CN101803531B - 一株中华隐孔菌及其固体培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株中华隐孔菌及其应用。该菌株为中华隐孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575。本发明所提供的新菌株具有多种功能，如抗组胺释放、抑制多种肿瘤细胞生长、抑制各种过敏反应、治疗疼痛和治疗炎症；在抗组胺释放、抑制肿瘤生长方面，本发明菌株或其发酵物的提取物的效果要好于阳性对照组。另外，本发明的培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)CGMCC No.3575的方法，操作简单、成本低廉、产量高，活性提取物收率可达1.5％(按照固体培养基干重量计算)。因此，本发明菌株、菌株发酵物及发酵物的提取物具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株中华隐孔菌及其固体培养方法与应用。
背景技术
隐孔菌又名：松橄榄、树疙瘩、荷色菌、木鱼菌、香木兰、一口耳，属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，隐孔菌属，是木腐菌，生长在松树或其他树种树干或树枝的背阴面，或倒木的向地面，入药部位为新鲜或干燥的子实体。分布于我国的河北、四川、云南、江苏、江西、湖北、广西、福建、海南、吉林等省及朝鲜、日本、欧洲、北美。在我国分布的隐孔菌有两个种，隐孔菌Cryptoporus volvatus(Peck)Schear、中华隐孔菌Cryptoporus sinensis Sheng H.Wu & M.Zang。2000年，吴声华和臧穆的研究表明我国分布的隐孔菌主要为中华隐孔菌。
隐孔菌子实体生态环境严格、子实体采收困难、野外蕴藏量少，且子实体的人工培养难度很大，所以隐孔菌子实体资源紧缺。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株中华隐孔菌。
本发明所提供的中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523，其保藏编号为CGMCC No.3575。
该菌株Liuzh2009-7523已于2010年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3575，分类命名为Cryptoporussinensis。
本发明的另一个目的是提供一种培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的方法。
本发明所提供的培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的方法，包括如下步骤：用下述任一所述培养基培养中华隐孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575。
上述培养过程中，所述培养的条件为：温度为25℃-30℃且避光。
本发明的另一个目的是提供一种中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物。
本发明所提供的中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：按照上述任一所述方法培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575，培养30天，收集培养容器内的所有物质，将培养容器内的所有物质记作发酵物。
本发明的另一个目的是提供一种中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物。
本发明所提供的中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：1)按照上述任一所述方法培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575，培养30天，收集培养容器内的所有物质，将培养容器内的所有物质记作发酵物；
2)将步骤1)中发酵物与95％(体积百分含量)乙醇水溶液混合，100℃回流提取，取有机相，即为中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物；
每次回流提取的时间为1小时；所述步骤1)中发酵物与所述95％(体积百分含量)乙醇水溶液的配比为(900-1000)g：5升。
中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575和/在制备如下产品中的应用也属于本发明的保护范围：1)具有抗组胺释放功能的产品；2)具有预防和/或治疗***反应性疾病功能的产品；3)具有镇痛功能的产品；4)具有抑制肿瘤细胞生长功能的产品；或5)具有预防和/或***功能的产品。
上述任一所述中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物在制备如下产品中的应用也属于本发明的保护范围：1)具有抗组胺释放功能的产品；2)具有预防和/或治疗***反应性疾病功能的产品；3)具有镇痛功能的产品；4)具有抑制肿瘤细胞生长功能的产品；或5)具有预防和/或***功能的产品。
上述任一所述中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物在制备如下产品中的应用也属于本发明的保护范围：1)具有抗组胺释放功能的产品；2)具有预防和/或治疗***反应性疾病功能的产品；3)具有镇痛功能的产品；4)具有抑制肿瘤细胞生长功能的产品；或5)具有预防和/或***功能的产品。
本发明的另一个目的是提供一种具有如下功能的产品：抗组胺释放功能、具有预防和/或治疗***反应性疾病功能、镇痛功能、抑制肿瘤细胞生长功能、或预防和/或***功能，其活性成分为中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575、和/或上述任一所述中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物、和/或上述任一所述中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物。
上述应用或上述产品中，所述镇痛中的痛为神经性疼痛、外伤性疼痛或肿瘤引起的疼痛，具体是0.6％(体积百分含量)冰醋酸的水溶液对鼠引起的痛；
所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2、人***癌细胞PC3、人肺癌细胞A549、人直肠癌细胞HCT-15、人***细胞Hela、人胃癌细胞SGC7901、小鼠乳腺癌细胞EMT6或小鼠***癌RM-1细胞；
所述肿瘤为肝癌、***癌、肺癌、直肠癌、***、胃癌或乳腺癌；
所述***反应性疾病为支气管哮喘、过敏性鼻炎或过敏性皮炎。
本发明的最后一个目的是提供一种用于培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的培养基。
本发明用于培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的培养基，包括米、无机盐和水；所述米为籼米、粳米和/或糯米；所述无机盐为磷酸盐、氯化钠、硫酸镁和氯化钾中的至少一种；所述磷酸盐为K2HPO4、K3PO4、KH2PO4、NaH2PO4和Na2HPO4中的至少一种。
本发明的用于培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培养基中还可包括碳源和氮源；
所述碳源为葡萄糖、果糖、半乳糖、淀粉、纤维素和蔗糖中的至少一种；
所述氮源为蛋白胨、麦芽提取物和酵母提取物中的至少一种；
所述米、碳源、氮源、无机盐和水的配比为米(80-100)g：碳源(0-12)g：氮源(0-6)g：无机盐(0.01-2)g：水(100-150)ml。
本发明的用于培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCCNo.3575的培养基具体如下1)、2)、3)、4)或5)所示：
1)所述培养基由米、无机盐和水组成；所述籼米、无机盐和水的配比为100g籼米：0.35g无机盐：130毫升水；
2)所述培养基由籼米、硫酸镁、K2HPO4和水组成；所述籼米、硫酸镁、K2HPO4和水的配比为100g籼米：0.15g硫酸镁：0.2g K2HPO4：130毫升水；
3)所述培养基由籼米、碳源、氮源、无机盐和水组成；所述籼米、碳源、氮源、无机盐和水的配比为(90-95)g籼米：(4-6)g碳源：(0.9-3.9)g氮源：0.1g无机盐：(130-150)毫升水；
4)所述培养基由籼米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水组成；所述籼米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水的配比为90g籼米：6g葡萄糖：3.9g酵母提取物：0.1g NaCl：150毫升水；
5)所述培养基由籼米、纤维素、麦芽提取物、硫酸镁和水组成；所述籼米、纤维素、麦芽提取物、硫酸镁和水的配比为95g籼米：4g纤维素：0.9g麦芽提取物：0.1g硫酸镁：130毫升水。
上述培养基中，蛋白胨、麦芽提取物和酵母提取物可从商业途径得到。蛋白胨购自Oxoid Ltd.，批号为806586；麦芽提取物购自Oxoid Ltd.，批号为1069878；酵母提取物购自Oxoid Ltd.，批号为1074139。
上述产品具体可为药物；所述药物可为片剂、胶囊、口服液、乳剂、注射剂、混悬剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。
上述产品还可为保健品；所述保健品可为片剂、胶囊、口服液或颗粒剂。
本发明所提供的新菌株具有多种功能，如抗组胺释放、抑制多种肿瘤细胞生长、抑制各种过敏反应、治疗疼痛和治疗炎症；本发明的培养中华隐孔菌(Cryptoporussinensis)CGMCC No.3575的方法，操作简单、成本低廉、产量高，活性提取物收率可达1.5％(按照固体培养基干重量计算)。因此，本发明菌株发酵物及其发酵物的提取物具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中华隐孔菌固体培养菌发酵物高效液相图谱。
图2为实施例3中华隐孔菌固体培养菌发酵物高效液相图谱。
图3为实施例4中华隐孔菌固体培养菌发酵物高效液相图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、菌的分离和鉴定
一、菌的分离
中华隐孔菌菌种从采自福建省武夷山的隐孔菌新鲜子实体分离得到；将中华隐孔菌新鲜子实体和基物带回实验室，在无菌间内用无菌操作法，分别切取子实体菌肉部分和基物的木质部部分，置土豆葡萄糖琼脂培养基的斜面上，25～28摄氏度培养，获得菌株的纯培养物。将其中的一株菌命名为Liuzh2009-7523。
二、菌的鉴定
1子实体的鉴定
培养菌株Liuzh2009-7523，至获得子实体，观察菌体及子实体的形态。
原始子实体的菌盖有菌幕，子实体层被包裹在菌幕内。该特征在多孔菌科中是独一无二的。微观检测中担孢子的大小7～10×4～5μm，该特征符合中华隐孔菌的范围。鉴定依据是1998年出版的《中国真菌志第三卷多孔菌科》和Mycotaxon 2000年LXXIV卷415-422页Cryptoprus sinensis sp.nov.，A new polyporue found in China。
2菌株鉴定
菌丝白色，绒毛状，菌丝经棉蓝染色在高倍显微镜下可见多个锁状联合，锁状联合是担子菌的独有结构。
综合上述鉴定结果，表明该菌株Liuzh2009-7523属于中华隐孔菌(Cryptoporussinensis)，该菌株已于2010年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3575。
实施例2、菌的培养、提取物的制备及应用
一、菌株活化
将菌种接种到土豆葡萄糖琼脂的斜面上，进行预培养；预培养的条件为：25摄氏度，避光，培养7天。
PDA培养基组成：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，纯净水定容至1L(pH自然)。
二、种子培养
预培养中，待菌丝长满整个斜面后，在无菌条件下将菌丝体转接到液体培养基中进行培养，得到种子培养液。培养的条件为：25摄氏度，避光，培养7天。
液体培养基：葡萄糖4.0g/L，Malt Extract(麦芽提取物)10.0g/L，YeastExtract(酵母)4.0g/L，水定容至1L。
三、发酵培养
取10毫升步骤二得到的种子培养液分别接种到经过灭菌的装有如下固体培养基的500毫升三角瓶中，接种10瓶，25℃，避光，培养30天，将三角瓶内所有的物质记作发酵物，发酵物由菌体、菌的代谢物、培养基及培养基被菌利用后产生的物质组成。
固体培养基：由90g籼米、6g葡萄糖、3.9g Yeast Extract(酵母提取物)、0.1g NaCl和150毫升水组成。
Yeast Extract(酵母提取物)购自Oxoid Ltd.，批号为1074139。
四、提取物的制备
1、实验组：发酵物的提取物的制备
将实验三中培养得到的发酵物冷冻干燥，称重，重量为900克。用5升95％(体积百分含量)乙醇水溶液回流提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，减压浓缩干燥得到60克提取物，提取物记作CS-E1。
回流提取步骤如下：
将实验三中培养得到的发酵物与5升95％(体积百分含量)乙醇水溶液混合，100℃回流提取1小时，取有机相和残渣，将有机相记作乙醇提取液I，将残渣记作残渣I；
将残渣I与5升95％(体积百分含量)乙醇水溶液混合，100℃回流提取1小时，取有机相和残渣，将有机相记作乙醇提取液II，将残渣记作残渣II；
将残渣II与5升95％(体积百分含量)乙醇水溶液混合，100℃回流提取1小时，取有机相和残渣，将有机相记作乙醇提取液III，将残渣记作残渣III；
合并乙醇提取液I、乙醇提取液II和乙醇提取液III，记作乙醇提取液。
2、高效液相色谱检测
将提取物CS-E1高效液相色谱检测。
高校液相化学指纹图谱分析条件如下：
使用安杰伦Agilent 1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站。色谱柱YMC C8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇-0.04％(体积百分比)三氟乙酸水溶液进行梯度洗脱(洗脱程序如下)，流速1.00mL/min。样品用甲醇溶解，配成10mg/mL的溶液。进样量10μL，紫外检测波长210nm。
线性梯度洗脱步骤如下：
时间(min) 甲醇 0.04％(体积百分比)三氟乙酸水溶液
0 50％ 50％
40 100％ 0％
60 100％ 0％
在如上色谱条件下，提取物CS-E1的主要代谢产物色谱峰出现在保留时间25-40分钟范围内(图1)。
五、提取物的功能
以下实验所用动物均购自广东省医学实验动物中心(许可证号SCXK(粤)2003-0002)
(一)提取物CS-E1的抗组胺释放作用：
PCA(高氯酸，北京市兴津化工厂，070523)，Compound 48/80购自Alexis，产品目录号为LSALX-420-008-M100。
将8周龄SD大鼠断头放血处死后，将MCM(+)基质液(50ml～100ml)注射入大鼠腹腔，按摩腹部120s左右，吸出全部腹腔液，4℃680rpm离心7min。弃上清液，用35ml MCM(+)基质液洗沉淀，4℃680rpm离心7min。再弃去上清液，同样35ml MCM(+)基质液洗沉淀，4℃680rpm离心7min，收集沉淀。所得沉淀即肥大细胞。再加入MCM(-)基质液5ml，台盼蓝染色。染色液为MCM液和4％台盼蓝液的混合溶液，MCM液∶4％台盼蓝液＝0.25∶0.75(体积比)，使用前37℃恒温振荡3min。显微镜下细胞计数，调整肥大细胞悬液中细胞浓度为1×105Cell/mL。将细胞分为自然释放组胺组，Compound 48/80刺激释放组胺组和样品组三部分。
自然释放组胺组：设三个平行管，每管加入肥大细胞悬液500μL；加入20μL60％PCA，室温放置20min，-4℃保存；
刺激释放组胺组：设三个平行管，每管加入肥大细胞悬液500μL，37℃振荡孵育5min后加入4μL250mM CaCl25min，加入生理盐水5μL10min，再加入5μL0.05mg/mL Compound 48/8010min后冰浴冷却，4℃6000rpm离心2.5min后取上清液400μL加入20μL60％PCA，室温放置20min。
样品组：设提取物CS-E1高(1000μg/mL)、低(500μg/mL)两个剂量，每个剂量各设三个平行管。每管加入肥大细胞悬液500μL，37℃振荡孵育5min后加入4μL250mM CaCl25min，加入提取物CS-E15μL 10min后再加入0.05mg/mL Compound 48/8010min后冰浴冷却，4℃6000rpm离心2.5min，然后取上清液400μL加入20μL 60％PCA，室温放置20min。
上述三组在室温放置20min后，均加入400μL生理盐水，4℃13000rpm离心2.5min。上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，储存在-20℃，用于HPLC分析，检测各组释放的组胺的量，按下式计算样品组胺释放抑制率(％)。
样品组胺释放抑制率＝(1-样品组胺释放率)×100％。
实验结果见表1，隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好的抗组胺释放的作用。
表1 隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)抗组胺释放作用
MCM(-)基质液配制：精密称取NaCl 8.766g，KCl 0.2758g，Na2HPO41.07g，KH2PO40.48g，D-Glucose 1g，BSA 1g，明胶(Gelatin)1g，加水定容至1000ml，摇匀，以Na0H水溶液调pH至6.8，即得MCM(-)溶液，-4℃保存，备用。
MCM(+)基质液配制：向MCM(-)基质液添加肝素，肝素在MCM(-)溶液中的浓度为10U/mL。
MCM基质液配制：MCM(-)溶液与MCM(+)溶液的混合溶液，MCM(-)溶液∶MCM(+)溶液＝29∶1(V∶V)。
(二)抗二硝基氟苯(DNFB)诱发的变应性接触性皮炎
***(DEX)购自天津药业集团新郑股份有限公司。二硝基氟苯(CAS编号70-34-8)购自上海如吉生物科技发展有限公司。
实验动物KM雄性小鼠，随机分为模型对照组(给等量的蒸馏水)、中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)500mg/kg、中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)1000mg/kg及***1mg/kg组，共4组，每组10只。受试动物于致敏前1天到DNFB攻击当天连续7天灌胃给药。实验第一天用15mg/mL的DNFB乙醇溶液(即DNFB与乙醇的混合溶液，DNFB15mg，乙醇1mL)50μL作为抗原在小鼠背部皮下注射致敏。5d后致敏成立，第6d在小鼠右耳上涂10mg/mL DNFB(丙酮∶橄榄油4∶1)溶液(即DNFB、丙酮和橄榄油的混合物，混合物中DNFB为10mg，丙酮0.8mL和橄榄油0.2mL)25μL作为抗原攻击，致炎24h，使小鼠产生耳接触性皮炎。用8mm直径打孔器分别在左右两耳相同部位打下圆耳片，测定左右耳组织块重量差，计算给药组耳肿胀抑制率(％)，结果如表2所示。隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好的抗DNFB诱发变应性皮炎的作用。
表2中，耳片重量差为右耳耳片重量与左耳耳片重量的差；
耳肿胀抑制率＝[1-(给药组重量差/模型组重量差)]×100％。
表2 中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)抗DNFB诱发变应性皮炎作用
(三)抗异种被动皮肤过敏反应：
百白破疫苗：成都生物制品研究所提供，批号20020403。卵白蛋白：中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号F20010702。
将7周龄18～22g雄性清洁级昆明种小鼠随机分成5组，每组10只；7周龄180～220g雄性SD大鼠随机分成5组，每组10只；分别设空白对照组、阳性对照组(酮替芬5mg/kg，sigma chemical Co.)及中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)500、1000mg/kg剂量组，连续7天小鼠口服给药。参照Tada等人方法利用卵白蛋白及百白破疫苗制备大鼠抗卵白蛋白血清(anti-OVA)(具体方法为：健康大鼠，体重100-200g，用1％卵白蛋白生理盐水溶液(1g卵白蛋白加入到100ml生理盐水中)按照10mg/kg肌肉注射于后腿两侧，同时腹腔注射百白破疫苗2×1010U/只。12-14天后(IgE高峰时间)，处死动物采血，血液低速离心，分离血清，置于冰箱中保存。)。异种被动皮肤过敏反应是将10μl大鼠抗卵白蛋白血清注射到小鼠右耳皮内，左耳皮内注射等量生理盐水。致敏48h后按0.1ml/10g体重剂量向小鼠尾静脉内注射1％卵白蛋白伊文斯兰生理盐水溶液进行攻击。30min后脱颈处死，用8mm直径打孔器分别在左右两耳同一部位打下圆耳片，测定左右耳组织块重量差，计算给药组耳肿胀抑制率(％)，结果如表3所示。隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好的抗异种被动皮肤过敏反应的作用。
1％卵白蛋白伊文斯兰生理盐水溶液组成：1g伊文思蓝，生理盐水100ml，内含卵白蛋白1g。
表3中，耳片重量差为右耳耳片重量与左耳耳片重量的差；
抑制率＝[1-(给药组重量差/模型组重量差)]×100％。
表3 隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)抗异种被动皮肤过敏反应的作用
(四)抗SRBC诱发迟发型过敏反应：
SRBC(绵羊红细胞)的制备：采健康绵羊的颈静脉血，立即注入无菌有玻璃珠的三角瓶内，经充分摇动15～20min，以去除纤维蛋白，获得抗凝绵羊全血。将全血和Alsever液(北京东胜创新生物科技有限公司，02-045-1B)以1∶2混合。全血与Alsever液充分混合后，置4℃保存可使用3周左右。使用前取适量抗凝血于离心管中，用无菌生理盐水洗细胞2～3次(每次2000rpm，10min)。最后，用无菌生理盐水稀释后使用。
将7周龄18～22g雄性清洁级昆明种小鼠(广东省医学实验动物中心(许可证号SCXK(粤)2003-0002))随机分成4组，每组10只，分别设空白对照组、中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)500、1000mg/kg剂量组，阳性药酮替芬5mg/kg。实验第1d在小鼠背部皮下注射1×108个SRBC作为抗原致敏。5d后将小鼠左侧下肢拉直，自足跖皮内中下部向上注入等量SRBC进行攻击，右足跖皮内中下部向上注射等量生理盐水。酮替芬和隐孔菌菌丝体提取物于致敏前1d开始到足跖皮SRBC攻击当天连续6d给药。致敏24h后，用Digimatic卡尺(分辨率为0.01mm)测量左右足跖厚度，计算浮肿抑制率(％)，结果如表4所示。表4中，足跖肿胀差为左侧足跖厚度与右侧足跖厚度的差。隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好的抗SRBC诱发迟发型过敏反应的作用。
浮肿抑制率(％)计算公式如下：
浮肿抑制率＝[1-(给药组肿胀差/模型组肿胀差)]×100％。
表4 隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)抗SRBC诱发迟发型过敏反应的作用
(五)对变应性鼻炎的治疗作用：
将50只7周龄18～22g雄性清洁级昆明种小鼠，随机分为5组：(1)空白对照组(A组)；(2)模型对照组(B组)；(3)实验药物小剂量组(C组)；(4)实验药物大剂量组(D组)；(5)阳性对照组(鼻炎康组E组)，每组10只。将实验动物A组予生理盐水注射，B、C、D、E组均以卵白蛋白0.3mg(sigma chemical Co.，grade V)辅以氢氧化铝30mg作佐剂、加生理盐水1ml形成混悬液，行腹腔注射，隔日1次，共7次，为基础致敏。再用0.5％卵白蛋白的生理盐水攻击双鼻腔，每侧0.05ml，每日1次，共7次。每次攻击后均观察30min，内容包括喷嚏、搔抓，构建大鼠变应性鼻炎模型。A、B组灌生理盐水，C、D、E组分别按体重灌治疗药物中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)0.5克/公斤，1.0克/公斤及阳性对照药物鼻炎康1.8g/kg。动物服药7d，灌药4h后，用0.1ml/只卵白蛋白生理盐水攻击双鼻腔，每侧0.05ml，0.5h后观察鼻部症状。20-30min后测量皮丘直径均超过1cm，并剪下鼻粘膜组织浸泡于4％甲醛溶液中备用，任选10个高倍视野，观察鼻粘膜组织中的嗜酸性细胞、嗜中性细胞和淋巴浆细胞的数目，结果如表6所示。中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好对变应性鼻炎的治疗作用，与阳性药物相当。
表6 鼻粘膜组织细胞观察
**P＜0.01.“-”未见所要观察的细胞；”+”少数散落的细胞；“++”可见较多的细胞；“+++”占全部上皮的2/3以上
(六)致敏大鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的变化
卵白蛋白由中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号F20010702。7周龄18～22g雄性清洁级昆明种小鼠50只，随机分为5组：(1)空白对照组(生理盐水0.5ml/kg)；(2)模型对照组(B组)；(3)实验药物小剂量组(中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)0.5g/kg)；(4)实验药物大剂量组(中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)1.0g/kg)；(5)阳性对照组(DEX 1mg/kg)。小鼠***麻醉，0.1％卵白蛋白氢氧化铝凝胶(0.1％卵白蛋白氢氧化铝凝胶：0.1g卵白蛋白加入到含有10g氢氧化铝的100mL生理盐水中)于两后足掌、两腹股沟、两腋下、颈部以及背部共八点皮下注射0.4mL，致敏第10天腹腔注射0.1％卵白蛋白氢氧化铝凝胶(0.1％卵白蛋白氢氧化铝凝胶：0.1g卵白蛋白加入到含有10g氢氧化铝的100mL生理盐水中)0.2mL再次致敏1次，第2次致敏11天后，用1％的卵白蛋白(1g卵白蛋白加入到100mL生理盐水)雾化吸入进行攻击，每次30分钟，连续攻击6天。每次攻击前1小时根据分组给药，末次攻击后24小时后取出小鼠支气管进行肺泡灌洗。脱臼处死小鼠，纵行剪开颈部皮肤，分离暴露气管，行气管插管，用灌洗液(Thornwell-Mcdowell溶液：NaCl 6.6g，KCl 0.46g，CaCl20.05g，NaHCO32.52g，MgCl20.09g，Na2HPO40.1g，加水至1000mL)灌洗，每次0.5mL，共3次，收集支气管肺泡灌洗液，摇匀后取出50微升，用白细胞稀释液(恒大百盛生物北京科技发展有限公司)稀释4倍，取少量滴于细胞计数板上，在显微镜下计数白细胞总数。将支气管肺泡灌洗液低温1000rpm离心10min后，弃去上清液，用移液器打匀后涂片。涂片室温干燥，染色6-8min，复染1分钟。用自来水将染料冲洗干净，在光学显微镜40倍镜下进行白细胞分类计数。计数200个细胞，计算淋巴单核细胞以及嗜酸性粒细胞的百分比。结果如表7，表明隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)对小鼠哮喘模型支气管肺泡的炎症细胞聚集有明显的抑制作用。
表7 中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)鼠哮喘模型支气管肺泡炎症细胞的作阳
(七)隐孔菌固体培养菌丝体提取物镇痛作用
将7周龄18～22g雄性清洁级昆明种小鼠，随机分为模型对照组、中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)500，1000mg/kg及阿司匹林200mg/kg组，共4组，每组10只。灌胃给药1小时后，每只小鼠腹腔注射0.6％(体积百分含量)冰醋酸的水溶液0.2ml致痛。记录注射致痛后30min内各小鼠扭体的次数，结果如表8所示。隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在试验剂量下显示了很好的镇痛作用。
镇痛率％的计算公式＝(1-给药组扭体次数/模型组扭体次数)*100％
表8 中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)镇痛作用
(八)抑制肿瘤细胞生长作用：
人肝癌细胞HepG2(ATCC HB-8065)、人***癌细胞PC3(ATCC CRL-1435)、人肺癌细胞A549(ATCC CCL-185)、人结直肠癌细胞HCT-15(ATCC CCL-225)、人***细胞Hela(ATCCCCL-2)、人胃癌细胞SGC-7901(ATCC SGC-7901)、小鼠乳腺癌细胞EMT6(ATCC CRL-2755)、小鼠***癌RM-1细胞(ATCC RM-1)均购自中山医科大学动物实验室。
人肝癌HepG2细胞，人***癌PC3细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液，人肺癌A549细胞、人直肠癌细胞HCT-15、人***Hela细胞、人胃癌SGC-7901细胞、小鼠乳腺癌EMT6细胞、小鼠***癌RM-1细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5％CO2培养箱中常规培养，隔天传代。用MTT方法，取对数生长期的各种肿瘤细胞，用胰酶消化，制成每毫升含1×105个细胞的单细胞悬液，接种于96孔板内(每孔200μL)，每组设3个平行孔。24小时后加入不同浓度的中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)培养48小时，同时设空白对照组和阳性对照组(顺铂)，进行MTT测定肿瘤细胞数目，计算抑制率(％)。结果表明中华隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)在12.5-100微克/毫升范围内具有很好的抑制肿瘤细胞生长的活性。
抑制率(％)的计算公式：(1-给药组OD值/空白对照组OD值)×100％。
表9 隐孔菌固体培养发酵物(CS-E1)对肿瘤细胞生长的抑制作用
实施例3、菌的培养、提取物的分析
一、菌株活化和种子培养同实施例2。
二、发酵培养
液体培养基培养10天后，取10毫升步骤一得到的种子培养液分别接种到经过灭菌的装有如下固体培养基的500毫升三角瓶中，接种10瓶，30℃，避光，培养30天，得到发酵物。
固体培养基：由95g籼米、4g纤维素、0.9g麦芽提取物、0.1g硫酸镁和130毫升水组成。
麦芽提取物购自Oxoid Ltd.，批号为1069878。
三、提取物的制备
1、发酵物的提取物的制备
将发酵物冷冻干燥，称重，重量为950克。按照实施例2中所述方法进行回流提取，合并乙醇提取液，减压浓缩干燥得到65克提取物，提取物记作CS-E2。
2、高效液相色谱检测
将实施例3中制备得到的提取物CS-E2进行高效液相色谱检测。分析条件同实施例2。结果如图2所示，提取物CS-E2的主要代谢产物色谱峰出现在保留时间25-40分钟范围内，与CS-E1相似。
四、功能验证
将CS-E2进行实施例2实验五中所述各项功能验证，结果与CS-E1无显著差异。
实施例4、菌的培养、提取物的制备
一、菌株活化和种子培养同实施例2。
二、发酵培养
液体培养基培养10天后，取10毫升步骤一得到的种子培养液分别接种到经过灭菌的装有如下固体培养基的500毫升三角瓶中，接种10瓶，28℃，避光，培养30天，得到发酵物。
固体培养基：由100g籼米、0.15g硫酸镁、0.2g K2HPO4和130毫升水组成。
蛋白胨购自Oxoid Ltd.，批号为806586。
三、提取物的制备
1、发酵物的提取物的制备
将发酵物冷冻干燥，称重，重量为1000克。用5升95％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，减压浓缩干燥得到63克提取物，提取物记作CS-E3。
2、高效液相色谱检测
将实施例4中制备得到的提取物CS-E3进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例2。结果如图3所示，提取物CS-E3的主要代谢产物色谱峰出现在保留时间25-40分钟范围内，与CS-E1相似。
四、功能验证
将CS-E3进行实施例2实验五中所述各项功能验证，结果与CS-E1无显著差异。
Claims (10)
1.一种用于培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的培养基，包括米、无机盐、水、碳源和氮源；
所述米为籼米、粳米和/或糯米；
所述无机盐为磷酸盐、氯化钠、硫酸镁和氯化钾中的至少一种；所述磷酸盐为K2HPO4、K3PO4、KH2PO4、NaH2PO4和Na2HPO4中的至少一种；
所述碳源为葡萄糖、果糖、半乳糖、淀粉、纤维素和蔗糖中的至少一种；
所述氮源为麦芽提取物和酵母提取物中的至少一种；
所述米、碳源、氮源、无机盐和水的配比为米80-100g∶碳源0-12g∶氮源0-6g∶无机盐0.01-2g∶水100-150ml。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基为如下1)、2)、3)、4)或5)所示：
1)所述培养基由籼米、无机盐和水组成；所述籼米、无机盐和水的配比为100g米∶0.35g无机盐∶130毫升水；
2)所述培养基由籼米、硫酸镁、K2HPO4和水组成；所述籼米、硫酸镁、K2HPO4和水的配比为100g籼米∶0.15g硫酸镁∶0.2g K2HPO4∶130毫升水；
3)所述培养基由籼米、碳源、氮源、无机盐和水组成；所述籼米、碳源、氮源、无机盐和水的配比为90-95g籼米∶4-6g碳源∶0.9-3.9g氮源∶0.1g无机盐∶130-150毫升水；
4)所述培养基由籼米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水组成；所述籼米、葡萄糖、酵母提取物、NaCl和水的配比为90g籼米∶6g葡萄糖∶3.9g酵母提取物：0.1g NaCl∶150毫升水；
5)所述培养基由籼米、纤维素、麦芽提取物、硫酸镁和水组成；所述籼米、纤维素、麦芽提取物、硫酸镁和水的配比为95g籼米∶4g纤维素∶0.9g麦芽提取物∶0.1g硫酸镁∶130毫升水。
3.培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的方法，包括如下步骤：用权利要求1或2所述培养基培养中华隐孔菌(Cryptoporussinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度为25℃-30℃且避光。
5.中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：按照权利要求3或4所述方法培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575，培养30天，收集培养容器内的所有物质，将培养容器内的所有物质记作发酵物。
6.权利要5所述发酵物在制备如下产品中的应用：1)具有抗组胺释放功能的产品，2)具有预防和/或治疗***反应性疾病功能的产品，3)具有镇痛功能的产品，4)具有抑制肿瘤细胞生长功能的产品，或5)具有预防和/或***功能的产品。
7.中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：a)、按照权利要求3或4所述方法培养中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575，培养30天，收集培养容器内的所有物质，将培养容器内的所有物质记作发酵物；b)用体积百分含量为95％的乙醇水溶液对步骤a)中发酵物进行回流提取，取有机相，即为中华隐孔菌(Cryptoporus sinensis)Liuzh2009-7523CGMCC No.3575的发酵物的提取物；每次回流提取的时间为1小时，温度为100℃；；所述步骤a)中发酵物与所述体积百分含量为95％的乙醇水溶液的配比为900-1000g∶5升。
8.权利要7所述提取物在制备如下产品中的应用：1)具有抗组胺释放功能的产品，2)具有预防和/或治疗***反应性疾病功能的产品，3)具有镇痛功能的产品，4)具有抑制肿瘤细胞生长功能的产品，或5)具有预防和/或***功能的产品。
9.一种具有如下1)-5)任一功能的产品，其活性成分为权利要求5或6所述发酵物、和/或权利要求7或8所述提取物；
1)抗组胺释放功能；
2)预防和/或治疗***反应性疾病功能；
3)镇痛功能；
4)抑制肿瘤细胞生长功能；
5)预防和/或***功能。
10.根据权利要求9所述产品，其特征在于：所述镇痛中的痛为神经性疼痛、外伤性疼痛或肿瘤引起的疼痛；
所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2、人***癌细胞PC3、人肺癌细胞A549、人直肠癌细胞HCT-15、人***细胞Hela、人胃癌细胞SGC7901、小鼠乳腺癌细胞EMT6或小鼠***癌RM-1细胞；
所述肿瘤为肝癌、***癌、肺癌、直肠癌、***、胃癌或乳腺癌；
所述***反应性疾病为支气管哮喘、过敏性鼻炎或过敏性皮炎；
所述过敏性皮炎为二硝基氟苯对鼠诱发的变应性接触性皮炎、大鼠抗卵白蛋白血清对小鼠诱发的异种被动皮肤过敏反应、或绵羊红细胞对鼠诱发的迟发型过敏反应；
所述二硝基氟苯对鼠诱发的变应性接触性皮炎为二硝基氟苯对鼠诱发的耳肿胀，所述大鼠抗卵白蛋白血清对小鼠诱发的异种被动皮肤过敏反应为大鼠抗卵白蛋白血清对小鼠诱发的耳肿胀，所述绵羊红细胞对鼠诱发的迟发型过敏反应为绵羊红细胞对鼠诱发的足跖肿胀。
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