CN102145166B - 重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗、其构建方法及其应用 - Google Patents
重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗、其构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗、其构建方法及其应用。所说的重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗中包含带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组表达质粒，所说的VP2基因中融合有H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因，其中H5亚型禽流感病毒的M2e氨基酸序列为SLLTEVETPTRN，H9亚型禽流感病毒的M2e氨基酸序列为SLLTEVETHTRN，VP2基因序列参考GenBank登录号DQ906921。本发明的重组疫苗安全性好，不仅能用于预防IBDV，还能对H5或H9亚型的禽流感提供保护，是一种理想的双价疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组疫苗，具体地说，涉及一种重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗，属于生物工程技术领域。
背景技术
H5和H9亚型禽流感(AI)和鸡传染性法氏囊病（IBD）是严重危害养鸡业发展的重要疫病。目前，我国对这3种疾病的防控主要依赖于疫苗免疫。
现有禽流感疫苗存在的问题 据OIE统计，从2005年底起，我国实施全面强制免疫以来，我国仍发生42起高致病性H5亚型禽流感。我国学者利用反向遗传技术已经开发出5代H5亚型禽流感疫苗，即Re-1至Re-5，仍赶不上病毒的变易。特别注意的是，2008年江苏东台爆发的禽流感与现用疫苗株Re-4在基因水平上属于同一分支。现有疫苗不能对不断出现的新变易株提供有效保护。因此，亟需一种具有广谱免疫效力的新疫苗。
H9亚型禽流感感染鸡群后症状轻微，其本身并不一定造成禽群的大规模死亡，但易发生并发或继发感染，引起蛋鸡产蛋量显著下降，饲料报酬降低等，造成严重经济损失。随着疫苗的使用，病毒在免疫选择压作用下，发生变异以逃逸免疫。类似于H5亚型禽流感，市场现有多种不同H9疫苗株，如F株、Sy株、SS/94株、HL株和SD696株等，仍不能对新出现的变易株提供有效保护。因此，开发具有广谱免疫效力的新疫苗势在必行。
鸡传染性法氏囊病的危害 鸡传染性法氏囊对我国养禽业造成了巨大的危害，尤其是自1991年强毒和超强毒以及变易株引起的发病，常使局部地区IBD的防控相当困难。防治该病现用疫苗有常规的灭活疫苗和活疫苗，以及初步应用的亚单位疫苗。
现有传染性法氏囊疫苗存在的问题 现用活疫苗包括中等弱毒活疫苗和中等偏强毒疫苗。中等弱毒活疫苗用于无母源抗体的雏鸡早期免疫，对有母源抗体的鸡免疫效果较差，免疫时如果母源抗体的水平仍很高，则该类鸡只不仅免疫效果差、而且会降低其体内循环抗体，导致免疫后数周发病。中等偏强毒疫苗时，能使低母源抗体水平鸡只有较强的免疫反应，但其安全性较差，会致使免疫时低抗体水平鸡只应激水平大甚至发病。另外由于现有生产疫苗的无特定病原（SPF）鸡胚均存在一定程度的REV等外源性病毒污染。这对活疫苗应用带来一定的风险。现用灭活疫苗的生产受鸡胚供应的限制，且该制备过程需要人力较多，很多工艺烦琐，且部分工艺节点难以实现标准化控制。
现有研究表明，流感病毒的M2e能促进机体产生良好的广谱性免疫保护。M.D. Filette 等用M2e与HBcAg融合表达，并与CTA1-DD佐剂联合使用免疫小鼠，能保护H3N1或H1N1的攻毒。A. Jegerlehner等研究表明，将M2e蛋白与HBcAg偶联的免疫效果优于M2e与HBcAg嵌合表达形成病毒样颗粒的免疫效果。G. Zhao等用含多拷贝M2e抗原免疫小鼠后，能对不同H5N1分支病毒的攻击提供有效保护。禽流感M2e与血蓝蛋白(KLH)的偶联物制备疫苗，不仅能对同一亚型内不同变易株的攻击提供保护，还能对不同亚型禽流感病毒的攻击提供保护，提高其存活率达80%。但KLH是一种异源蛋白，诱导产生大量与禽流感免疫无关的抗体。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种抵抗禽流感和鸡传染性法氏囊病毒的重组疫苗。
本发明的重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗中，包含带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组表达质粒，所说的VP2基因中融合有H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因，其中H5亚型禽流感病毒的M2e氨基酸序列为SLLTEVETPTRN，H9亚型禽流感病毒的 M2e氨基酸序列为SLLTEVETHTRN,VP2基因序列参考GenBank登录号DQ906921。
所说的融合基因中，H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因融合到VP2基因的BC区或羧基端。
所说的VP2基因的BC区融合1拷贝的M2e基因。
所说的VP2基因的羧基端融合4拷贝的M2e基因。
重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的构建方法，先将H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因融合到鸡传染性法氏囊病毒VP2基因形成重组基因，再将重组基因克隆到大肠杆菌原核表达***或pFast-Bac-1杆状病毒真核表达***中表达获得重组表达质粒，并经发酵培养制备重组疫苗。
重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗在制备防治禽流感病毒和鸡传染性法氏囊病毒药物中的应用。
含有重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的组合物。
本发明具有如下技术效果：
1）本发明选用鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）作载体，可有效地避免诱导产生大量与禽流感免疫无关的抗体。
2）VP2形成的病毒样颗粒（VLP）含20个VP2三聚体，理论上，存在60个M2e展示在VP2的形成的VLP上，可大幅提高 M2e的量和免疫原性。根据对IBDV VP2形成的晶体结构表明，VP2含有4个刺突区域（PBC、PDE、PFG和PHI），其中在其PBC区可以***外源性短序列氨基酸而不影响VP2表达和结构的完整性。本发明利用VP2的PBC区作为表达外源基因M2e的***区。或在不影响VP2的空间结构条件下，将多拷贝的M2e经连接子连接融合至VP2的羧基端，再用原核或真核表达***进行表达。
3）本发明采用原核细胞（大肠杆菌）或Bac-to-Bac真核表达***的进行表达，获得的产物不含核酸成分，可实现大规模发酵培养，具有生产量大、产品安全，质量和工艺易于标准化等优点。
附图说明
图1为重组疫苗的构建中在VP2的PBC区***1拷贝的M2e的示意图；
图2为重组疫苗的构建中在VP2的羧基端融合4拷贝的M2e的示意图；
图3为 SDS-PAGE鉴定pET32a表达各重组菌的融合蛋白的结果图；
图4为Western-blotting鉴定pET32a***表达各重组菌的融合蛋白的结果图；
图5为SDS-PAGE鉴定杆状病毒***表达的各重组蛋白的结果图；
图6为Western-Blotting鉴定杆状病毒***表达的各重组蛋白的结果图；
图7为各疫苗免疫后针对M2e的抗体效价；
图8为各疫苗免疫后针对M2e的抗体效价。
具体实施方式
本发明使用的鸡传染性法氏囊病毒B87株从南京天邦生物科技有限公司生产的活疫苗中分离、扩繁、保存。原核表达载体pET32a和BL21(DE3)表达菌株购自Novagen公司，限制性内切酶Sal I、BamH I、Hind III、T4 DNA连接酶、rTag DNA聚合酶、pUC19T载体均购自宝生物科技有限公司。含2个赖氨酸（K）连接子的4拷贝H5-M2e基因（KK-(M2e)4H5）和4拷贝H9-M2e基因（KK-(M2e)4H9）经人工设计后，交由南京金思瑞生物科技有限公司合成。
实施例1 重组疫苗的构建和鉴定
重组疫苗的构建，包括下列步骤：
(1)本发明根据GenBank中注册的鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因的序列设计引物，从疫苗株B87中经RT-PCR的方法扩增出VP2基因，进行序列测定；
(2)人工合成含部分VP2基因，2个赖氨酸（K）连接子和4拷贝H5亚型流感病毒的M2e基因，即KK-M2e4H5；
(3)人工合成含部分VP2基因，2个赖氨酸（K）连接子和4拷贝H9亚型流感病毒的M2e基因，即KK-M2e4H9；
(4)将1拷贝H5亚型流感病毒的M2e基因，用PCR方法融合至VP2的PBC区，即VP2的PBC区融合1拷贝的M2e，即获得VP2BCM2eH5基因。将该重组基因克隆至pET32a原核表达载体，获得高效表达载体p32aVP2BCM2eH5，并转化至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)；
(5) 将（4）中获得的VP2BCM2eH5重组基因克隆至Bac-to-Bac表达***，获得高效表达载体pBac-VP2BCM2eH5，并转染Sf9昆虫细胞；
(6)将人工合成的KK-M2e4H5基因用PCR方法融合至VP2的羧基端，即获得VP2-KK-(M2e)4H5重组基因。将重组基因克隆至pET32a原核表达载体。获得高效表达载体p32aVP2-KK-(M2e)4H5，并转化至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)；
(7)将（6）中获得的VP2-KK-(M2e)4H5重组基因克隆至Bac-to-Bac表达***，获得高效表达载体pBac- VP2-KK-(M2e)4H5，并转染Sf9昆虫细胞；
(8) 将1拷贝H9亚型流感病毒的M2e基因，用PCR方法融合至VP2的PBC区，即VP2的PBC区融合1拷贝的M2e，即获得VP2BCM2eH9基因。将该重组基因克隆至pET32a原核表达载体，获得高效表达载体p32aVP2BCM2eH9，并转化至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)；
(9) 将（8）中获得的VP2BCM2eH9重组基因克隆至Bac-to-Bac表达***，获得高效表达载体pBac-VP2BCM2eH9，并转染Sf9昆虫细胞；
(10) 将人工合成的KK-M2e4H9基因用PCR方法融合至VP2的羧基端，即获得VP2-KK-(M2e)4H9重组基因。将重组基因克隆至pET32a原核表达载体。获得高效表达载体p32aVP2-KK-(M2e)4H9，并转化至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)；
(11)将（10）中获得的VP2-KK-(M2e)4H9重组基因克隆至Bac-to-Bac表达***，获得高效表达载体pBac-VP2-KK-(M2e)4H9，并转染Sf9昆虫细胞；
(12)用含氨苄的LB培养基分别发酵培养含有p32aVP2BCM2eH5，p32aVP2BCM2eH9，p32aVP2-KK-(M2e)4H5和p32aVP2-KK-(M2e)4H9的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)，并对相应的表达产物进行鉴定。
(13)分别扩增感染不同杆状病毒的Sf9细胞，这些杆状病毒含相应重组基因，分别包括pBac-VP2BCM2eH5，pBac-VP2BCM2eH9，pBac-VP2-KK-(M2e)4H5和pBac-VP2-KK-(M2e)4H9 重组基因，并对相应的表达产物进行鉴定；
(14)将（12）和（13）获得的表达产物制备成油乳剂疫苗免疫鸡，检测表达产物的免疫原性。
具体阐述如下：
1、VP2基因的获得
VP2引物：根据国内外已在GenBank中登陆的IBDV VP2基因序列经多重比较后设计合成VP2引物。
上游引物(VP2M2eH511)：
5'-ATGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC -3'；
下游引物(VP2M2eH512)：
5'-TTGTCGACCTTATGCTCCTGCAATTTTCAGGGG AGA-3'。
VP2基因的RT-PCR获取与测序验证：
以B87株为模版，提取RNA，采用下游引物VP2M2eH512进行反转录，获得cDNA。以获得的cDNA为模版，加入rTag DNA聚合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。用上游引物(VP2M2eH511)和下游引物(VP2M2eH512)进行PCR，将PCR后的产物在1%的琼脂糖凝胶电泳观察，可见约1323bp的扩增条带，大小与预期结果一致。将上述目的基因克隆至pUC19T载体，并送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证。
2、构建VP2
BC
-M2e
H5
和VP2
BC
-M2e
H9
基因
1）构建VP2
BC
-M2e
H5
基因
将M2eH5的基因序列经PCR引物融合克隆至VP2的PBC区。描述如下：引物包括VP2M2eH511、223M2eH512 (其序列为5'-GCTAGTGTTTC TGGTAGGCGTTTCGACCTCGGTTAGAAGACTGCTGGCTTGGTACTGTGATG
AGAATTGG-3')，223M2eH521(其序列为：5'-GCCAGCAGTCTTCTAACCGAGGTCGA AACGCCTACCAGAAACACTAGC
GGGGTAACAATCACACTGTTCT-3')和223M2eH522（其序列为： 5'- TAGTCGACG TTA TGCTCCTGCAATTTTCAGG GGAG -3'）。其中，引物223M2eH512和223M2eH521均包含有H5 M2e的基因序列。用引物VP2M2eH511和223M2eH512扩增出VP2的BC区的上游片段，用引物223M2eH521和223M2eH522扩增出VP2的BC区的下游片段。获得上下游片段后，利引物VP2M2eH511和223M2eH522经融合PCR的方法，将上下游片段融合成嵌合有M2e基因序列的VP2基因，即VP2BC-M2eH5。
2）构建VP2
BC
-M2e
H9
基因
将M2eH9的基因序列经PCR引物融合克隆至VP2的PBC区。描述如下：引物包括VP2M2eH511和VP2M2eH912( 其序列为：5'- GCTAGTGTTTCTGGTGTGCGTTTCGACCTCGGTTAGAAGACTGCTGGCTTGGTACTGTGATGAGAATTGG-3')，以及223M2eH921( 其序列为：5'- GCCAGCAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCACAC CAGAAACACTAGCG
GGGTAACAATCACACTGTTCT-3')，223M2eH522。其中，引物223M2eH511和223M2eH912均包含有H9 M2e的基因序列。用引物VP2M2eH511和223M2eH912扩增出VP2的BC区的上游片段，用引物223M2eH921和VP2M2eH522扩增出VP2的BC区的下游片段。获得上下游片段后，利引物VP2M2eH511和223M2eH522经融合PCR的方法，将上下游片段融合成嵌合有M2e基因序列的VP2基因，即VP2BC-M2eH9。
3、构建VP2-KK-(M2e)
4H5
和 VP2-KK-(M2e)
4H9
基因
1）构建VP2-KK-(M2e) 4H5 基因
将含2个赖氨酸（K）连接子的4拷贝H5 M2e基因，即KK-(M2e)4H5基因通过融合PCR的方法克隆至VP2基因的C端。描述如下：引物包括VP2M2eH511，VP2M2eH512，VP2M2eH521( 其序列为：5'-GGAGGTGGCCGACCTCAACTCT-3')和VP2M2eH522( 其序列为：5'-GTCGAC GTTAGTTTCTGGTAGGCGTTTC-3')。其中，引物VP2M2eH511和VP2M2eH512用于扩增VP2基因，而VP2M2eH521和VP2M2eH522用于扩增人工合成的KK-(M2e)4H5基因。用VP2M2eH511和VP2M2eH522将VP2基因和KK-(M2e)4H5基因用PCR的方法融合成一条完整基因，即VP2-KK-(M2e)4H5。
2）构建VP2-KK-(M2e) 4H9 基因
将含2个赖氨酸（K）连接子的4拷贝H9 M2e基因，即KK-(M2e)4H9基因通过融合PCR的方法克隆至VP2基因的C端。描述如下：引物包括VP2M2eH511，VP2M2eH512，VP2M2eH521和VP2M2eH922( 其序列为：5'-GTCGACGTTAGTTTCTGGTGTGCGTTTC -3')。其中，引物VP2M2eH511和VP2M2eH512用于扩增VP2基因，而VP2M2eH521和VP2M2eH922用于扩增人工合成的KK-(M2e)4H5基因。用VP2M2eH511和VP2M2eH922将VP2基因和KK-(M2e)4H9基因用PCR的方法融合成一条完整基因，即VP2-KK-(M2e)4H5。
4、原核表达质粒（pET32aVP2
BC
-M2e
H5
，pET32aVP2
BC
-M2e
H9
，pET32aVP2-KK-(M2e)
4H5
和pET32aVP2-KK-(M2e)
4H9
）的构建和鉴定
利用试剂盒将PCR产物经回收，连接克隆至pMD19-T载体中，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，经PCR和酶切鉴定，并测定每一构建质粒的核苷酸序列。将测序验证正确的序列经克隆至 pET32a原核表达载体获得相应的连接子，将连接子转化BL21-DE3感受态细菌，涂板(含Amp+)，过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，酶切、电泳鉴定。以上操作方法为本领域常规方法。
挑取含相应连接子的BL21的重组菌于含Amp+抗性的LB液体培养基中，37℃振摇培养，至一定时间后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导5h，收获细菌。离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，于冰浴中超声波破碎细胞。将完整的诱导菌体以及超声波破碎后的上清、沉淀经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白, 其结果如图3所示。以经法氏疫苗免疫制备的单因子血清，经Western-Blotting鉴定上述表达产物，获得良好反应性，其结果如图4所示。以上操作方法为本领域常规方法。
5、真核表达质粒（pBac-VP2
BC
M2e
H5
，pBac-VP2
BC
M2e
H9
，pBac-VP2-KK-(M2e)
4H5
和pBac-VP2-KK-(M2e)
4H9
）的构建和鉴定
利用试剂盒将PCR产物经回收，连接克隆至pMD19-T载体中，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，经PCR和酶切鉴定，并测定每一构建质粒的核苷酸序列。将测序验证正确的序列经克隆至 pFastBac1杆状病毒载体获得相应的连接子，将连接子转化DH10Bac?? E. coli感受态细菌，经抗性筛选，过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，酶切、电泳鉴定。挑取含相应连接子重组菌于抗性的LB液体培养基中，37℃振摇培养后，提取重组菌的Bacmid DNA，将此Bacmid DNA转染Sf9细胞获得相应的重组杆状病毒。将获得的重组杆状病毒扩大培养，收获相应的重组蛋白用于后续分析。包括用SDS-PAGE和Western-Blotting鉴定表达的融合蛋白，分别见图5和图6。以上操作方法参考Invitrogen公司Bac-to-Bac??Baculovirus Expression System说明书进行。
实施例2 表达蛋白的免疫原性试验
将pET32a原核表达***和pFastBac-1真核表达***获得的各重组蛋白制备成油乳剂疫苗（该制苗方法为本领域常规操作方法），按0.3ml/羽份经颈部皮下途径免疫20日龄商品鸡。共分8个重组抗原免疫组，另设相应的商品疫苗对照组3组，H5商品疫苗、H9商品疫苗、IBDV亚单位商品疫苗组，空载体对照组2组，pET32a空载体对照和空pFastBac-1载体对照组，空白对照组，合计14个试验组，每组10只鸡。试验动物分组详见表1。
在一免后4周，进行二免。在免疫后每隔2周采血，分离血清，用ELSA方法检测针对M2e的抗体效价，用病毒血清中和试验在CEF上检测针对VP2的抗体效价。
针对M2e的ELISA检测方法简述如下：以5μg/mL的人工合成2拷贝M2e多肽作为包被抗原，待检血清做1：400倍稀释，HRP标记的羊抗鸡二抗做1：3000倍稀释，在37℃用TMB底物显色15min，以100??L 2mol/LH2SO4溶液终止反应，检测OD450吸光值，绘制抗体水平消长曲线。以上操作为本领域常规操作。
针对VP2的抗体检测简述如下：鸡胚成纤维细胞（CEF）按1×106个/孔接入96孔细胞培养板，培养至长成单层。待检血清用2% DMEM分别作1:100、1:200、1:400、 1:800、1:1600、1:3200梯度倍比稀释，IBDV细胞适应毒同样用2% DMEM稀释至200TCID50/100μL，稀释后的病毒和血清等体积混合，置37℃含5%CO2的细胞培养箱作用1h，将作用后的病毒血清混合物按100μL/孔加至事先培养长成单层的CEF细胞培养板中，每个血清稀释度设4个重复，同时设置正常细胞对照与病毒对照。置CO2细胞培养箱内培养，120h至172h观察细胞病变出现情况，按完全出现保护的稀释度记为该待检血清的有效保护效价。以上操作为本领域常规操作。
表1. 试验动物分组
| 简称 | 疫苗抗原成分 | 简称 | 疫苗抗原成分 | 简称 | 疫苗抗原成分 |
| C5T | pET32aVP2BC-M2eH5 | C5B | pBac-VP2BCM2eH5 | IBDV | IBDV亚单位商品苗 |
| C9T | pET32aVP2BC-M2eH9 | C9B | pBac-VP2BCM2eH9 | 32a | pET32a对照 |
| 4H5T | pET32aVP2-KK-(M2e)4H5 | 4H5B | pBac-VP2-(M2e)4H5 | Bac | pFastBac1对照组 |
| 4H9T | pET32aVP2-KK-(M2e)4H9 | 4H9B | pBac-VP2-(M2e)4H9 | C | PBS |
| H5 | H5 商品苗 | H9 | H9 商品苗 |
根据ELISA检测各免疫组的M2e抗体效价得知，在二免后2周，即一免后的6周，各免疫组抗体均有明显上升。综合比较，pFastBac-1真核表达***获得的重组抗原疫苗组的抗体效价略高于pET32a原核表达***获得的重组抗原疫苗组。所有构建的重组抗原，仅C5T(pET32aVP2BC-M2eH5)和C9T(pET32aVP2BC-M2eH9)免疫效果略低于正常H5和H9商业疫苗，其他各重组疫苗的免疫效果均高于上述商品疫苗，尤以C5B（pBac-VP2BCM2eH5）和4H9B（pBac-VP2-(M2e)4H9）的效果较好，如图7所示。
根据在CEF细胞上的病毒血清中和试验检测结果得知，在二免后4周抗体效价显著高于一免后4周抗体效价。综合比较，pFastBac-1真核表达***获得的重组抗原疫苗组的抗体效价显著高于pET32a原核表达***获得的重组抗原疫苗组，且这些疫苗组的抗体效价亦略高于IBDV商品疫苗组的抗体效价，其中尤以4H5B（pBac-VP2-(M2e)4H5）和4H9B（pBac-VP2-(M2e)4H9），如图8所示。
经上述综合比较可以得知，本发明的重组抗原均能作为疫苗抗原使用，特别是pBac-VP2-(M2e)4H9。
Claims (4)
1.重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗，其特征在于，所说的疫苗中包含带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组表达质粒，所说的VP2基因中融合有H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因，其中H5亚型禽流感病毒的M2e氨基酸序列为SLLTEVETPTRN，H9亚型禽流感病毒的 M2e氨基酸序列为SLLTEVETHTRN,VP2基因序列参考GenBank登录号DQ906921，所说的融合基因中，H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因融合到VP2基因的BC区或羧基端，所说的疫苗通过下列方法制备而成：先将H5或H9亚型禽流感病毒的M2e基因融合到鸡传染性法氏囊病毒VP2基因形成重组基因，再将重组基因克隆到pFast-Bac-1杆状病毒真核表达***中表达获得重组表达质粒，并经发酵培养制备重组疫苗。
2.根据权利要求2所述的重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗，其特征在于，所说的VP2基因的BC区融合1拷贝的M2e基因。
3.根据权利要求2所述的重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗，其特征在于，所说的VP2基因的羧基端融合4拷贝的M2e基因。
4.含有权利要求1-3中任意一项重组禽流感M2e的鸡传染性法氏囊VP2亚单位疫苗的组合物。
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