WO2003025155A1

WO2003025155A1 - Produit de fermentation de cryptoporus volvatus et son procede de preparation et utilisation

Info

Publication number: WO2003025155A1
Application number: PCT/CN2002/000508
Authority: WO
Inventors: Xinjun Guo; Chuankui Ke
Original assignee: Hangzhou Tsbio Science & Technology Co., Ltd.
Priority date: 2001-08-17
Filing date: 2002-07-22
Publication date: 2003-03-27
Also published as: CN1405314A; KR20040032920A; EP1422292A1; CN1539010A; US20040241184A1; CA2460460A1; WO2003025155A8; EP1422292A4; JP2005502379A; NO20040679L

Description

隐孔菌发酵产物及其制备方法和应用技术领域

本发明涉及一种隐孔菌发酵产物及其制备方法和其在药物制备中的应用。技术背景

隐孔菌（Cryptoporus volvatus (Peck) Schear), 又名：松橄榄、树疙瘩、荷色菌、木鱼菌、香木兰、一口耳，属于担子菌亚门（Basidiomycotina), 层菌纲（ Hymenomycetes )，非褶目（ Aphyllophorales )，多孔菌科

(Polyporaceae) , 隐孔菌属（ Cryptoporus )。属于木腐菌，生长在松树枯木的背影面，或倒木的向地面。入药部位为新鲜或干燥的子实体、菌丝体和深层培养的代谢产物。分布于中国的河北、四川、云南、江苏、湖北、广西、福建、海南、吉林等省、朝鲜、日本、欧洲、北美。其野生子实体的药用文献已有记载，隐孔菌含多糖蛋白、麦角醇、极苦的倍半萜类化合物和芳香物质。蓝茂（1397-1476)在《滇南本草》中记载： "松橄榄味苦甘，性微寒。治大肠下血、积热之毒。疗九种痔疮。于疼牙上咬住，疼即止。"应建浙等

( 1987) 《中国药用真菌图鉴》载： "用水煎服，以治疗气管炎和哮喘，此外还有消炎作用。" 《中华本草》记载： "味微苦，性平。有止咳、平喘、解毒等功能。用于治疗气管炎、哮喘"。韩国的李氏等人（1981 年）报道，隐孔菌的热水提取物中含有抗肿瘤活性的多糖蛋白。日本的桥本敏泓等人（1988 年)，浅川羲范等人（1988年）从隐孔菌子实体中分离纯化了 7种有强烈苦味的倍半萜类化合物（sesquiterpenoids), 即隐孔酸甲、乙、丙、丁、戊、己、庚（cryptoporic acid A、 B、 C D、 E、 F、 G)。用小白鼠进行试验，结果表明 cryptoporic acid C、 E、 F、 G对小白鼠因受刺激从腹腔巨噬细胞释放出来的氧自由基有强烈抑制作用。隐孔菌的植物形态、生态环境、生物学特性、药用功效等已在国内外文献杂志中有详细的报道，如《药用真菌隐孔菌的生物学特性研究》（作者：华启洪、孙静、沈礼， "中国中药杂志" 1991 年第 16卷第 12期）等。 2000年，臧木等的研究表明分布于中国的主要为中华隐孔菌（Cryptoporus sinensis Sheng H. Wu & M. Zang)。由于隐孔菌生态环境严格，子实体很难采集，蕴藏量少，资源紧缺，人工培养子实体有很大的难度，所以此菌的药用价值尚未得到重视，目前尚未有与此真菌有关的药材标准。

很早以前，人们就已经认识到机体接触某些物质后会产生异乎寻常的反应，如水肿、皮痒、哮喘等症状，甚至导致死亡。 1819年， John Bostock首先描述了枯草热。 1873年 Charles Blokley认识到花粉是枯草热的致病因子。 1906年，奥地利医生 Clemens vo Pirquet发现少数病人接受血清治疗后病情得不到好转，反而出现高烧、全身性***肿大、关节疼痛、肝脾肿大、肾功能衰竭等症状，据此提出了***反应 "Allergy"—词。 1921年， Prausnitz和 Kustner发现过敏性疾病体内存在着一种可转移至正常人组织使之过敏的致敏因子。 1963年， P. C. H. Cell和 R. R. A. Coombs将***反应病进行更合理的分型，将其分为四型。 1966年，美籍日本人石坂夫妇（Kimishige Ishizaka 和 Teruko Ishizaka) 首先发现了速发型***反应的抗体 lgE。目前， ***反应已成为一门独立学科，慢性过敏性炎症概念的提出使人们对 I型***反应有了更深入的认识。

流行病学调查统计表明，在各种***反应性疾患中，过敏性皮肤病发病率最高，约占 44%，其中以荨麻疹、血管神经性水肿、异位性皮炎、接触性皮炎、药物疹最为多见。各种呼吸道过敏病约占人群 11%，其中支气管病人占 4.6%，过敏性鼻炎占 6.7%，各种药物过敏占 3.2%，胃肠道过敏约占 1% —2%, 其他各种各样少见的过敏性疾患约占 5%。近 30年以来，随着经济的发展以及生活水平的提高，过敏性疾病在世界范围内明显增加。

过敏性疾病的发病主要涉及过敏原、抗体、细胞、受体和介质 5个环节。引起过敏的物质很多，如花粉、屋尘、食物、真菌、药物、人与动物皮屑、羽毛、昆虫、寄生虫及其他化学物质等，它们通过吸入、食入、注射、或接触使机体致敏，诱发 B细胞产生 IgE抗体， IgE抗体与肥大细胞、嗜酸性粒细胞等靶细胞表面的受体结合。当机体再次接触相同的抗原，后者与结合在靶细胞上的 IgE抗体发生特异反应，当特异性抗原与两个以上的 IgE分子结合就可能发生桥联反应，即双价或多价抗原分子和两个以上的 IgE分子靠近而发生构型改变，继而导致 IgE受体聚集，介导细胞脱颗粒。细胞脱颗粒后释放血管活性物质及某些酶类，可引起平滑肌收缩、黏液分泌、血压降低及组织损伤等。另外，过敏原也可由亲细胞性的 IgE抗体介导激活嗜酸性粒细胞而释放大量炎症因子，如白三烯， ***素、血栓素 A2，细胞因子等，从而导致皮肤、支气管黏膜、鼻黏膜和胃肠黏膜产生炎症。

在各种过敏性疾病中哮喘的发病机制在最近几年取得了很大进展。哮喘是由肥大细胞、嗜酸性细胞、 T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症。这种炎症使易感者对多种激发因子具有气道高反应，并可引起气道狭窄，表现为反复发作性喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）清晨发作、加剧，常常出现广泛多变的可逆性气流受限，多数患者可自行缓解或经治疗缓解。

哮喘发病机理的观点是一种涉及到气道壁的特定性的慢性炎症过程，它可引起气流受限和反应性增高，从而对不同的剌激物反应时气道更加狭窄。气道炎症的典型特点是呼吸道黏膜及管腔中活性的嗜酸性粒细胞、肥大细胞和 T淋巴细胞数目增多和基底膜网质层增厚、上皮下纤维增生。研究表明反复出现哮喘症状和以哮喘肺功能异常为特点的可逆性气流受限与炎症反应升高相关。引起哮喘发生的危险因素有：倾向性因素有特应性和性别，致病因素有室内变应原（室尘螨、动物变应原、蟑螂变应原、真菌)、室外变应原 (花粉、真菌）、阿司匹林、职业性致敏物质，促成因素有呼吸道感染、低出生体重、膳食、空气污染（室外污染物、室内污染物）、吸烟（主动吸烟、被动吸烟）。

近 20 年以来，世界各国的哮喘患病率及哮喘死亡率有所上升，有资料提示全球现有 1.5 亿哮喘患者，每年有 10万人不必要地死于哮喘病，哮喘不仅影响身体发育和健康，还会影响心理发展，包括自尊。哮喘这种长期的疾病会给个人和社会造成多方面的负担，生活质量降低或影响全身健康，进行性的能力丧失和早死，同时降低生产力和增加医疗费用。因此哮喘是一个主要的公共卫生问题，值得弓 I起政府和公共***门的关注。

哮喘是一种慢性的气道炎症性患疾，最有效的控制就是通过消除诱发因素来防止炎症的发生。哮喘的药物治疗是用来逆转及预防症状和气流受限的，包括控制药物和缓解药物。控制药物用于持续性哮喘，包括抗炎药和长效支气管扩张剂。抗炎药是目前最有效的控制药物，主要有皮质激素，它能在一方面或几方面来控制哮喘，但有严重副作用。支气管扩张剂通过松弛气道平滑肌来扩张气道。虽然支气管扩张剂能逆转或抑制支气管的收缩，但是它不能逆转气道炎症和气道高反应。目前还开发一些和白三烯的作用有关的药物，如白三烯拮抗剂，生物合成中的一种关键酶阻抗剂以及一种平滑肌细胞或其它细胞表面的脂类受体阻抗剂，阻止脂类物质与平滑肌细胞结合，从而封闭白三烯的生物活性。

因此，如何利用隐孔菌具有的药用功能，提供一种隐孔菌的发酵产物，用于制备预防和治疗过敏性疾病如哮喘的药物，将具有十分重要的意义。发明目的

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种隐孔菌发酵产物，以克服现有药物存在的严重副作用、不能逆转气道炎症和气道高反应的缺陷。获得的发酵产物所制备的预防和治疗控制过敏性疾病如哮喘的药物具有高效、专一、无副作用的特点，可降低病人对激素类药物的依赖性，减少激素用量，改善患者生活质量。

本发明需要解决的技术问题之二是提供上述发酵产物的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之三是公开上述发酵产物在制备预防和治疗过敏性疾病如哮喘的药物中的应用。发明概要

本发明的隐孔菌发酵产物为一种菌丝体和发酵上清液的混合物，该发酵混合物的干重为 5~50g/1000ml，多糖含量 3~10%，挥发性醚浸出物含量为 0.05-0.15%, 总生物碱含量为 0.03~0.25%。多糖、挥发性醚浸出物和总生物碱的分析方法如下：

(1) 总多糖

取发酵混合物粉末 10g，加入 200ml蒸馏水，煮沸提取 30min，过滤，滤渣中再加入 100ml蒸馏水，如前操作。合并两次提取的滤液，适当浓缩后置于截留分子量为 1万的透析袋中透析 3天，去除溶液中的小分子物质，取出浓缩到 10ml。

取浓縮液少量，加 Molish试剂反应，结果硫酸和水溶液界面有紫色或综红色圆环出现，表明本药材中含有多糖成分。

取浓缩液少量，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以希夫试剂染色，结果有连续的电泳条带，表明有分子量不同的多糖存在。

取浓缩液少量，做苯胺兰沉淀试验反应，结果发现有醇不溶性的蓝色沉淀，表明有 β -1,3葡聚糖存在。

取浓缩液 lml，稀释 200倍，用硫酸一苯酚法测定糖含量，结果每毫升浓缩液中含有多糖 30~100mg，即发酵混合物中含有多糖 3〜10%。

(2)挥发性醚浸出物

植物中提取的挥发油已经在临床上作为祛痰、发汗、镇咳或利尿的药物应用，并具有杀菌或抑菌的功效。从隐孔菌中得到的挥发油中棕榈酸的相对含量较高，而棕榈酸有抗炎、抑菌的作用和较强的镇痛活性。挥发油中的倍半萜化合物有抗菌、消炎、镇痛、平喘等作用。说明隐孔菌挥发油中存在多种与临床疗效相关的有效成分。

具体的方法如下：取发酵物粉末 3g，精密称定，置 50ml三角瓶中，加入 20ml***振摇 12小时，静置分取***层，置干燥至恒重的蒸发皿中，重复加入***，至***提取液无色，放置挥去***，置硫酸干燥器中干燥 18 小时，精密称定，缓缓加热至 105Ό , 并干燥至恒重。其减失的重量即为挥发性醚浸出物的重量，计算即得结果（见表 1 )。表 1，挥发性醚浸出物含量测定

(010302Y、 010306Y、 010307Y为制备的三批样品）

(3) 总生物碱

生物碱类化合物大多具有生理活性，往往是许多中草药及药用植物的有效成分，具有镇痛、止咳、平喘、抗菌消炎、松弛平滑肌等作用。本发明将发酵上清用氨水调 ρΗ>9，用氯仿多次萃取，水浴蒸馏除去氯仿得到总生物碱，并对所提取的生物碱进行定性和定量检测

三种沉淀试剂的反应：

与碘化铋钾试液反应，有橘黄色沉淀；与磷钼酸试液反应，有黄绿色沉淀，反应迅速；与硅钨酸（5%) 反应，有白色沉淀，反应迅速。

进行薄层层析 TLC分析：

.进行 TLC试验所用薄层板是硅胶 GF254板（200mm X 50mm)，用甲苯 -丙酮 -乙醇 -浓氨水试液（20: 20： 3： 1 ) 为展开剂，在紫外灯下进行检视，可以看到分离较好的斑点，斑点的重现性好。

对总生物碱进行定量检测的方法是酸性染料比色法。对照品溶液制备：精密称取***对照品 lmg，精密加入甲醇 lml，摇匀，即得（每 1ml中含有 *** lmg)。

供试品溶液制备：精密称取发酵物粉末 5g，用 1% H₂S0₄ 40ml提取 24 小时，加浓氨试液调节 pH至 9，用***提取 2次（40ml,40ml)，用氯仿提取 2 次（20ml,20ml)，合并有机溶剂，置温水浴上回收有机溶剂至近干，精密加入 20ml 酸水溶液（pH=3 )，挥尽有机溶剂，即得。绘制标准曲线：精密吸取对照品溶液， 20， 40， 60， 80， 100， 120 ul 分别置于 20ml分液漏斗中，精密加入 pH3.0的酸水溶液，至 lml，精密加入氯仿 5ml和溴甲酚绿试液（取溴甲酚绿 50mg与邻苯二甲酸氢钾 1.021g，加 0.2mol/L氢氧化钠溶液 6.0ml使溶解，再加水稀释至 100ml，摇匀） 1ml ，强力振摇 2min，静置，分取氯仿层，用分光光度法，在 420nm处测定吸收度，绘制标准曲线。样品测定：精密量取供试品溶液 400ul和 pH3.0的酸水溶液 600ul，置 20ml分液漏斗中，精密加入氯仿 5ml和溴甲酚绿试液 lml，强力振摇 2min，静置，分取氯仿层，用分光光度法，在 420nm处测定吸收度，计算即得结果（见表 2)。

表 2，样品总生物碱含量

(010302Y, 010306Y, 010307Y为三批隐孔菌发酵产物）

该发酵产物是这样制备的：

( 1 ) 菌种的活化：将 4°C条件下保存的隐孔菌菌种，通过无菌操作移植到以下培养基中，在真菌常规培养温度下无菌培养 3-10天，

培养基组分和重量百分含量为（％)：

葡萄糖 0.5-0.9

麦芽糖 0.5-2

蛋白胨 0.1-0.2

酵母粉 0.5-1

KH₂P0₄ 0.2-0.4

MgS0₄ · 7H₂0 0.2-0.5

维生素 0.05-0.1

琼脂 2.2-3.0 pH 4.5-5.0

其余成分为水

(2) 摇瓶培养：将上述活化的隐孔菌菌丝移入内装 150-200ml下述培养液的 500ml三角烧瓶中、在振荡频率为 100-200rpm、温度为 20°C-30°C条件下在摇床中振荡培养 6天；如需加大种量可再将菌丝液移入内装 750ml下述培养液的 3000ml三角烧瓶中、在振荡频率为 100-200rpm、温度为 20°C-30°C 条件下在摇床机中振荡培养 1-2天。

培养液组分和含量为：

葡萄糖 0.5-0.9

麦芽糖 0.5-2

蛋白胨 0.1-0.2

酵母粉 0.5-1

KH₂P0₄ 0.2-0.4

MgS0₄ · 7H₂0 0.2-0.5

维生素 0.05-0.1

pH 4.5—5.0

其余成分为水

(3 )液体发酵培养：在各种容量规格的发酵罐中装入等于或小于 70% 罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量 3-5%摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为 1： 0.1-1.0 (v/v/分钟）、叶轮搅拌速度为 100-200rpm、罐压大于 0.05kg/cm²,温度 20-30°C条件下发酵 1-10天。

培养液组分和重量百分含量为（％)：

葡萄糖 2.5-3.5

麦芽糖 0.5-2

玉米粉 0.3

蛋白胨 0.5

酵母粉 0.5-1 KH₂P0₄ 0.2-0.4

MgS0₄ · 7H₂0 0.2-0.5

维生素 0.05-0.1

pH 4.5—5.0

其余成分为水

(4) 将上述发酵罐内的隐孔菌发酵产物采用常规过滤方法过滤得到菌丝体和发酵液上清。隐孔菌菌丝体滤饼在 80-90°C条件下烘干，粉碎，过筛，得到颗粒小于 60目的隐孔菌菌粉。发酵上清液 70-80°C旋转蒸发浓缩至密度为 1.2-1.5克 /毫升。

3、临床应用及剂型

本发明获得的隐孔菌菌粉和发酵上清浓縮液可分别单独制成各种类型的药品和保健品或混合加工成各种药品和保健品。

如可将发酵上清浓缩液加热浓缩至稠膏状，加入菌粉并拌以 5%-50%的淀粉、微晶纤维素等辅料，搅拌均匀，烘干、粉碎，过 60 目筛，即得混合发酵产物。

本发明的发酵产物可以制备用于预防和治疗抗***反应药物，包括 I、 π、 III、 IV型***反应，尤其是发生在呼吸道、皮肤、胃肠道和眼的 I型***反应，如支气管哮喘炎、过敏性鼻炎、过敏性皮肤炎、药物过敏症、食物过敏症等，也可制备用于抗过敏的药物，如对花粉、尘螨、霉菌等过敏的疾病。

为了便于应用，可以将上述的发酵产物采用公知的方法，制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂。附图说明

图 1为样品对致敏豚鼠抗原攻击后肺机械功能的影响。

中华隐孔菌发酵产物对致敏豚鼠抗原攻击后气道阻力（RL) 影响。以抗原攻击前的气道阻力为 1005。与模型组比较， *P<0.05， **P<0.001 , ***P <0.001。

图 2为样品对致敏大鼠抗原攻击引起的肺灌洗液中白细胞总数的影响。与模型组比较， *P<0.05， **P<0.001 ;

T: 中华隐孔菌发酵产物提取物；

D: ***磷酸钠；

Κ: 酮替芬。

图 3 为样品对致敏大鼠抗原攻击引起的肺灌洗液中嗜酸性粒细胞的影响。

与模型组比较， *Ρ<0.05, **Ρ<0.001 ;

Τ: 中华隐孔菌发酵产物提取物；

D: ***磷酸钠；

Κ: 酮替芬。发明内容

以下将通过药理、毒理和临床试验数据对本发明的具体实施方式和应用 '进行说明。

( 1 ) 对致敏豚鼠抗原攻击后肺机械功能的影响

采用卵白蛋白 10mg后腿部肌内注射致敏豚鼠， 3-4 周后予以抗原攻击 ( 1%卵白蛋白）引起肺阻力（RL) 的变化来观察样品药效。结果表明中华隐孔菌发酵产物 TsOOOlpl样品 5.0g/kgxl0d对抗原攻击引起的 R_L增高有一定的抑制作用，在抗原攻击后 2min、 3min和 5min时有统计学差异（P<0.05)。阳性对照药 β₂激动药沙丁胺醇 7mg/kgxld，在抗原攻击后气道阻力反应最为严重的 lOmin内，各时相均有明显的抑制作用（P<0.05〜0.01 )，结果见图 1。

(2) 致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞变化采用卵白蛋白 2%凝胶溶液致敏，每只大鼠两后足掌、腹股沟、腰、背、颈、腋窝共十点，每点 0.05ml，皮下注射，同时腹腔注射 0.5ml。从致敏第 10天开始给药。受试物 A2、 B2、 C2或生理盐水溶液 0.5ml/kg，或*** (DXM) 0.5ml/kg，分别腹腔注射。 Al、 Bl 5g/kg, Cl、 2.5g/kg, 分别给予灌胃。以上受试药物均给药 10天。 A1 : 发酵菌丝体粉末， B1 : 发酵上清浓缩液， C1 : 子实体粉末， A2发酵菌丝体水提液， B2: 发酵浓缩液， C2: 子实体粉末水提液， ***磷酸钠。哮喘这种慢性气道炎症疾病，以支气管肺嗜酸性粒细胞显著升高为标志。嗜酸性粒细胞可释放几十种炎症物质，如细胞因子，白三烯、 ***素等。这些物质作用于气道产生炎症、水肿、损伤和增厚，使气道狭窄导致通气困难。因此，目前认为嗜酸性粒细胞是一个筛选平喘药物的靶点，能抑制气道嗜酸性粒细胞炎症的药物，就有可能成为预防和治疗哮喘的药物。本实验中 B物质（即发酵浓缩液）能较好的抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺部嗜酸性粒细胞的作用（见表 3 )。

表 3致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞变化

(与生理盐水组比较 *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

(3 ) 不同剂量的隐孔菌发酵产物对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌洗液中白细胞总数和嗜酸性粒细胞的影响。 SD大鼠 75只共分 8组，采用卵白蛋白 2%凝胶溶液致敏，每只大鼠四足掌皮下注射，每点 0.1ml, 10天后再重复致敏一次。从致敏第 14天开始给药。受试物隐孔菌发酵产物 T提取物或生理盐水溶液 lml/100g.灌胃，或 *** 0.5mg/kg腹腔注射，或酮替芬 5mg/kg灌胃，受试药物均给药 7天。从致敏第 14天，给药后 1小时抗原攻击，每日一次，共 7次，其中设计一组致敏不攻击抗原对照组，以生理盐水替代。攻击结束后收集支气管肺灌洗液，计数白细胞总数和嗜酸性粒细胞数。结果模型组抗原攻击后，与致敏不攻击的大鼠比较，白细胞总数和嗜酸性粒细胞明显增多，表明致敏大鼠抗原攻击有非常明显的过敏炎症反应过程。中华隐孔菌发酵产物呈剂量依赖性地抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞升高，抑制嗜酸性粒细胞 ID₅。（95%可信限） =0.15 (0.11-0.21 ) g kg, 抑制白细胞总数 ID₅₀ (95%可信限） =1.11 (0·73〜1·70) g/kg, 结果见图 2、 3。。

(4) 对大鼠多形核粒细胞释放白三烯的影响

药物采用肌肉注射，每天注射 2次，每次 0.5ml/kg，连续 5天。收集大鼠腹腔中的多形核粒细胞，以 Calcium ionopHore A23187诱导多形核粒细胞释放白三烯，用 Leukotriene C4 EIA Kit测定白三烯 LTC₄的含量。 A ：发酵上清浓缩液经 90%乙醇沉淀后的上清液， B: 发酵上清浓缩液 90%乙醇的沉淀物， C: 发酵上清浓縮液。结果三组药物均能明显抑制 LTC₄释放，与生理盐水对照组比较有显著性差异（P 〈0.01〉，表明该组药物能较好地抑制气道炎性介质的释放（见表 4)。

表 4对大鼠多形核粒细胞释放白三烯的影响

(与生理盐水组比较 **Ρ<0.01)

(5 ) 初步分离物对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的影响

采用卵白蛋白 2%凝胶溶液致敏，药物从致敏第 10天给药，受试药物或生理盐水 10ml/kg灌胃，或*** （DMX) 0.5mg/kg腹腔注射。受试药物均给药 10 天。 A: 发酵产物提取的总多糖， B: 发酵产物提取的总生物碱， C: 发酵产物提取的挥发油， D ：发酵产物提取的有机酸， E: 发酵产物提取的水提液，阳性对照物： ***。结果受试药物 A 即发酵产物中提取的总多糖能较好的抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺部嗜酸性粒细胞炎症的作用，受试药物 C即发酵产物中提取的挥发油的作用也很强（见表 5 )。

表 5对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的影响

(与生理盐水组比较 *P<0.05,**P<0.01，***P<0.001)

(6)对枸橼酸引起的豚鼠咳嗽反射的影响

将豚鼠放入体积描记盒稳定 1 min后，用超声雾化器气雾 15 %枸橼酸 2 min, 选出即刻起 10 min内的咳嗽次数在 10次以上的豚鼠。将选出的豚鼠按咳嗽次数均匀搭配分 5组后，分别给予受试药物 CVFS 0.3 g' g K 0.9 g-kg- 2.7 g.kg·¹、阳性对照药磷酸可待因 lOmg.kg- 及对照组以生理盐水 lOml.kg-¹ 灌胃（i.g)，每天一次，共 3天，末次给药 l h后，按上述方法引咳，计数自气雾开始 10 min内的咳嗽次数。结果表明 CVFS对枸橡酸引起的豚鼠咳嗽反射有明显抑制作用， ID₅。（95%可信限）为 0.82 (0.64-1.04) g-kg^ o 磷酸可待因 lO mg.kg-¹组对枸橼酸引起的豚鼠咳嗽反射抑制率为 67.4% (p<0.01 ), 见表 6。

表 6发酵产物对枸橡酸引起的豚鼠咳嗽反射的抑制作用（ S) 组另 IJ n 剂量咳嗽次数咳嗽次数

( Omi 内）

抑制 / % 生理盐水对照组 9 lOml-kg-' 28.8± 11.0 磷酸可待因组 8 10mg-kg-¹ 9.4 ±8.0" 67.4 发酵产物 8 0.3g-kg-' 22.3 ±8.3 22.6 发酵产物 8 0.9 g-kg ¹ 11.1 ±8.4** 61.5 发酵产物 9 2.7 g-kg'¹ 7.9 ±6.5" 72.6

(注：统计方法： Student-Newman-Keuls，与生理盐水组比较 P<0.01。） (7) 发酵产物小鼠急性毒性试验

昆明种小鼠 115只，中华隐孔菌提取物以 45g kg 的剂量灌胃给药，给药前禁食 12小时，连续给药 8天，结果动物死亡率为 0，未见其它毒性反应，小鼠的最大耐受量（MTD) 为 45g/kg。

由上述公开的内容可见，本发明的隐孔菌发酵产物对炎症细胞和哮喘具有十分显著的抑制和治疗作用，且无毒副作用，制备方法十分简单，易于大规模工业化生产，解决了隐孔菌这一药用资源从自然界获取受到限制的问题。以下将通过实施例对本发明的具体实施方式进行进一步的说明。

实施例 1

斜面隐孔菌菌种的培养方法为：将 4Ό条件下保存的隐孔菌菌种，通过无菌操作移植到以下培养基中，在真菌常规培养温度下无菌培养 2-10天，培养基组分和重量百分含量为（％)：

葡萄糖 1.5

麦芽糖 0.6

蛋白胨 0.2

酵母粉 1.4

ΚΗ,ΡΟ. 0.3 MgS0₄ · 7H₂0 0.1

维生素 0.03

琼脂 2.2

其余成分为水

pH5.0

菌体生长情况：菌丝浓密，白色，放射性生长，生长速度快。实施例 2

斜面隐孔菌菌种的培养方法为：将 4°C条件下保存的隐孔菌菌种，通过无菌操作移植到以下培养基中，在真菌常规培养温度下无菌培养 8-10天，培养基组分和重量百分含量为（％)：

葡萄糖 1.5

麦芽糖 0.6

蛋白胨 0.04

酵母粉 0.3

KH₂P0₄ 0.3

MgS0₄ · 7H₂0 0.1

维生素 0.03

琼脂 2.2

其余成分为水

H 5.0

菌体生长情况：菌丝稀疏，纤细，白色，放射生长，生长速度较快。实施例 3

将活化隐孔菌菌种的菌丝移入内装 150ml下述液体培养基的 500ml三角瓶中，用旋转式摇床振荡培养，旋转速度为 lOOrpm, 在 28°C下培养 6天。

基本液体培养基配方：

葡萄糖： 20 g 蛋白胨： 10g

酵母粉： 3g

磷酸二氢钾： lg

硫酸镁： 0.5g

水： 1000 ml

上述培养基的 pH为 5.5。

菌体生长状况：培养液澄清，菌体生长旺盛，菌丝球数大小均一充满整个培养基。实施例 4

取发酵菌丝体粉末 20g，加入 400ml蒸馏水，煮沸提取 30min，过滤，滤渣中再加入 200ml蒸馏水，如前操作。合并两次提取的滤液，再加入 100ml 发酵浓缩液上请，置于截留分子量为 1万的透析袋中对 10mM pH6.0的醋酸 -醋酸钠缓冲液 2000ml透析 3天，每天更换一次外透液，去除溶液中的小分子物质，取出浓縮到 100ml。动物实验分析该多糖组分对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞变化（结果见表。采用卵白蛋白 2%凝胶溶液致敏，每只大鼠两后足掌、腹股沟、腰、背、颈、腋窝共十点，每点 0.05ml，皮下注射，同时腹腔注射 0.5ml。从致敏第 10天开始给药。结果表明能较好的抑制致敏大鼠抗原攻击后支气管肺部嗜酸性粒细胞的作用。

表 7对致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的影响

(DXM为***，与生理盐水组比较 **P<0.01,***P<0.001) 实施例胶囊的制备方法：将发酵产物上清加热沸腾状态下浓缩至半固体状，加入菌丝体及 20%微晶纤维素在高速混合制粒机中混合， 40 目制粒。大颗粒可干燥后二次制粒。将颗粒置于烘箱小于 80°C烘干，定时翻料，至颗粒水分在 4%以下。 30目整粒，加 3 %滑石粉总混后灌装胶囊，装量 300mg/粒。抛光后包装。钴 60照射灭菌。实施例 6

片剂的制备方法：将发酵产物上清加热沸腾状态下浓缩至半固体状，加入菌丝体及 34%微晶纤维素、 17%预胶化淀粉在高速混合制粒机中混合， 10 目制粒。大颗粒可干燥后二次制粒。将颗粒置于烘箱， 80°C烘干，定时翻料，至颗粒水分在 1 %— 3 %。 12目整粒，加 3 %滑石粉总混后压片，装量 500mg/ 片。包薄膜彩衣。包装后钴 60照射灭菌。

Claims

权利要求

1. 一种隐孔菌发酵产物，其特征在于，先培养隐孔菌，然后进行发酵，获得发酵产物，该产物为一种菌丝体和发酵上清液的混合物，干重为 5~50g/l 000ml, 多糖含量 3〜10%，挥发性醚浸出物含量为 0.05〜0.15%，总生物碱含量为 0.03〜0.25%。

2. 如权利要求 1 所述的发酵产物，其特征在于，所述隐孔菌包括中华隐孑 L菌 (Cryptoporus sinensis Sheng H. Wu & M. Zang)、隐孑 L菌 ( Cryptoporus volvatus (Peck) Schear)和其它隐孔菌的种。

3. 如权利要求 1 所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵包括液体发酵和固体发酵，发酵产物包括隐孔菌液体和固体发酵培养的菌丝体和发酵上清液及其从其中提取的各种成分。

4. 如权利要求 3 所述的发酵产物，其特征在于，所述的成分包括多糖、挥发性醚浸出物含和生物碱。

5. 如权利要求 1 或 3 所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，先用无菌斜面培养基培养隐孔菌，然后进行液体或固体发酵，获得发酵产物。

6. 如权利要求 1 或 3 所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，该方法包括菌种的活化、摇瓶培养和液体或固体发酵培养。

7. 如权利要求 6 所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，菌种的活化是这样进行的：将隐孔菌菌种移植到含有浓度大于 0.05%的葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母粉、 KH₂P0₄、 MgS0₄ ' 7H₂0、维生素 B,、琼脂， pH3-7 的培养基上，在真菌常规培养温度下无菌培养 3-10天。

8. 如权利要求 6所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，摇瓶培养包括如下步骤：将上述活化的隐孔菌菌丝移入含有浓度大于 0.05%的葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母粉、 KH₂P0₄、 MgS0₄ ' 7H₂0、维生素 B pH3- 7的培养基中，在振荡频率为 50-200rpm、温度为 20°C-30°C条件下在摇床中振荡培养 2-10天。

9. 如权利要求 6 所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，液体发酵培养包括如下步骤：在发酵罐中装入含浓度大于 0.05%的葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母粉、 KH₂P0₄、 MgS0₄ - 7H₂0, pH3-7 的培养基，灭菌后移接摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为 1 : 0.1-1.0 (WW分钟）、叶轮搅拌速度小于 300rpm、罐压大于 0.05kg/cm²,温度 20°C-30°C条件下发酵 1-10天，其间用上述培养基补料。

10. 如权利要求 1或 3所述的发酵产物的应用，其特征在于，可制备用于预防和治疗抗***反应病和咳嗽的药物。

11. 如权利要求 10 所述的发酵产物的应用，其特征在于，所述的抗变态反应病包括抗 I、 II、 III、 IV型***反应病。

12. 如权利要求 11 所述的发酵产物的应用，其特征在于，所述的抗变态反应病包括发生在呼吸道、皮肤、胃肠道、眼的 I型***反应病。

13. 如权利要求 12 所述的发酵产物的应用，其特征在于，所述的抗变态反应病包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、药物过敏症、食物过敏症、胃肠炎、结膜炎或角膜炎。

14. 如权利要求 1或 3所述的发酵产物在制备预防和治疗用抗过敏疾病和咳嗽药物中的应用。

15. 如权利要求 14 所述的应用，其特征在于，过敏疾病包括花粉、尘螨、霉菌或粉尘过敏。

16. 如权利要求 1或 3所述的发酵产物的应用，其特征在于，制成片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂。