Beschreibung
Actinomyceten zum Abbau von Aflatoxin Bi, Ochratoxin A und/oder Zearalenon
Die Erfindung betrifft Actinomyceten zum Abbau von Aflatoxin Bi, Ochratoxin A und/oder Zearalenon sowie neue Stämme von Actinomyceten.
Das Mykotoxin Aflatoxin Bi ist eine Hauptkomponente des Afla- toxinkomplexes, der ein Stoffwechselprodukt bestimmter Stämme von Aspergillus flavus, A . nomius und A . parasi ticus ist. Aflatoxin Bi ist eines der stärksten bekannten natürlich vorkommenden Mutagene und Kanzerogene. Es findet sich in vielen Lebensmitteln und Rohstoffen wie beispielsweise Erdnüssen,
Sojabohnen, Sorghum, Hirse, Getreide und daraus hergestellten Produkten, auf denen sich die Aflatoxin Bi bildenden Schimmelpilze ansiedeln. Der Verzehr von Lebensmitteln, die mit Aflatoxin Bi kontaminiert sind, stellt für Menschen und Tiere u.U. eine ernste gesundheitliche Gefahr dar, da Aflatoxin Bx kanzerogene, teratogene und hepatotoxische Wirkungen hat. Das Wachstum der Aflatoxin Bi produzierenden Schimmelpilze ist nicht immer ein Indiz, daß das Mykotoxin tatsächlich vorhanden ist. Aflatoxin Bi wird nur unter bestimmten Bedingungen synthetisiert, zu denen Feuchtigkeit, Temperatur, Art des
Substrates, Wettbewerb mit anderer Mikroflora, Belüftung und auch genetische Anforderungen gehören.
Ein weiteres Mykotoxin ist Ochratoxin A. Ochratoxin A wird von verschiedenen Penizillium-Arten produziert. Es wirkt nierenschädigend und hat sich im Tierversuch als carzinogen wirksam erwiesen. Ochratoxin A kommt in Lebensmitteln, wie in Getreide oder Getreideprodukten, in Kaffee oder Kakao und de-
ren Folgeprodukten, in Trockenfrüchten, in Rotwein, in rotem Traubensaft und in Süßholzextrakt-enthaltenden Süßwaren vor.
Auch Zearalenon ist ein Mycotoxin. Es findet sich vor allem in Mais und Ährengetreide. Es hat hormonartige stark östroge- ne Wirkungen. Zearalenon greift in hormoneile Regelkreise des Körpers ein und hat damit auch negative Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit. Es wird angenommen, daß Zearalenon teratogene und karzinogene Eigenschaften besitzt.
Die Bildung von Aflatoxin Bi, Ochratoxin A und Zearalenon auf Lebensmitteln ist somit ein grundlegendes gesundheitliches und wirtschaftliches Problem mit weltweiter Bedeutung.
Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, das Aflatoxin Bi mit physikalischen und chemischen Techniken abgebaut werden kann. Die bekannten Verfahren sind jedoch mit Nachteilen verbunden, zu denen insbesondere die Verringerung der Qualität der Lebensmittel hinsichtlich ihrer Nähr- und organolepti- sehen Eigenschaften gehört. Darüber hinaus erfordert die Behandlung der Lebensmittel mit den bekannten Verfahren eine kostenintensive technische Ausrüstung. In vielen Fällen ist überdies die Behandlung ebenfalls mit gesundheitsschädlichen Wirkungen verbunden.
Es sind auch eine Vielzahl von Isolaten hinsichtlich ihrer Eignung, Aflatoxin Bi abzubauen, untersucht worden. Dabei hat sich allerdings herausgestellt, daß ein großer Teil der bekannten Isolate Aflatoxin Bi eher adsorbiert als tatsächlich abbaut. Die Adsorbtion von Aflatoxin B hat jedoch den Nachteil, daß das Aflatoxin B unter veränderten Bedingungen wieder freigesetzt werden kann.
Ein signifikanter Abbau von Aflatoxin Bx wurde unter anderem bei einem Stamm von Nocardia corynebacterioides, DSM-Nr. 12676, Aspergillus niger, A . parasi ticus, Tricoderma viride und Mucor ambiguus festgestellt (Mann, R. und Reh , H. J., Eur. J. Appl. Micobiol., 2 (1976), 297-306; Tsubouchi , H. , et al., Shakuhin Eiseigaku Zasshi, 24 2 (1983), 113-119; Line et al., J. Food Prot., 57 (1994), 788-791). Weiterhin ist es bekannt, daß Pseudonocardia hydrocarbonoxydans, bestimmte Myco- bakterien und bestimmte polycyclische aromatische Kohlenwas- serstoffe abbauende Bakterien, Aflatoxin B abbauen können.
Der Abbau des Aflatoxin Bx mittels der bisher bekannten Iso- late ist jedoch mit einer langen Abbauzeit verbunden, die dauerhaft mehr als 72 Stunden beträgt. Überdies verringert die Pigmentierung mancher Stämme deren Eignung für einen Ein- satz in der Lebensmittelindustrie. Ein Teil der Isolate produziert außerdem unter veränderten Bedingungen wieder Aflatoxin Bx, so daß ein Einsatz dieser Isolate bei Lebensmitteln ausgeschlossen ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere Mikroorganismen angegeben werden, die Mykotoxine, insbesondere Aflatoxin Bx, Ochratoxin A und/oder Zearalenon, mit deutlich verkürzter Abbauzeit abbauen können, sowie neue Stämme mit die- ser Eigenschaft.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 12 und 13 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 11.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß Mikroorganismen eines bakteriellen Stamms ausgewählt aus einer der Gattungen Rhodococcus, Mycobacterium, Gordonia, Pseudonocardia,
Streptomyces , Nocardiopsis, Nocardioides, Nocardia, Actinomyces, Rothia, Saccharothrix, Gallionella, Actinoplanes , Frankia und Clavibacter in der Lage sind, Aflatoxin Bx, Ochratoxin A und/oder Zearalenon schnell und effektiv abzubauen. Das betrifft insbesondere die neuen Isolate Rhodococcus erythro- polis sowie Λfycojbacte iuin sp. sowie Mutanten oder Varianten dieser Stämme bzw. Spezies. Die Varianten umfassen auch andere Stämme der genannten Spezies. Die vorgenannten Isolate sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zell- kulturen GmbH in Braunschweig, Deutschland unter den DSM-Nrn. 14303 bzw. 14304 hinterlegt worden. Bei dem Isolat von Mycob- acterium sp. handelt es sich um einen Stamm einer neuen Spezies. Ferner haben sich in dieser Hinsicht der Stamm Pseudonocardia hydrocarbonoxydans , welcher bei der Deutschen Samm- lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der DSM- Nr. 43281 hinterlegt worden ist, sowie Mutanten oder Varianten dieses Stamms bzw. dieser Spezies als besonders effektiv erwiesen. Die Varianten umfassen auch andere Stämme der genannten Spezies.
Zweckmäßigerweise werden die Mikroorganismen zum Abbau von Aflatoxin Bx, Ochratoxin A und/oder Zearalenon zerstört, so daß die von diesen gebildeten Enzyme freigesetzt werden. Beim Zerstören der Mikroorganismen werden Zellfragmente gebildet. Unter Zellfragmenten werden sowohl feste als auch flüssige bzw. gelöste Bestandteile der Zelle verstanden. Vorzugsweise wird ein zellfreier Extrakt aus den Mikroorganismen hergestellt, der beispielsweise mittels einer French-Presse erhalten wird.
Mit den aus den genannten Stämmen erhaltenen Zellfragmenten oder dem aus diesen Mikroorganismen gewonnenen Enzym wird das Aflatoxin Bχ~, Ochratoxin A- und/oder Zearalenon-haltige Substrat, bei dem es sich beispielsweise um ein Lebensmittel handelt, versetzt. Bei dem Substrat kann es sich aber auch um Futtermittel handeln.
Die Inkubationszeit nach der Zugabe der Zellfragmente oder des Enzyms zu dem Aflatoxin Bx-, Ochratoxin A- und/oder Zea- ralenon-haltigen Substrat sollte 5 bis 25 Stunden, vorzugsweise weniger als 10 Stunden, betragen. Die Reaktionstemperatur sollte 10 bis 40 °C, vorzugsweise 30 °C betragen. Diese Temperatur ist besonders geeignet, da sie in tropischen Ge- bieten, wie Westafrika, die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erleichtert.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 den prozentualen Aflatoxin Bχ-Abbau in Abhän- gigkeit von der Inkubationszeit für die Stämme
Nocardia corynebacterioides DSM-Nr. 12676, N. corynebacterioides DSM-Νr. 20151, Rhodococcus erythropolis (DSM-Νr. 14303) und MycoJacter um sp. (DSM-Νr. 14304),
Fig. 2 den prozentualen Aflatoxin Bχ-Abbau in Abhängigkeit von der Temperatur für die Stämme nach Fig. 1 und
Fig. 3 den prozentualen Ochratoxin-A-Abbau bei einer
Inkubationszeit von 20 Stunden und einer Temperatur von 30° C für die Stämme nach Fig. 1.
Das folgende erste Beispiel veranschaulicht den schnellen und effektiven Abbau von Aflatoxin Bx und/oder Ochratoxin A für die Stämme Rhodococcus erythropolis (DSM-Νr. 14303) und My- cobacterium sp. (DSM-Νr. 14304) im Vergleich zu den bekannten Stämmen Nocardia corynebacterioides DSM-Νr. 12676 und N. corynebacterioides DSM-Νr. 20151. Nocardia corynebacterioides
DSM-Nr. 12676 und N. corynebacterioides DSM-Nr. 20151 wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Deutschland geliefert.
1. Wachstumsbedingungen und Biomasseherstellung
Die gefrorenen oder gefriergetrockneten Bakterienkulturen der Stämme Nocardia corynebacterioides (DSM-Nr. 12676) , N. corynebacterioides (DSM-Nr. 20151), Rhodococcus erythropolis (DSM-Nr. 14303) und Mycobacterium sp. (DSM-Nr. 14304) wurden durch aufeinanderfolgende Kultivierungsschritte in Standard- I-Nährlösung (S-I-Medien, 1.07882,0500, Merck, Deutschland) reaktiviert. 20 ml der 24 h-Kulturlösung wurden verwendet, um 500 ml sterile (121° C/15 min) STDI-Medien zu beimpfen. Die beimpften Kulturen wurden 48 h bei 30 °C unter Schütteln bei 160 rpm (Gyrotary-Schüttelinkubator Modell G25, New Brunswick Scientific Co, USA) inkubiert. Die Zellen wurden durch 20 Minuten Zentrifugation bei 4 °C und 6000 rpm geerntet. Die erhaltenen Pellets wurden zweimal mit Phosphatpuffer (67 mmol/1, pH 7,0) gewaschen.
2. Disintegration zur Herstellung zellfreier Extrakte
Die gemäß Ziff. 1 erhaltenen Peletts wurden zur Zellzerstö- rung in Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert (3 ml Puffer pro Gramm Zellmasse) . Die Suspension wurde dreimal mittels der French-Presse bei 1200 psi (8,274 x 106 Pa) behandelt (Aminco French pressure cell press, SLM Instruments Inc.). Die Zellzerstörungsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die disintegrierte Zellsuspension wurde 20 Minuten bei 4 °C und 20.000 rpm zentrifugiert (Sorvall RC 26 plus, Kendo lab., Deutschland) . Der Überstand wurde unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von sterilen Cellulosepyrogen-freien Einmal-
Filtern mit 0,2 um Porengröße (Schleicher & Schuell, Deutschland) filtriert.
3.1 Aflatoxin Bχ-Abbau
20 μl einer Lösung von Aflatoxin Bx in Methanol (LiChroSolv,
Merck) wurden zu 730 μl des unter Ziff. 2 erhaltenen zellfreien Extraktes gegeben, so daß die Ausgangskonzentration an Aflatoxin Bx 2 , 5 ppm betrug. Zur Bestimmung der optimalen Re- aktions- oder Inkubationszeit wurde das Gemisch im Dunkeln 1, 2, 4, 6, 8 bzw. 24 h bei 30 °C ohne Schütteln inkubiert. Zur Bestimmung der optimalen Temperatur wurde das Gemisch 20 h bei 10, 20, 30 oder 40 °C und pH 7 inkubiert. Durch Zugabe von 750 μl HPLC-reinen Chloroforms (LiChroSolv, Merck) wurde die Inkubation beendet. Jeder Versuch wurde mehrmals wiederholt.
3.2 Ochratoxin A-Abbau
100 ßl einer Lösung von Ochratoxin A in Phosphatpuffer wurden zu 1000 μl des unter Ziff. 2 erhaltenen zellfreien Extraktes gegeben, so dass die Ausgangskonzentration an Ochratoxin A 20 ppm betrug. Die Inkubation wurde über eine Zeit von 20 Stunden durchgeführt .
Quantitative Analyse
Nach der Inkubation der zellfreien Extrakte wurde das Aflatoxin Bx dreimal mit Chloroform (LiChroSolv, Merck) extrahiert, das Lösungsmittel unter Stickstoff abgedampft und der Rückstand mit Methanol (LiChroSolv, Merck) aufgenommen. Ein Teil der resultierenden Lösung wurde unmittelbar für die HPLC ver-
wendet, während ein weiterer Teil bei -20 °C im Dunkeln gelagert wurde .
Zur Isolierung des Ochratoxins A wurde den Inkubationsansät- zen 100 μl 12,5%ige Salzsäure zugegeben, sowie 5 ml Natriumchloridlösung (118 g Natriumchlorid in 1000 ml destilliertem Wasser) . Danach wurde zweimal mit je 5 ml Chloroform ausgeschüttelt. Nach Zentrifugation zur Trennung der beiden flüssigen Phasen wurden die Chloroformphasen vereinigt und bei 50 °C bis zur Trockene eingedampft. Für die HPLC-Analyse ist der Rückstand in Acetonitril-Wasser-Essigsäure im Verhältnis 46 : 54 : 1 gelöst worden.
Das zur quantitativen Analyse verwendete HPLC-System umfaßte folgende Komponenten: HPLC-Pumpe (L-7100, Merck), HPLC-
Autosampler (L-7200, Merck) und einen Probenkühler, um die Probentemperatur bei 21 °C zu halten. Zur Bestimmung der Aflatoxin Bχ-Konzentration wurde ein Diodenarray-Nachweisgerät (HP1050, Hewlett-Packard, Deutschland) bei Wellenlängen von 230, 275, 315 und 365 nm verwendet. Als stationäre Phase wurde eine Umkehrphasen-C18-Säule (LiChroCART 250-4 RP-18 (5 μm) , Merck) in Verbindung mit einer Schutzsäule (LiChroCART 4-4 RP-18 (5 μm) , Merck) verwendet. Die mobile Phase war ein Gemisch aus Acetonitril, Methanol und Wasser in einem Verhältnis in bezug auf das Volumen von 25 : 25 : 50. Die
Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase betrug 1,0 ml/min bei einem Druck von ca. 200 kPa. Mit Hilfe dieser Aflatoxin Bx - Analysen wurde die optimalen Inkubationstemperatur und Inkubationszeit zum Aflatoxin Bx -Abbau ermittelt.
Die quantitative Analyse des Ochratoxins A erfolgte wie im Falle des Aflatoxins mittels HPLC, wobei anstelle des Dioden- array-Nachweisgerätes ein Fluoreszenzdetektor verwendet wur-
de. Angeregt wurde die Probe mit Licht der Wellenlänge 330 nm, gemessen wurde bei 460 nm. Das Toxin wurde mit einem aus Acetonitril-Wasser-Essigsäure im Verhältnis 46 : 54 : 1 bestehenden Gemisch von der C18-Trennsäule eluiert. Die Fließ- geschwindigkeit der mobilen Phase betrug 1,0 ml/Minute.
5. Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Gesamtproteinkonzentration wurde mittels des Mikrobiuret- Verfahrens gemessen. Die Referenzkurve wurde unter Verwendung einer bekannten Konzentration von bovinem Serumalbumin (BSA) erzeugt. Die Konzentration an Rohprotein wurde aus der Referenzkurve ermittelt.
6. Ergebnis
Die Gesamtproteinkonzentration in den zellfreien Extrakten aller Isolate ist in Tabelle 1 gezeigt:
Tabelle 1
Es ist aus Tabelle 1 zu erkennen, daß die zellfreien Extrakte von Rhodococcus erythropolis und Mycobacterium sp. höhere Konzentrationen an Protein enthielten als die Stämme von No- cardia corynebacterioides . Die unterschiedlichen Konzentrationen spiegeln die Anwesenheit von Protein, der funktionalen
Einheit aller Organismen in den Proben der zellfreien Extrakte, wieder und sind auch ein Hinweis nährsubstratbedingt gebildeter Biomasse. Zwischen der Proteinkonzentration und der Aktivität Stämme besteht eine Korrelation.
Wie in Fig. 1 dargestellt, zeigten die vier Isolate unterschiedliche Abbauniveaus. Rhodococcus erythropolis und Mycobacterium sp. bauten jedoch gegenüber den bekannten Stämmen von Nocardia corynebacterioides das Aflatoxin Bx wesentlich schneller und vollständiger ab. Innerhalb von einer Stunde bauten die neuen Stämme mehr als 70 % des Aflatoxin Bx ab, während die bekannten Stämme höchstens 30 % abbauten. Nach vier Stunden hatten die neuen Stämme bereits mehr als 90 % des Aflatoxin Bx beseitigt, während die bekannten Stämme in diesem Zeitraum höchstens 60 % abgebaut hatten. Nach acht Stunden war das Aflatoxin Bx bei den Proben, die mit dem zellfreien Extrakt der neuen Stämme versetzt wurden, nahezu vollständig abgebaut, bei einem der bekannten Stämmen hingegen nur zu höchstens 80 %, bei dem anderen der bekannten Stämme nur zu 5 % . Nach 24 Stunden konnte bei den neuen
Stämmen sowie bei Nocardia corynebacterioides DSM-Nr. 20151 kein Aflatoxin Bx mehr nachgewiesen werden.
Die neuen Stämme von Rhodococcus erythropolis und Mycobacte- rium sp. bauten Aflatoxin Bx somit deutlich schneller ab,
Überdies wurden im Gegensatz zu den Stämmen von Nocardia corynebacterioides keine Pigmente gebildet, was ein wesentlicher Vorteil ist, wenn die neuen Stämme in einem Lebensmittelfermentationssystem eingesetzt werden. Die Qualität der Lebensmittel wird somit während der Fermentation von den neuen Stämmen nicht beeinträchtigt.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich des Aflatoxin Bχ-Abbaus der vier Stämme bei unterschiedlichen Temperaturen. Aus den Kurven für die Stämme von Nocardia corynebacterioides wird auf einen en- zymatischen Abbau von Aflatoxin Bx geschlossen, da die Akti-
vität bei 30 °C höher als bei 10, 20 oder 40 °C ist. Die Aktivität der neuen Stämme ist bei allen Temperaturen im wesentlichen dieselbe. Das legt die Vermutung nahe, daß die von diesen Bakterien entwickelten Enzyme in einem breiten Tempe- raturbereich wirken.
Fig. 3 zeigt die Wirksamkeit der Stämme Nocardia corynebacterioides (DSM-Nr. 20151), Nocardia corynebacterioides (DSM-Nr. 12676) , Mycobacterium sp . (DSM-Nr. 14304) und Rhodococcus erythropolis (DSM-Nr. 14303) in Bezug auf den Abbau von
Ochratoxin A. Die Inkubationszeit hat 20 Stunden und die Inkubationstemperatur 30° C betragen. Es zeigt sich, daß insbesondere die Stämme Mycobacterium sp . (DSM-Nr. 14304) sowie Rhodococcus erythropolis (DSM-Nr. 14303) besonders effektiv das Mykotoxin Ochratoxin A abbauen.
Das folgende zweite Beispiel veranschaulicht den Abbau von Zearalenon:
200 μg Zearalenon werden in 500 μl Methanol gelöst und 1:1 mit Phosphatpuffer (118 g NaCl, 33,7 ml 85 % H3P04, auf 1 1 H20, pH 7,0) verdünnt. 100 μl dieser Lösung, welche 20 μg Zearalenon enthalten, werden jeweils zu 1 ml eines 800 μg Protein enthaltenden zellfreien Extrakts aus Rhodococcus erythropolis (DSM-Nr. 14303) gegeben und gemischt. Der zellfreie Bakterienextrakt ist wie unter Ziff. 2 beschrieben hergestellt worden. Das Gemisch wird für 20 Stunden bei 30 °C inkubiert .
Die Reaktion wird durch eine Proteinfällung beendet. Dazu werden 100 μl einer 6%igen Salzsäure zugesetzt. Anschließend werden 5 ml Phosphatpuffer zugesetzt und zweimal mit je 5 ml Chloroform ausgeschüttelt. Nach Zentrifugation zur Trennung der beiden flüssigen Phasen werden die Chloroformphasen ver- einigt und bei 50 °C bis zur Trockene eingedampft.
Für die quantitative HPLC-Analyse wird der Rückstand in 1 ml 50%igem Acetonitril in Wasser gelöst und die Lösung 1:10 mit 50%igem Acetonitril in Wasser verdünnt. 20 μl davon werden mittels HPLC unter den folgenden Bedingungen untersucht:
Anregungswellenlänge: 280 nm
Gemessene Emissionswellenlänge: 465 nm
Säulentemperatur: 25°C
Fließmittel : CH3CN/H20/CH3COOH im Verhältnis 50 /50/1 , 2
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Vorsäule: C18 (ODS) 4mm x 3mm ID (Phenomenex)
Trennsäule: Nucleosil 100-5 C18 CC 250/4 (Macherey - Nagel)
Alle Chemikalien werden in p.a. Qualität (Merck) verwendet. Organische Lösungsmittel sind solche für die HPLC in LiChro- solv gradient grade Qualität (Merck) .
Dabei sind die folgenden Ergebnisse erzielt worden:
Probe Messwert Wiederfindung [ng/20 μl] [%]
Puffer + Zearalenon 34,0 85,0
Puffer + Zearalenon 33,8 84,5
Inkubation ohne Bakterienextrakt 33,2 83,0
Inkubation ohne Bakterienextrakt 36,5 91,3
Inkubation ohne Bakterienextrakt 37,7 94,3
Inkubation ohne Bakterienextrakt 36,8 92
Inkubation ohne Bakterienextrakt 34,5 86,3
Inkubation ohne Bakterienextrakt 33,0 82,5
Inkubation mit Bakterienextrakt 20,3 50,8
Inkubation mit Bakterienextrakt 20,7 51,8
Inkubation mit Bakterienextrakt 18,9 47,3
Inkubation mit Bakterienextrakt 18,96 47,4
Daraus ist ersichtlich, dass der Extrakt aus Rhodococcus erythropolis unter den angegebenen Bedingungen einen etwa 50%ige Abbau von Zearalenon bewirkt. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Ochratoxin A und Zearalenon ist sowohl bei 20 °C als auch bei 30 °C ein bis zu 70%iger Abbau von Zearalenon gefunden worden.