CN108070529A - 一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种隐孔菌菌粉的生产方法以及该菌粉的应用，该隐孔菌菌粉的生产方法包括以下步骤：(1)配制如下组分和含量的培养基：麦芽粉或马铃薯粉0‑50g、葡萄糖0.5‑2g、松树屑提取液5‑10g、水100ml适量盐酸调PH值至弱酸性，消毒灭菌；(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25‑28℃的温度下培养3‑6天直至出现菌球；(3)将步骤(2)的产物通过半透膜进行过滤；(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。本发明获得的隐孔菌菌球或子实体大小接近自然生长状态下的隐孔菌子实体，并且培养周期短；该隐孔菌菌粉在制备治疗人体肾功能衰竭、牙龈萎缩、糖尿病的药物中的应用获得了很好的效果。

Description

一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物产品及生物制药领域，具体是指一种隐孔菌菌粉的生产方法以及该隐孔菌菌粉在制备治疗肾功能衰退、牙龈萎缩药物中的应用。
背景技术
隐孔菌是遮孔隐孔菌Cryptoporus volvatu(Peck)Schear.和中国(中华)隐孔菌Cryptoporus sinensis Sheng H.Wu&M.Zang的统称；属于真菌，民间又称松橄榄、树疙瘩、木鱼菌、荷色菌、香木兰、黑迈子(云南)、一口茸(日本)等；生物分类学中属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、隐孔菌属(Cryptoporus)。
隐孔菌为腐生真菌，野外能长子实体，一年生，大小为2-3.5×3-4.5×1-2.5cm(厚)，腹部(背面)有2-10mm小孔，孢子在孔内产生，往往需要昆虫传播孢子。因孢子传播机会少等原因，自然资源较少，年采集量200-500千克(冬虫夏草是100-120吨)，远远不能满足市场需要。
关于隐孔菌的药用价值早有报道。最早是中国明朝蓝茂(1397－1476)主编的《滇南本草》中记载：“味苦、甘，性微寒。治大肠下血，积热之毒，疗(内外)九种痔疮，附方：治牙齿疼，将松橄榄于疼牙上咬住，疼即止，有平喘、止咳、解毒等功效，民间用于治疗哮喘和气管炎，疗效显著。”1981年韩国李氏等发现隐孔菌子实体的热水提取物中具有抗癌活性。1994年，日本学者从人工培养的菌丝体中提取分离出多糖，动物试验表明有抑制肿瘤细胞生长的活性。1997年，王政等通过比色法测定隐孔菌发酵培养菌丝及野生隐孔菌的糖类成分。2016年，高丽等发现隐孔菌中的麦角甾醇有抑制猪呼吸综合征病毒。
专利号为ZL941172279的发明专利公开了一种应用于隐孔菌产业化生产的生产方法。申请号为2005100604638的专利公开了隐孔菌在制备治疗呼吸道疾病中的作用。
发明内容
如何通过培养方法和生产工艺的改进获得培养周期短、质量高的隐孔菌产品以及拓宽其在医药领域的应用是本发明要解决的技术问题。
为解决上述技术问题本发明提供如下的技术方案：
一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制按如下组分和质量含量的培养基，总数为100份：
加盐酸调pH值至5-6；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，置25-28℃恒温加湿培养箱培养60天以上，直至出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
作为优选，上述一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法的步骤(1)中配制的培养基中加入草木灰，所占份数为2—4份。
作为优选，上述一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法的步骤(1)中配制的培养基中加入MgCl2，所占份数为1份。
作为优选，上述一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法的步骤(1)中配制的培养基的组分和含量如下：
作为优选，上述一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法的松树屑提取液是通过将松树屑陈化不少于30天，使松树屑的含水量小于5％，再用水煮不少于12小时，冷却后将水煮混合物过滤制得所述的松数屑提取液，其中松树屑提取液的浓度控制是：按水煮所用松树屑的重量制备得到相同重量的松数屑提取液或一半的重量。作为更佳选择，在水煮松树屑过程中加入乙醇、丙醇、或丁醇，用量为水用量的四分之一。
作为优选，上述一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法的步骤(4)中的隐孔菌粉中的隐孔多糖，隐孔多糖的分子量大于800；分子式为(C6H10O5)n，其中n大于5。
上述生产方法获得的隐孔菌粉在制备治疗人体肾功能衰竭、牙龈萎缩、糖尿病的药物中的应用。
有益效果：本发明获得的隐孔菌的子实体大小接近自然生长状态下的隐孔菌子实体，并且培养周期短；该隐孔菌菌粉在制备治疗人体肾功能衰竭、牙龈萎缩、糖尿病的药物中的应用获得了很好的效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至5；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
隐孔菌的繁殖分为无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，当有性繁殖进行到一定程度，雄性菌丝和雌性菌丝会相互缠绕形成1-3cm左右的团状物，即子实体。子实体的出现是表征固体培养完成的一个指标。获得的隐孔菌菌粉中含有隐孔多糖，隐孔多糖的分子量大于800；分子式为(C6H10O5)n，其中n大于5。另外，本发明中的松树屑指的是刮取自枯萎的松树的树皮部分的木屑。
实施例2：
一种隐孔菌菌粉的生产方法，包括以下步骤：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至5；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，置25-28℃恒温加湿培养箱培养65天直至出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。本发明中使用的松数屑提取液取自经过陈化处理的松树屑，具体来说就是将将松树屑陈化30天以上，使松树屑的含水量小于5％，然后再进行提取获得。
实施例3
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至6；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体
培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。
实施例4
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至6；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在本实施例中，加入了草木灰、MgCl2后，对于步骤(2)中进行培养隐孔菌所发出的子实体的附着性更好，而且最终的所得在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。
实施例5
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至6；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
其中，松树屑提取液是通过将松树屑陈化不少于30天，使松树屑的含水量小于5％，再用水煮不少于12小时，冷却后将水煮混合物过滤制得所述的松数屑提取液，其中松树屑提取液的浓度控制是：按水煮所用松树屑的重量制备得到相同重量的松数屑提取液；在提取过程中加入用水量1/4的乙醇，可以实现提取更好效果。
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在本实施例中，加入了草木灰、MgCl2后，对于步骤(2)中进行培养隐孔菌所发出的子实体的附着性更好，经测定，在隐孔菌粉中的隐孔多糖的分子量大于800的含量较高；而且最终的所得在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。
对比实施例1
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至5；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养70天，没有出现如实施例1中所相同的子实体；
申请人除了对水杉树进行提取液进行试验以后，还将其它树木进行相同方式的提取液制备，然后再按实施例1相同的方式进行培养，均未出现如实施例1中相似大小的子实体。可见在本申请中松树屑的使用具有与其它树木具有根本不同的效果。
对比实施例2
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至5；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在本实施例中，加入了MgSO4、替换原来使用的MgCl2后，对于步骤(2)中进行培养隐孔菌所发出的子实体与实施例1中出现的情况差不多，与实施例4中的子实体相比较差，主要从子实体的形状、体积等方面来看；而且最终的所得在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。
对比实施例3
按实施例1相同的过程，具体配比如下：
(1)配制100ml如下组分和含量的培养基：
加盐酸调pH值至5；并对配置完成的培养基进行消毒灭菌；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，25-28℃的温度下培养60天，出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
在本实施例中，加入了K2CO4、替换原来使用的草木灰后，对于步骤(2)中进行培养隐孔菌所发出的子实体与实施例1中出现的情况差不多，与实施例4中的子实体相比较差，主要从子实体的形状、体积等方面来看；而且最终的所得在步骤(4)的喷雾干燥处理中，需要在步骤(3)中获得的过滤产物中加入少量固体培养基，再进行喷雾干燥处理，防止在处理过程中，过滤产物粘在容器壁上。
实施例6：
隐孔菌粉的毒理试验研究表明：
1、一般药理研究：取小鼠和猫分别灌胃结果：对精神神经***、对血管、呼吸***无明显影响；
2、急性毒性试验：大、小鼠单次口服给药，结果均大于20g/kg
3、长期毒性试验：大鼠按1.05g/kg/d连续口服给药90天；犬按3.2g/kg/d连续口服给药90天，均无明显显示毒副反应和中毒靶器官。
4、致突变试验，呈阴性。
5、生殖毒性试验，对大鼠致畸敏感期无明显的胚胎毒性和潜在的致畸性。
隐孔菌粉最大耐受量(MTD)45g/kg。
按新药申报试验结果表明：
口服2.7g/kg隐孔菌粉对脾虚和肾虚哮喘小鼠模型有效。
口服隐孔菌粉2.7g/kg/d与阳性对照药糖皮质激素***(皮下注射)0.5mg/kg/d、抗过敏药酮替芬5mg/kg/d、镇咳药可待因10mg/kg/d、β2激动剂类沙丁胺醇7mg/kg/d、祛痰药氯化铵1.0g/kg/d的作用相当；在作用机理研究中发现隐孔菌粉能降低IL-4水平、增高INF-γ水平，INF-γ/IL-4比值达正常水平，可能参与Th1和Th2的平衡调节；说明隐孔菌粉具有抗炎，抗过敏、镇咳、祛痰作用，而且呈量效关系。
将通过本发明获得的隐孔菌菌粉制备治疗人体肾功能衰竭的药物，将药物用于治疗人体肾功能衰竭的实例。患者65岁，男性，腰酸，抽血，发现肌酐180微摩/升(血肌酐正常值标准为：44-133umol/L)，血肌酐增高。医生诊断：慢性肾功能不全。之后，每天口服含有3克隐孔菌粉的药物(每天两次)，连续30天，抽血，发现肌酐140微摩/升，再每天口服含有3克隐孔菌粉的药物(每天两次)，连续30天，抽血，肌酐82微摩/升，15天复查，肌酐80微摩/升，一年后抽血复查，肌酐78微摩/升。意外发现左手背5个色斑(1-5mm)消失。
实施例7：
将通过本发明获得的隐孔菌菌粉制备治疗牙龈萎缩的药物，将药物用于治疗牙龈萎缩的实例。患者72岁，男性，22年前发现牙龈全部萎缩；9个月前，开始每天口服含有隐孔菌粉3-9克的药物，复查：牙龈萎缩全部修复。
实施例8：
将通过本发明获得的隐孔菌菌粉制备治疗糖尿病的药物，将药物用于治疗糖尿病的实例。患者92岁，女性，因糖尿病(依赖注射胰岛素维持)、胆管结石(2.5×3.5cm)全麻手术，引发胰腺炎、胃摊和器官组织衰竭，抢救成功，12个月前，开始口服含有6克隐孔菌粉的药物，每天18克(分三次)，现体重增加15斤，停止注射胰岛素，餐前血糖维持在4-8mmoL/L。

Claims (8)

1.一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制按如下组分和质量含量的培养基，总数为100份：
加盐酸调pH值至5-6；
(2)将隐孔菌移入装有步骤(1)所述的培养基的容器中，置25-28℃恒温加湿培养箱培养60天以上，直至出现子实体；
(3)提取步骤(2)的菌落，溶于水后通过半透膜进行过滤；
(4)将步骤(3)的产物进行喷雾干燥处理，制得隐孔菌粉。
2.如权利要求1所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：在步骤(1)中配制的培养基中加入草木灰，所占份数为2—4份。
3.如权利要求1所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：在步骤(1)中配制的培养基中加入MgCl2，所占份数为1份。
4.如权利要求1所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：步骤(1)中配制的培养基的组分和含量如下：
5.如权利要求1所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：松树屑提取液是通过将松树屑陈化不少于30天，使松树屑的含水量小于5％，再用水煮不少于12小时，冷却后将水煮混合物过滤制得所述的松数屑提取液，其中松树屑提取液的浓度控制是：按水煮所用松树屑的重量制备得到相同重量的松数屑提取液或一半的重量。
6.如权利要求5所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：在水煮松树屑过程中加入乙醇、丙醇、或丁醇，用量为水用量的四分之一。
7.如权利要求1所述的一种固态培养隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：步骤(4)中的隐孔菌粉中的隐孔多糖，隐孔多糖的分子量大于800；分子式为(C6H10O5)n，其中n大于5。
8.如权利要求1所述的生产方法获得的隐孔菌粉在制备治疗人体肾功能衰竭、牙龈萎缩、糖尿病的药物中的应用。
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