WO2003106676A1 - 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法 - Google Patents

微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法 Download PDF

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WO2003106676A1
WO2003106676A1 PCT/JP2003/007620 JP0307620W WO03106676A1 WO 2003106676 A1 WO2003106676 A1 WO 2003106676A1 JP 0307620 W JP0307620 W JP 0307620W WO 03106676 A1 WO03106676 A1 WO 03106676A1
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probe
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identifying
detecting
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PCT/JP2003/007620
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English (en)
French (fr)
Inventor
順也 橋田
上野　紳吾
勇 武藤
貴美子 成瀬
田村　美穂
耕一郎 松田
島津　光伸
寅喆 小林
石古　博昭
Original Assignee
日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社
株式会社三菱化学ビーシーエル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a specific probe for detecting and identifying microorganisms, particularly harmful bacteria in the fields of medicine and food, and a method for detecting and / or detecting the same using the same.
  • Microorganism Microorganism name Microorganism number
  • the first method is to use blood agar medium, MacConkey medium (for a stool, SS agar medium, etc.), various confirmation mediums, diagnostics, etc.
  • this method has a problem that the identification takes time.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the region of 400-500 bases from the 5 'end of the 16S rRNA molecule is an effective region to distinguish between closely related species of the phylogenetically conserved genus, Although it has been reported that a probe having a partial nucleotide sequence of those regions is prepared to detect and identify a specific microorganism, the 16S rRNA nucleotide sequence has low conservation between microorganisms, The VI, V2 and V3 regions having high specificity for a particular species are not individually specified, and a probe is prepared from the nucleotide sequence of the region to efficiently and specifically identify the microorganisms shown in Table 1 of the present invention. No method has been reported for detection and identification. Disclosure of the invention
  • the present invention can quickly and reliably detect harmful microorganisms in the fields of medicine and food, based on the base sequences of the VI, V2 and V3 regions having high specificity for a specific species of 16S rRNA.
  • Another object of the present invention is to provide a probe for detecting and / or identifying a microorganism and a detection and / or identification method using the probe.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, focused on the base sequences of specific VI, V2 and V3 regions, which are particularly high in species, among 16S rRNA base sequences. However, they have found a probe that can specifically detect and / or identify harmful bacteria in the fields of medicine and food, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following 1 to 66.
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans Actinobacillus actinomycetemcomitans, Acinetobacter calcoaceticus, Haemophilus influenza, Haemophilus ⁇ ⁇ uenzae, (Stenotrophomonas maltophilia) s Proteus 'Mirabilis (Proteus mirabilis), Streptococcus' Pneumoniae
  • Streptococcus oralis Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Capyronoctanae, Nanoha, Campylobacter fetus; Enterococcus gallinarumj, Enterococcus' caserifuranocus' (Enterococcus casselif lavus), Aeromonas' Nody drofira '(Aeromonas hydrophila), Sanoremonella' Noraffifi A (Salmonella paratyphi A), Sanoremonera phiphitostiphisti (Shiprepo typhisti strophy spell) equisimilis), Streptococcus canis, Streptococcus canis, Klebsiella oxytoca, Staphylococcus' Staphylococcus saprophyticus ⁇ Pasteurum munoletusida (Pasteu) rella multocida),
  • Mycobacterium avium Mycobacterium intracellulare (Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasi i), Mycobacterium gordonae (Mycobacterium gordonae)
  • the probe according to (1) which is selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 152 or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Actinobacillus actinomycetemcomitans comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Hemophilus influenzae comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 8 or 9, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying or identifying Stenotrophomonas maltophilia comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, 11, or 12, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 14, or 15, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Proteus mirabilis.
  • a probe for detecting and Z or identifying Streptococcus pneumoniae comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17, or 18, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Pseudomonas aeruginosa comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, 20, or 21, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Citrobacter frendi comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22, 23 or 24, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 25, 26 or 27, or a complementary sequence thereof, for detecting, identifying, or identifying Bayonella parvula.
  • a probe for detecting, identifying, or identifying Buffalo's stuarty comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, 29 or 30, or its complementary sequence.
  • a probe for detecting and / or identifying Neisseria gonorrhoeae comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31, 32 or 33, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Streptococcus agaratache comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34, 35 or 36, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37, 38 or 39, or a complementary sequence thereof, for detecting, detecting, or identifying Morganella 'morganii.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Pacteroides fragilis comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40, 41 or 42, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting, Z or identifying Staphylococcus hominis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43, 44 or 45, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49, 50 or 51, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying or identifying Staphylococcus hemolyticus.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52, 23 or 53, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Enterobacter.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54, 55, or 56, or a complement thereof, for detecting and / or identifying Enterobacter aerogenes.
  • a probe for detecting and / or identifying Staphylococcus epidermidis comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 57, 58 or 59, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Serratia marcescens comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 63, 23 or 64, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Streptococcus anginosus comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65, 66, or 67, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Escherichia coli comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 68, 69 or 70, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54, 71 or 72, or a complementary sequence thereof, for detecting, detecting, or identifying Klebsiella pneumoniae.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73, 74, or 75, or a complementary sequence thereof, for detecting, identifying, or identifying Enterococcus faecalis.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 76, 77, or 78, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Enterococcus phenezim.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 82, 83 or 18, or a complementary sequence thereof, for detecting and identifying or identifying Streptococcus mitosis.
  • a probe for detecting and / or identifying or identifying Streptococcus intermedius comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60, 84 or 67, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Listeria monocytogenes comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 85, 86 or 87, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Clostridium perfringens comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 88, 89 or 90, or a complement thereof.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Corynepacteria aquatium comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 91, 92 or 93, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 94, 95, or 18, or a complementary sequence thereof, for detecting and Z or identifying Streptococcus' oralis.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 96, 97 or 98, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Staphylococcus aureus.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Neisseria meningitidis comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99, 100 or 101, or a complementary sequence thereof.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 102, 103 or 104, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Campi pacter fetus.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 105, 106 or 107, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Enterococcus' galinalum.
  • a probe for detecting and / or identifying Aeromonas' hydrofila comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110, 111 or 112, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Salmonella typhi comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 115, 114, or 53, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and Z or identifying Streptococcus alleimiris comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 116, 117 or 118, or a complementary sequence thereof; 0
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 119, 120 or 121, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying S. caesus.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52, 23 or 122, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Klebsiella oxytoca.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46, 123 or 124, or a sequence complementary thereto, for detecting and identifying or identifying Staphylococcus coccus saprofiticus.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 125, 126, or 127, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Pasteurella multocida.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 128, 129 or 130, or a complementary sequence thereof, for detecting and / or identifying Eikenella corodense.
  • a probe for detecting and / or identifying Streptococcus pyogenes comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 131, 132 or 133, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and Z or identifying Moraxella catarrhalis comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 134, 135 or 136, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Legionella 'pneumophila comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 137, 138 or 139, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting, detecting, or identifying Mycobacterium tuberculosis cis comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 140, 141 or 142, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Mycobacterium intracellulare comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 146, 147 or 145, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying Mycobacterium kansasii comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 148, 149 or 145, or a complementary sequence thereof.
  • a probe for detecting and / or identifying mycopacterium 'Gordone comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 150, 151 or 152, or a complement thereof.
  • a method for designing a probe comprising determining a mismatched site by comparing microorganisms, determining a region containing the mismatched site and having a base length of 20 to 100 bp.
  • One or more of the probes according to (1) or (2) is used, characterized by the fact that Actinobacillus actinomycetemcomitans, Acinetopactor '' Norecoaceticus, Hemofuinoles infnolenza, Stenotrophomonas ma Norrethophilia, Proteus 'Miravillis, Streptococcus pneumoniae, Syudomonas enoleginosa, Citrobatata Frendi, Bayonela Pal Pula, Providencia Stuati, Neisseria Gonoloye, Streptogastroe', Streptogastroe's-Mora Fragiris, Staphylococcus hominis, Staphylococcus penorenelli, Staphylococcus.
  • FIG. 1 is a diagram showing the VI, V2 and V3 regions in the base sequence of 16S rRNA of a microorganism. Description of Sequence Listing
  • SEQ ID NO: 153 is synthetic DNA.
  • SEQ ID NO: 154 is a synthetic DNA.
  • the probe for detecting and identifying microorganisms of the present invention and the method for detection and / or identification using the same will be described in more detail.
  • a first aspect of the present invention is a probe for detecting and / or identifying one or more microorganisms selected from the microorganisms shown in Table 1 above, wherein the probe comprises a microorganism to be detected and / or identified. It is a probe consisting of a base sequence of 20 to 100 bp in the VI, V2 and V3 regions of 16S rRNA or its complementary sequence.
  • a probe is an oligonucleotide DNA or RNA capable of detecting a specific fragment from DNA or RNA fragments by utilizing the property that complementary sequences of nucleic acids specifically bind to each other.
  • This is an oligonucleotide sequence that specifically binds to a target nucleic acid having a nucleotide sequence contained in 16S rRNA or 16S rDNA derived from a microorganism.
  • the probe capable of detecting and / or identifying each microorganism of the present invention is obtained by performing a multiple alignment between two or more microorganisms to be detected and identified in the VI, V2 and V3 regions of 16S rRNA of each microorganism, and In particular, the probe can be prepared by determining a region having high specificity for each microorganism (see FIG. 1).
  • the VI, V2, and V3 regions are the gene sequences of the 5 'region of 16S rRNA of each microorganism.
  • the VI region is the region of the 50th to 120th base from the 5 'end
  • the V2 region is the 150th to 260th base
  • the V3 region is a region of the 420th to 520th bases.
  • the base sequence of the probe is preferably 20 to 100 bp, particularly preferably 30 to 80 bp. Note that these probes are referred to as vl probe, v2 probe, and v3 probe according to each corresponding region.
  • probes may be partially modified, or may have deletions, substitutions, or additions in their nucleotide sequences, as long as the microorganisms shown in Table 1 can be specifically detected and identified.
  • VI, V2, and V3 regions of each microorganism were identified by homology search in the 16S rRNA base sequence of the microorganisms described in Table 1, and two or more microorganisms were identified in the VI, V2, and V3 regions.
  • the mismatch site is preferably designed near the center of the probe.
  • organisms with a minimum number of mismatches of 4 or more between the nucleotide sequence of the V1 to V3 region of the microorganism itself and the nucleotide sequence of vl to v3 probes derived from microorganisms other than the microorganism are: A microorganism that can be detected and identified by using a probe alone. Microorganisms with a minimum number of mismatches of 3 or less are microorganisms that can be detected and identified by comprehensively judging the results of detection using multiple probes.
  • Tables 2 and 3 show the IDs of the detection and identification probes for each microorganism and their sequence numbers.
  • Table 2 shows examples of probes that can identify microorganisms by themselves, and Table 3 shows examples of probes that can be identified in combination.
  • the probes capable of specifically detecting and identifying actinobacillus actinomycetemcommitans alone include the 01v2 probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the probe having SEQ ID NO: 3
  • the 01 v3 probe having the nucleotide sequence shown, or a probe having the complementary sequence thereof, and capable of specifically detecting and identifying Acinetobacter p. Calcoaceticus alone has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Table 3 shows microorganisms that are difficult to detect and identify using a single probe because the 16S rRNA gene sequence is similar to other microorganisms.
  • detection and identification of individual microorganisms can be performed using hybridization patterns of probes designed for the detection of other microorganisms as well as probes designed for the detection of the microorganism. Do. For example, as shown in Table 4, all of the probes 06 vl to v3 of SEQ ID NOs: 16 to 18 for detecting Streptococcus pneumoniae have the smallest mismatch between other microorganisms in the V1 to V3 region. Since the number is within 3 bases, it is difficult to detect and identify Streptococcus pneumoniae alone.
  • probes may be of natural origin or may be obtained by a conventional method such as chemical synthesis.
  • the chemical synthesis is performed by a phosphoramidite method using, for example, a DNA synthesizer of ABI (Applied Biosystem Inc.).
  • ABI Applied Biosystem Inc.
  • a second aspect of the present invention is a method for detecting and / or identifying one or more microorganisms selected from the microorganisms shown in Table 1, wherein the method comprises the steps of: A method characterized by using one or more probes each having a base sequence of 20 to 100 bp or a complementary sequence thereof in the V2 and V3 regions.
  • the detection and identification method of the present invention performs hybridization by bringing the probe into contact with a specimen containing a microorganism or a nucleic acid derived therefrom, and using the label as an index, the microorganism of Table 1 is used as an indicator. It is a method of detection and identification.
  • the specimen containing the microorganism or nucleic acid derived therefrom can be amplified using primers capable of amplifying the base sequence containing the V1 to V3 region of the 16S rDNA of the microorganism shown in Table 1.
  • a primer is a polynucleotide that acts as a starting point for the polynucleotide chain to elongate during a nucleic acid synthesis reaction.
  • the forward primer in the present invention is preserved between microorganisms upstream of the VI region.
  • the reverse primer is a region that is highly conserved between microorganisms downstream of the V3 region, approximately 450 to 620. It is preferable to design from the region existing at the ⁇ ⁇ th base.
  • the size is preferably 15 to 35 mer, particularly preferably 18 to 30 mer.
  • the foreprimer is located at about the 1st to 70th bases, the 27F primer shown in the following SEQ ID NO: 153, and the reverse primer is about the 450th to 620th bases. 525R shown in the following SEQ ID NO: 154 can be used.
  • These primers may be of natural origin or chemically synthesized by a conventional method.
  • the danigami synthesis can be synthesized, for example, by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer manufactured by ABI (Applied Biosystem Inc.). It is also possible to use a known phosphate triester method, H-phosphonate method, phosphite method, or the like.
  • the nucleic acid includes RNA and DNA.
  • PCR can be achieved if the nucleic acid is present in a number of molecules to several tens of minutes or more.
  • Samples include, for example, stool, urine, blood, clinical test materials such as tissue homogenates, and food materials.
  • the extracted nucleic acid is made into type III, and a PCR method (Science 230, 1350 (1985)) is performed using the above primers.
  • the above primers (SEQ ID NOs: 153 and 154) are used to amplify the 27th to 525th bases from the 5 'end of the base sequence of the 16S rDNA of the microorganism and the sequences in the vicinity thereof. Is preferred.
  • Reaction conditions and reaction solutions for the PCR method can be arbitrarily set based on known information. For example, heat denaturation: 1 to 30 seconds at 90 to 95 ° C, annealing: 0 to 30 seconds at 37 to 65 ° C, extension reaction: 10 to 60 seconds at 50 to 75 ° C.
  • amplification is performed for 50 cycles.
  • the results of PCR amplification can be used to confirm the presence and length of amplified nucleotides by subjecting the solution after the reaction to agarol gel electrophoresis as needed.
  • the amplified nucleic acid of the microorganism can be used for hybridization using the above-described probe of the present invention.
  • hybridization means that, under specific conditions, two single-stranded nucleotide sequences having complementary sequences bind to each other to form a double strand.
  • the specific condition means a stringent condition in hybridization, and in particular, in the present invention, four or more mismatches between a base sequence derived from a microorganism and a base sequence of a probe of the present invention. In some cases, this means conditions that do not hybridize.
  • the stringency conditions vary depending on the hybridization conditions to be carried out, but those skilled in the art can use a solvent such as temperature, salt concentration, and activator concentration based on the hybridization protocol. Conditions such as composition can be appropriately set. As an example, hybridization with a 50-mer probe can be performed at 55 ° C., 0.5 ⁇ SSC, and 0.2% SDS. It should be noted that, depending on the purpose, it is possible to set the stringency to be higher so that the hybridization cannot be performed when the number of mismatches is 3 or more, 2 or more, or 1 or more. Also, lower stringency Thus, it is possible to set so that hybridization can be performed even when the number of mismatches is 5 or less, 6 or less.
  • hybridization is possible or not can be determined by extracting the amplified nucleic acid from the microorganism prepared as described above and labeling the amplified nucleic acid with a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate / tetramethylrhodamine / isothiosinate / hapten, etc. After hybridization with the above-mentioned labeled nucleic acid, it can be confirmed by measuring a label such as a fluorescent dye. Labeling can be obtained by, for example, nick translation, a method using DNA polymerase, or nucleic acid amplification using a labeled primer whose 5 ′ end is labeled with a fluorescent substance or a hapten.
  • the detection and identification method of the present invention includes a method of detecting and identifying a specific microorganism shown in Table 2 by using a single probe. For example, the minimum mismatch between the nucleotide sequence of the probe consisting of the nucleotide sequence of 20 to:! OObp or its complementary sequence in the VI to V3 region of the microorganism to be identified and the nucleotide sequence derived from microorganisms other than the microorganism. Microorganisms can be detected and identified by using the above-mentioned probe having a number of 4 or more (see Tables 2 and 4).
  • the method of the present invention also includes a method of detecting and further identifying a specific microorganism shown in Table 3 by comprehensively judging the detection results obtained by the plurality of probes of the present invention.
  • a mismatch with the base sequence of a probe consisting of a 20 to 100 bp base sequence or its complementary sequence in the V1, V2 and V3 regions of the 16S rRNA of the microorganism to be identified is 3
  • Two or more microorganisms having a base sequence of not more than two or more are detected, and as a second step, the base sequence of 20 to:!
  • the method is to further identify one of the two or more microorganisms by using one or more probes having a complementary sequence thereof.
  • Example 3 an example is shown in Table 61 (see Example 3). Since there are three or less mismatches between the 06 vl-v3 probe of ID 06 microorganism (Streptococcus pneumoniae) and the base sequence corresponding to ID 29 microorganism (Streptococcus' miteisu),
  • ID 34 When the detection method is performed using a 34 vl to v3 probe derived from a microorganism (Streptococcus' Oralis), the ID06 microorganism hybridizes only with the 34 v3 probe and a signal is detected, and the ID29 microorganism is detected in 34 v2 and v3. The signal hybridizes with the probe and is detected.
  • the microorganisms detected using the 06vl-v3 probe can be further identified as ID06 microorganisms or ID29 microorganisms by performing detection using the 34vl-v3 probe derived from the ID34 microorganism (Streptococcus oralis). An organism can be identified.
  • the method of the present invention includes (a) a step of preparing a nucleic acid from a microorganism to be identified, (b) a step of hybridizing the nucleic acid with the probe of the present invention, and (c) the presence or absence of hybridization in the step (b). (D) identifying the detection signal pattern for each probe, (d) detecting the detection signal pattern obtained in step (c) and the detection signal pattern of the microorganisms specified in Table 1 specified in advance. A method comprising the step of identifying the type of microorganism to be identified by comparison is also included. In this case, by analyzing the detection signal pattern by computer processing or the like, the efficiency of detecting and identifying microorganisms can be further enhanced. The method using the detection signal pattern can be performed more quickly and effectively by performing the method on a DNA chip.
  • the detection and identification method on the DNA chip can be performed as follows.
  • the probe of the present invention is immobilized at each position (spot) on a support such as glass or silicon by a covalent bond or the like.
  • a solution containing the labeled nucleic acid obtained as described above is applied to the support, the base of the microorganism-derived nucleic acid in the sample having a base sequence complementary to the base sequence of the probe in each spot is obtained.
  • the sequences hybridize to form a double strand and remain on the support.
  • microorganisms shown in Table 1 were used as standard strains.
  • Microorganisms are distributed by the American Type Culture Collection (ATCC strain) and the Microorganisms Resource Division of the National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation (the Fermentation Research Institute (IF0)). (IF0), available from the Institute of Medical Science, The University of Tokyo (IID).
  • the VI, V2, and V3 regions of the microorganisms shown in Table 1 were determined by performing multiple alignment (Hitachi Soft DNASIS Pro) on the base sequence obtained by decoding 16S rRNA using a sequencer (Applied Biosysteni). Furthermore, using a so-called plast algorithm (Hitachi Soft DNASIS Pro), mismatch sites were identified in those regions. The nucleotide sequence of the probe was designed such that the mismatch site was near the center. Table 4 shows the number of mismatched bases for the v1 to v3 probes designed for each microorganism, assuming that they hybridize with the sequences of the V1 to V3 regions of microorganisms other than the microorganism from which each probe was derived.
  • the minimum value (minimum mismatch number). If the minimum number of mismatches in any of the v1 to v3 probes is 4 or more, the microorganism can be detected and identified by a single probe. In any of the vl to v3 probes, if the minimum number of mismatches is 3 or less, detection and identification cannot be performed by a single probe, but detection and identification can be performed by the method of the present invention as described later. In Table 4, none means that no sequence with significant homology was found. Table 4
  • vl v3 probe of the microorganisms shown in Table 1 was synthesized, purified by HPLC, and stored in a lyophilized state. These were adjusted to 20 ⁇ and mixed 1: 1 with a microarray spotting solution (Genetics). All samples were spotted into 2X4 blocks by a spotter (Hitachi Software SPBI0), and a total of 4X4 blocks including replicas were made. Positive controls were spotted on the four ends of each block.
  • the pin used in the spotter was a stainless steel pin 150 ⁇ . After spotting, the chip was placed in 0.2% SDS solution, water and boiling water, and the chip was washed with a slide washer (Piofield), and used in the following experiments.
  • the microorganisms shown in Table 1 were cultured on LB medium agar medium (5 g of yeast extract, 10 g of tryptone, 5 g of NaCl, 20 g of agar, 1 L of distilled water, pH 7.4) and then collected. Add 300 ⁇ l of 1% Tween20 (Sigma), Cell Suspension Solution (Gentra Systems) solution containing 60Unit Lytic Enzyme (Gentra Systems; 600Unit Achromopeptidase (Wako Pure Chemical)) (Bacterial Enzyme Solution), suspend and add at 37 ° C. Next, 30 ⁇ l of a 600 mU / ⁇ 1 Proteinase K solution was added, and the mixture was heated at 70 ° C. for 10 minutes.
  • Reaction solution 501 contains 11 type I DNA (microbial DM extraction solution), 5 ⁇ l 10X buffer (for Z-Taq), 0.75 units Z-Taq (Takara Shuzo), 6 nmole dNTPs Forward primer 27F (SEQ ID NO: 153) and reverse primer 525R (SEQ ID NO: 154), each containing 6 pmole.
  • the PCR conditions were as follows: after 2 minutes at 98 ° C, 1 cycle at 98 ° C and 90 seconds at 60 ° C, one cycle was performed and 35 cycles were performed to obtain a PCR amplification product of the target gene in the microorganism. After completion of the reaction, the substrate was removed by spin column method using Sephadex TM G50 Fine (Amersham pharmacia biotech), concentrated by lyophilization to dryness, and dissolved in sterile ultrapure water ( ⁇ ⁇ ) to obtain a target DNA solution.
  • the above target DNA was labeled with FluoroLink TM Cy5-dUTP (Amersham pharmacia biotech) using Nick Translation Kit (Roche Diagnostics).
  • FluoroLink TM Cy5-dUTP Amersham pharmacia biotech
  • Nick Translation Kit Roche Diagnostics
  • 20 ⁇ l of the labeling reaction solution 1 g of the above target DNA solution, 3.5 / l Enzyme mixture, 0.04 mM dATP, 0.04 mM dCTP, 0.04 mM dGTP, 21 lOx buffer, 0. 1 mM
  • FluoroLink TM Cy 5 ⁇ dUTP The reaction was performed at 15 ° C for 2 hours. After the reaction, purification was performed by a spin force ram method using Sephadex TM G50 Fine (Amersham pharmacia biotech). The purified reaction was lyophilized and dissolved in 10 / zl sterile ultrapure water.
  • the solution was dropped on the microorganism identification chip prepared in Example 1, and placed on a 24 ⁇ 25 mm high precover slide (Bhem Kiki Co., Ltd.), and reacted in a 55 ° C constant temperature bath for 2 hours. After the reaction, the bacteria identification chip was immersed in a 2x ssc solution to slide down the hyperica slide. In addition, 2 x SSC, 0.2 ° /. After transferring to an SDS solution and washing for 5 minutes, the cells were washed with 0.2 ⁇ SSC and 0.2% SDS for 5 minutes. Further washing was performed with 0.5x SSC for 1 minute.
  • Table 5 shows that the polynucleotide having the sequence containing the V1 to V3 region of the 16S rRNA of Actinobacillus actinomycetemcomitans of microorganism ID 01 is a vl probe of each microorganism prepared for the microorganism identification chip, v2 Probes and v3 probes were hybridized, and the top 10 probes with the highest signal brightness values were shown for each region.
  • the probe ID is a combination of the microorganism ID number shown in Table 1 and the vl to v3 regions.
  • the brightness of Probe 01 vl is remarkably high. It is possible to detect the presence of Nomycetem commitans.
  • the probe 03 vl other than the probe 01 vl has a similar luminance value, it cannot be identified by using the probe 01 vl alone. This is because the base sequence of the probe 01vl has three or less mismatches with the base sequence derived from another microorganism, so that it can be compared with other microorganisms having a base sequence highly similar to a similar probe 01vl. This is because they will hybridize (see Table 1). Therefore, when it is necessary to identify in detail which microorganism is the microorganism detected by the probe 01 vl, an additional identification step needs to be performed.
  • the probes with relatively high signal intensity in the v1 probe are 03 vl and 01 vl, and the signal intensity in the v2 probe is relatively high. Since the probe is 01 v2 and the v3 probe has a relatively strong signal intensity of 01 v3, the target microorganism was Actinobacillus' actinomycetes, where strong signal intensity was detected in all regions. It can be detected and identified as cetemcomitance. Table 5
  • Table 6 shows the 16S rRNA of A. pactor. Calcoaceticus (microorganism ID 02).
  • Table 7 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of the 16S rRNA of H. influenzae (microorganism ID 03) with each probe on the chip. From the results in Table 7, it is clear that Hemophilus'influenza can be detected and identified by using probes 03v2 and 03v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, 03 vl, 01 vl for the vl probe, 03 v2 for the v2 probe, and 03 v3 for the v3 probe have relatively strong signal strength. However, it can be detected and identified as Hemophilus' influenza, in which high intensity is detected in each region.
  • Table 8 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Stenotrophomonas maltophilia (microorganism ID 04) with each probe on the chip. From the results in Table 8, it is clear that Stenotrophomonas maltophila can be detected and identified by using probes 04 vl and 04 v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, the signal intensity of 04 vl for the vl probe, 04 v2, 02 v2 for the v2 probe, and 04 v3 for the v3 probe has relatively strong signal strength. However, it can be detected and identified as a Stenot-mouth Fomonas maltophylla in which high intensity was detected in each region.
  • Table 9 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Proteus mirabilis (microorganism ID 05) with each probe on the chip.
  • V l even if the overall judgment in combination V 2, V 3 probe, vl probe in 05 vl, 01 vl, v2 in Puropu 05 v2, v3 in probe 05 v3, 45 v3 is relatively Since it has a strong signal intensity, it can be detected and identified as Proteus mirabilis in which high intensity was detected in each region.
  • Table 10 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Streptococcus pneumoniae (microorganism ID 06) with each probe on the chip. From the results in Table 10, Streptococcus pneumoniae could not be identified by using probes 06vl to 06v3 alone. However, judging comprehensively by the combination of the vl, v2, and v3 probes, 06 vl, 29 vl for the vl probe, 06 v2, 29 v2 for the v2 probe, and 06_29_34 v3 for the v3 probe have relatively strong signal strength. It can be detected and identified as Streptococcus pneumoniae, in which high intensity was detected in each region.
  • Table 11 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Pseudomonas aeruginosa (microorganism ID 07) with each probe on the chip. From the results in Table 11, it is clear that Pseudomonas aeruginosa can be detected and identified by using probe 07 vl, 07 v2, and 07 v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, each signal has a relatively strong signal intensity of 07 vl for the vl probe, 07 v2 for the v2 probe, and 07 v3 for the v3 probe. It can be detected and identified as Pseudomonas aeruginosa with high intensity detected in the region.
  • Table 12 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Citropactor 'Frendi (microorganism ID 08) with each probe on the chip. From the results in Table 12, it is clear that Citropactor'Frendi can be detected and identified by using Prop 08 v3 alone.
  • Table 13 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Bayonella pulpula (microorganism ID 09) with each probe on the chip. From the results in Table 13, it is clear that Bayonela 'pulpula can be detected and identified by using the probes 09vl, 09v2, and 09v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, the vl probe has a relatively strong signal intensity of 09 vl, the v2 probe has 09 v2, and the v3 probe has 09 v3. It can be detected and identified as bayonela / pulpura with detected intensity.
  • Table 14 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the VI to V3 regions of 16S rRNA of Buffalo Stuarty (microorganism ID 10) with each probe on the chip. From the results in Table 14, it is clear that Buffalo's quality can be detected and identified by using probes 10 vl, 10 v2, and 10 v3 alone. In addition, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, each region has relatively strong signal intensity of 10 vl, 13_vl for the vl probe, 10 v2 for the v2 probe, and 10 v3 for the v3 probe. Can be detected and identified as a Schau / Stuarty with a high intensity detected.
  • Table 15 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Neisseria gonorrhoeae (microorganism ID 11) with each probe on the chip. From the results in Table 15, it is clear that Neisseria gonorrhoeae can be detected and identified by using probe 11 v3 alone.
  • vl, V 2, v3 even after comprehensive consideration a combination of probe, vl probe in 11 vl, 36 vl, v2 in probe 11 ⁇ 2, 36 v2, the v3 probe 11 v3 is relatively strong signal Because of the high intensity, it is possible to detect and identify Neisseria gonorrhoeae in which high intensity was detected in each region.
  • Table 16 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Streptococcus agaratache (microorganism ID 12) with each probe on the chip. From the results in Table 16, it is clear that Streptococcus agarakche can be detected and identified by using probes 12vl, 12v2, and 12v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, 12 vl for the vl probe, 12 v2 for the v2 probe, and 12 v3 for the v3 probe have relatively high signal intensities, and are high in each region. It can be detected and identified as Streptococcus agalacti whose strength is detected.
  • Table 17 shows the results of hybridization of a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Morganella morga (microorganism ID 13) with each probe on the chip. From the results in Table 17, it is clear that Morganella morganii can be detected and identified by using probes 13v2 and 13v3 alone.
  • the vl probe has a relatively strong signal intensity of 13 vl, 10 vl, 13 v2 for the v2 probe, and 13 v3 for the v3 probe, It can be detected and identified as Morganella morganii, where high intensity was detected in the region.
  • Table 18 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Bacteroides fragilis (microorganism ID 14) with each probe on the chip. From the results in Table 18, it is clear that Pacteroides fragilis can be detected and identified by using Prop 14 vl, 14 v2, and 14 v3 alone. In addition, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, 14 vl for the vl probe, 14 v2 for the v2 probe, and 14 v3 for the v3 probe have relatively strong signal intensities. It can be detected and identified as Pacteroides fragilis in which high intensity was detected in the region.
  • Table 19 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Staphylococcus' hominis (microorganism ID 15) with each probe on the chip. From the results in Table 19, it was found that Staphylococcus 'Hominis' probe 15v :!
  • Table 20 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Staphylococcus' Perneri (microorganism ID 16) with each probe on the chip.
  • Table 21 shows the results of hybridization of a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Staphylococcus' hemolyticus (microorganism ID 17) with each probe on the chip. From the results in Table 21, Staphylococcus hemoriticus could not be identified by using probes 17 vl to 17 v3 alone, but when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, 17 vl, 15 vl, 16_46 vl, 17 v2, 15 v2 for the v2 probe, and 17 v3 and 20 v3 for the v3 probe have relatively high signal intensities, so that high intensity was detected in each region. Was detected and identified.
  • Table 22 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Enterobacter 'croaka (microorganism ID 18) with each probe on the chip.
  • Table 23 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the VI-V3 region of 16S rRNA of Enterobacter aerogenes (microorganism ID 19) with each probe on the chip. From the results in Table 23, it is clear that Enterobacter aerogenes can be detected and identified by using probe 19 v3 alone. In addition, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, relatively strong signal intensity is obtained at 19_25 vl for vl probe, 19 v2 for v2 probe, 08_18_22_45 v2, and 19 v3 for v3 probe. Enterobacter p. Aerogenes, whose high intensity was detected in each region, can be detected and identified.
  • Table 24 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Staphylococcus' epidemidis (microorganism ID 20) with each probe on the chip. From the results in Table 24, Staphylococcus' epididermidis could not be identified by using probes 20 vl, 20 v2, and 20 v3 alone, but it was determined that the combination of the vl, v2, and v3 probes was comprehensive.
  • 20 vl, 15 vl for vl probe, 20 v2, 35 v2, 17 v2 for v2 probe, 20 v3, 46 v3, 17 v3, 16 v3, 15 v3 for v3 probe have relatively strong signal strength, It can be detected and identified as Staphylococcus 'Epidermidis' in which high intensity was detected in the region.
  • Table 25 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the 16S rRNA region of Streptococcus' consteratas (microorganism ID 21) with each probe on the chip. From the results in Table 25, it is clear that Streptococcus constellus can be detected and identified by using probe 21 v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, 21_30 vl for vl probe, 30 v2, 21 v2 for v2 probe, and 21 v3 for v3 probe have relatively strong signal strength. It can be detected and identified as Streptococcus constellus where high intensity was detected in each region.
  • Table 26 shows the results of hybridization of a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Serratia marcescens (microorganism ID 22) with each probe on the chip. From the results in Table 26, it is clear that Serratia marcescens can be detected and identified by using probes 22vl and 22v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, the relative intensity of 22 vl for the vl probe, 08_18_22—45 v2 for the v2 probe, and 22 v3 for the v3 probe have relatively strong signal intensities. Serratia detected with high intensity in ''
  • Table 27 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of the 16S rRNA of Streptococcus' anginosus (microorganism ID 23) with each probe on the chip. From the results in Table 27, it is clear that Streptococcus angiosus can be detected and identified by using probes 23vl and 23v2 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of the vl, v2, and v3 probes, each region has a relatively strong signal intensity of 23 vl for the vl probe, 23 v2 for the v2 probe, and 23-30 v3 for the v3 probe. Can be detected and identified as Streptococcus anguinosa with high intensity.
  • Table 28 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Escherichia coli (microorganism ID 24) with each probe on the chip. From the results in Table 28, it is clear that Escherichia coli can be detected and identified by using probe 24v3 alone.
  • 24v3 has a relatively strong signal intensity, it can be detected and identified as Escherichia coli in which high intensity was detected in each region.
  • Table 29 shows the results of hybridization of a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Klebsiella 'pneumoniae (microorganism ID 25) with each probe on the chip.
  • Table 30 shows the results of hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of 16S rRNA of Enterococcus ficalis (microorganism ID 26) with each probe on the chip. From the results in Table 30, it is clear that Enterococcus tenuis can be detected and identified by using probes 26 vl, 26 v2, and 26 v3 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, 26 vl for the vl probe, 26 v2 for the v2 probe, and 26 v3 for the v3 probe have relatively strong signal intensities. It can be detected and identified as Enterococcus faecalis with high intensity.
  • Table 31 shows the results obtained by hybridizing a polynucleotide having a sequence containing the V1 to V3 region of the 16S rRNA of Enterococcus ′ fezium (microorganism ID 27) with each probe on the chip. From the results shown in Table 31, it is clear that Enterococcus faecium can be detected and identified by using probes 27vl and 27v2 alone. Also, even when comprehensively judged by the combination of vl, v2, and v3 probes, relatively high signal intensity is obtained at 27 vl for the vl probe, 27 v2 for the v2 probe, 27 v3, and 39 v3 for the v3 probe. However, it can be detected and identified as Enterococcus faecium in which high intensity was detected in each region.
  • Table 32 shows the results of hybridization of a polynucleotide having a sequence containing the VI to V3 region of 16S rRNA of Streptococcus sundaices (microorganism ID 28) with each probe on the chip. From the results in Table 32, it is clear that Streptococcus sanguis can be detected and identified by using probes 28 vl and 28 v2 alone.

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Abstract

微生物を検出同定する特異的プローブ及びそれを用いた検出及び／又は同定方法の提供。　アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、アシネトバクター・カルコアセチカス、ヘモフィルス・インフルエンザ等の医療及び食品等の分野において有害な１又は複数の微生物を検出同定するためのプローブであって、同定すべき微生物の16SrRNAのV1、V2及び／又はV3領域内の20～100bpの塩基配列又はその相補配列からなるプローブ。また、前記プローブの１種以上を用いる、微生物の検出及び／又は同定方法。

Description

明 細 書 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法 技術分野
本発明は、 微生物、 特に医療及び食品等の分野において有害な細菌を検出、 同 定する特異的なプロ一ブ及びそれを用レ、た検出及び/又は同定方法に関する。 背景技術
表 1に記載した細菌の検出は、 種々の医学、 公衆衛生に関して重要であり、 検 出方法については次の 2つの方法が知られている。
微生物 微生物名 微生物番号
ID
01 Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC 29522
02 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23055
03 Haemophilus influenzae ATCC 33391
04 Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637
05 Proteus mirabilis ATCC 29906
06 Streptococcus pneumoniae ATCC 33400
07 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
08 Citrobacter freundii ATCC 8090
09 Veillonella parvula ATCC 10790
10 Providencia stuartii ATCC 49809
1 1 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
12 Streptococcus agalactiae ATCC 13813
13 organella morganii ATCC 25830
14 Bacteroides fragilis ATCC 25285
15 Staphylococcus hominis ATCC 27844
16 Staphylococcus wameri ATCC 27836
17 Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970
18 Enterobacter cloacae ATCC 13047
19 Enterobacter aerogenes ATCC 13048
20 Staphylococcus epidermidis ATCC 14990
21 Streptococcus constellatus ATCC 27823
22 Serratia marcescens ATCC 8100
23 Streptococcus anginosus ATCC 33397
24 Escherichia coli ATCC 1 1775
25 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
26 Enterococcus faecalis ATCC 19433
27 Enterococcus faecium ATCC 19434
28 Streptococcus sanguis ATCC 10556
29 Streptococcus mitis ATCC 49456
30 Streptococcus intermedius ATCC 27335
31 Listeria monocytogenes ATCC 15313
32 Clostridium perfringens ATCC 13124
33 Corynebacterium aquatium IFO 15710
34 Streptococcus oralis ATCC 35037
35 Staphylococcus aureus ATCC 12600
36 Neisseria meningitidis IID 854
37 Campylobacter fetus ATCC 27374
38 Enterococcus gallinarum ATCC 49573
39 Enterococcus casseliflavus ATCC 25788
40 Aeromonas hydrophila ATCC 7966
41 Salmonella paratyphi A ATCC 9281
42 Salmonella typhi ATCC 19430
43 Streptococcus equisimilis ATCC 35666
44 Streptococcus canis ATCC 43496
45 Klebsiella oxytoca ATCC 13182
46 Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305
47 Pasteurella multocida ATCC 43137
48 Eikenella corrodens ATCC 23834
49 Streptococcus pyogenes ATCC 12344
50 Moraxella catarrhalis ATCC 25238 51 Legionella pneumophila ATCC 33152
52 Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294
53 Mycobacterium avium ATCC 25291
54 Mycobacterium intracellulare ATCC 13950
55 Mycobacterium kansasii ATCC 12478
56 Mycobacterium gordonae ATCC 14470 第 1の方法としては、 検体材料の患者糞便 ·血液及び食品等から、 基本的には 血液寒天培地、 マッコンキー培地 （便の場合、 SS 寒天培地等）、 各種確認培地、 診断用免疫血清を用いて微生物の同定を行う方法がある。 しかしながらこの方法 は、 同定に時間がかかってしまうという問題がある。
第 2の方法としては、 迅速に検査を行うことができる PCR (ポリメラーゼ連鎖 反応） 法と呼ばれる方法が開発され実用化されている。 この PCR法では細菌を同 定するプローブとして 16S rRNAまたは 23S rRNAの塩基配列を使用することが知 られている。 このようなリボソームの塩基配列を使用した細菌同定用プロ一ブ及 び同定方法は、例えば特許第 3116353号、特許第 3135909号、特許第 3030034号、 特願 2002- 17356号、 特開 2002-34578号などに開示されている。
しかしながら、 これらの出願には、 16S rRNA分子の 5'末端に由来の 400〜500 塩基の領域が系統学的に保存された属の近縁の種間を識別するために有効な領域 であり、 それらの領域の一部の塩基配列を有するプローブを調製してある特定の 微生物を検出、同定することは報告されてはいるが、 16S rRNAの塩基配列のうち、 微生物間の保存性が低く、 特定の種に対して特異性が高い VI、 V2及び V3領域は 個々に特定されておらず、 その領域の塩基配列からプローブを調製し、 本願発明 の表 1に示す微生物を効率よく特異的に検出、 同定する方法については全く報告 されていない。 発明の開示
従って、 本発明は、 医療及ぴ食品等の分野において有害な微生物を、 16S rRNA の特定の種に対して特異性が高い VI、 V2及ぴ V3領域の塩基配列に基づいて、 迅 速かつ確実に微生物を検出及び/又は同定するプローブ及ぴそのプローブを用い た検出及び/又は同定方法を提供することを目的とする。 本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意研究を行った結果、 16SrRNA塩 基配列のうち、 特に種に対して特異性が高い特定の VI、 V2及び V3領域の塩基配 列に着目し、 医療及ぴ食品等の分野において有害な細菌を特異的に検出及びノ又 は同定し得るプローブを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の 1〜6 6を提供する。
( 1 ) ァクチノバチルス · ァクチノマイセテムコミタンス (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、 ァシネトノヽクタ一'力ノレコアセチ刀ス (Acinetobacter calcoaceticus)、 へモフィルス ·インフルェンサ (Haemophilus ιηι丄 uenzae)、 ス テノ トロフォモナス -マル卜フィ リア (Stenotrophomonas maltophilia) s プロテ ウス ' ミラビリス （Proteus mirabilis)、 ス トレプトコッカス ' ニューモニエ
( Streptococcus pneumoniae)、 ンュー トモナス · エルキノサ (Pseudomonas aeruginosa)、 シトロ/ヽクタ一' フレンアイ (Citrobacter freundii)、 ベィヨネ ラ · パルプーラ (Veillonella parvula)、 プロ ビデンシァ · スチユアーティ
(Providencia stuartii)、 ナイセリ ノ · ゴノローェ (Neisseria gonorrhoeae)、 ス トレプトコッカス · ァガラクチェ (Streptococcus agalactiae)、 モルガネラ · モノレカュ (Morganella morganii)、 ノ クテロイテス · フフシリス (Bacteroides fragilis)、 スタフイロコッカス · ホミニス (Staphylococcus hominis) N スタフ イロコッカス · ヮノレネリ (Staphylococcus warneri)、 スタフイロコッカス ·へモ リティカス (Staphylococcus haemolyticus )、 ェンテロ ノくクタ一 · ク ロァカ
(Enterobacter cloacae)、 ェンテロノ クタ一 · ァエロケ不ス (Enterobacter aerogenes )、 スタ フイ ロ コ ッカス · ェピデルミ ディ ス ( Staphylococcus epidermidis )、 ス ト レプ ト コ ッカス * コ ンスァフータス { Streptococcus constellatus)、 セフチア .マルセッセンス (Serratia marcescens)、 ス トレプト コッカス · アンギノサス (Streptococcus anginosus)、 ェシエ リ シァ · コ リ
(Escherichia coli)、 クレブセラ - ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae)、 ェ ンテロコッカス ' フエカリス (Enterococcus faecalis) ェンテロコッカス · フ ェシゥム ( Enterococcus faeciura)、 ス ト レプ ト コ ッカス · サンダイ ス
(Streptococcus sanguis)、ス 卜レプ卜コッカス アイス (Streptococcus mitis)、 ス トレプトコッカス · インターメディウス (Streptococcus intermedius) , リス テリア，モノサイ 卜ゲネス (Listeria monocytogenes) , クロストリジゥム ·パー フリ ンゲンス （Clostridium perfringens)、 コリネパクテリゥム 'アクアチウム
(Corynebacterium aquatium) ス卜レプ ^コッカス *ォフリス (Streptococcus oralis)、 スタフイロコッカス -ァゥレウス (Staphylococcus aureus) ナイセジ ァ .メニンギチデイス （Neisseria meningitidis) , カ^ピロノ クタ一' フエタス Campylobacter fetus；、 ェンテロ コッカス ' ガリナノレム ( Enterococcus gallinarumj、ェンテロコッカス'カセリフラノくス (Enterococcus casselif lavus)、 エロモナス ' ノヽィ ドロフイラ (Aeromonas hydrophila)、 サノレモネラ ' ノ ラチフィ A ( Salmonella paratyphi A) , サノレモネラ .チフィ （Salmonella typhi)、 スト レプトコッカス .エタイシミリス （Streptococcus equisimilis)、 ストレフ 卜コ ッカス ' 力ニス (Streptococcus canis)、 クレブセラ -ォキシトカ (Klebsiella oxytoca )、 スタフイ ロ コ ッカス ' サプロフィティカス ( Staphylococcus saprophyticus) ^ ノ スッレラ ·ムノレトシダ (Pasteurella multocida)、 ェづケ不 ラ . コロデンス （Eikenella corrodens)、 ス トレプトコッカス · ピオゲネス
(Streptococcus pyogenes)、モフキセフ ·カタフリス (Moraxella catarrhal is)、 レジオネラ -ニューモフイラ (Legionella pneumophila) マイコノ クテリゥム - ッべノレクロシス (Mycobacterium tuberculosis) N マイ / クテリクム · ァヒ、、ゥム
(Mycobacterium avium)、マイコノ クテリゥム 'イントラセノレラレ (Mycobacterium intracellulare 、 マづ コノ クテジゥム ·力ンサシ (Mycobacterium kansasi i)、 マイコ/ クテリゥム · ゴノレドネ (Mycobacterium gordonae) 力 ら選択される 1又 は複数の微生物を検出及ぴノ又は同定するためのプローブであって、 検出及び Z 又は同定すべき微生物の 16S rRNAの VI、 V2及び/又は V3領域内の 20〜： !OObp の各塩基配列又はその相捕配列からなるプローブ。
( 2 ) 配列番号 1〜152で示される塩基配列またはその相補配列から選ばれる、 ( 1 ) に記載のプローブ。
( 3 ) 配列番号 1、 2又は 3に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、 ァ クチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミタンスを検出及び/又は同定するため のプローブ。
( 4 ) 配列番号 4、 5又は 6に示される塩基配列、 又はその相補配列を含む、 ァシネトバクタ一 ·カルコァセチカスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(5) 配列番号 7、 8又は 9に示される塩基配列、 又はその相補配列を含む、 へモフィルス .ィンフルェンザを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(6) 配列番号 10、 11又は 12に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、 ステノ トロフォモナス ·マルトフィリァを検出及ぴ Z又は同定するためのプロ一 ブ。
(7) 配列番号 13、 14又は 15に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、 プロテウス · ミラビリスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
(8) 配列番号 16、 17又 18に示される塩基配列、 又はその相補配列を含む、 ストレプトコッカス · ニューモニエを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
( 9 ) 配列番号 19、 20又は 21に示きれる塩基配列、又はその相補配列を含む、 シユードモナス ·エルギノサを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(1 0) 配列番号 22、 23又は 24に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 シトロパクター ·フレンディを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(1 1) 配列番号 25、 26又は 27に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 べィヨネラ ·パルブーラを検出及び z又は同定するためのプローブ。
(1 2) 配列番号 28、 29又は 30に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、プロビデンシァ'スチュアーティを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
(1 3) 配列番号 31、 32又は 33に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ナイセリア ·ゴノローェを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(14) 配列番号 34、 35又は 36に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 ストレプトコッカス ·ァガラタチェを検出及び/又は同定するためのプロ一 ブ。
(1 5) 配列番号 37、 38又は 39に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 モルガネラ 'モルガ二を検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
(1 6) 配列番号 40、 41又は 42に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 パクテロイデス ·フラジリスを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
(1 7) 配列番号 43、 44又は 45に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフィロコッカス ·ホミニスを検出及び Z又は同定するためのプローブ。 (1 8) 配列番号 46、 47又は 48に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス · ヮルネリを検出及ぴ z又は同定するためのプローブ。
(1 9) 配列番号 49、 50又は 51に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス ·へモリティカスを検出及び z又は同定するためのプロ ーブ。
(20) 配列番号 52、 23又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェンテロパクター .クロァカを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(21) 配列番号 54、 55又は 56に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、ェンテロパクター .ァエロゲネスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(22) 配列番号 57、 58又は 59に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス ·ェピデルミディスを検出及びノ又は同定するためのプ αーブ。
(23) 配列番号 60、 61又は 62に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス . コンステラータスを検出及びノ又は同定するためのプ π—ブ 0
(24) 配列番号 63、 23又は 64に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 セラチア ·マルセッセンスを検出及びノ又は同定するためのプローブ。
(25) 配列番号 65、 66又は 67に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレブトコッカス ·アンギノサスを検出及ぴ Ζ又は同定するためのプロ一 ブ。
(26) 配列番号 68、 69又は 70に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェシェリシァ ·コリを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(27) 配列番号 54、 71又は 72に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 クレブセラ ·ニューモニエを検出及ぴ Ζ又は同定するためのプローブ。
(28) 配列番号 73、 74又は 75に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェンテロコッカス · フエ力リスを検出及ぴ ζ又は同定するためのプローブ。
(29) 配列番号 76、 77又は 78に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェンテロコッカス . フエシゥムを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(30) 配列番号 79、 80又は 81に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、ストレプトコッカス ·サンダイスを検出及ぴ z又は同定するためのプローブ。
(3 1) 配列番号 82、 83又は 18に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ' ミテイスを検出及ぴ z又は同定するためのプローブ。
(32) 配列番号 60、 84又は 67に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ·ィンターメディウスを検出及ぴ Z又は同定するための プローブ。
(33) 配列番号 85、 86又は 87に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 リステリア · モノサイ トゲネスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(34) 配列番号 88、 89又は 90に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 クロストリジゥム ·パーフリゲンスを検出及ぴノ又は同定するためのプロ一 ブ。
(35) 配列番号 91、 92又は 93に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 コリネパクテリ ゥム ·アクアチウムを検出及ぴノ又は同定するためのプロ一 ブ。
(36) 配列番号 94、 95又は 18に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス 'オラリスを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
(37) 配列番号 96、 97又は 98に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、スタフイロコッカス'ァゥレウスを検出及びノ又は同定するためのプローブ。
(38) 配列番号 99、 100又は 101に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、ナイセリア ·メニンギチデイスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
(39) 配列番号 102、 103又は 104に示される塩基配列、 又はその相捕配列を 含む、 カンピ口パクター · フエタスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(40) 配列番号 105、 106又は 107に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、ェンテロコッカス'ガリナルムを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(4 1) 配列番号 108、 106又は 109に示される塩基配列、 又はその相捕配列を 含む、 ェンテロコッカス .カセリフラパスを検出及びノ又は同定するためのプロ ーブ。
(42) 配列番号 110、 111又は 112に示される塩基配列、 又はその相捕配列を 含む、 エロモナス 'ハイ ドロフイラを検出及び/又は同定するためのプローブ。 (4 3) 配列番号 113、 114又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 サルモネラ 'パラチフィ Aを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
(44) 配列番号 115、 114又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 サルモネラ ·チフィを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(45) 配列番号 116、 117又は 118に示される塩基配列、 又はその相捕配列を 含む、 ス トレプトコッカス .エタイシミリスを検出及び Z又は同定するためのプ ロープ、0
(46) 配列番号 119、 120又は 121に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 ストレプトコッカス · カエスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(47) 配列番号 52、 23又は 122に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 クレブセラ ·ォキシトカを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(48) 配列番号 46、 123又は 124に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 スタフィ口コッカス ·サプロフィティカスを検出及ぴ Z又は同定するため のプロープ。
(49) 配列番号 125、 126又は 127に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 パスッレラ .ムルトシダを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(50) 配列番号 128、 129又は 130に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 エイケネラ · コロデンスを検出及び 又は同定するためのプローブ。
(5 1) 配列番号 131、 132又は 133に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 ストレプトコッカス ' ピオゲネスを検出及ぴ /又は同定するためのプロ一 ブ。
(52) 配列番号 134、 135又は 136に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 モラキセラ ·カタラリスを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
(5 3) 配列番号 137、 138又は 139に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 レジオネラ 'ニューモフイラを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(54) 配列番号 140、 141又は 142に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 マイコバクテリゥム · ッベルク口シスを検出及ぴノ又は同定するためのプ ローブ。
(5 5) 配列番号 143、 144又は 145に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、マイコバクテリゥム ·アビゥムを検出及び/又は同定するためのプローブ。
(56) 配列番号 146、 147又は 145に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 マイコパクテリゥム ·ィントラセルラレを検出及び/又は同定するための プローブ。
(57) 配列番号 148、 149又は 145に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、マイコバクテリゥム'カンサシを検出及ぴ 又は同定するためのプローブ。
(58) 配列番号 150、 151又は 152に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、マイコパクテリゥム 'ゴルドネを検出及び //又は同定するためのプローブ。
(59) 複数の微生物の 16SrRNAの塩基配列における相同性検索によって、 そ れぞれの微生物における VI、 V2、 V3領域を特定し、 該 VI、 V2、 V3領域の塩基配 列において 2種以上の微生物間で比較してミスマツチ部位を決定し、 該ミスマツ チ部位を含み、 かつ塩基長が 20〜100bpの領域を決定することを含む、 プローブ の設計方法。
(60) (1) 又は （2) に記載のプローブの 1種以上を用いることを特徴と する、 ァクチノバチルス · ァクチノマイセテムコミタンス、 ァシネトパクター ' 力ノレコアセチカス、 へモフイノレス ·ィンフノレェンザ、 ステノ トロフォモナス · マ ノレトフィ リア、 プロテウス ' ミラビリス、 ス トレプトコッカス · ニューモニエ、 シユードモナス · エノレギノサ、 シトロバタター · フレンディ、 べィヨネラ · パル プーラ、 プロビデンシァ · スチュアーティ、 ナイセリァ · ゴノローェ、 ス トレプ トコッカス 'ァガラタチェ、 モルガネラ 'モルガ-、 パクテロイデス 'フラジリ ス、 スタフイロコッカス · ホミニス、 スタフイロコッカス · ヮノレネリ、 スタフィ ロコッカス .へモリティカス、 ェンテ口パクター .クロア力、 ェンテロノくクタ一 · ァエロゲネス、 スタフイロコッカス 'ェピデ ミディス、 ストレプトコッカス ' コンステラータス、 セラチア ·マ/レセッセンス、 ス トレプトコッカス · アンギノ サス、 ェシエリシァ · コリ、 クレブセラ · ェユーモニエ、 ェンテロコッカス · フ ェカリス、 ェンテロコッカス · フエシゥム、 ス トレプトコッカス .サングイス、 ス トレプトコッカス ' ミテイス、 ス トレプトコッカス ' インターメディウス、 リ ステリア ' モノサイ トゲネス、 クロス トリジゥム 'パーフリンゲンス、 コリネバ クテリ ウム ·アクアチウム、 ス トレプトコッカス ' オラリス、 スタフイロコッカ ス 'ァゥレウス、 ナイセリァ ·メニンギチデイス、 カンピロバクタ一 'フエタス、 ェンテロコッカス ·ガリナノレム、 ェンテロコッカス ·カセリフラノくス、 エロモナ ス . /、ィ ドロフィラ、 サノレモネラ ·ノ ラチフィ A、 サノレモネラ ·チフィ、 ストレ プトコッカス .エタイシミリス、 ストレプトコッカス '力ニス、 クレブセラ .ォ キシト力、スタフイロコッカス ·サプロフィティカス、パスッレラ ·ムルトシダ、 エイケネラ · コロデンス、 ストレプトコッカス · ピオゲネス、 モラキセラ ·カタ ラリス、 レジオネラ ·ニューモフィラ、 マイコバクテリゥム · ッべノレク口シス、 マイコバクテリゥム .アビゥム、 マイコバクテリゥム .イントラセルラレ、 マイ コバクテリゥム ·カンサシ、 マイコバクテリゥム · ゴルドネから選択される 1又 は複数の微生物の検出及びノ又は同定方法。
( 6 1 ) 微生物由来の塩基配列とプローブの塩基配列間でミスマッチが 4個以 上ある場合にハイブリダィズしないストリンジエンシー条件を用いて両配列をハ イブリダィズさせることを含む、 （6 0 ) に記載の方法。
( 6 2 ) 同定すべき微生物の 16S rRNAの V1、V2及び V3領域内の 20〜； !OObpの 塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが 3個以 下である塩基配列を有する 2種以上の微生物を検出し、 該 2種以上の微生物と異 なる微生物の V1、V2及ぴ V3領域内の 20〜100bpの塩基配列又はその相補配列から なるプローブの 1種以上を用い、 該 2種以上の微生物のうち 1種の微生物をさら に同定することを含む、 （6 0 ) 又は （6 1 ) に記載の方法。
( 6 3 ) 以下の工程： （a)同定すべき微生物から核酸を調製する工程、 （b)該核 酸を請求項 1又は 2に記載のプローブとハイプリダイズさせる工程、（c) 工程（b) におけるハイブリダィズの有無を検出し、 各プローブに対するその検出シグナル パターンを特定する工程、（d)工程（c)において得られた検出シダナルパターンと、 予め特定しておいた微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき微生 物の種類を特定する工程、 からなる （6 0 ) 又は （6 1 ) に記載の方法。
( 6 4 ) 配列番号 153及び 154で示されるプライマーを用いて標的配列を含む ヌクレオチドを増幅した後にプローブとハイブリダィズさせる、 （6 0 )〜（6 3 ) のいずれかに記載の方法。
( 6 5 ) 標的配列を含むヌクレオチドの増幅の際に、 蛍光物質を用いて標識を 行う、 （6 0 ) 〜 （6 4 ) のいずれかに記載の方法。
( 6 6 ) DNAチップ上で検出する、 （6 0 ) 〜（6 5 )のいずれかに記載の方法。 本明細書は本願の優先権の基礎である特願 2002-174564 号の明細書および/ま たは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、微生物の 16S rRNAの塩基配列中の VI、 V2及び V3領域を示す図である。 配列表の説明
配列番号 153は.合成 DNAである。
配列番号 154は合成 DNAである。 発明を実施するための形態
本発明の微生物検出同定用のプローブ及びそれを用いた検出及び/又は同定方 法についてさらに詳細に説明する。
本発明の第 1の態様は、 前述の表 1に示す微生物から選択される 1または複数 の微生物を検出及ぴ Z又は同定するためのプローブであって、 検出及び/又は同 定すべき微生物の 16S rRNAの VI、 V2及ぴ V3領域内の 20〜100bpの塩基配列又は その相補配列からなるプローブである。
本発明においてプローブとは、 核酸の相補的な配列が互いに特異的に結合する 性質を利用して、 DNAや RNA断片の中から特定の断片を検出し得るオリゴヌタレ ォチド DNAや RNAであり、 特に、 微生物由来の 16S rRNAまたは 16S rDNAに含ま れるヌクレオチド配列を有する標的核酸と特異的に結合するオリゴヌクレオチド 配列である。
本発明の各微生物を検出及ぴ Z又は同定し得るプローブは、 各微生物の 16S rRNAの VI、 V2及ぴ V3領域について検出同定対象の 2種以上の微生物間でマルチ ブルアライメントを行ってミスマッチ部位を決定し、 特に各微生物に対して特異 性が高い領域を決定して当該プローブを作製することができる （図 1参照）。本明 細書において、 VI、 V2、 V3領域とは、 各微生物の 16S rRNAの 5'領域遺伝子配列 (約 500bp) のうち、 保存性の低い 3つの領域であって、 VI領域は 5'末端からお およそ第 50〜第 120番目の塩基の領域であり、 V2領域はおおよそ第 150〜第 260 番目の塩基の領域であり、 V3領域はおおよそ第 420〜第 520番目の塩基の領域で ある。
これらの V1〜V3領域から作製し得る検出同定用プローブは、検出、同定感度の 点から検出同定すべき微生物間においてミスマッチが多い領域を用いるのが適当 であり、 ミスマッチは 4ケ所以上存在するのが好ましい。 また、 同定方法におけ る検出感度、 コス ト等を考慮すると、 プローブの塩基配列は 20〜100bpが好まし く、 特に 30〜80bpが好ましい。 なお、 これらのプローブは、 対応する各々の領域 に応じて、 vlプローブ、 v2プローブ、 v3プローブと称する。
これらのプローブは、 表 1に示す微生物が特異的に検出、 同定出来る限り、 一 部が修飾され、 又はその塩基配列に欠失、 置換又は付加が存在していてもよい。 具体的には、表 1に記載した微生物の 16S rRNAの塩基配列における相同性検索 によってそれぞれの微生物における VI、 V2、 V3領域を特定し、 該 VI、 V2、 V3領 域において 2種以上の微生物の塩基配列を比較してミスマッチ部位を決定する。 その結果を基にして、 該ミスマッチ部位を含み、 かつ塩基長が 20〜100bpのプロ ーブを作製する。 ミスマッチ部位はプローブの中央付近になるように設計するの が好ましい。表 1に示す微生物のうち、その微生物自身の V1〜V3領域の塩基配列 とその微生物以外の微生物由来の vl〜v3 プローブの塩基配列の間に最小ミスマ ツチ数が 4個以上ある徼生物は、 プローブを単独で用いることによって検出、 同 定可能な微生物である。 また、 最小ミスマッチ数が 3個以下の微生物は、 複数の プローブによる検出結果を総合的に判断することによって検出、 同定可能な微生 物である。
各微生物に対する検出同定用プローブの ID とその配列番号を表 2及び表 3に 示す。
Figure imgf000016_0001
 表 3
Figure imgf000017_0001
表 2は、 単独で微生物の同定が可能なプローブを、 表 3は、 組み合わせて同定 が可能なプローブの例を示す。
例えば、 表 2からわかるように、 ァクチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミ タンスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、 配列番号 2に示される塩基 配列を有する 01 v2プローブ及ぴ配列番号 3に示される塩基配列を有する 01 v3 プローブ、 またはそれぞれの相補配列を有するプローブであり、 ァシネトパクタ 一 ·カルコァセティカスを単独で特異的に検出同定し得るプローブは、 配列番号 4に示される塩基配列を有する 02 vlプローブ、 配列番号 5に示される塩基配列 を有する 02 v2プローブ、 配列番号 6に示される塩基配列を有する 02 v3プロ一 ブ、 またはそれぞれの相補配列を有するプローブである。
また、 表 3には、 他の微生物との 16S rRNA遺伝子配列が類似しているため、 単 独プローブによる検出 ·同定が困難な微生物を示してある。 これら微生物の場合 には、 該当微生物の検出用に設計されたプローブだけでなく、 他の微生物の検出 用に設計されたプローブによるハイブリダィゼーションパターンを利用して、 個々の微生物の検出同定を行う。 例えば、 表 4に示されるように、 ストレプトコ ッカス . ニューモニエを検出するための配列番号 16〜18 のプローブ 06 vl〜v3 はいずれも、 V1〜V3領域で他の微生物との間で最小のミスマッチ数が 3塩基以内 であるため、 単独でス トレプトコッカス ·ニューモニエの検出 ·同定が困難であ る。 そこで、 配列番号 16〜18のプローブ 06 vl〜v3だけでなく、 配列番号 82、 83、 18のプローブ 29 vl〜v3および、配歹 !J番号 94、 95、 18のプロープ 34 vl〜v3、 またはそれぞれの相補配列を有するプローブの検出結果を組み合わせて利用する ことで、 検出 ·同定を行う。
これらのプローブは、 天然由来のものであっても、 化学合成等の常法によるも のであってもよく、 化学合成は、 例えば ABI社 (Applied Biosystem Inc. ) の DNA シンセサイザーを用いてホスホロアミダイ ト法により合成できる。 また、 公知の リン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、ホスフアイト法等を用いることもで きる。
本発明の第 2の態様は、 表 1に示す微生物から選択される 1または複数の微生 物の検出及び/又は同定方法であって、検出同定すべき微生物の 16S rRNAの VI、 V2及ぴ V3領域内の 20〜100bpの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの 1以上を用いることを特徴とする方法である。
すなわち、 具体的には、 本発明の検出同定方法は、 微生物又はそれ由来の核酸 を含む被検体に上記プローブを接触させてハイブリダィゼーシヨンを行い、 標識 を指標にして表 1の微生物を検出、 同定する方法である。
微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体は、 核酸が微量である場合には、 表 1 に示す微生物の 16S rDNAの V1〜V3領域を含む塩基配列を増幅させることができ るプライマーを用いて増幅させる。 なお、 プライマーとは、 核酸の合成反応にあ たりポリヌクレオチド鎖が伸長していく出発点として働くポリヌクレオチドであ り、本発明におけるフォワードプライマーは、 VI領域より上流の各微生物間にお いて保存性の高い領域であるおおよそ 1から 70 番目の塩基に存在する領域から 設計するのが好ましく、 リバースプライマーは、 V3領域より下流の各微生物間に おいて保存性の高い領域であるおおよそ 450から 620番目の塩基に存在する領域 から設計するのが好ましい。 また、 そのサイズは、 15〜35mer が好ましく、 特に 18〜30mer が好ましい。 例えば、 一例として、 フォヮ一ドプライマ一としては、 おおよそ第 1から第 70番目の塩基に位置する、 以下の配列番号 153に示される 27Fプライマー、 リバースプライマーとしては、 おおよそ第 450から第 620番目 の塩基に位置する、 以下の配列番号 154に示される 525Rを用いることができる。 これらのプライマーは天然由来のものであっても、 常法により化学合成されたも のであってもよレ、。 ィ匕学合成は、 例えば ABI社 (Appl ied Biosystem Inc. ) の DNA シンセサイザーを用いてホスホロアミダイ ト法により合成できる。 また、 公知の リン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、ホスフアイト法等を用いることもで さる。
フォワードプライマー 27F (配歹番号 153) ： 5， agagtttgatcctggctcag 3' リバースプライマー 525R (配歹 (J番号 154) ： 5' gtattaccgcggctgctggcag 3' 微生物又はそれ由来の核酸を含む被検体は、 予め以下のような常法により調製 し、 上記のプライマーを用いた PCR増幅に供する。 例えば、 サンプルから遠心分 離法ゃメンプランフィルタ一等を用いて捕集された微生物に溶菌酵素、 界面活性 剤、 アルカリ等の公知の処理方法を用いて核酸を抽出する。 このうち、 抽出の効 率や純度、 操作性の点などから、 溶菌酵素を加える方法を用いるのが好ましい。 なお、 本発明において、 核酸には RNA、 DNAが含まれる。 また、 本発明では、 核酸 が数分子から数十分子以上存在すれば PCRは達成され得る。 サンプルとしては、 例えば、 糞便、 尿、 血液、 組織ホモジェネート等の臨床検査材料、 及ぴ、 食品材 料等が挙げられる。
次に、抽出した核酸を鑤型とし、上記のプライマーを用いて PCR法（Science 230, 1350 ( 1985) ) を実施する。 本発明においては、 上記プライマー （配列番号 153 及び 154) を用いることによって、 微生物の 16S rDNAの塩基配列の 5'末端からお およそ第 27〜第 525番目の塩基及びその近傍の配列を増幅させることが好ましい。 PCR 法の反応条件や反応溶液は公知の情報に基づいて任意に設定することができ る。例えば、熱変性： 90〜95°Cで 1〜30秒、ァニーリング： 37〜65°Cで 0〜30秒、 伸長反応： 50〜75°Cで 10〜60秒、 これを 1サイクルとして 30〜50サイクル行つ て増幅するのが好ましい。 PCR法の増幅結果は、 必要に応じ、 反応を終えた溶液 をそのままァガロールゲル電気泳動にかけることで、 増幅されたヌクレオチドの 存在、 及びその長さを確認することができる。
増幅された微生物の核酸は、 上記の本発明のプローブを用いたハイブリダィゼ ーシヨンに用いることができる。本発明において、ハイブリダィゼーシヨンとは、 特定の条件下において、 相補的な配列を有する 2つの 1本鎖の塩基配列が結合し て、 2本鎖を形成することを意味する。 また、 特定の条件とは、 ハイブリダィゼ ーシヨンにおけるス トリンジェンシ一な条件を意味し、 特に、 本発明では、 微生 物由来の塩基配列と本発明のプロ一ブの塩基配列間でミスマッチが 4個以上ある 場合にハイブリダィズしない条件を意味する。 ストリンジエンシーな条件は、 実 施されるハイプリダイゼーシヨンの条件によって異なるが、 当業者であればハイ ブリダィゼーシヨンのプロトコルに基づいて、 温度、 塩濃度、 活性剤濃度等の溶 媒組成等の条件を適宜設定することができる。 一例としては、 50mer のプローブ とのハイブリダィゼーシヨンの場合、 55°C、 0. 5 X SSC、 0, 2% SDSで実施すること ができる。 なお、 目的に応じ、 ストリンジエンシーを高くすることによって、 ミ スマッチ数が 3個以上、 2個以上、 又は 1個以上でハイブリダィズすることがで きないように設定することが可能である。 また、 ス トリンジエンシーを低くする ことによって、 ミスマッチが 5個以下、 6個以下等でもハイブリダィズできるよ うに設定することもできる。
ハイブリダィズの可否は、 上記のように調製した微生物から抽出し、 増幅した 核酸を予めフルォロセィンィソチオシァネートゃテトラメチルローダミンィソチ オシァネート等の蛍光物質ゃハプテン等で標識し、 プローブを前記の標識化した 核酸とハイブリダィズさせた後、 蛍光色素等の標識を測定することによって確認 することができる。 標識化は、 例えば、 ニック トランスレーション法、 DNA ポリ メラーゼを用いる方法や 5'側の末端が蛍光物質またはハプテン等で標識された 標識化プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより得ることができる。
本発明の検出同定方法には、 単独のプローブの使用によって、 表 2に示す特定 の微生物を検出、 同定する方法が含まれる。 例えば、 同定すべき微生物自身の VI 〜V3領域内の 20〜： !OObpの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配 列と、 その微生物以外の微生物由来の塩基配列との間に最小ミスマツチ数が 4個 以上存在する前記プローブを使用することによって、 微生物を検出するとともに 同定することができる （表 2及び表 4を参照）。
また、 本発明の方法には、 本発明の複数のプローブによる検出結果を総合的に 判断することによって、 表 3に示す特定の微生物を検出し、 さらに同定する方法 も含まれる。 具体的には、 第 1ステップとして、 同定すべき微生物の 16S rRNA の V1、V2及ぴ V3領域内の 20〜100bpの塩基配列又はその相補配列からなるプロ一 ブの塩基配列とのミスマッチが 3個以下である塩基配列を有する 2種以上の微生 物を検出し、 第 2ステップとして、 該 2種以上の微生物と異なる微生物の V1、V2 及び V3領域内の 20〜： !OObpの塩基配列又はその相補配列からなるプローブの 1種 以上を用い、 該 2種以上の微生物のうち 1種の微生物をさらに同定する方法であ る。
例えば、 一例を表 61に示している （実施例 3参照）。 ID 06微生物 （ストレブ トコッカス · ニューモニエ） の 06 vl〜v3プローブと ID 29微生物 （ス トレプト コッカス 'ミテイス）に対応する塩基配列とはミスマッチが 3個以下であるので、
06 vl〜v3プローブを用いて検出される微生物は、 ID 06微生物と ID 29微生物の いずれであるかまでは同定できない。 しかしながら、 第 2ステップとして、 ID 34 微生物 （ストレプトコッカス 'オラリス） 由来の 34 vl〜v3プローブを用いて検 出方法を行うと、 ID 06微生物は 34 v3プローブとのみハイブリダイズしてシグ ナルが検出され、 ID 29微生物は 34 v2及び v3プローブとそれぞれハイブリダイ ズしてシグナルが検出される。 従って、 06 vl〜v3 プローブを用いて検出された 微生物は、 さらに ID 34微生物 （ストレプトコッカス ·ォラリス） 由来の 34 vl 〜v3プローブを用いた検出を行うことによって、 ID 06微生物であるか ID 29微 生物であるかを同定することができる。
なお、 臨床や食品衛生の分野において、 検出すべき微生物が試料中に存在する 可能性があるか否かをいち早く確認することが必要であり、 微生物の同定まで行 う必要がない場合、 また、 同時に検出され得る複数の微生物が近縁の種であり、 それら複数の微生物に対する治療方法などの対処方法がすでに明らかである場合 には、 上記の第 1ステップを実施するだけでよい。
また、 本発明の方法には、 （a)同定すべき微生物から核酸を調製する工程、 （b) 該核酸を本発明のプローブとハイブリダィズさせる工程、（c) 工程 (b)におけるハ イブリダィズの有無を検出し、 各プローブに対するその検出シグナルパターンを 特定する工程、 （d)工程（c)において得られた検出シグナルパターンと、 予め特定 しておいた、 表 1に示す微生物の検出シグナルパターンとを比較して同定すべき 微生物の種類を特定する工程からなる方法も含まれる。 この場合、 検出シグナル パターンをコンピュータ処理等によって解析することによって、 微生物の検出、 同定効率を一層高めることができる。 また、 この検出シグナルパターンによる方 法は、 DNA チップ上で実施することによって、 より迅速に、 効果的に行うことが できる。
DNA チップ上での検出同定方法としては、 具体的には、 以下のように実施する ことができる。 本発明のプローブを、 例えば、 ガラス、 シリコン等の支持体上の 各位置 （スポッ ト） に共有結合等により固定化する。 その支持体上に、 上記のよ うにして得られた標識化核酸を含む溶液をかけると、 各スポット内のプローブの 塩基配列に相捕的な塩基配列を有する試料中の微生物由来核酸の塩基配列がハイ ブリダィズして二本鎖を形成し、 支持体上に残る。 ハイブリダィゼーシヨンした 結合体の標識又はハイプリダイゼーシヨンしなかった標識を測定することによつ て、 被検体中の微生物を検出同定することができる。 実施例
以下に実施例を示し、 本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。
[実施例 1 ] 微生物同定用プローブの調製と同定チップの作製
(プローブ調製用微生物）
本発明のプローブを調製するために、 表 1に示す微生物を標準菌株として用い た。 なお、 微生物は、 American Type Culture Collection (ATCC株）、 独立行政 法人 製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門 （財団法人発酵研究所 （IF0)の 微生物株分譲業務を引継ぎ、 微生物の分譲を行っている） （IF0 株）、 東京大学医 科学研究所 （IID株） 等から入手可能である。
(微生物の 16S rDNA 5'領域遺伝子配列 （約 500bp) の VI、 V2、 V3領域の決定と プローブとして利用可能な塩基配列の決定とプローブの調製）
表 1に示す微生物の VI、 V2、 V3領域は、 16S rRNA をシーケンサー （Applied Biosysteni社） で解読した塩基配列についてマルチプルァライメント （日立ソフ ト DNASIS Pro) を実行し、決定した。更に、 プラストと呼ばれるアルゴリズム （日 立ソフ ト DNASIS Pro) を用いて、 それらの領域においてミスマッチ部位を特定し た。 該ミスマッチ部位が中央付近にくるようにプローブの塩基配列を設計した。 表 4に、それぞれの微生物について設計された vl〜v3プローブについて、各プ ローブが由来する微生物以外の微生物の V1〜V3 領域の配列とハイブリダィズさ せることを想定した場合のミスマッチ塩基数の中で最小となる数値 （最小ミスマ ツチ数） を示す。 vl〜v3プローブのいずれかにおいて最小ミスマッチ数が 4以上 であれば、 単独のプローブによってその微生物が検出 ·同定可能である。 vl〜v3 プロ一ブのいずれにおいても最小ミスマツチ数が 3以下であるばあいには単独の プローブによって検出 ·同定ができないが、 後述するように本発明の方法によつ て検出 ·同定できる。 なお、 表 4中、 noneとは、 有意な相同性のある配列がなか つたということを表す。 表 4
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
(DNAチップの作製）
表 1に示す微生物の各 vl v3プローブを合成し、 HP L C精製の後凍結乾燥し た状態で保存した。 これらを 20 μΜに調整し、 マイクロアレイスポッティングソ リューシヨン (ジェネティックス社） と 1： 1で混合した。 全てのサンプルをスポ ッター (日立ソフト社 SPBI0) にて 2X4ブロックにスポッ トし、 レプリカを含 め合計 4X4プロックとした。それぞれのブロックの 4端にはポジティブコントロ ールをスポットした。 スポッターで使用するピンは、 ステンレス 'スチールピン 150μπιとした。 スポットした後、 0.2 % SDS溶液 ·水 ·沸騰水に入れ、 スライ ド ウォッシャー（パイオフィールド社）にてチップを洗浄し、以下の実験に用いた。
[実施例 2] 微生物同定プローブを用いた微生物の同定方法
(微生物 DNA抽出溶液の調製）
表 1に示す微生物を LB培地寒天培地（酵母エキス 5g、トリプトン 10g NaCl 5g 寒天 20g、蒸留水 1L pH7.4) で培養した後、集菌した。 300μ1の 1% Tween20 (シ クマ) ， 60Unit Lytic Enzyme (Gentra Systems; 600Unit Achromopeptidase (和光純薬） を含む Cell Suspension Solution (Gentra Systems) 溶液 （溶菌酵 素液） を加え懸濁し、 37°Cで 2 時間加温した。 次に、 600mU / μ 1 Proteinase K 溶液を 30 μ 1加え、 70°Cで 10分間加温した。
この溶液に 5M グァニジン塩酸- lOOmM トリス塩酸溶液（pH 8.0)を 330 1加え、 10分間混合した。 その後、 TE飽和フエノール： クロ口ホルム液 （1:1) 600^1を 加えて懸濁した後、 微量高速遠心分離機を用い 15,000rpm 10分間 25°Cで遠心分 離した。 上層を 600 分取し、 60μ1の 3Μ 酢酸ナトリゥム（ρΗ6.0)、 1800 μ 1の 99. 5%エタノールを加え混和し、 - 80°Cで 10分間放置後、 8，000rpm l5分間 4。Cで 遠心分離した。 70%冷エタノールでリ ンスした後、 沈殿を乾燥させ、 滅菌蒸留水 100 μ 1を加えて十分に溶解した。 この溶液を PCRに供した。
(PCRによるターゲット DNAの増幅）
PCRは、 GeneAmp9600システム （Roche diagnosti cs社） を使用し、 50 μ 1の反 応液量で行った。 反応液 50 1中には、 1 1の铸型 DNA (上記微生物 DM抽出溶 液）、 5 μ 1の 10Xバッファー（Z- Taq用）、 0. 75 units Z - Taq (宝酒造）、 6 nmole dNTPs、 フォワードプライマー 27F (配列番号 153)、 リバースプライマ一 525R (配列番号 154) 各 6 pmoleが含まれる。
PCRの条件は、 98°Cで 2分の後、 98°Cで 1秒、 60°Cで 90秒を 1サイクルとし、 35サイクル反応させ、微生物中のターゲット遺伝子の PCR増幅産物を得た。 反応 終了後、 Sephadex™ G50 Fine (Amersham pharmacia biotech)によるスピンカラム 法により基質を除去後、 凍結乾燥により濃縮乾固させ、 ΙΟ μ Ι の滅菌超純水にて 溶解し、 ターゲット DNA溶液とした。
(PCR増幅産物の標識）
Nick Translation Kit (ロシュ ·ダイァグノスティックス社） を用いて、 上記 のターゲッ卜 DNAを FluoroLink™ Cy 5 -dUTP (Amersham pharmacia biotech)で標 識した。標識反応液 20 μ 1中には、 1 gの上記ターゲット DNA溶液、 3. 5 / l Enzyme mixture, 0. 04mM dATP、 0. 04 mM dCTP、 0. 04 mM dGTP、 2 1 lOx buffer, 0. 1 mM
FluoroLink™ Cy 5 ~dUTP が含まれる。 反応条件は、 15°C、 2時間で行った。 反応 後、 Sephadex™ G 5 0 Fine (Amersham pharmacia biotech)によるスピン力ラム法 で精製した。 精製した反応物を凍結乾燥し、 10 /z l滅菌超純水に溶解した。
(ハイブリダィゼーション）
2 μ 1の上記標識ターゲット DNAを加えて、 最終濃度が 50% ホルムアミ ド、 5χ SSC、 2% SDS、 1 % BSAとなるようにハイブリダイゼーション溶液を調整した。 こ の溶液 15 μ 1を 98°C、 2分間ディネイチヤーさせた。
実施例 1で作製した微生物同定チップ上に滴下し、 24 X 25mmハイプリカバース ライド （ビーェム機器社） を乗せ、 55°Cの恒温槽で 2時間反応させた。 反応後、 細菌同定チップを 2x ssc溶液に浸し、 ハイプリカパースライ ドを滑り落とした。 さらに、 2 x SSC、 0. 2°/。 SDS溶液へ移し、 5分間洗浄後、 0. 2x SSC、 0. 2% SDSで 5分間洗浄した。 さらに 0. 5x SSCで 1分間洗浄した。
微生物同定チップを 2000rpm、 1分間遠心乾燥した後、 ScanArray 4000 (Packard BioChip Technologies, LLC) で常温、 室温の元、 シグナル検出した。 なお、 シグ ナルの強度をより明確に判断するために、 検出されたシグナルを日立ソフ ト DNASIS (登録商標） Arrayによって数値化し、 輝度値とした。
表 5には、 微生物 ID 01のァクチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミタンス の 16S rRNAの V1〜V3領域を含む配列を有するポリヌクレオチドを微生物同定チ ップに調製された各微生物の vlプローブ、 v2プローブ及ぴ v3プローブとハイブ リダイズさせ、シグナルの輝度値が高かった上位 10種類のプローブを各領域毎に 示した。 表 5中、 プローブ IDは、 表 1に示す微生物 IDの番号と vl〜v3領域を組 み合わせて示している。
例えば、 ァクチノバチノレス ·ァクチノマイセテムコミタンスの 16S rRNAの VI 領域の結果をみると、 プローブ 01 vlの輝度値が著しく高いので、 プローブ 01 vl は被検体中にァクチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミタンスが存在する可能 性があることを検出することができる。 ただし、 この場合、 プローブ 01 vl以外 にプローブ 03 vlが類似の輝度値を示すので、 プローブ 01 vlの単独使用による 同定はできない。 これは、 プローブ 01 vlの塩基配列が他の微生物由来の塩基配 列に対してミスマッチ塩基数が 3個以下であるため、 類似のプローブ 01 vl と相 同性の高い塩基配列を有する他の微生物ともハイプリダイズしてしまうからであ る （表 1を参照）。 従って、 プローブ 01 vlによって検出された微生物がいずれの 微生物であるかを詳細に同定する必要がある場合には、 さらなる同定ステップを 行う必要がある。
一方、 ァクチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミタンスの 16S rRNA V2領域 の結果をみると、 プローブ 01 v2の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著 しく高いので、 プロープ 01 v2を用いて被検体中のァクチノバチルス 'ァクチノ マイセテムコミタンスの存在を検出、 同定することができる。
また、 ァクチノバチルス .ァクチノマイセテムコミタンスの 16S rRNA V3領域 の結果をみると、 プローブ 01 v3の輝度値のオーダーが他のプローブに比べて著 しく高いので、 プローブ 01 v3を用いて被検体中のァクチノバチルス 'ァクチノ マイセテムコミタンスの存在を検出、 同定することができる。
また、 VI領域、 V2領域、 V3領域のプローブの組合せから総合的に判断して、 vlプローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは 03 vlおよび 01 vlで あり、 v2プローブにおいて比較的シグナル強度の高いプローブは 01 v2であり、 v3プローブにおいて比較的シグナル強度の強いプローブは 01 v3であることから, 対象微生物は、 全ての領域に共通して強いシグナル強度が検出されたァクチノバ チルス 'ァクチノマイセテムコミタンスであると検出 ' 同定することができる。 表 5
プロ一ブ ID 領域 発光シグナル強度
03 v1 V1 領域 24292772
01 vl V1 領域 23806916
05 v1 V1 領域 6665238
47 v1 V1 領域 3385259
24 v1 V1 領域 2169069
41 1 V1 領域 2168168
42 vl V1 領域 2021318
13 v1 V1 領域 1865555
08 v1 V1 領域 1833450
36 v1 V1 領域 1520337
01 2 V2領域 24106717
03 v2 V2領域 8121296
08J 8— 22— 45 v2 V2領域 507673
25 v2 V2領域 473566
20 v2 V2領域 467841
07 v2 V2領域 457081
19 v2 V2領域 452294
47 v2 V2領域 444574
23 v2 V2領域 444368
26 v2 V2領域 443460
01 v3 V3領域 44018306
03 v3 V3領域 1563637
53—54 v3 V3領域 1008301
05 v3 V3領域 458131
46 v3 V3領域 446885
12 v3 V3領域 441418
16 v3 V3領域 440355
45 v3 V3領域 437947
15 v3 V3領域 436469
26 v3 V3領域 433456 表 6は、 ァシネ トパクター . カルコァセチカス （微生物 ID 02) の 16S rRNAの
V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダィズさせた結果を示す。 表 6の結果から、 ァシネトパクター 'カルコア セチカスは、 プローブ 02 vl、 02 v2、 02 v3の単独使用により検出、 同定できる ことが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場 合でも、 vlプローブでは 02 vl、 v2プローブでは 02 v2、 v3プローブでは 02 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたァシネト パクター .カルコァセチカスであると検出 .同定することができる。
表 6 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
02 v1 V1 領域 13924050
07 v1 V1 領域 1862320
20 v1 V1 領域 1378305
32 v1 V1 領域 1327221
13 v1 V1 領域 1232256
17 v1 V1 領域 1 145747
50 v1 V1 領域 1 133280
35 v1 V1 領域 1 1 15164
16—46 v1 V1 領域 1091812
22 v1 V1 領域 1072129
02一 v2 V2 領域 14595023
04-v2 V2 領域 6953521
07 v2 V2 領域 5933146
36 v2 V2 領域 4666635
40 v2 V2 領域 3464230
50 v2 V2 領域 1883560
05 v2 V2 領域 1765482
1 1 v2 V2 領域 1536763
10 v2 V2 領域 545853
08— 18— 22_45 v2 V2 領域 321589
02 v3 V3 領域 17774582
08 v3 V3 領域 240445
05 v3 V3 領域 2401 10
19 v3 V3 領域 232178
38 v3 V3 領域 206877
22 v3 V3 領域 204959
25 v3 V3 領域 190615
04 v3 V3 領域 1 89167
40 v3 V3 領域 179787
07 v3 V3 領域 176742 表 7は、 へモフィルス · インフルエンザ （微生物 ID 03) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダ ィズさせた結果を示す。 表 7の結果から、 へモフィルス 'インフルエンザは、 プ ローブ 03 v2、 03 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 ま た、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 03 vl、 01 vl、 v2プローブでは 03 v2、 v3プローブでは 03 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたへモフィルス 'インフルェ ンザであると検出 ·同定することができる。
表 7
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
03 v1 V1 領域 2378623
01 v1 V1 領域 1906842
47 v1 V1 領域 1016080
41 v1 V1 領域 859149
42 v1 V1 領域 829649
05 v1 V1 領域 741202
24 v1 V1 領域 670298
13 v1 V1 領域 657089
29 vl VI 領域 569133
18—45 v1 V1 領域 563785
03 v2 V2 領域 17021408
01 v2 V2 領域 1131659
08一 18—22—45 v2 V2 領域 488172
23 v2 V2 領域 467092
04 v2 V2 領域 456739
49 v2 V2 領域 450377
24 v2 V2 領域 447638
33 v2 V2 領域 444928
07 v2 V2 領域 444421
26 v2 V2 領域 444320
03 v3 V3 領域 34956972
01 v3 V3 領域 7686990
53—54 v3 V3 領域 992698
33 v3 V3 領域 930101
25 v3 V3 領域 851733
50 v3 V3 領域 58561 1
47 v3 V3 領域 565322
48 v3 V3 領域 552483
05 v3 V3 領域 459296
37 v3 V3 領域 458129 表 8は、 ステノ トロフォモナス ·マルトフィリア （微生物 ID 04) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダィズさせた結果を示す。 表 8の結果から、 ステノ トロフォモナス 'マ ルトフイリァは、 プローブ 04 vl、 04 v3の単独使用により検出、 同定できること が明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合で も、 vlプロ プでは 04 vl、 v2プローブでは 04 v2、 02 v2、 v3プローブでは 04 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたステノ ト 口フォモナス ·マルトフィリァであると検出 · 同定することができる。
表 8
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
04 v1 V1 領域 10553679
36 v1 V1 領域 466306
55 v1 V1 領域 418442
52 v1 V1 領域 399038
56 v1 V1 領域 392406
53 v1 V1 領域 385465
11 v1 V1 領域 350646
39 v1 V1 領域 345370
54 v1 V1 領域 340987
38 v1 V1 領域 325138
04 v2 V2 領域 10010827
02 v2 V2 領域 9289489
07 v2 V2 領域 1682837
40 v2 V2 領域 1168392
36 v2 V2 領域 1016436
05 v2 V2 領域 547876
11 v2 V2 領域 393560
19 v2 V2 領域 293886
08J 8一 22一 45 v2 V2 領域 286031
24 v2 V2 領域 276338
04 v3 V3 領域 17018787
32 v3 V3 領域 318622
53一 54 v3 V3 領域 294460
05 v3 V3 領域 273603
36 v3 V3 領域 156275
21 v3 V3 領域 153557
25 v3 V3 領域 148719
51 v3 V3 領域 144205
48 v3 V3 領域 143748
28 v3 V3 領域 142935 表 9は、 プロテウス · ミラビリス （微生物 ID 05) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズ させた結果を示す。 表 9の結果から、 プロテウス . ミラビリスは、 プローブ 05 V2 の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 Vl、 V2、 V3プロ ーブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 05 vl、 01 vl、 v2 プロープでは 05 v2、 v3プローブでは 05 v3、 45 v3が比較的強いシグナル強度を もっため、各領域で高い強度が検出されたプロテウス .ミラビリスであると検出 . 同定することができる。
表 9
ノロ一ノ ID 発光ンクナノレ強度
05 v1 V1 領域 20827926
01 v1 V1 領域 15475009
13 vl V1 領域 9362993
10 v1 V1 領域 7681042
03 v1 V1 領域 7004544
22 v1 V1 領域 3735229
07 v1 V1 領域 2610601
24 v1 V1 領域 2389560
20 v1 V1 領域 2128154
47 v1 V1 領域 1946520
05 v2 V2領域 40877654
04 v2 V2領域 4549427
10 v2 V2領域 3936746
02 v2 V2領域 2747031
13 v2 V2領域 1756674
25 v2 V2領域 1579401
07 v2 V2領域 1459845
11 v2 V2領域 1214739
08_18— 22一 45 v2 V2領域 1008826
19 v2 V2領域 965000
05 v3 V3領域 「 35771 120
45 v3 V3領域 16469087
25 v3 V3領域 4041990
18— 41一 42 v3 V3領域 3949284
24 v3 V3領域 1675672
19 v3 V3領域 1537185
13 v3 V3領域 1386238
22 v3 V3領域 1287333
09 v3 V3領域 902008
28 v3 V3領域 847886 表 10は、 ストレプトコッカス · ニューモニエ （微生物 ID 06) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダイズさせた結果を示す。 表 10の結果から、 ス トレプトコッカス ·ニュー モニエは、 プローブ 06 vl〜06 v3の単独使用により同定はできなかった。 しかし ながら、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せで総合的に判断すると、 vl プローブでは 06 vl、 29 vl、 v2プローブでは 06 v2、 29 v2、 v3プローブでは 06_29_34 v3が 比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレブト コッカス . ニューモニエであると検出 .同定することができる。
表 10
Figure imgf000033_0001
表 11は、 シユードモナス ·エルギノサ （微生物 ID 07) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 11の結果から、 シユードモナス .エルギノサは、 プロ ーブ 07 vl、 07 v2、 07 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ一 ブでは 07 vl、 v2プローブでは 07 v2、 v3プローブでは 07 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたシユードモナス ·エルギノ サであると検出 · 同定することができる。
表 11
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
07 v1 V1 領域 21582444
35 v1 V1 領域 1 140158
31 vl V1 領域 1069940
50 v1 V1 領域 1047192
15 v1 V1 領域 1017726
14 v1 V1 領域 971673
02 v1 V1 領域 955063
13 v1 V1 領域 916576
17 v1 V1 領域 897631
20 v1 V1 領域 872552
07 v2 V2 領域 8962135
36 v2 V2 領域 2597328
04 v2 V2 領域 1886057
29 v2 V2 領域 1688042
1 1 v2 V2 領域 1565487
24 v2 V2 領域 1410365
02 v2 V2 領域 1 142371
19 v2 V2 領域 1000455
41.42 v2 V2 領域 934199
40 v2 V2 領域 814738
07 v3 V3 領域 7269868
40 v3 V3 領域 784278
37 v3 V3 領域 524732
24 v3 V3 領域 488503
13 v3 V3 領域 469384
32 v3 V3 領域 438322
05 v3 V3 領域 408564
45 v3 V3 領域 40461 1
31 3 V3 領域 388594
06— 29一 34 v3 V3 領域 387010 表 12は、 シトロパクター ' フレンディ （微生物 ID 08) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 12の結果から、 シトロパクター ' フレンディは、 プロ ープ 08 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 08 vl、 18一 45 vl、 v2プローブでは 41—42 v2、 08_18— 22— 45 v2、 24 v2、 19 v2、 v3プロ ーブでは 08 v3が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出 されたシトロパクター · フレンディであると検出 · 同定することができる。
表 12
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
08 vl VI 領域 12042247
18.45 v1 V1 領域 8702122
01 v1 V1 領域 1482998
52 v1 V1 領域 1481 121
04 v1 V1 領域 1387682
53 v1 V1 領域 131 1987
36 v1 V1 領域 1234712
42 v1 V1 領域 1 180221
41 v1 V 領域 1 180112
56 v1 V1 領域 1078698
41一 42 v2 V2 領域 24978187
08— 18一 22— 45 v2 V2 領域 20819098
24 v2 V2 領域 16861254
19 v2 V2 領域 12857791
25 v2 V2 領域 71 69295
1 1 2 V2 領域 2316184
40 v2 V2 領域 1966698
36 v2 V2 領域 1305178
10 v2 V2 領域 1201810
13 v2 V2 領域 981693
08 v3 V3 領域 31353656
19 v3 V3 領域 10317886
18—41—42 v3 V3 領域 8251997
25 v3 V3 領域 3888031
10 v3 V3 領域 2857964
22 v3 V3 領域 1232473
45 v3 V3 領域 970905
53—54 v3 V3 領域 905069
02 v3 V3 領域 859252
13 v3 V3 領域 597583 表 13は、 べィヨネラ . パルプーラ （微生物 ID 09) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズ させた結果を示す。表 13の結果から、べィヨネラ 'パルプーラは、プローブ 09 vl、 09 v2、 09 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 09 vl、 v2プローブでは 09 v2、 v3プローブでは 09 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたべィヨネラ ·パルプーラであると検出 ·同 定することができる。
表 13
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
09 v1 V1 領域 1 1262606
39 v1 V1 領域 1525696
38 v1 V1 領域 1386804
31 v1 V1 領域 1279271
52 v1 V1 領域 1273860
36 v1 V1 領域 1201348
27 v1 V1 領域 1 175722
53 v1 V1 領域 1 154955
1 1 v1 V1 領域 1154121
50 v1 V1 領域 1087600
09 v2 V2領域 4576479
36 v2 V2領域 1594541
1 1 v2 V2領域 1457529
07 v2 V2領域 1312259
49 v2 V2領域 1052090
41—42 v2 V2領域 1040564
04 v2 V2領域 1024936
24 v2 V2領域 101 1879
40 v2 V2領域 998230
13 v2 V2領域 963780
09 v3 V3領域 5145378
53—54 v3 V3領域 841703
32 v3 V3領域 770670
1 1 3 V3領域 724183
06-29一 34 v3 V3領域 701800
52一 55 v3 V3領域 692188
31 v3 V3領域 691998
22 v3 V3領域 683726
37 v3 V3領域 679404
13 v3 V3領域 678675 表 14は、 プロビデンシァ ·スチュアーティ （微生物 ID 10) の 16S rRNAの VI 〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイ ブリダィズさせた結果を示す。 表 14の結果から、 プロビデンシァ 'スチユアーテ ィは、 プローブ 10 vl、 10 v2、 10 v3の単独使用により検出、 同定できることが 明らかである。また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 10 vl、 13_vl、 v2プローブでは 10 v2、 v3プローブでは 10 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたプロビデ ンシァ ·スチュアーティであると検出 ·同定することができる。
表 14
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
10 v1 V1 領域 7987691
13 v1 V1 領域 5972673
05 v1 V1 領域 1 197313
22 v1 V1 領域 1076876
07 v1 V1 領域 986987
19—25 v1 V1 領域 907682
20 v1 V1 領域 829768
04 v1 V1 領域 788987
40 v1 V1 領域 787867
01 v1 V1 領域 781687
10 v2 V2 領域 14879362
1 1 v2 V2 領域 2737726
40 v2 V2 領域 2233598
51 v2 V2 領域 1483104
08_18_22.45 v2 V2 領域 947619
19 v2 V2 領域 879936
25 v2 V2 領域 877404
36 v2 V2 領域 839596
41—42 v2 V2 領域 693910
02 v2 V2 領域 693016
10 v3 V3 領域 25810166
45 v3 V3 領域 765859
25 v3 V3 領域 760872
13 v3 V3 領域 755829
19 v3 V3 領域 668770
08 v3 V3 領域 596139
49 v3 V3 領域 538412
18—41—42 v3 V3 領域 514935
05 v3 V3 領域 470843
26 v3 V3 領域 464401 表 15は、 ナイセリア . ゴノローェ （微生物 ID 11) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダイズ させた結果を示す。表 15の結果から、ナイセリア 'ゴノローェは、プローブ 11 v3 の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 V2、 v3プロ ーブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 11 vl、 36 vl、 v2 プローブでは 11 ν2、 36 v2、 v3プローブでは 11 v3が比較的強いシグナル強度を もっため、各領域で高い強度が検出されたナイセリァ ·ゴノローェであると検出 · 同定することができる。
表 15
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
1 1 v1 V1 領域 26218769
36 v1 V1 領域 20106531
04 v1 V1 領域 1 148687
17 v1 V1 領域 1 123692
56 v1 V1 領域 795876
53 v1 V1 領域 709876
54 v1 V1 領域 658782
52 v1 V1 領域 647787
53 v1 V1 領域 638967
18_45 v1 V1 領域 629876
11 v2 V2 領域 30109876
36 v2 V2 領域 23409746
40 v2 V2 領域 3997698
51 v2 V2 領域 2598790
10 v2 V2 領域 1207098
08—18—22—45 v2 V2 領域 1027869
07 v2 V2 領域 1011769
19 v2 V2 領域 908763
04 v2 V2 領域 792340
41_42 v2 V2 領域 748769
1 1 v3 V3 領域 18694137
36 v3 V3 領域 884298
07 v3 V3 領域 390902
39 v3 V3 領域 387087
25 v3 V3 領域 378093
46 v3 V3 領域 375906
53—54 v3 V3 領域 374803
45 v3 V3 領域 370866
15 v3 V3 領域 367255
13 v3 V3 領域 365979 表 16は、 ストレプトコッカス ·ァガラタチェ （微生物 ID 12) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダイズさせた結果を示す。 表 16の結果から、 ス トレプトコッカス ·ァガラ クチェは、 プローブ 12 vl、 12 v2、 12 v3の単独使用により検出、 同定できるこ とが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合 でも、 vlプローブでは 12 vl、 v2プローブでは 12 v2、 v3プローブでは 12 v3が 比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたストレブト コッカス ·ァガラクチェであると検出 ·同定することができる。
表 16
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
12 vl VI 領域 44947674
06 v1 V1 領域 3873241
34 v1 V 領域 2703603
29 v1 V1 領域 2651862
44 v1 V1 領域 2623306
43 v1 V1 領域 2484804
49 v1 V1 領域 1889335
28 v1 V1 領域 1818534
21一 28 v1 V1 領域 1810848
01 1 V1 領域 1490870
12 v2 V2領域 30700769
49 v2 V2領域 6918627
19 v2 V2領域 3579300
06 v2 V2領域 3512292
24 v2 V2領域 3464250
29 v2 V2領域 3287064
07 v2 V2領域 3106369
25 v2 V2領域 3007513
08J 8— 22— 45 v2 V2領域 2691057
34 v2 V2領域 2579428
12 v3 V3領域 53581492
49 v3 V3領域 8548413
43 v3 V3領域 6200222
44 v3 V3領域 3240147
27 v3 V3領域 2352093
39 v3 V3領域 2291647
38 v3 V3領域 2219299
32 v3 V3領域 1785051
21 v3 V3領域 1329525
06— 29_34 v3 V3領域 1211039 表 17は、 モルガネラ ·モルガ- (微生物 ID 13) の 16S rRNAの V1〜V3領域を 含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズさ せた結果を示す。 表 17の結果から、 モルガネラ ·モルガ二は、 プローブ 13 v2、 13 v3 の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 13 vl、10 vl、 v2プローブでは 13 v2、 v3プローブでは 13 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたモルガネラ ·モルガ二であると検出 ·同定 することができる。
表 17
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
13 v1 V1 領域 28976987
10 vl V1 領域 20876298
05 v1 V1 領域 5987986
22 v1 V1 領域 2376987
07 v1 V1 領域 1 187687
20 v1 V1 領域 1176876
17 v1 V1 領域 1089768
35 v1 V1 領域 997987
14 v1 V1 領域 949879
16—46 v1 V1 領域 893987
13 v2 V2領域 20920924
10 v2 V2領域 2053932
25 v2 V2領域 1500548
19 v2 V2領域 1021487
08.18_22_45 v2 V2領域 1001221
41—42 v2 V2領域 902148
36 v2 V2領域 803154
04 v2 V2領域 728878
1 1 v2 V2領域 700703
24 v2 V2領域 699761
13 v3 V3領域 14425456
18.41.42 v3 V3領域 1 160989
10 v3 V3領域 1 102065
19 v3 V3領域 1092044
53一 54 v3 V3領域 856732
05 v3 V3領域 823358
45 v3 V3領域 470306
08 v3 V3領域 454786
50 v3 V3領域 386009
52一 55 v3 V3領域 370832 表 18は、 バクテロイデス ' フラジリス （微生物 ID 14) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 18の結果から、 パクテロイデス ·フラジリスは、 プロ ープ 14 vl、 14 v2、 14 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ一 ブでは 14 vl、 v2プローブでは 14 v2、 v3プローブでは 14 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたパクテロイデス · フラジリ スであると検出 · 同定することができる。
表 18 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
14 v1 V1 領域 26790920
47 v1 V1 領域 1 18741 1
05 v1 V1 領域 527363
36 v1 VI 領域 507633
22 v1 V1 領域 485571
13 v1 V1 領域 452603
50 v1 V1 領域 414464
20 v1 V1 領域 391619
07 v1 V1 領域 383929
37 v1 V1 領域 383808
14 v2 V2 領域 21293063
25 v2 V2 領域 629025
19 v2 V2 領域 606147
07 v2 V2 領域 360263
08—18— 22一 45 v2 V2 領域 289452
15 v2 V2 領域 288112
54 v2 V2 領域 282965
16 v2 V2 領域 281543
41—42 v2 V2 領域 278321
50 v2 V2 領域 277973
14 v3 V3 領域 17838095
37 v3 V3 領域 301773
25 v3 V3 領域 283236
16 v3 V3 領域 279815
51 v3 V3 領域 275369
18—41一 42 v3 V3 領域 268313
50 v3 V3 領域 267447
13 v3 V3 領域 264208
56 v3 V3 領域 263492
08 v3 V3 領域 263058 表 19は、 スタフイロコッカス 'ホミニス （微生物 ID 15) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 19の結果から、スタフイロコッカス'ホミニスは、 プローブ 15 v:！〜 15 v3の単独使用により検出、同定できることができなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 16__46 vl、 15 vl、 17 vl、 v2プローブでは 15 v2、 16 v2、 v3プローブでは 15 v3、 16 v3が 比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたスタフイロ コッカス 'ホミニスもしくはスタフィロコッカス'ヮルネリの存在が示唆された。 表 19 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
16一 46 v1 V1 領域 9636297
15 v1 V1 領域 8688319
17 v1 V1 領域 7822648
20 v1 V1 領域 2690099
35 v1 V1 領域 756910
53 v1 V1 領域 499825
02 v1 V1 領域 451079
07 v1 V1 領域 412397
32 v1 V1 領域 395656
13 v1 V1 領域 377834
15 v2 V2 領域 8187686
16 v2 V2 領域 7896897
35 v2 V2 領域 1897098
20 v2 V2 領域 987973
56 v2 V2 領域 398768
46 v2 ί領域 298767
02 v2 V2 領域 208768
50 v2 V2 領域 201767
07 v2 V2 領域 198769
31 v2 V2 領域 188678
15 v3 V3 領域 12898732
16 v3 V3 領域 1 1866243
35 v3 V3 領域 4776521
20 v3 V3 領域 886287
46 v3 V3 領域 517652
17 v3 V3 領域 418761
04 v3 V3 領域 239766
32 v3 V3 領域 221876
36 v3 V3 領域 198767
37 v3 V3 領域 191852 表 20は、 スタフイロコッカス 'ヮルネリ （微生物 ID 16) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 20の結果から、スタフィ口コッカス 'ヮルネリは、 プローブ 16 vl〜16 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プ ローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 16_46 vl、 15 vl、 17 vl、 v2プローブでは 16 v2、 35 v2、 v3プローブでは 16 v3、 35 v3、 15 v3が比較的 強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたスタフイロコッカ ス · ヮルネリの検出 ·同定が可能であった。
表 20
Figure imgf000043_0001
表 21 は、 スタフイロコッカス 'へモリティカス （微生物 ID 17) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイプリダイズさせた結果を示す。 表 21の結果から、 スタフイロコッカス ·へモ リティカスは、 プローブ 17 vl〜17 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 17 vl、 15 vl、 16_46 vl、 v2プローブでは 17 v2、 15 v2、 v3プローブでは 17 v3、 20 v3が 比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたスタフイロ コッカス ·へモリティカスであると検出 · 同定することができた。
表 21
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
17 v1 V1 領域 9140975
15 v1 V1 領域 9067760
16_46 v1 V1 領域 6804271
20 v1 V1 領域 1905673
50 v1 V1 領域 1064254
02 v1 V1 領域 995094
35 v1 V1 領域 854346
31 v1 V1 領域 835559
13 v1 V1 領域 807708
07 v1 V1 領域 713656
17 v2 V2 領域 2983744
15 v2 V2 領域 2442856
35 v2 V2 領域 857752
46 v2 V2 領域 820022
20 v2 V2 領域 536312
16 v2 V2 領域 337042
03 v2 V2 領域 289615
38.39 v2 V2 領域 237405
19 v2 V2 領域 230281
04 v2 V2 領域 225625
17 v3 V3 領域 4176321
20 v3 V3 領域 2798760
15 v3 V3 領域 1 197281
46 v3 V3 領域 1 119872
35 v3 V3 領域 1022122
16 v3 V3 領域 796758
32 v3 V3 領域 567851
37 v3 V3 領域 3961 12
14 v3 V3 領域 289868
22 v3 V3 領域 217865 表 22は、 ェンテロパクター ' クロァカ （微生物 ID 18) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌク レオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 22の結果から、 ェンテロパクター ·クロァカは、 プロ ーブ 18 vl、 18 v2、 18 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せを総合的に考えた場合、 vlプローブでは 18_45 vl、 v2プロ一 ブでは 08_18_22_45 v2、 41—42 v2、 24 v2、 v3プローブでは 18— 41— 42 v3が比較 的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロバクタ 一 · クロァカであると検出 ·同定することができた。
表 22 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
18一 45 v1 V1 領域 24178609
19—25 v1 V1 領域 10966958
08 v1 V1 領域 3226628
56 v1 V1 領域 2249984
55 v1 V1 領域 1955213
52 v1 V1 領域 1825328
53 v1 V1 領域 1746709
36 v1 V1 領域 1714315
01 v1 V1 領域 1658325
04 v1 V1 領域 1634919
08一 18一 22— 45 v2 V2領域 34967588
41一 42 v2 V2領域 26612959
24 v2 V2領域 22463213
25 v2 V2領域 16145401
19 v2 V2領域 16030188
1 1 v2 V2領域 3678267
40 v2 V2領域 2477658
51 v2 V2領域 2156539
36 v2 V2領域 2094885
13 v2 V2領域 2021289
18一 41一 42 v3 V3領域 58668243
08 v3 V3領域 12496515
05 v3 V3領域 5472813
25 v3 V3領域 5283913
13 v3 V3領域 3228907
45 v3 V3領域 2914331
24 v3 V3領域 2546582
22 v3 V3領域 1839215
53_54 v3 V3領域 1434928
19 v3 V3領域 1238023 表 23は、 ェンテロパクター ·ァエロゲネス （微生物 ID 19) の 16S rRNAの VI 〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイ ブリダィズさせた結果を示す。 表 23の結果から、 ェンテロパクター 'ァエロゲネ スは、 プローブ 19 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブで は 19_25 vl、 v2プローブでは 19 v2、 08_18_22_45 v2、 v3 プローブでは 19 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロ パクター .ァエロゲネスであると検出 ·同定することができる。
表 23
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
19一 25 v1 V1 領域 28812260
18—45 v1 V1 領域 9383804
05 v1 V1 領域 2187459
13 v1 V1 領域 1854417
22 v1 V1 領域 1802189
14 v1 V1 領域 1390057
07 v1 VI 領域 1316013
20 v1 V1 領域 1235029
10 v1 V1 領域 1210090
32 v1 V1 領域 1 158607
19 v2 V2領域 38919738
08一 18— 22—45 v2 V2領域 24987198
25 v2 V2領域 13987281
41—42 v2 V2領域 12981961
24 v2 V2領域 1 1964021
1 1 2 V2領域 1890122
07 v2 V2領域 182541 1
36 v2 V2領域 148761 1
40 v2 V2領域 1298731
13 v2 V2領域 1016732
19 v3 V3領域 53121093
08 v3 V3領域 10985176
45 v3 V3領域 8292437
25 v3 V3領域 2575095
05 v3 V3領域 1383349
13 v3 V3領域 1288969
1 1 v3 V3領域 1268765
22 v3 V3領域 1245965
18一 41一 42 v3 V3領域 1200845
10 v3 V3領域 1 152808 表 24は、 スタフイロコッカス 'ェピデルミディス （微生物 ID 20) の 16S rRNA の V1〜V3領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイプリダイズさせた結果を示す。 表 24の結果から、 スタフイロコッカス 'ェピ デルミディスは、 プローブ 20 vl、 20 v2、 20 v3の単独使用により同定はできな かったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 20 vl、 15 vl、 v2プローブでは 20 v2、 35 v2、 17 v2、 v3プローブでは 20 v3、 46 v3、 17 v3、 16 v3、 15 v3が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高 い強度が検出されたスタフイロコッカス 'ェピデルミディスであると検出 · 同定 することができる。
表 24
ブローン ID 領域 発光ンクナル ¾i度
20 v1 V1 領域 5564151
15 v1 V1 領域 4297641
13 v1 V1 領域 2298763
50 v1 V1 領域 227651 1
17 v1 V1 領域 219261 1
16—46 v1 V1 領域 2017652
14 v1 V1 領域 201251 1
31 v1 V1 領域 1918761
02 v1 V1 領域 1876181
32 v1 V1 領域 1586519
20 v2 V2領域 371 1401
35 v2 V2領域 3544303
17 v2 V2領域 2252854
16 v2 V2領域 1447884
46 v2 V2領域 1 188084
15 v2 V2領域 1179760
56 v2 V2領域 750663
04 v2 V2領域 587370
32 v2 V2領域 554422
52 v2 V2領域 550275
20 v3 V3領域 8696647
46 v3 V3領域 5234071
17 v3 V3領域 5181402
16 v3 V3領域 4043267
15 v3 V3領域 3725666
35 v3 V3領域 221 1902
37 v3 V3 領域 1747232
32 v3 V3領域 1455263
36 v3 V3領域 859988
14 v3 V3領域 759021 表 25は、 ストレプトコッカス ' コンステラータス （微生物 ID 21) の 16S rRNA の領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリ ダイズさせた結果を示す。 表 25の結果から、 ストレプトコッカス ·コンステラー タスは、プローブ 21 v3の単独使用により検出、同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブで は 21_30 vl、 v2プローブでは 30 v2、 21 v2、 v3プローブでは 21 v3が比較的強 いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレプトコッカ ス . コンステラータスであると検出 ·同定することができる。
表 25
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
21 30 v1 V1 領域 13493205
49 v1 V1 領域 626462
14 v1 V1 領域 472249
28 v1 V1 領域 406692
09 v1 V1 領域 372127
23 v1 V1 領域 334462
04 v1 VI Ti良域 281259
3g vl VI 域 264440
33 v1 V1 領域 261432
44 v1 V1 領域 231431
30 v2 V2 領域 40001310
21 2 V2 領域 37777213
36 v2 V2 領域 442244
13 v2 V2 領域 435228
04 v2 V2 領域 434745
25 v2 V2 領域 405090
1 1 2 V2 領域 389678
19 v2 V2 領域 386999
41一 42 v2 V2 領域 365454
23 v2 V2 領域 362880
21 3 V3 領域 48491419
06一 29一 34 v3 V3 領域 16236812
28 v3 V3 領域 10188066
23—30 v3 V3 領域 1704489
32 v3 V3 領域 501471
33 v3 V3 領域 2551 13
49 v3 V3 領域 240367
04 v3 V3 領域 221273
12 v3 V3 領域 216686
44 v3 V3 領域 215405 表 26は、 セラチア · マルセッセンス (微生物 ID 22) の 16S rRNAの V1〜V3領 域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダイ ズさせた結果を示す。 表 26の結果から、 セラチア 'マルセッセンスは、 プローブ 22 vl、 22 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 22 vl、 v2プローブでは 08_18_22— 45 v2、 v3プローブでは 22 v3が比較的強いシグナル 強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたセラチア '
ると検出 .同定することができる。
表 26 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
22 v1 V1 領域 2799986
19_25 v1 V1 領域 645042
05 v1 V1 領域 464262
14 v1 V1 領域 403849
13 v1 V1 領域 348639
10 v1 V1 領域 340365
08 v1 V1 領域 334770
56 v1 V1 領域 329794
07 v1 V1 領域 319945
20 v1 V1 領域 301988
08—18—22—45 v2 V2 領域 8881924
41一 42 v2 V2 領域 361 1 108
19 v2 V2 領域 3501442
24 v2 V2 領域 3388138
25 v2 V2 領域 1364269
36 v2 V2 領域 440534
1 1 2 V2 領域 437523
10 v2 V2 領域 351575
07 v2 V2 領域 333596
13 v2 V2 領域 330089
22 v3 V3 領域 4336423
25 v3 V3 領域 552973
19 v3 V3 領域 376449
1 8— 41一 42 v3 V3 領域 370767
05 v3 V3 領域 359246
08 v3 V3 領域 317135
53一 54 v3 V3 領域 251368
40 v3 V3 領域 241465
02 v3 V3 領域 183823
13 v3 V3 領域 156441 表 27は、 ス トレプトコッカス ' アンギノサス （微生物 ID 23) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダイズさせた結果を示す。 表 27の結果から、 ストレプトコッカス ·アンギ ノサスは、 プローブ 23 vl、 23 v2の単独使用により検出、 同定できることが明ら かである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 23 vl、 v2プローブでは 23 v2、 v3プローブでは 23—30 v3が比較的 強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカ ス · アンギノサスであると検出 · 同定することができる。
表 27
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
23 v1 V1 領域 13621920
21_30 v1 V1 領域 1429074
12 v1 V1 領域 351954
54 v1 V1 領域 322529
06 v1 V1 領域 313548
29 v1 V1 領域 285465
56 v1 V1 領域 279073
52 v1 V1 領域 277580
55 v1 V1 領域 270510
53 v1 V1 領域 265961
23 v2 V2 領域 17801418
08—18一 22—45 v2 V2 領域 939544
41一 42 v2 V2 領域 853515
19 v2 V2 領域 767853
36 V2 領域 678990
25 v2 V2 領域 661394
24 v2 V2 領域 660099
40 v2 V2 領域 629656
13 v2 V2 領域 614760
1 1 v2 V2領域 463405
23—30 v3 V3 領域 34042714
06— 29一 34 v3 V3 領域 2910169
21 v3 V3 領域 2028456
28 v3 V3 領域 1845357
32 v3 V3 領域 1 1 17260
25 v3 V3 領域 522676
37 v3 V3 領域 364237
33 v3 V3 領域 281238
09 v3 V3 領域 274590
43 v3 V3 領域 261961 表 28は、 ェシエリシァ · コリ （微生物 ID 24) の 16S rRNAの V1〜V3領域を含 む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダィズさせ た結果を示す。 表 28の結果から、 ェシェリシァ 'コリは、 プローブ 24 v3の単独 使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの 組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 24 vl、 41 vl、 v2プロ一 ブでは 08— 18— 22_45 v2、 24 v2、 41—42 v2、 v3プローブでは 24 v3が比較的強い シグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェシェリシァ · コリで あると検出 ·同定することができる。
表 28
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
24 v1 V1 領域 17987542
41 v1 V1 領域 15887613
42 v1 V1 領域 4765198
03 v1 V1 領域 2191683
01 v1 V1 領域 1486217
08 v1 V1 領域 13291 1 1
56 v1 V1 領域 991762
52 v1 V1 領域 978628
55 v1 V1 領域 987780
53 v1 V1 領域 926175
08— 18— 22一 45 v2 V2領域 982791 1
24 v2 V2領域 9218763
41—42 v2 V2領域 4907915
19 v2 V2領域 3896124
25 v2 V2領域 1778622
1 1 v2 V2領域 598792
36 v2 V2領域 597517
10 v2 V2領域 527651
13 v2 V2領域 486981
40 v2 V2領域 479617
24 v3 V3領域 4646334
05 v3 V3領域 676154
25 v3 V3領域 614952
18一 41一 42 v3 V3領域 587388
53_54 v3 V3領域 506098
07 v3 V3領域 475754
32 v3 V3領域 435473
45 v3 V3領域 409346
13 v3 V3領域 332258
19 v3 V3領域 276499 表 29は、 クレブセラ 'ニューモニエ （微生物 ID 25) の 16S rRNAの V1〜V3領 域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダイ ズさせた結果を示す。 表 29の結果から、 クレプセラ 'ニューモニエは、 プローブ 25 vl、 25 v2、 25 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プロ ーブの糸且合せを総合的に判断すると、 vl プローブでは 19_25 vl、 18_45 vl、 v2 プローブでは 25 v2、 19 v2、 v3プローブでは 25 v3、 45 v3が比較的強いシグナ ル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたクレブセラ 'ニューモニエで あると検出 · 同定することができる。
表 29 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
19—25 v1 V1 領域 44899827
18—45 v1 V1 領域 22296940
13 v1 V1 領域 5066743
05 v1 V1 領域 4572823
22 v1 V1 領域 3932829
10 v1 V1 領域 3095199
14 v1 V1 領域 28641 13
07 v1 V1 領域 2658302
20 v1 V1 領域 2612310
32 v1 V1 領域 2529941
25 v2 V2 領域 56236707
19 v2 V2 領域 52302190
08一 18_22—45 v2 V2 領域 22930464
41一 42 v2 V2 領域 20291404
24 v2 V2 領域 15891725
07 v2 V2 領域 3433724
11 2 V2 領域 3330589
13 v2 V2 領域 2995258
40 v2 V2 領域 2330892
36 v2 V2 領域 2213813
25 v3 V3 領域 4457641 1
45 v3 V3 領域 27662864
19 v3 V3 領域 13943196
18_41_42 v3 V3 領域 6416896
05 v3 V3 領域 6387121
08 v3 V3 領域 4853371
24 v3 V3 領域 2016550
10 v3 V3 領域 1424743
13 v3 V3 領域 1402032
53—54 v3 V3 領域 1042800 表 30は、 ェンテロコッカス · フエカリス (微生物 ID 26) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 30の結果から、ェンテロコッカス'フエカリスは、 プローブ 26 vl、 26 v2、 26 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らか である。 また、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 26 vl、 v2プローブでは 26 v2、 v3プローブでは 26 v3が比較的強 いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロコッカス · フエカリスであると検出 ·同定することができる。
表 30 プローブ 1D 領域 発光シグナル強度
26 v1 V1 領域 6245244
50 v1 V1 領域 1519767
31 v1 V1 領域 997402
03 v1 V1 領域 971075
08 v1 V1 領域 749485
27 v1 V1 領域 743405
01 v1 V1 領域 683398
41 v1 V1 領域 630838
07 v1 V1 領域 627885
13 v1 V1 領域 616087
26 v2 V2領域 6899137
41一 42 v2 V2領域 575015
08— 18— 22一 45 v2 V2領域 494906
19 v2 V2 領域 492700
24 v2 V2領域 427571
36 v2 V2領域 415871
40 v2 V2 領域 410203
07 v2 V2領域 381812
04 v2 V2領域 374505
25 v2 V2領域 358563
26 v3 V3領域 4672443
31 v3 V3 領域 439560
27 v3 V3 領域 369990
39 v3 V3領域 337964
32 v3 V3 領域 330311
38 v3 V3 領域 317024
37 v3 V3領域 31 1826
13 v3 V3 領域 245796
10 v3 V3 領域 213954
12 v3 V3 領域 187308 表 31は、 ェンテロコッカス ' フエシゥム （微生物 ID 27) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 31の結果から、ェンテロコッカス ·フエシゥムは、 プローブ 27 vl、 27 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロープで は 27 vl、 v2プローブでは 27 v2、 v3プローブでは 27 v3、 39 v3が比較的強いシ グナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロコッカス . フエ シゥムであると検出 ·同定することができる。
表 31
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
27 v1 V1 領域 9778728
39 v1 V1 領域 3061690
56 v1 V1 領域 2755188
53 v1 V1 領域 2721 149
54 v1 V1 領域 2565777
38 v1 V1 領域 2549340
26 v1 V1 領域 2330722
52 v1 V1 領域 2263885
55 v1 V1 領域 2049533
09 v1 V1 領域 969809
27 v2 V2 領域 9929701
V2 領域 1671 138
38_39 v2 V2 領域 331665
26 v2 V2 領域 312678
07 v2 V2 領域 278453
16 v2 V2 領域 260282
04 v2 V2 領域 239858
15 v2 V2 領域 238161
24 v2 V2 領域 235895
19 v2 V2 領域 223883
27 v3 V3 領域 8639767
39 v3 V3 領域 7896327
38 v3 V3 領域 237681 1
31 v3 V3 領域 1098762
44 v3 V3 領域 675861
26 v3 V3 領域 589761
19 v3 V3 領域 318761
32 v3 V3 領域 307681
05 v3 V3 領域 297987
08 v3 V3 領域 278768 表 32は、 ス トレプトコッカス · サンダイス （微生物 ID 28) の 16S rRNAの VI 〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイ プリダイズさせた結果を示す。 表 32の結果から、 ストレプトコッカス ·サングイ スは、 プローブ 28 vl、 28 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかで ある。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ ーブで 28 vl、 v2プローブでは 28 v2、 v3プローブでは 28 v3、 06— 29— 34 v3力 S比 較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレプトコ ッカス 'サンダイスであると検出 ·同定することができる。
表 32 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
28 v1 V1 領域 16338885
06 v1 V1 領域 1 181797
29 v1 V1 領域 730573
21—30 v1 V1 領域 483231
34 vl V1 領域 472055
43 v1 V1 領域 459749
44 v1 V1 領域 404106
12 v1 V1 領域 381948
49 v1 V1 領域 376569
09 v1 V1 領域 351832
28 v2 V2領域 12909216
24 v2 V2領域 503344
36 v2 V2領域 499619
41一 42 v2 V2領域 431345
13 v2 V2領域 424502
19 v2 V2領域 417881
25 v2 V2領域 403362
08_18.22_45 v2 V2領域 395035
04 v2 V2領域 394017
1 1 v2 V2領域 374090
28 v3 V3領域 45542140
06一 29—34 v3 V3領域 351 14448
21 3 V3領域 15435778
23—30 v3 V3領域 1521965
32 v3 V3領域 739219
24 v3 V3領域 465434
49 v3 V3領域 450890
43 v3 V3領域 427491
44 v3 V3領域 396805
01 v3 V3領域 355158 表 33は、 ス トレプトコッカス ' ミテイス （微生物 ID 29) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 33の結果から、ス トレプトコッカス 'ミテイスは、 プローブ 29 vl、 29 v2、 29 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 29 vl、 28 vl、 v2 プローブでは 29 v2、 06 v2、 v3プローブでは 06— 29— 34 v3、 28 v3が比較的強い シグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス · ミテイスであると検出 '同定することができる。
表 33
プローブ ID 領域 発光ンクナル強度
29 v1 V1 領域 38198721
28 v1 V1 領域 24682981
06 v1 V1 領域 5817621
21一 30 v1 V1 領域 2119781
34 v1 V1 領域 1087983
12 v1 V1 領域 909878
49 v1 V1 領域 687611
44 v1 V1 領域 576586
43 v1 V1 領域 467651
27 v1 V1 領域 416581
29 v2 V2 領域 46472243
06 v2 V2 領域 24406385
34 v2 V2 領域 12962338
08—18— 22— 45 v2 V2 領域 902177
12 v2 V2 領域 866635
19 v2 V2 領域 849684
30 v2 V2 領域 826972
25 v2 V2 領域 743509
24 v2 V2 領域 736106
36 v2 V2 領域 669629
06— 29_34 v3 V3 領域 43974721
28 v3 V3 領域 28728883
21 v3 V3 領域 11488220
23一 30 v3 V3 領域 3778464
32 v3 V3 領域 1193519
47 v3 V3 領域 600238
12 v3 V3 領域 288689
43 v3 V3 領域 258797
49 v3 V3 領域 253604
08 v3 V3 領域 237332 表 34は、ストレプトコッカス 'インターメディウス （微生物 ID 30) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダィズさせた結果を示す。 表 34の結果から、 ス トレプトコッカス .イン ターメディウスは、 プローブ 30 vl、 30 v2、 30 v3の単独使用により同定はでき なかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブで は 21—30 vl、 v2プローブでは 30 v2、 21 v2、 v3プローブでは 23_30 v3が比較的 強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカ ス 'インターメディウスであると検出 ·同定することができる。
表 34
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
21一 30 v1 V1 領域 1744391 1
23 v1 V1 領域 430260
06 v1 V1 領域 417406
09 v1 V1 領域 41 1 180
28 v1 V1 領域 357081
29 v1 V1 領域 333449
43 v1 V1 領域 321388
49 v1 V1 領域 295344
44 v1 V1 領域 290890
39 v1 V1 領域 270773
30 v2 V2領域 28660345
21 v2 V2領域 26065824
36 v2 V2領域 564178
24 v2 V2領域 552656
25 v2 V2領域 542309
19 v2 V2領域 525497
08—18—22—45 v2 V2領域 510266
04 v2 V2領域 509800
41—42 v2 V2領域 498506
49 v2 V2領域 473932
23—30 v3 V3領域 26887538
06—29—34 v3 V3領域 4386868
21 v3 V3領域 2120637
28 v3 V3領域 209741 1
32 v3 V3領域 663634
25 v3 V3領域 630821
37 v3 V3領域 296965
43 v3 V3領域 243304
49 v3 V3領域 233886
27 v3 V3領域 193883 表 35は、 リステリア 'モノサイトゲネス （微生物 ID 31) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 35の結果から、リステリア'モノサイトゲネスは、 プローブ 31 vl、 31 v2、 31 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らか である。 また、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 31 vl、 v2プローブでは 31 v2、 v3プローブでは 31 v3が比較的強 いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたリステリア ·モノサ ィ トゲネスであると検出 ·同定することができる。
表 35 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
31 v1 V1 領域 10579601
50 v1 V1 領域 2532393
55 v1 V1 領域 984441
56 v1 V1 領域 891055
53 v1 V1 領域 853211
52 v1 V1 領域 828320
02 v1 V1 領域 776127
01 v1 V1 領域 726470
13 v1 V1 領域 719011
07 v1 V1 領域 691938
31 v2 V2領域 10336138
06 v2 V2領域 6911 13
52 v2 V2領域 31 1987
56 v2 V2領域 280315
55 v2 V2領域 269230
24 v2 V2領域 254150
14 v2 V2領域 251251
51 v2 V2領域 250609
28 v2 V2領域 247383
49 v2 V2領域 243528
31 v3 V3領域 7713541
27 v3 V3領域 807508
39 v3 V3領域 606205
38 v3 V3領域 519822
32 v3 V3領域 367659
37 v3 V3領域 338211
26 v3 V3領域 275414
53—54 v3 V3領域 249554
46 v3 V3領域 248050
15 v3 V3領域 245416 表 36 は、 クロストリジゥム ·パーフリンゲンス （微生物 ID 32) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダイズさせた結果を示す。 表 36の結果から、 クロストリジゥム ·パーフ リンゲンスは、 プローブ 32 vl、 32 v2、 32 v3の単独使用により検出、 同定でき ることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した 場合でも、 vlプローブでは 32 vl、 v2プローブでは 32 v2、 v3プローブでは 32 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたクロスト リジゥム .パーフリンゲンスであると検出 · 同定することができる。
表 36
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
32 v1 V1 領域 13777878
02 v1 V1 領域 6313849
50 v1 V1 領域 4552246
07 v1 V1 領域 3595672
13 v1 V1 領域 3360097
20 v1 V1 領域 2960479
17 v1 V1 領域 2794853
16一 46 v1 V1 領域 2575870
15 v1 V1 領域 2569927
22 v1 V1 領域 2336865
32 v2 V2領域 19353147
13 v2 V2領域 816957
41—42 v2 V2領域 757723
25 v2 V2領域 716127
08—18—22-45 v2 V2領域 690633
24 v2 V2領域 644953
19 v2 V2領域 635561
35 v2 V2領域 585284
03 v2 V2領域 531673
26 v2 V2領域 525063
32 v3 V3領域 16219819
35 v3 V3領域 650373
37 v3 V3領域 565610
18_41— 42 v3 V3領域 Ί 500354
16 v3 V3領域 497630
05 v3 V3領域 496913
15 v3 V3領域 496064
08 v3 V3領域 487976
17 v3 V3領域 484020
20 v3 V3領域 476998 表 37は、 コリネバクテリゥム · アクアチウム (微生物 ID 33) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダィズさせた結果を示す。 表 37の結果から、 コリネパクテリゥム · ァク ァチウムは、 プローブ 33 vl、 33 v2、 33 v3の単独使用により検出、 同定できる ことが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場 合でも、 vlプローブでは 33 vl、 v2プローブでは 33 v2、 v3プローブでは 33 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたコリネバ クテリ ウム ·アクアチウムであると検出 ·同定することができる。
表 37 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
33 v1 V1 領域 28909022
09 v1 V1 領域 2068941
56 v1 V1 領域 1810656
54 v1 V1 領域 1617630
27 v1 V1 領域 1480859
55 v1 V1 領域 1439777
50 v1 V1 領域 1409621
26 v1 V1 領域 1387770
53 v1 VI 領域 1291271
39 v1 V1 領域 1 138148
33 v2 V2 領域 25700462
24 v2 V2 領域 457898
49 v2 V2 領域 456921
54 v2 V2 領域 428638
01 v2 V2 領域 41 1464
36 v2 V2 領域 400441
04 v2 V2 領域 393293
53 v2 V2 領域 390216
17 v2 V2 領域 384017
51 v2 V2 領域 382889
33 v3 V3 領域 28292530
53_54 v3 V3 領域 5160490
36 v3 V3 領域 674367
09 v3 V3 領域 446040
14 v3 V3 領域 412684
12 v3 V3 領域 404894
1 1 v3 V3 領域 400830
45 v3 V3 領域 400482
51 v3 V3 領域 395914
37 v3 V3 領域 386918 表 38は、 ス トレプトコッカス . オラリス （微生物 ID 34) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 38の結果から、ストレプトコッカス ·オラリスは、 プローブ 34 vlの単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、v2、v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 34 vl、 v2プローブでは 34 v2、 29 v2、 v3プローブでは 06_29— 34 v3、 28 v3が比較的強 いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレプトコッカ ス ·オラリスであると検出 · 同定することができる。
表 38
Figure imgf000061_0001
表 39は、 スタフイロコッカス ' ァウレウス （微生物 ID 35) の 16S rRNAの VI 〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイ プリダイズさせた結果を示す。 表 39の結果から、 スタフィロコッカス ·ァウレゥ スは、 プローブ 35 vlの単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブで は 35 vl、 v2プローブでは 35 v2、 20 v2、 v3プローブでは 35 v3、 16 v3が比較 的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたスタフィロコッ カス ·ァウレウスであると検出 '同定することができる。
表 39 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
35 v1 V1 領域 2697296
13 v1 V1 領域 474763
20 v1 V1 領域 454987
10 v1 V1 領域 428401
17 v1 V1 領域 426633
15 v1 V1 領域 413146
16.46 v1 V1 領域 405001
32 v1 V1 領域 404788
07 v1 V1 領域 401440
31 v1 V1 領域 399650
35 v2 V2 領域 7879871
20 v2 V2 領域 5687671
46 v2 V2 領域 387611
17 v2 V2 領域 381876
15 v2 V2 領域 381541
16 v2 V2 領域 378876
38—39 v2 V2 領域 326987
19 v2 V2 領域 329887
49 v2 V2 領域 318761
34 v2 V2 領域 309919
35 v3 V3 領域 19330782
16 v3 V3 領域 14291750
15 v3 V3 領域 5158030
17 v3 V3 領域 2649605
20 v3 V3 領域 2643488
46 v3 V3 領域 2466902
04 v3 V3 領域 519443
37 v3 V3 領域 457426
32 v3 V3 領域 445579
24 v3 V3 領域 419666 表 40は、 ナイセリァ · メニンギチディス （微生物 ID 36) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 40の結果から、ナイセリア'メニンギチデイスは、 プローブ 36 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、v2、v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 36 vl、 11 vl、 v2プローブでは 36 v2、 11 v2、 v3プローブでは 36 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたナイセリア · メニンギチデ イスであると検出 ·同定することができる。
表 40 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
36 v1 V1 領域 32691 1 13
1 1 vl VI 領域 17218976
04 v1 V1 領域 47651 1 1
50 vl VI 領域 2786176
08 v1 V1 領域 1567121
09 v1 V1 領域 1387629
52 v1 V1 領域 1018762
53 v1 V1 領域 908761
54 v1 V1 領域 892145
56 v1 V1 領域 882165
36 v2 V2領域 35287615
1 1 v2 V2領域 188761 1 1
07 v2 V2領域 5876819
04 v2 V2領域 48761 12
40 v2 V2領域 308761 1
02 v2 V2領域 2898798
24 v2 V2領域 2787687
41_42 v2 V2領域 2287657
08— 18一 22— 45 v2 V2領域 2098791
19 v2 V2領域 200761 1
36 v3 V3領域 24445975
1 1 3 V3領域 1785303
49 v3 V3領域 685013
38 v3 V3領域 640621
53—54 v3 V3領域 615719
04 v3 V3領域 567466
48 v3 V3領域 470694
33 v3 V3領域 420137
28 v3 V3領域 272902
52—55 v3 V3領域 270469 表 41は、 カンピロバクタ一'フエタス （微生物 ID 37) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 41の結果から、 カンピロバクタ一 ·フエタスは、 プロ ーブ 37 vl、 37 v2、 37 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ一 ブでは 37 vl、 v2プローブでは 37 v2、 v3プローブでは 37 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたカンピロバクタ一 · フエタ スであると検出 ·同定することができる。
表 41 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
37 v1 V1 領域 28176245
50 v1 V1 領域 6876182
09 v1 V1 領域 3876141
39 v1 V1 領域 3201876
38 v1 V1 領域 301641 1
53 v1 V1 領域 2787635
55 v1 V1 領域 2516252
31 v1 V1 領域 2387613
27 v1 V1 領域 2298713
52 v1 V1 領域 2017824
37 v2 V2領域 38923509
35 v2 V2領域 352512
16 v2 V2領域 341168
15 v2 V2領域 333426
03 v2 V2領域 330858
26 v2 V2領域 326179
04 v2 V2領域 317611
17 v2 V2領域 308803
38一 39 v2 V2領域 307528
05 v2 V2領域 306582
37 v3 V3領域 32361007
05 v3 V3領域 620284
33 v3 V3領域 556400
32 v3 V3領域 444124
45 v3 V3領域 344770
13 v3 V3領域 341006
11 v3 V3領域 331067
48 v3 V3領域 323257
17 v3 V3 領域 322958
35 v3 V3領域 319217 表 42は、 ェンテロコッカス 'ガリナルム （微生物 ID 38) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 42の結果から、ェンテロコッカス'ガリナルムは、 プローブ 38 vl、 38 v2、 38 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 38 vl、 39 vl、 v2 プローブでは 38— 39 v2、 v3プローブでは 38 v3、 39 v3が比較的強いシグナル強 度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロコッカス ·ガリナルムも しくはェンテロコッカス ·カセリフラバスの存在が検出可能であった。
表 42
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
38 v1 V1 領域 6517750
39 v1 V1 領域 4901402
27 v1 V1 領域 789749
55 v1 V1 領域 676041
53 v1 V1 領域 672402
56 v1 V1 領域 668186
52 v1 V1 領域 665378
54 v1 V1 領域 628486
50 v1 V1 領域 586201
09 v1 V1 領域 540023
38_39 v2 V2領域 4946381
27 v2 V2領域 324809
46 v2 V2領域 283923
04 v2 V2領域 266692
07 v2 V2領域 243399
26 v2 V2領域 237094
36 v2 V2領域 225802
35 v2 V2領域 220052
24 v2 V2領域 199337
16 v2 V2領域 198654
38 v3 V3領域 2487517
39 v3 V3領域 1886944
27 v3 V3領域 678538
31 v3 V3領域 491787
28 v3 V3領域 348711
06_29.34 v3 V3領域 298851
32 v3 V3領域 281756
37 v3 V3領域 278761
26 v3 V3領域 215761
23_30 v3 V3領域 198725 表 43は、 ェンテロコッカス ' 力セリフラバス （微生物 ID 39) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハ イブリダイズさせた結果を示す。 表 43の結果から、 ェンテロコッカス ·力セリフ ラパスは、 プローブ 39 vl、 39 v2、 39 v3の単独使用により同定はできなかった が、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプロープでは 39 vl、 38 vl、 v2プローブでは 38_39 v2、 v3プローブでは 39 v3、 38 v3、 27 v3が比較 的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたェンテロコッカ ス 'カセリフラバスもしくはェンテロコッカス'ガリナルムの存在が検出できる。 表 43
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
39 v1 V1 領域 10173097
38 v1 V1 領域 9707541
27 v1 V1 領域 1919310
26 v1 V1 領域 1016063
52 v1 V1 領域 905910
53 v1 V1 領域 841171
56 v1 V1 領域 801008
55 v1 V1 領域 754869
54 v1 V1 領域 746869
09 v1 V1 領域 729929
38—39 v2 V2領域 10097683
27 v2 V2領域 308179
04 v2 V2領域 288203
33 v2 V2領域 253786
07 v2 V2領域 243847
36 v2 V2領域 232551
28 v2 V2領域 225088
06 v2 V2領域 222919
14 v2 V2領域 222342
46 v2 V2領域 221837
39 v3 V3領域 761 1583
38 v3 V3領域 5728271
27 v3 V3領域 2777612
31 3 V3領域 61 1879
28 v3 V3領域 528693
44 v3 V3領域 329722
32 v3 V3領域 294821
23一 30 v3 V3領域 281214
37 v3 V3領域 277122
21 3 V3領域 223212 表 44は、 ェ口モナス ·ハイ ドロフイラ （微生物 ID 40) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 44の結果から、 エロモナス ·ハイ ドロフイラは、 プロ ープ 40 vl、 40 v2、 40 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ一 ブでは 40 vl、 v2プローブでは 40 v2、 v3プローブでは 40 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたエロモナス 'ハイ ドロフィ ラであると検出 ·同定することができる。
表 44 プロ一ブ ID 領域 発光シグナル強度
40 v1 V1 領域 8192676
14 v1 V1 領域 1257526
13 v1 V1 領域 1086045
32 v1 V1 領域 943819
02 v1 V1 領域 840592
22 v1 VI 領域 715704
10 v1 V1 領域 707947
07 v1 V1 領域 696602
50 v1 V1 領域 615060
36 v1 V1 領域 560709
40 v2 V2 領域 204731 1 1
1 1 v2 V2 領域 5040956
04 v2 V2 領域 4658427
36 v2 V2 領域 3038991
10 v2 V2 領域 156251 1
51 Ml V2 領域 1443971
41—42 v2 V2 領域 1240287
25 v2 V2 領域 1048912
07 v2 V2 領域 1011046
19 v2 V2 領域 921406
40 v3 V3 領域 17741881
53—54 v3 V3 領域 878575
22 v3 V3 領域 788368
08 v3 V3 領域 361891
19 v3 V3 領域 265936
25 v3 V3 領域 260828
18—41—42 v3 V3 領域 227853
46 v3 V3 領域 222916
07 v3 V3 領域 220238
05 v3 V3 領域 217679 表 45は、 サルモネラ .パラチフィ A (微生物 ID 41) の 16S rRNAの V1〜V3領 域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダイ ズさせた結果を示す。 表 45の結果から、 サルモネラ ·パラチフィ Aは、 プローブ 41 vl、 41 v2、 41 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プロ ーブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 41 vl、 42 vl、 v2プロ一 ブでは 41—42 v2、 08_18_22— 45_v2、 v3プローブでは 18_41_42 v3が比較的強いシ グナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたサルモネラ '
Aもしくはサルモネラ ·チフィの存在が検出可能であった。
表 45
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
41 v1 V1 領域 1 1027871
42 v1 V1 領域 999 /321
、 百
01 v1 V1 領域 1698719
56 v1 V1 領域 1349871
39 v1 V1 領域 1321897
55 v1 V1 領域 1299873
52 v1 V1 領域 1288176
03 v1 V1 領域 1284125
53 v1 V1 領域 1187664
41_42 v2 V2 領域 14866236
08— 18一 22— 45 v2 V2 領域 1 1 103694
24 v2 V2 領域 7643623
19 v2 V2 領域 6381 197
25 v2 V2 領域 4083972
1 1 v2 V2 領域 1708635
36 v2 V2 領域 1 151729
40 v2 V2 領域 987650
13 v2 V2 領域 861170
07 v2 V2 領域 8381 10
18—41—42 v3 V3 領域 44477558
08 v3 V3 領域 3883445
25 v3 V3 領域 2592177
13 v3 V3 領域 2196040
05 v3 V3 領域 2070933
24 v3 V3 領域 1238550
45 v3 V3 領域 1 144361
22 v3 V3 領域 1019021
19 v3 V3 領域 788897
10 v3 V3 領域 687740 表 46は、 サルモネラ 'チフィ （微生物 ID 42) 'の 16S rRNAの V1〜V3領域を含 む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダィズさせ た結果を示す。表 46の結果から、サルモネラ ·チフィは、プローブ 42 vl、 42 v2、 42 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで 総合的に判断すると、 vlプローブでは 41 vl、 42 vl、 v2プローブでは 41_42 v2、 08_18_22_45 v2、 v3プローブでは 18_41— 42 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたサルモネラ ·チフィもしくはサルモネラ · パラチフィ Aの存在が検出可能であった。
表 46
プロ一ブ ID 領域 発光シグナル強度
41 v1 V1 領域 19765781
42 v1 V1 領域 18519837
26 v1 V1 領域 5918762
24 v1 V1 領域 4891983
05 v1 V1 領域 4151873
56 v1 V1 領域 3924512
55 v1 V1 領域 3518762
52 v1 V1 領域 3401 191
53 v1 V1 領域 2998712
01 1 V1 領域 2122987
41_42 v2 V2領域 20917542
08— 18—22一 45 v2 V2領域 16851388
24 v2 V2領域 7913337
1 9 v2 V2領域 5278967
25 v2 V2領域 3466704
1 1 v2 V2領域 2547883
36 v2 V2領域 1767852
40 v2 V2領域 1730755
02 v2 V2領域 1500814
07 v2 V2領域 1405621
18一 41一 42 v3 V3領域 21554387
05 v3 V3領域 4929756
08 v3 V3領域 3710485
25 v3 V3領域 3325205
13 v3 V3領域 2317940
45 v3 V3領域 1974662
24 v3 V3領域 1796852
19 v3 V3領域 1366178
22 v3 V3領域 1361857
53—54 v3 V3領域 1049738 表 47は、 ストレプトコッカス 'エタイシミリス （微生物 ID 43) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダイズさせた結果を示す。 表 4ァの結果から、 ストレプトコッカス .エタ イシミ リスは、 プローブ 43 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らか である。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブ では 43 vl、 49 vl、 44 vl、 v2プローブでは 43 v2、 v3プローブでは 43 v3、 49 v3 が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレプ トコッカス .ェクイシミリスであると検出 ·同定することができる。
表 47
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
43 v1 VI 領域 17876978
49 v1 V1 領域 10987138
44 v1 V1 領域 7918732
07 v1 V1 領域 61 7263
21—30 v1 V1 領域 601987
28 v1 V1 領域 578186
06 v1 V1 領域 558761
12 v1 V1 領域 497867
09 vl VI 領域 481649
29 v1 V1 領域 463278
43 v2 V2 領域 16515111
44 v2 V2 領域 1 1 14371
24 v2 V2 領域 552425
25 v2 V2 領域 528801
19 v2 V2 領域 4961 15
36 v2 V2 領域 434616
08一 18— 22—45 v2 V2 領域 432575
13 v2 V2領域 432559
04 v2 V2 領域 416492
49 v2 V2 領域 407134
43 v3 V3 領域 43685987
49 v3 V3 領域 27404940
45 v3 V3 領域 1861661
12 v3 V3 領域 1662885
44 v3 V3 領域 1586160
32 v3 V3 領域 1 171556
28 v3 V3 領域 433031
06-29一 34 v3 V3 領域 290481
23.30 v3 V3 領域 286664
21 3 V3 領域 272138 表 48は、 ス トレプトコッカス · 力ニス （微生物 ID 44) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 48 の結果から、 ストレプトコッカス ·力ニスは、 プロ ーブ 44 vl、 44 v2、 44 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断すると、 vlプローブでは 44 vl、 v2プローブでは 44 v2、 v3プローブでは 44 v3が比較的強いシグナノレ強 度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたストレプトコッカス ·力ニスであ ると検出 ·同定することができる。
表 48
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
44 v1 V1 領域 35094631
43 v1 V1 領域 2427565
47 v1 V1 領域 1943075
49 v1 V1 領域 1355586
52 v1 V1 領域 1229788
28 v1 V1 領域 1 151650
53 v1 V1 領域 1026335
21一 30 v1 V1 領域 1010370
12 v1 V1 領域 993928
39 v1 V1 領域 985182
44 v2 V2領域 23079672
25 v2 V2領域 1627031
24 v2 V2領域 1529748
19 v2 V2領域 1427430
08J8— 22—45 v2 V2領域 1348247
13 v2 V2領域 1306064
43 v2 V2領域 1276319
36 v2 V2領域 1220998
49 v2 . V2領域 1088665
04 v2 V2領域 1081821
44 v3 V3領域 21280416
43 v3 V3領域 3751773
49 v3 V3領域 3344193
12 v3 V3領域 2123092
32 v3 V3領域 1237399
46 v3 V3領域 1066998
28 v3 V3領域 985713
21 v3 V3領域 943735
06—29一 34 v3 V3領域 714979
39 v3 V3領域 690467 表 49は、 クレブセラ .ォキシト力 （微生物 ID 45) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズ させた結果を示す。表 49の結果から、クレブセラ'ォキシト力は、プローブ 45 vl、 45 v2、 45 v3の単独使用により同定はできなかったが、 vl、 v2、 v3プローブの組 合せで総合的に判断すると、 vl プローブでは 18—45 vl、 19—25 vl、 v2プローブ では 41— 42 v2、 08_18_22_45 v2、 v3プローブでは 45 v3、 05 v3が比較的強いシ グナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたクレブセラ ·ォキシトカ であると検出 ·同定することができる。
表 49 プローブ ID 領域 発光シグナル強度
18_45 v1 V1 領域 2898674
19—25 v1 V1 領域 1208235
26 v1 V1 領域 755934
35 v1 V1 領域 721250
52 v1 V1 領域 717318
42 v1 V1 領域 660524
41 v1 V1 領域 634164
55 v1 V1 領域 613698
53 v1 V1 領域 601442
08 v1 V1 領域 593709
41—42 v2 V2領域 8934930
08一 18一 22— 45 v2 V2領域 5101372
24 v2 V2領域 2385253
19 v2 V2領域 1623113
25 v2 V2領域 11 12476
1 1 v2 V2領域 721183
40 v2 V2領域 66 800
51 2 V2領域 567220
36 v2 V2領域 535714
10 v2 V2領域 534958
45 v3 V3領域 7431501
05 v3 V3領域 4897697
18—41一 42 v3 V3領域 1598792
25 v3 V3領域 1298790
08 v3 V3領域 778610
13 v3 V3領域 729871
19 v3 V3領域 619873
15 v3 V3領域 588761
31 3 V3領域 568712
26 v3 V3領域 512791 表 50は、スタフイロコッカス 'サプロフィティカス （微生物 ID 46) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダイズさせた結果を示す。 表 50の結果から、 スタフイロコッカス 'サプ ロフィティカスは、 プローブ 46 v2の単独使用により検出、 同定できることが明 らかである。 また、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 16_46 vl、 17 vl、 15 vl、 v2プローブでは 46 v2、 v3プローブ では 46 v3、 15 v3、 20 v3、 16 v3、 17 v3が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたスタフイロコッカス ·サプロ
と検出 · 同定することができる。
表 50
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
16—46 v1 V1 領域 10277032
17 v1 V 領域 9674540
15 v1 V1 領域 8769172
20 v1 V1 領域 3283426
07 v1 V1 領域 1892855
02 v1 V1 領域 1889753
22 v1 V1 領域 154601 1
13 v1 V1 領域 1243847
50 v1 V1 領域 1070738
35 v1 V1 領域 1003672
46 v2 V2領域 4786129
17 v2 V2領域 1887621
35 v2 V2領域 1717876
15 v2 V2領域 886876
16 v2 V2領域 478765
20 v2 V2領域 437165
01 2 V2領域 258761
04 v2 V2領域 231987
24 v2 V2領域 228761
51 v2 V2領域 217861
46 v3 V3領域 6991 183
15 v3 V3領域 6554178
20 v3 V3領域 5145896
16 v3 V3領域 4530444
17 v3 V3領域 4503253
35 v3 V3領域 2942362
04 v3 V3領域 456583
32 v3 V3領域 366061
49 v3 V3領域 334503
09 v3 V3領域 281250 表 51は、 パスッレラ 'ムルトシダ （微生物 ID 47) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプリダイズ させた結果を示す。表 51の結果から、パスッレラ 'ムルトシダは、プローブ 47 v2、 47 v3 の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 47 vl、01 vl、 v2プローブでは 47 v2、 v3プローブでは 47 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたパスッレラ ·ムルトシダであると検出 ·同 定することができる。
表 51
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
47 v1 V1 領域 26718761
01 1 V1 領域 187651 12
03 v1 V1 領域 88761 12
14 v1 V1 領域 6987991
24 v1 V1 領域 5989798
42 v1 V1 領域 5587619
41 v1 V1 領域 5287681
56 v1 V1 領域 3987911
50 v1 V1 領域 3387162
05 v1 V1 領域 2589761
47 v2 V2 領域 37586588
03 v2 V2 領域 4960568
24 v2 V2 領域 446406
01 v2 V2 領域 347257
19 v2 V2 領域 304368
48 v2 V2 領域 302776
07 v2 V2 領域 301324
25 v2 V2 領域 293772
08J 8一 22—45 v2 V2 領域 288850
41一 42 v2 V2 領域 286261
47 v3 V3 領域 33921374
53_54 v3 V3 領域 1892549
14 v3 V3 領域 261579
01 3 V3 領域 257277
04 v3 V3 領域 250816
23—30 v3 V3 領域 250456
28 v3 V3 領域 247470
1 1 v3 V3 領域 246482
21 v3 V3 領域 245279
49 v3 V3 領域 244577 表 52は、 エイケネラ ' コ口デンス （微生物 ID 48) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダイズ させた結果を示す。表 52の結果から、エイケネラ 'コロデンスは、プローブ 48 vl、 48 v2、 48 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 48 vl、 v2プローブでは 48 v2、 v3プローブでは 48 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたエイケネラ · コロデンスであると検出 · 同 定することができる。 ':' 表 52
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
48 vl V1 領域 13502759
56 v1 V1 領域 990652
53 v1 V1 領域 901384
55 v1 V1 領域 896907
54 v1 V1 領域 853309
51 v1 V1 領域 751093
52 v1 V1 領域 730236
50 v1 V1 領域 557710
36 v1 V1 領域 468439
40 v1 V1 領域 427702
48 v2 V2領域 14921478
7 v2 V2領域 1825342
40 v2 V2領域 1026522
4 v2 V2領域 732834
36 v2 V2領域 514674
50 v2 V2領域 389476
8_18_22_45 v2 V2領域 360461
55 v2 V2領域 357967
51 v2 V2領域 356507
1 1 v2 V2領域 353923
48 v3 V3領域 10069025
53_54 v3 V3領域 794485
50 v3 V3領域 440359
51 v3 V3領域 376628
47 v3 V3領域 366841
52—55 v3 V3領域 349558
40 v3 V3領域 344429
2 v3 V3領域 326945
56 v3 V3領域 324890
36 v3 V3領域 324201 表 53は、 ス トレプトコッカス · ピオゲネス （微生物 ID 49) の 16S rRNAの VI 〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイ ブリダィズさせた結果を示す。 表 53の結果から、 ス トレプトコッカス ·ピオゲネ スは、 プローブ 49 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブで は 49 vl、 3 vl、 v2プローブでは 49 v2、 v3プローブでは 49 v3、 43 v3が比較 的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたス トレプトコッ カス · ピオゲネスであると検出 · 同定することができる。
表 53
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
49 v1 V1 領域 9198798
43 v1 V1 領域 7387612
28 v1 V1 領域 987988
21_30 v1 V1 領域 787618
44 v1 V1 領域 678681
1 9一 25 v1 V1 領域 571614
17 v1 V1 領域 571 185
16_46 v1 V1 領域 479871
4 v1 V1 領域 408791
53 v1 V1 領域 387987
49 v2 V2 領域 14086816
7 v2 V2 領域 431324
25 v2 V2 領域 361329
4 v2 V2 領域 350067
19 v2 V2 領域 348217
24 v2 V2 領域 342690
41—42 v2 V2 領域 323245
36 v2 V2 領域 317579
34 v2 V2 領域 305133
8.18.22_45 v2 V2 領域 301791
49 v3 V3 領域 14313338
43 v3 V3 領域 14017125
12 v3 V3 領域 1716148
32 v3 V3 領域 551288
44 v3 V3 領域 525264
45 v3 V3 領域 464793
46 v3 V3 領域 359604
8 v3 V3 領域 358468
24 v3 V3 領域 355960
22 v3 V3 領域 339749 表 54は、 モラキセラ ' カタラリス （微生物 ID 50) の 16S rRNAの V1〜V3領域 を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダィズ させた結果を示す。表 54の結果から、モラキセラ'力タラリスは、プローブ 50 vl、 50 v2、 50 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せを総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 50 vl、 v2プローブでは 50 v2、 v3プローブでは 50 v3が比較的強いシグナル強度をもつ ため、 各領域で高い強度が検出されたモラキセラ ·カタラリスであると検出 ·同 定することができる。
表 54
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
50 v1 V1 領域 33692348
31 v1 V1 領域 2237951
07 v1 V1 領域 1491773
08 v1 V1 領域 1395166
01 v1 V1 領域 1 184515
20 v1 V1 領域 1 133034
09 v1 V1 領域 1067291
17 v1 V 領域 9351 14
16—46 v1 V1 領域 91 1298
03 v1 V1 領域 907361
50 v2 V2領域 8304820
04 v2 V2領域 329961 1
07 v2 V2領域 893720
08 18 22 45 v2 V2領域 827816
40 v2 V2領域 788590
19 v2 V2領域 758554
25 v2 V2領域 743874
36 v2 V2領域 654115
02 v2 V2領域 591388
1 1 v2 V2領域 589922
50 v3 V3領域 5799671
31 v3 V3領域 319034
18一 41_42 v3 V3領域 312670
24 v3 V3領域 308527
25 v3 V3領域 290458
05 v3 V3領域 281378
45 v3 V3領域 254033
19 v3 V3領域 252532
07 v3 V3領域 244682
20 v3 V3領域 239298 表 55 は、 レジオネラ ' ニューモフイラ （微生物 ID 51) の 16S rRNAの V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブリダ ィズさせた結果を示す。 表 55の結果から、 レジオネラ 'ニューモフイラは、 プロ ーブ 51 vl、 51 v2、 51 v3の単独使用により検出、 同定できることが明らかであ る。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプロ一 プでは 51 vl、 v2プローブでは 51 v2、 v3プローブでは 51 v3が比較的強いシグ ナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたレジオネラ ' ニューモフィ ラであると検出 · 同定することができる。
表 55
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
51 vl VI 領域 24876818
52 v1 V1 領域 528761 1
55 v1 V1 領域 51 19832
53 v1 V1 領域 387181 1
54 v1 V1 領域 2876861
56 v1 V1 領域 1976817
09 v1 V1 領域 1387681
50 v1 V1 領域 1287681
48 v1 V1 領域 1 19871 1
39 v1 V1 領域 1019871
51 v2 V2領域 21387192
52 v2 V2領域 8987614
55 v2 V2領域 1989729
54 v2 V2領域 1898798
53 v2 V2領域 1598791
56 v2 V2領域 1498791
40 v2 V2領域 146761 1
1 1 v2 V2領域 129871 1
10 v2 V2領域 1 1 19821
36 v2 V2領域 987123
51 3 V3領域 14398704
52—55 v3 V3領域 1319899
53—54 v3 V3領域 491713
56 v3 V3領域 44871 1
38 v3 V3領域 418731
07 v3 V3領域 389816
19 v3 V3領域 387681
39 v3 V3領域 379918
37 v3 V3領域 368761
25 v3 V3領域 351875 表 56 は、 マイコパクテリゥム ·ッベルク口シス （微生物 ID 52) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダィズさせた結果を示す。 表 56の結果から、 マイコパクテリゥム ·ッベ ルクロシスは、 プローブ 52 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らか である。 また、 vl、 v2、 v3 プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 52 vl、 55 vl、 v2プローブでは 52 v2、 v3プローブでは 52_55 v3、 53— 54 v3が比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出された マイコバクテリゥム . ッベルク口シスであると検出 ·同定することができる。 表 56
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
52 v1 V1 領域 17196053
55 v1 V1 領域 1041 1849
53 v1 V1 領域 6047891
54 v1 V1 領域 3971764
71 1 V1 領域 3827331
09 v1 V1 領域 1 197595
50 v1 V1 領域 863188
48 v1 V1 領域 843273
39 v1 V1 領域 746841
38 v1 V1 領域 672658
52 v2 V2領域 173981 18
55 v2 V2領域 3193388
54 v2 V2領域 1821709
53 v2 V2領域 1598909
56 v2 V2領域 777591
40 v2 V2領域 408032
51 v2 V2領域 287459
1 1 2 V2領域 251307
10 v2 V2領域 250094
36 v2 V2領域 240315
52一 55 v3 V3領域 20381022
53-54 v3 V3領域 1 1 192775
56 v3 V3領域 8461940
39 v3 V3領域 220756
07 v3 V3領域 157302
19 v3 V3領域 150205
39 v3 V3領域 148797
37 v3 V3領域 148389
25 v3 V3 領域 142268
20 v3 V3領域 140806 表 57は、 マイコバクテリゥム 'アビゥム （微生物 ID 53) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 57の結果から、マイコバクテリゥム'アビゥムは、 プローブ 53 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、v2、v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 53 vl、 54 vl、 v2プローブでは 53 v2、 v3プローブでは 56 v3、 53—54 v3、 52—55 v3力 S 比較的強いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたマイコバク テリゥム ·アビゥムであると検出 ·同定することができる。
表 57
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
53 v1 V1 領域 46987988
54 v1 V1 領域 36176731
52 v1 V1 領域 6876819
55 v1 V1 領域 6198763
56 v1 V1 領域 1879132
10 v1 V1 領域 1 198723
13 v1 V1 領域 939714
38 v1 V1 領域 879813
05 v1 V1 領域 826813
27 v1 V1 領域 771568
53 v2 V2 領域 21270538
40 v2 V2領域 2009083
10 v2 V2 領域 1205790
1 1 v2 V2 領域 963480
04 v2 V2 領域 697372
51 2 V2 領域 694035
07 v2 V2 領域 654143
19 v2 V2 領域 604806
54 v2 V2 領域 583414
52 v2 V2 領域 566515
56 v3 V3 領域 9459717
53一 54 v3 V3 領域 7329665
52一 55 v3 V3 領域 5980193
20 v3 V3 領域 469364
17 v3 V3 領域 441098
25 v3 V3 領域 380680
07 v3 V3 領域 347194
46 v3 V3 領域 315047
15 v3 V3 領域 289176
10 v3 V3 領域 275267 表 58は、 マイコバクテリゥム ' イントラセノレラレ (微生物 ID 54) の 16S rRNA の V1〜V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブと ハイブリダィズさせた結果を示す。 表 58の結果から、 マイコバクテリゥム ·イン トラセルラレは、 プローブ 54 v2の単独使用により検出、 同定できることが明ら かである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vl プローブでは 54 vl、 53 vl, v2プローブでは 54 v2、 v3プローブでは 56 v3、 53_54 v3が比較的強いシグナル強度をもっため、各領域で高い強度が検出されたマイコ バクテリゥム ·イントラセルラレであると検出 ·同定することができる。
表 58
Figure imgf000081_0001
表 59は、 マイコパクテリゥム .カンサシ （微生物 ID 55) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイブ リダイズさせた結果を示す。表 59の結果から、マイコバクテリゥム 'カンサシは、 プローブ 55 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、v2、v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブでは 55 vl、 52 vl、 v2プローブでは 55 v2、 v3プローブでは 52—55 v3、 56 v3が比較的強い シグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリゥム · カンサシであると検出 · 同定することができる。
表 59
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
55 v1 V1 領域 27987135
52 vl VI 領域 18971812
53 v1 V1 領域 4786132
54 v1 V1 領域 3987133
56 v1 V1 領域 2187634
38 v1 V1 領域 1387681
39 v1 V1 領域 1287731
27 v1 V1 領域 1216765
26 vl VI 領域 1098791
05 v1 V1 領域 798716
55 v2 V2領域 4421 7188
52 v2 V2領域 1 171394
40 v2 V2領域 1 161 661
54 v2 V2領域 1 123512
1 1 v2 V2領域 942604
53 v2 V2領域 872231
56 v2 V2領域 826313
10 v2 V2領域 695878
51 v2 V2領域 689889
07 v2 V2領域 663997
52一 55 v3 V3領域 39856910
56 v3 V3領域 20350562
53—54 v3 V3領域 16127395
18— 41一 42 v3 V3領域 392542
08 v3 V3領域 368803
20 v3 V3領域 352527
07 v3 V3領域 347768
17 v3 V3領域 347648
45 v3 V3領域 343925
19 v3 V3領域 332638 表 60は、 マイコバクテリ ゥム ' ゴルドネ （微生物 ID 56) の 16S rRNAの Vl〜 V3 領域を含む配列を有するポリヌクレオチドをチップ上の各プローブとハイプ リダイズさせた結果を示す。表 60の結果から、マイコバクテリゥム 'ゴルドネは、 プローブ 56 vl、 56 v2の単独使用により検出、 同定できることが明らかである。 また、 vl、 v2、 v3プローブの組合せで総合的に判断した場合でも、 vlプローブで は 56 vl、 v2プローブでは 56 v2、 v3プローブでは 56 v3、 53_54 v3が比較的強 いシグナル強度をもっため、 各領域で高い強度が検出されたマイコバクテリゥ ム · ゴルドネであると検出 ·同定することができる。
表 60
プローブ ID 領域 発光シグナル強度
56 v1 V1 領域 30688338
54 v1 V1 領域 2713077
53 v1 V1 領域 2497231
52 v1 VI 領域 2093852
55 v1 V1 領域 1112548
36 v1 VI 領域 788790
10 v1 V1 領域 725818
05 v1 V1 領域 542286
13 v1 V1 領域 538930
39 v1 V1 領域 53330。
56 v2 V2領域 7578904
52 v2 V2領域 1892398
40 v2 V2領域 1364607
51 v2 V2領域 984604
11 2 V2領域 585449
10 v2 V2領域 580267
55 v2 V2領域 486057
02 v2 V2領域 450110
41—42 v2 V2領域 408259
54 v2 V2領域 397348
56 v3 V3領域 56594408
53一 54 v3 V3領域 28772559
52一 55 v3 V3領域 11861849
12 v3 V3領域 406138
20 v3 V3領域 296776
07 v3 V3領域 292847
44 v3 V3領域 290502
11 3 V3領域 289832
17 v3 V3領域 284805
50 v3 V3領域 282254 [実施例 3 ] 複数のプローブによるシグナル結果に基づく微生物の同定方法 上記表 3に記載された微生物由来の vl、 v2及ぴ v3プローブは、 いずれもその 塩基配列と他の微生物由来の塩基配列とのミスマッチが 3個以下であるため、 他 の微生物由来の塩基配列とクロスハイプリダイゼーシヨンを起こしゃすく、 単独 のプローブによって検出、 同定することが困難であった。 このため、 上記表 3に 記載された微生物については、その検出シグナルの傾向からグループ分けを行い、 それら微生物由来の vl、 v2及び v3プローブを用いたハイプリダイゼーションの 検出シグナルの結果を総合的に検討し、 その微生物がいずれの属種であるかを同 定した。 '
例えば、 ス トレプトコッカス ' ニューモニエ （微生物 ID 06)、 ストレプトコッ カス 'ミテイス （微生物 ID 29)及ぴスト プトコッカス 'オラリス （微生物 ID 34) は同属の菌であるため相同性が高く、 互いの区別が困難であり、 特にストレプト コッカス . ニューモニエおよびス トレプトコッカス · ミテイスは単独プローブに よる区別が不可能であった。 そこでこれらをグループ Aとしてまとめ、 被検体が これら 3種のいずれかであると判定された場合、 各々に対応する 3種の vl〜v3 プローブを用いた更なる同定作業を行った。 そして、 ス トレプトコッカス 'ニュ 一モニエ (微生物 ID 06)、 ス トレプトコッカス ' ミテイス (微生物 ID 29) 及び ストレプトコッカス .オラリス （微生物 ID 34) の 3種類の微生物について、 検 出シグナルの結果を各微生物の各プローブについて表 61のようにまとめた。 表 61
Figure imgf000084_0001
◎は微生物とプローブの間の塩基配列にミスマッチがなぐングナル強度が強いもの
〇は微生物とプローブの間の塩基配列に 3個以下のミスマッチがありシグナル強度が強いもの、（）内はミスマッチ数
Xは微生物とプローブの間の塩基配列に 4個以上のミスマッチがあ yシグナル強度が弱いもの 表 61から明らかなように、グループ Aの各微生物は各プローブに対して独自の 検出シグナルパターンを有する。 すなわち、 ス トレプトコッカス ' ニューモニエ (微生物 ID 06) は、 34 vl及ぴ v2プローブのシグナル強度が弱く、 他の 06 vl 〜v3プローブ、 29 vl〜v3プローブ、 34 v3プローブではシグナノレ強度が強いの で、 これらのスポットにおける発色の程度を総合的に判断することによって、 被 検体がストレプトコッカス ' ニューモニエ （微生物 ID 06) であるか否かを同定 することができた。 また、 同様に、 ストレプトコッカス ·ミテイス (微生物 ID 29) 及ぴストレプトコッカス .オラリス （ί敷生物 ID 34) についても、 06 vl〜v3、 29 vl〜v3、 34 vl〜v3 のプローブに対して特有のシグナル強度呈示パターンを有す るので、 これらのプローブのスポットにおける発色の程度を総合的に判断するこ とによって、 被検体がス トレプトコッカス ' ミテイス （微生物 ID 29) あるいは ス トレプトコッカス .オラリス (微生物 ID 34)、 ス トレプトコッカス ' ニューモ ニェ （微生物 ID 06) であるか否かを同定することができた。
同様に、 スタフイロコッカス ·ホミニス (微生物 ID 15)、 スタフイロコッカス · ヮルネリ （微生物 ID 16)、 スタフイロコッカス ·へモリティカス (微生物 ID 17)、 スタフイロコッカス * ェピデルミディス (微生物 ID 20)、 スタフイロコッカス · ァゥレウス (微生物 ID 35)、 スタフイロコッカス ♦サプロフィティカス (微生物 ID 46) は同属であるために 16S rRNA遺伝子配列の類似性が高く、 互いの区別が 困難であり、 特に、 スタフイロコッカス ·ホミニス、 ストレプトコッカス · ヮル ネリ、 スタフイロコッカス ·へモリティカス、 スタフイロコッカス ' ェピデルミ ディスは、 単独プローブによる区別が不可能であった。 そのため、 これら微生物 をグループ Bとして、 各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパター ンを検討した。 その結果を表 62に示す。 その結果、 各微生物の有する独自の検出 シグナルパターンに基づいて、 微生物を同定することができることがわかった。 表 62
Figure imgf000086_0001
◎は微生物とプローブの間の塩基配列にミスマッチがなぐングナル強度が強いもの
〇は微生物とプローブの間の塩基配列に 3個以下のミスマッチがあリシグナル強度が強いもの、（）内はミスマッチ数
Xは微生物とプローブの間の塩基配列に 4個以上のミスマッチがあリシグナル強度が弱いもの 同様に、 シトロパクター · フレンディ (微生物 ID 08)、 ェンテロパクター · ク ロア力 （微生物 ID 18)、 ェンテロパクター 'ァエロゲネス （微生物 ID 19)、 セラ チア ·マルセッセンス (微生物 ID 22)、 ェシェリシァ · コリ (微生物 ID 24)、 ク レブセラ ·ニューモニエ (微生物 ID 25)、 サルモネラ 'パラチフィ A (微生物 ID 41)、サルモネラ ·チフィ (微生物 ID 42)、 クレブセラ 'ォキシトカ （微生物 ID 45) は 16S rRNA遺伝子配列の類似性が高く、 互いの区別が困難であり、 特にェンテロ パクター * クロア力、 クレブセラ · ニューモニエ、 サルモネラ ·パラチフィ A、 サルモネラ 'チフィ、 クレブセラ 'ォキシト力は単独プローブによる区別が不可 能であった。 そのため、 これら微生物をグループ Cとして、 各微生物の各プロ一 ブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。 その結果を表 63に示す。そ の結果、 各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基づいて、 微生物を同 定することができることがわかった。 ただし、 このうち、 サルモネラ 'パラチフ ィ 、 サルモネラ ·チフィの場合はいずれかの微生物が存在することを検出可能 であった。 03 07620 表 63
Figure imgf000087_0001
◎は微生物とプローブの間の塩基配列にミスマッチがなぐングナル強度が強いもの
〇は微生物とプローブの間の塩基配列に 3個以下のミスマッチがぁリシグナル強度が強いもの、 (：)内はミスマッチ数
Xは微生物とプローブの間の塩基配列に 4個以上のミスマッチがありシグナル強度が弱いもの 同様に、 ェンテロコッカス 'フエシゥム (微生物 ID 27)、 ストレプトコッカス · サンダイス (微生物 ID 28)、 ェンテロコッカス .ガリナルム (微生物 ID 38)、 ェ ンテロコッカス ·力セリフラバス （微生物 ID 39) は 16S rRNA遺伝子配列の類似 性が高く、 互いの区別が困難であり、 特に、 ェンテロコッカス 'ガリナルム、 ェ ンテロコッカス .力セリフラバスは区別が不可能であった。 そのため、 これら微 生物をグループ Dとして、 各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパ ターンを検討した。 その結果を表 64に示す。 その結果、 各微生物の有する独自の 検出シグナルパターンに基づいて、 微生物を同定することができることがわかつ た。 ただし、 このうち、 ェンテロコッカス 'ガリナノレム、 ェンテロコッカス '力 セリフラパスの場合はいずれかの微生物であることが検出可能であった。 表 64
Figure imgf000088_0001
Oは微生物とプローブの間の塩基配列に 3個以下のミスマッチがありシグナル強度が強いもの、（）内はミスマッチ数
は微生物とプローブの間の塩基配列に 4個以上のミスマッチがありシグナル強度が弱いもの 同様に、 ス トレプトコッカス ' コンステラータス （微生物 ID 21)、 ス トレプト コッカス · アンギノサス (微生物 ID 23)、 ス トレプトコッカス ' インターメディ ウス （微生物 ID 30) は同属であり、 16S rRNA遺伝子配列の類似性が高く、 互い の区別が困難であり、 特にストレプトコッカス ·ィンターメディウスは単独プロ ーブによる区別が不可能であった。そのため、これら微生物をグループ Eとして、 各微生物の各プローブに対する独自の検出シグナルパターンを検討した。 その結 果を表 65に示す。その結果、各微生物の有する独自の検出シグナルパターンに基 づいて、 微生物を同定することができることがわかった。
表 65
Figure imgf000089_0001
◎は微生物とプローブの間の塩基配列にミスマッチがなぐングナル強度が強いもの
Oは微生物とプロ一ブの間の塩基配列に 3個以下のミスマッチがあリシグナル強度が強いもの、（）内はミスマッチ数
Xは微生物とプローブの間の塩基配列に 4個以上のミスマッチがあリシグナル強度が弱いもの 以上のように、 本発明のプローブを用いることによって表 1に示す微生物を検 出及び/又は同定することが可能となった。 また、 その検出シグナルパターンが 明らかになつたので、 その検出シダナルパターンをコンピュータ等の記憶分析媒 体に予め登録させることによって、 被検体の微生物を迅速に確実に検出、 同定す ることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明の微生物の 16S rRNA塩基配列のうち、 特に特異性が高い VI、 V2及ぴ V3 領域の塩基配列から設計したプローブを用い、 被検体である微生物から抽出した 核酸を铸型として PCR法によって増幅を行い、 得られた増幅産物を解析すること により、 医療及び食品等の分野において有害な細菌を特異的にかつ迅速に検出、 同定することができる。

Claims

請求の範囲
1. ァクチノバチノレス · ァクチノマイセテムコミタンス (Actinobacillus act inomycetemcomi tans) , ァシネ トノ クタ一'力ノレコアセチカス (Acinetobacter calcoaceticus)、 へモフィルス 'インフルェンサ (Haemophi丄 us influenzae)、 ス テノ トロフォモナス ·マルトフィ リァ (Stenotrophomonas maltophilia)、 プロテ ウス ' ミ ラビリス （Proteus mirabilis)、 ス トレプトコッカス ' ニューモニエ
( Streptococcus pneumoniae)、 ンユー トモナス · エルキノサ (Pseudomonas aeruginosa)、 シトロノヽクタ1 ~ · フレンディ (Citrobacter freundii) ベィヨ不 ラ . パルプーラ （Veillonella parvula)、 プロ ビデンシァ · スチュアーティ
(Providencia stuartii) N ナイセリア · コノローェ (Neisseria gonorrhoeae ス 卜レプ卜コッカス · ァガラクチェ (Streptococcus agalactiae) N モルガネラ · モノレガニ (Morganella morganii)N ノ クテロィ τ~ス - フラジジス (Bacteroides fragilis)、 スタフイロコッカス · ホミニス (Staphylococcus hominis) , スタフ イロコッカス - ヮノレネリ (Staphylococcus warneri)ゝ スタフイロコッカス ·へモ リ ティカス (Staphylococcus haemolyticus) , ェンテロパクター - ク ロァカ
(Enterobacter cloacae)、 ェンテロノ クタ一 · ァエログネス (Enterobacter aerogenes )、 ス タ フ イ ロ コ ッカス 《 ェ ピデルミ ア イ ス ( Staphylococcus epidermidis 、 ス ト レプ ト コ ッカス ' コ ンスァフ 1 ~タス 、 Streptococcus constellatus)、 セラチア 'マノレセッセンス (Serratia marcescens)、 ス トレプト コ ッカス · アンギノサス (Streptococcus anginosus)、 ェシエ リ シァ · コ リ
(Escherichia coli)、 クレプセラ ♦ ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae; N ェ ンテロコッカス · フエカリス (Enterococcus faecalis)、 ェンテロコッカス · フ ェ シゥム ( Enterococcus faeciura)、 ス ト レプ ト コ ッカ ス · サングイ ス
(Streptococcus sanguis)、ス トレプトコッカス アイス (Streptococcus mitis ス トレフ トコッカス · ンターメアイウス (Streptococcus intermedius)、 リス テリア 'モノサイ トゲネス （Listeria monocytogenes)、 クロス トリジゥム 'ノ ー フリ ンゲンス （Clostridium perfringens)、 コリネパクテリ ゥム · アクアチウム
(Corynebacterium aquatium) ス レフ。トコッカス 'オフリス (Streptococcus oralis)、 スタフイロコッカス -ァゥレウス (Staphylococcus aureus)、 ナイセジ ァ · メニン = ^テアイス (Neisseria meningitidis
)、 カンピロノ クタ一. フエタス （Campylobacter fetus)、 ェンテロコッカス 'ガ リナノレム (Enterococcus gallinarum) ェンテロコッカス - 力セリフラバス
(Enterococcus casseliflavus)、 エロモフ-ス · ノヽ 卜 口 フィ フ ( Aeromonas hydrophila), サノレモネラ ·ノ ラチフィ A ( Salmonella paratyphi A) , サノレモネ ラ ' チフィ （Salmonella typhi ) , ス ト レプトコッカス ' エタイシミ リ ス
(Streptococcus equisimilis)、 ストレプトコッカス ' 力ニス (Streptococcus canis)、 クレブセラ *ォキシト力 (Klebsiella oxytoca) , スタフイロコッカス ' サプロフィティカス (Staphylococcus saprophyticus) Λ ノ スッレラ《ムノレ卜シグ
(Pasteurella multocida)、 エイケネ： · コロテンス (Eikenella corrodens)、 ストレフ。卜コッカス - ピオゲネス (Streptococcus pyogenes) モラキセラ -カタ ラリス (Moraxella catarrhal is) ^ レシ；? rネフ · ニューモフィ フ (Legionella pneumophila )、 マイ コパクテ リ ウム - ッベルク 口シス ( Mycobacterium tuberculosis八 マイコノ クテリゥム ·アビゥム (Mycobacterium avium; マイコ ノ クテリゥム ·イントラセノレラレ (Mycobacterium intracellulars マイコノ、ク テリゥム ·カンサシ (Mycobacterium kansasii) ^ マイコノ クテリゥム · ゴルド -不
(Mycobacterium gordonae) から選択される 1又は複数の微生物を検出及び Z又 は同定するためのプローブであって、 検出及び/又は同定すべき微生物の 16S rRNAの VI、 V2及ぴ Z又は V3領域内の 20〜100bpの各塩基配列又はその相補配列 からなるプローブ。
2. 配列番号 1〜152で示される塩基配列またはその相補配列から選ばれる、 請求項 1に記載のプローブ。
3. 配列番号 1、 2又は 3に示される塩基配列、 又はその相補配列を含む、 了 クチノバチルス ·ァクチノマイセテムコミタンスを検出及び/又は同定するため のプローブ。
4. 配列番号 4、 5又は 6に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含む、 ァシネトパクター 'カルコァセチカスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
5. 配列番号 7、 8又は 9に示される塩基配列、 又はその相補配列を含む、 へモフィルス ·ィンフルェンザを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
6 . 配列番号 10、 11又は 12に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、 ステノ トロフォモナス ·マルトフィリアを検出及ぴ Z又は同定するためのプロ一 ブ。
7 . 配列番号 13、 14又は 15に示される塩基配歹、又はその相補配列を含む、 プロテウス · ミラビリスを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
8 . 配列番号 16、 17又 18に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含む、 ストレプトコッカス . ニューモニエを検出及び 又は同定するためのプローブ。
9 . 配列番号 19、 20又は 21に示される塩基配列、又はその相補配列を含む、 シユードモナス ·エルギノサを検出及び/又は同定するためのプローブ。
1 0 . 配列番号 22、 23又は 24に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 シトロパクター . フレンディを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
1 1 . 配列番号 25、 26又は 27に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 べィヨネラ 'パルブーラを検出及び/又は同定するためのプローブ。
1 2 . 配列番号 28、 29 '又は 30に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、プロビデンシァ'スチュアーティを検出及び/又は同定するためのプローブ。
1 3 . 配列番号 31、 32又は 33に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ナイセリア · ゴノローェを検出及び/又は同定するためのプローブ。
1 4 . 配列番号 34、 35又は 36に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ·ァガラクチェを検出及ぴ Z又は同定するためのプロ一 ブ。
1 5 . 配列番号 37、 38又は 39に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 モルガネラ · モルガ二を検出及び/"又は同定するためのプローブ。
1 6 . 配列番号 40、 41又は 42に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 パクテロイデス · フラジリスを検出及ぴ /又は同定するためのプローブ。
1 7 . 配列番号 43、 44又は 45に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス .ホミニスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
1 8 . 配列番号 46、 47又は 48に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス · ヮルネリを検出及び/又は同定するためのプローブ。
1 9 . 配列番号 49、 50又は 51に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 スタフイロコッカス ·へモリティカスを検出及ぴノ又は同定するためのプロ ーブ。
2 0 . 配列番号 52、 23又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェンテロパクター . クロァカを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
2 1 . 配列番号 54、 55又は 56に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、ェンテロパクター .ァエロゲネスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
2 2 . 配列番号 57、 58又は 59に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 スタフイロコッカス .ェピデルミディスを検出及び Z又は同定するためのプ π—ブ0
2 3 . 配列番号 60、 61又は 62に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレブトコッカス · コンステラータスを検出及ぴ z又は同定するためのプ 口一ブ0
2 4 . 配列番号 63、 23又は 64に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 セラチア .マルセッセンスを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
2 5 . 配列番号 65、 66又は 67に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレブトコッカス ·アンギノサスを検出及び Z又は同定するためのプロ一 ブ。
2 6 . 配列番号 68、 69又は 70に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェシェリシァ · コリを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
2 7 . 配列番号 54、 71又は 72に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 クレブセラ 'ニューモニエを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
2 8 . 配列番号 73、 74又は 75に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ェンテロコッカス . フエカリスを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
2 9 . 配列番号 76、 77又は 78に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 ェンテロコッカス · フエシゥムを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
3 0 . 配列番号 79、 80又は 81に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、ストレプトコッカス'サンダイスを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
3 1 . 配列番号 82、 83又は 18に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ' ミテイスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
3 2 . 配列番号 60、 84又は 67に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ·インターメディウスを検出及び/又は同定するための プローブ。
3 3 . 配列番号 85、 86又は 87に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 リステリア ·モノサイ トゲネスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
3 4 . 配列番号 88、 89又は 90に示される塩基配列、 又はその相捕配列を含 む、 クロストリジゥム ·パーフリンゲンスを検出及び/又は同定するためのプロ ーブ。
3 5 . 配列番号 91、 92又は 93に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 コリネバクテリゥム ·アクアチウムを検出及び/又は同定するためのプロ一 ブ。
3 6 . 配列番号 94、 95又は 18に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、 ストレプトコッカス ·オラリスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
3 7 . 配列番号 96、 97又は 98に示される塩基配列、 又はその相補配列を含 む、スタフイロコッカス ·ァウレウスを検出及ぴ Ζ又は同定するためのプローブ。
3 8 . 配列番号 99、 100又は 101に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、ナイセリア'メニンギチデイスを検出及ぴ Ζ又は同定するためのプローブ。
3 9 . 配列番号 102、 103又は 104に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 カンピロバクタ一 · フエタスを検出及び/又は同定するためのプローブ。
4 0 . 配列番号 105、 106又は 107に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、ェンテロコッカス.ガリナルムを検出及び/又は同定するためのプローブ。
4 1 . 配列番号 108、 106又は 109に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 ェンテロコッカス .カセリフラパスを検出及び/又は同定するためのプロ ーブ。
4 2 配列番号 110、 111又は 112に示される塩基配列、又はその相補配列を含 む、 エロモナス ·ハイ ドロフイラを検出及び/又は同定するためのプローブ。
4 3 . 配列番号 113、 114又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 サルモネラ 'パラチフィ Αを検出及ぴノ又は同定するためのプローブ。
4 4 . 配列番号 115、 114又は 53に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 サルモネラ 'チフィを検出及びノ又は同定するためのプローブ。
4 5 . 配列番号 116、 117又は 118に示される塩基配歹 IJ、又はその相補配列を 含む、 ストレプトコッカス ·ェクイシミリスを検出及び z又は同定するためのプ ローブ。
4 6 . 配列番号 119、 120又は 121に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 ストレプトコッカス ·力ニスを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
4 7 . 配列番号 52、 23又は 122に示される塩基配列、又はその相補配列を含 む、 クレブセラ .ォキシトカを検出及び/又は同定するためのプローブ。
4 8 . 配列番号 46、 123又は 124に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、 スタフイロコッカス .サプロフィティカスを検出及び Z又は同定するため のプローブ。
4 9 . 配列番号 125、 126又は 127に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 パスッレラ · ムルトシダを検出及ぴ Z又は同定するためのプローブ。
5 0 . 配列番号 128、 129又は 130に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 エイケネラ · コロデンスを検出及ぴ z又は同定するためのプローブ。
5 1 . 配列番号 131、 132又は 133に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 ストレプトコッカス · ピオゲネスを検出及び/又は同定するためのプロ一 ブ。
5 2 . 配列番号 134、 135又は 136に示される塩基配列、又はその相捕配列を 含む、 モラキセラ 'カタラリスを検出及び Z又は同定するためのプローブ。
5 3 . 配列番号 137、 138又は 139に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 レジオネラ ' ニューモフイラを検出及ぴ 又は同定するためのプローブ。
5 4 . 配列番号 140、 141又は 142に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 マイコバクテリゥム ·ッベルク口シスを検出及び/又は同定するためのプ ローブ 0
5 5 . 配列番号 143、 144又は 145に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、マイコパクテリゥム 'アビゥムを検出及び/又は同定するためのプローブ。
5 6 · 配列番号 146、 147又は 145に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、 マイコバクテリゥム .ィントラセルラレを検出及び/又は同定するための プローブ。
5 7 . 配列番号 148、 149又は 145に示される塩基配列、又はその相補配列を 含む、マイコバクテリゥム'カンサシを検出及びノ又は同定するためのプローブ。
5 8 . 配列番号 150、 151又は 152に示される塩基配列、 又はその相補配列を 含む、マイコバクテリゥム ·ゴルドネを検出及び/又は同定するためのプローブ。
5 9 . 複数の微生物の 16S rRNAの塩基配列における相同性検索によって、 そ れぞれの微生物における VI、 V2、 V3領域を特定し、 該 VI、 V2、 V3領域の塩基配 列において 2種以上の微生物間で比較してミスマツチ部位を決定し、 該ミスマツ チ部位を含み、 かつ塩基長が 20〜100bpの領域を決定することを含む、 プローブ の設計方法。
6 0 . 請求項 1又は 2に記載のプローブの 1種以上を用いることを特徴とす る、 ァクチノパチ^ /ス ♦ ァクチノマイセテムコミタンス、 ァシネトパクター '力 ノレコアセチカス、 へモフィルス · ィンフルェンザ、 ステノ ト口フォモナス · マル トフィ リア、 プロテウス ' ミラビリス、 ス トレプトコッカス ' ニューモニエ、 シ ユードモナス · エノレギノサ、 シトロノくクタ一. フレンディ、 べィヨネラ 'パノレブ ーラ、 プロビデンシァ · スチュアーティ、 ナイセリァ · ゴノローェ、 ス トレプト コッカス ·ァガラタチェ、 モノレガネラ ·モ^ "ガ二、 バタテロイデス 'フラジリス、 スタフイロコッカス ' ホミニス、 スタフイロコッカス . ヮノレネリ、 スタフイロコ ッカス . へモリティカス、 ェンテロバクタ一 · クロァカ、 ェンテロバクター · ァ エロゲネス、 スタフイロコッカス .ェピデノレミディス、 ス トレプトコッカス 'コ ンステラータス、 セラチア .マノレセッセンス、 ス トレプトコッカス · アンギノサ ス、 ェシェリシァ ' コリ、 クレブセラ · ニューモニエ、 ェンテロコッカス · フエ カリス、 ェンテロコッカス ' フエシゥム、 ス トレプトコッカス ' サンダイス、 ス トレブトコッカス · ミテイス、 ス トレプトコッカス ' インターメディウス、 リス テリア ' モノサイ トゲネス、 クロス トリジゥム 'パーフリンゲンス、 コリネパク テリ ゥム 'アクアチウム、 ス トレプトコッカス 'オラリス、 スタフイロコッカス · ァゥレウス、 ナイセリア · メニンギチデイス、 カンピロバクタ一 · フエタス、 ェ ンテロコッカス ·ガリナルム、 ェンテロコッカス 'カセリフラノくス、 エロモナス · ハイ ドロフィラ、 サルモネラ ·パラチフィ A、 サルモネラ ·チフィ、 ストレプト コッカス ·ェクイシミリス、 ストレプトコッカス ·力ニス、 クレブセラ ·ォキシ トカ、 スタフイロコッカス ·サプロフィティカス、 パスッレラ 'ムノレトシダ、 ェ ィケネラ · コロデンス、 ストレプトコッカス · ピオゲネス、 モラキセラ '力タラ リス、 レジオネラ · ニューモフィラ、 マイコパクテリゥム 'ッベルク口シス、 マ ィコパクテリゥム ' アビゥム、 マイコバクテリゥム 'イントラセノレラレ、 マイコ バタテリゥム 'カンサシ、 マイコパクテリゥム · ゴルドネから選択される 1又は 複数の微生物の検出及ぴ Z又は同定方法。
6 1 . 微生物由来の塩基配列とプローブの塩基配列間でミスマッチが 4個以 上ある場合にハイブリダィズしないストリンジエンシー条件を用いて両配列をハ イブリダイズさせることを含む、 請求項 6 0に記載の方法。
6 2 . 同定すべき微生物の 16S rRNAの V1、V2及ぴ V3領域内の 20〜： lOObpの 塩基配列又はその相補配列からなるプローブの塩基配列とのミスマッチが 3個以 下である塩基配列を有する 2種以上の微生物を検出し、 該 2種以上の微生物と異 なる微生物の VI、 V2及ぴ V3領域内の 20〜100bpの塩基配列又はその相補配列から なるプローブの 1種以上を用い、 該 2種以上の微生物のうち 1種の微生物をさら に同定することを含む、 請求項 6 0又は 6 1に記載の方法。
6 3 . 以下の工程： （a)同定すべき微生物から核酸を調製する工程、 （b)該核 酸を請求項 1又は 2に記載のプローブとハイブリダィズさせる工程、（c) 工程（b) におけるハイプリダイズの有無を検出し、 各プローブに対するその検出シグナル パターンを特定する工程、 (d)工程（c)において得られた検出シグナルパターンと、 予め特定しておいた微生物の検出シグナルバターンとを比較して同定すべき微生 物の種類を特定する工程、 からなる請求項 6 0又は 6 1に記載の方法。
6 4 . 配列番号 153及び 154で示されるプライマーを用いて標的配列を含む ヌクレオチドを増幅した後にプローブとハイプリダイズさせる、 請求項 6 0〜 6 3のいずれか 1項に記載の方法。
6 5 . 標的配列を含むヌクレオチドの増幅の際に、 蛍光物質を用いて標識を 行う、 請求項 6 0〜 6 4のいずれか 1項に記載の方法。
6 6 . DNA チップ上で検出する、 請求項 6 0〜 6 5のいずれか 1項に記載の ^
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Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118882A2 (de) * 2004-05-26 2005-12-15 Eppendorf Ag Verfahren zur taxonspezifischen zellidentifizierung und zellsortierung auf grampositive bakterien und vorrichtungen hierfür
JP2006061155A (ja) * 2004-07-28 2006-03-09 Bml Inc 抗酸菌属細菌同定キット
JP2007289173A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP2007289172A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
EP1921161A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
EP1921168A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118904A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008118906A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008118914A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008118913A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008519603A (ja) * 2004-11-09 2008-06-12 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ群連鎖球菌属を検出するための組成物及び方法
JP2008545432A (ja) * 2005-06-02 2008-12-18 アドヴァンディーエックス，インコーポレイテッド 微生物を解析するためのペプチド核酸プローブ
WO2009034315A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 University Of Stirling Vaccine
WO2009039549A3 (de) * 2007-09-27 2009-07-30 Herbert Wiesinger-Mayr Verfahren zur bestimmung von mikroorganismen
US20100081581A1 (en) * 2006-03-31 2010-04-01 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2010525814A (ja) * 2007-04-25 2010-07-29 アドバンディーエックス， インコーポレイテッド 特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのペプチド核酸プローブ
US8173785B2 (en) * 2003-11-26 2012-05-08 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain Staphylococcus species
CN1814797B (zh) * 2005-12-02 2012-09-19 浙江大学 用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的特异性探针
CN104894232A (zh) * 2015-04-03 2015-09-09 贵州省畜牧兽医研究所 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒
US9175353B2 (en) 2008-11-14 2015-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid
WO2018012011A1 (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 三菱ケミカル株式会社 口腔内検査方法
WO2018168816A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 株式会社ジーシー 齲蝕細菌検出用ｄｎａチップ
WO2019088272A1 (ja) 2017-11-02 2019-05-09 三菱ケミカル株式会社 臨床的指標と関連性のある細菌群の情報を利用した口腔内検査方法
EP3625358A4 (en) * 2017-05-17 2021-02-24 Microbio Pty Ltd BIOMARKERS AND USES THEREOF

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424862B (zh) * 2012-01-09 2013-06-26 南开大学 嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEDEGAARD J. ET AL.: "Phylogeny of the genus haemophilus as determined by comparison of partial infB sequences", MICROBIOLOGY, vol. 147, September 2001 (2001-09-01), pages 2599 - 2609, XP002973178 *
HUGHES M.S. ET AL.: "Identification by 16S rRNA gene analysis of a potential novel mycobacterial species as an etiological agent of canine leproid granuloma syndrome", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 38, no. 3, March 2000 (2000-03-01), pages 953 - 959, XP002190512 *
KAPLAN J.B. ET AL.: "Population structure and genetic diversity of actinobacillus actinomycetemcomitans strains isolated from localized juvenile periodontitis patients", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 40, no. 4, April 2002 (2002-04-01), pages 1181 - 1187, XP002973177 *
PETERS S. ET AL.: "Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR-single-strand-conformation polymorphism-based genetic profiles of small-subunit rRNA genes", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 66, no. 3, March 2000 (2000-03-01), pages 930 - 936, XP002973180 *
RANDAZZO C.L. ET AL.: "Diversity, dynamics and activity of bacterial communities during production of an artisanal sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 68, no. 4, April 2002 (2002-04-01), pages 1882 - 1892, XP009017967 *
SCHMALENBERGER A. ET AL.: "Effect of primers hybridizing to different evolutionarily conserved regions of the small-subunit rRNA gene in PCR-based microbial community analysis and genetic profiling", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 67, no. 8, August 2001 (2001-08-01), pages 3557 - 3563, XP002973181 *
SIMPSON J.M. ET AL.: "Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA amplicons to monitor changes in fecal bacterial populations of weaning pigs after introduction of lactobacillus reuteri strain MM53", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 66, no. 11, November 2000 (2000-11-01), pages 4705 - 4714, XP002973182 *
TRAN S.D. ET AL.: "Improved multiplex PCR using conserved and species-specific 16S rRNA gene primers for simultaneous detection of actinobacillus actinomycetemcomitans, bacteroides forsythus and porphyromonas gingivalis", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 37, no. 11, November 1999 (1999-11-01), pages 3504 - 3508, XP002973179 *

Cited By (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8227192B2 (en) * 2003-11-26 2012-07-24 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain Staphylococcus species
US8173785B2 (en) * 2003-11-26 2012-05-08 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain Staphylococcus species
WO2005118882A3 (de) * 2004-05-26 2006-02-02 Eppendorf Ag Verfahren zur taxonspezifischen zellidentifizierung und zellsortierung auf grampositive bakterien und vorrichtungen hierfür
WO2005118882A2 (de) * 2004-05-26 2005-12-15 Eppendorf Ag Verfahren zur taxonspezifischen zellidentifizierung und zellsortierung auf grampositive bakterien und vorrichtungen hierfür
JP2006061155A (ja) * 2004-07-28 2006-03-09 Bml Inc 抗酸菌属細菌同定キット
JP2008519603A (ja) * 2004-11-09 2008-06-12 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ群連鎖球菌属を検出するための組成物及び方法
US8202978B2 (en) 2004-11-09 2012-06-19 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting group A streptococci
JP2008545432A (ja) * 2005-06-02 2008-12-18 アドヴァンディーエックス，インコーポレイテッド 微生物を解析するためのペプチド核酸プローブ
CN1814797B (zh) * 2005-12-02 2012-09-19 浙江大学 用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的特异性探针
JP2007289173A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
JP2007289172A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法
US20100081581A1 (en) * 2006-03-31 2010-04-01 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118906A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
US8211647B2 (en) 2006-11-10 2012-07-03 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118907A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
EP1921161A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118913A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
EP1921168A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2008118914A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008118904A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
JP2008118912A (ja) * 2006-11-10 2008-05-29 Canon Inc プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法
US8207317B2 (en) 2006-11-10 2012-06-26 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
JP2010525814A (ja) * 2007-04-25 2010-07-29 アドバンディーエックス， インコーポレイテッド 特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのペプチド核酸プローブ
US8257713B2 (en) 2007-09-14 2012-09-04 University Of Stirling Vaccine
WO2009034315A3 (en) * 2007-09-14 2009-06-04 Univ Stirling Vaccine
WO2009034315A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 University Of Stirling Vaccine
WO2009039549A3 (de) * 2007-09-27 2009-07-30 Herbert Wiesinger-Mayr Verfahren zur bestimmung von mikroorganismen
US9175353B2 (en) 2008-11-14 2015-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid
US10829824B2 (en) 2008-11-14 2020-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid
CN104894232A (zh) * 2015-04-03 2015-09-09 贵州省畜牧兽医研究所 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒
JPWO2018012011A1 (ja) * 2016-07-11 2018-07-19 三菱ケミカル株式会社 口腔内検査方法
CN109790531A (zh) * 2016-07-11 2019-05-21 三菱化学株式会社 口腔内检查方法
WO2018012011A1 (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 三菱ケミカル株式会社 口腔内検査方法
WO2018168816A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 株式会社ジーシー 齲蝕細菌検出用ｄｎａチップ
JP2018148855A (ja) * 2017-03-14 2018-09-27 三菱ケミカル株式会社 齲蝕細菌検出用ｄｎａチップ
US11732310B2 (en) 2017-03-14 2023-08-22 Gc Corporation DNA chip for detecting dental caries bacteria
EP3625358A4 (en) * 2017-05-17 2021-02-24 Microbio Pty Ltd BIOMARKERS AND USES THEREOF
US11739389B2 (en) 2017-05-17 2023-08-29 Microbio Pty Ltd Biomarkers and uses thereof
WO2019088272A1 (ja) 2017-11-02 2019-05-09 三菱ケミカル株式会社 臨床的指標と関連性のある細菌群の情報を利用した口腔内検査方法

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