WO1999053063A1 - LIGAND PEPTIDIQUE PRESENTANT UNE AFFINITE SPECIFIQUE VIS-A-VIS DE LA PROTEINE p24 DU RETROVIRUS HIV-1 - Google Patents

LIGAND PEPTIDIQUE PRESENTANT UNE AFFINITE SPECIFIQUE VIS-A-VIS DE LA PROTEINE p24 DU RETROVIRUS HIV-1 Download PDF

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WO1999053063A1
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peptide
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ligand
sequence
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Armelle Novelli-Rousseau
Stéphanie MONACO
Nadia Piga
Carmen Berthet
François Mallet
Stephen Cusack
Nicole Battail
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Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1054—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV gag-pol, e.g. p17, p24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to a peptide ligand having a specific affinity for the p24 protein of the acquired immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).
  • the invention also relates to a murine, or chimeric human-murine type antibody, having a specific affinity with respect to the p24 protein of HIV-1, the DNA molecule corresponding to the peptide ligand, the cassettes and vectors comprising this DNA molecule, a method of in vitro detection of HIV-1 infection from a biological sample, as well as the use of chimeric antibodies for use as a medicament.
  • AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
  • AIDS is a slow-growing disease and people with HIV are infectious when they have had no symptoms of the disease for years. It is therefore necessary to be able to diagnose infection with the virus as soon as possible.
  • HIV genome has been sequenced, and the functions of the various genes have been elucidated.
  • Viral reverse transcriptase and integrase are produced by cleavage of a large gag-pol fusion protein, while viral capsid proteins are produced by cleavage of the gag protein.
  • a gag p55 precursor protein is cut by a protease encoded by the pol gene, which produces the main protein p24 (sometimes called p25) and the proteins p1 8 and p1 3.
  • Each antibody consists of two “light” chains and two “heavy” chains.
  • the antigen binding region or binding site region determining complementarity
  • the two chains fold into a series of unstructured clusters, distributed in a discreet manner, which are called domains.
  • a single domain antibody (Dabs) comprises only one of the domains of a given antibody.
  • variable regions which include hypervariable regions which differ from one antibody to another, the rest of these variable regions being made up of relatively constant amino acids. forming a framework with the specific structure of the antibody.
  • the other domains of the antibody, particularly those in the C-terminal position, are said to be constant, that is to say that they are identical for all the antibodies of the same class.
  • the first object of the present invention relates mainly to a peptide ligand and / or peptide equivalent having a specific affinity with respect to the p24 protein of the HIV-1 retrovirus, comprising at least one peptide strand corresponding to the N— part.
  • the light chain comprising a series of amino acids determining three so-called hypervariable regions L1, L2 and L3, respectively positioned from 70 to 99, from 145 to 165, from 262 to 285, according to the sequence of amino acids described by the sequence SEQ ID No 1, and the heavy chain comprising a sequence of amino acids determining three regions called hypervariable H1, H2 and H3, respectively positioned from 76 to 105, of 155 to 195, from 295 to 327, according to the sequence of amino acids described by the sequence SEQ ID No 2.
  • "equivalent" for a peptide means that the chemical structure is similar and that the function of the peptide is identical.
  • a peptide equivalent may therefore have different amino acids but will have identical functionality, in this case vis-à-vis the p24 protein. Therefore, an amino acid is said to be equivalent to another amino acid, when their chemical characteristics, such as polarity, hydrophobicity, and / or basicity, and / or acidity, and / or neutrality, are substantially the same.
  • a leucine is equivalent to an isoleucine, within the meaning of the preceding definition.
  • the peptide ligands according to the invention can be such as in the native state, when it is a monoclonal antibody for example, or chemically modified.
  • chemical modification is meant any chemical alteration of at least one functional group of the peptide sequence, substantially preserving, or even increasing, the biological properties of said peptide sequence with respect to the p24 antigen of HIV-1.
  • Part of the chemical modifications considered above are the replacement of an amino acid of the L series with an amino acid of the D series, a modification of the side chains of the amino acids, such as acetylation of the amino functions, carboxymethylation of the thiol functions, an esterification of peptide bonds such as carba, retro-inverso, reduced and methylene-oxy bonds.
  • the peptide ligand comprises a peptide strand comprising the light chain and the heavy chain of an antibody corresponding respectively to the sequence SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2.
  • the ligand comprises a peptide strand which consists of the light chain and / or the heavy chain of an antibody corresponding respectively to the sequence SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2.
  • the ligand is an antibody.
  • the ligand is a monoclonal antibody of murine origin, named in the present invention "13B5".
  • the ligand is an antibody of chimeric type, consisting of regions called constant of human origin and regions called hypervariable of murine origin.
  • Such antibodies can also be called recombinant antibodies.
  • the inserts of recombinant DNA coding for the variable regions are fused, with a DNA coding for constant regions of the heavy and light chains, then they are transferred into appropriate host cells, for example after incorporation into hybrid vectors.
  • Fab fragment of the antibody 13B5 Since the sequence of the Fab fragment of the antibody 13B5 is disclosed in the present invention, those skilled in the art can manufacture, using recombinant DNA technology with host cells such as yeasts or bacteria, various antibody fragments comprising the hypervariable regions mentioned above, and which retain their specificity towards p24.
  • the ligand comprises a marker.
  • a marker is called conjugate.
  • Said conjugate can be made from a fragment of said antibody, insofar as the latter retains its specificity towards p24.
  • the label can be, for example, an enzyme, a fluorescent type label, a chemiluminescent type label, an avidin, a biotin, or a radioactively labeled antibody.
  • the enzymes used for the antibody conjugates of the invention are, for example, Raiford peroxidase, alkaline phosphatase, beta-D-galactosidase, glucose oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysosyme, malate dehydrogenase or glucose-6-phosphatase dehydrogenase.
  • the markers used for the fluorescent type conjugates according to the invention can be fluorescein, fluorochrome, rhodamine.
  • the chemiluminescent type markers are for example the acridium esters of luminol.
  • the antibodies or antibody fragments are linked to the conjugation partner directly or by a spacer group or chelating agent.
  • chelating agents As an example of chelating agents, mention may be made of ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriamine-pentaacetic acid (DPTA), 1, 4,8, 1 1 -tetra azatetradecane, acid 1, 4, 8, 1 1 - tetraazatetradecane-1, 4.8, 1 1 -tetraacetic, acid 1 -oxa-4.7, 1 2, 1 5- tetraaza heptadecane-4.7, 1 2, 1 5-tetraacetic, or the like.
  • EDTA ethylene diaminetetraacetic acid
  • DPTA diethylenetriamine-pentaacetic acid
  • 1, 4,8, 1 1 -tetra azatetradecane acid 1, 4, 8, 1 1 - tetraazatetradecane-1
  • 4.8 1 1 -tetraacetic, acid 1 -oxa-4.7, 1 2, 1 5- tetraaza heptadecane-4.7, 1
  • the radioactively labeled antibodies according to the present invention contain, for example, radioactive iodine (I 1 23 , I 125 'I 131 ), tritium (H 3 ), carbon (C 14 ), sulfur (S 35 ) , yttrium (Y 90 ), technetium (TC 99m ), or the like.
  • the peptide ligands according to the present invention are obtained from the ligants according to the present invention by iodization known per se, for example with radioactive potassium or sodium iodide and a reagent chemically oxidizing, such as sodium hypochlorite, chloramine T or the like, or an enzymatically oxidizing reagent, such as lactoperoxidase and glucose oxidase.
  • the ligands according to the present invention can also be coupled to yttrium, for example by chelation with DPTA.
  • the binding of the enzyme with the antibody according to the present invention can be carried out by reacting an antibody according to the present invention with a coupling reagent, for example, glutaraldehyde, periodate, N, N'-O-phenylenedimaleimide , N- (m-maleimidobenzoyl oxy) -succinimide, N- (3- [2'-pyridyldithio] -propionoxy) -succinimide, N- ethyl-N '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide.
  • a coupling reagent for example, glutaraldehyde, periodate, N, N'-O-phenylenedimaleimide , N- (m-maleimidobenzoyl oxy) -succinimide, N- (3- [2'-pyridyldithio] -propionoxy) -succinimide, N-
  • the conjugates with biotin are prepared for example by reacting the antibody according to the present invention with an activated ester of biotin such as the ester of biotin N-hydroxysuccinimide.
  • the conjugates with a fluorescent or chemiluminescent label are prepared in the presence of a coupling reagent, for example those mentioned above, or by a reaction with isothiocyanate, preferably fluorescein isothyocyanate.
  • the ligand is recognized by an antibody-marker conjugate.
  • the ligand according to the present invention will therefore comprise a useful part for the recognition of this second labeled antibody.
  • the constant heavy chains of the murine or human type will be used in the case where the ligand is an antibody.
  • the antibodies of the present invention can be digested by proteases. Several fragments, Fab, Fab 'and Fc, are thus obtained.
  • antibody fragments are that they can be made quite easily by bacteria or yeast.
  • single domain antibody (Dabs) technology offers the ability to clone antibody-like molecules into bacteria and screen millions of antibodies much more simply than monoclonal antibodies. .
  • a second object according to the invention is a method for detecting p24 of HIV-1 in a biological sample comprising bringing said sample into contact with at least one ligand according to the invention, and the measurement of the Iigand-p24 complex formed.
  • a third object according to the invention is a diagnostic kit for detecting an infection with HIV-1 comprising at least one ligand according to the invention.
  • a fourth object according to the invention is the use of antibodies of the human-murine chimeric type according to the invention for the preparation of a medicament intended for treating patients suffering from an infection with HIV-1.
  • a fifth object according to the invention is the DNA molecule coding for a peptide ligand according to claim 1.
  • a peptide ligand according to claim 1 mention may be made of the nucleic acid sequences of the sequences SEQ ID Nos. 1 and 2.
  • FIGS. 1 and 2 respectively represent the amino acid sequence of the light and heavy chains of the Fab fragment of the antibody 13B5 with the hypervariable regions framed, coded by the sequences SEQ ID Nos. 1 and 2.
  • FIG. 3 represents the results of an indirect ELISA test according to Example 3. On the abscissa is shown the antibody concentration (/ g / ml), and on the ordinate the measurement of OD (optical density) at 405 nm.
  • the sequences SEQ ID No 1 and SEQ ID No 2 respectively represent the nucleotide and amino acid sequences of the light chain and of the heavy chain of the Fab fragment of the antibody 1 3B5.
  • a sixth object according to the invention is the functional expression cassettes in a cell originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, allowing the expression of DNA coding for a peptide ligand according to the invention, the vectors comprising the cassettes of expression described above, and cells from a eukaryotic or prokaryotic organism comprising an expression cassette or a vector according to the invention.
  • mice of the BALB / C species and of the BALB / C BYJICO strain (supplied by IFFA Credo), and the myeloma line SP2 / 0-AG14 were used as antigen.
  • b) Immunization protocol The mice were immunized 1 5 days apart using
  • IP intraperitoneal
  • ACF complete Freund's adjuvant
  • AIF incomplete Freund's adjuvant
  • Iscove's Modified Dulbecco Medium supplemented with sodium bicarbonate (3024 mg / l), 10% fetal calf serum (SVF), pH 6.7 to 7.3, and at 25 ° C.
  • Additional reagents were: insulin 4 mg / l, 2-mercaptoethanol (10 ⁇ M), ethanolamine (20 // M), penicillin (100 U / ml), streptomycin (50 // g / ml ).
  • the heterolploid cells obtained were subcultured every two or three days. e) Freezing of cells
  • composition medium was used: IMDM supplemented with 10% fetal calf serum (SVF) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO-Sigma).
  • the cell concentration was 3.6 x 10 6 cells per ampoule (2 x 10 6 cells / ml).
  • the cells were slowly frozen at -80 ° C in 10% IMDM-SVF-10% DMSO medium for 24 to 72 hours, then the cells were stored in liquid nitrogen at -180 ° C.
  • mice 4 to 6 weeks old, of the BALB / C species, of the BALB / C BYJICO strain (IFFA Credo) are used.
  • a cell suspension of clone 13B5 was prepared which was centrifuged at 200 G for 10 minutes at 25 ° C. The cells were then resuspended in 9% NaCl at 10 6 cells / ml.
  • the ascites fluid was then harvested after 10 days +/- 2 days.
  • mice conjugated 100 ⁇ l of anti-Ig (H + L) immunoglobulins from mice conjugated to alkaline phosphatase (Jackson Laboratories).
  • reaction was then blocked with 100 ⁇ l of 1N NaOH.
  • the ELISA shows that the 13B5 antibody specifically recognizes the p24 of HIV-1.
  • the 13B5 antibody is of the lgG1, k isotype.
  • the membrane was then taken up and then incubated in a solution of PBS-Rministerlait 3% Tween 0.05% containing the antibody 3B5 diluted to 10 / g / ml, at room temperature, for 1 hour 30 minutes. The membrane was then taken up, washed 3 times in 0.05% PBS-Tween, then incubated 10
  • conjugates are revealed by a solution of beta-naphthyl acid phosphate 0.5 mg / ml and O-Dianisidine 0.5 mg / ml in tetraborate buffer 12.07 g / l, MgSO4 1.2 g / l, pH 9. A single band is observed with an expected molecular weight, approximately 27,000, compatible with the theoretical molecular weight of p24, 26,707.
  • the antibody 13B5 specifically recognizes p24 in western blotting.
  • P24 diluted in PBS 0.5 ⁇ g / ml, 350 ⁇ l per Vidas cone was adsorbed. Washed with 600 ⁇ l 0.1% PBS-Tween 20 buffer.
  • the antibody 1 3B5 was diluted a first time 1000 times to approximately 10 / g / ml, then 10 to 10, in a 100 mM Tris buffer, 300 mM NaCl, 5% Tween 20, 2% BSA, Regulated 0 , 2%, pH 7. The antibody 3B5 is then added and incubated at 37 ° C.
  • RNA from hybridoma cells was extracted using a technique derived from the method of Chomczynski (1987) using the kit
  • the cDNA solution contained a mixture of all single stranded cDNAs from reverse transcription of all mRNAs produced by hybridoma cells. It was therefore necessary to select and amplify the DNA with previously selected DNA primers. - choice of DNA primers: The N-terminal sequencing of the light and heavy chains was carried out automatically by Edman degradation. Only the first 10 amino acids of the light chain could be determined:
  • PCR tests were carried out at different hybridization temperatures, with different concentrations of cDNA and DNA primers. To evaluate the stringency of the reactions, controls were carried out under the same conditions with a single DNA primer per reaction medium in order to eliminate the non-specific amplification conditions.
  • PCR reactions were carried out in a reaction mixture of 50 ⁇ ⁇ varying according to the chain to be amplified (cf. Table I).
  • the reaction medium contained a mixture of two DNA polymerases: TAQ and PWO (Expand Long Template System by Boerhinger Mannheim). Table I below presents the PCR reaction mixtures of the light and heavy chains of the Fab fragment of the antibody 13B5.
  • the amplification started with a denaturation of 2 minutes at 94 ° C and then continued with 30 identical cycles comprising a denaturation phase of 30 seconds at 94 ° C, a hybridization phase 13
  • Qiagen plasmid midi This technique is based on a modified alkaline lysis followed by purification on an anion exchange column. About 100 ⁇ g of plasmid DNA could be extracted from each 50 ml culture (LB-ampicillin). The plasmid DNA of a clone for each chain was manually sequenced on the direct strand and reverses using oligonucleotides internal to the gene sequences. In order to avoid possible errors of interpretation of the sequences due to the fact of the errors of the polymerase during the amplification, 5 other clones containing the gene coding for the light chain and 5 other clones containing the gene coding for the heavy chain have been sequenced entirely in both directions.
  • Example 2 Description of a process for producing a recombinant antibody from the Fab13B5 sequence.
  • the purpose of the process described is to produce a recombinant antibody or ScFv (Single chain Fv) from the clones coding respectively for the heavy and light chains of the Fab.
  • the Pharmacia kit "Recombinant Phage antibody System” will be used to carry out this process (reference 27 9401-01, 27902-01, 279043-01).
  • VH and VL hypervariable regions of the heavy and light chains
  • the genes coding for the hypervariable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains will be amplified by PCR, from the plasmids isolated during example 1, paragraph 7 , cloning, using primers chosen from the “framework” regions of the variable regions of immunoglobulins. Pharmacia kits will be used below.
  • the resulting PCR products will then be assembled, using a linker, into a single gene (750 bp) coding for a Scfv.
  • the Scfv fragment consisting of the VH and VL regions separated by the peptide sequence (GGGGS) 3 will be obtained.
  • the Scfv gene will then be amplified with primers specific for the 5 'ends of the VH and 3' of the VL and containing the Sfil and NotI restriction sites respectively.
  • the resulting amplification product will then be digested with restriction enzymes Sfil and NotI, then ligated with the phagemid pCANTAB ⁇ E previously opened with the restriction enzymes Sfil and
  • Colonies containing the phage will be infected with a phage helper M1 3K07 to produce recombinant phages which contain the gene coding for ScfV. These recombinant phages also express on their surface one or more copies of Scfv in the form of the Scfv-g3p fusion protein.
  • the p24 protein is adsorbed on a NUNC (polystyrene) Maxisorb type ELISA plate in PBS at 25 ng per well for 2 hours at 37 ° C.
  • NUNC polystyrene
  • the plate was then saturated with 200 ml of 0.05% PBS-Tween 20 buffer 3% BSA for 2 hours at 37 ° C.
  • the antibody 13B5 coupled to biotin is then diluted to 1 ⁇ g / ml, then 4 in 4 in PBS-Tween 20 buffer at 0.05% 1% BSA. We then put 200 ⁇ ⁇ per well of each dilution to incubate with p24 for 2 hours at 37 ° C.
  • pNPP p-nitrophenyl phosphate
  • the plate is washed 3 times with 0.05% PBS-Tween 20 buffer.
  • the antibody 13B5 recognizes p24 in indirect ELISA. It gives a detection signal higher than those obtained for the other antibodies and the maximum detection signal is reached for an antibody concentration of approximately 0.2 ⁇ g / ml.
  • the polyclonal antibodies and the monoclonal antibodies 15F8 and 23A5 give a maximum detection signal for a significantly higher antibody concentration, of approximately 1 // g / ml for 1 5F8 and the polyclonal, and greater than 1 // g / ml for 23A5.

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Abstract

Ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du rétrovirus HIV-1, comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N-terminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, caractérisé en ce que la chaîne légère comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1, L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1, et la chaîne lourde comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1, H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 2.

Description

1
Ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du retrovirus HIV-1
La présente invention concerne un ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du virus de l'immunodéficience acquise de type 1 (VIH-1 ) . L'invention concerne également un anticorps de type murin, ou chimérique humain-murin, présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du VIH-1 , la molécule d'ADN correspondant au ligand peptidique, les cassettes et vecteurs comprenant cette molécule d'ADN, un procédé de détection in vitro de l'infection par le VIH-1 à partir d'un échantillon biologique, ainsi que l'utilisation d'anticorps chimérique pour l'utilisation en tant que médicament.
Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) est l'ultime étape de l'infection de l'homme par le VIH. On pense aujourd'hui que l'infection présente un caractère irréversible et la plupart du temps fatal, même si le décès survient après un temps qui peut varier considérablement d'un patient à l'autre. Alors que l'on a longtemps pensé que le virus était seul responsable de la maladie, de plus en plus d'indices suggèrent aujourd'hui que la présence de mycoplasmes prédispose à l'infection par le VIH lors d'un contact avec le virus. De même, le cytomégalovirus, présent chez de nombreux individus, semblerait favoriser le passage d'une forme d'infection à VIH asymptomatique au déclenchement du SIDA. II existe aussi une autre théorie, dénommée " HIVER ", selon laquelle la plupart des dommages causés par la maladie relèveraient de problèmes auto-immuns. Néanmoins, dans toutes ces hypothèses, l'efficacité de substances antivirales suggère fortement que le virus doit jouer un rôle important.
Le SIDA est une maladie à évolution lente et des personnes séropositives sont infectieuses alors qu'elles ne manifestent aucun symptôme de la maladie pendant des années. II est donc nécessaire de pouvoir diagnostiquer l'infection par le virus le plus tôt possible.
Le génome entier du VIH a été séquence, et les fonctions des différents gènes élucidées. La transcriptase réverse et l'intégrase virales sont produites par clivage d'une grosse protéine de fusion gag-pol, alors que les protéines de la capside virale sont produites par clivage de la protéine gag. Une protéine précurseur p55 de gag est coupée par une protéase codée par le gène pol, laquelle produit la protéine principale p24 (parfois appelée p25) et les protéines p1 8 et p1 3.
L'être humain infecté par le VIH développe rapidement des titres élevés en anticorps dirigés contre les antigènes gp1 20, gp1 60, gp41 et p24. Les anticorps du sérum dirigés contre la p24 apparaissent très tôt au moment de l'infection.
L'homme de l'art connaît bien la structure des anticorps. Chaque anticorps est constitué de deux chaînes " légères " et de deux chaînes " lourdes ". La région de fixation de l'antigène ou site de fixation (région déterminant la complémentarité) se situe à l'extrémité amino- terminale (N-terminale) des chaînes lourde et légère et implique donc ces deux types de chaînes. Les deux chaînes se replient en une série d'amas non structurés, répartis de manière discrète, que l'on appelle les domaines. Ainsi, ce que l'on appelle un " anticorps à domaine unique " (Dabs) ne comprend qu'un seul des domaines d'un anticorps donné.
Les domaines situés en position amino-terminale de chacune des chaînes lourdes et légères sont appelés régions variables, lesquelles comprennent des régions hypervariables qui diffèrent d'un anticorps à l'autre, le reste de ces régions variables étant constitué d'acides aminés relativement constants formant une ossature à la structure spécifique de l'anticorps. Les autres domaines de l'anticorps, particulièrement ceux en position C-terminale, sont dits constants, c'est à dire qu'ils sont identiques pour tous les anticorps d'une même classe.
Bien que l'on connaisse déjà des anticorps monoclonaux de type murin et humain dirigés contre la p24, utilisés dans des immuno- essais ou en tant qu'agents thérapeutiques, la demanderesse a de manière surprenante obtenu un anticorps monoclonal d'origine murine présentant une sensibilité et une spécificité élevée pour la protéine p24 du VIH-1 . A partir du clone cellulaire sécrétant cet anticorps monoclonal, la demanderesse a obtenu une lignée cellulaire hybridome sécrétant cet anticorps monoclonal et a déterminé la séquence en acide désoxyribonucléique (ADN) et acides aminés dudit anticorps.
Le premier objet de la présente invention concerne principalement un ligand peptidique et/ou équivalent peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du retrovirus HIV-1 , comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N- terminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, la chaîne légère comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1 , L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1 , et la chaîne lourde comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1 , H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID No 2. Selon la présente invention, " équivalent " pour un peptide signifie que la structure chimique est similaire et que la fonction du peptide est identique. Un équivalent peptidique pourra donc présenter des acides aminés différents mais présentera une fonctionnalité, en l'occurence vis-à- vis de la protéine p24, identique. De ce fait, un acide aminé est dit équivalent d'un autre acide aminé, lorsque leurs caractéristiques chimiques, telles polarité, hydrophobicité, et/ou basicité, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes. Ainsi, une leucine est équivalente d'une isoleucine, au sens de la définition précédente.
Les ligands peptidiques selon l'invention peuvent être tels qu'à l'état natif, lorsqu'il s'agit d'un anticorps monoclonal par exemple, ou modifiés chimiquement. Par modification chimique, on entend toute altération chimique d'au moins un groupement fonctionnel de la séquence peptidique, préservant substantiellement , voire augmentant, les propriétés biologiques de ladite séquence peptidique vis-à-vis de l'antigène p24 du VIH-1 . Font notamment partie des modifications chimiques considérées précédemment, le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminé, une carboxyméthylation des fonctions thiols, une estérification des liaisons peptidiques telles que des liaison carba, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand peptidique comprend un brin peptidique comprenant la chaîne légère et la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2. Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand comprend un brin peptidique qui consiste en la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps monoclonal d'origine murine, dénommé dans la présente invention " 13B5 ". Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand est un anticorps de type chimérique, constitué de régions dites constantes d'origine humaine et de régions dites hypervariables d'origine murine.
De tels anticorps peuvent être également dénommés anticorps recombinants. Pour l'assemblage des molécules de type immunoglobuline tétramère complète et l'expression d'anticorps actifs, on fusionne les inserts d'ADN recombinant codant pour les régions variables ( comprenant les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères), avec un ADN codant pour des régions constantes des chaînes lourdes et légères, puis on les transfère à l'intérieur de cellules hôtes appropriées, par exemple après incorporation dans des vecteurs hybrides.
Du fait que la séquence du fragment Fab de l'anticorps 13B5 est divulguée dans la présente invention, l'homme de l'art peut fabriquer, en utilisant la technologie de l'ADN recombinant avec des cellules hôtes telles que levures ou bactéries, divers fragments d'anticorps comprenant les régions hypervariables citées ci-dessus, et qui gardent leur spécificité envers la p24.
Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand comprend un marqueur. Un tel anticorps est dénommé conjugué. Le dit conjugué peut être fabriqué à partir d'un fragment dudit anticorps, dans la mesure où ce dernier garde sa spécificité envers la p24. Le marqueur peut être par exemple une enzyme, un marqueur de type fluorescent, un marqueur de type chémiluminescent, une avidine , une biotine, ou un anticorps marqué de manière radioactive.
Les enzymes utilisées pour les conjugués d'anticorps de l'invention sont, par exemple, la peroxidase de Raiford, la phosphatase alkaline, la béta-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucoamylase, l'anhydrase carbonique, l'acétylcholinestérase, le lysosyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6-phosphatase déhydrogénase.
Les marqueurs utilisés pour les conjugués de type fluorescent selon l'invention peuvent être de la fluorescéine, du fluorochrome, de la rhodamine.
Les marqueurs de type chémiluminescent sont par exemple les esters d'acridium du luminol.
Dans de tels conjugués, les anticorps ou fragments d'anticorps sont liés au partenaire de conjugaison directement ou par un groupement espaceur ou agent chélatant.
Comme exemple d'agents chélatants, on peut citer l'acide éthylène-diaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriamine- pentaacétique (DPTA), le 1 ,4,8, 1 1 -tétra azatétradécane, l'acide 1 ,4,8, 1 1 - tétraazatétradécane-1 ,4,8, 1 1 -tétraacétique, l'acide 1 -oxa-4,7, 1 2, 1 5- tétraaza heptadécane-4,7, 1 2, 1 5-tétraacétique, ou du même genre.
Les anticorps marqués de manière radioactive selon la présente invention contiennent par exemple de l'iode radioactive (I1 23, I125' I131 ), du tritium (H3), du carbone (C14), du souffre (S35), de l'yttrium (Y90), du technétium (TC99m), ou autre du même genre. Les ligands peptidiques selon la présente invention, marqués de manière radioactive avec de l'iode, sont obtenus à partir des ligants selon la présente invention par iodation connue per se, par exemple avec de l'iodure de potassium ou de sodium radioactif et un réactif chimiquement oxydant, tel que l'hypochlorite de sodium, la chloramine T ou du même genre, ou un réactif enzymatiquement oxydant, tel que la lactoperoxidase et la glucose oxydase. Les ligands selon la présente invention peuvent également être couplés à l'yttrium par exemple par chélation avec le DPTA.
La liaison de l'enzyme avec l'anticorps selon la présente invention peut être réalisée en faisant réagir un anticorps selon la présente invention avec un réactif de couplage, par exemple, le glutaraldéhyde, le périodate, la N,N'-O-phénylènedimaléimide, le N-(m-maléimidobenzoyl oxy)-succinimide, le N-(3-[2'-pyridyldithio]-propionoxy)-succinimide, le N- éthyl-N'-(3-diméthylamino-propyl)-carbodiimide. Les conjugués avec de la biotine sont préparés par exemple en faisant réagir l'anticorps selon la présente invention avec un ester activé de la biotine tel que l'ester de biotine N-hydroxysuccinimide. Les conjugués avec un marqueur fluorescent ou chémiluminescent sont préparés en présence d'un réactif de couplage, par exemple ceux cités ci-dessus, ou par une réaction avec de l'isothiocyanate, de préférence de l'isothyocyanate de fluorescéine. Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand est reconnu par un conjugué anticorps-marqueur.
Dans la mesure où l'on préfère utiliser dans des immunoessais les ligands selon la présente invention, par révélation par un autre anticorps marqué, le ligand selon la présente invention comprendra de ce fait une partie utile pour la reconnaissance de ce deuxième anticorps marqué. On utilisera particulièrement les chaînes lourdes constantes de type murin ou humain dans le cas où le ligand soit un anticorps.
Les anticorps de la présente invention peuvent être digérés par des protéases. On obtient alors plusieurs fragments dénommés, Fab, Fab' et Fc.
L'avantage potentiel des fragments d'anticorps est qu'ils peuvent être fabriqués assez facilement par des bactéries ou des levures. Comme l'homme de l'art le sait, la technologie des anticorps à domaine unique (Dabs) offre la possibilité de cloner des molécules ressemblant à des anticorps dans des bactéries et de cribler des millions d'anticorps beaucoup plus simplement que des anticorps monoclonaux.
Un exemple d'une telle réalisation est donné dans l'exemple 2. Un second objet selon l'invention est un procédé de détection de la p24 du VIH-1 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec au moins un ligand selon l'invention, et la mesure du complexe Iigand-p24 formé.
Un troisième objet selon l'invention est un Kit de diagnostic pour détecter une infection par le VIH-1 comprenant au moins un ligand selon l'invention. Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation des anticorps de type chimérique humain-murin selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des patients atteints d'une infection par le VIH-1 .
Un cinquième objet selon l'invention est la molécule d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1 . Comme exemple d'une telle molécule, on peut citer les séquences d'acides nucléiques des séquences SEQ ID N ° 1 et 2.
Les Figures 1 et 2 représentent respectivement la séquence en acides aminés des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5 avec les régions hypervariables encadrées, codées par les séquences SEQ ID N° 1 et 2.
La figure 3 représente les résultats d'un test ELISA indirect selon l'exemple 3. En abscisse est représenté la concentration en anticorps ( /g/ml), et en ordonnée la mesure de DO (densité optique) à 405 nm. Les séquences SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 représentent respectivement les séquences en nucléotides et en acides aminés de la chaîne légère et de la chaîne lourde du fragment Fab de l'anticorps 1 3B5.
Un sixième objet selon l'invention est les cassettes d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un ligand peptidique selon l'invention, les vecteurs comprenant les cassettes d'expression décrites ci-dessus, et les cellues issues d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.
Exemple 1 : Séquençage de la partie Fab de l'anticorps 1 3B5
1 ) Procédé d'obtension de l'anticorps a) Préparation de cellules de rate de souris immunisées avec de la protéine recombinante p24.
On a utilisé comme antigène une protéine recombinante p24 HIV-1 , des souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/C BYJICO (fournies par IFFA Credo), et la lignée myélomateuse SP2/0-AG14. b) Protocole d'immunisation Les souris ont été immunisées à 1 5 jours d'intervalle à l'aide de
3 injections par voie intra-péritonéale (IP) associant 50 μg d'antigène et de l'adjuvant complet de Freund (ACF) pour la première injection et de l'adjuvant incomplet de Freund (AIF) pour les autres injections. c) Fusion On réalise la fusion selon la technique classique décrite par G.
Kôhler et C. Milstein (Nature 256. 495-497 ( 1997)). 8
d) Culture en suspension
On a utilisé un milieu de base : Iscove's Modified Dulbecco Médium (IMDM) additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/l), de 10% de sérum de veau foetal (SVF), de pH 6,7 à 7,3, et à température 25 °C.
Les réactifs additionnels étaient : l'insuline 4 mg/l, le 2- mercaptoéthanol ( 10 μM), l'éthanolamine (20 //M), la pénicilline (100 U/ml), la streptomycine (50 //g/ml) .
Les cellules hétérolplôides obtenues ont été sub-cultivées tous les deux ou trois jours. e) Congélation des cellules
On a utilisé un milieu de composition: IMDM additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et 10% de diméthyl sulfoxide (DMSO- Sigma) . La concentration cellulaire était de 3,6 x 106 cellules par ampoules (2 x 106 cellules/ml) .
On a effectué une congélation lente des cellules à -80°C dans du milieu IMDM-SVF 10%-DMSO 10%, pendant 24 à 72 heures, puis on a conservé les cellules dans de l'azote liquide à -180°C.
2) Production d'anticorps in vivo
On utilise des souris femelles ayant de 4 à 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/C BYJICO (IFFA Credo) .
On a préparé une suspension cellulaire du clone 1 3B5 que l'on a centrifugé à 200 G pendant 10 minutes à 25 °C. Puis on a remis en suspension les cellules dans du NaCI 9%o à raison de 106 cellules/ml.
On a injecté 106 cellules dans chaque souris par voie intrapéritonéale.
On a ensuite récolté le liquide ascite après 10 jours + /- 2 jours.
3) Identification de l'anticorps 1 3B5 sécrété par l'hybridome. a) ELISA indirect.
On a utilisé pour l'ELISA indirect des plaques de polystyrène
Maxisorb NUNC (commercialisée par la société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454), coatées avec 100 / I d'antigènes p24 recombinante à 1 vg/ml en tampon bicarbonate (NaHCO3 0,05M; pH 9,6). On a laissé la plaque incuber pendant une nuit à 22°C.
On a saturé avec 100 μ\ de tampon PBS (50 mM Phosphate et 1 50 mM NaCI, pH 7,2) additionné de 1 % d'extrait de lait lyophilisé Régilait durant 1 heure à 37°C. ~~
On a ajouté 100 μ\ de surnageant de culture ou de liquide d'ascite, obtenu au paragraphe précédent, dilués en PBS-Tween 20 à 0,05%, puis on a laissé incuber une heure à 37°C.
On a ajouté ensuite 100 μ\ d'immunoglobulines anti-lg (H + L) de souris conjuguées à la phosphatase-alcaline (Jackson Laboratories
Référence 1 1 5-055-062) dilué au 1 /2000 dans du tampon PBS-BSA 1 %
(phosphate buffer saline-bovine sérum albumine), pendant une heure à
37°C.
On a alors ajouté 100 μ\ de p-nitrophényl phosphate ((pNPP), commercialisé par bioMérieux, référence 60002990) à la concentration de
2 mg/ml dans de la DEA-HCL (commercialisé par bioMérieux, référence 60002989), pH 9,8, et on a laisser incuber 30 minutes à 37°C.
On a ensuite bloqué la réaction avec 100 μl de NaOH 1 N.
On effectue 3 lavages entre chaque étape avec 300 μ\ de PBS- Tween 20 à 0,05% et un lavage supplémentaire en eau distillée avant d'ajouter le pNPP.
L'ELISA montre que l'anticorps 13B5 reconnait spécifiquement la p24 du HIV-1 . L'anticorps 13B5 est d'isotype lgG1 ,k.
b) Utilisation de l'anticorps 13B5 en Western-blot:
On a déposé la p24 sur SDS-Tricine PAGE 1 6,5% (Tricine- Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Séparation of Proteins in the Range from 1 to 100kDa; Hermann Schâgger and Gebhard von Jagow, Analytical Biochemistry 166, 368-379 (1 987)) puis on l'a transférée électriquement sur une membrane de nitrocellulose (Hybond C Amersham) . On a ensuite saturé la membrane par une solution PBS-Régilait 3% pendant 20 minutes à température ambiante. La membrane a ensuite été reprise puis mise à incuber dans une solution de PBS-Régilait 3% Tween 0,05% contenant l'anticorps 1 3B5 dilué à 10 /g/ml, à température ambiante, pendant 1 heure 30 minutes. On a alors repris la membrane, on l'a lavée 3 fois en PBS-Tween 0,05 %, puis incubée 10
en présence d'un conjugué, anticorps anti-souris marqué à la phosphatase alcaline, dilué à environ 1 //g/ml, pendant 1 heure à température ambiante. On effectue la révélation des conjugués par une solution de béta-naphtyl acide phosphate 0,5mg/ml et la O-Dianisidine 0,5mg/ml dans du tampon tétraborate 12,07g/l, MgS04 1 ,2g/l, pH 9. Une bande unique est observée de poids moléculaire attendu, environ 27000, compatible avec le poids moléculaire théorique de la p24, 26707. L'anticorps 13B5 reconnaît de façon spécifique la p24 en western-blot.
c) Test sandwich antigène p24:
Les expériences suivantes ont été effectuées en Vidas (commercialisé par bioMérieux) sur le modèle suivant:
On a adsorbé de la p24 diluée dans du PBS à 0,5 //g/ml, 350 μ\ par cône Vidas. On a lavé avec 600 / l de tampon PBS-Tween 20 à 0, 1 %.
On a saturé par 400 μ\ de tampon Tris 200 mM, NaCI 1 50 mM, acide maléique 200 mM, NaOH 150 mM, Tween 20 à 0,05% et pH 6, 1 .
On a lavé par 600 μ\ de tampon PBS-Tween 20 à 0, 1 %. On a dilué l'anticorps 1 3B5 une première fois 1000 fois à environ 10 / g/ml, puis de 10 en 10, dans un tampon Tris 100 mM, NaCI 300 mM, Tween 20 à 5 %, BSA 2%, Régilait 0,2%, pH 7. L'anticorps 1 3B5 est ensuite ajouté et incubé à 37°C.
On lave ensuite par 600 μ\ de tampon PBS-Tween 20 0, 1 %. On met ensuite à incuber à 37°C 100 ng de p24, couplée à la biotine, dans 400 /l de tampon PBS Régilait 0,25%, Tween 20 à 0,05%. On lave ensuite par 600 μ\ de tampon PBS-Tween 20 à 0, 1 %. On met alors à incuber le conjugué steptavidine-phosphatase- alcaline à 37°C dans 400 μ\ de tampon Tris 100 mM, BSA 0,25%, NaCI 300 mM, Tween 20 à 0,25%, Régilait 0,25%, pH 7,4.
On lave ensuite par 600 μ\ de tampon PBS-Tween 20 0, 1 %. Après révélation des conjugués p24/anticorps 13B5/p24- biotine/streptavidine-phosphatase-alcaline, on détecte un signal positif qui caractérise la présence de l'anticorps 1 3B5. L'anticorps 13B5 reconnaît spécifiquement la p24 dans un test sandwich antigène. 1 1
4) Extraction des ARNm produits par les cellules hybridomes.
L'ARN total des cellules hybridomes a été extrait suivant une technique dérivée de la méthode de Chomczynski (1987) en utilisant le kit
CLONsep TM (commercialisé par Clontech). La purification d'ARNm à partir de l'ARN total a été réalisée à partir du kit mRNA separator (TM) de
CLONTECH.
Environ 30 μg de l'ARNm ont été obtenus à partir de 10 cellules d'hybridomes avec une pureté raisonnable (A260/A280 = 1 ,8).
5) Transcription réverse en ADNc
Les molécules d'ARNm ont été transcrites réversement en ADN complémentaires simples brins suivant le protocole du kit Advantage TM
CLONTECH à partir d'amorces aléatoires d'ADN de six mers et de la transcriptase réverse du virus MMLV.
6) Sélection et amplification du gène codant pour le fragment
Fab de l'anticorps 13B5
La solution d'ADNc contenait un mélange de tous les ADNc simples brins issus de la transcription réverse de tous les ARNm produits par les cellules hybridomes. Aussi était-il nécessaire de sélectionner et d'amplifier l'ADN avec des amorces d'ADN préalablement choisies. - choix des amorces d'ADN: Le séquençage N-terminal des chaînes légère et lourde a été réalisé de manière automatique par dégradation d'Edman. Seuls les 10 premiers acides aminés de la chaîne légère ont pu être déterminés:
EIVLTQSPAI. II semble que le premier acide aminé N-terminal de la chaîne lourde était protégé par un groupe acétyl, devenu ainsi non modifiable chimiquement par l'isothiocyanate de phényl. A partir de la séquence peptidique N-terminale de la chaîne légère, de l'usage des codons chez la souris et de la stabilité des amorces d'ADN, il a été possible de définir des oligonucléotides dégénérés. de 5' vers 3':
VLK2 GAA ATT GTK CT{G,C} AC{C,T} CAG TCT CC (oligo direct)
CLKB GTT GAA GCT CTT GAC {A, G} AT GGG (oligo réverse) D'autre part, le choix d'amorces d'ADN pour la chaîne lourde a été réalisé à partir des séquences connues des chaînes lourdes de souris 1 2
de type lgG1 ,k (Kabat et al., Séquences of proteins of immunological interest. Fifth édition, 1 991 ) . de 5' vers 3':
VHA GAG GTG CAG CT{G,T} CAG CAG TC{A,T} GG (oligo direct) CH GTC CAC CTT GGT GCT GCT (oligo réverse)
- résultats de PCR:
Des essais de PCR ont été réalisés à différentes températures d'hybridation, avec différentes concentrations d'ADNc et d'amorces d'ADN. Pour évaluer la stringence des réactions, des contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions avec une seule amorce d'ADN par milieu réactionnel afin d'éliminer les conditions d'amplification non spécifiques.
10 à 100 ng d'ADNc ont été utilisés par PCR. Les réactions de PCR ont été réalisées dans un mélange réactionnel de 50 μ\ variant suivant la chaîne à amplifier (cf Tableau I) .
Le milieu réactionnel contenait un mélange de deux ADN polymérases: TAQ et PWO (Expand Long Template System de Boerhinger Mannheim). Le tableau I suivant présente les mélanges réactionnels de PCR des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5.
Tableau I
Milieu réactionnel Chaîne légère Chaîne lourde
ADNc (//g) 0,01 0, 1
Amorces d'ADN 100 50 pour VHA (pmoles) 10 pour CH dNTP (mM) 0,2 0,2
MgCI2 (mM) 1 ,75 1 ,75
Figure imgf000014_0001
polymérases (unités) 2,8 2,8
L'amplification a commencé par une dénaturation de 2 minutes à 94°C puis s'est poursuivie par 30 cycles identiques comprenant une phase de dénaturation de 30 secondes à 94°C, une phase d'hybridation 13
de 30 sec à 60°C puis une phase d'élongation de 2 minutes à 68 °C. Après ces cycles, le milieu réactionnel a été soumis à une élongation de 6 minutes à 68°C, puis conservé à 4°C.
L'analyse des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1 ,5% de 8 μ\ du mélange réactionnel, a montré l'existence d'un produit fortement majoritaire correspondant à la taille des fragments attendus dans les deux cas (680 pb environ pour chaque chaîne) .
7) Clonage Les produits de PCR ont été clones dans le vecteur pTAg (R&D
Systems) pour la chaîne lourde et dans le vecteur pUAg (R&D Systems) pour la chaîne légère, les bactéries issues des cellules de type DH1 (R&D Systems) ont été transformées avec ces plasmides issus de la ligation puis étalées sur milieu Luria broth (LB) solide additionné d'Ampicilline, d'IPTG, de Tétracycline et d'X-gal. Les colonies blanches ont ensuite été analysées par digestion de leur ADN plasmidique préalablement extrait (avec EcoRI et Hindlll pour le plasmide pTAg et EcoRI seul pour le plasmide pUAg) .
8) Production et séquençage de l'ADN codant pour le fragment Fab de l'anticorps 13B5 L'ADN plasmidique a été extrait suivant le protocole du Kit
Qiagen plasmid midi. Cette technique est basée sur une lyse alcaline modifiée suivie d'une purification sur colonne échangeuse d'anions. Environ 100 μg d'ADN plasmidique a pu être extrait à partir de chaque culture de 50 ml (LB-ampicilline). L'ADN plasmidique d'un clone pour chaque chaîne a été séquence manuellement sur le brin direct et réverse en utilisant des oligonucléotides internes à la séquences des gènes. Afin d'éviter des possibles erreurs d'interprétation des séquences dues au fait des erreurs de la polymérase lors de l'amplification, 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne légère et 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne lourde ont été séquences entièrement dans les deux sens. Le séquençage de ces 10 clones a été réalisé sur un séquenceur automatique. Après correction des spectres et alignement des séquences de chaque clone (environ 4 à 6 séquences par clones), une séquence consensus pour chacun a été déduite en remplaçant les bases ambiguës par un N. Une séquence en acides aminés a été déduite de ces séquences 14
en nucléotides pour chaque clone puis toutes ces séquences en acides aminés ont été alignées pour la chaîne lourde et pour la chaîne légère du fragment Fab de l'anticorps 13B5. Les ambiguïtés résiduelles s'exprimant au niveau des acides aminés ont été levées par une relecture des spectres aux endroits problématiques.
On a obtenu les séquences en acide aminé des chaînes lourde et légère présentées à la figure 1 et à la figure 2.
Exemple 2: Description d'un procédé de réalisation d'un anticorps recombinant à partir de la séquence du Fab13B5.
Le procédé décrit a pour objectif de réaliser un anticorps recombinant ou ScFv (Single chain Fv) à partir des clones codant respectivement pour les chaînes lourde et légère du Fab. On utilisera pour effectuer ce procédé le kit Pharmacia " Recombinant Phage antibody System " (référence 27 9401 -01 , 27902-01 , 279043-01 ) .
a) Clonage des régions variables des chaînes lourde et légère: Les gènes codant pour les régions hypervariables des chaînes lourde (VH) et légère (VL) seront amplifiées par PCR, à partir des plasmides isolés au cours de l'exemple 1 , paragraphe 7, clonage, à l'aide d'amorces choisies dans les régions " framework " des régions variables des immunoglobulines. On utilisera dans la suite les kits de Pharmacia. Les produits de PCR résultant seront ensuite assemblés, à l'aide d'un linker, en un seul gène (750 pb) unique codant pour un Scfv. On obtiendra le fragment Scfv constitué des régions VH et VL séparées par la séquence peptidique (GGGGS)3.
On procédera ensuite à l'amplification du gène Scfv avec des amorces spécifiques des extrémités 5' du VH et 3' du VL et contenant respectivement les sites de restriction Sfil et Notl. On digérera ensuite le produit d'amplification résultant par des enzymes de restriction Sfil et Notl, puis on liguera avec le phagémide pCANTABδE préalablement ouvert par les enzymes de restriction Sfil et
Notl. b) Expression du Scfv: Afin d'exprimer le Scfv, des bactéries E.coli de type SupE
(TG1 ) seront transformées par le pCANTABδE contenant le gène du Scfv. 1 5
Les colonies contenant le phage seront infectées par un phage helper M1 3K07 pour produire des phages recombinants qui contiennent le gène codant pour le ScfV. Ces phages recombinants expriment par ailleurs à leur surface une ou plusieurs copies de Scfv sous forme de protéine de fusion Scfv-g3p.
On sélectionnera un phage recombinant produisant un Scfv fonctionnel. On réalisera la sélection en ELISA par fixation des phages à l'antigène spécifique du Scfv, puis on mettra en évidence des complexes formés à l'aide d'un anticorps anti-phage M13 et d'un conjugué anticorps anti-espèce marqué à la phosphatase-alcaline (ou peroxydase) . On réalisera 3 cycles consécutifs sélection/enrichissement afin d'obtenir une population de phages exempte de phages n'exprimant pas le Scfv. Après sélection, on utilisera les phages recombinants exprimant le Scfv pour infecter des bactéries E.coli HB21 51 (souche non suppressive) afin de produire l'anticorps recombinant sous forme soluble.
L'homme du métier pourra ainsi obtenir, en utilisant notamment le Kit Pharmacia, des anticorps recombinants correspondant à la partie Fab de l'anticorps 1 3B5.
Exemple 3 : spécificité et sensibilité de l'anticorps 1 3B5
Résultats d'un test ELISA indirect:
La protéine p24 est adsorbée sur une plaque ELISA de type Maxisorb de NUNC (polystyrène) dans du PBS à raison de 25 ng par puits pendant 2 heures à 37°C.
On a ensuite saturé la plaque par 200 ml de tampon PBS- Tween 20 à 0,05% BSA 3% pendant 2 heures à 37°C.
L'anticorps 1 3B5 couplé à la biotine est ensuite dilué à 1 //g/ml, puis de 4 en 4 dans du tampon PBS-Tween 20 à 0,05% BSA 1 %. On a alors mis 200 μ\ par puits de chaque dilution à incuber avec la p24 pendant 2 heures à 37°C.
On a ensuite mis 200 μ\ par puits d'une dilution de streptavidine phosphatase alcaline à 0,5 //g/ml dans du tampon PBS- Tween 20 à 0,05% BSA 1 %, à incuber pendant 30 minutes à 37°C. On a révélé les complexes p24/anticorps 1 3B5 biotinilés/streptavidine-phosphatase-alcaline par 100 μ\ d'une solution de 1 6
pNPP (p-nitrophényl phosphate) en tampon diéthanolamine 1 M/MgCI2 0,5 mM pH 9 pendant 1 5 minutes à 37°C. On a alors bloqué la réaction par addition de 100 //I de NaOH 1 M. La densité optique est lue à 405 nm.
Après chaque étape, la plaque est lavée 3 fois par du tampon PBS-Tween 20 à 0,05%.
Le test ELISA indirect a été effectué pour l'anticorps 1 3B5 ainsi que pour des anticorps polyclonaux anti-p24 et deux autres anticorps monoclonaux 23A5 et 1 5F8 décrits dans les références bibliographiques 1 , 2 et 3. Les résultats sont donnés par la figure 3.
L'anticorps 1 3B5 reconnaît la p24 en ELISA indirect. II donne un signal de détection supérieur à ceux obtenus pour les autres anticorps et le signal maximum de détection est atteint pour une concentration en anticorps de environ 0,2 //g/ml. Les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux 15F8 et 23A5 donnent, en revanche, un signal de détection maximum pour une concentration en anticorps nettement supérieure, de environ 1 //g/ml pour le 1 5F8 et le polyclonal, et supérieur à 1 //g/ml pour le 23A5.
Ces résultats montrent que l'anticorps 13B5 reconnaît le p24 avec une affinité supérieure à celle des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux 1 5F8 et 23A5.
17
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Claims

1 8
REVENDICATIONS
1/ Ligand peptidique et/ou équivalent peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du retrovirus HIV-1 , comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N- terminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, caractérisé en ce que la chaîne légère comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1 , L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 1 65, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1 , et la chaîne lourde comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H 1 , H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 1 55 à 1 95, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID No 2.
2/ Ligand selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le brin peptidique comprend la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.
3/ Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le brin peptidique consiste en la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.
4/ Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est un anticorps.
5/ Ligand selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est un anticorps monoclonal d'origine murine.
6/ Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est un anticorps de type chimérique, constitué de régions dites constantes d'origine humaine et de régions dites hypervariables d'origine murine. 11 Ligand selon les revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un marqueur.
8/ Ligand selon les revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est reconnu par un conjugué anticorps-marqueur.
9/ Procédé de détection de la p24 du VIH-1 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec au moins 1 9
un ligand selon la revendication 1 , et la mesure du complexe Iigand-p24 formé.
10/ Kit de diagnostic pour détecter une infection par le VIH-1 comprenant au moins un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
1 1 / Utilisation des anticorps de type chimérique humain-murin selon la revendication 6 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des patients atteints d'une infection par le VIH-1 .
12/ Molécule d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1 .
13/ Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1 .
14/ Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 1 3.
15/ Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassete d'expression selon la revendication 1 3 ou un vecteur selon la revendication 14.
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