WO2002016496A1 - Complexe polymere / polymere sensible a la temperature - Google Patents

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Noriyuki Ohnishi
Hirotaka Furukawa
Kazunori Kataoka
Katsuhiko Ueno
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Chisso Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive polymer complex that can be used for a separation agent, an immobilized enzyme, a denatured protein modifier, a microorganism separation method, or concentration, nucleic acid purification or concentration, drug release microcapsules, and the like.
  • PE0 Polyethylene oxide
  • PAAm polyacrylamide
  • PAAc polyacrylic acid
  • PMMc polyacrylic acid
  • a mixed aqueous solution of PAAm and PAAc forms an intermolecular complex under acidic conditions, and the complex shows the upper critical solution temperature (UCST), as shown by D ⁇ J. Eustance et all, J. Appl. Polym. Sci., 35, 707 (1988).
  • the above polymers form an interpolymer complex with the polyelectrolytes polyacrylic acid (PAAc) and polyacrylic acid (PMAAc).
  • PAAc polyelectrolytes polyacrylic acid
  • PMAAc polyacrylic acid
  • an object of the present invention is to find a technique capable of forming an interpolymer complex in response to temperature even under neutral to alkaline conditions.
  • the present invention has the following configuration.
  • a temperature-responsive polymer complex that is thermosensitive in an aqueous solution and contains poly-N-acetylacetylacrylamide and polyethylene glycol.
  • thermoresponsive polymer complex containing polyvinyl alcohol and polyethylene glycol and exhibiting heat sensitivity in an aqueous solution.
  • a temperature-responsive polymer-in-water complex that contains polyvinyl alcohol and polyacrylamide or polyacrylamide, and is thermosensitive in an aqueous solution.
  • the interpolymer complex of the present invention has temperature responsiveness even under neutral to alkaline conditions, its application range is greatly expanded.
  • a ligand having molecular recognition ability It can be widely applied to separation agents, test agents, immobilized enzymes, denatured protein modifiers, microorganism separation methods, or concentration, nucleic acid purification or concentration, and drug release microcapsules. Therefore, the present invention further includes the following configurations.
  • a mixture of the poly-N-acetylacrylamide and polyethylene glycol of the present invention, or a copolymer of N-acetylacrylamide and a hydrophilic or hydrophobic monomer and a polymer Mixtures with acrylamide or polymer acrylamide exhibit an upper critical solution temperature (UCST) in aqueous solution. That is, an interpolymer complex is formed at a temperature lower than the UCST temperature. In particular, it has coacervate ability.
  • a mixture of poly-N-acetylacrylamide and polyacrylamide or polymethacrylamide exhibits a lower critical solution temperature (LCST) in an aqueous solution. That is, at a temperature higher than the LCST temperature, an interpolymer complex is formed.
  • UCST upper critical solution temperature
  • LCST lower critical solution temperature
  • a mixture of polyvinyl alcohol and polyacrylamide or polyacrylamide, or a mixture of polyvinyl alcohol and polyethylene glycol exhibits both UCST and LCST in an aqueous solution.
  • UCST temperature at temperatures below the UCST temperature and above the LCST temperature, they form an interpolymer complex and have coacervate ability.
  • hydrophilic monomers copolymerized with N-acetylacrylamide examples include acrylamide, methylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylacrylamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacrylamide. And aryl alcohol.
  • hydrophobic monomer copolymerized with ⁇ -acetylacrylamide examples include acrylate, methyl acrylate, styrene, ⁇ -alkyl (preferably alkyl having 3 or more carbon atoms) acrylamide, Examples thereof include vinyl chloride, ethylene, and propylene.
  • hydrophilic or hydrophobic monomer preferably has a copolymerization ratio of 0.5 to 80%, particularly 5 to 70%, with respect to p-acetylacrylamide. Is preferred.
  • LCST lower critical solution temperature
  • LCST lower critical solution temperature
  • the molecular weight of the interpolymer complex obtained in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set according to the use and the like. Usually a range of hundreds to millions is appropriate. Although the molecular weight of each polymer constituting the interpolymer complex is not particularly limited, it is preferable that the difference in molecular weight between the respective polymers constituting the interpolymer complex is small. The smaller the difference in molecular weight, the more the temperature-responsive interpolymer complex with less transition temperature range of UCST and LCST is formed.
  • the concentration of each polymer dissolved in the aqueous solution can be appropriately set according to the application. Preferably, at 0.1% or more, good temperature responsiveness can be obtained.
  • the higher the polymer concentration in the aqueous solution the more the UCST tends to shift to a higher temperature side.
  • the temperature-responsive polymer mixture of the present invention shows UCST or LCST even under neutral to alkaline conditions
  • various applications are possible.
  • a ligand having molecular recognition ability can be immobilized on any one of the polymers constituting the above-mentioned temperature-responsive polymer mixture, whereby the separating agent, the test agent, the immobilized enzyme, and the denatured protein are modified. It can be widely applied to agents, separation methods for microorganisms, or concentration, purification or concentration of nucleic acids, drug release microcapsules, and the like.
  • ligands having molecular recognition ability examples include antigens, antibodies, and biotin.
  • Example 1 Poly-N-acetylacetylamide and PEG high molecular complex 1
  • Poly-N-acetylacrylamide having a molecular weight of about 13000 in 10 g of purified water, 800 mg and a molecular weight of about 8500
  • polyethylene glycol and 400 mg were mixed, an intermolecular complex was formed, and the mixture became cloudy.
  • Observation of this interpolymer complex with an optical microscope revealed that a coacervate with a diameter of about 1 micron was formed.
  • Example 2 Poly-N-acetyl acrylamide / PEG interpolymer complex 2
  • 800 mg of polyethylene glycol was mixed, a coacervate interpolymer complex was formed.
  • Example 3 Poly-N-acetylacetylamide and PEG high molecular complex 3
  • Poly-N-acetylacetylamide with a molecular weight of about 13000 in 10 g of purified water, 1.4 g, and a molecular weight of about 3000 When 320 mg of the polyethylene glycol was mixed, a coacervate interpolymer complex was formed.
  • the obtained coacervate showed UCST in the aqueous solution, and the temperature was 34 ° C both when the temperature was raised and when the temperature was lowered.
  • the measurement of UCST was performed after adjusting the pH of the aqueous solution to 7.4.
  • Example 8 complex between polyvinyl alcohol and polyethylene glycol
  • a mixture of 400 mg of polyvinyl alcohol having a molecular weight of about 10,000 (80% hydrolyzate) and 400 mg of polyacrylamide having a molecular weight of about 10,000 was mixed in 10 g of PBS sarin buffer solution to form a coacervate interpolymer complex.
  • the obtained coacervate showed LCST and UCST in aqueous solution.
  • LCST was 35 ° C during both heating and cooling
  • UCST was 84 ° C during both heating and cooling.
  • the measurement of LCST was performed after adjusting the pH of the aqueous solution to 7.4.
  • the polymer mixture of the present invention forms a polymer complex in response to heat
  • the solution shows UCST and / or LCST in aqueous solution.

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Description

明 細 温度応答性高分子間コンプレックス ぐ技術分野 >
本発明は分離剤、 固定化酵素、 変性蛋白改質剤、 微生物の分離方法、 もしくは 濃縮、 核酸の精製もしくは濃縮、 薬物放出マイクロカプセルなどに利用できる、 温度応答性高分子コンプレックスに関する。
<背景技術 >
水溶性高分子であるポリェチレンォキシド（PE0)、ポリアクリルァミ ド（PAAm)、 ポリアクリル酸（PAAc)或いはポリメ夕クリル酸（PMMc)は水溶液中で任意の温 度範囲で水に溶解する。しかし PE0と PAAcもしくは PMAAcの混合水溶液は酸性条 件下で高分子間コンプレックスを形成し、 そのコンプレックスは水溶液中で下限 臨界溶液温度 （LCST) を示すことが、 長田義仁、 斉藤祐、 日本化学会誌、 1、 171 ( 1976) に記載されている。
一方、 PAAmと PAAcの混合水溶液は酸性条件下、 高分子間コンプレックスを形 成し、そのコンプレックスが上限臨界溶液温度（UCST)を示すことが、 D · J. Eustance et all , J. Appl . Polym. Sci .， 35， 707 ( 1988)に記載されている。
しかしながら、上記に示す高分子は、高分子電解質であるポリアクリル酸 (PAAc) やポリメ夕クリル酸（PMAAc) との高分子間コンプレックスを形成するため、 中性 〜アル力リ性条件下では高分子電解質のカルボキシル基の解離が起こり、 高分子 間コンプレックスは形成されず、 その応用範囲に限界があった。
従って、 本発明の目的は、 中性〜アルカリ条件下でも温度に応答して高分子間 コンプレックスを形成することのできる技術を見出すことにある。
<発明の開示 >
今回我々は非イオン性高分子間における高分子間コンプレックスの形成を試み た結果、 非イオン性水溶性高分子同士で高分子間コンプレックスを形成すること を見出し、 本発明に至ったものである。 即ち、 本発明は、 下記の構成によりなる ものである。
( 1 )ポリ- N-ァセチルァクリルアミドとポリエチレングリコールとを含有する、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
( 2 )ポリ- N-ァセチルァクリルアミドとポリアクリルアミ ド又はポリメ夕クリル アミ ドとを含有する、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレック ス。
( 3 ) ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールとを含有する、 水溶液中 で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
( 4 ) ポリビニルアルコールとポリアクリルアミ ド又はポリメ夕クリルアミ ドと を含有する、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
( 5 )ポリ- N-ァセチルァクリルアミドが、 N -ァセチルァクリルアミ ドと親水性又 は疎水性モノマーとの共重合体である上記 （ 1 ) 又は （2 ) 記載の温度応答性高 分子間コンプレックス。
本発明の上記高分子間コンプレックスは、 中性〜アル力リ性条件下においても 温度応答性を有するため、 その応用範囲は格段に広がり、 例えば、 分子認識能を 有するリガンドを固定することにより、 分離剤、 検査薬、 固定化酵素、 変性蛋白 改質剤、 微生物の分離方法、 もしくは濃縮、 核酸の精製もしくは濃縮、 薬物放出 マイクロカプセルなどに幅広く応用することができる。 従って、 本発明は、 更に 下記の構成よりなるものである。
( 6 )ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ド、 ポリビニルアルコール、 ポリエチレング リコール、 ポリアクリルアミ ド及びポリメ夕クリルアミ ドのうちの少なくとも一 つが、 分子認識能を有するリガンドが固定されたものである上記 （ 1 ) 〜 （5 ) のいずれかに記載の温度応答性高分子間コンプレックス。
( 7 ) 上記 （6 ) 記載の温度応答性高分子間コンプレックスを用いた分離剤。 <発明を実施するための最良の形態 >
より具体的には、本発明のポリ- N-ァセチルァクリルアミ ドとポリエチレングリ コールの混合物、あるいは N-ァセチルァクリルアミ ドと親水性又は疎水性モノマ —との共重合体とポリアクリルアミ ド又はポリメ夕クリルアミ ドとの混合物は、 水溶液中で上限臨界溶液温度 （UCST) を示す。 すなわち、 UCST温度以下の温度に おいて、 高分子間コンプレックスを形成する。特に、 コアセルペート能を有する。 また、ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドとポリアクリルアミ ド又はポリメタクリ ルアミ ドとの混合物は、 水溶液中で下限臨界溶液温度（LCST) を示す。 すなわち、 LC ST温度以上の温度において、 高分子間コンプレックスを形成する。
更に、 ポリビニルアルコールとポリアクリルアミ ド又はポリメ夕クリルアミ ド との混合物、 あるいはポリビニルアルコールとポリエチレングリコールとの混合 物は、 水溶液中で UCST及び LCSTの双方を示す。 すなわち、 UCST温度以下 LCST 温度以上の温度において、 高分子間コンプレックスを形成し、 コアセルべート能 を有する。
上記の N-ァセチルアクリルアミ ドと共重合する親水性モノマーとしては、 ァク リルアミ ド、 メ夕クリルアミ ド、 N-メチルアクリルアミ ド、 N-ェチルアクリルァ ミ ド、 Ν,Ν-ジメチルアクリルアミ ド、 ァリルアルコール等を挙げることができる。 また、 Ν-ァセチルアクリルアミ ドと共重合する疎水性モノマ一としては、 ァクリ ル酸エステル、 メ夕クリル酸エステル、 スチレン、 Ν-アルキル （好ましくは炭素 数 3以上のアルキル） アクリルアミ ド、 塩化ビニル、 エチレン、 プロピレン等を 挙げることができる。
上記親水性又は疎水性モノマーは、 Ν-ァセチルアクリルアミ ドに対して、 0 . 5〜8 0 %の共重合比であることが好ましく、 特に 5〜7 0 %の共重合比である ことが好ましい。
本発明において、 LCST (下限臨界溶液温度） とは、 特定温度以下では溶解状態 を維持するが、その特定温度以上の溶液中では不溶性となり凝集する温度を言い、 UCST (上限臨界溶液温度） とは、 特定温度以上では溶解状態を維持するが、 その 特定温度以下の溶液中では不溶性となり凝集する温度を言う。すなわち、例えば、 「高分子混合物が水溶液中で下限臨界溶液温度 （LCST) を示す」 とは、 ある特定 温度（LCST)以下の溶液中では均一に分散するが、 溶液の温度を特定温度（LCST) 以上にすると高分子間コンプレックスを形成して凝集することを意味する。
本発明で得られる高分子間コンプレックスの分子量は特に限定的ではなく、 そ の用途等に併せて適宜設定することができる。 通常数百から数百万の範囲が適当 である。 また、 高分子間コンプレックスを構成する各高分子の分子量も特に限定 的ではないが、 高分子間コンプレックスを構成するそれそれの高分子間の分子量 の差が小さい方が好ましい。 分子量差が少ない方が、 UCSTや LCSTの転移温度幅 の少ない感熱性の良い温度応答性高分子間コンプレックスが形成される。
また、 水溶液中に溶解させた各高分子の濃度も、 用途に応じて適宜設定するこ とができる。 好ましくは 0 . 1 %以上において、 良好な温度応答性を得ることが できる。 また、例えば UCSTを示す高分子間コンプレックスは、水溶液中の高分子 濃度が高い方が、 UCSTが高温側にシフトする傾向がある。
本発明の温度応答性高分子混合物は、 中性〜アルカリ性条件下でも UCST 又は LCSTを示すため、 各種応用が可能である。特に、 上記温度応答性高分子混合物を 構成するいずれかの高分子に、 分子認識能を有するリガンドを固定することがで き、 これにより、 分離剤、 検査薬、 固定化酵素、 変性蛋白改質剤、 微生物の分離 方法、 もしくは濃縮、 核酸の精製もしくは濃縮、 薬物放出マイクロカプセルなど に幅広く応用することができる。
分子認識能を有するリガンドとしては、 抗原、 抗体、 ピオチンなどが挙げられ る。
<実施例 >
以下、 本発明の実施例により更に詳述するが、 本発明はこれらの実施例により 限定されるものではない。 なお、 水溶液中で示す、 UCST、 LCST の測定は可視光 (550nm) の透過率を用いて測定した。 また UCST、 LCSTは可視光の透過率が 50% の温度とした。 実施例 1 (ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドと PEGの高分子間コンプレックス 1) 精製水 10g中に分子量約 13000のポリ- N-ァセチルァクリルアミ ド、 800mgと分 子量約 8500のポリエチレングリコ一ル、 400mgを混合したところ高分子間コンプ レックスを形成し、 白濁した。 この高分子間コンプレックスを光学顕微鏡で観測 したところ、 直径約 1 ミクロンのコアセルべ一トを形成していた。
得られたコアセルペートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、降温時 共に 51°Cであった。 なお、 U C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整し た後行った。 実施例 2 (ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドと PEGの高分子間コンプレックス 2) 精製水 10g中に分子量約 13000のポリ- N-ァセチルァクリルアミ ド、 800mgと分 子量約 8500のポリエチレングリコ一ル、 800mgを混合したところコアセルべ一ト の高分子間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルべ一トは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、 76°C降 温時は 80°Cであつた。 なお、 U C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整 した後行った。 実施例 3 (ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドと PEGの高分子間コンプレックス 3) 精製水 10g中に分子量約 13000のポリ- N-ァセチルァクリルアミ ド、 1.4gと分 子量約 3000のポリエチレングリコ—ル、 320mgを混合したところコアセルべート の高分子間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルペートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、 23°C降 温時は 10°Cであった。 なお、 U C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整 した後行った。 実施例 4 (ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドとポリアクリルアミ ドの高分子間コン プレックス）
精製水 10g中に分子量約 13000のポリ- N-ァセチルアクリルアミ ド、 1. 3gと分 子量約 14000のポリエチレングリコール、 1.4gを混合したところ、高分子間コン プレックスを形成した。
得られた高分子間コンプレックスは水溶液中で LCSTを示し、その温度は昇温時、 降温時共に 23°Cであった。 なお、 LCSTの測定は、 該水溶液の pHを 7. 4に 調整した後行った。 実施例 5 (N-ァセチルアクリルアミ ド-アクリルアミ ド （1 :2)共重合体とポリア クリルアミ ドの高分子間コンプレックス 1)
精製水 10g中に分子量約 340000の N-ァセチルアクリルアミド-アクリルアミ ド (1 : 2) 共重合体、 200mgと分子量約 10000のポリアクリルアミ ド、 8mgを混合 したところ、 コアセルべ一トの高分子間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルべートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、降温時 共に 35°Cであった。 なお、 UCS Tの測定は、 該水溶液の pHを 7. 4に調整し た後行った。 実施例 6 (N-ァセチルアクリルアミ ド-アクリルアミ ド （1 :2) 共重合体とポリア クリルアミ ドの高分子間コンプレックス 2)
精製水 10g中に分子量約 340000の N-ァセチルアクリルアミド-アクリルアミ ド (1 :2)共重合体、 400mgと分子量約 10000のポリアクリルアミ ド、 16mgを混合 したところ、 コアセルペートの高分子間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルべートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、降温時 共に 66°Cであった。 なお、 UCS Tの測定は、 該水溶液の pHを 7. 4に調整し た後行った。 実施例 7 (N-ァセチルァクリルアミ ド -ァクリルアミ ド （1： 2)共重合体とポリァ クリルアミドの高分子間コンプレックス 3)
PBSサリン緩衝溶液 10g中に分子量約 340000の N-ァセチルァクリルアミ ド-ァ クリルアミド （1 : 2) 共重合体、 400mgと分子量約 10000のポリアクリルアミ ド、 16mgを混合したところ、 コアセルペートの高分子間コンプレックスを形成した。 得られたコアセルペートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、降温時 共に 34°Cであった。 なお、 U C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整し た後行った。 実施例 8 (ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールの高分子間コンプレ ックス）
精製水 10g中に分子量約 16000のポリビニルアルコール、 lgと分子量約 8000 のポリエチレングリコール、 500mg を混合したところ、 コアセルべ一トの高分子 間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルペートは水溶液中で UCSTを示し、その温度は昇温時、降温時 共に 42°Cであった。 なお、 U C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整し た後行った。 実施例 9 (ポリビニルアルコール （80%加水分解物） とポリアクリルアミドの高 分子間コンプレックス）
PBSサリン緩衝溶液 10 g中に分子量約 10000のポリビニルアルコール （80%加 水分解物） 400mgと分子量約 10000のポリアクリルァミ ド 400mgを混合したとこ ろ、 コアセルペートの高分子間コンプレックスを形成した。
得られたコアセルペートは水溶液中で LCSTと UCSTを示した。 LCSTは昇温時及 び降温時ともに 35°C、 UCSTは昇温時及び降温時ともに 84°Cであった。 なお、 L C S Tの測定は、 該水溶液の p Hを 7 . 4に調整した後行つた。 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と範 囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にと つて明らかである。
本出願は、 2000年 8月 23日出願の日本特許出願 No.2000— 252526に基づくも のであり、 その内容はここに参照として取り込まれる。 <産業上の利用可能性 >
本発明の高分子混合物は、 熱に応答して高分子コンプレックスを形成し、 中性
〜アル力リ上条件下でも、 水溶液中で UCST及び/又は LCSTを示す。
これにより、 分子認識能を有するリガンドを上記高分子混合物のいずれかの成 分中に固定することにより、 各種分離剤、 検査薬、 変性蛋白改質剤、 核酸の精製 剤又は薬物放出マイクロカプセル等に幅広く応用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ポリ- N-ァセチルァクリルアミ ドとポリエチレングリコールとを含有す る、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
2 . ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドとポリアクリルアミ ド又はポリメタク リルアミ ドとを含有する、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレ ヅクス。
3 . ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールとを含有する、 水溶 液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
4 . ポリビニルアルコールとポリアクリルアミ ド又はポリメ夕クリルアミ ドとを含有する、 水溶液中で感熱性を示す温度応答性高分子間コンプレックス。
5 . ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ドが、 N-ァセチルアクリルアミ ドと親水 性又は疎水性モノマーとの共重合体である請求項 1又は 2記載の温度応答性高分 子間コンプレックス。
6 . ポリ- N-ァセチルアクリルアミ ド、 ポリビニルアルコール、 ポリエチレ ングリコール、 ポリァクリルァミ ド及びポリメタクリルアミ ドのうちの少なくと も一つが、 分子認識能を有するリガンドが固定されたものである請求の範囲第 1 項〜第 5項のいずれかに記載の温度応答性高分子間コンプレックス。
7 . 請求の範囲第 6項記載の温度応答性高分子間コンプレックスを用いた 分離剤。
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