WO2005105834A1 - Procedimiento para la producción en levaduras de cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de pvp2 del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv) - Google Patents

Procedimiento para la producción en levaduras de cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de pvp2 del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv) Download PDF

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protein
ibdn
amino acid
acid sequence
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PCT/ES2005/070052
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José RUIZ CASTÓN
Irene SAUGAR GÓMEZ
Daniel Luque Buzo
Fernando Abaitua Elustondo
Ana Mª OÑA BLANCO
Mª Dolores GONZÁLEZ DE LLANO
José F. RODRÍGUEZ AGUIRRE
Juan Ramón RODRÍGUEZ FERNÁNDEZ-ALBA
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Bionostra, S.L.
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    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10023—Virus like particles [VLP]

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of empty viral capsids composed of proteins derived from the pNP2 protein (pNP2 *) of the virus causing infectious bursitis disease (IBDN).
  • Said capsids can be used in the production of vaccines and in the elaboration of vectors for gene therapy.
  • the virus causing infectious bursitis disease is a member of the Birnaviridae family that infects different avian species and is directly responsible for a serious immunosuppressive disease causing significant economic losses in the global poultry industry ( Sharma JM et al. 2000. Infectious bursal disease virus of chickens: pathogenesis and immunosuppression. Developmental and Comparative Immunology 24: 223-235; van den Berg TP et al. 2000. Infectious bursal disease (Gumboro disease). Revue strig et technique ( International Office of Epizootics) 19: 509-543).
  • NP4 polypeptide 4 (28 kDa)
  • NP4 polypeptide 4
  • the NP2, NP3, and NP4 proteins are produced from the proteolytic processing of a precursor polypeptide (or polyprotein) of a size of 109 kDa. This precursor is autocatalytically processed by releasing peptides pNP2 (NPX), NP3 and
  • the NP4 domain which is located in the central region of the polyprotein, belongs to the Ion family of proteases and is responsible for proteolytic cutting.
  • the pNP2 and NP3 polypeptides are directly responsible for the assembly of the capsids.
  • NP2 mature form of the protein
  • NP3 the mature form of the protein
  • viruses have developed strategies that allow the sequential and correct interaction between each of its components.
  • the conventional vaccines used for the control of infectious bursitis are based on the use of strains, with different degrees of virulence, of the IBDN itself grown in cell culture or in embryonated eggs. Extracts containing infectious material are subjected to chemical inactivation processes to produce inactivated vaccines or are used directly to produce live attenuated vaccines.
  • the latter type of vaccines has the classic drawbacks associated with the use of live attenuated vaccines, namely, the risk of mutations that reverse the virulence of the virus or make it lose its immunogenicity.
  • NLPs are an alternative to the use of live attenuated vaccines and recombinant sub-unit vaccines.
  • the NLPs are obtained by self-assembly of all or part of the constituent sub-units of the viral capsid and mimic the structure and antigenic properties of the native virion although they lack genetic material and are therefore unable to replicate.
  • NLPs can be used as vectors of molecules of biological interest, for example, nucleic acids, peptides, proteins, etc.
  • the use of different vectors for the expression of IBDN genes has allowed the development of different viral assembly production systems. In this sense, the production of different IBDN NLPs by viral polyprotein expression has been described using different expression systems, for example, mammalian cells (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. J. Gen. Nirol. 79: 1047-54) or alternative vectors based on the use of recombinant baculovirus (rBNs) (Nakharia No. 1997.
  • NP3 the scaffolding protein of infectious bursal disease virus
  • NLPs produced by the expression of a chimeric form of the viral polyprotein formed by the fusion of it to a heterologous protein in order to improve the efficiency in the formation of NLPs
  • IBDN NLPs The various methods of production of IBDN NLPs described previously suffer from different defects that reduce or prevent their applicability for the generation of vaccines against IBDN since: (i) vectors developed to produce IBDN NLPs are based on the use of viruses recombinants, derived from the vaccine virus or baculovirus, so that the production of said NLPs is made from mammalian or insect cells; however, these production systems are very expensive for their application in the industrial production of veterinary vaccines; (ii) the production of IBDN NLPs in mammalian cells is based on the use of vaccine virus recombinants; However, in addition to the fact that this production system has a very high cost, the use of a recombinant virus capable of infecting both mammals and birds does not meet the biosecurity conditions necessary for its use as a vaccine; (iii) the production of IBDN NLPs in insect cells using conventional expression systems, for example, rBNs that express only viral polyprotein, in addition to being
  • Naccine 21: 4736-4743 who, although they describe the expression of the gene encoding the NP2 protein of IBDN in Pichia pastoras and the use of a partially purified material containing said IBDN rNP2 protein to immunize animals do not describe the formation of capsids formed by self-assembly of said rNP2 expressed in P. pastoris.
  • NLPs-pNP2 * IBDN NLPs provided by this invention
  • This strategy is based on the use of a gene expression system or vector that allows the expression of an IBDN pNP2 * in yeasts and the formation of IBDN NLPs-pNP2 *, with a very high yield and a very low economic cost .
  • Vaccines obtained using said NLPs-pNP2 * have numerous advantages since, on the one hand, the manipulation of highly infectious material is avoided, the potential risk of new IBDN mimics is prevented and the use of live virus in the virus is eliminated. poultry farms, thus preventing the risk of dissemination of vaccine strains of IBDN to the Environment, and, on the other hand, allows the development of differential diagnostic systems to discriminate between vaccinated and infected animals.
  • the present invention relates to a process for the production of said IBDN NLPs-pNP2 * based on the gene expression of an IBDN pNP2 * protein in yeasts.
  • IBDN NLPs-pNP2 * which exhibit antigenic or immunogenic activity against infection caused by IBDN, constitute a further aspect of this invention.
  • the use of said IBDN NLPs-pNP2 * in the preparation of medicaments, such as vaccines and vectors for gene therapy, and / or for diagnostic purposes constitutes an additional aspect of this invention.
  • Such vaccines and vectors constitute additional aspects of the present invention.
  • FIGURES shows a schematic representation of the plasmid pESCURAinv / pNP2-456.
  • the plasmid contains an AD ⁇ fragment that contains the region corresponding to the IBDN polyprotein that encodes from residue 1 to residue 456 of the NPDN protein of IBDN, under the transcriptional control of the galactose-inducible promoter called GALl.
  • GALl galactose-inducible promoter
  • Figure 3A shows the microscopic characterization of NLPs-pNP2 * purified; fractions 21 to 26 of the gradient shown in Figure 2 were mixed and analyzed by transmission electron microscopy (TEM); In the image shown, the presence of numerous isometric particles with a size of approximately 23 nm is observed. The sample was stained with uranyl acetate.
  • Figure 3B shows the result of a biochemical analysis, specifically, the sample (NLP) was analyzed by SDS-PAGE followed by coomassie blue staining. The molecular weight marker (M) used was Dual Color (BIO-RAD).
  • Figure 3C shows the result of an antigenic analysis, specifically, the sample (NLP) was analyzed by Western blotting using IBDN anti-NP2 serum.
  • M indicates the lane corresponding to the molecular weight markers (Dual Color, BIO-RAD).
  • Figure 4 is a bar chart illustrating the characterization of the humoral response against NLPs-pNP2-456. Said NLPs-pNP2-456 were used to immunize 1-day SPF chickens (Example 2). Immunization was performed using a group of 7 chickens, with a single dose of antigen intramuscularly. As a control, a group of chickens that were injected intramuscularly with an identical volume of the antigen diluent (PBS) was used. Samples were taken at intervals of 7 days until day 35. Serum samples were analyzed by ELISA using a serum sample dilution of 1/500.
  • PBS antigen diluent
  • IBDN refers to the different strains of IBDN belonging to any of the known serotypes (1 or 2) [for illustrative purposes see review by van den Berg TP, Eterradossi To, Toquin D, Meulemans G., in Rev Sci Tech 2000 19: 509-43].
  • pNP2 * protein refers, in general, to a protein whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the "n" moiety of the IBDN pNP2 protein, where "n” It is an integer between 441 and 501 and includes any of the different forms of pNP2 proteins representative of any of the aforementioned IBDN strains [ ⁇ CBI protein databank], according to the definition made by Sánchez and Rodr ⁇ guez (1999) ( Sánchez AB, Rodr ⁇ guez JF. Proteolytic processing in infectious bursal disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by site-directed mutagenesis. Nirology.
  • proteins substantially homologous to said proteins IBDN pNP2 ie proteins whose amino acid sequences have a degree of identity, with respect to said IBDN pNP2 proteins, of at least 60%, preferably at least 80%, more preferably of at least 90% and, even more preferably of at least 95%.
  • Particular pNP2 * proteins are named following the "pNP2-n" format, where "n" is the one defined previously.
  • said pNP2 * protein is a protein selected from the group consisting of: (i) the pNP2-441 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between residue 1 and residue 441 of the protein IBDN pNP2; (ii) the pNP2-452 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the remainder 452 of the IBDN pNP2 protein; (iii) the pNP2-456 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the remainder 456 of the IBDN pNP2 protein; (iv) the pNP2-466 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between moiety 1 and moiety 466 of the IBDN pNP2 protein; (v) the pNP2-476 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between moiety 1 and moiety 476 of the IBDN pNP2 protein; (v)
  • the IBDN pNP2 * protein present in the NLPs-pNP2 * provided by this invention has an amino acid sequence comprising between 441 and 501 amino acid residues, starting from residue number 1, of any PNP2 protein representative of any IBDN strain. , for example, of the IBDN pNP2 protein strain Soroa [ ⁇ CBI, accession number AAD30136].
  • said IBDN pNP2 * protein present in the NLPs-pNP2 * provided by this invention is the pNP2-456 protein whose amino acid sequence is comprised between residue 1 and residue 456 of the IBDN pNP2 strain Soroa strain [ ⁇ CBI, access number AAD30136].
  • the nucleotide sequence encoding said IBDN PNP2-456 protein extends from nucleotide 350 to nucleotide 1719 of the nucleotide sequence shown in SEQ. ID. ⁇ O: 1.
  • the term "open reading phase corresponding to the IBDN pNP2 * protein” includes, in addition to the nucleotide sequences of said open reading phases, other open reading phases analogous to the same protein codes pNP2 * from IBDN.
  • analog is intended to include any nucleotide sequence that can be isolated or constructed on the basis of the nucleotide sequence encoding pDN1 * of IBDN, for example, by introducing conservative nucleotide substitutions or non-conservative, including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at any end or within the sequence.
  • a nucleotide sequence analogous to another nucleotide sequence is substantially homologous to said nucleotide sequence.
  • substantially homologous means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the level of nucleotides, of at least 60%, preferably of at least 80%, more preferably of at least 90% and, even more preferably of at least 95%.
  • IBDN NLPs-pNP2 * method for its production and applications
  • the NLPs-pNP2 * provided by this invention can be obtained by expressing said IBDN pNP2 * protein, in appropriate host cells, in particular, yeasts, which contain the sequence of nucleotides encoding said IBDN pNP2 * protein in a gene construct.
  • said appropriate host cells are yeasts transformed with a suitable expression system that includes a gene construct comprising the nucleotide sequence encoding said IBDN pNP2 * protein.
  • the invention relates to a method for the production of NDNs-pNP2 * from IBDN, hereinafter method of the invention, comprising culturing a yeast containing the nucleotide sequence encoding an IBDN pNP2 * protein and expressing said IBDN pNP2 * protein, and, if desired, recovering said NLPs-pNP2 * of the invention.
  • the process of the invention comprises the steps of: a) culturing yeast cells transformed with an expression system comprising the nucleotide sequence encoding an IBDN PNP2 * protein, wherein said pNP2 * protein is a protein whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the remainder "n" of the IBDN pNP2 protein, wherein "n” is an integer between 441 and 501, under conditions that allow the expression of said pNP2 * proteins and their assembly to form IBDN NLPs-pNP2 *; and b) if desired, isolate and, optionally, purify, said IBDN NLPs-pNP2 *.
  • the process of the invention comprises the gene expression of an IBDN pNP2 * protein by the use of a vector that allows the expression of said protein in yeasts.
  • the process of the invention comprises, as a previous step, the obtaining of a gene expression system, such as a system consisting of a plasmid containing a gene construct that codes for said IBDN pNP2 * protein, followed by transformation. of yeasts with said expression system, the expression of recombinant proteins, and, if desired, the isolation of NDNs-pNP2 * from IBDN formed by assembling said proteins
  • PNP2 * of IBDN and, optionally, the purification of said NLPs-pNP2 *.
  • Obtaining yeasts transformed with an expression system or vector that allows the expression of the IBDN pNP2 * protein can be carried out by a person skilled in the art based on what is described herein and the state of the art on this technology (epitope CFSP tagging vectors Instructions manual Stratagene www.stratagene.com; Sambrook
  • the transformed yeasts are grown under conditions, known to those skilled in the art, which allow the expression of recombinant proteins (pNP2 *) and their assembly to form NDNs-pNP2 * of IBDN.
  • pNP2 * recombinant proteins
  • the expressed pNP2 * proteins are assembled and form the IBDN NLPs-pNP2 *, which can be isolated or removed from the medium, and, if desired, purified. Isolation and purification of said IBDN NLPs-pNP2 * of the invention can be carried out by conventional methods, for example, by fractionation in sucrose gradients.
  • the expression system or vector used to transform yeasts comprises the nucleotide sequence encoding an IBDN pNP2 * protein operably linked to transcription and, optionally, translation control elements, and constitutes an additional aspect of this invention. Therefore, in another aspect, the invention provides an expression system or vector useful for transforming yeasts, comprising a nucleotide sequence encoding an IBDN pNP2 * protein, wherein said pNP2 * protein is a protein whose amino acid sequence it is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the "n" moiety of the IBDN pNP2 protein, wherein "n” is an integer between 441 and 501, said nucleotide sequence encoding said pNP2 protein * of IBDN operatively linked to transcription and, optionally, translation control elements.
  • said expression system comprises the nucleotide sequence comprising the open reading phase or coding region corresponding to a protein pNP2 * selected from proteins pNP2-441, pNP2-452, pNP2-456, pNP2-466, pNP2-476, pNP2-487, pNP2-494 and pNP2-501.
  • the transcription and, optionally, translation control elements present in said expression system include promoters, which direct the transcription of the pNP2 * protein sequence (to which it is operably linked), and other sequences necessary or appropriate for transcription and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cut sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), etc., all useful in yeasts Virtually any appropriate expression system or vector can be used in the generation of said expression system.
  • said vectors include plasmids, artificial yeast chromosomes (YACs), etc.
  • said expression vector or system is a plasmid, such as a suitable plasmid for transforming yeasts based on a Yeast (Stratagene) pESC expression system, for example, the plasmid pESCURA / pNP2-456 (Example 1.1) which It contains a gene construct that codes for IBDN pNP2-456 protein and allows the production of NDNs-pNP2 * from IBDN in yeasts.
  • the use of the gene expression system provided by this invention for the production and obtaining of NDNs-pNP2 * from IBDN constitutes a further aspect of this invention.
  • the invention provides a host cell, such as a yeast, that contains a nucleotide sequence encoding said IBDN PNP2 * protein.
  • said host cell is a yeast transformed with an expression system provided by this invention comprising a gene construct comprising the nucleotide sequence encoding said IBDN pNP2 * protein.
  • Virtually any yeast can be used for the implementation of the process of the invention; however, in a particular embodiment, said yeast is a yeast of the genus Saccharomyces, by for example, S. cerevisae, S. pombe, etc., a yeast of the genus Pichia, for example, P. pastoris, etc.
  • IBDN NLPs-pNP2 * can be used as vectors or carriers of products of interest, such as molecules with biological activity, for example, drugs, polypeptides, proteins, nucleic acids, etc., so they can be used for therapeutic purposes. , diagnostic or research.
  • said molecules of biological interest include polypeptides of interest, such as antigens or inducers of immune responses in animals or humans to which they are delivered, or include nucleic acid sequences, useful in gene therapy, intended to be introduced. inside the appropriate cells.
  • IBDN NLPs-pNP2 * can be used to immunize animals, in particular, birds, per se or as vectors or carriers of molecules with biological activity, for example, polypeptides, proteins, nucleic acids, drugs, etc., whereby They can be used for therapeutic or diagnostic purposes.
  • said molecules with biological activity include antigens or inducers of immune responses in animals or humans to which they are supplied, or drugs that are released at their specific site of action, or nucleic acid sequences, all useful. in gene therapy and intended to be introduced into the appropriate cells. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of said
  • IBDN NLPs-pNP2 * in the development of medications such as vaccines, gene therapy vectors (delivery systems), etc.
  • said medicament is a vaccine intended to confer protection to animals, in particular, birds, against IBDN.
  • said medicament is a vector for gene therapy.
  • the invention provides a vaccine comprising a therapeutically effective amount of NDNs-pNP2 * from IBDN, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles. This vaccine is useful for protecting animals, particularly birds, against IBDN.
  • the vaccine provided by this invention is a vaccine useful for protecting chickens from infection caused by IBDN.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of NLPs-pNP2 * of the invention calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the proper characteristics. of the NLPs-pNP2 * of the invention and the immunization effect to be achieved.
  • the pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said vaccines are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in vaccine production.
  • said vaccine is prepared in the form of an aqueous solution or suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent, such as saline, phosphate buffered saline (PBS), or any other pharmaceutically acceptable diluent.
  • a pharmaceutically acceptable diluent such as saline, phosphate buffered saline (PBS), or any other pharmaceutically acceptable diluent.
  • the vaccine provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration that results in a protective immune response against the heterologous sequence or epitope used, for which said vaccine will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen. .
  • the administration of the vaccine provided by this invention is carried out parenterally, for example, intraperitoneally, subcutaneously, etc.
  • Example 1 illustrates the obtaining of NLPs-pNP2- 456 from IBDN
  • Example 2 demonstrates the antigenic ability of said NLPs-pNP2-456 of IBDN in chickens.
  • EXAMPLE 1 Obtaining VLPs-pVP2 * by expressing various regions of the pVP2 protein in yeasts 1.1 Obtaining NLPs-pNP2-465 by expressing the region 1-456 of the pNP2 protein in yeasts In order to study the possibility to obtain IBDN NLPs formed by self-assembly of the pNP2-456 protein, whose amino acid sequence is constituted by the amino acid sequence comprised between the remainder 1 and the remainder 456 of the protein
  • IBDN PNP2 called NLPs-pNP2-456
  • yeast cultures Sacharomyces cerevisiae
  • the vector pESCURAinv / pNP2-456 was generated.
  • the first step in the construction of the vector was performed by cloning the coding region of the pNP2-456 protein (residues 1-456 of the pNP2 of IBDN) into the pESCURAinv vector.
  • the plasmid pESCURAinv was generated by digesting the vector pRS426 (Stratagene) with the enzyme PvuII and religating the digestion mixture.
  • the resulting vector, pESCURAinv contains the region of multiple cloning in an inverted position with respect to that of the parental vector pRS426.
  • the D ⁇ A fragment corresponding to the pNP2- 456 protein was obtained by PCR with the oligonucleotides identified as Oligo I (SEQ ID ⁇ O: 2) and Oligo II (SEQ ID ⁇ O: 3) using the plasmid pNOTE.2 / Poly as a template ( Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79: 1047-1054).
  • Plasmid pESCURAinv / pNP2-456 was used to transform a S. cerevisiae haploid strain 499 yeast culture according to a previously described protocol (Gietz & Woods. 2002. Transformation of yeast by the Liac / SS carrier D ⁇ A / PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96).
  • Yeasts transformed with the plasmid were selected by growth in SC medium plates (CSM + Y ⁇ B, 2% glucose and agar agar) supplemented with the amino acids tryptophan, leucine and histidine and lacking uracil (-Ura). After an incubation of 48 h at 30 ° C, a colony was selected which was used for the subsequent analysis of protein expression and NLPs formation.
  • SC medium plates CSM + Y ⁇ B, 2% glucose and agar agar
  • a colony was selected which was used for the subsequent analysis of protein expression and NLPs formation.
  • the analysis of pNP2-456 protein expression and NLPs formation was performed following a previously described protocol for the characterization of IBDN NLPs in other expression systems (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles.
  • NP1 the putative R ⁇ A-dependent R ⁇ A polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein NP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-698).
  • the selected colony was grown in liquid medium CSM (-Ura) + Y ⁇ B supplemented with 2% raffinose. The culture was incubated at 30 ° C for 24 h.
  • This culture was used to inoculate, at an optical density (OD) of 0.2, a 200 ml flask of CSM medium (-Ura) + YNB supplemented with the 2% galactose inducer.
  • the culture was maintained at 30 ° C for 18 hours (up to an OD between 1.0 and 2.0).
  • the yeasts were centrifuged at 3,000 rpm, for 5 minutes at 4 ° C, washed with distilled water 1 time, and the pellet was resuspended in lysis buffer (TEN: 10 mM Tris, pH
  • NP1 the putative R ⁇ A-dependent R ⁇ A polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein NP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73: 6973-6983).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate
  • EXAMPLE 2 Characterization of the immunogenicity of IBDV VLPs-pVP2-456 In order to determine the immunogenicity of NLPs-pNP2-456 (Example 1.1), a 1-day-old chicken immunization test was performed. A group of 7 SPF animals (free of specific pathogens) was immunized intramuscularly with a single dose of 200 ⁇ l containing 10 ⁇ g of NLPs-pNP2-456 / animal diluted in PBS. A similar group was injected with PBS. Weekly serum extractions were performed from each of the animals of both groups. The sera of each group and date were mixed to obtain a homogeneous serum (pool) represented by equivalent volumes of each individual in the group. The sera were analyzed by ELISA.

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Abstract

Las cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) están constituidas por ensamblaje de proteínas derivadas de la proteína pVP2 de IBDV, de distinto tamaño y tienen aplicación en la producción de vacunas y en la elaboración de vectores para terapia génica.

Description

TÍTULO
PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN EN LEVADURAS DE CÁPSIDAS
VIRALES VACÍAS COMPUESTAS POR PROTEÍNAS DERIVADAS DE pVP2
DEL VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV)
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un procedimiento para la producción de cápsidas virales vacías compuestas por proteínas derivadas de la proteína pNP2 (pNP2*) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN). Dichas cápsidas pueden ser utilizadas en la producción de vacunas y en la elaboración de vectores para terapia génica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) es un miembro de la familia Birnaviridae que infecta diferentes especies aviares y es el responsable directo de una grave enfermedad inmunosupresora causante de importantes pérdidas económicas en la industria avícola mundial (Sharma JM et al. 2000. Infectious bursal disease virus of chickens: pathogenesis and immunosuppression. Developmental and Comparative Immunology 24:223 -235; van den Berg TP et al. 2000. Infectious bursal disease (Gumboro disease). Revue scientifique et technique (International Office ofEpizootics) 19:509-543). Las partículas de IBDN son icosaédricas con una simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a la obtención un modelo atómico para las partículas de IBDN han fracasado. Por ello, la información estructural disponible está basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de partículas virales vacías. En base a estos estudios, se ha comprobado que la superficie externa de la partícula está formada por un entramado continuo de 260 trímeros de la proteína NP2 (37 kDa) ordenados en cinco conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas contiene 200 trímeros de la proteína NP3 (29 kDa), los cuales, independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de los trímeros de NP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, NP4 (28 kDa), también podría formar parte de las partículas, estando situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la estructura icosaédrica. Las proteínas NP2, NP3, y NP4 se producen a partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido (o poliproteína) precursor de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa autocatalíticamente liberando los péptidos pNP2 (NPX), NP3 y
NP4. El dominio NP4, que se localiza en la región central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas Ion y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos pNP2 y NP3 son los responsables directos del ensamblaje de las cápsidas.
El péptido pNP2 sufre un último corte en su extremo C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de la proteína (NP2), que es la que se encuentra en las partículas purificadas. Este procesamiento de pNP2 es necesario para la correcta formación de las cápsidas, y requiere la presencia de NP3, aunque la proteasa responsable aún no ha sido identificada. Como es conocido, la morfogénesis es un proceso vital para el ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos asociados a modificaciones en los polipéptidos precursores. Por ello, los virus han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas estrategias, utilizada con frecuencia por virus icosaédricos, es la utilización de polipéptidos provenientes de una única poliproteína como base de sus componentes estructurales. En estos casos, el adecuado procesamiento proteolítico de dicha poliproteína juega un papel crucial en el proceso de ensamblaje. Las vacunas convencionales empleadas para el control de la bursitis infecciosa se basan en el empleo de cepas, con diferentes grados de virulencia, del propio IBDN crecidas en cultivo celular o en huevos embrionados. Los extractos que contienen el material infeccioso son sometidos a procesos de inactivación química para producir vacunas inactivadas o bien son empleados de forma directa para producir vacunas vivas atenuadas. Este último tipo de vacunas presenta los inconvenientes clásicos asociados con el empleo de vacunas vivas atenuadas, concretamente, el riesgo de mutaciones que reviertan la virulencia del virus o le hagan perder su inmunogenicidad. Se han descrito vacunas sub-unidad recombinantes que comprenden la proteína NP2 de IBDN expresada en diversos sistemas de expresión, por ejemplo, bacterias, levaduras o baculovirus, normalmente en forma de proteína de fusión. Los resultados obtenidos en ensayos de inmunización de pollos con dichas vacunas no han sido completamente satisfactorios. Las partículas pseudovirales (NLPs, del inglés "virus-like particles"), constituyen una alternativa al empleo de vacunas vivas atenuadas y de vacunas sub- unidad recombinantes. Las NLPs se obtienen por autoensamblaje de la totalidad o parte de las sub-unidades constituyentes de la cápsida viral y mimetizan la estructura y propiedades antigénicas del virión nativo aunque carecen de material genético por lo que son incapaces de replicarse. Además de su aplicación con fines vacunales las NLPs pueden ser utilizadas como vectores de moléculas de interés biológico, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, etc. La utilización de diferentes vectores para la expresión de genes de IBDN ha permitido desarrollar sistemas de producción de ensamblados virales diferentes. En este sentido, se ha descrito la producción de distintas NLPs de IBDN mediante expresión de la poliproteína viral empleando distintos sistemas de expresión, por ejemplo, células de mamífero (Fernández- Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. J. Gen. Nirol. 79:1047-54) o vectores alternativos basados en el empleo de baculovirus recombinantes (rBNs) (Nakharia NΝ. 1997. Development of recombinant vaccines against infectious bursal disease. Biotechnology Annual Review 3:151-68; Kibenge FS et al. 1999. Formation of virus-like particles when the polyprotein gene (segment A) of infectious bursal disease virus is expressed in insect cells. Can J Net Res 63:49- 55). El empleo de dichos vectores virales ha permitido la producción en células de insecto de diferentes tipos de NLPs entre las que se incluyen partículas, formadas por ensamblaje de una proteína NP2 recombinante, de 20-30 nm de diámetro (Min-Ying Wang et al. 2000. Self- Assembly of the infectious bursal disease virus capsid protein, rNP2, expressed in insect cells and purification of immunogenic chimeric rNP2H particles by immobilized metal-ion affinity chromatography. Biotechnology and Bioengineering. Nol. 67(1):104-111); NLPs con simetría T=l obtenidas mediante expresión de una forma quimérica de la proteína NP2 (rNP2-456) (Martínez- Torrecuadrada JL et al. 2000. Different architectures in the assembly of infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells. Nirology 278:322-331); NLPs que contienen todas las proteínas presentes en la particula viral (Maraver A et al. 2003. The oligomerization domain of NP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of Virology 77:6438-49); y NLPs producidas por la expresión de una forma quimérica de la poliproteína viral formada por la fusión de ésta a una proteína heteróloga con el fin de mejorar la eficiencia en la formación de NLPs (Chevalier C et al. 2002. The maturation process of pNP2 requires assembly of infectious bursal disease virus capsids. J. Nirol. 76:2384-92). Los diversos procedimientos de producción de NLPs de IBDN descritos previamente adolecen de diferentes defectos que reducen o impiden su aplicabibilidad para la generación de vacunas frente a IBDN ya que: (i) los vectores desarrollados para producir NLPs de IBDN se basan en el empleo de virus recombinantes, derivados del virus vacunal o baculovirus, por lo que la producción de dichas NLPs se realiza a partir células de mamífero o de insecto; sin embargo, esos sistemas de producción son muy costosos para su aplicación en la producción a nivel industrial de vacunas veterinarias; (ii) la producción de NLPs de IBDN en células de mamífero se basa en el empleo de recombinantes del virus vacunal; sin embargo, además de que ese sistema de producción tiene un costo muy elevado, el empleo de un virus recombinante capaz de infectar tanto mamíferos como aves, no reúne las condiciones de bioseguridad necesarias para su empleo como vacuna; (iii) la producción de NLPs de IBDN en células de insecto empleando sistemas de expresión convencionales, por ejemplo, rBNs que expresan únicamente la poliproteína viral, además de costosa, es muy ineficiente y conduce a una producción de NLPs prácticamente nula; y (iv) la producción de NLPs de IBDN en células de insecto mediante la expresión de una poliproteína quimérica, formada por la fusión de la fase de lectura abierta (ORF) correspondiente a una proteína heteróloga al extremo 3' de la ORF correspondiente a la poliproteína de IBDN, tiene como resultado la producción de NLPs de IBDN que contienen una proteína de fusión (NP3 -proteína heteróloga), lo que introduce un elemento proteico no presente en viriones de IBDN, de efecto desconocido y de dudosa aplicabilidad en la cadena de producción de carne de pollo para consumo humano. Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar un vector que permita la producción a nivel industrial de vacunas frente a IBDN que subsane la totalidad o parte de los inconvenientes mencionados previamente. Las levaduras constituyen una alternativa a los sistemas de expresión previamente mencionados por razones de simplicidad y coste de producción. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha descrito la posibilidad de producir en levaduras cápsidas formadas por ensamblaje de la proteína NP2 de IBDN expresada en levaduras. Por el contrario, los resultados obtenidos por distintos grupos de investigadores señalan en la dirección opuesta, es decir, en el sentido de que la expresión de la proteína NP2 de IBDN en levaduras no conduce a la formación de partículas o cápsidas. En relación con esto, Azad et al. (US 5.614.409) describen la producción de una forma altamente inmunogénica de una proteína NP2 recombinante (rNP2) de IBDN, en la que los 5 últimos restos de aminoácidos del extremo amino terminal de la NP2 nativa de IBDN han sido reemplazados por un octapéptido, mediante la expresión de la secuencia codificante de dicha rNP2 en levaduras. Sin embargo, como reconocen los mismos autores, el análisis por microscopía electrónica del material obtenido no reveló la formación de estructuras de partículas definidas (US 5.614.409, columna 8, líneas 64-67). Resultados similares parecen haber sido obtenidos por Pitcovski et al. (Pitcovski J et al. 2003. Development and large-scale use of recombinant NP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Naccine 21:4736-4743) quienes, aunque describen la expresión del gen que codifica para la proteína NP2 de IBDN en Pichia pastoras y el empleo de un material parcialmente purificado que contiene dicha proteína rNP2 de IBDN para inmunizar animales, no describen la formación de cápsidas formadas por autoensamblaje de dicha rNP2 expresada en P. pastoris.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que es posible obtener cápsidas vacías de IBDN mediante la expresión y ensamblaje de una proteína pNP2* de IBDN, en donde dicha proteína pNP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, en levaduras. Dichas cápsidas vacías de IBDN, formadas por autoensamblaje de dicha proteína pNP2* de IBDN, se denominan NLPs-pNP2* en esta descripción. Dichas NLPs-pNP2* de IBDN contienen uno de los elementos proteicos antigénicamente más relevante presente en los viriones infectivos de IBDN por lo que son capaces de inducir una respuesta inmune o antigénica en un animal y, por tanto, pueden ser utilizadas con fines terapéuticos o de diagnóstico. En concreto, se ha observado que la expresión de una proteína pNP2* de IBDN en Saccharomyces cerevisiae permite obtener NLPs-pNP2* de IBDN. Dichas NLPs- PNP2* tienen isometría T=l y son inmunogénicas. Estos resultados han permitido diseñar una nueva estrategia para la producción de las NLPs de IBDN proporcionadas por esta invención (NLPs-pNP2*) que, a diferencia de los métodos descritos previamente para la producción de NLPs de IBDN (generalmente basados en el empleo de virus recombinantes derivados del virus vacunal o de un baculovirus y en la producción de dichas NLPs a partir células de mamífero o de insecto, sistemas de producción inaceptables para la producción industrial de vacunas veterinarias por razones de bioseguridad, eficiencia y coste), permite la expresión y producción de NLPs de IBDN en levaduras con lo que se subsanan los problemas de bioseguridad y eficiencia y se consigue un significativo abaratamiento de los costes de producción, lo que permite su empleo en la producción industrial de vacunas frente a IBDN. Dicha estrategia se basa en la utilización de un sistema o vector de expresión génica que permite la expresión de una pNP2* de IBDN en levaduras y la formación de NLPs-pNP2* de IBDN, con un rendimiento muy elevado y con un coste económico muy bajo. Las vacunas obtenidas utilizando dichas NLPs-pNP2* presentan numerosas ventajas ya que, por una parte, se evita la manipulación de material altamente infeccioso, se previene el riesgo potencial de aparición de nuevos imitantes de IBDN y se elimina el uso de virus vivo en las explotaciones avícolas, previniéndose de este modo el riesgo de diseminación de cepas vacunales de IBDN al Medio Ambiente, y, por otra parte, permite el desarrollo de sistemas de diagnóstico diferencial para discriminar entre animales vacunados e infectados. Estos sistemas de diagnóstico diferencial se basan en la detección de anticuerpos frente a las proteínas NP2, NP3 y NP4 de IBDN. Los animales con IBDN desarrollan una fuerte respuesta humoral frente a ambas proteínas mientras que los animales inmunizados con NLPs-pNP2* solo presentan anticuerpos frente a la proteína NP2 de IBDN. Por tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un procedimiento para la producción de dichas NLPs-pNP2* de IBDN basado en la expresión génica de una proteína pNP2* de IBDN en levaduras. Los sistemas de expresión y las levaduras desarrolladas para la puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas NLPs-pNP2* de IBDN, así como su empleo para la producción de dichas NLPs-pNP2* de IBDN, constituyen aspectos adicionales de la presente invención. Dichas NLPs-pNP2* de IBDN, que presentan actividad antigénica o inmunogénica frente a la infección causada por IBDN, constituyen un aspecto adicional de esta invención. Asimismo, el empleo de dichas NLPs-pNP2* de IBDN en la elaboración de medicamentos, tales como vacunas y vectores para terapia génica, y/o con fines de diagnóstico constituye un aspecto adicional de esta invención. Dichas vacunas y vectores constituyen aspectos adicionales de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática del plásmido pESCURAinv/pNP2-456. El plásmido contiene un fragmento de ADΝ que contiene la región correspondiente a la poliproteína de IBDN que codifica desde el resto 1 al resto 456 de la proteína NP2 de IBDN, bajo el control transcripcional del promotor inducible por galactosa denominado GALl. Este plásmido fue utilizado para transformar un cultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae haploide cepa 499. La Figura 2 muestra la purificación de estructuras derivadas de IBDN en células de S. cerevisiae transformadas con pESCURAinv/pNP2-456 y crecidas en presencia de galactosa (inductor) durante 18 h a 30°C. Los cultivos fueron recogidos y utilizados para la obtención de extractos que fueron posteriomente analizados mediante ultracentrifugación en gradientes lineales de sacarosa. Los carriles incluyen muestras correspondientes al extracto total sin fraccionar (I) y a las diferentes fracciones desde la zona inferior a la superior del gradiente (1-37) mediante SDS-PAGE y tinción con azul de coomassie (Figura 2A), y mediante Western blot empleando suero anti-NP2 de IBDN (Figura 2B). M indica los carriles cargados con marcadores de peso molecular (Dual Color, BIO-RAD). La Figura 3 muestra la caracterización estructural de ensamblados derivados de IBDN producidos en células de S. cerevisiae transfomadas con pESCURAinv/pNP2- 456. La Figura 3A muestra la caracterización microscópica de NLPs-pNP2* purificadas; las fracciones 21 a 26 del gradiente mostrado en la Figura 2 fueron mezcladas y analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM); en la imagen mostrada se observa la presencia de numerosas partículas isométricas de un tamaño de 23 nm aproximadamente. La muestra fue teñida con acetato de uranilo. La Figura 3B muestra el resultado de un análisis bioquímico, concretamente, la muestra (NLP) fue analizada mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul de coomassie. El marcador de peso molecular (M) empleado fue Dual Color (BIO-RAD). La Figura 3C muestra el resultado de un análisis antigénico, concretamente, la muestra (NLP) fue analizada mediante Western blot empleando suero anti-NP2 de IBDN. En las Figuras 3B y 3C "M" indica el carril correspondiente a los marcadores de peso molecular (Dual Color, BIO-RAD). La Figura 4 es un diagrama de barras que ilustra la caracterización de la respuesta humoral frente a NLPs-pNP2-456. Dichas NLPs-pNP2-456 fueron utilizadas para inmunizar pollos SPF de 1 día (Ejemplo 2). La inmunización se realizó empleando un grupo de 7 pollos, con una única dosis de antígeno por vía intramuscular. Como control se utilizó un grupo de pollos que fueron inyectados por vía intramuscular con un volumen idéntico del diluyente del antígeno (PBS). Se tomaron muestras a intervalos de 7 días hasta el dia 35. Las muestras de suero fueron analizadas mediante ELISA empleando una dilución de la muestra de suero de 1/500.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término VLP-pNP2* (singular) o NLPs-pNP2* (plural) de IBDN, tal como se utiliza en esta descripción, se refiere a cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN), en ocasiones denominadas genéricamente NLP-pNP2* o NLPs-pNP2* de la invención, con isometría T=l, constituidas por ensamblaje de una proteína pNP2*, en donde dicha proteína pNP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501. El término "IBDN", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a las diferentes cepas de IBDN pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP, Eterradossi Ν, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000 19: 509-43]. El término "proteína pNP2*" se refiere, en general, a una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501 e incluye a cualquiera de las diferentes formas de las proteínas pNP2 representativas de cualquiera de las mencionadas cepas de IBDN [ΝCBI protein databank], de acuerdo con la definición realizada por Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez AB, Rodríguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by site-directed mutagenesis. Nirology. 1999 Sep 15; 262(1):190-199) así como a proteínas sustancialmente homologas a dichas proteínas pNP2 de IBDN, es decir, proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de identidad, respecto a dichas proteínas pNP2 de IBDN, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un 95%. Las proteínas pNP2* particulares se denominan siguiendo el formato "pNP2-n", donde "n" es el definido previamente. En una realización particular, dicha proteína pNP2* es una proteína seleccionada del grupo formado por: (i) la proteína pNP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pNP2 de IBDN; (ii) la proteína pNP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pNP2 de IBDN; (iii) la proteína pNP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pNP2 de IBDN; (iv) la proteína pNP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pNP2 de IBDN; (v) la proteína pNP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pNP2 de IBDN; (vi) la proteína pNP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pNP2 de IBDN; (vii) la proteína pNP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pNP2 de IBDN; y (viii) la proteína pNP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pNP2 de IBDN. La proteína pNP2* de IBDN presente en las NLPs-pNP2* proporcionadas por esta invención tiene una secuencia de aminoácidos que comprende entre 441 y 501 restos de aminoácidos, comenzando a partir del resto número 1, de cualquier proteína PNP2 representativa de cualquier cepa de IBDN, por ejemplo, de la proteína pNP2 de IBDN cepa Soroa [ΝCBI, número de acceso AAD30136]. En una realización particular, dicha proteína pNP2* de IBDN presente en las NLPs-pNP2* proporcionadas por esta invención es la proteína pNP2-456 cuya secuencia de aminoácidos está comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pNP2 de IBDN cepa Soroa [ΝCBI, número de acceso AAD30136]. La secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína PNP2-456 de IBDN se extiende desde el nucleótido 350 hasta al nucleótido 1719 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. ΝO: 1. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pNP2* de IBDN" incluye, además de las secuencias de nucleótidos de dichas fases de lectura abierta, otras fases de lectura abiertas análogas a las mismas codificantes de proteínas pNP2* de IBDN. El término "análoga", tal como aquí se utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos codificantes de pNP2* de IBDN, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es sustancialmente homologa a dicha secuencia de nucleótidos. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un 95%.
NLPs-pNP2* de IBDN: procedimiento para su producción y aplicaciones Las NLPs-pNP2* proporcionadas por esta invención pueden obtenerse mediante la expresión de dicha proteína pNP2* de IBDN, en células hospedadoras apropiadas, en particular, levaduras, que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pNP2* de IBDN en una construcción génica. En una realización particular, dichas células hospedadoras apropiadas son levaduras transformadas con un sistema de expresión adecuado que incluye una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pNP2* de IBDN. En un aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de NLPs-pNP2* de IBDN, en adelante procedimiento de la invención, que comprende cultivar una levadura que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN y que expresa dicha proteína pNP2* de IBDN, y, si se desea, recuperar dichas NLPs-pNP2* de la invención. En una realización particular, el procedimiento de la invención comprende las etapas de: a) cultivar células de levadura transformadas con un sistema de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína PNP2* de IBDN, en donde dicha proteína pNP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteínas pNP2* y su ensamblaje para formar NLPs-pNP2* de IBDN; y b) si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas NLPs-pNP2* de IBDN. Como puede apreciarse, el procedimiento de la invención comprende la expresión génica de una proteína pNP2* de IBDN mediante el empleo de un vector que permite la expresión de dicha proteína en levaduras. Para ello, el procedimiento de la invención comprende, como paso previo, la obtención de un sistema de expresión génica, tal como un sistema constituido por un plásmido que contiene una construcción génica que codifica para dicha proteína pNP2* de IBDN, seguido de la transformación de levaduras con dicho sistema de expresión, la expresión de las proteínas recombinantes, y, si se desea, el aislamiento de las NLPs-pNP2* de IBDN formadas por ensamblaje de dichas proteínas
PNP2* de IBDN, y, opcionalmente, la purificación de dichas NLPs-pNP2*. La obtención de levaduras transformadas con un sistema o vector de expresión que permite la expresión de la proteína pNP2* de IBDN puede ser realizada por un experto en la materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta tecnología (pESC epitope tagging vectors Instructions manual. Stratagene www.stratagene.com; Sambrook
J.1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, Ν.Y.). Las levaduras transformadas se cultivan bajo condiciones, conocidas por los expertos en la materia, que permiten la expresión de las proteínas recombinantes (pNP2*) y su ensamblaje para formar NLPs-pNP2* de IBDN. Tras la expresión de dicha proteína pNP2* de IBDN en levaduras, las proteínas pNP2* expresadas se ensamblan y forman las NLPs-pNP2* de IBDN, las cuales pueden ser aisladas o retiradas del medio, y, si se desea, purificadas. El aislamiento y purificación de dichas NLPs-pNP2* de IBDN de la invención puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante fraccionamiento en gradientes de sacarosa. El sistema o vector de expresión utilizado para transformar levaduras comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, y constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un sistema o vector de expresión útil para transformar levaduras, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN, en donde dicha proteína pNP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, estando dicha secuencia de nucleótidos codificante para dicha proteína pNP2* de IBDN operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción. En una realización particular, dicho sistema de expresión proporcionado por esta invención comprende la secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región codificante correspondiente a una proteína pNP2* seleccionada entre las proteínas pNP2-441, pNP2-452, pNP2-456, pNP2-466, pNP2-476, pNP2-487, pNP2-494 y pNP2-501. Los elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, presentes en dicho sistema de expresión incluyen promotores, que dirigen la transcripción de la secuencia de la proteína pNP2* (a la que está operativamente unido), y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc., todas ellas útiles en levaduras. Prácticamente cualquier sistema o vector de expresión apropiado puede ser utilizado en la generación de dicho sistema de expresión. A modo ilustrativo, dichos vectores incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), etc. que pueden contener, además, un origen de replicación heterólogo, por ejemplo, bacteriano, para que pueda ser amplificado en bacterias, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Estos vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook J et al. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory] y forman parte de la presente invención. En una realización particular, dicho sistema o vector de expresión es un plásmido, tal como un plásmido adecuado para transformar levaduras basado en un sistema de expresión pESC Yeast (Stratagene), por ejemplo, el plásmido pESCURA/pNP2-456 (Ejemplo 1.1) que contiene una construcción génica que codifica para la proteína pNP2-456 de IBDN y permite la producción de NLPs-pNP2* de IBDN en levaduras. El empleo del sistema de expresión génica proporcionado por esta invención para la producción y obtención de NLPs-pNP2* de IBDN constituye un aspecto adicional de esta invención. En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora, tal como una levadura, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína PNP2* de IBDN. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una levadura transformada con un sistema de expresión proporcionado por esta invención que comprende una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pNP2* de IBDN. Prácticamente cualquier levadura puede ser utilizada para la puesta en práctica del procedimiento de la invención; no obstante, en una realización particular, dicha levadura es una levadura del género Saccharomyces, por ejemplo, S. cerevisae, S. pombe, etc., una levadura del género Pichia, por ejemplo, P. pastoris, etc. Las NLPs-pNP2* de IBDN pueden ser utilizadas como vectores o vehiculizadores de productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación. En una realización particular, dichas moléculas de interés biológico incluyen polipéptidos de interés, tales como antígenos o inductores de respuestas inmunes en animales o humanos a los que se suministre, o bien incluyen secuencias de ácido nucleico, útiles en terapia génica, destinadas a ser introducidas en el interior de las células apropiadas. Dichas NLPs-pNP2* de IBDN pueden ser utilizadas para inmunizar animales, en particular, aves, per se o como vectores o vehiculizadores de moléculas con actividad biológica, por ejemplo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, fármacos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos o de diagnóstico. En una realización particular, dichas moléculas con actividad biológica incluyen antígenos o inductores de respuestas inmune en animales o humanos a los que se suministre, o bien fármacos que se liberan en su sitio de acción específico, o bien secuencias de ácido nucleico, todas ellas útiles en terapia génica y destinadas a ser introducidas en el interior de las células apropiadas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas
NLPs-pNP2* de IBDN en la elaboración de medicamentos tales como, vacunas, vectores para terapia génica (delivery systems), etc. En una realización particular, dicho medicamento es una vacuna destinada a conferir protección a animales, en particular, aves, frente a IBDN. En otra realización particular, dicho medicamento es un vector para terapia génica. En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de NLPs-pNP2* de IBDN, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna es útil para proteger animales, en particular, aves, frente a IBDN. En una realización particular, dichas aves se seleccionan del grupo formado por pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces. En una realización preferida, la vacuna proporcionada por esta invención es una vacuna útil para proteger pollos de la infección causada por IBDN. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de NLPs-pNP2* de la invención calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de las NLPs-pNP2* de la invención y el efecto de inmunización a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas. En una realización particular, dicha vacuna se prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro diluyente aceptable farmacéuticamente. La vacuna proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la vacuna proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Los siguientes Ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. El Ejemplo 1 ilustra la obtención de NLPs-pNP2- 456 de IBDN, mientras que el Ejemplo 2 pone de manifiesto la capacidad antigénica de dichas NLPs-pNP2-456 de IBDN en pollos. EJEMPLO 1 Obtención de VLPs-pVP2* mediante la expresión de diversas regiones de la proteína pVP2 en levaduras 1.1 Obtención de NLPs-pNP2-465 mediante la expresión de la región 1-456 de la proteína pNP2 en levaduras Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener NLPs de IBDN formadas por autoensamblaje de la proteína pNP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína
PNP2 de IBDN, denominadas NLPs-pNP2-456, en cultivos de levadura (Saccharomyces cerevisiae) se generó el vector pESCURAinv/pNP2-456. El primer paso en la construcción del vector se realizó mediante el clonaje de la región codificante de la proteína pNP2-456 (restos 1-456 de la pNP2 de IBDN) en el vector pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante digestión del vector pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y religación de la mezcla de digestión. El vector resultante, pESCURAinv, contiene la región de clonaje múltiple en posición invertida con respecto a la del vector parental pRS426. El fragmento de DΝA correspondiente a la proteína pNP2- 456 se obtuvo mediante PCR con los oligonucleótidos identificados como Oligo I (SEQ ID ΝO: 2) y Oligo II (SEQ ID ΝO: 3) empleando como molde el plásmido pNOTE.2/Poly (Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79:1047-1054). El fragmento fue purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y clonado en el vector pESCURAinv previamente digerido con los enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó pESCURAinv/pNP2-456 (Figura 1 ). El plásmido pESCURAinv/pNP2-456 se empleó para transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae haploide cepa 499 según un protocolo previamente descrito (Gietz & Woods. 2002. Transformation of yeast by the Liac/SS carrier DΝA/PEG method. Methods in Enzymology 350:87-96). Las levaduras transformadas con el plásmido fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de medio SC (CSM + YΝB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo (-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30°C, se seleccionó una colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes análisis de expresión de proteínas y formación de NLPs. El análisis de la expresión de la proteína pNP2-456 y la formación de NLPs se realizó siguiendo un protocolo descrito previamente para la caracterización de NLPs de IBDN en otros sistemas de expresión (Fernández- Arias A et al. 1998. Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus results in the formation of virus-like particles. Journal of General Virology 79, 1047-1054; Lombardo E et al. 1999. NP1, the putative RΝA-dependent RΝA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein NP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada en medio liquido CSM (-Ura) + YΝB suplementado con rafinosa al 2%. El cultivo se incubó a 30°C durante 24 h. Este cultivo fue empleado para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de 200 mi de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor galactosa al 2%. El cultivo fue mantenido a 30°C durante 18 horas (hasta una D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas a 3.000 rpm, durante 5 minutos a 4°C, se lavaron con agua destilada 1 vez, y el pellet fue resuspendido en tampón de lisis (TEN: Tris 10 mM, pH
8,0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X (Compl Roche). Para la lisis se añadió 1 volumen de "glass beads" (cuentas o perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de 425-600 micrones (Sigma). Esta mezcla fue sometida al vortex vigoroso durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de 30 segundos, y todo ello a 4°C. Tras ello se recuperó la fracción soluble por centrifugación de la mezcla de lisis a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Esta muestra fue sometida a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa según un protocolo previamente descrito (Lombardo E et al. 1999. NP1, the putative RΝA-dependent RΝA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein NP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:6973-6983). Las muestras obtenidas tras el fraccionamiento, así como una muestra del material de partida fueron analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols in Molecular Biology, Edited by: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl, John Wiley & Sons, http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm] y tinción con azul de coomassie (coomassie blue) e inmunodetección por Western blot empleando suero anti- NP2 [Current Protocols in Molecular Biology, Edited by: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl, John Wiley & Sons, http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm]. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2. Como puede observarse en la Figura 2A, la tinción con azul de coomassie reveló la presencia de una proteína con el tamaño (42 kDa) esperado para pNP2-456, junto con proteínas de mayor masa molecular, en diferentes fracciones correspondientes a la zona central del gradiente. La Figura 2B, correspondiente al análisis mediante Western blot, muestra que la bandas detectadas mediante tinción con azul de coomassie corresponden a la proteína pNP2-456 tanto en su forma monomérica como en forma de oligómeros de alto peso molecular. Estos resultados demostraron de forma fehaciente la correcta expresión del polipéptido pNP2- 456 en el cultivo de S. cerevisiae transformado con el plásmido pESCURAinv/pNP2- 456. A continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión tal como se ha descrito previamente (Lombardo E et al. 1999. NPl, the putative RΝA-dependent RΝA polymerase of infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein NP3, leading to efficient encapsidation into virus-like particles. Journal of Virology 73:6973-6983). Este análisis se realizó con el producto resultante de mezclar las fracciones 21 a 26 del gradiente indicado en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 3A, el análisis mediante TEM de dichas fracciones del gradiente reveló la existencia de NLPs de IBDN en esa región del gradiente. Las NLPs obtenidas (NLPs-pNP2-456) son isométricas (T = 1) y presentan un diámetro de 23 nm y aspecto circular. El subsiguiente análisis mediante SDS-PAGE
(Figura 3B) e inmunoblot con suero anti-NP2 (Figura 3C), mostró que la fracción contenía la proteína pNP2-456 con un grado de pureza estimado de, al menos, 95%.
1.2 Obtención de NLPs-pNP2* mediante la expresión de otras regiones de la proteína pNP2 en levaduras Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.1 se generaron los vectores que se describen en la Tabla 1 que expresaban en levaduras las NP2* que se relacionan en dicha Tabla 1, en la que se recoge, además, la isometría que presentan las NLPs- PNP2* obtenidas y los iniciadores utilizados.
Tabla 1
Figure imgf000021_0001
NOTAS: * El número indica el número de restos de aminoácidos de pNP2 de IBDN de cada proteína. (a) NLPs T = 1 (b) NLPs T = 7 (c) Túbulos 20 nm (d) Capsómeros (e) NLPs T = 13 (f) Túbulos 50 nm
EJEMPLO 2 Caracterización de la inmunogenicidad de las VLPs-pVP2-456 de IBDV Con el fin de determinar la inmunogenicidad de las NLPs-pNP2-456 (Ejemplo 1.1) se realizó un ensayo de inmunización en pollos de 1 dia. Un grupo de 7 animales SPF (libre de patógenos específicos) fue inmunizado por vía intramuscular con una única dosis de 200 μl conteniendo 10 μg de NLPs-pNP2-456/animal diluidas en PBS. Un grupo similar fue inyectado con PBS. Se realizaron extracciones semanales de suero de cada uno de los animales de ambos grupos. Los sueros de cada grupo y fecha fueron mezclados para obtener un suero homogéneo (pool) representado por volúmenes equivalentes de cada individuo del grupo. Los sueros fueron analizados mediante ELISA. Para ello, los pocilios fueron tapizados con 10 ng de NLPs-pNP2-456. Los ensayos fueron realizados según un protocolo previamente descrito (Current Protocols in Immunology. Edited by: Barbara Bierer, John E. Coligan, David H. Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober, John Wiley & Sons http://www.interscience.wiley.com/c_p/index.htm). Los resultados obtenidos, reflejados en la Figura 4, demuestran que una única inmunización en ausencia de adyuvante produce una potente respuesta frente a la proteína pNP2-456.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para la producción de cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLPs-pNP2*] que comprende cultivar una levadura que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN y que expresa dicha proteína pNP2* de IBDN, y, si se desea, recuperar dichas NLPs-pNP2*, en donde dicha proteína pNP2* de IBDN es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas de: a) cultivar células de levadura transformadas con un sistema de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteínas PNP2* y su ensamblaje para formar NLPs-pNP2* de IBDN; y b) si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas NLPs-pNP2* de IBDN.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha proteína pNP2* de IBDN se selecciona del grupo formado por:
(i) la proteína pNP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pNP2 de IBDN;
(ii) la proteína pNP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pNP2 de IBDN;
(iii) la proteína pNP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pNP2 de IBDN; (iv) la proteína pNP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pNP2 de IBDN;
(v) la proteína pNP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pNP2 de IBDN; (vi) la proteína pNP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pNP2 de IBDN;
(vii) la proteína pNP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pNP2 de IBDN; y
(viii) la proteína pNP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pNP2 de IBDN.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha levadura es del género Saccharomyces o del género Pichia.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha levadura es S. cerevisiae, S. pombe o P. pastoris.
6. Un sistema de expresión, útil para transformar levaduras, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína pNP2* de IBDN operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, en donde dicha proteína pNP2* es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína pNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501.
7. Una levadura que comprende un sistema de expresión según la reivindicación 6.
8. Una levadura transformada con un sistema de expresión según la reivindicación
6.
9. Levadura según cualquiera de las reivindicaciones 7 ú 8, en el que dicha levadura es del género Saccharomyces.
10. Levadura según la reivindicación 9, en el que dicha levadura es S. cerevisiae o S. pombe.
11. Empleo de un sistema de expresión según la reivindicación 6, o de una levadura según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para la producción de cápsidas virales vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLPs-pNP2*].
12. Una cápsida vacía del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLP-pNP2*] obtenida según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Una cápsida vacía del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLP-pNP2*], caracterizada porque está constituida por ensamblaje de proteínas pNP2* de IBDN expresadas en levaduras, en donde dicha proteína pNP2* de IBDN es una proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto "n" de la proteína PNP2 de IBDN, en donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501.
14. Cápsida según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que dicha proteína pNP2* de IBDN se selecciona del grupo formado por: (i) la proteína pNP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pNP2 de IBDN;
(ii) la proteína pNP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pNP2 de IBDN;
(iii) la proteína pNP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pNP2 de IBDN;
(iv) la proteína pNP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pNP2 de IBDN;
(v) la proteína pNP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pNP2 de IBDN;
(vi) la proteína pNP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pNP2 de IBDN;
(vii) la proteína pNP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pNP2 de IBDN; y
(viii) la proteína pNP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pNP2 de IBDN.
15. Cápsida según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque tiene isometría T=l.
16. Empleo de cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLPs-pNP2*], según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la elaboración de un medicamento.
17. Empleo según la reivindicación 16, en el que dicho medicamento es una vacuna frente a la enfermedad aviar denominada bursitis infecciosa o un vector para terapia génica.
18. Una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDN) [NLPs-pNP2*], según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
19. Vacuna según la reivindicación 18, para proteger aves de la infección causada por el virus causante de la bursitis infecciosa (IBDN).
20. Vacuna según la reivindicación 19, en la que dichas aves se seleccionan del grupo formado por pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces.
21. Una vacuna para proteger pollos de la infección causada por el virus causante de la bursitis infecciosa (IBDN) que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías de IBDN [NLPs-pNP2*], según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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