WO2005010531A1 - Biochemisches diagnostikum zur erkennung von rheumatoider arthritis - Google Patents

Biochemisches diagnostikum zur erkennung von rheumatoider arthritis Download PDF

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WO2005010531A1
WO2005010531A1 PCT/AT2004/000190 AT2004000190W WO2005010531A1 WO 2005010531 A1 WO2005010531 A1 WO 2005010531A1 AT 2004000190 W AT2004000190 W AT 2004000190W WO 2005010531 A1 WO2005010531 A1 WO 2005010531A1
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WO
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combination
tubulin
desmin
antigen
diagnostic
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PCT/AT2004/000190
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English (en)
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Inventor
Kurt Herkner
Original Assignee
Kurt Herkner
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Publication date
Application filed by Kurt Herkner filed Critical Kurt Herkner
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9

Definitions

  • Biochemical diagnostic for the detection of rheumatoid arthritis Biochemical diagnostic for the detection of rheumatoid arthritis.
  • the invention relates to a biochemical diagnostic for the reliable detection of rheumatoid arthritis (short name: RA) from the blood (serum) and for differentiation from other rheumatic and inflammatory diseases, in particular for use in a laboratory chemical diagnostic method.
  • the invention relates in particular to a diagnostic agent for the detection of RA in children (juvenile idiopathic arthritis-JIA) and in adults (chronic polyarthritis-cP).
  • the tests currently used in the field of rheumatism / arthritis diagnostics are mainly as follows: a) Classic rheumatoid factor: the determination of an autoantibody of the immunoglobulin-M (IgM) type against the body's own immunoglobulin-G (IgG).
  • Rheumatoid factors in which autoantibodies of all three isotypes IgG, IgA and IgM against the body's own IgG are determined using the ELISA technique.
  • the object of the invention is to create a diagnostic for the detection of rheumatoid arthritis (RA), in particular juvenile idiopathic arthritis JIA and in adults of chronic polyarthritis cP, from the blood (serum) and to differentiate it from other rheumatic and inflammatory diseases, which can be made available on the one hand in a less complex and cost-effective manner and on the other hand ensures that tests in the field of rheumatism / arthritis diagnostics can be carried out in a simple and uncomplicated manner.
  • RA rheumatoid arthritis
  • JIA juvenile idiopathic arthritis JIA and in adults of chronic polyarthritis cP
  • the basis of the operation is the use of a new (combination ) Antigen that binds with the specific antibodies of the immunoglobulin G (IgG) type from the blood of RA patients, so-called autoantibodies, ie forms an antigen-antibody complex, the amount of which allows conclusions to be drawn about the type and severity of the disease.
  • IgG immunoglobulin G
  • the object is achieved in that the diagnostic agent contains a combination of natural or recombinant proteins acting as an antigen, consisting of ⁇ / ⁇ -tubulin and desmin, optionally additionally with nimentin.
  • the advantage of the diagnostic agent according to the invention is that the antigen-antibody complex formed in this way, or its quantification, allows an exact conclusion to be drawn about the type and severity (of the “activity”) of the disease, which also makes it possible to assess the success of the therapy
  • the advantage is Applicability of the diagnostic agent according to the invention in pediatric rheumatology, ie an expansion of the diagnosable range of application by approximately 20%, measured in terms of the population share of the 0 to 20 year olds. In this context, three factors must be emphasized, which clearly demonstrate the great benefit and advantage of the diagnostic agent according to the invention:
  • the invention is further set out and characterized in the subclaims 2 to 7 and the following description.
  • Tubulin T; Desmin: D; Vimentin: V
  • Solid phase methods such as ELISA or blot techniques (dot blot or strip test) in combination with a visualization of the hnm complex by means of a second, labeled antibody in combination with a chromogenic substrate (usual methods for ELISA or blot techniques).
  • the coating is carried out in commercial, chemically activated or even untreated microtiter plates.
  • For the blotting or freezing techniques are commercial Membranes used. The sample incubation times are variable between 4 and 24 hours at 4 ° to 30 ° C.
  • the color development is effected by means of an enzyme-conjugated (horseradish peroxidase) second anti (human) -IGG antibody and measured spectrophotometrically.
  • the present invention relates to the use of a combination antigen consisting of tubulin ( ⁇ / ⁇ -tubulin) combined with the protein desmin, optionally with the addition of vimentin, for the detection and monitoring of the course of rheumatoid arthritis in children and adults.
  • the subject arthritis marker is able to use the combination antigen, in contrast to the methods previously described in the literature and the known commercial tests, to the current status of the patient (ie the severity of the disease) and the influence of therapy reflect.
  • antigens Natural or recombinant are used in combination in the test described:
  • Combination antigen I ⁇ / ß-tubulin (50-80%) + desmin (20-50%)
  • Combination antigen II ⁇ / ß-tubulin (50-80%) + desmin (20-40%) + vimentin (5-10 %)
  • the percentages are mixing ratios of the antigens].
  • the MAPs Microtubule Associated Proteins
  • Mapmodulin can be added.
  • the non-intermediate filament tubulin is an integral component in addition to the intermediate filament Desmin and optionally the intermediate filament Vimentin. If vimentin is used, it should be native vimentin of animal origin (cattle) that does not contain any citrullinated sequences.
  • All proteins described react with the body's own IgG, i.e. they combine with it according to the principle of the antigen-antibody reaction to form an immune complex, the amount of which can be used for the detection and quantification of RA.
  • the test is indicative of RA and JIA due to its sensitivity and specificity, i.e. the test can detect the rheumatoid arthritis from other autoimmune diseases and other inflammatory diseases - especially from other diseases of the rheumatic type, e.g. Delimit SLE, collagenosis, etc., safely.
  • Table 1 Specificity and sensitivity of the test after clinical testing in child and adult patients and in healthy volunteers.
  • fragments of the antigen combinations used which are produced from ⁇ / ⁇ -tubulin and desmin by degradation reactions using proteolytic enzymes, and peptides with a molecular weight> 13 kDa contained, react qualitatively with RA sera in a Western blot in the sense of the diagnostic mentioned.
  • Step 1 (Coating"): Introducing 100 ⁇ L of a combination antigen I solution with a total protein concentration of 0.2-1.5 ⁇ g / mL (in a coating buffer) per well of a microtiter plate. Reaction time: 8 to 24 Hours. Reaction temperature: 4 ° C. This process is followed by washing steps (using the washing buffer defined below) in order to remove the excess antigen solution.
  • Step 2 (“blocking”): The washed cavities are removed by the action of 5 % (w / v) blocking milk ("nonfat dry milk” in distilled water) or by means of 1% (w / v) BSA solution (in distilled water) blocked to avoid non-specific bindings. Response time: 1 hour. Reaction temperature: 30 ° C.
  • Step 3 serum addition: this starts the actual analysis procedure.
  • the incubation times can be varied between 4 and 24 hours at 4 ° C to 30 ° C without changing the diagnostic value.
  • the serum incubation step is ended by a further washing process - as described under step 1 and step 2.
  • step 4 After the washing processes from step 4 are completed, a sweet solution is added, which is the basis for the peroxidase reaction and leads to color development - which, after stopping the reaction with 0.5% strength sulfuric acid (w / v) from step 6 (photometric Measurement) is followed.
  • This measurement is a spectrophotometric method that is carried out using an ELISA reader at a measurement wavelength of 450 nm.
  • the washed cavities are blocked by the action of 5% (w / v) blocking milk ("nonfat dry milk” in distilled water) or by means of 1% (w / v) B SA solution (in distilled water) to prevent unspecific binding Reaction time: 1 hour, reaction temperature: 30 ° C. After the milk / BSA exposure, the cavities are washed again as in step 1.
  • Step 3 serum addition: this starts the actual analysis procedure.
  • the enzyme coupled to the second antibody the approach described is "Horseradish Peroxidase" (HRP).
  • Step 5 substrate addition: After the washing processes from step 4 have been completed, a substrate solution is added which is the basis for the peroxidase reaction and leads to a color development which, after the reaction has been stopped, using 0.5% strength sulfuric acid (w / v) followed by step 6 (photometric measurement). This measurement is a spectrophotometric method that is carried out using an ELISA reader at a measurement wavelength of 450 nm.
  • the extinction values are divided into normal and pathological values, according to a “cut-off absorbance, which was determined after analysis of a statistical number of healthy or arthritis-negative subjects.
  • Tubulin ICN (Cat.No. 77112).
  • the product is in liquid form in a concentration of 10 mg / mL (according to the Bradford prototype method).
  • the pure substance is dissolved in SOmM piperazine, N '- bis [2-E hansnlfonsäüie sodium salt], ImM magnesium chloride (MgCl 2 ), ImM ethylene glycol bis (ß-aminoethyl ether) N, N, N', N'-tetraacetic acid, ImM Guanosine 5'-triphosphate and 10% (w / v) glycerin.
  • Desmin: ICN (Cat.No. 77104).
  • the substance is in the form of a lyophilized powder and contains 10MM sodium phosphate, which is mixed with 6M urea, 2mM dithiotreitol (DTT), ImM ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA) and 10MM methylammonium chloride. Purity> 98% (regarding foreign proteins)
  • Nimentin: IC ⁇ (Cat ⁇ o. 77110).
  • the substance is in the form of a lyophilized powder and contains lOmM sodium phosphate, which is mixed with 6M urea, 2mM dithiotreitol (DTT), and ImM ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA).
  • Coating buffer 50 mM sodium carbonate, pH 9.6
  • Wash solution 0.1 M PBS (phosphate-buffered saline) with the addition of Tween 20 (0.02% -0.05% v / v), hereinafter PBS-T

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Abstract

Biochemisches Diagnostikum zur Erkennung von Rheumatoider Arthritis (RA), insbesondere bei Kindern (Juvenile idiopathische Arthritis-JIA) und bei Erwachsenen (chronische Polyarthritis-cP) aus dem Blut (Serum) und zur Abgrenzung von anderen rheumatischen und entzündlichen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine als Antigen wirkende Kombination natürlicher oder rekombinanter Proteine, bestehend aus α/ß-Tubulin und Desmin, gegebenenfalls zusätzlich mit Vimentin enthält. Das Diagnostikum enthält vorzugsweise eine Kombination in einem Mischungsverhältnis von 50 bis 80 % α/ß-Tubulin und 20 bis 50 % Desmin. Das Diagnostikum liegt zweckmäßiger Weise in auf eine Festphase aufgebrachter Form vor, die eine Kavität einer Mikrotiterplatte (ELISA-Platte) oder zur Anwendung der Blot- oder Streifentechniken Membranen sind.

Description

Biochemisches Diagnostikum zur Erkennung von Rheurnatoider Arthritis.
Die Erfindung betrifft ein biochemisches Diagnostikum zur sicheren Erkennung von Rheurnatoider Arthritis (Kurzbezeichnung: RA) aus dem Blut (Serum) und zur Abgrenzung von anderen rheumatischen und entzündlichen Erkrankungen, insbesondere zur Anwendung in einem laborchemischen Diagnoseverfahren. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Diagnostikum zur Erkennung der RA bei Kindern (juvenile idiopathische Arthritis- JIA) und bei Erwachsenen (chronische Polyarthritis-cP).
Stand der Technik
Die z.Z. verwendeten Tests im Bereich der Rheuma-/Arthritis-Diagnostik sind hauptsächlich folgende: a) klassischer Rheumafaktor: die Bestimmung eines Autoantikörpers vom Typ Immunglobulin-M (IgM), gegen körpereigenes hnmunglobulin-G (IgG). Die Analysenmethode ist vorzugsweise die Nephelometrie und der ELISA (■= Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Ferner gibt es noch Immundiffusions- und koagulometrischen Techniken. b) Rheumafaktoren, bei denen Autoantikörper aller drei Isotypen IgG, IgA und IgM gegen das körpereigene IgG mittels ELISA Technik bestimmt werden. c) Bestimmung der Autoantikörper vom IgG-Typ gegen Zytokeratin(e) mittels indirekter immunfiuoreszenz auf modifizierten Hep-2 Zellen. d) Bestimmung von Autoantikörpern (vom IgG-Typ) gegen das Protein „RA33" mittels ELISA e) Bestimmung von Autoantikörpern (vom IgG-Typ) gegen citrullinierte, cyclische Peptide (CCP) mittels ELISA. Eine solche Methode ist in der WO 1999/28344 A2 geoffenbart, bei der primär Antikörper bestimmt werden, die in dem Intermediärfilament Vimentin die Aminosäure Citrullin (entstanden durch Deüninierung von Arginin) und distinkte, das Citrullin umgebende Aminosäuresequenzen erkennen. Durch diese Umwandlung des natürlichen Nimentins wird „in vivo" die Verknüpfung mit bestimmten Cytokeratinen getriggert (auch beschrieben als Sa-Immunsystem oder „hapten-carrier" System). f) Bestimmung von Autoantikörpern (vom IgG-Typ) gegen das Protein Fillaggrin mittels ELISA.
Alle unter a) bis f) beschriebenen Diagnosemethoden sind laut wissenschaftlichen Publikationen mit großen Schwankungsbreiten von Sensitivität und Spezifität behaftet und sind vor allem nicht für die labordiagnostische Erkennung des kindlichen Rheumas (JIA) geeignet.
(Statistik Austria, 2004: die Population der 0-15 Jährigen beträgt in Österreich 16,6% der Gesamtbevölkerung, hochgerechnet auf die Gruppe der 0-20 Jährigen sind dies etwa 20%, die von den bisher beschriebenen Assays nicht erfasst werden können).
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist nun die Schaffung eines Diagnostikums zur Erkennung der Rheumatoiden Arthritis (RA), insbesondere der Juvenilen Idiopathischen Arthritis-JIA und bei Erwachsenen der chronischen Polyarthritis-cP, aus dem Blut (Serum) und zur Abgrenzung von anderen rheumatischen und entzündlichen Erkrankungen, das einerseits in wenig aufwendiger und kostengünstiger Weise zur Verfügung gestellt werden kann und mittels welchem anderseits in einfacher und unkomplizierter Weise eine Durchfuhrung von Tests im Bereich der Rheuma-/ Arthritis-Diagnostik gewährleistet ist.. Grundlage des Nerfahrens ist die Nerwendung eines neuen (Kombinations-) Antigens, das mit den spezifischen Antikörpern vom Typ Immunglobulin-G (IgG) aus dem Blut von RA- Patienten, so genannten Autoantikörpern, eine Bindung eingeht, d.h. einen Antigen- Antikörper Komplex bildet, dessen Menge einen Rückschluss auf Art und Schweregrad der Erkrankung erlaubt.
Die Lösung der gestellten Aufgabe besteht gemäß vorliegender Erfindung darin, dass das Diagnostikum eine als Antigen wirkende Kombination natürlicher oder rekombinanter Proteine, bestehend aus α/ß-Tubulin und Desmin, gegebenenfalls zusätzlich mit Nimentin enthält.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Diagnostikums liegt darin, dass der so gebildete Antigen-Antikörper Komplex, bzw. dessen Quantifizierung einen genauen Rückschluss auf Art und Schwere (der „Aktivität") der Erkrankung erlaubt, womit auch eine Einschätzung des Therapieerfolges möglich wird.. Von besonderem Vorteil ist die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Diagnostikums in der pädiatrischen Rheumatologie, i.e. eine Ausweitung des diagnostizierbaren Anwendungsbereichs um etwa 20 %, gemessen am Bevölkrungsanteil der 0 bis 20-Jährigen. In diesem Zusammenhang müssen drei Faktoren betont werden, welche den hohen Nutzen und Vorteil des erfindungsgemäßen Diagnostikums eindeutig belegen:
1. Die Nerwendung einer spezifischen Antigenkombination, deren Grundsubstanz das Nicht- Intermediärfilament Tubulin ist, das immer mit Desmin kombiniert wird, und gegebenenfalls zusätzlich mit Vimentin.
2. Die Anwendbarkeit des Diagnostikums in der pädiatrischen Rheumadiagnostik.
3. Die Möglichkeit der Quantifizierung des Schweregrades der Krankheit und damit auch der Feststellung der Therapiewirkung.
Die Erfindung ist ferner in den Unteransprüchen 2 bis 7 und der nachfolgenden Beschreibung näher dargelegt und gekennzeichnet.
Im Weiteren werden noch folgende Kurzbezeichnungen verwendet: Tubulin: T; Desmin: D; Vimentin: V
Die getesteten, in der Routineanalytik einsetzbaren Analysenverfahren zur Erzielung eines auswertbaren Antigen-Antikörper Komplexes sind:
Festphasenmethoden (Antigen ist fixiert), wie z.B. ELISA oder Blot-Techniken (Dot-Blot oder Streifentest) in Kombination mit einer Visualisierung des hnmunkomplexes mittels eines zweiten, markierten Antikörpers in Kombination mit einem chromogenen Substrat (übliche Methoden bei ELISA oder Blot Techniken). Bei den für die gegenständliche Anwendung getesteten Analysenverfahren wurden die Antigene in Gesamtproteinkonzentrationen von 0,1 - 1,5 μg/mL (= Coatingkonzentration) verwendet. Das Coating wird in kommerziellen, chemisch aktivierten oder auch unbehandelten Mikrotiterplatten durchgeführt. Für die Blot- oder Sfreifentechniken werden kommerzielle Membranen verwendet. Die Probeninkubationszeiten sind variabel zwischen 4 und 24 Stunden bei 4° bis 30° C. Die Farbentwicklung wird mittels eines enzymkonjugierten (horseradish-peroxidase) zweiten anti(human)-IgG Antikörpers bewirkt und spektrophotometrisch vermessen. Die gemessenen Extinktionen werden nach Leerwertkorrektur (*•= Abzug eines Reagentien-Blanks) als „Arbitrary Units" zur Quantifizierung verwendet.
A] Das Antigen:
Gegenstand vorliegender Erfindung ist die Verwendung eines Kombinationsantigens, bestehend aus Tubulin (α/ß-Tubulin), kombiniert mit dem Protein Desmin, gegebenenfalss unter Zusatz von Vimentin, zur Erkennung und zum Verlaufsmonitoring der Rheumatoiden Arthritis bei Kindern und Erwachsenen.
Gemäß klinischen Testungen ist der gegenständliche Arthritis-Marker bei Verwendung des Kombinations-Antigens, im Gegensatz zu den bisher in der Literatur beschriebenen Methoden und den bekannten kommerziellen Tests in der Lage, den aktuellen Status des Patienten (i.e. die Schwere der Krankheit) und den Therapieeinfluss widerzuspiegeln.
Folgende Antigene (natürliche oder rekombinante) werden im beschriebenen Test in Kombination eingesetzt:
Kombinationsantigen I: α/ß-Tubulin (50-80%) + Desmin (20-50%) Kombinationsantigen II: α/ß-Tubulin (50-80%) + Desmin (20-40%) + Vimentin (5-10%)
[Die Prozentangaben sind Mischungsverhältnisse der Antigene]. Zur Optimierung der Kombination Tubulin mit Desmin (Kombinationsantigen I) können die MAPs (Microtubule Associated Proteins) E-MAP-115 und Mapmodulin hinzugefügt werden. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationsantigene ist das Nicht- Intermediärfilament Tubulin ein integraler Bestandteil neben dem Intermediärfilament Desmin und gegebenenfalls dem Intermediärfilament Vimentin. Wenn Vimentin mitverwendet wird, soll es natives Vimentin tierischer Herkunft (Rind) sein, das keine zitrullinierten Sequenzen enthält.
Alle beschriebenen Proteine reagieren mit körpereigenem IgG, d.h. sie verbinden sich mit diesem nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper Reaktion zu einem immunkomplex, dessen Menge für die Erkennung und Quantifizierung der RA verwendet werden kann. Bei Verwendung der Kombinationsantigene I und TJ ist der Test aufgrund seiner Sensitivität und Spezifität indikativ für die RA und die JIA, d.h. der Test kann die rheumatoiden Arthritiden von anderen Autoimmunerkrankungen und sonstigen entzündlichen Erkrankungen- speziell aber auch von anderen Krankheiten des rheumatischen Formenkreises, wie z.B. SLE, Kollagenosen, etc., sicher abgrenzen. Auch das unter e) beschriebene Verfahren, das den neuesten Stand der Technik darstellt, versagt völlig bei JIA, wie die rezente Literatur belegt: Autoimmunity 35(6), 397-401 (2002), Annais of the Rheumatic Dieseases 61(7), 608-611 (2002), Journal of Rheumatology 30(4), 825-828 (2003). Die Unterschiede in der Verwendbarkeit liegen in den diagnostischen Qualitäten, beschrieben durch die Größen „Spezifität" und „Sensitivität" (siehe dazu Tabelle 1).
Tabelle 1: Spezifität und Sensitivität des Tests nach klinischer Erprobung bei kindlichen und erwachsenen Patienten und bei gesunden Probanden.
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Es wird ausserdem noch festgehalten, dass auch Bruchstücke der verwendeten Antigenkombinationen, die aus α/ß-Tubulin und Desmin durch Abbaureaktionen mittels proteolytischer Enzyme hergestellt werden und Peptide mit einem Molekulargewicht > 13 kDa enthalten, mit RA-Seren in einem Western-Blot in Sinne des angeführten Diagnostikums qualitativ reagieren.
B] Die Analysenmethode:
Zur Quantifizierung des Immunkomplexes können verschiedene immunologische Techniken verwendet werden:
1. Aufbringen (Coating) des Antigens auf eine Festphase. Beispiele: i) Mikrotite latte (ELISA) ii) folienartige Trägermaterialien (Blot- oder Streifen-Techniken).
2. Difmsiontechniken. Beispiele: i) Ouchterlony Methode ii) Radiale Immundiffusion.
Die Aufzählung der Anwendungsbeispiele erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Die oben angegebenen Werte wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests erzielt.
C] Anwendungsbeispiel 1:
Quantitativer Antikörper-Nachweis mittels ELISA unter Nerwendung von Kombinationsantigen I:
Schritt 1 („Coating"): Einbringen von 100 μL einer mit einer Kombinationsantigen I- Lösung mit einer Gesamtproteinkonzentration von 0,2 - 1,5 μg/mL (in einem Coating-Puffer) pro Kavität einer Mikrotiterplatte. Reaktionsdauer: 8 bis 24 Stunden. Reaktionstemperatur: 4° C. Dieser Norgang wird gefolgt von Waschschritten (unter Nerwendung des in der Folge n her definierten Waschpuffers), um die überschüssige Antigenlösung zu entfernen. Schritt 2 („Blocking"): Die gewaschenen Kavitäten werden durch Einwirkung von 5 % (w/v) Blockiermilch („nonfat dry milk" in Aqua dest.) oder mitttels 1% (w/v) BSA-Lösung (in Aqua dest.) blockiert, um unspezifische Bindungen zu vermeiden. Reaktionsdauer: 1 Stunde. Reaktionstemperatur: 30° C. Nach der Milch/BSA-Exposition werden die Kavitäten wieder, wie unter Schritt 1, gewaschen. Schritt 3 (Serumzugabe): damit beginnt die eigentliche Analysenprozedur. 100 μL Probe (=Serumverdünnung 1:20 bis 1:100 in Waschpuffer oder physiologicher NaCl-Lösung) werden in die Kavitäten pipettiert und inkubiert.
Die Inkubationszeiten können zwischen 4 und 24 Stunden bei 4°C bis 30°C variiert werden, ohne die diagnostische Wertigkeit zu verändern. Der Seruminkubationsschritt wird durch einen weiteren Waschvorgang- wie unter Schritt 1 und Schritt 2 beschrieben, beendet.
Schritt 4 („Konjugieren"):
Zugäbe eines enzymmarkierten, zweiten Antikörpers, der gegen humanes IgG gerichtet ist (=Konjugat), gefolgt von einer 30 minütigen Inkubation bei 37°C, sowie einer neuerlichen Waschprozedur. Bei dem an den zweiten Antikörper gekoppelten Enzym handelt es sich bei dem beschriebenen Ansatz um „Horseradish Peroxidase" (HRP). Schritt 5 (Substratzugabe):
Nach Beendigung der Waschvorgänge von Schritt 4 wird eine Sübs ratlösung zugegeben, die die Grundlage für die Peroxidase-Reaktion ist und zu einer Farbentwicklung führt- welche nach Abstoppen der Reaktion mittels 0,5%iger Schwefelsäure (w/v) von Schritt 6 (photometrische Messung) gefolgt wird.
Diese Messung ist eine spektrophotometrische Methode, die mittels eines ELISA-Readers bei Messwellenlänge von 450 nm durchgeführt wird.
Die Daten aus dieser Messung, i.e. die Extinktionen, werden als „Arbitrary Units" (AU) zur quantitativen Beurteilung der gefundenen Immunkomplexe verwendet. Interpretation: Die Extinktionswerte werden in unauffällige und pathologische Werte eingeteilt, gemäß einer „cut-of " Extinktion, die nach Analyse einer statistischen Anzahl von gesunden, bzw. Arthritis-negativen Probanden ermittelt wurde. D] Anwendungsbeispiel 2:
Quantitativer Antikörper-Nachweis mittels ELISA unter Nerwendung von Kombinationsantigen U:
Schritt 1 Coating"):
Einbringen von 100 μL einer mit einer Kombinationsantigen II- Lösung mit einer Gesamtproteinkonzentration von 0,2 - 1,5 μg/mL (in einem Coating-Puffer) pro Kavität einer Mikrotiterplatte. Reaktionsdauer: 8 bis 24 Stunden. Reaktionstemperatur: 4° C. Dieser Norgang wird gefolgt von Waschschritten (unter Nerwendung des in der Folge näher definierten Waschpuffers), um die überschüssige Antigenlösung zu entfernen. Schritt 2 („Blocking"):
Die gewaschenen Kavitäten werden durch Einwirkung von 5 % (w/v) Blockiermilch („nonfat dry milk" in Aqua dest.) oder mitttels 1% (w/v) B SA-Lösung (in Aqua dest.) blockiert, um unspezifische Bindungen zu vermeiden. Reaktionsdauer: 1 Stunde. Reaktionstemperatur: 30° C. Nach der Milch/BSA-Exposition werden die Kavitäten wieder, wie unter Schritt 1, gewaschen.
Schritt 3 (Serumzugabe): damit beginnt die eigentliche Analysenprozedur. 100 μL Probe (=Serumverdünnung 1:20 bis 1:100 in Waschpuffer oder physiologicher NaCl-Lösung) werden in die Kavitäten pipettiert und inkubiert.
Die Inkubationszeiten können zwischen 4 und 24 Stunden bei 4°C bis 30°C variiert werden, ohne die diagnostische Wertigkeit zu verändern. Der Seruminkubationsschritt wird durch einen weiteren Waschvorgang, wie unter Schritt 1 und Schritt 2 beschrieben, beendet. Schritt 4 („Konjugieren"): Zugabe eines enzymmarkierten, zweiten Antikörpers, der gegen humanes IgG gerichtet ist (=Konjugat), gefolgt von einer 30 minütigen Inkubation bei 37°C, sowie einer neuerlichen Waschprozedur. Bei dem an den zweiten Antikörper gekoppelten Enzym handelt es sich bei dem beschriebenen Ansatz um „Horseradish Peroxidase" (HRP). Schritt 5 (Substratzugabe): Nach Beendigung der Waschvorgänge von Schritt 4 wird eine Substratlösung zugegeben, die die Grundlage für die Peroxidase-Reaktion ist und zu einer Farbentwicklung führt, welche nach Abstoppen der Reaktion mittels 0,5%iger Schwefelsäure (w/v) von Schritt 6 (photometrische Messung) gefolgt wird. Diese Messung ist eine spektrophotometrische Methode, die mittels eines ELISA-Readers bei Messwellenlänge von 450 nm durchgeführt wird.
Die Daten aus dieser Messung, i.e. die Extinktionen, werden als „Arbitrary Units" (AU) zur quantitativen Beurteilung der gefundenen Irnmunkomplexe verwendet.
Interpretation:
Die Extinktionswerte werden in unauffällige und pathologische Werte eingeteilt, gemäß einer „cut-off Extinktion, die nach Analyse einer statistischen Anzahl von gesunden, bzw. Arthritis-negativen Probanden ermittelt wurde.
Reagenzien, soweit nicht in der Beschreibung definiert und Präzisierung der Waschschritte:
Tubulin: Fa. ICN (Cat.No. 77112). Das Produkt liegt in flüssiger Form in einer Konzentration von lOmg/mL vor (laut Protembestimmungsmethode nach Bradford). Die Reinsubstanz ist gelöst in SOmM Piperazin- ,N' - bis [2-E hansnlfonsäüie Natriumsalz], ImM Magnesiumchlorid (MgCl2), ImM Ethylenglykol-bis(ß-Aminoethyläther)N,N,N',N'- Tetraessigsäure, ImM Guanosin-5'-triphosphat und 10% (w/v) Glycerin.
Desmin: Fa. ICN (Cat.No. 77104). Die Substanz liegt als lyophylisiertes Pulver vor und enthält produktionsbedingt lOmM Natriumphosphat, das mit 6 M Harnstoff, 2mM Dithiotreitol (DTT), ImM Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und lOmM Methylammoniumchlorid versetzt ist. Reinheit > 98% (Fremdproteine betreffend) Nimentin: Fa. ICΝ (CatΝo. 77110). Die Substanz liegt als lyophylisiertes Pulver vor und enthält produktionsbedingt lOmM Νatriumphosphat, das mit 6 M Harnstoff, 2mM Dithiotreitol (DTT), und ImM Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) versetzt ist. Reinheit > 98% (Fremdproteine betreffend). Coating-Puffer: 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,6 Waschlösung: 0,1 M PBS (phosphate-buffered saline) mit Zusatz von Tween 20 (0,02%-0,05% v/v), im Folgenden PBS-T
Waschvorgang: 300 μL PBS-T pro Kavität, 10 Minuten Einwirkdauer, absaugen, 2 Wiederholungen
Die vorstehende Methodenbeschreibung ist, abgesehen von den eingesetzten Antigenen, ein in vielen Varianten beschriebenes, kommerzielles Verfahren, das mit beliebigen anderen, aus der Literatur bekannten Reagenzien für das Coaten, Blockieren, Waschen und Konjugieren durchgeführt werden kann (sh .z.B.: Harlow Ed und Lane David „Antibodies. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1988). Die oben beschriebene Variante hat sich für die gegenständliche Analyse distirikter RA- Antikörper, die mit den Kobinationsantigenen I und II reagieren, als optimal erwiesen, und ist deshalb hier detailliert beschrieben.

Claims

Patentansprüche:
1. Biochemisches Diagnostikum zur Erkennung von Rheurnatoider Arthritis (RA), insbesondere bei Kindern (Juvenile idiopathische Arthritis-JIA) und bei Erwachsenen (chronische Polyarthritis-cP) aus dem Blut (Serum) und zur Abgrenzung von anderen rheumatischen und entzündlichen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine als Antigen wirkende Kombination natürlicher oder rekombinanter Proteine, bestehend aus α/ß-Tubulin und Desmin, gegebenenfalls zusätzlich mit Nimentin enthält.
2. Diagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kombination in einem Mischungsverhältnis von 50 bis 80 % α/ß-Tubulin und 20 bis 50 % Desmin enthält.
3. Diagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kombmation von α/ß-Tubulin und Desmin und Nimentin umfasst, in der α/ß-Tubulin in einem Mischungsverhältnis zwischen 50 bis 80 %, Desmin zwischen 20 bis 40 % und Nimentin zwischen 5 bis 10 % enthalten sind.
4. Diagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form einer gepufferten, gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe enthaltenden Lösung in destilliertem Wasser mit einer Gesamtproteinmenge von 0,1 bis 1,5 μ/mL vorliegt.
5. Diagnostikum nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kombinationsantigen in auf eine Festphase aufgebrachter Form vorliegt.
6. Diagnostikum nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase eine Kavität einer Mikrotiterplatte (ELISA-Platte) ist.
7. Diagnostikum nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase zur Anwendung der Blot- oder Streifenteclmiken Membranen sind.
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