KR20230041242A - 락토바실러스 사케이 k040706 균주 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물에 관한 것으로서, 다기능성을 갖는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출 및 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물은 저비용, 고효율로 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 이용한 건강기능식품 등의 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있고, 품질을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 활용한 다양한 연구 등에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이 K040706 균주 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 락토바실러스 사케이 중에서 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적으로 검출 및 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물, 이를 포함하는 검출용 조성물, 이를 이용한 검출방법 및 프라이머 세트 조성물을 포함하는 PCR 키트에 관한 것이다.
젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품ㅇ김치류ㅇ양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.
이중에서도 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)는 장내 NO 생성능을 증가하여 면역을 증진시키고, 장조직의 손상을 감소시키며, 대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 효과를 갖는 유용 미생물로 알려져 있다. 현재 코로나 19로 인한 건강기능식품 시장 규모가 증가하고 있는 추세에서, 상기 바이러스 감염 질환 억제 효능을 갖는 균주의 품질 관리 및 유지는 매우 중요하다.
그러나, 현재 특정 유산균을 분석하기 위해서는, 시료 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 시료 내에 존재하는 미생물의 수를 실시간으로 분석할 수 없다는 문제가 있다. 게다가 시료를 준비하고, 이로부터 미생물을 별도로 배양하는 과정이 필요하며, 그 과정에서 균주가 사멸할 경우에는 측정되지 않는다. 또한 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있다. 또한, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 정확하게 측정하기 위해서는, 이를 분리 및 동정해야 하며 그 과정에서 많은 시간과 비용이 필요하다는 문제점이 있다.
이에 따라, 유전적 성질이 비슷한락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다기능성의 특정 균주만을 효율적으로 검출 및 판별할 수 있는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 PCR 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법을 제공한다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 함유된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 키트를 제공한다.
PCR 반응 혼합물은 dNTP, DNA 폴리머라아제 및 버퍼를 포함하는 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.
본 발명에 따르면, 다기능성을 갖는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출 및 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물은 저비용, 고효율로 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 이용한 건강기능식품 등의 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있고, 품질을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 활용한 다양한 연구 등에 활용될 수 있다.
게다가 사균 형태의 락토바실러스 사케이 K040706 균주도 검출이 가능하므로, 사균형태의 제품 및 연구에도 광범위하게 적용할 수 있다.
도 1은 유전체 염기서열의 상관도를 분석하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과의 계통학적 유연관계를 OrthoANI 값을 이용해 클러스터링한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 및 표 1에 나타낸 4종의 균주의 범유전체(Pan-Genome) 분석을 통한 Strain specific CDSs를 분석한 결과이다.
도 3은 서열번호 2로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 4는 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 5는 서열번호 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트를 이용하여 다양한 균종드로부터 추출한 DNA 샘플들에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Lane L은 마커이고, Lane 1은 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)이고, Lane 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)이며, Lane 3은 KACC17865 균주이며, Lane 4는 KACC17868 균주이며, Lane 5는 KACC17871 균주이며, Lane 6은 KACC18352 균주이며, Lane 7은 KACC17864 균주이며, Lane 8은 KACC16119 균주이다.
도 7은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR CT 그래프 결과이다.
도 8은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 용융 그래프(melting curve)이다.
도 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 및 표 1에 나타낸 4종의 균주의 범유전체(Pan-Genome) 분석을 통한 Strain specific CDSs를 분석한 결과이다.
도 3은 서열번호 2로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 4는 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 5는 서열번호 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트를 이용하여 다양한 균종드로부터 추출한 DNA 샘플들에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Lane L은 마커이고, Lane 1은 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)이고, Lane 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)이며, Lane 3은 KACC17865 균주이며, Lane 4는 KACC17868 균주이며, Lane 5는 KACC17871 균주이며, Lane 6은 KACC18352 균주이며, Lane 7은 KACC17864 균주이며, Lane 8은 KACC16119 균주이다.
도 7은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR CT 그래프 결과이다.
도 8은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 용융 그래프(melting curve)이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)는 장내 NO 생성능을 증가하여 면역을 증진시키고, 장조직의 손상을 감소시키며, 대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 효과를 갖는다. 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 유용성에 비해 효과적으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 미비하여 실제 산업분야 활용에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 구체적으로 도 1의 계동도를 통해 확인할 수 있듯이 락토바실러스 사케이 및 락토바실러스 균주 중에서 유전체 유사도가 높은 균주가 4종 이상 존재하는 것을 확인할 수 있다. 종래 판별방법으로는 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출하는데 여러 문제가 있다. 따라서 락토바실러스 군주 중에서 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적이고, 정확하게 식별, 검출 및 정량할 수 있는 프라이머에 대한 개발이 매우 시급하다.
본 발명의 일 측면은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서도 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적이고, 정확하게 높은 민감도로 식별, 검출할 수 있다는 이점이 있다. 상기 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706 균주 중에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자 또는 이의 단편을 특이적으로 검출하는 것으로, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 염기서열 중에서 다른 균주에서는 존재하지 않는 영역을 검출하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자 중에서 선택되는 어느 하나를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자는 Hypothesis gene으로 아직 그 기능이 확인되지 않은 영역이다.
구체적으로, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 증폭시키고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 증폭하며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "프라이머"란, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
상기 주형의 서열은 앞서 설명한 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 유전자라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일 예로, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등의 단백질, 아크리딘, 프로랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철, 사화성 금속 등의 킬레이트화제, 알킬화제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P, 32P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프라이머 세트는 현장진단(point-of-care testing, POCT)을 위해 사용될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 현장진단용 기기를 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 현장진단을 위한 프라이머 세트일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
상기 조성물은 락토바실러스 사케이의 표적 핵산을 증폭하기 위한 것일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온(isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 실시간 PCR, 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법에 관한 것이다.
a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계.
상기 시료는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 시료로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 포함 여부 식별이 필요한 시료라면 특별히 제한되지 않으며, 일예로써 프로바이오틱스 제제, 화장품, 식품, 영양제, 음료, 첨가제, 각종 식이에 포함되는 물질 등을 대상으로 할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니며 락토바실러스 속 균주의 포함 여부를 확인하고자 하는 것이라면 모두 대상 시료가 될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 시료에 함유된 미생물은 생균뿐만 아니라 사균일 수 있다.
상기 검출방법을 통해 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서도 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적이고, 정확하게 높은 민감도로 식별, 검출할 수 있다는 이점이 있다. 상기 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)일 수 있다.
상기 시료로부터 DNA를 분리하는 방법은 단업계에 공지된 방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizardprep 키트(Promega 사), QIAmp 키트(QIAGEN사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
다음으로, a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 수행한다.
상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물로, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 서열번호 1로 표시되는 유전자 중 소정의 영역에 상보적인 서열을 가지며, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 서열번호 2 내지 4로 표시되는 DNA를 증폭할 수 있는 염기서열일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 농도에서도 효과적으로 타겟 DNA를 증폭할 수 있다.
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)"은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 것으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.
상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time RCR)일 수 있다. 일반적인 PCR의 경우 반응이 완료된 후 최종산물의 양을 알 수 있는 반면, 실시간 PCR은 PCR이 진행하는 동안 DNA 분자가 증폭되는 과정을 정량적으로 관찰할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 실시간 PCR은 형광 탐침을 이용하는 Taqman 방법 또는 SYBR Green을 사용할 수 있고, 구체적으로는 SYBR Green을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR은, 목적하는 서열이 증폭됨에 따라 DNA 양이 증가하고, 이때 이중 가닥(double stranded) DNA에 끼어 들어가는 성질이 있는 형광 염료인 SYBR Green이 이중가닥 DNA에 끼어들어가게 된다. 상기 SYBR은 DNA에 끼어들어 발광하는 성질을 나타내므로, 발광 정도를 측정하여 증폭된 DNA양의 검출이 가능하다. SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR법은 프라이머나 탐침에 형광 염료를 부착하지 않아도 되기 때문에 저렴하다는 장점이 있다. 그러나, SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR 방법은 한 종류의 PCR 산물만 증폭되는 조건이어야 하고, 통상적인 PCR에서 일어나는 비특이적 산물이나 프라이머간의 다이머(dimer)의 형성이 일어나지 않는 민감한 프라이머 조건을 요구한다.
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이 K040706 균주가 함유된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 158 bp의 PCR 산물을 증폭하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 160 bp의 PCR 산물을 증폭하며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 176 bp의 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 검출용 키트는 실시간-PCR(RT-PCR) 키트일 수 있다. 구체적으로, RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 칩(chip)을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "바이오 칩(chip)"은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.
바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.
바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이 상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험예 1. EzBioCloud의 비교 유전체(comparative genomics) 분석
대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 치료 또는 개선효과를 갖는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 특이적 검출을 위해, 프라이머를 설계하고자 하였다.
우선, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 EZbiocloud( 통해 염기분석을 진행하여, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과 Orthologous average nucleotide identity(OrthoANI)에서의 Core size가 95% 이상인 4개의 균주를 선별하였다. Lactobacillus에 속하는 4종 strain(DSM 20017, DSM 15831, DS4, DSM 20019)은 각 균주간의 차이를 거의 확인할 수 없을 정도로 매우 유사하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트 조성물의 정확도를 위한 비교군으로 사용하였다(표 1, 도 1).
도 1은 유전체 염기서열의 상관도를 분석하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과의 계통학적 유연관계를 OrthoANI 값을 이용해 클러스터링한 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)와 계통학적으로 매우 유사한 4종의 균주를 확인하였다.
| 구분 | Strain name | Taxon name | Source |
| 표적 균주 |
K040706 | Lactobacillus sakei | Korean traditional food |
| 비교군 1 | DSM 20017 | Latilactobacillus sakei subsp. sakei | Moto (Starter of sake) |
| 비교군 2 | DSM 15831 | Latilactobacillus sakei subsp. carnosus | fermented meat produkt |
| 비교군 3 | DS4 | Latilactobacillus sakei | Korean kimchi |
| 비교군 4 | DSM 20019 | Latilactobacillus curvatus | milk |
실험예 2. 범유전체(Pan genome) 분석
다음, 상기 4종의 균주와 락토바실러스 사케이 K040706의 범유전체(Pan genome) 분석을 수행하여, 락토바실러스 사케이 K040706 만의 특이적인 서열을 확인하였다. 범유전체(Pan genome) 분석은, 상동 유전자(Homologous gene) 분석을 통하여 유사도 95 이상인 CDSs(Coding sequences)를 확인하고, 유사한 유전자는 Core로 표시하고, 유사도 90에서 95 사이인 유전자는 Shell gene으로 표현하여 수행되었다. 상기 Core 또는 Shell gene에 포함되지 않는 낮은 유사도를 갖는 서열을 Strain specific strain인 서열로 확인하였다(도 2)(서열번호 1).
도 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 및 표 1에 나타낸 4종의 균주의 범유전체(Pan-Genome) 분석을 통한 Strain specific CDSs를 분석한 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)만의 특이적인 81개의 CDS(단백질 코딩 유전자)를 확인하였다.
실험예 3. 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 특이적 유전자 분석
실험예 2로부터 분석된 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 81개 CDS 서열을 NCBI BLAST() 검색하여, 유의미한 유전자가 있는지 확인하였다.
NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 검색결과, 다른 균주에서 확인되지 않는 3 가지 서열(K040706_02017, K040706_02018, K040706_02019)을 선별하였다(도 3, 4, 5)(서열번호 2, 3, 4). 상기 서열번호 2, 3, 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자는 모두 Hypothesis gene으로 아직 그 기능이 확인되지 않은 것이다.
도 3은 서열번호 2로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이고, 도 4는 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이며, 도 5는 서열번호 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 3 내지 5에 나타난 바와 같이 서열번호 2 내지 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자와 동일하거나 유사한 서열이 락토바실러스 사케이 종에서는 존재하지 않는 것을 확인하였다.
실험예 6.
락토바실러스 사케이 K040706(
Lactobacillus sakei
K040706) 검출용 프라이머(primer) 세트 조성물의 분석
프라이머(primer) 세트 조성물 제조
실험예 5에서 확인한, 서열번호 2, 3, 4에 결합하는 특이적인 프라이버 세트를 제작하여 표 2에 나타내었다. 프라이머 디자인은 NCBI의 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 디자인하였다.
| 구분 | 서열번호 | Primer | Primer sequence | Target band size (bp) |
| 실시예 1 | 5 | 2017_F | 5’-AAGAGTTCGGATGGCAGCAA-3’ | 158 |
| 6 | 2017_R | 5’-CGCTATCCGATAAGCTCGCA-3’ | ||
| 실시예 2 | 7 | 2018_F | 5’-ATGGGTAAAATGATTCACTCGAAATATG-3’ | 160 |
| 8 | 2018_R | 5’-TTATCTATTGGCCACTCTTCTATT -3’ | ||
| 실시예 3 | 9 | 2019_F | 5’-GAAAAGGGATGCGATTGCCG -3’ | 176 |
| 10 | 2019_R | 5’-ATCACCCACCACTTGCCAAT -3’ |
PCR 분석
상기 실시예 1, 2, 3의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)에 대해 PCR을 진행하였다.
PCR을 진행하기에 앞서, 프라이머 세트 조성물의 정확도를 확인하기 위하여, 본 발명의 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)와 락토바실러스 사케이에 속하는 6종의 균주를 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 24 시간동안 각각 배양하여 비교대상으로 사용하였다. 또한 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)를 가열하여 비활성한 시료에 대해서도 실험을 진행하였다(표 3).
| Lane | Strain | Strain number | Sample Character |
| 1 | Lactobacillus sakei | K040706 | Genome |
| 2 | Lactobacillus sakei | K040706 | Heat inactivated |
| 3 | Lactobacillus sakei | KACC17865 | Genome |
| 4 | Lactobacillus sakei | KACC17868 | Genome |
| 5 | Lactobacillus sakei | KACC17871 | Genome |
| 6 | Lactobacillus sakei | KACC18352 | Genome |
| 7 | Lactobacillus sakei | KACC17864 | Genome |
| 8 | Lactobacillus sakei | KACC16119 | Genome |
상기 배양액을 각각 회소한 후, 원심분리(13,000 x g, 10 min)하여 균체를 분리하고 QIAmp DNA mini kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고, 추출 조건은 2 g/L Lysozyme buffer를 이용하여 Gram 양성균인 락토바실러스 사케이의 표면을 녹이는 전처리를 수행한 후, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 각각의 DNA를 추출하였다. 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)의 경우, Autoclave를 통하여 사멸시킨 다음 DNA를 추출하였다.
PCR 증폭 반응은 T100™ Thermal Cycler(BIO-RAD, USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 BioFACT™ Pfu DNA Polymerase(BIOFACT, Korea)를 이용하였다. PCR 조성물은 제조사가 제공하는 조건에서 진행하였다. PCR 증폭 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃ 10초, 55 ℃ 10초, 72 ℃ 40초를 1 사이클로 30회 반복하였다. 전기영동의 경우 2% Agarose(E&S, Korea) 조건에서 MINIE-135(Miulab, China)를 수행하였다.
도 6은 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트를 이용하여 다양한 균종드로부터 추출한 DNA 샘플들에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Lane L은 마커이고, Lane 1은 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)이고, Lane 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)이며, Lane 3은 KACC17865 균주이며, Lane 4는 KACC17868 균주이며, Lane 5는 KACC17871 균주이며, Lane 6은 KACC18352 균주이며, Lane 7은 KACC17864 균주이며, Lane 8은 KACC16119 균주이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 모두 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)를 제외하고는 그 어디에서도 밴드가 관찰되지 않았다. 즉, 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 중에서 어느 것을 사용하더라도, 락토바실러스 사케이 K040706에 특이적으로 각각 158, 160, 176 bp 크기의 PCR 산물을 생성한다는 것을 확인할 수 있다.
게다가 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물은 사균화된 샘플 시료에서도 특이적으로 PCR 산물을 증폭함을 확인할 수 있었다. 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 중에서도 실시예 2의 프라이머 세트 조성물이 가장 분명한 밴드를 형성한다는 것을 확인하였다.
실험예 7. 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR 분석
본 발명자들은 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 실시예 2의 조성물을 이용한 정확도를 확인하기 위하여 락토바실러스 사케이 K040706의 DNA 수준에서 검정하였다.
구체적으로, 실험예 6에서와 같이 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 DNA를 준비한 후, 상기 추출한 DNA 양을 100 μg 내지 10 ng까지 다양하게 희석시킨 후, 실시예 2의 프라이머 세트 조성물을 이용한 실시간 PCR을 수행하였다.
실시간 PCR 증폭반응을 수행하였다. PCR 혼합액은 SYBRㄾ Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo, Japan)를 사용하였고, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였으며, 플레이트에서 20 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)은 Applied Biosystems™ 7500(Applied Biosystems, USA)을 사용해서 실시하였으며, 구체적인 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초간 72 ℃에서 30초를 1 사이클로 40회 반복하였다. 플레이트로부터 방출된 형광 데이터(fluorescence data)는 7500 system SDSsoftware v1.3.0에 의해 분석되었다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72부터 95까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 각각의 Ct 값(Cycle threshold, Ct value)은 세 번씩 수행해서 나온 수치의 평균값을 구하였다.
도 7은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR CT 그래프 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 실시간 PCR의 표준 검량선이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 표준 검량선의 R2(Regression coefficient) 값이 0.998인 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 표준 검량선은 상관지수(R2)가 1에 가까운 이상적인 그래프라는 것을 알 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 적정범위의 유효한 데이터를 얻을 수 있으며, 100 μg 내지 10 ng까지 측정가능하다는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 용융 그래프(melting curve)이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 피크는 85.01 ℃에서 검출되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706에 대해 PCR 산물이 특이적으로 결합 및 형성됨을 알 수 있다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus sakei K040706
<400> 1
aatacaaaac tgtttttgct tgtctcgtaa gtctgcgtta cttattaaat cagttgttgt 60
tttacttatt tttttagtct cactattaaa aggagcgctc cctttatgtt taggagcgct 120
ccttttgtgt tcttcatccc acttgtcttg ggacttccat tttctaaccg tggaactagt 180
aactccgagc tcttcagcaa tatcctttag tggtcggttc ccaccagagt ctttccataa 240
ctgtagcgcc ttatcccgat taggatttct aggtttgggc actcatatca ccacctcact 300
atctttgttt attgatcatc gcttccgctt caagtaatat tttcaaatca ttagctgttg 360
ttaattttat ctggccgttt ttaaagttac tcacccactg gccaacgccg gcacgtacta 420
tcttttgata ttcatctagt tcttcttcac gcaataattg ttgttctatt tctaaatcaa 480
tgagttcttc atttggattg ctcattgtca acgcctcggc tttcccatat aatggttaac 540
gagatagcgt gctttgtaaa accagcgctg gtcgttacgc tatctcaggc cggaggcgtt 600
tagctgtcgg tttgaatgag gtcgggtgtg tcagcactcg gcctttttca atgcaaaaaa 660
ataggcccaa ctagaattga gtctaaacat attgttcaat atctgcgtat tcttgataag 720
tgattactcc tgcatcccat aatacaagtg caagtctcaa atcaccgaaa gccttaactc 780
tatcgcgaaa tacataagcg cctgccaatt ctaactctct aactaattta gttgctaaaa 840
ctgcagaaca ttgatcatcg aaccaaatat gtgtttcttt acctttaaca ttaaactttg 900
ccatcttcat tattaatcac tccttattcg ttgaccacat catagctctg tatacctgat 960
acatcaacgt ttataagcaa cttaattaat tttaacagct ttgtttccgg taaagtcttc 1020
ccaccgtttg ataatggtgt ccacatatcg cggatctaac tccatcaagt aagcgttgcg 1080
gccattttgc tcacaggcca ttagggttgt tcctgaaccg ccaaaactat ctagtacgtt 1140
gtcgcctgac ttcgtactat ttttaatttg gtaatcaaat aaaggaacag gtttcattgt 1200
gggatgcaac tcactggctg ccggcttatc gaagttcaac accgttgttt gtttacgatc 1260
cgtgaaccat gagtgcgttc cttcgttcca accatacaag caaggttcat gctgccattg 1320
ataatcttgc cgacctagcg taaacatatt tttatgccag ataagcgttt gacgcaattg 1380
ccagttaact tctcttatgg caccttcaaa gttatagcgt tctgtatctg catgccaaat 1440
ataaaaggct gctcccgact tcataacgct cttagctgca gtaaatgcat taacaaggaa 1500
ttgtctaaac gcatcacttt ccatcgagtc attcataatc ttcaaatggt cttctgtttg 1560
accctcgtaa tcaatgttat atggtgggtc cgttagcaat aggtccgctt gttgcccgcc 1620
catgagcttt tcaacatcgt ttgcattggt tgaatcacca cacattaatc tatgattacc 1680
caattgataa atctctccga cctttgaaac aggatcttca acaactgcac catcatactc 1740
atcatctgca acagggatgt cgacatcatt taattcaata tccgtaaatc caaggccgct 1800
taaatcaacg tcatcaatac tattaatttc gacctgcagt ttttctagtt cccaatcagc 1860
aagctctcct gtacgattat ccgctatccg ataagctcgc accttgtctt cggataaatt 1920
agcaactgtt actggtactt catcaaggcc aagtaactta gcagccttta atcgcgtatg 1980
gccaactaca atcacacctt cgttatcaac cacaattggt tgctgccatc cgaactcttt 2040
aatagactgc gccgtgggtt caacagcggc ttcgttatta cgtggattgt tctcataagg 2100
aacaacctta tctattggcc actcttctat tttcatcttg accctcactc ttcttttttg 2160
agttatccgc tttcttttca ttactgagcc acttatcaag ccttgcaaac attccagtcg 2220
cctcacgcgt ctcgtaccca tatttcgagt gaatcatttt acccatgatt aatcacccac 2280
cacttgccaa tcttctctaa acagttcgat gttggtttct ttccaaggta cccgaccaaa 2340
tcgactttca acatacaaat aaggtgctgt catcttacta tatttatctg gtttctgaac 2400
ccgtactaca acatcttttg accactgcgg caatcgcatc ccttttccaa cctttactgc 2460
ttcaaacgcc tgtccaaaat tcatagtgac ttctccttat agatcatatt taatattttt 2520
ccatttttta tatgcatcga agtacaattc ttttttatcc ccgttatacg taacttcgta 2580
atacatccca tcgctaagtg gcgtacttaa taatgccttg ttgttttgca aagctttaac 2640
tgaccaaact acaaacacat catcaggtgt aatgctaatc ccatctgttt tgtcg 2695
<210> 2
<211> 1155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus sakei K040706
<400> 2
atgaaaatag aagagtggcc aatagataag gttgttcctt atgagaacaa tccacgtaat 60
aacgaagccg ctgttgaacc cacggcgcag tctattaaag agttcggatg gcagcaacca 120
attgtggttg ataacgaagg tgtgattgta gttggccata cgcgattaaa ggctgctaag 180
ttacttggcc ttgatgaagt accagtaaca gttgctaatt tatccgaaga caaggtgcga 240
gcttatcgga tagcggataa tcgtacagga gagcttgctg attgggaact agaaaaactg 300
caggtcgaaa ttaatagtat tgatgacgtt gatttaagcg gccttggatt tacggatatt 360
gaattaaatg atgtcgacat ccctgttgca gatgatgagt atgatggtgc agttgttgaa 420
gatcctgttt caaaggtcgg agagatttat caattgggta atcatagatt aatgtgtggt 480
gattcaacca atgcaaacga tgttgaaaag ctcatgggcg ggcaacaagc ggacctattg 540
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gctaagagcg ttatgaagtc gggagcagcc ttttatattt ggcatgcaga tacagaacgc 720
tataactttg aaggtgccat aagagaagtt aactggcaat tgcgtcaaac gcttatctgg 780
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gattaccaaa ttaaaaatag tacgaagtca ggcgacaacg tactagatag ttttggcggt 1020
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gttaaaatta attaa 1155
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<212> DNA
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gagggtcaag atgaaaatag aagagtggcc aatagataa 159
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Lactobacillus sakei K040706
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tggtcaaaag atgttgtagt acgggttcag aaaccagata aatatagtaa gatgacagca 120
ccttatttgt atgttgaaag tcgatttggt cgggtacctt ggaaagaaac caacatcgaa 180
ctgtttagag aagattggca agtggtgggt gattaa 216
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaaagggat gcgattgccg 20
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<212> DNA
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<223> K040706_2019_R
<400> 10
atcacccacc acttgccaat 20
Claims (11)
- 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물.
- a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법. - 제5항에 있어서,
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법. - 제5항에 있어서,
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법. - 제5항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법. - 제5항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 함유된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 검출 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 키트.
- 제10항에 있어서,
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 PCR 키트.
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