WO1995029420A1 - Kontrastvorrichtung für mikroskopie - Google Patents

Kontrastvorrichtung für mikroskopie Download PDF

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WO1995029420A1
WO1995029420A1 PCT/DE1995/000533 DE9500533W WO9529420A1 WO 1995029420 A1 WO1995029420 A1 WO 1995029420A1 DE 9500533 W DE9500533 W DE 9500533W WO 9529420 A1 WO9529420 A1 WO 9529420A1
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microscope
diffuser
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Inventor
Hans-Ulrich Dodt
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Dodt Hans Ulrich
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation

Definitions

  • phase objects such as Cells are used in microscopy for differential interference contrast (DIC) according to Nomarski, modulation contrast according to Hoffmann (HMC) and oblique lighting (SB).
  • DIC differential interference contrast
  • HMC modulation contrast according to Hoffmann
  • SB oblique lighting
  • the DIC works with polarized light and no longer gives clear images for objects of a certain thickness. It also has other disadvantages, for example it cannot be used with cells in plastic culture dishes.
  • the HMC does not give good images from a certain specimen thickness.
  • SB gives over-contrasted, object-unlike images on which no details can be seen at high magnification. Furthermore, all three methods give contrast only in one direction of the image, ie only up / down or left / right.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • the object of the invention is achieved by a device according to claim 1.
  • Advantageous embodiments are characterized in the subclaims.
  • the decisive idea of the invention according to claim 1 now consists in allowing more Fourier components than in the case of obliquely oblique illumination for image formation, and thus making the image more object-like. According to one of the preferred embodiments of the invention, this can be achieved, for example, by not using a simple perforated or sector diaphragm, but rather a quarter-ring diaphragm and this. downstream of a diffuser. You can also make the aperture itself spatially variable, something like a weighted one to receive oblique lighting on several sides. When examining thick objects, the diffuser is not absolutely necessary, since the object itself then acts as a diffuser.
  • a modulator is additionally arranged in a Fourier plane of the imaging beam path. It weakens the Fourier components of direct light, and thus also creates a more object-like picture.
  • contrast is generated in 2 essentially orthogonal spatial directions of the image.
  • the modulator can be used with and without switching on the diffuser.
  • the contrast of the images of thicker phase objects is significantly improved compared to the conventional contrast methods. To do this, it is sufficient to use a contrast device according to the invention in the illumination beam path, while other contrast methods must also influence the imaging beam path.
  • Existing microscopes can be easily retrofitted with the gradient contrast described below.
  • the gradient contrast can be used for both thick and thin phase objects, the strength of the contrast can be regulated.
  • phase contrast with reduced halo can also be generated with the invention.
  • a variable combination of phase and gradient contrast can also be set.
  • the gradient contrast arises in two essentially orthogonal directions of the image plane.
  • the gradient contrast can advantageously also be used on various special microscopes such as infrared, polarization and fluorescence microscopes.
  • FIG. 2 shows a preferred embodiment of a spatial filter for a device according to the invention
  • FIG. 3 shows a schematic view of the beam path near the object of an embodiment of the invention
  • FIG. 5A shows the pupil image when using an embodiment with a modulator
  • 5 B shows the relative position of the spatial filter and modulator in the beam path
  • FIG. 6 shows the schematic structure of an embodiment of the invention in combination with an infrared microscope
  • the contrast is generated in phase objects with the present invention by a spatial filter that generates an illumination gradient in the Fourier plane.
  • a spatial filter that generates an illumination gradient in the Fourier plane. This is achieved in that the rear focal plane of the condenser is mapped to an accessible location in front of the light source by means of a suitable lens system.
  • Fig.l shows, between the microscope body (1) and the halogen lamp (2) two lenses L1 and L2 of focal length f 1 are placed with the distance 2X fl.
  • the filament (3) of the lamp (2) is imaged from infinity to infinity.
  • the filament of the lamp is also shown in this plane.
  • FIG. 2 shows an embodiment of the filter as it is used for the observation of brain sections. It is essentially a combination of central aperture (6) and 90 degree sector aperture (7).
  • the width of the effective quarter ring (8), which is still effective for illumination in the aperture of the objective, is advantageously 1/2 - 1/10 of the radius of the objective pupil of the microscope. As the lighting ring becomes narrower, the contrast of the image increases. Free sectors up to 180 degrees can also be used. 90 degree sectors give maximum contrast in the two orthogonal spatial directions.
  • the increased contrast is explained by the fact that the object, such as brain sections, is no longer illuminated with a full light cone (9), but only with a curved, pointed light sword (10). This creates much less stray light in the brain section above and below the focus than with conventional full-cone lighting: You can look deeper into the brain section.
  • the oblique lighting provides a representation of the phase objects, the image is similar to DIC images.
  • the decisive point why the oblique lighting provides excellent images here is, in addition to the combination of central and sector aperture, above all the fact that the thick brain section acts as a diffuser.
  • the pupil level of the Objectively When looking at the pupil level of the Objectively, therefore, one does not see a sharp quarter ring with an inserted brain section, but a blurred lighting gradient that still has its maximum at the location of the quarter ring. No point on the Fourier plane is completely dark, so that all Fourier components contribute to the formation of the image.
  • the aperture is dimensioned such that the part of the quadrant in the condenser aperture that is no longer imaged in the objective pupil is also illuminated. Since an immersion condenser with a higher aperture than the objective serves as the condenser, contrast-enhancing and resolution-increasing effects of dark field microscopy also come into play.
  • the spatial filter for the gradient contrast can also be attached directly in the rear focal plane of the condenser or in other planes conjugated to it.
  • the described contrast method leads to strong overexposure and strong contrast when applied to thin objects.
  • the decisive modification here is the introduction of a diffuser (11) behind the quarter-ring diaphragm, approximately at the level of the Fourier plane (FIG. 1).
  • the effect of the brain slice acting as a diffuser is thus achieved without having to have a brain slice in the object plane.
  • the objective pupil When looking at the objective pupil, one again sees a diffuse illumination gradient.
  • this lighting gradient can now be regulated in a variety of ways: First, by varying the distance between the quarter-ring diaphragm and the diffuser. Also by moving the lens L2 against the diffuser, the cutout and thus the slope of the lighting gradient shown can be changed comfortably. Furthermore, the lighting gradient can be changed by folding or moving different ring diaphragms or by changing diffusers of different strengths. Another possibility for varying the gradient is to produce the diaphragm from polarizing film and to place a rotatable polarizer in front of it. This results in an aperture of adjustable transmission, which can of course also be achieved by using neutral filter foils with different transmissions as the aperture material.
  • the gradient can also be generated without a diffuser '' by evaporating reflective or absorption layers on glass plates, the transmission at any point on the glass plate having to imitate the effect of the combination of ring diaphragm and diffuser described above.
  • this gradient can also be realized using liquid crystal modules (LC-SLM). This has the advantage that the gradient can be set arbitrarily by computer. This would also make it possible to implement several concentric rings which, in conjunction with phase-shifting components, should lead to over-resolutions (Toraldo apertures).
  • rings up to 180 degrees can also be used.
  • phase contrast lenses can be used in combination with phase contrast lenses.
  • the invention it is also possible with the invention to produce phase contrast without the usual halos.
  • either the diffuser or preferably the lens L2 is displaced (FIG. 1) in such a way that the significantly lighter part of the gradient (12) includes the phase ring (13) in the objective (FIG. 4).
  • Phase contrast images of the cell without halos are then obtained. If you move L2 away from the diffuser, the gradient maximum in the pupil image moves outwards and the phase ring is no longer directly illuminated.
  • the microscopic image changes from the phase contrast image to a DIC-like image.
  • a particular advantage of the invention is that this transition can be set continuously. Illuminating the phase ring increases the contrast of very fine structures even without a diffuser when using thick objects.
  • the invention advantageously consists of the following components.
  • the light source 1 from the radiation of which the longer-wave infrared is filtered out with a heat protection filter (14) which is transparent to light and short-wave infrared.
  • the light passes through the gradient contrast device (15) and enters the microscope (16). Only the desired wavelength range in the near infrared is passed through the filter (17).
  • the image created in the microscope is from a infrared sensitive camera (18) captured and displayed on a monitor (19).
  • the quarter ring illumination can also be used in the reflected light illumination of microscopes. Here too, you can achieve a greater depth of penetration into thick objects than with conventional incident light.
  • the invention can be used in particular to reduce scattered light in fluorescence microscopy. Since no phase objects need to be displayed, a full ring can also be used for lighting. The light then falls in as a thin-walled hollow cone and only reaches the intensities necessary for effective fluorescence excitation in the focal plane. This makes fluorescent structures outside of the focal plane much less visible, similar to confocal microscopy.
  • the gradient contrast can also be combined with polarization microscopy. A combination of polarization and gradient contrast is then obtained in the image.
  • a modulator can also be inserted in the imaging beam path in the lens-side pupil plane, or in an image of this plane.
  • the advantage of doing this in an imaging plane is that the lens does not have to be modified.
  • the modulator (20) (a sector-coated glass plate) with a transmission of 10-20% is designed in such a way that it completely covers the quarter ring (21) of direct lighting (FIG. 6A).
  • 6B shows the arrangement of the spatial filter and modulator in the Fourier planes of the illumination and imaging beam path.
  • the modulator can also be temporarily installed at the location of the DIC slider.
  • the quarter ring diaphragm can be made of polarizing film to adjust the contrast (see above).
  • the modulator also provides contrast in orthogonal directions. With and without the use of a diffuser after the quarter-ring diaphragm, the limitation of the modulator can also be carried out blurry. It can be halo-like Side effects of sharp edges can be avoided. By using a diffuser and event. out of focus phase rings can also be reduced with classic phase contrast halo phenomena.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neuartiges Kontrastverfahren, um ungefärbte Phasenobjekte in dünnen und dicken Präparaten im Mikroskop sichtbar zu machen. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß mit geeigneten Blenden bestimmte räumliche Fourierkomponenten im Beleuchtungsstrahlengang ausgefiltert werden. Durch Einschalten eines Diffusors in die Fourierebene des Beleuchtungsstrahlengangs wird verhindert, daß bestimmte Fourierkomponenten völlig verschwinden. Dadurch werden die Nachteile der bisherigen Verfahren schiefer Beleuchtung vermieden und mit einfachen Mitteln ein hochwertiges Bild von Phasenobjekten erhalten.

Description

Kontrastvorrichtung für Mikroskopie
Zur Kontrasterzeugung bei Phasenobjekten wie z.B. Zellen werden in der Mikroskopie der Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) nach Nomarski, der Modulationskontrast nach Hoffmann (HMC) und die Schiefe Beleuchtung (SB) verwandt.
Der DIC arbeitet mit polarisiertem Licht und gibt bei Objekten ab einer bestimmten Dicke keine klaren Bilder mehr. Er hat auch andere Nachteile, beispielsweise ist er bei Zellen in Plastikkulturschalen nicht einsetzbar.
Der HMC gibt, wie der DIC, ab einer gewissen Präparatdicke keine guten Bilder. SB gibt überkontrastierte, objektunähnliche Bilder, auf denen bei hoher Vergrößerung keine Details mehr zu erkennen sind. Weiterhin ergeben alle drei Verfahren Kontrast nur in einer Bildrichtung, also nur oben/unten oder links/rechts.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen. Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
Im Mikroskopstrahlengang, also dem Gang der Lichtstrahlen durch das Mikroskop, gibt es immer mindestens 2 Fourierebenen. Sie sind dadurch gekennzeichnet, das sich in Ihnen die räumlichen Fourierkomponenten aus denen das Bild in der Bildebene entsteht, räumlich aufgelöst befinden und beeinflusst werden können. Dies geschieht z.B. bei der schiefen Beleuchtung, bei der selektiv bis auf einen kleinen seitlichen Rest in der Fourierebene alle Fourierkomponenten ausgeblendet werden. Diese seit langem bekannte Beleutungsart hat den Nachteil, daß das Bild durch das Herausfallen der meisten Fourierkomponenten sehr objektunähnlich wird. Die entscheidende Idee der Erfindung nach Anspruch 1 besteht nun darin, mehr Fourierkomponenten als bei der einseitig schiefen Beleuchtung zur Bildentstehung zuzulassen, und damit das Bild objektähnlicher zu machen. Dies kann nach einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung z.B. dadurch erreicht werden, daß man nicht eine einfache Loch- oder Sektorenblende benutzt sondern ein Viertelsringblende und dieser eventl. einen Diffusor nachschaltet. Man kann auch die Transmission der Blende selbst räumlich variabel gestalten, um so etwas wie eine gewichtete mehrseitig schiefe Beleuchtung zu erhalten. Bei Untersuchung dicker Objekte ist der Diffusor nicht unbedingt erforderlich, da dann das Objekt selbst als Diffusor wirkt.
Bei Ausfürung der Erfindung nach Anspruch 2 wird zusätzlich in einer Fourierebene des Abbildungsstrahlenganges ein Modulator angeordnet. Er schwächt die Fourierkomponenten des direkten Lichtes ab, und bewirkt so ebenfalls ein objektähnlicheres Bild. In der Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 3 wird in 2 im wesentlichen orthogonalen Raumrichtungen des Bildes Kontrast erzeugt. Der Modulator kann mit und ohne Einschaltung des Diffusors verwendet werden.
Der Kontrast der Bilder dickerer Phasenobjekten wird gegenüber den herkömmlichen Kontrastverfahren wesentlich verbessert. Hierzu reicht es aus eine Kontrastvorrichtung gemäß der Erfindung im Beleuchtungsstrahlengang einzusetzten, während andere Kontrastverfahren auch den Abbildungsstrahlengang beeinflussen müssen. Existierende Mikroskope können somit problemlos mit dem unten beschriebenen Gradientenkontrast nachgerüstet werden. Der Gradientenkontrast ist sowohl für dicke als auch dünne Phasenobjekte einsetzbar, die Stärke des Kontrastes kann reguliert werden. Bei Gebrauch herkömmlicher Phasenkon trastobjektive kann mit der Erfindung auch Phasenkontrast mit reduziertem Halo erzeugt werden. Es kann Auch eine variable Kombination aus Phasen- und Gradientenkontrast eingestellt werden. Der Gradientenkontrast entsteht im Gegensatz zu anderen Kontrastverfahren in zwei im wesentlichen orthogonalen Richtungen der Bildebene. Der Gradientenkontrast kann an vorteilhaft auch and verschiedenen Spezialmikroskopen wie Infrarot-, Polarisations- und Fluoreszensmikroskopen verwendet werden.
Die Erfindung wird klar werden anhand der folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Bezug auf die begleitenden Zeichnungen, in welchen
- Fig. 1 eine schematische Ansicht des Strahlenganges einer Ausführungsform der Erfindung:
- Fig. 2 eine bevorzugte Ausführungsform eines Raumfilters für eine Vorrichtung gemäß der Erfindung;
- Fig. 3 eine schematische Ansicht des Strahlenganges in Objektnähe einer Ausführungsform der Erfindung;
- Fig. 4 das Pupillenbild eines Phasenkontrastobjektivs im Mikroskop bei Verwendung einer Ausführungsform der Erfindung;
- Fig. 5 A das Pupillenbild bei Verwendung einer Ausführungsform mit Modulator; Fig. 5 B relative Lage von Raumfilter und Modulator im Strahlengang - Fig. 6 den schematischen Aufbau einer Ausführungsform der Erfindung in Kombination mit einem Infrarotmikroskop zeigt;
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Vorrichtung zur Beleuchtung dicker Objekte (Gradientenkontrast)
Der Kontrast wird bei Phasenobjekten mit der vorliegenden Erfindung durch einen Raumfilter erzeugt, der in der Fourierebene einen Beleuchtungsgradienten generiert. Dies wird dadurch erreicht, daß die hintere Fokalebene des Kondensors durch ein geeignetes Linsensytem an zugängliche Stelle vor der Lichtquelle abgebildet wird. Wie Fig.l zeigt, werden zwischen den Mikroskopkörper (1) und die Halogenlampe (2) zwei Linsen Ll und L2 der Brennweite f 1 mit dem Abstand 2X fl gesetzt. Hierbei wird die Leuchtwendel (3) der Lampe (2) von Unendlich nach Unendlich abgebildet. Am Punkt f 1 zwischen den beiden Linsen ist nun die hintere Fokalebene = Fourierebene (4) des Kondensors (nicht gezeigt) abgebildet. Ebenfalls in diese Ebene wird die Leuchtwendel der Lampe abgebildet. Der Kontrast wird nun durch einen geeigneten Raumfilter = Blende (5) , der an dieser Stelle zentrierbar an gebracht ist, erzeugt.
Fig. 2 zeigt eine Ausführung des Filters, wie er für die Beobachtung von Hirnschnitten verwendet wird. Er ist im wesentlichen eine Kombination aus Zentralblende (6) und 90 Grad Sektorenblende (7). Die Breite des wirksamen Viertelsringes (8), der noch zur Beleuchtung in der Apertur des Objektives wirksam ist, beträgt vorteilhaft 1/2 - 1/10 des Radius der Objektivpupille des Mikroskops. Mit schmäler werdendem Beleuchtungsring steigt der Kontrast des Bildes. Es können auch freie Sektoren bis zu 180 Grad verwendet werden. 90 Grad Sektoren geben maximalen Kontrast in den beiden orthogonalen Raumrichtungen.
Wie Fig. 3 zeigt, wird der gesteigerte Kontrast dadurch erklärt, daß das Objekt wie beispielsweise Hirnschnitte nicht mehr mit einem vollen Lichtkonus (9) beleuchtet wird, sondern nur noch mit einem gekrümmten, spitz zulaufendem Lichtschwert (10). Hierdurch entsteht im Hirnschnitt über und unter dem Fokus viel weniger Streulicht, als bei der üblichen Vollkonusbeleuchtung: Man kann tiefer in den Hirnschnitt hineinsehen. Die schiefe Beleuchtung sorgt dabei für eine Darstellung der Phasenobjekte, das Bild ähnelt DIC Aufnahmen.
Der entscheidende Punkt, warum die schiefe Beleuchtung hier hervorragende Bilder liefert, ist neben der Kombination von Zentral- und Sektorenblende vor allem die Tatsache, daß der dicke Hirnschnitt als Diffusor wirkt. Bei Betrachtung der Pupillenebene des Objektivs sieht man deshalb, bei eingelegtem Hirnschnitt, keinen scharfen Viertelsring, sondern einen verschwommenen Beleuchtungsgradienten, der an der Stelle des Viertelsrings noch sein Maximum hat. Keine Stelle der Fourierebene ist völlig dunkel, sodaß alle Fourierkomponenten zur Bildentstehung beitragen. Man könnte von einer gewichteten rundumschiefen Beleuchtung sprechen. Überkontrastierung wird vermieden und feinste Details sind noch erkennbar. Die Blende ist so bemessen, daß auch noch der Teil des Quadranten in der Kondensorapertur, der nicht mehr in die Objektivpupille abgebildet wird, beleuchtet wird. Da als Kondensor ein Immersionskondensor höherer Apertur als das Objektiv dient, kommen auch noch kontrastverstärkende und auflösungserhöhende Effekte der Dunkelfeldmikroskopie zum Tragen.
Der Raumfilter für den Gradientenkontrast kann auch direkt in der hinteren Fokalebene des Kondensors oder in anderen dazu konjugierten Ebenen angebracht werden.
Gradientenkontrast für die Beleuchtung dünner Objekte
Das beschriebene Kontrastverfahren führt bei Anwendung an dünnen Objekten zu starker Überstrahlung und zu starkem Kontrast. Die entscheidende Modifikation ist hier nun die Einführung eines Diffusors (11) hinter der Viertelsringblende, etwa in Höhe der Fourierebene (Fig. l). Man erreicht damit die Wirkung des als Diffusor wirkenden Hirnschnitts, ohne einen Hirnschnitt in der Objektebene haben zu müssen. Bei Betrachtung der Objektivpupille sieht man wieder einen diffusen Beleuchtungsgradienten.
Die Verteilung dieses Beleuchtungsgradienten kann nun auf verschiedenste Weise reguliert werden: Einmal durch Variation des Abstandes Viertelsringblende - Diffusor. Auch durch Verschieben der Linse L2 gegen den Diffusor kann der Ausschnitt und damit die Steilheit des abgebildten Beleuchtungsgradienten bequem geändert werden. Weiterhin läßt sich der Beleuchtungsgradient durch Einklappen oder Verschieben verschiedener Ringblenden oder durch Wechsel verschieden starker Diffusoren verändern. Eine andere Möglichkeit zur Variation des Gradienten ist es, die Blende aus Polarisationsfolie herzustellen, und vor diese einen drehbaren Polarisator zu setzen. Dadurch erhält man eine Blende einstellbarer Transmission, was man natürlich auch durch Neutralfilterfolien verschiedener Transmission als Blendenmaterial erreichen kann.
Schließlich kann man den Gradienten auch ohne Diffusor'' durch Aufdampfen verlaufender Reflektions- oder Absorptionsschichten auf Glasplättchen erzeugen, wobei die Transmission an jedem Punkt des Glasplättchens die Wirkung der oben beschriebenen Kombination von Ringblende und Diffusor immitieren muß. Letztlich kann dieser Gradient auch durch Flüssigkristallbausteine (LC-SLM) realisiert werden. Dies hat den Vorteil, daß der Gradient beliebig per Rechner eingestellt werden kann. Hiermit wären auch mehrere konzentrische Ringe realisierbar, die in Verbindung mit phasenverschiebenden Komponenten zu Überauflösungen führen sollen (Toraldo- Aperturen).
Statt eines Viertelsringes können auch Ringe bis zu 180 Grad verwendet werden.
Phasenkontrast ohne Haloerscheinungen mit dem Gradientenkontrast
D ie erfi n d u n g s ge m äß e V orri ch tu n g kan n i n Ko mb i n ati o n mi t Phasenkontrastobjektiven verwendet werden. Bei Verwendung der üblichen Phasenkontrastobjektive ist es möglich, mit der Erfindung auch Phasenkontrast ohne die üblichen Halos zu erzeugen. Hierzu wird entweder der Diffusor oder bevorzugt die Linse L2 so verschoben (Fig. 1), daß der deutlich hellere Teil des Gradienten (12) den Phasenring (13) im Objektiv mit einschließt (Fig. 4). Man erhält dann Phasenkontrastbilder der Zelle ohne Halos. Verschiebt man nun L2 vom Diffusor weg, so wandert das Gradientenmaximum im Pupillenbild nach Außen und der Phasenring wird nicht mehr direkt beleuchtet. Das mikroskopische Bild wandelt sich vom Phasenkon trastbild in ein DIC-artiges Bild. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, daß dieser Übergang kontinuierlich eingestellt werden kann. Mitbeleuchtung des Phasenrings erhöht auch ohne Diffusor, bei Verwendung von dicken Objekten, den Kontrast sehr feiner Strukturen.
Infrarotmikroskopie mit dem Gradientenkontrast
Wird Strahlung des nahen Infrarotbereichs statt sichtbarem Licht zur Beleuchtung des Präparats verwendet, so kann man bei Verwendung einer infrarotempfindlichen Videokamera tiefer in dicke Objekte hineinsehen. Der Grund ist, daß Infrarotstrahlung weniger gestreut wird als sichtbares Licht. Der durch die Erfindung erzeugte Gradientenkontrast kann vorteilhaft wie bei sichtbarem Licht zur Kontrasterzeugung bei Phasenobjekten eingesetzt werden. Es kann insbesondere auch Strahlung mit einer Wellenlänge über 800 nm verwendet werden. Bei diesen Wellenlängen kann der DIC mit den üblichen Folienpolarisatoren nicht mehr benutzt werden, da die Polarisationsfolien oberhalb von 800 nm ihre polarisierende Wirkung verlieren, wie Fig. 5 zeigt, besteht die Erfindung vorteilhaft aus folgenden Komponenten. Der Lichtquelle 1, aus deren Strahlung das längerwellige Infrarot mit einem, für Licht und kurzwelliges infrarotdurchlässigen, Hitzeschutzfilter (14) herausgefiltert wird. Das Licht durchläuft, wie beschrieben die Gradientenkontrastvorrichtung (15) und tritt ins Mikroskop (16) ein. Nur der gewünschte Wellenlängenbereich im nahen Infrarot wird durch den Filter (17) durchgelassen. Das im Mikroskop entstehende Bild wird von einer infrarotempfindlichen Kamera (18) aufgefangen und auf einem Monitor (19) dargestellt.
Verwendung des Gradientenkontrastes in der Auflicht- und Fluoreszensmikroskopie
Die Viertelsringbeleuchtung kann auch in der Auflichtbeleuchtung von Mikroskopen verwendet werden. Auch hier erreicht man mit Ihr eine größere Eindringtiefe in dicke Objekte als mit herkömmlicher Auflichtbeleuchtung. Insbesondere in der Fluoreszensmikroskopie kann die Erfindung zur Reduktion von Streulicht verwendet werden. Da keine Phasenobjekte dargestellt werden müssen, kann auch ein Vollring zur Beleuchtung verwendet werden. Das Licht fällt dann als dünnwandiger Hohlkegel ein und erreicht nur in der Fokusebene, die für effektive Fluoreszensanregung notwendigen Intensitäten. Hiermit werden fluoreszierende Strukturen außerhalb der Fokusebene ähnlich wie bei der konfokalen Mikroskopie wesentlich weniger sichtbar.
Verwendung des Gradientenkontrastes in der Polarisationsmikroskopie
Im Gegensatz zum DIC kann der Gradientenkkontrast auch mit Polarisations¬ mikroskopie kombiniert werden. Man erhält dann eine Kombination von Polarisations- und Gradientenkontrast im Bild.
Gradientenkontrast mit zusätzlichem Modulator im Abbildungsstrahlengang
Um die ungleiche Ausleuchtung des Gradientenkontrastes bei seiner Ausführung ohne Diffusor zu verbessern, kann man auch im Abbildungsstrahlengang in der objektivseitigen Pupillenebene, oder in einer einer Abbildung dieser Ebene, einen Modulator einfügen. Wenn man dies in einer Abbildungsebene tut, hat es den Vorteil, daß das Objektiv nicht modifiziert werden muß. Der Modulator (20) (ein sektorenbedampftes Glasplättchen) mit einer Transmission um 10 - 20% ist so gestaltet, daß er den Viertelsring (21) der direkten Beleuchtung vollständig überdeckt (Fig. 6A). Fig. 6B zeigt die Anordnung von Raumfilter und Modulator in den Fourierebenen von Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang. Der Modulator kann behelfsmäßig auch an der Stelle der DIC-Schieber eingebracht werden. Die Viertelsringblende kann zur Einstellung des Kontrastes aus Polarisationsfolie ausgeführt werden (s.o.). Man erhält auch mit dem Modulator Kontrast in orthogonale Richtungen. Mit und ohne Verwendung eines Diffusors nach der Viertelsringblende kann auch die Begrenzung des Modulators verschwommen ausgeführt werden. Damit können haloartige Nebeneffekte der scharfen Kannten vermieden werden. Durch Verwendung eines Diffusors und event. unscharf begrenzter Phasenringe können auch beim klassischen Phasenkontrast Haloerscheinungen verringert werden.
Stereomikroskopie mit dem Gradientenkontrast
Es ist möglich mit dem Gradientenkontrast stereoskopische Bilder zu erzeugen, wenn man zwei unabhängige Strahlenverläufe im Mikroskop schafft. Hierzu kann man z.B. bei einer Sektorenblende mit 2 einandergegenüberliegenden viertelsringförmigen Aussparungen diese Aussparungen mit Farbfiltern oder orthogonalen Polarisatoren belegen. Wenn man nun z.B. in die Okularmuschel auch solche Polarisatoren oder Farbfilter legt, erhält man stereoskopische Bilder.

Claims

OPatentansprüche:
1. Kontrastvorrichtung für Mikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß
- Sie in oder mindestens nahe einer Fourierebene des Mikroskopstrahlengangs angeordnet ist;
- sie den Kontrast durch eine besondere Form der schiefen Beleuchtung, z.B. einen Beleuchtungsgradienten, erzeugt.
2. Kontrastvorrichtung für Mikroskopie, gekennzeichnet durch
- eine Einrichtung zur Sektorenausblendung (20) in einer ersten beleuchtungsseitigen Fourierebene des Mikroskopstrahlenganges, und
-eine Einrichtung zur Modulation (21) der Lichtintensität in einer zweiten abbildungsseitgen Fourierebene des Mikroskopstrahlenganges.
3. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Kontrast gleichzeitig in 2 Richtungen der Bildebene erzeugt.
4. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen, gekennzeichnet durch einen Raumfilter (5) vorzugsweise in Form einer Sektorenblende.
5. Vorrichtung nach vorausgegangenen Ansprüchen gekennzeichnet durch einen Diffusor (11).
6. Vorrichtung nach vorangegangenen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast variabel ist, vorzugsweise durch Verschiebbarkeit des Diffusors (11) oder der Linse L2 entlang des Strahlenganges.
7. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast durch variabel einstellbare Transmission des Raumfilters (5) regulierbar ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie so einstellbar ist, daß sie in Kombination mit Phasenkontrastobjektiven phasenkontrastartige Bilder mit reduziertem Halo erzeugt.
9. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontrast des Bildes zwischen Phasenkontrast und Gradientenkontrast variabel einstellbar ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Infrarotlicht beteibbar ist, wobei zur Bildaufnahme eine infrarotempfindliche Kamera vorgesehen ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in oder mindestens nahe der Fourierebene des Auflichtstrahlenganges angeordnet ist, wobei das Objekt durch einen Voll- oder Teilhohlkegel beleuchtet ist und dadurch zum fluoreszieren gebracht werden kann. wird.
12. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Mikroskopstrahlengang eines Polaristionsmikroskops angeordnet ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sektorenblende zwei gegenüberliegende teilringförmige Asusparungen enthält, und durch geeignete Beeinflussung der Teilstrahlengänge z.B. durch Polarisatoren Stereomikroskopie betrieben werden kann.
PCT/DE1995/000533 1994-04-20 1995-04-18 Kontrastvorrichtung für mikroskopie WO1995029420A1 (de)

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JP7527280A JPH09501780A (ja) 1994-04-20 1995-04-18 顕微鏡に用いられるコントラスト装置
EP95915797A EP0705451A1 (de) 1994-04-20 1995-04-18 Kontrastvorrichtung für mikroskopie

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Application Number Priority Date Filing Date Title
DEG9406545.4U 1994-04-20
DE9406545U DE9406545U1 (de) 1994-04-20 1994-04-20 Kontrastvorrichtung für Mikroskopie

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WO1995029420A1 true WO1995029420A1 (de) 1995-11-02

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JP (1) JPH09501780A (de)
DE (2) DE9406545U1 (de)
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