝΑΌ 100 mM ギ酸ナトリゥム及び酵素を含む反応液中で 30°Cで反応させた。 1U は、 1分間に 1 /Z molの NADHの生成を触媒する酵素量とした。 組換え大腸菌から 得た無細胞抽出液では、 その比活性は、 1. 11 U/ mg—タンパク質であった。
[実施例 8 ] ピキア . フィンランディ力由来 （R) — 2—ォクタノール脱水素酵素 とマイコバクテリゥム .パッカェ由来ギ酸脱水素酵素による（S) - CHP0の合成 実施例 6で得られた形質転換した大腸菌を 2 X YT培地（Dif Co- Tryptone 2 0g/L、 Difco-Yeast extract 10 g/レ NaCl 10 g/ pH 7. 2) 50mLで培養し、 0. 1 mM IPTG で遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。 得られた菌体の半量を 400 mM リン酸力 リウム緩衝液 (pH 6. 5)、 1%CHPN (73 mM)、 1 %ジメチルスルホキシド、 1. 6%グ ルコース （88 mM) 、 1 mM NAD+を含む 25 mLの反応液に加えて、振盪下 20 °Cで一 晚反応を継続した。 反応液に対し、 75 mLの酢酸ェチルを用いて 2回抽出を行レ、、 ガスクロマトグラフィ一で定量した結果、変換率は 84%であった。
[実施例 9 ] サッカロマイセス .セレビジェからの染色体 DNAの精製
サッカロマイセス ·セレビジェ X2180- IB (Yeast Genetic Stock Center) を YM培地で培養し、 菌体を調製した。 菌体からの染色体 DNAの精製は、 Meth. Cell Biol. 29， 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
[実施例 1 0 ] カルボ-ル還元酵素の ScGRE2 のクロー-ング
DDBJに登録されている予想タンパク質 Y0L151w (SWISS - PR0T Accession No. Z74893-1) に対応する DNA配列 (DDBJ Accession No. Z74893) を基に PCR用プラ イマ一 Y0L1- ATG1 (配列番号： 9) 、 YOL-XbaIR (配列番号： 10) 、 YOL- XbalF (配 列番号： 11) 、 Y0L1-TAA1 (配列番号： 12) を合成した。
配列番号 9 ：
Y0L-ATG1： GACACATGTCAGTTTTTGTTTCAGGTGCTAAC
配列番号 1 0 ：
YOL-XbaIR: TCCTCTAGAAATTCCCAAGCTG
配列番号 1 1 ：
Y0L-XbaIF： CTGTCTAGAGGAGAATCGTGACTCTGTAAAATTC
配列番号 1 2 ：
Y0L-TAA1： GTCGAATTCCTCTATTAAATACGGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGGAG
プライマー Y0L - ATG1, YOL-XbaIRを各 2 5 p m o 1、 dNTP 1 0 n m o 1、 サッ 力口マイセス ·セレビジェ由来染色体 DNA 5 0 n g、 Pfu DNA polymerase用緩衝 液 （STRATAGENE製）、 Pfu DNA polymerase 2 U (STRATAGENE製）を含む 5 0 L の反応液を用い、 変性 （9 5 °C、 4 5秒） 、 ァニール （5 5。C、 3 0秒） 、 伸長 ( 7 2 °C、 1分 2 0秒） を 30サイクル、 GeneAmp PCR System 2400 (パーキンェ ルマー製）を用いて PCRを行った結果、 特異的な增幅産物が得られた。
増幅産物をフエノール処理後、制限酵素 BspLUllI, Xbalで 2重消化し、得られ た断片を精製した。
次に、プライマー Y0L - XbalF, Y0L-TAA1を各 2 5 p m o 1、 dNTP 1 0 n m o 1、 サッカロマイセス 'セレビジェ由来染色体 DNA 5 0 n g、 Pfu DNA polymerase用 緩衝液 (STRATAGENE製）、 Pfu DNA polymerase 2 U (STRATAGENE製）を含む 5 0 の反応液を用い、 変性 （9 5 °C、 4 5秒） 、 ァニール （5 5。C、 3 0秒） 、 伸長 （7 2 °C、 1分 2 0秒） を 30サイクル、 GeneAmp PCR System 2400 (パーキ ンエルマ一製）を用いて PCRを行った結果、 特異的な増幅産物が得られた。
得られた增幅産物をフヱノール処理後、 制限酵素 Xbal， EcoRIで 2重消化し、 得られた断片を精製した。
得られた 2種類の制限酵素消化済み P C R増幅 DNA断片を、 制限酵素 Ncol, EcoRIで 2重消化したべクタ一 pSE420D (特開 2000-189170号公報） と TAKARA Ligation Kitによりライゲーシヨンした。 ラィゲーションした DNAにより大腸菌 JM109株を形質転換し、 アンピシリン （5 0 m g / L ) を含む LB培地で生育し、 得られた形質転換株よりプラスミドを FlexiPrepにより精製した。 得られたブラ スミドの揷入 DNA部分の塩基配列を解析した結果、 プライマー部分を除き、 DDBJ に登録されている塩基配列と完全に一致した。 得られたプラスミドを pSE - Y0L1 とした。 プラスミド構築の過程を図 1に示した。
[実施例 1 1 ]カルポニル還元酵素 ScGRE2と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素 遺伝子を共発現するプラスミド PSG- SCR1の構築
PSE-Y0L1を Nhel， Csp45Iで 2重消化し、 719 bpからなる DNA断片を精製した。 更に、 同プラスミドを Csp45I， EcoRIで 2重消化し、 469 bpからなる DNA断片を 精製した。枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミド pSE-BSGl
(特願 2000-374593号）を Nhel、 EcoRIの 2つの制限酵素で二重消化し、 pSE- Y0L1 から切り出した上記 2 DNA断片と Takara Ligation Kitを用いてライゲーション した。 ライゲーシヨンした DNAにより大腸菌 J1109株を形質転換し、 アンピシリ ン （5 O m g Z L ) を含む LB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミド を FlexiPrepにより精製し、グルコース脱水素酵素と ScGRE2を同時に発現可能な プラスミ ドである pSG-SCRlを得た。 プラスミド構築の過程を図 2に示した。
[実施例 1 2 ]カルボニル還元酵素 ScGRE2と枯草菌由来グルコース脱水素酵素の 同時発現
実施例 1 1で得られた pSG- SCR1で形質転換した大腸菌 HB101株 (E. coli HB101 (pSG-SCRl) ) をアンピシリン 50 mg/Lを含む LB培地で終夜培養後、 IPTGを 0. 1 mM 添加して遺伝子の発現を誘導し、 更に 4時間培養した。 得られた菌体を集菌後、 密閉式超音波破碎装置 UCD- 200TM (コスモバイオ製） で破砕し、 遠心分離した上 清を無細胞抽出液とした。
[実施例 1 3 ]カルポニル還元酵素 ScGRE2の酵素活性
実施例 1 2で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。 CHPN還元活 性の測定は、 100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 6. 5) 、 0. 2 mM NADPH 2 mM CHPN、 l°/oジメチルスルホキシド及び酵素を含む反応液中で、 25 °Cで反応させた。 1Uは、 1分間に 1 μ ηιοΐの MDHの生成を触媒する酵素量とした。 組換え大腸菌から得た 無細胞抽出液では、 NADPH依存的に CHPN還元活性を示し、 その比活性は、 10. 8 U/mg-抽出液であった。
W
[実施例 1 4 ]カルポニル還元酵素 ScGRE2を用いた（R) - CHP0の合成
200 mM リン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5) 、 1 mM NADP+、 CHPN 50 mM、 D -ダルコ ース 250 mM、 BSA 0. 1%、 グルコース脱水素酵素 （ァマノ製） 2 U、 及び ScGRE2 酵素溶液 1 Uを含む反応液を振盪下、 25 °Cで一晩反応させた。
[実施例 1 5 ] (R) - CHP0の光学純度
実施例 1 4で調整した反応液に対し、 2倍容の酢酸ェチルで抽出を行った。 減 圧下に溶媒を留去し、残渣を 1倍容のへキサン / 2 _プロパノール（97/3)に溶解 した。 このサンプルの光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用 いた光学純度の測定を行った。 分析は、 実施例 5に記載の方法により行った。 そ の結果、生成物の光学純度は 99. 8%ee (R)であった。
[実施例 1 6 ] (R)-CHPOの変換率
実施例 1 4で調整したサンプルを用い、実施例 4に記載の方法によりガスクロ マトグラフィ一で変換率の測定を行った。 ピーク面積から算出した変換率は 28. 4%であった。
[実施例 1 7 ]カルポニル還元酵素 ScYGD9のクローニング及びカルボニル還元酵 素 ScYGD9と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミド PSG-YGD9の構築
特願 2003-113402号の記載の方法に従って、 以下の通り行つた。
( 1 ) カノレポ二ノレ還元酵素のホモログ YGL039w のクローニング
DDBJに登録されている予想タンパク質 YGL039w (SWISS - PROT Accession No. P53183) に対応する DNA配列 (DDBJ Accession No. Z72561) を基に PCR用プ ライマー YGL2-ATG2 (配列番号 1 3 ) 、 YGL2-TAA2 (配列番号 1 4 ) を合成した。 プライマーを各 2 5 p m o 1、 dNTP 1 0 n m o 1、 サッカロマイセス ·セレビジ
ェ由来染色体 DNA 5 0 n g、 Pfu DNA polymerase用緩衝液 （STRATAGENE製）、 Pfu DNApolymerase 2 U (STRATAGENE製）を含む 5 0 μ Lの反応液を用い、変性（ 9 5。C 4 5秒） 、 ァニール （5 0 °C、 3 0秒） 、 伸長 （7 2 °C、 1分 1 5秒） を 30サイ クル、 GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマ一製）を用いて PCRを行った結 果、 特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物をフエノール処理後、 制限酵素 BspHI, Nhelで 2重消化し、 制限酵素 Ncol, Xbalで 2重消化したベクター pSE420Dと TAKARA Ligation Kit によりライ ゲーシヨンした。 ライゲーシヨンした DNAにより大腸菌 J1109株を形質転換し、 アンピシリン （ 5 0 m gノ L ) を含む LB培地で生育し、得られた形質転換株より プラスミ ドを FlexiPrepにより精製した。 プラスミドの揷入 DNA部分の塩基配列 を解析し、 その結果を配列番号 1 5に示した。 得られた塩基配列は、 DDBJに登録 されている塩基配列と完全に一致した。 得られたプラスミ ドを pSE - YGD9とした。 ( 2 ) カルボエル還元酵素のホモログ YGL039wと枯草菌由来のグルコース脱水素 酵素遺伝子を共発現するブラスミ ド pSG- YGD9の構築
PSE-YGD9を EcoRI、 Hindlllの 2つの制限酵素で二重消化し、 枯草菌由来のグ ルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミ ド pSE- BSG1 (特開 2000- 189170) から 同酵素で切り出したグルコース脱水素遺伝子を含む DNA断片と Takara Ligation Kitを用いてライゲーションした。 ライゲーシヨンした DNAにより大腸菌 JM109 株を形質転換し、 アンピシリン （5 0 m g / L ) を含む LB培地で生育し、得られ た形質転換株よりプラスミドを FlexiPrepにより精製し、 グルコース脱水素酵素 と YGL039wを同時に発現可能なプラスミドである PSG-YGD9を得た。
[実施例 1 8 ] カルボニル還元酵素 ScYGD9の発現
実施例 1 7で得られた pSG- YGD9で形質転換した大腸菌 HB101株（E. coli HB101 (pSG-YGD9) ) をアンピシリン 50 mg/Lを含む LB培地で終夜培養後、 IPTGを 0. 1 mM 添加して遺伝子の発現を誘導し、 更に 4時間培養した。 得られた菌体を集菌後、 密閉式超音波破碎装置 UCD- 200TM (コスモバイオ製） で破枠し、 遠心分離した上
清を無細胞抽出液とした
[実施例 1 9 ] カルポニル還元酵素 ScYGD9の酵素活性
実施例 1 8で得られた無細胞抽出液を用い、 実施例 1 3の方法に従って酵素活 性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、 NADPH依存的に CHPN還 元活性を示し、 その比活性は、 22. 7 U/mg-抽出液であった。
[実施例 2 0 ]カルボ-ル還元酵素 ScYGD9を用いた（R) - CHP0の合成
200 mMリン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5) 、 1 mM NADP+、 CHPN 50 raM、 D -ダルコ ース 250 mM、 BSA 0· 1%、 グルコース脱水素酵素 （ァマノ製） 2U、 及ぴ ScYGD9酵 素溶液 1Uを含む反応液を振盪下、 25°Cでー晚反応させた。
[実施例 2 1 ] (R) -CHPOの光学純度
実施例 2 0で調整した反応液に対し、 実施例 5と同様の方法で光学純度の測定 を行った。 その結果、生成物の光学純度は 99. 3%ee (R)であった。
[実施例 2 2 ] (R) -CHPOの変換率
実施例 2 0で調整したサンプルを用レ、、実施例 4と同様の方法で変換率の測定 を行った。 その結果、ピーク面積から算出した変換率は 11. 6%であった。
[実施例 2 3 ] カルボニル還元酵素 TdCRlのクローニング及びカルボニル還元酵 素 TdCRlと枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミド pSG-TDRlの構築
文献 （特願 2003-113402) 記載の方法に従って、 以下の通り行った。
( 1 ) カルポニル還元酵素遺伝子 TdCRlの一部を含むプラスミ ド pUC- TDXの構築 カルボ-ル還元酵素遺伝子の 0RFの Xbal部位から 3'末端までをクローニング するために、 プライマー Td - XbaF (配列番号 1 6 ) 、 Td-TAAl (配列番号 1 7 ) を
合成した。
プライマー Td-XbaFと Td- TM1を各 50 pmol、 dNTPIO nmol、 トルラスポラ ·デ ルブレッキー由来染色体 DNA 50ng、 Pfu Turbo DNA polymerase用緩衝液
(STRATAGENE製）、 Pfu Turbo DNA polymerase 3. 75 U (STRATAGENE製）を含む 50 L の反応液を用い、変性（95°C、 2分 30秒）、ァニール （55°C、 1分）、伸長（72°C、 1分） を 30サイクル、 GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマ一製）を用いて 行つた。 得られた PCR産物を Td- PCR2とした。
得られた PCR産物を、フエノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として 回収した。 Td- PCR2を Xbalで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的 とするパンドの部分を切り出し、 Sephaglas BandPrep Kit (フアルマシア製）によ り精製した。
制限酵素消化された Td- PCR2は、 Xbalで消化した pUC18 (宝酒造製） と TakaraLigation Kitを用いてライゲーシヨンし、大腸菌 JM109株を形質転換した。 形質転換株をアンピシリンを含む LB培地で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析 した。 ここで得られたプラスミドを pUC-TDXとした。
( 2 ) カルポニル還元酵素遺伝子 TdCRlと枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺 伝子を共発現するプラスミド pSG- TDR1の構築
プラスミド pUC- TDXを制限酵素 Xbalで消化し、ェタノール沈殿後、ァガロース 電気泳動を行い、 TdCRl遺伝子の一部を含む約 0. 8 bpのバンドを切り出し、 SephaglasBandPrep (Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、 回収した。 得 られた DNA靳片と、 同制限酵素で消化し、 アルカリフォスファターゼ処理後、 フ ヱノール抽出、 フヱノール-クロ口ホルム抽出、 クロ口ホルム抽出、エタノール沈 殿したプラスミド pSG- TDXを、 TaKaRa Ligation Kitを用いてライゲーシヨンし た。 ライゲーシヨンした DNAによって大腸菌 JM109株を形質転換し、 アンピシリ ン（50 mg/L)を含む LB培地で生育させ、 得られた形質転換株よりプラスミ ドを FlexiPrepにより精製した。 その結果、 グルコース脱水素酵素と TdCRlを同時に 発現可能なプラスミドである pSG-TDRlを得た。
[実施例 2 4 ] カルボニル還元酵素 TdCRlと枯草菌由来のグルコース脱水素酵素 の同時発現
実施例 2 3で得られた pSG-TDRlで形質転換した大腸菌 HB101株 (E. coli HB101 (pSG-TDRl) ) をアンピシリン 50 mg/Lを含む LB培地で終夜培養後、 IPTGを 0. 1 mM 添加して遺伝子の発現を誘導し、 更に 4時間培養した。 得られた菌体を集菌後、 密閉式超音波破砕装置 UCD- 200TM (コスモバイオ製） で破枠し、 遠心分離した上 清を無細胞抽出液とした。
[実施例 2 5 ] カルボニル還元酵素 TdCRlの酵素活性
実施例 2 4で得られた無細胞抽出液を用い、 実施例 1 3の方法に従って酵素活 性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、 NADPH依存的に CHPN還 元活性を示し、 その比活性は、 5. 7 U/mg -蛋白質であった。
[実施例 2 6 ]カルボニル還元酵素 TdCRlを用いた（R) - CHP0の合成
200 mM リン酸カリゥム緩衝液 (pH 6. 5) 、 1 mM NADP+、 CHPN 50 raM、 D -ダルコ ース 250 mM、 BSA O. 1%、 グルコース脱水素酵素 （ァマノ製） 1U、 及ぴ TdCRl酵素 溶液 0. 5Uを含む反応液を振盪下、 25°Cでー晚反応させた。
[実施例 2 7 ] (R)-CHPOの光学純度
実施例 2 6で調整した反応液に対し、 実施例 5と同様の方法で光学純度の測定 を行った。 その結果、生成物の光学純度は 99. 7%ee (R)であった。
[実施例 2 8 ] (R) -CHPOの変換率
実施例 2 6で調整したサンプルを用い、実施例 4と同様の方法で変換率の測定 を行った。 その結果、ピーク面積から算出した変換率は 9. 0%であった。
産業上の利用可能性
本発明により、 高い光学純度を有する光学活性プロパルギルアルコールを効率 よく製造する方法を提供することが可能になった。
Claims
1 . 下記 （a ) から （e ) ；
( a ) 配列番号 1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチド；
( c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、揷入およぴ Zまたは付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プ 口パルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポ リヌクレオチド；
( d ) 配列番号 1に記載された塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条 件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示されるプロパル ギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示される光学活性プロパルギルアルコール誘 導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
( e ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 2で示され る光学活性プ口パルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質を
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式 1 ：
(式中、 Rは、 C 1一 C 1 0の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアル キル基、アルケニル基又はアルキ-ル基、あるいは C 6— C 2 0のァリール基を表 す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式 2 ：
(式中、 Rは、 式 1の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、 光学 活性プロパルギルアルコール驟導体の製造方法。
2 . 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体が式 3 ：
で示される （S ) —1—シクロへキシルー 2 _プロピン一 1 _オールである、 請 求項 1に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
3 . ( a ) から （e ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質を、 対応する捕酵素、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チド (NADH)もしくは還元型二コチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは 該形質転換株の処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトンを還元し、
式 2で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、 請求項 1又は 2に 記載の方法。
4 . NADHもしくは NADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵 素若しくはギ酸脱水素酵素である、 請求項 3に記載の方法。
5 . 下記 （a ) から （e ) ；
( a ) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレオチド；
( c ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数の ァミノ酸が置換、欠失、揷入およぴ または付加したアミノ酸からなるタンパク質 であって、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される 光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド；
( d ) 配列番号 3、 5又は 7に記載された塩基配列からなる D N Aとス トリンジ ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、 式 1で示され るプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルァ ルコール該導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド；又は
( e ) 配列番号 4、 6又は 8に記載のァミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有す るアミノ酸配列を有し、 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタ ンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、 該タンパ ク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式 1 ：
(式中、 Rは、 C I一 C I 0の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアル キル基、アルケニル基又はアルキ-ル基、あるいは C 6— C 2 0のァリール基を表 す）
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式 5 ：
(式中、 Rは、 式 1の場合と同義である）
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、 光学 活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
6 . 式 1で示されるプロパルギルケトン誘導体が式 3 ：
式 3 で示される 1—シクロへキシル _ 2—プロピン一 1一オンであり、 式 5で示され る光学活性プロパルギルアルコール誘導体が式 6 ：
式 6 で示される （R) — 1ーシクロへキシルー 2—プロピン一 1一オールである、 請 求項 5に記載の光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
7 . ( a ) 力 ら （e ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質を、 対応する捕酵素、 還元型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チド（NADH)もしくは還元型二コチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン酸
(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは 該形質転換株の処理物を用いて、 式 1で示されるプロパルギルケトンを還元し、 式 5で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、 請求項 5又は 6に 記載の方法。
8 . NADHもしくは NADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵 素若しくはギ酸脱水素酵素である、 請求項 7に記載の方法。
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