DE19960583A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Mikroskopie - Google Patents

Abstract

Zur dreidimensionalen optischen Abbildung einer Probe (140) erfolgen eine gleichmäßige Beleuchtung der gesamten Probe (140) und Aufnahme eines konventionellen ersten Teilbildes, eine lateral strukturierte Beleuchtung der Probe (140) in einer Fokalebene, bei der die Beleuchtung der einzelnen Punkte der Fokalebene nach vorbestimmten zeitlichen Sequenzen variiert wird, und Aufnahme eines zweiten Teilbildes durch Erfassung des von den in der Konfokalebene jeweils nicht beleuchteten Objektpunkten emittierten Lichtes und eine Ermittlung eines dreidimensional räumlich aufgelösten Bildes der Probe (140) aus den ersten und zweiten Teilbildern. Es werden auch optische Abbildungssysteme zur Durchführung dieses Abbildungsverfahrens beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskopieverfahren zur Erzeu­ gung dreidimensional räumlich aufgelöster optischer Abbil­ dungen einer Probe, insbesondere ein Mikroskopieverfahren unter Verwendung eines Mikroskops mit einem lateralen Be­ leuchtungsmodulator. Die Erfindung betrifft ferner optische Abbildungssysteme zur Gewinnung dreidimensional räumlich aufgelöster Abbildungen einer Probe.

Bisher bekannte Verfahren zur dreidimensional auflösenden Abbildung einer Probe basieren auf dem Prinzip der Konfo­ kalmikroskopie. Bei diesen Verfahren wird die Probe punkt­ weise beleuchtet und das aus den jeweils beleuchteten Pro­ benpunkten emittierte Licht detektiert. Es kann im wesent­ lichen zwischen zwei Klassen von Konfokalmikroskopen unter­ schieden werden.

Zum einen gibt es Mikroskope, die strikt konfokal arbeiten. Dabei werden ein oder mehrere wohl getrennte Punkte in der Probe beleuchtet. Die Detektion erfolgt über eine oder meh­ rere Aperturen, die sich in zu den beleuchteten Probenpunk­ ten konjugierten Bildpunkten befinden. Die zu beleuchtenden Punkte in der Probe sind so weit voneinander entfernt zu wählen, daß durch jede Detektionsapertur nur Licht aus dem dazu konjugierten Probenpunkt durchtritt. Dadurch ergibt sich, daß das Signal im Wesentlichen aus den Probenpunkten in der Fokalebene ensteht. Zur Aufnahme eines Gesamtbildes wird die Probe mit der punktförmigen Beleuchtung und Detek­ tion abgetastet. Die Zuordnung von beleuchtetem Punkt zu Detektionsapertur erfolgt ausschließlich aus der Korrelation der räumlichen Anordnung. Als Abtastsysteme finden hierbei rotierende Aperturscheiben (sog. Nipkow-Scheiben), mechanisch bewegte Spiegel oder Mikrospiegelanordnungen (Patent US 5,923,466) Anwendung. Daß die zu beleuchtenden Punkte weit voneinander entfernt sind, führt dazu, daß die Lichtausbeute gering ist. So erreichen nur ca. 2-3% des An­ regungslichtes die Probe und zudem ist die Datenaqui­ sitionsrate durch die Notwendigkeit des Abrasterns und der nur gering möglichen Parallelisierung limitiert.

Die Entwicklung einer zweiten Klasse von Konfokalmikrosko­ pen, die die strikte räumliche Trennung der einzelnen be­ leuchteten Probenpunkte aufgeben, wie sie von R. Jukaitis et al. in "Nature" (Band 383, 1996, Seite 804 ff), T. Wilson et al. in "Optics Letters" (Band 21, 1996, Seite 1879 ff), in der Patentanmeldung WO 97/31282 und in dem EP 0 911 667 A1 beschrieben werden, ermöglichte eine Erhöhung der Lichtausbeute. Bei diesen Mikroskopen werden die einzelnen Bildpunkte nicht mehr nur räumlich unter­ schieden, sondern die zeitliche Abfolge, mit der die opti­ schen Eigenschaften der lokalen Beleuchtung variieren, wird verwendet, die Zuordnung zwischen beleuchtetem Punkt und Detektionsapertur vorzunehmen. Dadurch ist es möglich, von jedem Punkt während 50% der Meßzeit Signale aufzuzeichnen. Idealerweise wird hierzu die Beleuchtung jeden Punktes mit einer anderen zeitlichen Abfolge derart moduliert, daß kei­ ne Korrelation mit den zeitlichen Abfolgen der Beleuchtung aller anderen Punkte auftritt. Hierzu ist es notwendig für jeden Punkt unabhängige Zufallsfolgen zu wählen. Alternativ können zur Modulation der zeitlichen Abfolgen Sätze von endlich langen Folgen mit verschwindender Korrelation, wie z. B. komplementäre Golay Sequenzen oder Hadamard-Sequenzen vom S-Matrix-Typ, die aus maximal so vielen Elementen be­ stehen, wie die Sequenzen lang sind, ausgewählt werden. Häufig genügt es, da das Übersprechen zwischen zwei Punkten mit der Entfernung abnimmt, mit kurzen Sequenzen nur die Korrelation zwischen nahe beieinander liegenden Punkten aufzuheben. Da diese Sequenzen auch negative Werte enthal­ ten, die rein optisch in einer Transmissionsmaske nicht um­ setzbar sind, muß der Sequenz ein Gleichanteil hinzugefügt werden. Dies führt dazu, daß das gemessene optische Bild die Überlagerung eines konfokalen mit einem konventionellen Bild ist.

Ein bei dieser Klasse von Konfokalmikroskopen auftretender Nachteil ist der durch die Überlagerung von konfokalem und konventionellem Signal erforderliche Kontrastumfang des De­ tektors. Bei vergleichbarem Signalanteil von konfokalem und konventionellem Bild muß der Detektor im Vergleich zum ge­ wünschten konfokalem Signal das Doppelte an Gesamtsignal verarbeiten können.

Nachteil beider Klassen der Konfokalmikroskope ist, daß sich die Beleuchtungs- und Detektions-Strahlengänge für die jeweils betrachteten Bildpunkte überlagern und sie daher aufwendig, z. B. im Falle der Fluoreszenzmessung mit dichroitischen Strahlteilern, getrennt werden müssen. Diese Trennung führt im Falle von Fluoreszenzmessungen zu einer erheblichen Verringerung der zu detektierenden von der Pro­ be emittierten Fluoreszenzstrahlung und zudem sind für un­ terschiedliche Fluoreszenzanwendungen unterschiedliche dichroitische Strahlteiler notwendig. Die bei der Durchfüh­ rung von elastischen Streumessungen und Reflexionsmessun­ gen notwendigen Strahlteiler verringern die Intensität so­ wohl des eingestrahlten als auch des emittierten Lichtes um typischerweise 50%.

Ein weiterer Nachteil der Konfokalmikroskope ist die Detek­ tion des konfokalen Signals nur aus einer Teilmenge aller Bildpunkte. Bei konfokal arbeitenden Mikroskopen werden nur aus etwa 2% (oder sogar weit darunter) bis maximal 50% der Fläche der Fokalebene gleichzeitig Signale aufgezeich­ net. Dadurch ist die gemessene Intensität im Vergleich zur zeitlich gemittelten Intensität bis zu einem Faktor von 50 (oder darüber) größer. Um mit diesen Verfahren eine hohe Datenaquisitionsrate zu erzielen, muß generell mit einer sehr hohen lokalen Anregungsintensität gearbeitet werden. Allerdings gewinnen hierbei nichtlineare Prozesse wie die Anreicherung der Farbstoffmoleküle in Triplettzuständen an Bedeutung, die einen negativen Einfluß auf die Signalinten­ sität haben.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfah­ ren zur dreidimensionalen räumlich auflösenden Mikroskopie und Mikroskope zur Implementierung dieses Verfahrens anzu­ geben, mit denen sowohl eine hohe Lichtausbeute als auch eine hohe Datenaquisitionsrate ohne die vorgenannten Nach­ teile erzielt werden können.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 und durch die Vorrichtungen mit den Merk­ malen gemäß den Ansprüchen 9, 14 bzw. 17 gelöst. Vorteil­ hafte Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung er­ geben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten Gesichtspunktes der Erfindung wird ein optisches Abbildungsverfahren beschrieben, bei dem zunächst ein konventionelles erstes Teilbild einer Probe aufgezeich­ net wird. Unter einem konventionellen Bild wird hier die lichtmikroskopische Abbildung des gesamten betrachteten Probenbereiches verstanden. Das erste Teilbild enthält ne­ ben Signalanteilen aus der Fokalebene auch Störsignale, die sich daraus ergeben, daß Licht, welches außerhalb der Fokalebene emittiert oder gestreut wird, oder Licht nach mehrfacher Streuung inner- und außerhalb der Fokalebene den Detektor erreicht. Die Fokalebene ist die Bildebene, auf die das Mikroskop zur Probenabbildung fokussiert ist. Des weiteren wird an der Probe ein zweites Teilbild aufgenom­ men, welches nur die unerwünschten Störanteile enthält. Da­ zu wird die Probe mit lateral strukturierter Beleuchtung beleuchtet und vollständig abgetastet. Dabei wird jeweils nur aus gerade nicht beleuchteten Probenpunkten das opti­ sche Signal aufgezeichnet. Das gewünschte dreidimensional räumlich aufgelöste Bild wird schließlich durch Kompensati­ on der Störanteile im ersten Teilbild mit Hilfe des zweiten Teilbildes erhalten. Das dreidimensionale räumliche aufge­ löste Bild besitzt eine Ortsauflösung in der Bildebene und senkrecht dazu.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstel­ lung eines optischen Abbildungssystems mit mindestens einer Lichtquelle zur Probenbeleuchtung, einer Vorrichtung zur Aufzeichnung eines ersten konventionellen Teilbildes der Probe, einem lateralen Beleuchtungsmodulator zur struktu­ rierten Beleuchtung der Probe in der Fokalebene und einer Einrichtung zur Übertragung von Licht aus nicht­ beleuchteten Probenbereichen zu einer Detektoreinrichtung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Beleuchtungsmodulator durch einen DMD (Digital Mirror Device) oder einen LCD (Liquid Crystal Device) gebildet, die zur strukturierten Beleuchtung der Probe in der Fokale­ bene entsprechend einem vorbestimmten Zeitmuster angesteu­ ert werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form der Erfindung erfolgt die strukturierte Beleuchtung durch eine teilweise reflektierende oder transmittierende Maske, die z. B. durch Rotation oder Translation bewegt wird. Für die Strukturierung der Maske bzw. für das zur An­ steuerung des Beleuchtungsmodulators verwendete Verfahren kann auf Muster zugegriffen werden, wie sie aus der internationalen Anmeldung WO 97/31282 oder der europäischen An­ meldung EP 0 911 667 A1 bekannt sind.

Gemäß weiterer Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Ab­ bildungssysteme werden die Beleuchtungsmodulatoren in Ab­ hängigkeit von der Probe in Reflexion oder Transmission eingesetzt, arbeiten die Abbildungssysteme in Reflexions- oder Transmissionsgeometrie und sind ein oder zwei Licht­ quellen mit jeweils angepaßten Beleuchtungsoptiken vorgese­ hen.

Die Erfindung besitzt folgende Vorteile. Der Aufbau des Mi­ kroskops wird vereinfacht. Bei Aufnahme des zweiten Teil­ bildes mittels strukturierter Beleuchtung kann auf verlust­ behaftete und anwendungsspezifische dichroitische Strahl­ teiler verzichtet werden, da sich die Beleuchtungs- und De­ tektionsstrahlengänge nicht überlagern. Zur Aufnahme des konventionellen ersten Teilbildes kann ein 50%-Strahlteiler eingesetzt werden, der nahezu unabhängig von der Wellenlän­ ge etwa 50% des einfallenden Lichtes reflektiert und etwa 50% transmittiert. Damit ist bei den bevorzugten Ausführun­ gen der strukturierten Beleuchtung, bei denen jeder Bild­ punkt zu 50% der Belichtungszeit beleuchtet wird und wäh­ rend der anderen 50% der Zeit davon Licht detektiert wird, die Beleuchtungs- und Abbildungseffizienz für beide Teil­ bilder gleich.

Ein weiterer Vorteil gegenüber der zweiten Klasse von Kon­ fokalmikroskopen ergibt sich daraus, daß an den Kontrastum­ fang des Detektors geringere Anforderungen als bei den her­ kömmlichen Techniken gestellt werden können, denn im Gegen­ satz dazu bestehen die zwei aufzuzeichnenden Teilbilder entweder aus einem konventionellen Bild oder aus den in diesem Bild enthaltenen Hintergrundanteilen. Die Skalierung des Signals auf dem Detektor kann sich somit an der Intensität des konventionellen Bildes orientieren und muß nicht weitere dazu addierte Signalanteile berücksichtigen.

Ein weiterer Vorteil ergibt sich daraus, daß Signale aus Probenbereichen aufgezeichnet werden, die nicht mit der maximalen Intensität bestrahlt werden. Nichtlineare Effek­ te, wie z. B. die Anreicherung in Triplettzuständen, die bei Farbstoffen unter hoher Anregungsintensität vermehrt auf­ treten, und so das Fluoreszenzsignal verringern, werden vermieden. Somit sind auch geringere Anforderungen an die photophysikalischen Eigenschaften der Farbstoffe zu stel­ len.

Desweiteren wird zu jedem dreidimensional räumlich aufgelö­ sten Bild ein konventionelles Bild der Probe aufgezeichnet. Damit können verbesserte Rekonstruktionsverfahren, die auf mehreren Bildern der gleichen Probe basieren, wie sie z. B. von P. J. Verveer und T. M. Jovin in "Applied Optics" (Band 37, Seiten 6240-6246, 1998) beschrieben werden, an­ gewendet werden.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindungen werden im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be­ schrieben. Es zeigen:

Fig. 1: eine schematische Darstellung des Lichtweges in einem optischen Abbildungssystem gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung mit zwei Lichtquellen,

Fig. 2: eine schematische Darstellung des Lichtweges in einem optischen Abbildungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit einer Lichtquelle,

Fig. 3: eine schematische Darstellung des Lichtweges in einem optischen Abbildungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit einer rotierenden Maske,

Fig. 4: eine schematische Darstellung des Lichtweges in einem optischen Abbildungssystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung in einer Transmissionsgeometrie.

Die erfindungsgemäße Abbildungstechnik kann mit Beleuch­ tungsmodulatoren implementiert werden, die als Durchlicht­ modulatoren (z. B. programmierbare Aperturmasken auf der Basis von Flüssigkristallen (LCD) oder mikromechanischen Schaltern), als Reflektionsmodulatoren (z. B. DMD) oder Mischformen davon (z. B. teilreflektierende und -transmit­ tierende Scheiben) ausgeführt sind.

Im folgenden wird in unterschiedlichen Aufbauten auf die Verwendung unterschiedlicher Modulatoren Bezug genommen. Die erläuterten Prinzipien der Erfindung können jedoch in entsprechender Weise auch mit anderen Modulatoren reali­ siert werden.

Das erfindungsgemäße Abbildungssystem 100 in Fig. 1 umfaßt eine erste Lichtquelle 110, einen Beleuchtungsmodulator 120 mit einer Vielzahl von Beleuchtungselementen 121, eine Ab­ bildungsoptik 130, eine Detektoreinrichtung 150 und eine zweite Lichtquelle 160. Das Bezugszeichen 140 verweist auf eine Probe, die mit dem Abbildungssystem 100 abgebildet werden soll.

Als Lichtquellen 110 und 160 sind z. B. gefilterte Weiß­ lichtlampen oder Laserlichtquellen einzusetzen, wobei beide Lichtquellen vorzugsweise die jeweils gleiche Bauart besitzen, um beispielsweise in der Probe 140 eine bestimmte Fluoreszenz anzuregen. Von der ersten Lichtquelle 110 wird über eine Feldlinse 111, den Beleuchtungseinkoppler 113 und die Abbildungsoptik 132 ein erster Beleuchtungslichtweg zur gleichmäßigen Beleuchtung der Probe 140 gebildet. Von der zweiten Lichtquelle 160 wird über eine weitere Feldlinse 161, den Beleuchtungsmodulator 120 und die Abbildungsoptik 130 ein zweiter Beleuchtungslichtweg zur Probenbeleuchtung mit lateral variierender Intensität in der Fokalebene ge­ bildet.

Der hier dargestellte Beleuchtungsmodulator 120 ist ein DMD. Der DMD 120 beinhaltet eine Matrixanordnung aus ein­ zelnen, unabhängig voneinander zwischen zwei stabilen Posi­ tionen verkippbaren Spiegeln, die die Modulatorelemente bilden und von denen aus Übersichtlichkeitsgründen nur zwei Spiegel 121 jeweils in einer der Schwenkpositionen darge­ stellt sind (121a und 121b). Die Auslenkung aus der DMD- Fläche hängt von der konkreten Bauart des eingesetzten DMDs ab und kann beispielsweise ±10° mit typischen Spiegeldimen­ sionen von rund 16 µm betragen. Der Aufbau und die Steuer­ technik von DMDs sind an sich aus dem Stand der Technik be­ kannt, so daß sie hier nicht weiter erläutert werden.

Die Abbildungsoptik 130 umfaßt eine erste Feldlinse 131 und ein Objektiv 132. Die Detektoreinrichtung 150 umfaßt eine Abbildungsoptik 151, einen Filter 152 und eine Detektor­ kamera 153. Mit der Detektorkamera 153 wird wahlweise Licht aus allen Probenbereichen oder nur aus den unbeleuchteten Punkten der Fokalebene aufgenommen. Die Abbildungsoptik 151 kann sowohl mit Linsen als auch mit Spiegeln wie zum Bei­ spiel einem Offner-Triplett entsprechend dem Patent US 3,748,015 oder einer Kombination aus refraktiven und reflektiven Elementen aufgebaut sein. Aufgrund der Abbil­ dungseigenschaften des Offner-Tripletts ist es beispiels­ weise für den Einsatz mit einem DMD sehr gut geeignet.

Das Abbildungssystem 130 ist so angeordnet, daß der Be­ leuchtungsmodulator 120 bei Mikroskopieanwendungen verklei­ nert reell in die Probe 140 abgebildet wird. Die beiden Schwenkpositionen 121a und 121b der Spiegel 121 können nach ihrer Funktion zur Beleuchtung bzw. Detektion unter­ schieden werden. In der Stellung 121a der Spiegel 121 (siehe unteres Teilbild in Fig. 1) leiten diese Licht von der Lampe 110 mit der Abbildungsoptik 130 auf die Probe 140 (Beleuchtung). Im Gegensatz dazu sind die Beleuchtungsmodu­ latoren in Stellung 121b so ausgerichtet, daß Licht von der Probe 140 zur Detektoreinrichtung 150 reflektiert wird (De­ tektion).

In dieser Abbildung wird das Licht von der ersten Licht­ quelle 110 über die Feldlinse 111, den Beleuchtungseinkopp­ ler 113 und die Abbildungsoptik 132 auf die Probe 140 ge­ richtet. Der Beleuchtungseinkoppler ist hier ein Prismen­ strahlteiler oder ein teildurchlässiger Spiegel mit einer Durchlässigkeit von beispielsweise 50%. Um diesen Lichtweg zeitweise abzuschirmen, kann ein Shutter 112 eingebaut wer­ den oder der Beleuchtungseinkoppler 113 wird schalt- oder schwenkbar ausgeführt.

Die räumlich dreidimensionale aufgelöste Bildaufnahme mit einem optischen Abbildungssystem 100 gemäß der Abb. 1 erfolgt durch wechselweise Probenabbildung mit den folgen­ den Einstellungen:

In einem ersten Abbildungsmodus wird entweder mit dem Shut­ ter 112 oder dem schaltbaren Beleuchtungseinkoppler 113 die Beleuchtung mit der ersten Lichtquelle 110 freigegeben, so daß die gesamte Probe über den Beleuchtungseinkoppler 113 beleuchtet wird. Gleichzeitig werden alle Spiegel 121 des DMDs 120 in die Detektions-Stellung 121b geschwenkt, so daß kein Licht von der Lichtquelle 160 auf die Probe 140 ge­ langt und die Abbildung der gesamten Probe auf die Detek­ toreinrichtung 150 gegeben ist (Erfassung des ersten, kon­ ventionellen Teilbildes).

In einem zweiten Abbildungsmodus wird der Lichtweg von der ersten Lichtquelle 110 zur Probe 140 durch den Shutter 112 oder den schaltbaren Spiegel 113 abgeblockt. Die Probe 140 wird nun über die in Beleuchtungs-Stellung 121a geschwenk­ ten Spiegel 121 des DMDs 120 mit der Lichtquelle 160 be­ leuchtet. Welche Spiegel 121 des DMDs 120 in zeitlicher Reihenfolge in die Beleuchtungsposition geschwenkt werden und welche Punkte in der Fokalebene der Probe 140 beleuch­ tet werden, hängt vom jeweiligen Modulationsmuster ab. Das Modulationsmuster bestimmt, mit welcher zeitabhängigen Be­ leuchtungssequenz bzw. welchem zeitabhängigen Aperturmuster die Fokalebene der Probe 140 beleuchtet wird. Das Modu­ lationsmuster kann beispielsweise auf einer sogenannten Pseudo-Zufallssequenz mit endlicher Länge, einer Hadamard- Sequenz vom S-Matrix-Typ oder einer Zufallssquenz basieren. Es können insbesondere sämtliche Sequenzen implementiert werden, die in EP 0 911 667 A1 und WO 97/31282 beschrieben sind.

Während dieser zweiten Phase der Probenabbildung wird die Probe 140 durch die Abbildung der Mikrospiegel 121 in die Fokalebene mit zeitabhängigen Modulationsmustern beleuch­ tet. Simultan wird das in der übrigen Probe 140 emittierte Licht (Streulicht und Fluoreszenzlicht) über die Abbil­ dungsoptik 130 und die in Detektions-Position 121b ge­ schwenkten Mikroskopiegel 121 zur Detektoreinrichtung 150 gelenkt. Die Detektorkamera 153 nimmt ein zweidimensionales Bild der Probe 140 auf, wobei in der Fokalebene zu jedem Zeitpunkt nur aus denjenigen Punkten Licht detektiert wird, die jeweils nicht beleuchtet werden. Dieses zweite Teilbild besteht somit im wesentlichen aus den Hintergrundbeiträgen.

Schließlich werden die bei der ersten bzw. zweiten Proben­ aufnahme ermittelten Teilbilder zur Ermittlung eines Bildes der Fokalebene ausgewertet. Dazu wird das Differenzbild aus dem ersten und zweiten Teilbild berechnet. Auch wenn die beiden Lichtquellen 110 und 160 durch Lampen gleicher Bau­ art gebildet werden, kann es durch Justageabweichungen zu Unterschieden in der Probenbeleuchtung kommen. Vorzugsweise werden daher bei der Differenzbildung die Signale der Teil­ bilder zunächst derart gewichtet, daß sich die in beiden Teilbildern enthaltenen Signalanteile außerhalb der Fokal­ ebene gegenseitig auslöschen. Hierzu kann folgendermaßen vorgegangen werden:

Anstelle der zu untersuchenden Probe 140 wird hierzu ein Testobjekt in Form einer streuenden oder fluoreszierenden ebenen Scheibe oder eines anderen beliebigen, möglichst ho­ mogen streuenden oder fluoreszierenden Objektes außerhalb der Fokalebene angeordnet. Das Testobjekt wird abwechselnd mit der ersten und zweiten Lichtquelle 110 und 160 beleuch­ tet und es werden die jeweiligen Signalverteilungen ent­ sprechend der zwei Abbildungsmodi aufgenommen. Aus dem Quo­ tienten der Signalverteilungen ergeben sich entsprechende Normierungsfaktoren, die bei der genannten Differenzbildung berücksichtigt werden. Es werden für das gesamte Bild ein gemeinsamer Normierungsfaktor oder spezifische Normierungs­ faktoren für einzelne Bildpunkte oder Bildpunktgruppen er­ mittelt.

Eine alternative Ausführungsform eines erfindungsgemäßen optischen Abbildungssystems 100 ist in Fig. 2 gezeigt. Bei dieser Ausführungsform ist lediglich eine Lichtquelle 170 vorgesehen, deren Licht wahlweise über die Feldlinse 171, den schalt- oder schwenkbar ausgeführten Beleuchtungsein­ koppler 172 und die Abbildungsoptik 131 oder über den Um­ lenkspiegel 173, die in Beleuchtungsposition geschwenkten Mikrospiegel 121 des DMDs 120 und die Abbildungsoptik 130 zur Probe gelenkt wird. Im ersten Fall erfolgt die konven­ tionelle Beleuchtung der Gesamtprobe über den als Prismen­ strahlteiler oder teildurchlässigen Spiegel ausgeführten Beleuchtungseinkoppler 172, wie dies bereits für Fig. 1 (Lichtquelle 110) beschrieben wurde.

Während der zweiten Phase der Probenabbildung erfolgt die Beleuchtung über die in die Beleuchtungsposition 121a ge­ schwenkten Mikrospiegel 121 des DMDs 120, wie dies bereits beschrieben wurde, während mittels der Detektoreinrichtung 150 Licht aus den nicht beleuchteten Bereichen der Fokale­ bene aufgezeichnet wird. Zur Abblockung des in den Abbil­ dungsphasen jeweils nicht verwendeten Lichtweges werden alle Elemente des DMD 120 in die Detektionsposition 121b geschwenkt oder der Beleuchtungseinkoppler 172 aus dem Strahlengang gebracht. Auch wenn in Fig. 2 nicht darge­ stellt, so ist wahlweise ein Aufbau mit Shuttern möglich. Im übrigen entspricht das Abbildungssystem 100 gemäß Fig. 2 der oben beschriebenen ersten Ausführungsform, so daß die einzelnen Komponenten mit den gleichen Bezugszei­ chen wie oben bezeichnet sind. Das Bezugszeichen 174 ver­ weist auf einen Shutter. Als Shutter werden vorzugsweise elektromechanische Shutter (z. B. Blenden oder Schwenkspie­ gel, betätigt z. B. mit Elektromotoren oder Hubmagneten) verwendet.

Die Probenabbildung erfolgt ebenfalls, wie dies oben be­ schrieben wurde, indem zwei Teilbilder entsprechend der zwei Abbildungsmodi aufgezeichnet und anschließend zu einem räumlich dreidimensional aufgelösten Bild der Probe ver­ rechnet werden. Der DMD 120 wird wiederum entsprechend den bereits genannten Modulationsmustern angesteuert.

Eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Abbil­ dungssystem 200 mit einer teildurchlässigen und teilreflek­ tierenden rotierenden Maske ist in Fig. 3 gezeigt. Es um­ faßt eine Lichtquelle 210, eine Maske 220 als Beleuchtungs­ modulator, eine Abbildungsoptik 230 und eine Detektorein­ richtung 250 bestehend aus einer Abbildungsoptik 251, einem Filter 252 und einer Detektorkamera 253. Das Bezugszeichen 240 verweist auf eine Probe, die mit dem Abbildungssystem 200 abgebildet werden soll.

Die Lichtquelle 210 beleuchtet über die Feldlinse 211 die Maske 220, die mit der Beleuchtungsoptik 230 in die Probe 240 abgebildet wird. In der Fokalebene der Probe 240 ergibt sich somit ein Beleuchtungsmuster, welches dem auf der Mas­ ke 220 aufgeprägten Reflektionsmuster entspricht. Das von der Probe 240 emittierte Licht wird mit der Abbildungsoptik 230 auf die Maske 220 abgebildet. Mit der Abbildungsoptik 251 wird die Maske 220 auf die Detektorkamera 253 abgebil­ det. Ähnlich wie die Abbildungsoptik 151 kann die Abbil­ dungsoptik 251 sowohl aus refraktiven als auch reflektiven Elementen aufgebaut sein. Die hier beschriebenen Abbil­ dungsmodi unterscheiden sich durch die optischen Eigen­ schaften einzelner Teilbereiche (Sektoren) der Maske 220. Eine bevorzugte Ausführungsform der Maske 220 ist im unte­ ren Teil von Fig. 3 gezeigt.

Ein erster Abbildungsmodus ergibt sich dadurch, daß der ho­ mogene teilreflektierende Sektor a der Maske 220 zur gleichmäßigen konventionellen Beleuchtung der Probe 240 verwendet wird. Das von der Probe 240 emittierte Licht kann zum Teil den homogenen Sektor der Maske 220 passieren und wird auf die Detektorkamera 253 abgebildet (Erfassung des konventionellen Teilbildes).

Für den zweiten Abbildungsmodus wird ein Sektor b der Maske 220 verwendet, auf dem, z. B. mittels photolithographischer Techniken, die vorgenannten Modulationsmuster aufgeprägt wurden. Voll verspiegelte und vollständig transmittierende Zonen sind hier entsprechend dem gewünschten Modulations­ muster angeordnet. Das Modulationsmuster kann wie in den zuvor beschriebenen Ausführungsformen gewählt werden, also beispielsweise als Pseudo-Zufallszahlensequenz. Durch die Rotation der Maske 220 ergibt sich aus der lateralen Anord­ nung der Aperturmuster auf der Scheibe 220 eine zeitabhän­ gige Beleuchtungssequenz für die einzelnen Punkte der Fokalebene. Für das von der Probe 240 emittierte und mit der Abbildungsoptik 230 auf die Maske 220 abgebildete Licht wirkt diese Maske 220 derart, daß nur Licht aus gerade nicht beleuchteten Punkten durch die Maske hindurchtreten und mit der Detektoreinrichtung 250 aufgezeichnet werden kann. Das mit der Detektorkamera 253 aufgezeichnete zweite Teilbild besteht somit im wesentlichen aus den unerwünsch­ ten Hintergrundbeiträgen.

Die weitere Bildverarbeitung zur Gewinnung eines dreidimen­ sional aufgelösten Bildes der Fokalebene der Probe 240 aus den zwei Teilbildern wird nach den weiter oben beschriebe­ nen Methoden durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Abbildungssystems können die Positionen der Beleuchtungseinrichtung 210, 211 und der De­ tektoreinrichtung 250 wahlweise ohne weitere Veränderungen gegeneinander vertauscht werden.

Eine weitere alternative Ausführungsform eines erfindungs­ gemäßen optischen Abbildungssystems 300 für Untersuchungen in Transmissionsgeometrie ist in Fig. 4 dargestellt. Es umfaßt eine Lichtquelle 310, die über eine Feldlinse 311 einen Beleuchtungsmodulator 320 beleuchtet. Dieser wird über eine Abbildungsoptik 330 in die Fokalebene in der Pro­ be 340 abgebildet. Eine zweite Abbildungsoptik 331 bildet diese Fokalebene in der Probe 340 auf einen Detektionsmodu­ lator 350 ab, der über eine Abbildungsoptik 361 und einen Filter 362 auf eine Detektorkamera 363 abgebildet wird.

Die Lichtquelle 310 ist beispielsweise eine gefilterte Weißlichtlampe oder ein gefilterter Laser. Die Modulatoren 320, 350 sind hier als LCDs ausgeführt. Für Fluoreszenzan­ wendungen wird mit dem Filter 362 die Emission der Probe 340 herausgefiltert.

Für das in einem ersten Abbildungsmodus aufgezeichnete kon­ ventionelle Teilbild werden alle Pixel der LCDs 320, 350 auf Transmission gestellt, so daß die Probe 340 gleichmäßig beleuchtet und mit der Detektorkamera 363 ein konventionel­ les erstes Teilbild aufgezeichnet wird.

In einem zweiten Abbildungsmodus wird die Transmission der Elemente des Beleuchtungsmodulators 320 beispielsweise nach den oben beschriebenen Modulationsmustern variiert und da­ durch die Punkte der Fokalebene der Probe 340 mit den ent­ sprechenden zeitabhängigen Beleuchtungssequenzen beleuch­ tet. Während dieser Phase wird die Transmission der Elemen­ te des Detektionsmodulators 350 derart gesteuert, daß nur Licht aus den zum jeweiligen Zeitpunkt nicht direkt be­ leuchteten Punkten der Fokalebene der Probe zur Detek­ toreinrichtung 360 gelangt. Dieses mit der Detektorkamera 363 aufgezeichnete zweite Teilbild enthält die Hintergrund­ beiträge. Die Gewinnung eines dreidimensional aufgelösten Bildes der Fokalebene der Probe 340 aus den zwei Teilbil­ dern wird nach den weiter oben beschriebenen Methoden durchgeführt.

Das erfindungsgemäße optische Abbildungssystem kann sowohl als eigenständiges Gerät, als auch als Zusatz zu einem ver­ fügbaren Mikroskop realisiert werden. Der DMD-Beleuchtungs­ modulator kann beispielsweise mit einem "DLP XGA Electro­ nics Subsystem Kit" (Hersteller: Texas Instruments, Dallas, TX, USA) realisiert werden.

Claims (22)

1. Verfahren zur optischen Abbildung einer Probe (140), mit den Schritten:

• - gleichmäßige Beleuchtung der gesamten Probe (140) und Aufnahme eines konventionellen ersten Teilbildes,
• - lateral strukturierte Beleuchtung der Probe (140) in einer Fokalebene, bei der die Beleuchtung der einzelnen Punkte der Fokalebene nach vorbestimmten zeitlichen Sequen­ zen variiert wird, und Aufnahme eines zweiten Teilbildes durch Erfassung des von den in der Konfokalebene jeweils nicht beleuchteten Objektpunkten emittierten Lichtes, und
• - Ermittlung eines dreidimensional räumlich aufgelösten Bildes der Probe (140) aus den ersten und zweiten Teilbil­ dern.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die strukturierte Beleuchtung der Probe (140) unter Verwendung eines Beleuch­ tungsmodulators mit einer Vielzahl von Beleuchtungsapertu­ ren erfolgt, der mit einem vorbestimmten oder zufälligen Modulationsmuster angesteuert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem als Beleuchtungsmo­ dulator ein DMD (120) mit einer Vielzahl von einzeln an­ steuerbaren Mikrospiegeln (121) verwendet wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem als Beleuchtungsmo­ dulator ein LCD (320) verwendet wird, bei dem die Trans­ mission der Pixel einzeln angesteuert wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die strukturierte Beleuchtung der Probe unter Verwendung einer Maske (220) in Transmission oder Reflexion erfolgt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das dreidimensional räumlich aufgelöste Bild durch Differenzbildung aus den zwei Teilbildern ermittelt wird, wobei das erste und/oder zweite Teilbild derart gewichtet wird, daß bei der Differenzbildung die Bildanteile von au­ ßerhalb der Fokalebene der Probe sich im Wesentlichen ge­ genseitig aufheben.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Aufnahme des er­ sten und zweiten Teilbildes eine einzelne (170) oder zwei getrennte Lichtquellen (110, 160) verwendet werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das verwendete Modu­ lationsmuster

• - aus einer einzelnen systematisch verschobenen Zeile oder aus mehreren Zeilen besteht, die regelmäßig, entsprechend einer Pseudo-Zufallssequenz endlicher Länge, einer Hada­ mard-Sequenz oder einer Zufallssquenz angeordnet sind,
• - sich aus regelmäßigen Punkt- oder Linienmustern zusammen­ setzt,
• - aus Zufallsmustern besteht,
• - aus auf so genannten Walsh, Sylvester, Hadamard oder Go­ lay Sequenzen basierenden Pseudo-Zufallsmustern endlicher Länge besteht,
• - aus einer wiederholten Anordnung von Mustern, die sich aus den Zeilen oder Spalten einer zyklischen Hadamard- Matrix ergeben, besteht, oder aus einer Kombination der vorgenannten Muster besteht.

9. Optisches Abbildungssystem (100), das mindestens eine Lichtquelle (110, 160, 170), eine Detektoreinrichtung (150) und einen Beleuchtungsmodulator (120) mit einer Vielzahl von einzeln ansteuerbaren Modulatorelementen (121) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß ein Beleuchtungseinkoppler zur gleichmäßigen Beleuchtung der gesamten Probe (140) in einem ersten Abbildungsmodus vorgesehen ist, und die Modulatorelemente (121) mindestens zwei Gruppen von Mo­ dulatorelementen aufweisen, von denen in einem zweiten Ab­ bildungsmodus eine erste Gruppe von Modulatorelementen (Be­ leuchtungs-Elemente) Licht von einer Lichtquelle (160, 170) in die Probe (140) lenken und eine zweite Gruppe von Modu­ latorelementen (Detektions-Elemente) Licht aus jeweils nicht beleuchteten Bereichen der Fokalebene der Probe (140) zur Detektoreinrichtung (150) lenken.

10. Abbildungssystem gemäß Anspruch 9, bei dem der Beleuch­ tungsmodulator durch einen DMD-Reflektor (120) mit einer Vielzahl von matrixartig angeordneten, verschwenkbaren Spiegeln (121) gebildet wird.

11. Abbildungssystem gemäß Anspruch 9, bei dem die Beleuch­ tungseinrichtung so aufgebaut ist, daß die Probe (140) von der Lichtquelle (170) entweder gleichmäßig über Beleuch­ tungseinkoppler (172) oder über den Umlenkspiegel (173) und den Beleuchtungsmodulator in der Fokalebene strukturiert beleuchtet wird.

12. Abbildungssystem gemäß Anspruch 9, bei dem zwei Licht­ quellen (110, 160) vorgesehen sind und die Beleuchtungsein­ richtung so aufgebaut ist, daß die Probe (140) entweder von der ersten Lichtquelle (110) über den Beleuchtungseinkopp­ ler (113) gleichmäßig beleuchtet wird, oder daß die Probe (140) über die zweite Lichtquelle (160) und den Beleuch­ tungsmodulator (120) in der Fokalebene strukturiert be­ leuchtet wird.

13. Abbildungssystem gemäß Anspruch 11 oder 12, bei dem die Beleuchtungseinrichtung Shutter (112, 174) aufweist, die zur Abschirmung von Beleuchtungsstrahlengängen vorgesehen sind.

14. Optisches Abbildungssystem (200), das mindestens eine Lichtquelle (210), eine Maske (220) mit verschiedenen Sek­ toren und eine Detektoreinrichtung (250) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sektor (a) der Maske (220) für eine gleichmäßige Beleuchtung der Probe (240) in einem ersten Abbildungsmodus vorgesehen ist, und ein Sektor (b) der Mas­ ke (220) verschiedene Zonen aufweist, wobei eine erste Gruppe der Zonen Licht von der Lichtquelle (210) zur struk­ turierten Beleuchtung der Fokalebene in die Probe (240) lenkt und eine zweite Gruppe von Zonen Licht von den je­ weils nicht beleuchteten Bereichen der Fokalebene der Probe (240) zur Detektoreinrichtung (250) lenkt.

15. Abbildungssystem gemäß Anspruch 14, bei dem die Maske (220) aus mindestens einem teilverspiegelten Sektor (a) und mindestens einem Sektor (b) besteht, in dem die erste Gruppe von Zonen verspiegelt und die zweite Gruppe von Zonen transparent ist.

16. Abbildungssystem gemäß Anspruch 14, bei dem die Maske (220) als eine rotierende Scheibe ausgeführt ist.

17. Optisches Abbildungssystem (300), das mindestens eine Lichtquelle (310), einen Beleuchtungs- und einen Detek­ tionsmodulator (320, 350) mit jeweils einer Vielzahl von einzeln ansteuerbaren Modulatorelementen und eine Detek­ toreinrichtung (360) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß eine gleichmäßige Beleuchtung der gesamten Probe (340) in einem ersten Abbildungsmodus vorgesehen ist, und die ein­ zelnen Modulatorelemente des Detektions- und des Beleuchtungsmodulators (320, 350) in einem zweiten Abbildungsmodus so gesteuert werden, daß eine Gruppe von Modulatorelementen des Beleuchtungsmodulators Licht von der Lichtquelle (310) in die Probe (340) lenken und eine Gruppe von Modulatorele­ menten des Detektionsmodulators (350) Licht aus jeweils nicht beleuchteten Bereichen der Fokalebene der Probe (340) zur Detektoreinrichtung (360) lenken.

18. Abbildungssystem gemäß Anspruch 17, bei dem der Be­ leuchtungsmodulator (320) und/oder der Detektionsmodulator (350) durch einen DMD-Reflektor gebildet wird.

19. Abbildungssystem gemäß Anspruch 17, bei dem der Be­ leuchtungsmodulator (320) und/oder der Detektionsmodulator (350) durch einen LCD gebildet wird.

20. Abbildungssystem gemäß Anspruch 17, bei dem der Be­ leuchtungsmodulator (320) und/oder der Detektionsmodulator (350) durch eine Maske gebildet wird.

21. Abbildungssystem gemäß den Ansprüchen 10 oder 18, bei dem die Optik (161, 151, 311, 330, 331, 361) zur Beleuch­ tung oder Abbildung des DMDs (120, 320 oder 350) ein Offner-Triplett ist oder ein Offner-Triplett verwendet wird.

22. Abbildungssystem gemäß dem Anspruch 14, bei dem die Optik (211, 251) zur Beleuchtung oder Abbildung der Maske (220) ein Offner-Triplett ist oder ein Offner-Triplett ver­ wendet wird.