CN104894232A - 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒 - Google Patents

弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104894232A
CN104894232A CN201510157826.3A CN201510157826A CN104894232A CN 104894232 A CN104894232 A CN 104894232A CN 201510157826 A CN201510157826 A CN 201510157826A CN 104894232 A CN104894232 A CN 104894232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
citrobacter freundii
quantitative pcr
pcr
fluorescent quantitative
diagnostic reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510157826.3A
Other languages
English (en)
Inventor
余波
徐景峨
罗永成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Original Assignee
GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE filed Critical GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority to CN201510157826.3A priority Critical patent/CN104894232A/zh
Publication of CN104894232A publication Critical patent/CN104894232A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。本发明根据GenBank中的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计了1对引物，通过对荧光定量PCR反应条件进行优化，研制出弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR诊断试剂盒，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。根据以上研究设计的引物，将其应用在荧光定量PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出弗氏柠檬酸杆菌，并且具有良好的特异性及敏感性。

Description

弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。
背景技术
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是革兰氏阴性短杆菌，在土壤、水体、污水、食物中广泛存在，为人和动物肠道的正常菌群，该菌是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1-3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鲟鱼、以及大鲵。随着冷水鱼养殖场（户）集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前报道的病害报道主要集中在鲟鱼、虾、中华鳖，鳟鲑鱼、大鲵报道较少，感染该菌的鲟鱼、虾、中华鳖、鳟鲑鱼和大鲵出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状，随后死亡[4-7]。
发明内容
本发明的目的是：传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果，从而对症下药。应用荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。提供一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它可以快速检测弗氏柠檬酸杆菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
本发明是这样实现的：弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物的序列为： 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'。
阴性对照为超纯水。
阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD-18T阳性质粒样品。
荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/μL的氯化镁，1000pmol/μL的 dNTP 4.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成。
试剂盒的保存期检测
试剂盒保存期：将试剂盒各组份于室温、4 ℃、-20 ℃，保存时间1周、3月、6月、1年，对标准阳性样品进行检测。4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，-20℃保存1月、3月、6月、1年对阳性拷贝数无影响。
本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计1对特异性的引物，通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，T克隆到pMD-18T载体上作为标准阳性样品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，再以建立的诊断方法研制出试剂盒。试剂盒对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性峰值，无引物二聚体，灵敏度可达1.0×10１拷贝/μL，结果表明，研制的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒适合于弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病料样品的快速诊断。
为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验：
弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断方法的建立
1  材料与方法
1.1  试验材料
菌株：弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。
主要试剂：MIX PCR酶、pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶、Goldview、1×TAE电泳缓冲液、DL2000、DH5α，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等购自上海捷瑞生物工程公司，引物为上海捷瑞生物工程公司合成，其他为国产试剂。
主要仪器：EppendorfMastercycler ep realplex 4 实时荧光定量PCR仪。
试验方法
1.2.1  引物设计  
根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA序列，设计1对引物，上游引物：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物: 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'，预计扩增产物大小为117bp。
核酸的提取
   （1）组织样品：取患病大鲵肝脏组织约1.0 g，加入0.1mol/L PBS缓冲液2 mL进行研磨，然后置-70℃低温冰箱反复冻融3次，5000 r/min离心，取上清液970μL加入10%SDS 20μL，蛋白酶K 10μL（20mg/mL），55℃反应30 min，5000 r/min离心，取上清液用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组，提取的基因组置-20℃保存。
   （2）细菌样品：细菌样品DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取的基因组置-20℃保存。
fre 阳性标准品的制备
    通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火温度55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T- fre，同时送上海捷瑞生物工程公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T- fre在D260nm/D280nm处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。
荧光定量PCR反应条件的优化
荧光定量PCR反应体系25 μL，对退火温度（50℃、55℃、60℃），引物浓度（5、10、20 μmol/L），荧光定量的反应时间、体系，进行优化以确定最佳反应条件。
反应体系为：上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1μL，Premix Ex Taq 12.5μL，ROX Reference Dye 0.5μL，模板1 μL，用超纯水补足至25 μL，同时以超纯水作为空白对照。
反应条件为：94℃ 10s；94℃ 5s、退火温度（50℃、55℃、60℃）10s、72℃10s，40个循环。
荧光定量PCR反应标准曲线的构建
    用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-fre，计算出重组质粒的浓度和纯度，以及DNA拷贝数；将标准阳性样本连续10倍倍比稀释，以1.2.4的优化好的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
敏感性试验
    计算出重组质粒pMD-18T-fre DNA拷贝数，10倍倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。
特异性试验
    分别以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。
重复性试验
    应用建立的荧光定量PCR方法重复检测弗氏柠檬酸杆菌DNA样品3次，以考察检验结果的可靠性。
试剂盒的研制
以建立的荧光定量PCR方法为基础，组装成试剂盒。试剂盒组成：①荧光定量PCR反应混合液（Premix Ex Taq）；②引物；③ROX Reference Dye；④裂解液；⑤阳性对照；⑥阴性对照；⑦超纯水。将试剂盒储存于室温、4 ℃和-20 ℃保存，保存时间1周、3月、6月、1年，对标准阳性样品进行检测。
荧光定量PCR试剂盒对临床样品的检测  
对2013年1月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料（肝脏），85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。
结果与分析
2.1  pMD-18T-fre阳性标准品的制备
    扩增的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA，片段大小为117bp，无非特异性片段产生（图1）。将上海捷瑞生物工程公司测序结果与GenBank中的16S rRNA基因序列比对，核苷酸相似度为98.9%～100%。
荧光定量PCR反应条件的优化
通过荧光定量PCR反应条件的优化，在25 μL反应体系中，最佳反应条件为：Premix Ex Taq 12.5μL，ROX Reference Dye 0.5μL，引物浓度10 μmol/L 1μL，反应条件为：94℃ 10s；94℃ 5s、退火温度55℃10s、72℃10s，40个循环。
荧光定量PCR反应标准曲线的构建
将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105拷贝/μL的重组质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，得到扩增反应的标准曲线（图2），线性回归方程为
Ct＝-2.980×lgcopies＋9.27（R2=0.999）。
熔解曲线分析
   如图3所示熔解曲线，扩增产物的溶解温度Tm为84.6℃～85.4℃，无引物二聚体和非特异性产物等峰值出现。
敏感性试验
    将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0×100、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105拷贝/μL重组质粒作为模板，进行荧光定量PCR扩增，结果显示其灵敏度为1.0×101拷贝/μL（图4）。
特异性试验
以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性，结果弗氏柠檬酸杆菌为阳性，而弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌为阴性（图5）。
重复性试验
    应用建立的荧光定量PCR方法检测弗氏柠檬酸杆菌DNA，样品重复3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。
试剂盒研制
（1）试剂盒组成20头份：①荧光定量PCR反应混合液（Premix Ex Taq）250 μL；②引物25μL；③ROX Reference Dye 25μL；④裂解液1000μL；⑤阳性对照40μL；⑥阴性对照40μL；⑦超纯水200μL。
（2）试剂盒保存期：将试剂盒各组份于室温、4 ℃、-20 ℃，保存时间1周、3月、6月、1年，对标准阳性样品进行检测。4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，-20℃保存1月、3月、6月、1年对阳性拷贝数无影响。
试剂盒对临床样品的检测
对2013年1月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料（肝脏），85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。156份疑似病料（肝脏）荧光定量检测阳性率23/156（14.74%），细菌分离鉴定阳性率14/156（9.0%）；85头份大鲵饵料鱼病料荧光定量检测阳性率16/85（18.82%），细菌分离鉴定阳性率8/85（9.4%）；36份发病鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场水样荧光定量检测阳性率11/36（30.55%），细菌分离鉴定阳性率2/36（5.5%）。
讨论
目前，临床常用的病原菌鉴定方法主要有传统平板分离培养及生化鉴定，以及在此基础上纯化菌落后进行PCR扩增、测序、比对，普通PCR和实时荧光定量PCR等。随着生物技术的快速发展，基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR技术与传统鉴定方法相比，具有快速、准确的优势；与普通PCR相比，具有准确、灵敏、特异性高的特点；该技术无需探针，且价格较TaqMan探针低廉，适合于临床样品的快速诊断。
余波等[8]利用传统鉴定方法结合PCR测序对大鲵细菌性败血症病原进行分离鉴定，从对病原菌分离、培养、纯化，到生化鉴定整个过程最快需要一周时间。胡秀彩等[9]采用弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA V3区的PCR-SSCP图谱进行菌株鉴别效果良好。余波等[10]研制的致病性嗜水气单胞菌 SYBR Green I实时荧光定量 PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速等特点，敏感度达到1.0×101拷贝/μL。
本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计1对引物，将PCR扩增获得的基因片段克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，以此为基础研制出诊断试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰，无引物二聚体，对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，灵敏度可达1.0×10１拷贝/μL。传统细菌分离和荧光定量均监测到养殖用水和饵料鱼中存在弗氏柠檬酸杆菌，提示该菌是一种条件致病菌，人工养殖的水和饵料均含有弗氏柠檬酸杆菌，由于规模化养殖，当养殖密度提高以及鳟鲑鱼、大鲵大鲵免疫力下降时就出现发病。因此，应用本试剂盒开展鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场弗氏柠檬酸杆菌早期感染检测对饵料和养殖用水进行检测，有利于弗氏柠檬酸杆菌的防治。
附图说明
图1为弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR扩增结果；
图1中，M：DL2000；1：弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR产物；2：阴性对照；
图2为SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线；
图3为SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线；
图4为SYBR Green I荧光定量PCR敏感性试验结果；
图4中，1～6：重组质粒DNA 1.0×105～100拷贝/μL稀释的荧光定量PCR结果；
图5为SYBR Green I荧光定量PCR特异性试验
图5中，1: 弗氏柠檬酸杆菌；2：致病性嗜水气单胞菌；3：荧光假单胞菌；4：黄杆菌；5：迟缓爱德华菌。
具体实施方式
本发明的实施例：弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：250μL荧光定量PCR反应混合液（Premix Ex Taq）；上下游引物各20μL；25μL荧光核酸染料、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；20μL上游引物，上游引物的序列为5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，20μL下游引物，下游引物的序列为：5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR产物。
SEQUENCE LISTING                       
序列表
<110>  贵州省畜牧兽医研究所
<120>  弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒
<130>  nm:
<160>  2
<170>  PatentIn version
 
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>根据弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物，用DNAStar软件设计，以用于荧光定量PCR扩增。
<400> 1CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG 23
 
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>根据弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列设计1对特异性引物，用DNAStar软件设计，以用于荧光定量PCR扩增。
<400> 2TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC 23
 

Claims (4)

1.一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：它包括250μL荧光定量PCR反应混合液；上游引物20μL、浓度为10nmol/μL、下游引物20μL、浓度为10nmol/μL；荧光核酸染料25μL、浓度为25mmol/μL；40μL阳性对照；40μL阴性对照；170μL超纯水；上游引物的序列为：5'-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3'，下游引物的序列为： 5'-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3'。
2.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD-18T阳性质粒样品。
4.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/μL的氯化镁，1000pmol/μL的 dNTP 4.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成。
CN201510157826.3A 2015-04-03 2015-04-03 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒 Pending CN104894232A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510157826.3A CN104894232A (zh) 2015-04-03 2015-04-03 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510157826.3A CN104894232A (zh) 2015-04-03 2015-04-03 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104894232A true CN104894232A (zh) 2015-09-09

Family

ID=54027184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510157826.3A Pending CN104894232A (zh) 2015-04-03 2015-04-03 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104894232A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734163A (zh) * 2016-05-05 2016-07-06 重庆文理学院 一种棘腹蛙感染弗氏柠檬酸杆菌的pcr快速检测试剂盒及检测方法
CN107058459A (zh) * 2017-05-24 2017-08-18 中国检验检疫科学研究院 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003106676A1 (ja) * 2002-06-14 2003-12-24 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法
WO2004033720A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Hôpitaux Universitaires De Geneve Analytical chip for detection of 16s-rrna from clinically relevant bacteria and analytical method based thereon

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003106676A1 (ja) * 2002-06-14 2003-12-24 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 微生物同定用プローブ及びそれを用いた同定方法
WO2004033720A2 (en) * 2002-10-09 2004-04-22 Hôpitaux Universitaires De Geneve Analytical chip for detection of 16s-rrna from clinically relevant bacteria and analytical method based thereon

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王艳萍: "应用16S rRNA基因序列分析技术鉴定临床非典型细菌的研究", 《中国病原生物学杂志》 *
益钧镒: "《当代食物安全》", 30 May 2014 *
陈红莲: "克氏原螯虾弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与药敏试验", 《淡水渔业》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734163A (zh) * 2016-05-05 2016-07-06 重庆文理学院 一种棘腹蛙感染弗氏柠檬酸杆菌的pcr快速检测试剂盒及检测方法
CN107058459A (zh) * 2017-05-24 2017-08-18 中国检验检疫科学研究院 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102146466B (zh) 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法
Sharma Real-time reverse transcription-multiplex PCR for simultaneous and specific detection of rfbE and eae genes of Escherichia coli O157: H7
O'mahony et al. Rapid real-time PCR assay for detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis DNA in artificially contaminated milk
CN103160615B (zh) 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN105506153B (zh) 一种检测维氏气单胞菌的试剂盒和方法
CN104450940B (zh) 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒
Jacob et al. Evaluation of a multiplex real-time polymerase chain reaction for the quantification of Escherichia coli O157 in cattle feces
CN110004250A (zh) 一种非洲猪瘟病毒lamp可视化检测试剂盒
CN104726567A (zh) 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
Zhu et al. Rapid diagnosis of largemouth bass ranavirus in fish samples using the loop-mediated isothermal amplification method
CN101381767B (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
CN109439775A (zh) 一种猪病原体的多重pcr检测方法
Gumaa et al. Specific detection and differentiation between Brucella melitensis and Brucella abortus by a duplex recombinase polymerase amplification assay
CN102952881B (zh) 一种阴沟肠杆菌特异性pcr检测引物
CN105567802A (zh) 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒
Li et al. Rapid detection of Edwardsiella ictaluri in yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) by real-time RPA and RPA-LFD
CN104894232A (zh) 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒
CN106435007A (zh) 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法
Xiong et al. A novel multiplex PCR assay for rapid detection of virulent Aeromonas in cultured eels
CN103305613B (zh) 大鲵致病性嗜水气单胞菌pcr诊断试剂盒
CN105567821A (zh) 炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒
AU2020103778A4 (en) Primer Set for Detection of Streptococcus agalactiae, Detection Kit and Multiplex PCR Detection Method
Gwak et al. How to rapidly and sensitively detect for Escherichia coli O157: H7 and Salmonella Typhimurium in cabbage using filtration, DNA concentration, and real-time PCR after short-term enrichment
CN111206110B (zh) 同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法
CN103122383B (zh) 猪链球菌种水平荧光定量pcr检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150909

RJ01 Rejection of invention patent application after publication