DE3877565T2

DE3877565T2 - Kaltes stabiles fluessiges kreatininreagenz.

Info

Publication number: DE3877565T2
Application number: DE8888906417T
Authority: DE
Inventors: Bret Seaton
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1987-06-26
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1993-07-08
Anticipated expiration: 2008-06-17
Also published as: EP0344220A1; US4950611A; ATE84620T1; WO1988010429A1; ES2006999A6; CA1309000C; JP2609920B2; US4950611B1; EP0344220B1; AU602111B2; DE3877565D1; JPH01503646A; AU2079688A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Reaktionssystem für die Bestimmung von Kreatinin.
Kreatinin, 1-Methylglycocyamidin, , C&sub4;H&sub7;ON&sub3;, ist das Endprodukt des Kreatininmetabolismus. Es ist eines der nichtproteinhältigen Bestandteile des Blutes. Kreatinin ist ein normaler alkalischer Bestandteil von Urin und Blut. Der Mensch scheidet ungefähr 0,02 gm/kg des Körpergewichts täglich über die Nieren aus. Größere Mengen Kreatinin in Körperflüssigkeiten sind im allgemeinen ein Zeichen für renale Störungen.
Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Bestimmung von Kreatinin in Körperflüssigkeit. Die meisten dieser Methoden beruhen auf der Pikratreaktion mit Kreatinin unter alkalischen Bedingungen, wie von Jaffé M. Jaffé, Z. Physiol., Chem., 10(1886)391 beschrieben. Der Kreatinin- Pikratkomplex absorbiert stark bei 520 nm, und sein Vorhandensein kann kolorimetrisch gemessen werden. Die Kreatininkonzentration kann somit entweder durch Messen der endgültigen Absorptionsfähigkeit bei 520 nm oder durch Messung der Veränderungsrate der Absorptionsfähigkeit bei 520 nm bestimmt werden. Letzere Messung ist als die Jaffé-Absorptionsänderungsmethode bekannt (rate Jaffé method).
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Substanzen in Körperflüssigkeiten mit der Jaffé-Reaktion interferieren und die Farbbildung verstärken. Diese Substanzen umfassen z.B. Glucose, Proteine, Acetoacetat und Pyruvat. Die Jaffé-Reaktion weist daher einen Mangel an Spezifizität auf. Es wurden Versuche unternommen, das Kreatinin von den interferierenden Substanzen (Proteine, Kohlenhydrate, etc.) zu trennen, z.B. mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie. Diese Methode ist jedoch zeitaufwendig, erfordert bestens geschultes Personal und ist nicht geeignet für die Routineanalyse einer großen Anzahl von Proben.
Die übliche Praxis besteht in der Verwendung von Boraten und organischen Sulfaten, um nichtspezifische Farbbildung aufgrund der Interferenz durch die Reaktion von chromogenbildenden Substanzen (außer Kreatinin) mit Pikrat unter alkalischen Bedingungen zu eliminieren. Diese Methode ermöglicht die Kreatininbestinmiung ohne vorhergehende Deproteinisierung. Zum Beispiel verbinden sich Proteine mit Natriumdodecylsulfat (SDS), um sehr stabile Komplexe mit einer großen Anzahl von negativ geladenen Sulfatgruppen zu bilden. Borate bilden negativ geladene Komplexe mit Kohlenhydraten unter alkalischen Bedingungen. Kohlenhydrate sind neutral. Eine Erklärung für die Effizienz von SDS und Borat besteht darin, daß die negativ geladenen Komplexe und die Pikrationen einander abstoßen und somit an einer Reaktion gehindert werden. Auf diese Weise kann nichtspezifische Farbbildung bei der Jaffé-Reaktion reduziert werden. Weiters erlaubt das Vorhandensein von SDS die Herstellung einer Reaktionsmischungsleerprobe, da eine Säuerung zur Eliminierung der Kreatininfarbe die negativen SDS-Proteinkomplexe nicht ausfällt. Dadurch wird die Messung der Leerprobenabsorbptionsfähigkeit ermöglicht. Es wurde berichtet, daß die Resultate, welche man bei Verwendung der SDS-Boratreagenzien erhielt, gut mit jenen korrelieren, welche man mit einer Methode umfassend die Isolierung von Kreatinin mit Hilfe eines chromatographischen Verfahrens erhielt.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung beeinflußt auch die Farbentwicklung. Je höher der pH-Wert umso schneller die Rate der Farbbildung und umso intensiver die endgültige Farbe. Es ist übliche Praxis, einen pH-Puffer, wie z.B. einen Phosphatpuffer, in das alkalische SDS-Boratreagens einzuführen. Dadurch wird der pH-Wert innerhalb eines vorbestimmten, engen Bereiches gehalten, wie z.B. ein pH- Wert der endgültigen Reaktionsmischung von 12 bis 13 ± 0,2. Das Borat wirkt auch als ein pH-Puffer.
In modernen, automatischen Analysevorrichtungen werden größere Mengen von Reagenzien häufig im Gerät selbst gelagert. Somit können Mehrfachproben analysiert werden, bevor ein Wiederauffüllen notwendig ist. In der klinischen Praxis sind jedoch viele Reagenzien bei Raumtemperaturen unstabil und erfordern Kühlung. Daher sind bestimmte moderne, automatische Analysevorrichtungen mit gekühlten Reagenzienkammern versehen. Darin liegt das durch die vorliegende Erfindung gelöste Problem.
Wegen der relativ labilen Natur des Pikrations unter alkalischen Bedingungen umfaßt ein flüssiges Kreatininreagens auf der Basis der Jaffé-Reaktion im allgemeinen zwei Komponenten. Die erste Komponente, eine Pikrinsäurelösung, umfaßt Pikrinsäure und deionisiertes Wasser. Die zweite Komponente, ein alkalischer Puffer, kann Natriumdodecylsulfat und Natriumtetraborat zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine und Kohlenhydrate, Natriumphosphat als pH-Puffer, Natriumhydroxid zur Schaffung von Alkalität, Polypropylenglycol zur Schaumeinstellung und deionisiertes Wasser umfassen. Der dynamische Bereich eines Kreatinin-Reaktionssystems wird im allgemeinen als der Kreatininkonzentrationsbereich der Probe definiert, innerhalb welchem die lineare Extrapolation von Resultaten akzeptabel ist. Für ein Kreatinin-Reaktionssystem mit einem dynamischen Bereich von 0,3 bis 25 mg/dl Kreatinin kann das folgende Reaktionssystem verwendet werden: (a) Pikrinsäurekomponente: 50 mM Pikrinsäure; (b) alkalischer Puffer: pH 13,1. Die Komponenten werden in einem Verhältnis von 1:4 (Pikrinsäure zu alkalischem Puffer) gemischt, um ein assayfertiges Reagens zu bilden. Die Probe und das assayfertige Reagens werden in einem Verhältnis von 1:5 (Probe: assayfertiges Reagens) gemischt. Zum Zwecke der Vereinfachung werden ähnliche Konzentrationen, Bereiche und Verhältnisse durchgehend in dieser Anmeldung verwendet.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß die aktiven Bestandteile in den beiden getrennten Komponenten bei niederen Temperaturen aus der Lösung präzipitieren können. Zum Beispiel bei einer Pikrinsäurelösung mit einer Pikrinsäurekonzentration von 50 nM oder mehr erfolgt die Kristallbildung bei ungefähr 10ºC. Beim alkalischen Puffer präzipitiert Natriumdodecylsulfat bei einer Konzentration von 1,5 Gew.% (in Gramm pro Deziliter) oder mehr bei Temperaturen von weniger als 18ºC. Andere gelöste Stoffe, wie z.B. Natriumphosphat und Natriumtetraborat, präzipitieren auch im Bereich von Gefriertemperaturen.
Ein Hauptproblem bei solchen Präzipitaten liegt darin, daß sie mit der Reagensmessung in der automatischen Analysevorrichtung interferieren können. Im schlimmsten Fall können die Präzipitate die Mikropipetten verstopfen und das genaue Messen der flüssigen Komponenten stören. Dadurch wird die Assayreproduzierbarkeit ein Problem. Eine Lösung des Problems besteht natürlich darin, die Analysevorrichtung mit mehrfachen Reagenskammern zu versehen, wobei einige gekühlt und einige auf Raumtemperatur gehalten werden. Dies ist jedoch nicht zufriedenstellend, da damit kompliziertere Konstruktionen und somit höhere Kosten verbunden sind.
Erforderlich ist ein Reagens für die Bestimmung von Kreatinin mit Komponenten, bei denen sich keine Präzipitationsprobleme bei niederen Temperaturen ergeben.
Die vorliegende Erfindung deckt diesen Bedarf. Sie betrifft ein kältestabiles Reaktionssystem, das für die Verwendung in einer Jaffé Methode für die Bestimmung von Kreatinin geeingnet ist, umfassend:
(a) eine homogene, flüssige Pikrinsäurekomponente enthaltend Pikrinsäure in einer Menge von nicht mehr als 40 mM, sodaß die Pikrinsäurekomponente bei einer Temperatur von nur 0ºC bis zu einem Jahr oder mehr sichtbar homogen bleibt;
(b) eine homogene, flüssige, alkalische Pufferkomponente enthaltend:
(i) eine alkalische Substanz in einer Menge, die ausreicht, um den pH-Wert der alkalischen Pufferkomponente auf mehr als 13 zu halten, zur Einstellung des pH-Wertes des assayfertigen Reagens gebildet durch Kombination der Pikrinsäure und der alkalischen Pufferkomponenten;
(ii) mindestens eine pH-Puffersubstanz;
(iii) ein Detergens zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine in der Jaffé-Methode; und
dadurch gekennzeichnet, daß die alkalischen Pufferkomponenten im wesentlichen keine Metallkationen enthalten, sodaß die Komponente bei einer Temperatur von nur 0ºC bis zu einem Jahr oder mehr sichtbar homogen bleibt.
Das Detergens ist vorzugsweise ein lösliches, organisches Sulfat mit einem Kationenteil und einem Anionenteil, wobei der Anionenteil ein organisches Sulfat mit 8 bis 12 Kohlenstoffen ist, und der Kationenteil aus der Gruppe bestehend aus Diethanolamin, Diethylamin, Triethanolamin und Triethylamin ausgewählt wird; und worin die alkalische Substanz aus der Gruppe bestehend aus Tetramethylammoniumhydroxid und
Tetramethanolammoniumhydroxid ausgewählt wird. Der alkalische Puffer umfaßt vorzugsweise weiters 1% (v/v) n- Butanol und Polypropylenglycol in einer Menge zwischen 0 und 2% (v/v).
Die Pikrinsäurekomponente umfaßt vorzugsweise nicht mehr als 35 mM Säure. Vorzugsweise enthält die alkalische Pufferkomponente auch Borat zum Reduzieren der Kohlenhydrate in der Jaffé-Methode. Vorzugsweise bleibt sowohl die Pikrinsäurekomponente als auch die alkalische Pufferkomponente zumindest bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage lang oder mehr sichtbar homogen.
In einer bevorzugten Ausführung ist das kältestabile Reaktionssystem geeignet für die Verwendung in einer Jaffé-Absorptionsänderungsmethode für die Bestimmung von Kreatinin in einer Probe mit einer Kreatininkonzentration im Bereich von 0,3 bis 30 mg/dl, wobei das Reaktionssystem umfaßt:
(a) eine homogene, flüssige Pikrinsäurekomponente bestehend aus 35 mM Pikrinsäure und deionisiertem Wasser, sodaß die Pikrinsäurekomponente bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage oder mehr sichtbar homogen bleibt;
(a) eine homogene, flüssige, alkalische Pufferkomponente umfassend:
(i) Tetramethylammoniumhydroxid in einer Menge zwischen 350 und 550 mM;
(ii) Phosphorsäure als Puffer in einer Menge zwischen 25 und 35 mM;
(iii) Diethanolamindodecylsulfat in einer Menge zwischen 1,2 und 1,5 % (v/v) als Detergens zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine in der Jaffé-Absorptionsänderungsmethode;
(iv) O-Borsäure in einer Menge zwischen 40 und 60 mM zur Herabsetzung der Interferenz durch Kohlenhydrate in der Jaffé-Absorptionsänderungsmethode;
(v) 1 % (v/v) n-Butanol; und
(vi) Polypropylenglycol in einer Menge zwischen 0 und 2 % (v/v);
dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Pufferkomponente im wesentlichen keine Metallkationen enthält, sodaß die Komponente bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage oder mehr sichtbar homogen bleibt, und daß ein assayfertiges Reagens gebildet durch Kombination von einem Teil der Pikrinsäurekomponente und vier Teilen der alkalischen Pufferkomponente einen pH-Wert von 13,1 oder mehr hat.
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung, den dazugehörigen Ansprüchen und den beiliegenden Zeichnungen besser verständlich, in denen
die Fig. 1 eine graphische Darstellung des Linearitätsbereichs einer bevorzugten Form eines erfindungsgemäßen kältestabilen Kreatininreagens ist,
die Fig. 2 bis 5 graphische Darstellungen sind, die die Interferenzwirkungen von Lithiumacetoacetat und Cefalotin auf eine bevorzugte Form eines erfindungsgemäßen kältestabilen Kreatininreagens zeigen, und
die Fig. 6 bis 9 graphische Darstellungen sind, die die Interferenzwirkungen von Lithiumacetoacetat und Cefalotin auf (a) ein herkömmliches Kreatininreagens und (b) eine bevorzugte Form des erfindungsgemäßen kältestabilen Kreatininreagens vergleichen.
Das erfindungsgemäße Kreatininreagens hat zwei homogene flüssige Komponenten, nämlich eine Pikrinsäurekomponente und eine alkalische Pufferkomponente. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die wesentliche Eliminierung von Metallionen aus der alkalischen Pufferkomponente die alkalische Pufferkomponente kältestabil macht. Wird die Pikrinsäurekonzentration in der Pikrinsäurekomponente unter 40 mM gehalten, so wird auch die Pikrinsäurekomponente kältestabil. "Kältestabil" bedeutet in diesem Zusammenhang sichtbar homogen bleiben, d.h. keine sichtbare Trübung oder Präzipitatbildung bei einer Temperatur von 2 bis 8ºC in einem Zeitraum von 30 Tagen oder mehr. Vorzugsweise bleiben die kältestabilen Reagenzien bei einer Temperatur bis zu 0ºC ein Jahr oder mehr sichtbar homogen.
Zum Zwecke der Vereinfachung bezieht sich die folgende Beschreibung auf eine bevorzugte Form des erfindungsgemäßen, flüssigen Kreatinin-Reaktionssystems, in welchem die beiden Komponenten zur Mischung in einem Verhältnis von 1:4 (Pikrinsäure: alkalischer Puffer) vorgesehen sind, um ein assayfertiges Reagens zu bilden. Das assayfertige Reagens ist mit der Probe in einem Verhältnis von 5:1 (Reagens:Probe) zu mischen. Der dynamische Bereich des Reaktionssystems (d.h. der Kreatininkonzentrationsbereich der Probe, in welchem die lineare Extrapolation von Ergebnissen akzeptabel ist) liegt zwischen 0,3 und 30 mg/dl. Diese Zahlen dienen nur der Erläuterung und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
Das erfindungsgemäße kältestabile, flüssige Kreatininreagens umfaßt zwei homogene, flüssige Komponenten, nämlich eine Pikrinsäurekomponente und eine alkalische Pufferkomponente.
Die Pikrinsäurekomponente umfaßt Pikrinsäure in einer Menge von nicht mehr als 40 mM, besser von nicht mehr als 35 mM, und deionisiertes Wasser. Diese Pikrinsäurekomponente bleibt sichtbar homogen bei einer Temperatur von nur 0ºC über den Zeitraum von einem Jahr oder mehr. Da ein Herabsetzen der Pikrinsäurekonzentration die Assayaktivität in einer Jaffé-Reaktion reduziert, soll die Pikrinsäurekonzentration vorzugsweise so hoch wie möglich sein, ohne das oben angeführte Limit zu überschreiten.
Die alkalische Pufferkomponente umfaßt:
(a) eine alkalische Substanz in einer Menge, die ausreicht, um den pH-Wert der alkalischen Pufferkomponente auf mehr als 13 zu halten, zur Einstellung des pH-Wertes des assayfertigen Reagens begildet durch Kombination der Pikrinsäure und der alkalischen Pufferkomponenten;
(b) mindestens eine pH-Puffersubstanz; und
(c) ein Detergens zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine in der Jaffé-Methode;
wobei die alkalischen Pufferkomponenten im wesentlichen keine Metallkationen enthalten, sodaß die Komponente bei einer Temperatur von nur 0ºC bis zu einem Jahr oder mehr sichtbar homogen bleibt.
Vorzugsweise enthält die alkalische Pufferkomponente auch Borat zur Herabsetzung der Interferenz durch Kohlenhydrate in der Jaffé-Methode. Vorzugsweise bleiben die Pikrinsäure- und die aklaische Pufferkomponente bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage oder mehr sichtbare homogen.
Bei der herkömmlichen alkalischen Pufferkomponente sind die funktionellen Verbindungen meistens anionischer Natur: die Dedecylsulfat- und Boratanionen verhindern Protein und Kohlenhydratinterferenz, das Borat und Phosphat puffern den pH-Wert, und Hydroxylionen aus Natriumhydroxid halten den hohen pH-Wert. Es hat sich gezeigt, daß kalte Präzipitation in der alkalischen Pufferkomponente ein Problem darstellt, wenn die Gegenionen (Kationen) Metallionen sind. Das Präzipitationsproblem wird noch ausgeprägter bei stärker löslichen Metallarten, wie z.B. Lithium, Natrium, Kalium und Magnesium. Es hat sich gezeigt, daß die wesentliche Eliminierung von Metallionen aus der alkalischen Pufferkomponente das Präzipitationsproblem bei niederer Temperatur löst. Die bleibende Aufgabe ist die Wahl von geeigneten Gegenionen (Kationen). Kriterien für die Auswahl von Gegenionen in der alkalischen Pufferkomponente umfassen: gute Löslichkeit der beteiligten chemischen Arten, geringe oder keine Interferenz mit der Funktion der Anionen, Verfügbarkeit und angemessene Kosten.
Im erfindungsgemäßen Reaktionssystem kann das Detergens ein organisches Sulfatdetergens mit 8 bis 12 Kohlenstoffen sein. Beispiele sind Octosulfate, Decylsulfate, Dodecylsulfate, etc. Geeignete Gegenionen für das Detergenssulfat umfassen Amine, wie z.B. Diethanolamin, Triethanolamin, Diethylamin, Triethylamin, etc. Häufig sind nur Di- und Triethanolaminsalze von Dodecylsulfat ohne weiteres bei angemessenen Kosten verfügbar. Die anderen Salze könnten durch herkömmliche Titration der sauren organischen Sulfate hergestellt werden. Die Ammoniumsalze von organischen Sulfaten sind im Hinblick auf pH-Wert und Flüchtigkeit nicht akzeptabel. Tetraalkylammoniumsalze von organischen Sulfaten sollten vermieden werden, da hohe Konzentrationen von Tetraalkylammoniumionen Präzipitation mit Pikrationen verursachen können. Ein bevorzugtes Detergens ist Diethanolamindodecylsulfat im Hinblick auf Kosten und Verfügbarkeit. Es ist zu beachten, daß die meisten im Handel erhältlichen Formen von Diethanolamindodecylsulfat kleine Mengen von Dodecanol und anderen aliphatischen Alkoholen mit hohem Molekulargewicht (C8-C13) enthalten, welche in der alkalischen Pufferkomponente bei Temperaturen von weniger als 20ºC Trübung verursachen können. Zur Kompensierung kann ein linearer Alkohol mit niederem Molekulargewicht, wie z.B. n-Butanol, der alkalischen Pufferkomponente beigegeben werden, um die Alkohole mit hohem Molekulargewicht in Lösung zu halten. Es hat sich gezeigt, daß n-Butanol mit einer Konzentration bis zu 1% (v/v) mit Bestimmungen durch die Jaffé-Absorptionsänderungsmethode nicht interferieren.
Die Hydroxidquelle für den alkalischen Puffer kann Tetramethylammoniumhydroxid (TMA-OH) sein. Andere Tetraalkylammoniumhydroxyde (z . B. Tetraethyl-, Propyl-, Butyl- , etc.) mit hohem Molekulargewicht sind nicht zufriedenstellend. Sie bilden fast augenblicklich Präzipitate mit Pikrat und interferieren mit dem Kreatininassay. Quaternäre Ammoniumverbindungen werden in der Forschung häufig verwendet, entweder zur Reinigung von polyanionischen Polysacchariden oder zur Fraktionierung von sauren Polysacchariden von neutralen Polysacchariden durch selektive Präzipitation. Es wurde auch berichtet, daß quaternäre Ammoniumkationen mit Pikrinsäure quantitativ präzipitiert werden können. Es ist erstaunlich, daß Tetramethylammoniumhydroxid geeignet ist, die im alkalischen Puffer erforderliche Alkalität zu schaffen. Abhängig von der Konzentration der Arten bilden Tetramethylammoniumionen (TMA&spplus;) Präzipitate mit Pikrationen, es dauert jedoch im allgemeinen mehr als fünfzehn Minuten bis die Präzipitate bemerkbar werden. Dies dauert beträchtlich länger als die drei bis zehn Minuten, die für die Durchführung einer Jaffé-Absorptionsänderungsmethode in einer automatischen Analysiervorrichtung erforderlich sind. Da die Präzipitation von TMA-Pikrat mit einer höheren TMA&spplus;-Konzentration schneller wird, wird die TMA&spplus;-Konzentration in der alkalischen Pufferkomponente auf einem Minimum gehalten. In einem Kreatinin-Reaktionssystem, wo die Komponenten in einem Verhältnis von 1:4 gemischt werden sollen (Pikrinsäure: alkalischer Puffer), wobei die Pikrinsäurekonzentration 35 mM in der Pikrinsäurekomponente nicht übersteigt, ergibt sich ein TMA&spplus;-Anteil im alkalischen Puffer von vorzugsweise weniger als 1000 mM, besser weniger als 500 mM. Eine weitere geeignete Hydroxidquelle ist Tetraethanolammoniumhydroxid, obwohl dieses teurer ist als TMA-OH.
Der pH-Puffer in der alkalischen Pufferkomponente kann Phosphat sein, zugegebenen in Form von Phosphorsäure. Der pKa eines Puffers ist der pH-Wert, bei dem die Pufferkapazität optimal ist. Im allgemeinen werden Puffer verwendet, um einen pH-Wert von pKa ± 1,0 beizubehalten. Phosphat hat 3 bekannte pKa. Der pKa 3 von Phosphat ist 12,3, wodurch dieses geeignet ist zum Puffern eines pH- Wertes von 13,1±0,2. Eine Alternative für einen organischen Puffer kann Guanidin sein, welches einen höheren pKa als Phosphat hat und als das *HCL oder *HCO&sub3; Salz verfügbar ist.
Das Borat kann als Orthoborsäure beigegeben werden. Eine kleine Menge von Polypropylenglycol kann als Entschäumungsmittel beigegeben werden. Der Rest der alkalischen Pufferkomponente ist deionisiertes Wasser.
Vorzugsweise bilden die Metallionen im alkalischen Puffer nicht mehr als 10% der gesamten enthaltenen Kationen, besser nicht mehr als 5% und am günstigsten sind im wesentlichen keine Metallkationen enthalten. Vorzugsweise enthält die Pikrinsäurekomponente im wesentlichen auch keine Metallkationen.
Die Komponenten des kältestabilen Kreatininreagens sollten bei Raumtemperatur gelagert werden bis sie im Instrument benötigt werden. Sie können mindestens 30 Tage bei einer Temperatur von 2 bis 8ºC, vorzugsweise ein Jahr oder mehr bei einer Temperatur von nur 0ºC, sichtbar homogen bleiben. Es sollte darauf geachtet werden, daß der alkalische Puffer und das TMA-OH Rohmaterial nicht übermäßig hohen Temperaturen über irgendeinen Zeitraum ausgesetzt werden. Wärme kann bei TMA&spplus; eine Hoffman-Umlagerung (Demethylisierung) hervorrufen, woraus sich Trimethylamin und Methanol ergeben. Daher können Wärmeschäden pH-Veränderungen im alkalischen Puffer hervorrufen. Da TMA&spplus; mit Pikrat mit der Zeit eine Reaktion eingeht und Präzipitate bildet, sollen die Komponenten des kältestabilen Kreatininreagens erst kurz vor der Durchführung des Assays gemischt werden, um das assayfertige Reagens zu bilden. Die Stabilität des assayfertigen Reagens beträgt 3 bis 7 Tage bei Raumtemperatur.
In einer weniger bevorzugten Form des erfindungsgemäßen kätlestabilen Kreatininreagens, worin die Pikrinsäurekomponente eine Pikrinsäurekonzentration von nicht mehr als 35 mM und die alkalische Pufferkomponente einen pH-Wert aufweist, der dem herkömmlichen vergleichbar ist (ungefähr 13,1), kann das assayfertige Reagens eine Sensitivität aufweisen, die 50% geringer ist als jene der herkömmlichen Formulierung (bei Verwendung auf einem COBAS-BIO von Roche Diagnostics of Nutley, New York, mit einem Meßfenster zwischen 35 Sekunden und 45 Sekunden und einer Fenstergröße von 10 Sekunden). Die Verringerung der Sensitivität ist größtenteils auf die niedrigere Pikratkonzentration zurückzuführen. Die Signalstärke kann mindestens 5 bis 10% erhöht werden, indem das Meßfenster von 35 Sekunden bis 45 Sekunden auf 25 Sekunden bis 35 Sekunden oder sogar 15 Sekunden bis 25 Sekunden verschoben wird, oder indem die Fenstergröße von 10 Sekunden auf 20 oder 30 Sekunden vergrößert wird.
Zur Kompensierung des Sensitivitätsverlustes durch die Abnahme der Pikratkonzentration ist es nötig, den pH-Wert der alkalischen Pufferkomponente zu erhöhen, um das Signal im Jaffé-Absorportionsänderungsassay zu verstärken. Um die TMA&spplus;-Konzentration nieder zu halten (um die Bildung von TMA-Pikratpräzipitat zu verlangsamen), wird jedoch die Verwendung von Tetraethanolammoniumhydroxid zur Erhöhung des pH-Wertes bevorzugt. Wenn der pH-Wert erhöht wurde, sollte ein Puffer mit einem pKa verwendet werden, der höher als jener von Phosphat ist, wie z.B. Guanidin.
Weiters kann der pH-Wert des alkalischen Puffers nach oben eingestellt werden, z.B. auf 13,35 bis 13,55, ohne die TMA-OH Menge zu erhöhen, indem die Phosphat- und Boratpuffermengen reduziert werden. Die letztgenannte Methode zur pH-Einstellung ist die bevorzugtere. Bei diesen hohen pH-Werten kann das erfindungsgemäße kältestabile Kreatininreagens, bei dem eine Pikrinsäurekomponente mit 35 mM verwendet wird, eine Sensitivität aufweisen, die jener des herkömmlichen Reagens vergleichbar ist, bei dem eine Pikrinsäurekomponente mit 50 mM verwendet wird. Die folgenden Beispiele zeigen solche Ergebnisse.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen kältestabilen Kreatininreagens sind vielfältig. Die gelösten chemischen Stoffe in den Komponenten können in der wäßrigen Phase bei einer Temperatur von nur 0ºC gelöst bleiben. Dies ermöglicht ein Lagern der Komponente in klinischen Analysiervorrichtungen, welche eine Reagenskühlung im Hinblick auf die technische Konstruktion erfordern. Die Wiederverwendbarkeit nach dem Gefrieren und Auftauen ist auch kein besonderes Problem, z.B. im Hinblick auf den Transport während der Wintermonate. Der alkalische Puffer ist beständig gegen Schäden durch Gefrieren und Auftauen, was sich durch das Nichtvorhandensein von Trübung im alkalischen Puffer nach dem Auftauen zeigt. Dadurch ist die Verwendung des alkalischen Puffers unmittelbar nach dem Auftauen möglich.

Beispiele

In den folgenden Beispielen wird gezeigt, daß die Sensitivität des erfindungsgemäßen kältestabilen Kreatininreagens in jeder Hinsicht besser ist als jene der herkömmlichen Kreatininreagenzien. Alle Bestimmungen mit Hilfe der Jaffé-Absorptionsänderungsmethode wurden als Zwei-Punkte-Rate auf COBAS-BIO (Roche Diagnostics of Nutley, New Jersey) gemessen. Es folgt eine Aufstellung der COBAS-BIO Parameter:
1. Einheiten MG/DL
2. Berechnungsfaktor 0
3. Standard 1 Konz. 5
4. Standard 2 Konz. 5
5. Standard 3 Konz. 5
6. Limit 25
7. Temperatur [DEG.C] 37
8. Analyseart 4
9. Wellenlänge [NM] 520
10. Probenvolumen [mL] 25
11. Verdünnungsmittelvolumen [mL) 25
12. Reagensvolumen [mL] 250
13. Inkubationszeit [SEC] 180
14. Ausgangsreagensvolumen [mL] 0
15. Zeit 1. Ablesung [SEC] 25
16. Zeitinervall [SEC] 10
17. Ablesungszahl 2
18. Leerprobenbetriebsart (blanking mode) 0
19. Ausdrucksbetriebsart (printout mode) 4

Reagensquelle

Diethanolamindodecylsulfat (33-35%) ist erhältlich von Pfaltz & Bauer, Waterbury, Connecticut; Tetramethylammoniumhydroxid (25%) ist erhältlich von Southwestern Analytical Chemicals, Austin, Texas.
Die anderen Reagenzien sind im Handel erhältliche Standardprodukte. Das einzige Erfordernis ist, daß sie von guter Qualität und Reinheit sind (z.B. ACS-Qualität).
Die folgenden Reagenzien wurden getestet:

A.HERKÖMMLICHES REAGENS (PA)

1. Pikrinsäurekomponente

(a) 50 mM Pikrinsäure
(b) deinosiertes Wasser (NCCLS Klasse II)

2. Alkalische Pufferkomponente

(a) Natriumdodecylsulfat 1,5 Gew.% (Gramm/dl)
(b) Natriumtetraboratdecahydrat 100 mM als Borat
(c) Natriumphosphat (dreibasisch) 62 mM
(d) Natriumhydroxid 187,5 mM
(e) Polypropylenglycol 1025 0,2 % (v/v)
(f) Deionisiertes Wasser (NCCLS Klasse II) bildet den Rest
(g) pH 13,1

B.KÄLTESTABILE REAGENZIEN (CS)

1. Pikrinsäurekomponente

(a) 35 mM Pikrinsäure
(b) deionisiertes Wasser (NCCLS Klasse II) 2. Alkalische Pufferkomponente PROBEN Diethanolamindodecylsulfat O-Borsäure (gemessen als Borat) 85% Phosphorsäure Polypropylenglycol 1025 (v/v) *Deionisiertes Wasser (NCCLS Klasse II) bildet den Rest.
Die Pikrinsäurekomponente und die alkalische Pufferkomponente in jedem Reagens wurden in einem Verhältnis von 1:4 (Pikrinsäure: alaklischer Puffer) gemischt, um das assayfertige Reagens vor der Durchführung des Assays herzustellen.

Beispiel 1

Die Aktivitäten des CS1 Reagens wurden mit jenen des PA Reagens verglichen, wobei ein 10 mg/dl wäßriger Kreatininstandard verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 angeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß wegen der niederen Pikratkonzentration (35 mM vs 50 mM) die Aktivität des CS1 Reagens weniger als die Hälfte jener des herkömmlichen Reagens betragen kann. Tabelle 1 Sensitivitätsauswertung Herkömmliche vs kältestabile Reagenzien 10,0 mg/dl wäßriger Kreatininstandard 25-35 SEC Fenster Werte in dA/MIN MITTEL (%CV = % Variationskoeffizient = S.D x 100%/MITTEL

Beispiel 2

Die alkalischen Pufferkomponenten in Reagenzien CS2, CS3 und CS4 wurden mit dem Ziel formuliert, die Hydroxidkonzentration zu erhöhen ohne die TMA&spplus;-Konzentration auf ein Maß zu erhöhen, wo die Bildung eines TMA-Pikratkomplexes günstig ist. Die Borat- und Phosphatkonzentrationen wurden im Vergleich zu den Reagenzien PA und CS1 um 50% reduziert. Es hat sich gezeigt, daß höhere pH- Werte dann ohne deutliche Erhöhung der TMA&spplus;-Konzentration hergestellt werden können. Unter Verwendung eines 10 mg/dl wäßrigen Kreatininstandards wurden die kältestabilen Reagenzien CS2, CS3 und CS4 mit dem herkömmlichen Reagens PA in bezug auf Sensitivität, Linearität der Resultate, Präzision innerhalb der Testphase, Korrelation mit dem herkömmlichen Reagens und Beständigkeit gegen Arzneimittelinterferenz verglichen. Es hat sich herausgestellt, daß diese neuen, kältestabilen Kreatininreagenzien auf dem COBAS-BIO ausgezeichnete Eigenschaften aufweisen.

A. Sensitivität

Die Ratensignale, welche man mit den neuen kältestabilen Formulierungen mit hohem pH-Wert erhielt, wurden als vergleichbar mit jenen des herkömmlichen Reagens befunden. Die Tabelle 2 zeigt die Resultate eines solchen Vergleichs. Tabelle 2 Sensitivität der neuen kältestabilen, alkalischen Pufferformulierung vs jene des herkömmlichen Reagens Assayfertige Mischung PA: 4 Teile (v/v) alkalischer Puffer zu 1 Teil 50 mM Pikrinsäure. 10,0 mg/dl wäßriger Standard 25-35 SEC Fenster Werte in dA/MIN alkalischer Puffer Mittel
Es hat sich gezeigt, daß die Sensitivität in dA/min. der bevorzugten Form der neuen kältestabilen Reagensformulierungen besser ist als jene des herkömmlichen Reagens, wenn der alkalische Puffer einen pH-Wert von 13,35 oder mehr hat.

B. Linearität der Resultate

Die Linearität der Resultate innerhalb des dynamischen Bereichs der neuen CS-3 Reagensformulierung wurde untersucht, wobei das oben beschriebene Verfahren unter Verwendung von COBAS-BIO angewandt wurde. Die Fig. 1 ist eine Summe der Testresultate. Ausgezeichnete Linearität innerhalb eines dynamischen Bereichs von 0,3 mg/dL bis 30 mg/dL wurde bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,9999 beobachtet.

C. Präzision innerhalb der Testphase

Drei Beckman-Proben auf der Basis von menschlichem Serum wurden parallel bearbeitet, wobei das CS3 Reagens (13,4spH) verwendet wurde. Die Testphasen wurden 24 mal für jede Probe wiederholt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Studie der Präzision innerhalb der Testphase mit Proben auf der Basis von menschlichem Serum Neues kältestabiles Reagens (CS-3) Probe MITTEL
Es wird im allgemeinen bevorzugt, daß die Präzision innerhalb der Testphase ein 2,0 mg/dl S.D. oder ein 3,0 % C.V. Erfordernis erfüllt, gleich welches größer ist. Somit erfüllt das erfindungsgemäße kältestabile Kreatininreagens die Erfordernisse.

D.Korrelation mit herkömmlichem Reagens

Zweiundzwanzig (22) verschiedene Proben wurden auf dem COBAS-BIO bearbeitet, wobei sowohl das CS3 Reagens als auch das PA Reagens verwendet wurde, um die Korrelation der Ergebnisse bei Verwendung der neuen und alten Reagenzien zu testen. Die Resultate werden in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Korrelation Neues kältestabiles Reagens vs PA Reagens COBAS WÄSSRIGER STD BECKMAN ASTRA KALIBRATOR STD KREAT. LI ACETOACETAT CEFALOTIN ENTSCHEIDUNG#1(Probe auf der Basis von menschlichem Serum)
Die Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Verhalten der beiden Reagenzien auf dem COBAS-BIO , sogar bei Vorhandensein von verschiedenen interferierenden Medikamenten.

E. Beständigkeit gegen Medikamenten-Interferenzen

Medikamenten-Interferenzen stellen ein Hauptproblem bei der Jaffé-Absorptionsänderungsreaktion dar. Cephalosporin und Ketonkörper verursachen häufig positive Interferenzprobleme. Die Interferenzwirkung von Cefalotin (Cephalosporine) und Li-acetoacetat (Ketonkörper) auf das CS-3 Reagens wurde untersucht. Die Ergebnisse werden in den Figuren 2-5 gezeigt. Sie zeigen, daß das CS Reagens keine drastischen positiven Interferenzen zeigt.
Die Wirkung der oben angeführten Medikamente auf die CS-3- und herkömmlichen Reagenzen wurde dann auch verglichen. Die Ergebnisse werden in den Fig. 6-9 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß die CS Formulierung sich zumindest gleich gut oder besser als die herkömmliche Formulierung in bezug auf die Beständigkeit gegen Medikamenten-Interferenz verhielt.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Formen sehr detailliert beschrieben wurde, sind andere Versionen möglich.

Claims

1. Kältestabiles, flüssiges Reaktionssystem geeignet für die Verwendung in einer Jaffe-Methode für die Bestimmung von Kreatinin, umfassend:

(a) eine homogene, flüssige Pikrinsäurekomponente enthaltend Pikrinsäure in einer Menge von nicht mehr als 40 mM, sodaß die Pikrinsäurekomponente bei einer Temperatur von nur 0ºC bis zu einem Jahr oder mehr sichtbar homogen bleibt;

(b) eine homogene, flüssige, alkalische Pufferkomponente enthaltend:

(i) eine alkalische Substanz in einer Menge, die ausreicht, um den pH-Wert der alkalischen Pufferkomponente auf mehr als 13 zu halten, zur Einstellung des pH-Wertes des assayfertigen Reagens gebildet durch Kombination der Pikrinsäure und der alkalischen Pufferkomponenten;

(ii) mindestens eine pH-Puffersubstanz; und

(iii) ein Detergens zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine in der Jaffé-Methode;

dadurch gekennzeichnet, daß die alkalischen Pufferkomponenten im wesentlichen keine Metallkationen enthalten, sodaß die Komponente bei einer Temperatur von nur 0ºC bis zu einem Jahr oder mehr sichtbar homogen bleibt.

2. Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Metallkationen weniger als 10 % der Gesamtmenge aller Kationenarten in der alkalischen Pufferkomponente umfaßt.

3. Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Metallkationen weniger als 5 % der Gesamtmenge aller Kationenarten in der alkalischen Pufferkomponente umfaßt.

4. Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pikrinsäurekomponente auch im wesentlichen keine Metallkationen enthält.

5. Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Pufferkomponente auch Borat für die Herabsetzung der Interferenz durch Kohlenhydrate in der Jaffé-Methode enthält.

6. Reaktionssystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ein lösliches, organisches Sulfat mit einem Kationenteil und einem Anionenteil ist, wobei der Anionenteil ein organisches Sulfat mit 8 bis 12 Kohlenstoffen ist, und der Kationenteil aus der Gruppe bestehend aus Diethanolamin, Diethylamin, Triethanolamin und Triethylamin ausgewählt wird; und worin die alkalische Substanz aus der Gruppe bestehend aus Tetramethylammoniumhydroxid und Tetraethanolammoniumhydroxid ausgewählt wird.

7. Reaktionssystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens Diethanolamindodecylsulfat ist, und die alkalische Substanz Tetramethylammoniumhydroxid ist.

8. Reaktionssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Pufferkomponente umfaßt:

(a) Tetramethylammoniumhydroxid in einer Menge zwischen 350 und 550 mM;

(b) Phosphorsäure als Puffersubstanz in einer Menge zwischen 25 und 35 mM;

(c) Diethanolamindodecylsulfat als Detergens in einer Menge zwischen 1,2 und 1,5 % (v/v); und

(d) O-Borsäure als Boratquelle in einer Menge zwischen 40 und 60 mM;

worin der pH-Wert der alkalischen Pufferkomponente zwischen 13,3 und 13,6 liegt.

9. Reaktionssystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Pikrinsäurekomponente 35 mM Pikrinsäure enthält und die alkalische Pufferkomponente weiter umfaßt:

(a) 1 % (v/v) n-Butanol; und

(b) Polypropylenglycol in einer Menge zwischen 0 und 2 % (v/v).

10. Kältestabiles, flüssiges Reaktionssystem geeignet für die Verwendung in einer Jaffé-Absorptionsänderungsmethode für die Bestimmung von Kreatinin in einer Probe mit einer Kreatininkonzentration im Bereich von 0,3 bis 30 mg/dl, wobei das Reaktionssystem umfaßt:

(a) eine homogene, flüssige Pikrinsäurekomponente bestehend aus 35 mM Pikrinsäure und deionisiertem Wasser, sodaß die Pikrinsäurekomponente bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage oder mehr sichtbar homogen bleibt;

(b) eine homogene, flüssige, alkalische Pufferkomponente umfassend:

(i) Tetramethylammoniumhydroxid in einer Menge zwischen 350 und 550 mM;

(ii) Phosphorsäure als Puffer in einer Menge zwischen 25 und 35 mM;

(iii) Diethanolamindodecylsulfat in einer Menge zwischen 1,2 und 1,5 % (v/v) als Detergens zur Herabsetzung der Interferenz durch Proteine in der Jaffé-Absorptionsänderungsmethode;

(iv) O-Borsäure in einer Menge zwischen 40 und 60 mM zur Herabsetzung der Interferenz durch Kohlenhydrate in der Jaffé-Absorptionsänderungsmethode;

(v) 1 % (v/v) n-Butanol; und

(vi) Polypropylenglycol in einer Menge zwischen 0 und 2 % (v/v);

dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Pufferkomponente im wesentlichen keine Metallkationen enthält, sodaß die Komponente bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC 30 Tage oder mehr sichtbar homogen bleibt, und daß ein assayfertiges Reagens gebildet durch Kombination von einem Teil der Pikrinsäurekomponente und vier Teilen der alkalischen Pufferkomponente einen pH-Wert von 13,0 oder mehr hat.