WO2001023348A1 - Stabilisiertes guanidinthiocyanat und dessen verwendung - Google Patents

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WO2001023348A1
WO2001023348A1 PCT/EP2000/009342 EP0009342W WO0123348A1 WO 2001023348 A1 WO2001023348 A1 WO 2001023348A1 EP 0009342 W EP0009342 W EP 0009342W WO 0123348 A1 WO0123348 A1 WO 0123348A1
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guanidine thiocyanate
stabilized
aqueous solution
thiocyanate according
thiourea
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PCT/EP2000/009342
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Inventor
Klaus-Peter Stengele
Winfried Kolbeck
Bernd Schulz
Original Assignee
Nigu Chemie Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/02—Guanidine; Salts, complexes or addition compounds thereof

Definitions

  • the present invention relates to stabilized guanidine thiocyanate and its use as a chaotropic substance in the isolation of nucleic acids from biological material.
  • EP-PS 389 063 describes a process for isolating nucleic acids from complex biological starting material, the starting material being mixed with a chaotropic substance and a nucleic acid-binding solid phase (such as SiO ⁇ ), the solid phase Separates nucleic acid complexes and, if necessary, elutes the nucleic acid from the corresponding complexes after washing.
  • a chaotropic substance which changes the secondary, tertiary or quaternary structure of the protein or nucleic acid and at least leaves the primary structure intact
  • guanidine salts and in particular guanidine thiocyanate are preferably recommended.
  • guanidine thiocyanate in a mixture with detergents as a chaotropic substance.
  • Guanidine thiocyanate is usually used in the form of an aqueous solution, so-called kits, which usually also contain buffer salts and auxiliary reagents.
  • kits which usually also contain buffer salts and auxiliary reagents.
  • a disadvantage of the use of guanidine thiocyanate in the isolation of nucleic acids from biological material is the fact that guanidine thiocyanate, particularly in the form of the aqueous solutions, is extremely sensitive to light and temperature.
  • the present invention was therefore based on the object of providing a stabilized guanidine thiocyanate which has sufficient light and temperature stability and with which no biochemical interactions with the biological starting materials can be determined at the same time.
  • the guanidine thiocyanate contains 5 to 5000 ppm, based on the weight of the guanidine thiocyanate, thiourea and / or N-acetylcysteine.
  • the guanidine thiocyanate stabilized according to the invention thus contains 5 to 5,000 ppm, preferably 10 to 100 ppm, (based on the weight of the guanidine thiocyanate) thiourea and N-acetylcysteine.
  • the guanidine thiocyanate can be present both in solid form and as an aqueous solution which preferably has a concentration of 30 to 70% by weight and has a pH of 4.5 to 7.0.
  • the aqueous solution may also contain the customary buffer salts and auxiliary reagents which are required for isolating nucleic acids from biological materials.
  • the aqueous guanidine thiocyanate solution preferably also contains 5 to 50 mmol of buffer salts selected from the group consisting of sodium acetate, sodium phosphate and tris hydrochloride. Dithiothreid (DTT), dithioerythritol (DTE) and mercaptoethanol are preferably used as auxiliary reagents in an amount of 50 to 100 mmol.
  • the aqueous guanidine thiocyanate solution also contains 1 to 10% by weight of SiC> 2 particles, which is required as a solid phase in nucleic acid isolation.
  • the preparation of the guanidine thiocyanate stabilized according to the invention is relatively unproblematic in that, for example, solid guanidine thiocyanate is mixed with the appropriate amounts of thiourea and / or N-acetylcysteine and then mixed homogeneously.
  • aqueous guanidine thiocyanate solutions stabilized guanidine thiocyanate can be converted into the aqueous phase or aqueous guanidine thiocyanate solutions can be mixed with the appropriate amounts of thiourea and / or N-acetylcysteine.
  • Another object of the present invention is the use of guanidine thiocyanate stabilized with thiourea and / or N-acetylcysteine as a chaotropic substance in the isolation of nucleic acids from biological material, the guanidine thiocyanate being used in the form of an aqueous solution, if appropriate with the customary additions of buffer salts, auxiliary reagents and solid phase materials.
  • the guanidine thiocyanate stabilized according to the invention Due to its excellent light and temperature stability of at least 4 months and the low interaction with the most important biochemical systems, the guanidine thiocyanate stabilized according to the invention has proven itself extremely well in practice.
  • a guanidine thiocyanate which has been stabilized with 10 to 20 ppm thiourea and / or N-acetylcysteine has proven particularly suitable.
  • sample A3 is mixed with 1 mg of thiourea (approx. 20 ppm) and mixed thoroughly
  • sample A4 is mixed with 1 mg of N-acetyl-L-cysteine (approx. 20 ppm) and also mixed thoroughly
  • sample A2 , A3 and A4 then stored under the usual daylight at the window. The samples were examined optically for staining.
  • sample A5 is stored in the dark, sample A7 mixed with 1 mg thiourea (approx. 10 ppm) and mixed thoroughly, sample A8 mixed with 1 mg N-acetylcysteine (approx. 10 ppm) and also mixed thoroughly, samples A6, A7 and A8 then stored under the usual daylight at the window. The samples were examined optically for staining and, after intensive mixing, for turbidity.
  • Example 2 Each 2 g of solutions prepared as in Example 2 are mixed with 100 mg SiO 2 (Aerosil, Akzo). Probe Bl is stored in the dark. Samples B2, B3 and B4 are then stored under the usual daylight at the window. The samples were examined optically for coloring and after intensive mixing after settling of the silica particles for turbidity.

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Es wird stabilisiertes Guanidinthiocyanat beschrieben, welches 5 bis 5 000 ppm, bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats, Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein enthält. Aufgrund seiner ausgezeichneten Licht- und Temperaturstabilität und der geringen Wechselwirkung mit den biochemischen Systemen eignet sich das erfindungsgemäss stabilisierte Guanidinthiocyanat hervorragend als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.

Description

Stabilisiertes Guanidinthiocyanat und dessen Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft stabilisiertes Guanidinthiocyanat und dessen Verwendung als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.
Aufgrund der steigenden Bedeutung von DNA- oder RNA-Analysen im medizinischen und biotechnischen Bereich ist die Nachfrage nach einfachen und effektiven Methoden zur Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material sehr stark angestiegen.
So wird bspw. in der EP-PS 389 063 ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus komplexem biologischem Ausgangsmaterial beschrieben, wobei man das Ausgangsmaterial mit einer chaotropen Substanz und einer Nucleinsäure bindenden Festphase (wie z. B. SiO^) mischt, die Festphase- Nucleinsäure-Komplexe abtrennt und ggf. nach dem Waschen die Nucleinsäure von den entsprechenden Komplexen eluiert . Als chaotrope Substanz, welche die Sekundär-, Tertiär- oder Quarternärstruktur des Proteins oder der Nucleinsäure ändert und zumindest die Primärstruktur intakt läßt, werden vorzugsweise Guanidinsalze und insbesondere Guanidinthiocyanat empfohlen.
Auch entsprechend der Veröffentlichung von Piotr Chomczynski et al. in Biotechnics, Vol. 22, Nr. 3 (1997) wird Guanidinthiocyanat im Gemisch mit Detergenzien als chaotrope Substanz beschrieben. Guanidinthiocyanat wird üblicherweise hierbei im Form einer wäßrigen Lösung, sog. Kits, eingesetzt, die üblicherweise noch Puffersalze und Hilfsreagenzien enthalten . Nachteilig bei der Verwendung von Guanidinthiocyanat bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material ist die Tatsache, daß Guanidinthiocyanat, insbesondere in Form der wäßrigen Lösungen, äußerst licht- und temperaturempfindlich ist. Vor allem im schwach sauren Medium (pH 4,5 bis 7,0) kommt es zu unerwünschten Redoxreaktionen, wobei elementarer Schwefel als Zersetzungsprodukt entsteht . Durch die Zersetzungsreaktion, die sich durch eine intensive Gelbfärbung bemerkbar macht, wird das eingesetzte Material in kürzester Zeit unbrauchbar.
Zur Lösung dieses Problems wurde bereits vorgeschlagen, den Guanidinthiocyanat -Lösungen Stabilisatoren in Form von Komplexbildnern, wie z. B. EDTA, zuzusetzen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß derartige Komplexbildner mit dem biologischen Material unerwünschte biochemische Interaktionen eingehen.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein stabilisiertes Guanidinthiocyanat bereitzustellen, welches eine ausreichende Licht- und Temperaturstabilität aufweist und mit dem gleichzeitig keinerlei biochemische Wechselwirkungen mit den biologischen Ausgangsmaterialien festzustellen ist.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Guanidinthiocyanat 5 bis 5 000 ppm bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats , Thioharnstoff und/oder N- Acetylcystein enthält.
Es hat sich hierbei überraschenderweise gezeigt, daß durch diesen Zusatz die Licht- und Temperaturstabilität von Guanidinthiocyanat erheblich verbessert wird, ohne dessen Produkteigenschaften, insbesondere die spektroskopischen Eigenschaften, negativ zu beeinflussen. Das erfindungsgemäß stabilisierte Guanidinthiocyanat enthält also 5 bis 5 000 ppm, vorzugsweise 10 bis 100 ppm, (bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats) Thioharnstoff und N- Acetylcystein . Das Guanidinthiocyanat kann hierbei sowohl in fester Form als auch als wäßrige Lösung vorliegen, die vorzugsweise eine Konzentration von 30 bis 70 Gew.-% aufweist und einen pH-Wert von 4,5 bis 7,0 besitzt.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ohne weiteres möglich, daß die wäßrige Lösung noch die üblichen Puffersalze und Hilfsreagenzien enthält, die bei der Nucleinsäuren- Isolierung aus biologischen Materialien erforderlich sind. Vorzugsweise enthält die wäßrige Guanidinthiocyanat -Lösung noch 5 bis 50 mmol Puffersalze ausgewählt aus der Gruppe Natriumacetat , Natriumphosphat und Tris-Hydrochlorid. Als Hilfsreagenzien werden vorzugsweise Dithiothreid (DTT) , Dithioerythrit (DTE) sowie Mercaptoethanol in einer Menge von 50 bis 100 mmol eingesetzt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die wäßrige Guanidinthiocyanat-Lösung noch 1 bis 10 Gew.-% an SiC>2-Partikeln, die bei der Nucleinsäuren-Isolierung als Festphase benötigt wird.
Die Herstellung des erfindungsgemäß stabilisierten Guanidinthiocyanats ist relativ unproblematisch, indem bspw. festes Guanidinthiocyanat mit den entsprechenden Mengen an Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein versetzt und anschließend homogen vermischt wird. Zur Herstellung von wäßrigen Guanidinthiocyanat-Lösungen kann bereits stabilisiertes Guanidinthiocyanat in die wäßrige Phase übergeführt werden oder wäßrige Guanidinthiocyanat -Lösungen mit den entsprechenden Mengen an Thioharnstoff und/oder N- Acetylcystein versetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des mit Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein stabilisierten Guanidinthiocyanats als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material, wobei das Guanidinthiocyanat in Form einer wäßrigen Lösung ggf. mit den üblichen Zusätzen an Puffersalzen, Hilfsreagenzien und Festphasenmaterialien eingesetzt wird.
Aufgrund ihrer ausgezeichneten Licht- und Temperaturstabilität von mindestens 4 Monaten und der geringen Wechselwirkung mit den wichtigsten biochemischen Systemen hat sich das erfindungsgemäß stabilisierte Guanidinthiocyanat hervorragend in der Praxis bewährt .
Als besonders gut geeignet hat sich ein Guanidinthiocyanat erwiesen, welches mit 10 bis 20 ppm Thioharnstoff und/oder N- Acetylcystein stabilisiert wurde.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen .
Beispiele
Beispiel 1
Je 50 g festes Guanidinthiocyanat (Reinheit 99,6 %) wird in eine Laborglasflasche (Schott, Duran, hell) gefüllt. Probe AI wird unter Lichtausschluß gelagert, Probe A3 mit 1 mg Thioharnstoff (ca. 20 ppm) versetzt und intensiv durchmischt, Probe A4 mit 1 mg N-Acetyl-L-Cystein (ca. 20 ppm) versetzt und ebenfalls intensiv durchmischt, Proben A2 , A3 und A4 sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert . Die Proben wurden optisch auf Färbungen untersucht .
Figure imgf000006_0001
V Vergleich , E = Erfindung
Beispiel 2
Je 50 g festes Guanidinthiocyanat (Reinheit 99,6 %) wird in eine Laborglasflasche (Schott, Duran, hell) gefüllt und in 50 g vollentsalztem Wasser (Millipore Laborreinst- wassererzeugungsanlage) gelöst. Probe A5 wird unter Lichtausschluß gelagert, Probe A7 mit 1 mg Thioharnstoff (ca. 10 ppm) versetzt und intensiv durchmischt, Probe A8 mit 1 mg N-Acetylcystein (ca. 10 ppm) versetzt und ebenfalls intensiv durchmischt, Proben A6 , A7 und A8 sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert. Die Proben wurden optisch auf Färbungen und nach intensivem Durchmischen auf Trübungen untersucht .
Figure imgf000006_0002
V Vergleich Erfindung Beispiel 3
Je 2 g Lösungen wie unter Beispiel 2 hergestellt werden mit 100 mg Siθ2 (Aerosil, Akzo) versetzt. Probe Bl wird unter Lichtausschluß gelagert. Proben B2 , B3 und B4 werden sodann unter üblicher Tageslichteinstrahlung am Fenster gelagert. Die Proben wurden optisch auf Färbungen und nach intensivem Durchmischen nach Absetzen der Silica Partikel auf Trübungen untersucht .
Figure imgf000007_0001
V = Vergleich , E = Erfindung

Claims

Patentansprüche
1. Stabilisiertes Guanidinthiocyanat, dadurch gekennzeichnet, daß es 5 bis 5 000 ppm, bezogen auf das Gewicht des Guanidinthiocyanats, Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein enthält.
2. Guanidinthiocyanat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Thioharnstoff und/oder N-Acetylcystein 10 bis 100 ppm beträgt.
3. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, daß es in fester Form vorliegt.
4. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 30 bis 70 Gew.-% vorliegt.
5. Guanidinthiocyanat nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 4,5 bis 7,0 aufweist.
6. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch 5 bis 50 mmol Puffersalze, ausgewählt aus der Gruppe Natriumacetat , Natriumphosphat und Tris-Hydrochlorid, enthält.
7. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch mit 50 bis 100 mmol an Hilfsreagenzien, wie z. B. Dithiothreid (DTT) , Dithioerythrit (DTE) sowie Mercaptoethanol , versetzt ist.
8. Guanidinthiocyanat nach den Ansprüchen 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung noch 1 bis 10
Gew.-% an Siθ2"Partikeln enthält. Verwendung des stabilisierten Guanidinthiocyanats nach den Ansprüchen 1 bis 8 als chaotrope Substanz bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0389063A2 (de) * 1989-03-23 1990-09-26 Akzo Nobel N.V. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE19755960C1 (de) * 1997-12-16 1998-11-26 Hoechst Ag Verfahren zum Aufschluß von biologischem Material

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