FR2777285A1 - Ligand peptidique presentant une affinite specifique vis-a-vis de la proteine p24 du retrovirus hiv-1 - Google Patents

Abstract

Ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du rétrovirus HIV-1, comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N-terminale de la chaîne légère et/ ou la chaîne lourde d'un anticorps, caractérisé en ce que la chaîne légère comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1, L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1, et la chaîne lourde comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1, H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID No 2.

Description

La présente invention concerne un ligand peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du virus de l'immunodéficience acquise de type 1 (VIH-1). L'invention concerne également un anticorps de type murin, ou chimérique humain-murin, présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du VIH-1, la molécule d'ADN correspondant au ligand peptidique, les cassettes et vecteurs comprenant cette molécule d'ADN, un procédé de détection in vitro de l'infection par le VIH-1 à partir d'un échantillon biologique, ainsi que l'utilisation d'anticorps chimérique pour l'utilisation en tant que médicament.

Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) est l'ultime étape de l'infection de l'homme par le VIH. On pense aujourd'hui que l'infection présente un caractère irréversible et la plupart du temps fatal, même si le décès survient après un temps qui peut varier considérablement d'un patient à l'autre. Alors que l'on a longtemps pensé que le virus était seul responsable de la maladie, de plus en plus d'indices suggèrent aujourd'hui que la présence de mycoplasmes prédispose à l'infection par le VIH lors d'un contact avec le virus. De même, le cytomégalovirus, présent chez de nombreux individus, semblerait favoriser le passage d'une forme d'infection à VIH asymptomatique au déclenchement du SIDA. II existe aussi une autre théorie, dénommée " HIVER ", selon laquelle la plupart des dommages causés par la maladie relèveraient de problèmes auto-immuns. Néanmoins, dans toutes ces hypothèses, I'efficacité de substances antivirales suggère fortement que le virus doit jouer un rôle important.

Le SIDA est une maladie à évolution lente et des personnes séropositives sont infectieuses alors qu'elles ne manifestent aucun symptôme de la maladie pendant des années. II est donc nécessaire de pouvoir diagnostiquer l'infection par le virus le plus tôt possible.

Le génome entier du VIH a été séquencé, et les fonctions des différents gènes élucidées. La transcriptase réverse et l'intégrase virales sont produites par clivage d'une grosse protéine de fusion gag-pol, alors que les protéines de la capside virale sont produites par clivage de la protéine gag. Une protéine précurseur p55 de gag est coupée par une protéase codée par le gène pol, laquelle produit la protéine principale p24 (parfois appelée p25) et les protéines p18 et p13.

L'être humain infecté par le VIH développe rapidement des titres élevés en anticorps dirigés contre les antigènes gp120, gp160, gp41 et p24. Les anticorps du sérum dirigés contre la p24 apparaissent très tôt au moment de l'infection.

L'homme de l'art connaît bien la structure des anticorps.

Chaque anticorps est constitué de deux chaînes " légères " et de deux chaînes " lourdes ". La région de fixation de l'antigène ou site de fixation (région déterminant la complémentarité) se situe à l'extrémité aminoterminale (N-terminale) des chaînes lourde et légère et implique donc ces deux types de chaînes. Les deux chaînes se replient en une série d'amas non structurés, répartis de manière discrète, que l'on appelle les domaines.

Ainsi, ce que l'on appelle un a anticorps à domaine unique " (Dabs) ne comprend qu'un seul des domaines d'un anticorps donné.

Les domaines situés en position amino-terminale de chacune des chaînes lourdes et légères sont appelés régions variables, lesquelles comprennent des régions hypervariables qui diffèrent d'un anticorps à l'autre, le reste de ces régions variables étant constitué d'acides aminés relativement constants formant une ossature à la structure spécifique de l'anticorps. Les autres domaines de l'anticorps, particulièrement ceux en position C-terminale, sont dits constants, c'est à dire qu'ils sont identiques pour tous les anticorps d'une même classe.

Bien que l'on connaisse déjà des anticorps monoclonaux de type murin et humain dirigés contre la p24, utilisés dans des immunoessais ou en tant qu'agents thérapeutiques, la demanderesse a de manière surprenante obtenu un anticorps monoclonal d'origine murine présentant une sensibilité et une spécificité élevée pour la protéine p24 du VIH-1. A partir du clone cellulaire sécrétant cet anticorps monoclonal, la demanderesse a obtenu une lignée cellulaire hybridome sécrétant cet anticorps monoclonal et a déterminé la séquence en acide désoxyribonucléique (ADN) et acides aminés dudit anticorps.

Le premier objet de la présente invention concerne principalement un ligand peptidique et/ou équivalent peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du rétrovirus HIV-1, comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie N terminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, la chaîne légère comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1, L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1, et la chaîne lourde comprenant une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1,
H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID
No 2.

Selon la présente invention, ' équivalent " pour un peptide signifie que la structure chimique est similaire et que la fonction du peptide est identique. Un équivalent peptidique pourra donc présenter des acides aminés différents mais présentera une fonctionnalité, en l'occurence vis-àvis de la protéine p24, identique. De ce fait, un acide aminé est dit équivalent d'un autre acide aminé, lorsque leurs caractéristiques chimiques, telles polarité, hydrophobicité, et/ou basicité, et/ou acidité, et/ou neutralité, sont sensiblement les mêmes. Ainsi, une leucine est équivalente d'une isoleucine, au sens de la définition précédente.

Les ligands peptidiques selon l'invention peuvent être tels qu'à l'état natif, lorsqu'il s'agit d'un anticorps monoclonal par exemple, ou modifiés chimiquement. Par modification chimique, on entend toute altération chimique d'au moins un groupement fonctionnel de la séquence peptidique, préservant substantiellement ,voire augmentant, les propriétés biologiques de ladite séquence peptidique vis-à-vis de l'antigène p24 du VIH-1. Font notamment partie des modifications chimiques considérées précédemment, le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amine, une carboxyméthylation des fonctions thiols, une estérification des liaisons peptidiques telles que des liaison carba, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.

Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand peptidique comprend un brin peptidique comprenant la chaîne légère et la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence
SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.

Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand comprend un brin peptidique qui consiste en la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence
SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.

Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps.

Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le ligand est un anticorps monoclonal d'origine murine, dénommé dans la présente invention " 13B5 ".

Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, le ligand est un anticorps de type chimérique, constitué de régions dites constantes d'origine humaine et de régions dites hypervariables d'origine murine.

De tels anticorps peuvent être également dénommés anticorps recombinants. Pour l'assemblage des molécules de type immunoglobuline tétramère complète et l'expression d'anticorps actifs, on fusionne les inserts d'ADN recombinant codant pour les régions variables ( comprenant les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères), avec un ADN codant pour des régions constantes des chaînes lourdes et légères, puis on les transfère à l'intérieur de cellules hôtes appropriées, par exemple après incorporation dans des vecteurs hybrides.

Du fait que la séquence du fragment Fab de l'anticorps 13B5 est divulguée dans la présente invention, l'homme de l'art peut fabriquer, en utilisant la technologie de l'ADN recombinant avec des cellules hôtes telles que levures ou bactéries, divers fragments d'anticorps comprenant les régions hypervariables citées ci-dessus, et qui gardent leur spécificité envers la p24.

Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand comprend un marqueur. Un tel anticorps est dénommé conjugué. Le dit conjugué peut être fabriqué à partir d'un fragment dudit anticorps, dans la mesure où ce dernier garde sa spécificité envers la p24. Le marqueur peut être par exemple une enzyme, un marqueur de type fluorescent, un marqueur de type chémiluminescent, une avidine , une biotine, ou un anticorps marqué de manière radioactive.

Les enzymes utilisées pour les conjugués d'anticorps de l'invention sont, par exemple, la peroxidase de Raiford, la phosphatase alkaline, la béta-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucoamylase,
I'anhydrase carbonique, l'acétylcholinestérase, le lysosyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6-phosphatase déhydrogénase.

Les marqueurs utilisés pour les conjugués de type fluorescent selon l'invention peuvent être de la fluorescéine, du fluorochrome, de la rhodamine.

Les marqueurs de type chémiluminescent sont par exemple les esters d'acridium du luminol.

Dans de tels conjugués, les anticorps ou fragments d'anticorps sont liés au partenaire de conjugaison directement ou par un groupement espaceur ou agent chélatant.

Comme exemple d'agents chélatants, on peut citer l'acide éthylène-diaminetétraacétique (EDTA), I'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), le 1,4,8,1 1-tétra azatétradécane, I'acide 1,4,8,11tétraazatradécane-1,4,8,11-tétraacétique, l'acide 1-oxa-4,7,12,15tétraaza heptadécane-4,7,12,15-tétraacétique, ou du même genre.

Les anticorps marqués de manière radioactive selon la présente invention contiennent par exemple de l'iode radioactive (I123, I125, I131), du tritium (H ), du carbone (C14), du souffre (S35), de l'yttrium (Y90), du technétium (TC99m), ou autre du même genre.

Les ligands peptidiques selon la présente invention, marqués de manière radioactive avec de l'iode, sont obtenus à partir des ligants selon la présente invention par iodation connue oer se, par exemple avec de l'iodure de potassium ou de sodium radioactif et un réactif chimiquement oxydant, tel que l'hypochlorite de sodium, la chloramine T ou du même genre, ou un réactif enzymatiquement oxydant, tel que la lactoperoxidase et la glucose oxydase. Les ligands selon la présente invention peuvent également être couplés à l'yttrium par exemple par chélation avec le
DPTA.

La liaison de l'enzyme avec l'anticorps selon la présente invention peut être réalisée en faisant réagir un anticorps selon la présente invention avec un réactif de couplage, par exemple, le glutaraldéhyde, le périodate, la N,N'-O-phénylènedimaléimide, le N-(m-maléimidobenzoyl oxy)-succinimide, le N-(3-[2'-pyridyldithio]-propionoxy)-succinimide, le N éthyl-N'-(3-diméthylamino-propyl)-carbodiimide. Les conjugués avec de la biotine sont préparés par exemple en faisant réagir l'anticorps selon la présente invention avec un ester activé de la biotine tel que l'ester de biotine N-hydroxysuccinimide. Les conjugués avec un marqueur fluorescent ou chemiluminescent sont préparés en présence d'un réactif de couplage, par exemple ceux cités ci-dessus, ou par une réaction avec de l'isothiocyanate, de préférence de l'isothyocyanate de fluorescéine.

Dans encore un autre mode de réalisation, le ligand est reconnu par un conjugué anticorps-marqueur.

Dans la mesure où l'on préfère utiliser dans des immunoessais les ligands selon la présente invention, par révélation par un autre anticorps marqué, le ligand selon la présente invention comprendra de ce fait une partie utile pour la reconnaissance de ce deuxième anticorps marqué. On utilisera particulièrement les chaînes lourdes constantes de type murin ou humain dans le cas où le ligand soit un anticorps.

Les anticorps de la présente invention peuvent être digérés par des protéases. On obtient alors plusieurs fragments dénommés, Fab, Fab' et Fc.

L'avantage potentiel des fragments d'anticorps est qu'ils peuvent être fabriqués assez facilement par des bactéries ou des levures.

Comme l'homme de l'art le sait, la technologie des anticorps à domaine unique (Dabs) offre la possibilité de cloner des molécules ressemblant à des anticorps dans des bactéries et de cribler des millions d'anticorps beaucoup plus simplement que des anticorps monoclonaux.

Un exemple d'une telle réalisation est donné dans l'exemple 2.

Un second objet selon l'invention est un procédé de détection de la p24 du VIH-1 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec au moins un ligand selon l'invention, et la mesure du complexe ligand-p24 formé.

Un troisième objet selon l'invention est un Kit de diagnostic pour détecter une infection par le VIH-1 comprenant au moins un ligand selon l'invention.

Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation des anticorps de type chimérique humain-murin selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des patients atteints d'une infection par le VIH-1.

Un cinquième objet selon l'invention est la molécule d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1.

Comme exemple d'une telle molécule, on peut citer les séquences d'acides nucléiques des séquences SEQ ID N01 et 2.

Les Figures 1 et 2 représentent respectivement la séquence en acides aminés des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 1 3B5 avec les régions hypervariables encadrées, codées par les séquences
SEQ ID N01 et 2.

La figure 3 représente les résultats d'un test ELISA indirect selon l'exemple 3. En abscisse est représenté la concentration en anticorps (,ug/ml), et en ordonnée la mesure de DO (densité optique) à 405 nm.

Les séquences SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2 représentent respectivement les séquences en nucléotides et en acides aminés de la chaîne légère et de la chaîne lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5.

Un sixième objet selon l'invention est les cassettes d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un ligand peptidique selon l'invention, les vecteurs comprenant les cassettes d'expression décrites ci-dessus, et les cellues issues d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.

Exemple i : Séquençage de la partie Fab de l'anticorps 13B5
1) Procédé d'obtension de l'anticorps
a) Préparation de cellules de rate de souris immunisées avec de la protéine recombinante p24.

On a utilisé comme antigène une protéine recombinante p24 HIV-1, des souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/C
BYJICO (fournies par IFFA Credo), et la lignée myélomateuse SP2/0-AG14.
b) Protocole d'immunisation
Les souris ont été immunisées à 15 jours d'intervalle à l'aide de 3 injections par voie intra-péritonéale (IP) associant 50 p9 d'antigène et de l'adjuvant complet de Freund (ACF) pour la première injection et de l'adjuvant incomplet de Freund (AIF) pour les autres injections.
c) Fusion
On réalise la fusion selon la technique classique décrite par G.

Kôhler et C. Milstein (Nature 256. 495-497 (1997)).
d) Culture en suspension
On a utilisé un milieu de base : Iscove's Modified Dulbecco
Medium (IMDM) additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/l), de 10% de sérum de veau foetal (SVF), de pH 6,7 à 7,3, et à température 250C.

Les réactifs additionnels étaient l'insuline 4 mg/l, le 2mercaptoéthanol (10 pM), I'éthanolamine (20 HM), la pénicilline (100
U/ml), la streptomycine (50 /Jg/ml).

Les cellules hétérolploides obtenues ont été sub-cultivées tous les deux ou trois jours.
e) Congélation des cellules
On a utilisé un milieu de composition: IMDM additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et 10% de diméthyl sulfoxide (DMSO
Sigma).

La concentration cellulaire était de 3,6 x 106 cellules par ampoules (2 x 106 cellules/ml).

On a effectué une congélation lente des cellules à -800C dans du milieu IMDM-SVF 10%-DMSO 10%, pendant 24 à 72 heures, puis on a conservé les cellules dans de l'azote liquide à -18O0C.

2) Production d'anticorps in vivo
On utilise des souris femelles ayant de 4 à 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/C BYJICO (IFFA Credo).

On a préparé une suspension cellulaire du clone 13B5 que l'on a centrifugé à 200 G pendant 10 minutes à 250C. Puis on a remis en suspension les cellules dans du NaCI 9 à raison de 106 cellules/ml.

On a injecté 106 cellules dans chaque souris par voie intrapéritonéale.

On a ensuite récolté le liquide ascite après 10 jours +/- 2 jours.

3) Identification de l'anticorps 13B5 sécrété par 'hybridome.
a) ELISA indirect.

On a utilisé pour 'ELISA indirect des plaques de polystyrène
Maxisorb NUNC (commercialisée par la société Polylabo Paul Block sous la référence 4-39454), coatées avec 100 1ll d'antigènes p24 recombinante à 1 ,ug/ml en tampon bicarbonate (NaHCO3 0,05M; pH 9,6). On a laissé la plaque incuber pendant une nuit à 220C.

On a saturé avec 100 ijI de tampon PBS (50 mM Phosphate et 150 mM NaCI, pH 7,2) additionné de 1 % d'extrait de lait lyophilisé Régilait durant 1 heure à 370C.

On a ajouté 100 l de surnageant de culture ou de liquide d'ascite, obtenu au paragraphe précédent, dilués en PBS-Tween 20 à 0,05%, puis on a laissé incuber une heure à 370C.

On a ajouté ensuite 100 'il d'immunoglobulines anti-lg (H+L) de souris conjuguées à la phosphatase-alcaline (Jackson Laboratories
Référence 115-055-062) dilué au 1/2000 dans du tampon PBS-BSA 1% (phosphate buffer saline-bovine serum albumine), pendant une heure à 370C.

On a alors ajouté 100 ,ul de p-nitrophényl phosphate ((pNPP), commercialisé par bioMérieux, référence 60002990) à la concentration de 2 mg/ml dans de la DEA-HCL (commercialisé par bioMérieux, référence 60002989), pH 9,8, et on a laisser incuber 30 minutes à 370C.

On a ensuite bloqué la réaction avec 100 l de NaOH 1N.

On effectue 3 lavages entre chaque étape avec 300 pI de PBS
Tween 20 à 0,05% et un lavage supplémentaire en eau distillée avant d'ajouter le pNPP.

L'ELISA montre que l'anticorps 13B5 reconnait spécifiquement la p24 du HIV-1. L'anticorps 13B5 est d'isotype IgG1,k.
b) Utilisation de l'anticorps 13B5 en Western-blot:
On a déposé la p24 sur SDS-Tricine PAGE 16,5% (Tricine
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the
Separation of Proteins in the Range from 1 to 100kDa; Hermann Schägger and Gebhard von Jagow, Analytical Biochemistry 166, 368-379 (1987)) puis on l'a transférée électriquement sur une membrane de nitrocellulose (Hybond C Amersham). On a ensuite saturé la membrane par une solution
PBS-Régilait 3% pendant 20 minutes à température ambiante. La membrane a ensuite été reprise puis mise à incuber dans une solution de
PBS-Régilait 3% Tween 0,05% contenant l'anticorps 13B5 dilué à 10,ag/ml, à température ambiante, pendant 1 heure 30 minutes. On a alors repris la membrane, on l'a lavée 3 fois en PBS-Tween 0,05%, puis incubée en présence d'un conjugué, anticorps anti-souris marqué à la phosphatase alcaline, dilué à environ 1 ,ug/ml, pendant 1 heure à température ambiante.

On effectue la révélation des conjugués par une solution de béta-naphtyl acide phosphate 0,5mg/ml et la O-Dianisidine 0,5mg/ml dans du tampon tétraborate 12,07g/l, MgS04 1,2g/l, pH 9. Une bande unique est observée de poids moléculaire attendu, environ 27000, compatible avec le poids moléculaire théorique de la p24, 26707. L'anticorps 13B5 reconnaît de façon spécifique la p24 en western-blot.
c) Test sandwich antigène p24:
Les expériences suivantes ont été effectuées en Vidas (commercialisé par bioMérieux) sur le modèle suivant:
On a adsorbé de la p24 diluée dans du PBS à 0,5 pg/ml, 350 pl par cône Vidas.

On a lavé avec 600,ul de tampon PBS-Tween 20 à 0,1%.

On a saturé par 400 pI de tampon Tris 200 mM, NaCI 150 mM, acide maléique 200 mM, NaOH 150 mM, Tween 20 à 0,05% et pH 6,1.

On a lavé par 600 p de tampon PBS-Tween 20 à 0,1%.

On a dilué l'anticorps 13B5 une première fois 1000 fois à environ 10 pg/ml, puis de 10 en 10, dans un tampon Tris 100 mM, NaCI 300 mM, Tween 20 à 5 %, BSA 2%, Régilait 0,2%, pH 7. L'anticorps 13B5 est ensuite ajouté et incubé à 370C.

On lave ensuite par 600 l de tampon PBS-Tween 200,1%.

On met ensuite à incuber à 370C 100 ng de p24, couplée à la biotine, dans 400 p de tampon PBS Régilait 0,25%, Tween 20 à 0,05%.

On lave ensuite par 600 pI de tampon PBS-Tween 20 à 0,1 %.

On met alors à incuber le conjugué steptavidine-phosphatasealcaline à 370C dans 400 pI de tampon Tris 100 mM, BSA 0,25%, NaCI 300 mM, Tween 20 à 0,25%, Régilait 0,25%, pH 7,4.

On lave ensuite par 600 pI de tampon PBS-Tween 200,1%.

Après révélation des conjugués p24/anticorps 13B5/p24biotine/streptavidine-phosphatase-alcaline, on détecte un signal positif qui caractérise la présence de l'anticorps 13B5. L'anticorps 13B5 reconnait spécifiquement la p24 dans un test sandwich antigène.

4) Extraction des ARNm produits par les cellules hybridomes.

L'ARN total des cellules hybridomes a été extrait suivant une technique dérivée de la méthode de Chomczynski (1987) en utilisant le kit
CLONsep TM (commercialisé par Clontech). La purification d'ARNm à partir de l'ARN total a été réalisée à partir du kit mRNA separator (TM) de
CLONTECH.

Environ 30 pg de l'ARNm ont été obtenus à partir de 108 cellules d'hybridomes avec une pureté raisonnable (A260/A280= =
5) Transcription réverse en ADNc
Les molécules d'ARNm ont été transcrites réversement en ADN complémentaires simples brins suivant le protocole du kit Advantage TM
CLONTECH à partir d'amorces aléatoires d'ADN de six mers et de la transcriptase réverse du virus MMLV.

6) Sélection et amplification du gène codant pour le fragment
Fab de l'anticorps 13B5
La solution d'ADNc contenait un mélange de tous les ADNc simples brins issus de la transcription réverse de tous les ARNm produits par les cellules hybridomes. Aussi était-il nécessaire de sélectionner et d'amplifier l'ADN avec des amorces d'ADN préalablement choisies.

- choix des amorces d'ADN:
Le séquençage N-terminal des chaînes légère et lourde a été réalisé de manière automatique par dégradation d'Edman. Seuls les 10 premiers acides aminés de la chaîne légère ont pu être déterminés:
EIVLTQSPAI. II semble que le premier acide aminé N-terminal de la chaîne lourde était protégé par un groupe acétyl, devenu ainsi non modifiable chimiquement par l'isothiocyanate de phényl. A partir de la séquence peptidique N-terminale de la chaîne légère, de l'usage des codons chez la souris et de la stabilité des amorces d'ADN, il a été possible de définir des oligonucléotides dégénérés. de 5' vers 3':
VLK2 GAA ATT GTK CT(G,C) AC(C,T) CAG TCT CC (oligo direct)
CLKB GTT GAA GCT CTT GAC (A,G) AT GGG (oligo réverse)
D'autre part, le choix d'amorces d'ADN pour la chaîne lourde a été réalisé à partir des séquences connues des chaînes lourdes de souris de type IgGl,k (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. Fifth edition, 1991). de 5' vers 3':
VHA GAG GTG CAG CT(G,T) CAG CAG TC(A,T) GG (oligo direct)
CH GTC CAC CTT GGT GCT GCT (oligo réverse)
- résultats de PCR:
Des essais de PCR ont été réalisés à différentes températures d'hybridation, avec différentes concentrations d'ADNc et d'amorces d'ADN. Pour évaluer la stringence des réactions, des contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions avec une seule amorce d'ADN par milieu réactionnel afin d'éliminer les conditions d'amplification non spécifiques.

10 à 100 ng d'ADNc ont été utilisés par PCR.

Les réactions de PCR ont été réalisées dans un mélange réactionnel de 50 pI variant suivant la chaîne à amplifier (cf Tableau I).

Le milieu réactionnel contenait un mélange de deux ADN polymérases: TAQ et PWO (Expand Long Template system de Boerhinger
Mannheim).

Le tableau I suivant présente les mélanges réactionnels de PCR des chaînes légère et lourde du fragment Fab de l'anticorps 13B5.

Tableau I

<tb> Milieu <SEP> réactionnel <SEP> Chaîne <SEP> lé <SEP> ère <SEP> Chaîne <SEP> lourde
<tb> ADNc <SEP> ( g) <SEP> 0,01 <SEP> 0,1
<tb> Amorces <SEP> d'ADN <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> pour <SEP> VHA
<tb> (pmoles) <SEP> 10 <SEP> pour <SEP> CH
<tb> dNTP <SEP> (mM) <SEP> 0,2 <SEP> 0,2
<tb> M <SEP> Cl2 <SEP> (mM) <SEP> 1,75 <SEP> 1,75
<tb> ol <SEP> mérases <SEP> (unités) <SEP> 2,8 <SEP> 2,8
<tb>
L'amplification a commencé par une dénaturation de 2 minutes à 940C puis s'est poursuivie par 30 cycles identiques comprenant une phase de dénaturation de 30 secondes à 940C, une phase d'hybridation de 30 sec à 60"C puis une phase d'élongation de 2 minutes à 68 C.

Après ces cycles, le milieu réactionnel a été soumis à une élongation de 6 minutes à 680C, puis conservé à 40C.

L'analyse des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% de 8 pI du mélange réactionnel, a montré l'existence d'un produit fortement majoritaire correspondant à la taille des fragments attendus dans les deux cas (680 pb environ pour chaque chaîne).

7) Clonage
Les produits de PCR ont été clonés dans le vecteur pTAg (R & D
Systems) pour la chaîne lourde et dans le vecteur pUAg (R & D Systems) pour la chaîne légère. les bactéries issues des cellules de type DHi (R & D
Systems) ont été transformées avec ces plasmides issus de la ligation puis étalées sur milieu Luria broth (LB) solide additionné d'Ampicilline, d'lPTG, de Tétracycline et d'X-gal. Les colonies blanches ont ensuite été analysées par digestion de leur ADN plasmidique préalablement extrait (avec EcoRI et Hindlil pour le plasmide pTAg et EcoRI seul pour le plasmide pUAg).

8) Production et séquençage de l'ADN codant pour le fragment
Fab de l'anticorps 13B5
L'ADN plasmidique a été extrait suivant le protocole du Kit
Qiagen plasmid midi. Cette technique est basée sur une lyse alcaline modifiée suivie d'une purification sur colonne échangeuse d'anions.

Environ 100 pg d'ADN plasmidique a pu être extrait à partir de chaque culture de 50 ml (LB-ampicilline).

L'ADN plasmidique d'un clone pour chaque chaîne a été séquencé manuellement sur le brin direct et réverse en utilisant des oligonucléotides internes à la séquences des gènes. Afin d'éviter des possibles erreurs d'interprétation des séquences dues au fait des erreurs de la polymérase lors de l'amplification, 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne légère et 5 autres clones contenant le gène codant pour la chaîne lourde ont été séquencés entièrement dans les deux sens.

Le séquençage de ces 10 clones a été réalisé sur un séquenceur automatique. Après correction des spectres et alignement des séquences de chaque clone (environ 4 à 6 séquences par clones), une séquence consensus pour chacun a été déduite en remplaçant les bases ambigues par un N. Une séquence en acides aminés a été déduite de ces séquences en nucléotides pour chaque clone puis toutes ces séquences en acides aminés ont été alignées pour la chaîne lourde et pour la chaîne légère du fragment Fab de l'anticorps 13B5. Les ambiguités résiduelles s'exprimant au niveau des acides aminés ont été levées par une relecture des spectres aux endroits problématiques.

On a obtenu les séquences en acide aminé des chaînes lourde et légère présentées à la figure 1 et à la figure 2.

Exemple 2: Description d'un procédé de réalisation d'un anticorps recombinant à partir de la séquence du Fab13B5.

Le procédé décrit a pour objectif de réaliser un anticorps recombinant ou ScFv (Single chain Fv) à partir des clones codant respectivement pour les chaînes lourde et légère du Fab. On utilisera pour effectuer ce procédé le kit Pharmacia " Recombinant Phage antibody system " (référence 27 9401-01, 27902-01, 279043-01).
a) Clonage des régions variables des chaînes lourde et légère:
Les gènes codant pour les régions hypervariables des chaînes lourde (VH) et légère (VL) seront amplifiées par PCR, à partir des plasmides isolés au cours de l'exemple 1, paragraphe 7, clonage, à l'aide d'amorces choisies dans les régions " framework " des régions variables des immunoglobulines. On utilisera dans la suite les kits de Pharmacia. Les produits de PCR résultant seront ensuite assemblés, à l'aide d'un linker, en un seul gène (750 pb) unique codant pour un Scfv.

On obtiendra le fragment Scfv constitué des régions VH et VL séparées par la séquence peptidique (GGGGS)3.

On procèdera ensuite à l'amplification du gène Scfv avec des amorces spécifiques des extrémités 5' du VH et 3' du VL et contenant respectivement les sites de restriction Sfil et Notl.

On digérera ensuite le produit d'amplification résultant par des enzymes de restriction Sfil et Notl, puis on liguera avec le phagémide pCANTAB5E préalablement ouvert par les enzymes de restriction Sfil et
Notl .
b) Expression du Scfv:
Afin d'exprimer le Scfv, des bactéries E.coli de type SupE (TG1) seront transformées par le pCANTAB5E contenant le gène du Scfv.

Les colonies contenant le phage seront infectées par un phage helper
M13K07 pour produire des phages recombinants qui contiennent le gène codant pour le ScfV. Ces phages recombinants expriment par ailleurs à leur surface une ou plusieurs copies de Scfv sous forme de protéine de fusion Scfv-g3p.

On sélectionnera un phage recombinant produisant un Scfv fonctionnel. On réalisera la sélection en ELISA par fixation des phages à l'antigène spécifique du Scfv, puis on mettra en évidence des complexes formés à l'aide d'un anticorps anti-phage M13 et d'un conjugué anticorps anti-espèce marqué à la phosphatase-alcaline (ou peroxydase). On réalisera 3 cycles consécutifs sélection/enrichissement afin d'obtenir une population de phages exempte de phages n'exprimant pas le Scfv. Après sélection, on utilisera les phages recombinants exprimant le Scfv pour infecter des bactéries E.coli HB2151 (souche non suppressive) afin de produire l'anticorps recombinant sous forme soluble.

L'homme du métier pourra ainsi obtenir, en utilisant notamment le Kit Pharmacia, des anticorps recombinants correspondant à la partie Fab de l'anticorps 13B5.

Exemple 3 : spécificité et sensibilité de l'anticorps 13B5
Résultats d'un test ELISA indirect:
La protéine p24 est adsorbée sur une plaque ELISA de type
Maxisorb de NUNC (polystyrène) dans du PBS à raison de 25 ng par puits pendant 2 heures à 370C.

On a ensuite saturé la plaque par 200 ml de tampon PBS
Tween 20 à 0,05% BSA 3% pendant 2 heures à 370C.

L'anticorps 13B5 couplé à la biotine est ensuite dilué à 1 pg/ml, puis de 4 en 4 dans du tampon PBS-Tween 20 à 0,05% BSA 1%. On a alors mis 200 pI par puits de chaque dilution à incuber avec la p24 pendant 2 heures à 370C.

On a ensuite mis 200 ,ul par puits d'une dilution de streptavidine phosphatase alcaline à 0,5 pg/ml dans du tampon PBS
Tween 20 à 0,05% BSA 1 %, à incuber pendant 30 minutes à 370C.

On a révélé les complexes p24/anticorps 13B5 biotinilés/streptavidine-phosphatase-alcaline par 100 pI d'une solution de pNPP (p-nitrophényl phosphate > en tampon diéthanolamine 1M/MgCI2 0,5 mM pH 9 pendant 15 minutes à 370C. On a alors bloqué la réaction par addition de 100 pI de NaOH 1M. La densité optique est lue à 405 nm.

Après chaque étape, la plaque est lavée 3 fois par du tampon
PBS-Tween 20 à 0,05%.

Le test ELISA indirect a été effectué pour l'anticorps 13B5 ainsi que pour des anticorps polyclonaux anti-p24 et deux autres anticorps monoclonaux 23A5 et 15F8 décrits dans les références bibliographiques 1, 2 et 3. Les résultats sont donnés par la figure 3.

L'anticorps 13B5 reconnaît la p24 en ELISA indirect. II donne un signal de détection supérieur à ceux obtenus pour les autres anticorps et le signal maximum de détection est atteint pour une concentration en anticorps de environ 0,2 pg/ml. Les anticorps polyclonaux et les anticorps monoclonaux 15F8 et 23A5 donnent, en revanche, un signal de détection maximum pour une concentration en anticorps nettement supérieure, de environ 1 ,ug/ml pour le 15F8 et le polyclonal, et supérieur à 1 pg/ml pour le 23A5.

Ces résultats montrent que l'anticorps 13B5 reconnaît le p24 avec une affinité supérieure à celle des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux 15F8 et 23A5.

REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Immune response to a major epitope of p24 during infection with human immunodeficiency virus type 1 and implications for diagnosis and prognosis.B. Janvier, A. Baillou, Ph. Archinard, M. Mounier, B.

Mandrand, A. Goudeau and F. Barin. Journal of Clinical Microbiology (1991) 29 n03:488-492.

2. Clonal analysis of murine B cell response to the human immunodeficiency virus type 1 gag p17 and p25 antigens. V. Robert
Herbmann, S. Emiliani, F. Jean, M. Resnicoff, F. Traincard and C. Devaux.

Molecular Immunology (1992) 29 n06:729-738.

3. Linear B cell epitope of the major core protein of human immunodeficiency virus type 1 and 2. B. Janvier, Ph. Archinard, B.

Mandrand, A. Goudeau and F. Barin. Journal of Virology (1990) 64 n09:4258-4263.

LISTE DE SEQUENCES
(I) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIOMERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Anticorps monoclonal et de rives d'un tel anticorps réagissant contre un épitope
de la p24 du V1H- I
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 624 paires de bases
(B) TYPE: ADN génomique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN génomique de la chaîne légère du Fabl3B5 (iii) CARACTERISTIQUES:
CDRIl: de 70 à 99
CDR21: de 145 à 165
CDR31: de 262 à 285
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGGCAAAAGGTCACC 1 + + + + + + 60
CTTTAACACGACTGGGTCAGAGGTCGGTAGTGTCGACGTAGAGACCCCGTTTTCCAGTGG
E I V L T Q S P A I T A A S L G Q K V T
ATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGC
61 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 120 TAGTGGACGTCACGGTCGAGTTCACATTCAATGTACGTGACCATGGTCGTCTTCAGTCCG
I T C S A S S S V S Y M H W Y Q Q K S G
ACCTCCCCCAAACCATGGATTTATGAAATATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGC 121 + + ---±--- + + - --- + - + 180
TGGAGGGGGTTTGGTACCTAAATACTTTATAGGTTTGACCGAAGACCTCAGGGTCGAGCG T SP K P Wl Y E ISK LAS G V PAR
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA 181 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 240
AAGTCACCGTCACCCAGACCCTGGAGAATGAGAGAGTGTTAGTCGTCGTACCTCCGACTT
F S G S G S G T S Y S L T I S S M E A E
GATGCTGCCATTTATTACTGCCAGCAGTGGAATTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA 241 + + + + + + 300
CTACGACGGTAAATAATGACGGTCGTCACCTTAATAGGTAAGTGCAAGCCGAGCCCCTGT
D A A I Y Y C Q Q W N Y P F T F G S G T
AAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGT 301 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 360
TTCAACCTTTATTTTGCCCGACTACGACGTGGTTGACATAGGTAGAAGGGTGGTAGGTCA
K L E I K R A D A A P T V S I F P P S S
GAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAA 361 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 420
CTCGTCAATTGTAGACCTCCACGGAGTCAGCACACGAAGAACTTGTTGAAGATGGGGTTT
E Q L T S G G A S V V C F L N N F Y P K
GACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGT 421 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 480
CTGTAGTTACAGTTCACCTTCTAACTACCGTCACTTGCTGTTTTACCGCAGGACTTGTCA
D I N V K W K I D G S E R Q N G V L N S TGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACC 481 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 540
ACCTGACTAGTCCTGTCGTTTCTGTCGTGGATGTCGTACTCGTCGTGGGAGTGCAACTGG
W T D Q D S K D S T Y S M S S T L T L T
AAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACT 541 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 600
TTCCTGCTCATACTTGCTGTATTGTCGATATGGACACTCCGGTGAGTGTTCTGTAGTTGA
K D E Y E R H N S Y T C E A T H K T S T
TCACCCATCGTCAAGAGCTTCAAC 601 ---------±--------±--- 624
AGTGGGTAGCAGTTCTCGAAGTTG SP IV K SF N (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 642 paires de bases
(B) TYPE:ADN génomique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Adn génomique de la chaîne lourde
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: (iii) CARACTERISTIQUES:
CDR1H: de 76 à 105
CDR2H: de 155 à 195
CDR3H: de 295 à 327
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATG
1 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 60
CTCCACGTCGACGTCGTCAGACCCCGACTTGACCGTTCTGGACCCCGGAGTCACTTCTAC
E V Q L Q Q S G A E L A R P G A S V K M
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGG
61 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 120 AGGACGTTCCGAAGACCGATGTGGAAATGATCGATGTGCTACGTGACCCATTTTGTCTCC
S C K A S G Y T F T S Y T M H W V K Q R
CCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGTGGTTATAGTAATTAC
121 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 180
GGACCTGTCCCAGACCTTACCTAACCTATGTAATTAGGATCGTCACCAATATCATTAATG
P G Q G L E W I G Y I N P S S G Y S N Y
AATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
181 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 240
TTAGTCTTCAAGTTCCTGTTCCGGTGTAACTGACGTCTGTTTAGGAGGTCGTGTCGGATG
N Q K F K D K A T L T A D K S S S T A Y
ATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGACCGGTG
241 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 300
TACGTTGACTCGTCGGACTGTAGACTCCTGAGACGTCAGATAATGACAAGTTCTGGCCAC
M Q L S S L T S E D S A V Y Y C S R P V
GTACGACTGGGGTACAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCTCCACTCTCACAGTCTCCTCA
301 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 360
CATGCTGACCCCATGTTGAAACTGATGACCCCGGTTCCGAGGTGAGAGTGTCAGAGGAGT
V R L G Y N F D Y W G Q G S T L T V S S
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC 361 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 420
CGGTTTTGCTGTGGGGGTAGACAGATAGGTGACCGGGGACCTAGACGACGGGTTTGATTG
A K T T P P S V Y P L A P G S A A Q T N
TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC 421 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 480
AGGTACCACTGGGACCCTACGGACCAGTTCCCGATAAAGGGACTCGGTCACTGTCACTGG
S M V T L G C L V K G Y F P E P V T V T
TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC 481 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 540
ACCTTGAGACCTAGGGACAGGTCGCCACACGTGTGGAAGGGTCGACAGGACGTCAGACTG
W N S G S L S S G V H T F P A V L Q S D
CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTC 541 ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ 600
GAGATGTGAGACTCGTCGAGTCACTGACAGGGGAGGTCGTGGACCGGGTCGCTCTGGCAG
L Y T L S S S V T V P S S T W P S E T V
ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGAC 601 ---------±--------±--------±--------±- 642
TGGACGTTGCAACGGGTGGGCCGGTCGTCGTGGTTCCACCTG
T C N V A H P A S S T K V D

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Ligand peptidique et/ou équivalent peptidique présentant une affinité spécifique vis-à-vis de la protéine p24 du rétrovirus HIV-1, comprenant au moins un brin peptidique correspondant à la partie Nterminale de la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps, caractérisé en ce que la chaîne légère comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables L1, L2 et L3, respectivement positionnées de 70 à 99, de 145 à 165, de 262 à 285, selon la suite d'acides aminés décrite par la séquence SEQ ID No 1, et la chaîne lourde comprend une suite d'acides aminés déterminant trois régions dites hypervariables H1, H2 et H3, respectivement positionnées de 76 à 105, de 155 à 195, de 295 à 327, selon la suite d'acides aminés décrites par la séquence SEQ ID No 2.

2. Ligand selon la revendication 1, caractérisé en ce que le brin peptidique comprend la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.

3. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le brin peptidique consiste en la chaîne légère et/ou la chaîne lourde d'un anticorps correspondant respectivement à la séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID No 2.

4. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est un anticorps.

5. Ligand selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est un anticorps monoclonal d'origine murine.

6. Ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est un anticorps de type chimérique, constitué de régions dites constantes d'origine humaine et de régions dites hypervariables d'origine murine.

7. Ligand selon les revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un marqueur.

8. Ligand selon les revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est reconnu par un conjugué anticorps-marqueur.

9. Procédé de détection de la p24 du VIH-1 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec au moins un ligand selon la revendication i, et la mesure du complexe ligand-p24 formé.

10. Kit de diagnostic pour détecter une infection par le VIH-1 comprenant au moins un ligand selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.

11. Utilisation des anticorps de type chimérique humain-murin selon la revendication 6 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des patients atteints d'une infection par le VIH-1.

12. Molécule d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1.

13. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour un ligand peptidique selon la revendication 1.

14. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 13.

15. Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassete d'expression selon la revendication 13 ou un vecteur selon la revendication 14.