WO1991008232A1 - Klonierung und expression des für die blut-hirn-schranke spezifischen proteins ht7 - Google Patents

Klonierung und expression des für die blut-hirn-schranke spezifischen proteins ht7 Download PDF

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WO1991008232A1
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blood
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PCT/EP1990/002000
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Harald Seulberger
Friedrich Lottspeich
Werner Risau
Sigrid Henke-Fahle
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the unique properties of endothelial cells in the brain, which form the blood-brain barrier, are expressed by the expression of specific cell surface molecules, such as the HT7 protein. Purification, cloning and expression of this molecule showed that it is a new transmembrane glycoprotein with two Im unglobulin-like domains. This protein can be a receptor that participates in the cell surface recognition at the blood-brain barrier.
  • Impermeable tight junctions zonula occludens
  • specific transport systems in endothelial cells of the brain capillaries are responsible for the blood-brain barrier in higher vertebrates (TS Reese & MJ Karnovsky, J. Cell Biol. 34, 207-217 (1967) and AL Betz & GW Goldstein, Annu. Rev. Physiol. 48, 241-250 (1986)).
  • astrocytes the end feet of which lie tightly on the discharge side of CNS capillaries, induce blood-brain barrier properties in endothelial cells in vivo (RC Jan-er and MC Raff, Nature 325, 253-257 (1987) ).
  • Two processes are involved in the formation of a functional vascular system of the blood-brain barrier.
  • angiogenesis the formation of capillaries from the existing perineural vascular system, causes the migration and proliferation of endothelial cells. This process is presumably regulated by soluble brain-derived factors (W. Risau, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3855-3859 (1986)).
  • the blood vessels thus formed differentiate into barrier capillaries.
  • astrocytes play a major role in the latter process, the mechanisms remain unclear (RC Janzer and MC Raff, Nature 325, 253-257 (1987)). This is mainly due to the lack of an in vitro model system. As a result, markers that specifically recognize in vitro endothelial cells of the blood-brain barrier are valuable for the development of such a system.
  • the blood-brain barrier-specific HT7 antigen can be characterized using antibodies (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht & S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). Monoclonal antibodies to HT7 are available from mice immunized with the nasal retina of 7-day-old chickens according to the protocol of Mattew and Patterson (Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 48. (1983), 625-631) with Cyclophos - Pha id were immunosuppressed and in which the anti-body formation was stimulated by the administration of sleeping retina. The mice treated in this way contain polyclonal antibodies.
  • a monoclonal antibody against HT7 can be produced in the usual way by fusing NS1 myeloma cells with spleen cells of these mice. The specificity of the antibodies obtained can be tested on frozen sections from the retina and tectum. It was found that the expression of the cell surface marker induced HT7 in endothelial cells which had penetrated into transplanted brain tissue (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht & S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). It is also expressed in the epithelial cells of renal tubules, in the choroid plexus and in the retinal pigment layer, in erythroblasts and pinealocytes.
  • the HT7 protein can have considerable diagnostic and therapeutic importance. Accordingly, it was the object of the present invention to characterize this protein by purification, cloning and expression at the molecular level.
  • the invention thus relates to a new membrane protein with two immunoglobulin-like domains, the amino acid sequence shown in FIG. 3D, naturally occurring allelic variations of this amino acid sequence or a sequence homologous to this amino acid sequence with essentially the same biological properties and has functions.
  • the protein according to the invention has several glycosylation sites and, depending on its location, can be present in differently glycosylated forms.
  • the N-terminal amino acid sequences of the protein, purified from chicken brain capillaries, kidneys and erythroblasts, are identical.
  • Specific oligonucleotide primers could be constructed on the basis of partial information of the amino acid sequence, so that a cDNA clone was obtained by the polymerase chain reaction.
  • HT7 The nucleotide sequence of the HT7 protein reveals that it is a member of the iminunglobulin superfamily that contains two C2-like domains. In certain areas there is considerable homology to the v-fms oncogene. There was a region in the presumably cytoplasmic end of the protein found with clear homology to the p53 nuclear oncogene. So far, the sequence has not been discovered in membrane proteins. Furthermore, their biological meaning is still • unknown. On the basis of these results, it can be suggested that HT7 is a receptor which is involved in the cell-surface recognition at the blood-brain barrier. It can therefore be a valuable marker for these important processes at the blood-brain barrier. HT7 could also allow the specific transport of drugs and toxins into the brain.
  • HT7 protein For the characterization of suitable cells or tissues for the purification of the HT7 protein, monoclonal and polyclonal antibodies against immune-purified HT7 antigen were used (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht and S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). Such antibodies can be produced by the person skilled in the art using the method described above without major difficulties.
  • a protein with an apparent molecular weight of approximately 45 to 52 kD was found in extracts from chicken brain microvessels (45 kD) kidney (52 kD) and erythroblasts
  • the erythroblast cell line HD3 is a cell line transformed with the poultry erythroblastosis virus (H. Beug, G. Doederlein, C. Freudenstein and T. Graf, J. Cell. Physiol. 115, 295-309
  • the HT7 antigen was expressed on the cell surface of these cells in a manner similar to that of a chicken hen endothelial cell culture (Fig. 1B, C).
  • the erythroblast cell line HD3 is therefore a good source of the antigen.
  • the antigen was purified from erythroblast plasma membrane proteins, which were solubilized with Nonidet P40, with the aid of HT7 monoclonal antibodies Bromine-activated Sepharose 4B were bound.
  • the eluate from this affinity column was passed through a reverse phase C4-HPLC column.
  • the protein-containing peak fractions were analyzed in immunoblots for the presence of the HT7 antigen.
  • Figure 2A shows HPLC (a) and immunoblot (b) analysis of immunopurified HT7 antigen.
  • the only peak (4) which contained the antigen was analyzed by gel electrophoresis and silver training (FIG. 2B) and then sequenced using the gas phase amino acid microsequencing method. The N-terminal amino sequence was identified with
  • oligonucleotide primers were constructed and used for the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • a resulting amplified DNA fragment with the expected size of 120 bp was found, which hybridized with a pool of degenerate oligonucleotides, which was constructed using an internal sequence.
  • the other pool of degenerate oligonucleotides used as a control did not hybridize (Fig. 3B).
  • the amplified fragment was cloned into a vector and used to examine an erythroblast ⁇ gtll cDNA library. The investigation of 1.5 x 10 5 clones revealed 30 positive clones.
  • the cleavage of the signal peptide presumably occurs between the alanine (-1) - and threonine residue * -l), which would correspond to the N-terminal amino acid sequence obtained by amino acid sequence analysis.
  • a transmembrane region that contains a typical membrane anchor with basic amino acids extends from alanine (187) to isoleucine (207).
  • the hydropathy analysis of the predicted protein agrees with these interpretations (FIG. 3E).
  • the predicted molecular weight of the mature protein is 24075 D, which is in good agreement with the estimate of 25 kD that was obtained after gel electrophoresis of erythroblasts treated with tunicamycin (FIG. 2D).
  • the corresponding PTH amino acids were not identified at positions 21, 80 and 138, which indicates that at least these residues glycosylate in the mature protein could be.
  • 150 were identified by amino acid sequence analysis (underlined in FIG. 3D).
  • the predicted amino acid sequence of the cDNA clone matched all of the amino acid sequences obtained. Examination of the MIPSX database confirmed that this gene had not been previously sequenced.
  • the arrangement of the nucleotide sequence of the HT7 gene with published sequences allows the HT7 gene to be clearly classified into the immunoglobulin superfamily.
  • Two immunoglobulin-like domains with the characteristic ⁇ -sheet sandwich (predicted by Chou-Fassmann analysis), stabilized by disulfide bridges, are predicted from the analysis of homology regions and preserved cysteine residues (FIGS. 4A and D) .
  • a comparison of the immunoglobulin domains of the HT7 protein with other members of the immunoglobulin superfamily indicates that they are of the C2 type according to the criteria of Williams and Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405 (1988).
  • the total homology with a protein gp70 M.
  • leucine zipper which consists of 4 to 5 leucine residues repeated every 7th amino acid, is important for the functional dimerization of DNA-binding proteins (T. Kouzarides and E. Ziff, Nature 336, 646-651 (1988 ), WH Landshultz, PF Johnson and SL McKnight, Science 243, 1681-1688 (1988). It is known that the leucine zipper motif also occurs in membrane transport proteins and ion channels (K. McCormack et al., Nature 340, 103 (1989) and MK White and MJ Weber, Nature 340, 103-104 ( 1989)), but its meaning is questioned (V.
  • a new motif encoded in the predicted cytoplasmic end of the HT7 gene has homology to a sequence of the p53 nuclear oncogene (Fig. 4C) (T. Soussi et al., Nucl. Acids Res. 16, 11383 (1988)) . 5 consecutive amino acids are identical and some are conserved in the neighborhood (38% identity in 29 amino acids), so far this sequence has not been found in membrane proteins and their biological significance is unclear. Based on the homologies, a model for the structure of the HT7 protein is proposed (FIG. 4D).
  • the HT7 antigen is a new protein. Based on the available results, it is a receptor that is involved in cell surface recognition at the blood-brain barrier. The ligand is still unknown.
  • the HT7 antigen is a specific protein from chicken endothelial cells of the blood-brain barrier. It has not been found in other endothelial cells. It is therefore a marker for an organ-specific endothelium. However, it is not brain specific. Expression is also found in erythroblasts, epithelial cells of renal tubules, choroid plexus and retinal pigment layer. This suggests that the HT7 protein participates in transport processes into these cells.
  • HT7 protein can be a role in cell adhesion.
  • the antigen was concentrated in areas with cell-cell contact (Fig. IB).
  • ICAM cell adhesion molecules
  • N-CAM N-CAM
  • the HT7 protein is unlikely to be a growth factor receptor because (1) its expression does not match the growth status of the cell and (2) tyrosine phosphorylation sites are absent from the cytoplasmic end.
  • HT7 protein can be a valuable marker for elucidating these processes and their disruption under pathological conditions such as in brain tumors (DR Groothuise and NA Vick, TINS 5, 232-235 (1982)), Alzheimer's disease (CL Masters and K.
  • HT7 protein according to the invention could also be used for the specific transport of drugs in and possibly through the blood-brain barrier.
  • Microvessels were isolated from brain from adult chickens by a single pronase digestion (0.5% weight / volume in serum-free DMEM, one hour at 37 ° C.) from pieces of the cerebral cortex, those of meninges were cleaned. The microvessels settled after centrifugation (20 minutes, 1000 g) in 25% bovine serum albumin in saline, while neural tissue swam under these conditions. Microvessels, erythroblasts (H. Beug et al., J. Cell. Physiol.
  • Brain endothelial cells were cultured from embryo brain (day 18) microvessel fragments in DMEM, 10% calf serum and 1% bovine retina extract (containing fibroblast growth factors) as already described (W. Risau et al., J. Cell Biol. (1989)). Endothelial colonies were identified by the expression of FVIIIrAg-vWF and incubated with monoclonal HT7 antibodies (10 ⁇ g IgG per ml). They were then fixed using 4% buffered paraformaldehyde and stained with secondary rhodamine-labeled antibodies. Controls using monoclonal antibodies corresponding to isotype or preimmune serum in immunofluorescence and immunoblots were in each case negative.
  • FIG. 1A shows 70 ⁇ g protein from chicken brain microvessels (lane 1), kidney (2) and erythroblasts (3), which were separated by PAGE in a 7.5 to 17.5% polyacrylamide gel under reducing conditions and using polyclonal HT7 antibodies were immunoblotted.
  • Figures IB and C show indirect immunofluorescence from chicken brain endothelial cells (B) and erythroblasts (C).
  • Example 2
  • Erythroblasts were cultivated in bioreactors (1 1) with continuous stirring and harvested by centrifugation. From this, plasma membrane proteins were isolated (S. Hoffman et al., J. Biol. Chem. 257, 7720-7729 (1982)).
  • the HT7 antigen was purified from membrane proteins solubilized with Nonidet P40 by immunoaffinity chromatography, using HT7 monoclonal antibodies bound to Sepharose (2 mg IgG per ml packed gel, 50 ml gel). The bound material was eluted with buffered 3.5 M sodium thiocyanate, dialyzed, lyophilized, taken up in water and applied to a VYDAC-C4 reverse phase column (25 cm, 4.5 mm inner diameter).
  • the bound material was eluted using a linear gradient from 25 to 75% solvent B.
  • the peak fractions were lyophilized and analyzed in immunoblots (cf. Example 1).
  • the amino acid sequencing was carried out using an Applied Biosystems gas phase microsequencing apparatus. Solid phase peptide synthesis was performed in an Applied Biosystems Model 431A automated peptide synthesizer using Fmoc-protected amino acids.
  • the peptide was bound to keyhole limpet hemocyanin (H. Shapira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2461-2465 (1984)). Rabbits were immunized with this. The rabbits' sera were tested in immunoblots.
  • FIG. 2A shows a reverse phase C4-HPLC-Diagra ⁇ m_ ⁇ of the immunologically purified erythroblast HT7 antigen.
  • the proteins in the indicated peak fractions were lyophilized, electrophoretically separated on a 12% polyacrylamide gel and analyzed in immunoblots (FIG. 2B).
  • the antigen is contained in fraction 4, which elutes at 55% solution B (95% acetonitrile, 0.1% TFA).
  • FIG. 2B shows PAGE (lanes 1 and 2) and immunoblot analysis (lanes 3 and 4) of immune-purified and C4-HPLC-purified HT7 antigen from brain (1.3) and kidney (2.4) plasma membrane proteins.
  • FIG. 2D shows an immunoblot analysis of the HT7 antigen from brain microvessels using antibodies against the N-terminal peptide (lane 1). Munoblot analysis of the HT7 antigen after tunicamycin treatment (1 ⁇ g / ml for 24 hours) of erythroblasts is shown in lane 3.
  • FIG. 2E shows the amino acid sequences of the N-terminus, the CNBr fragment and of trypsin fragments of the HPLC-purified HT7 antigen.
  • X represents an unidentified amino acid.
  • Oligonucleotides were made with an Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A.
  • CDNA complementary to mRNA from erythroblasts (C. Chen and H. Okayama, Mol. Cell. Biology 7, 2745-2752 (1987)) was produced according to known methods (U. Gubler, Nucl. Acids Res. 16, 2726 (1988)) and as a template for the PCR reaction (SI Girgis et al., Nucl. Acids Res. 16, 10371 (1988)), the degenerate sense and antisense primer molecules (see FIG. 3A) were used at the specified annealing temperatures (Fig. 3B).
  • the amplified DNA fragments were separated on 2.5% agarose gels, blotted on nylon membranes and hybridized with the 2 P-labeled test oligonucleotides.
  • the 120 bp fragment was eluted and cloned into the commercially available Bluescript KS vector.
  • An erythroblast ⁇ gtll cDNA library made in a manner known to those skilled in the art was tested using the 120 bp fragment. Inserts from two positive clones (out of a total of 30) were sequenced (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3918-3921 (1979)) as indicated in Figure 3C.
  • FIG. 3A shows the sequence of primers and test oligonucleotides for the PCR reaction based on the amino acid sequence of the CNBr fragment of HT7.
  • FIG. 3B shows pool B of the test oligonucleotides (SOb) which give a strong hybridization with the expected 120 bp fragment (arrow), whereas pool A (SOa) was negative.
  • FIG. 3C shows a restriction map of the cDNA clones pCHT7.1 and pCHT7.2. The arrows indicate the direction and scope of the nucleotide sequence analysis.
  • Figure 3D shows the nucleotide sequence of the HT7 gene. The two initiation codons and the suspected transmembrane region are boxed.
  • FIG. 3E shows a hydropathy blot of the suspected amino acid sequence of the HT7 protein below Using the algorithm of Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).
  • FIG. 4D shows the suspected leucine zipper motif. Leucine or isoleucine residues participating in the hypothetical zipper are framed.
  • FIG. 4C shows the homology of the HT7 protein with the oncoprotein p53.
  • FIG. 4D represents a possible structural model for the HT7 protein. The circles held together by disulfide bridges represent possible immunoglobulin domains. Assumed N-glycosylation sites are marked with small circles.
  • High molecular genomic chicken DNA was made from the liver of an adult chicken. Samples of 20 ⁇ g each were cleaved by restriction enzymes, applied on a 0.9% agarose gel and blotted on Genescreen nylon membranes (DuPont). 5 ⁇ g poly-A-RNA, isolated from the respective tissues (P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)), was in a 0.9% formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresed and blotted onto a Hybond-N nylon filter (Amersham).
  • the hybridization reactions were carried out in a 50% formamide solution, 5X SSC, 5X Denhardt's solution, 5% SDS and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA at 42 ° C. for 12 hours. It was washed three times with 0.1 ⁇ SSC, 1% SDS for 15 minutes at 65 ° C.
  • the EcoRI / PstI fragment of the pCHT7.2 clone (FIG. 3A) was cloned into the vector pCMV (S. Andersson et al., J. Biol. Chem. 264, 8222-82229 (1989)) and thus COS- Cells transfected (P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal. Biochem.
  • FIG. 5A shows a Southern blot analysis of chicken DNA digested with BamHI, EcoRI and PstI. It can be seen from this that the HT7 gene occurs only once in the chicken genome.
  • FIG. 5B shows a Northern blot analysis of poly-A RNA from the brain (lane 1), kidney (2) and erythroblasts (3). The blots were hybridized with the 120 bp fragment from FIG. 3C.
  • FIGS. 5C and D show the expression of the HT7 protein by transfected COS cells. Indirect immunofluorescence (C) and phase contrast (D) from COS cells using HT7 monoclonal antibodies were performed. 20 to 30% of the cells showed bright membranes and intracellular fluorescence. The magnification is 250 times.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Membranprotein mit zwei Immunglobulin-artigen Domänen, das (a) die aus Figur 3D ersichtliche Aminosäure-Sequenz besitzt, (b) eine natürlich vorkommende, allelische Variation dieser Aminosäuresequenz besitzt oder (c) eine dazu homologe Sequenz besitzt, die einem Protein mit im wesentlichen denselben biologischen Aktivitäten und Funktionen entspricht, sowie eine für das erfindungsgemäße Protein kodierende rekombinante DNA, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung als Arzneimittel.

Description

B E S C H R E I B U N G Klonierung und Expression des für die Blut-Hirn-Schranke spezifischen Proteins HT7
Die einzigartigen Eigenschaften von Endothelzellen im Gehirn, welche die Blut-Hirn-Schranke bilden, werden durch die Expression spezifischer Zelloberflächen-Mole¬ küle, wie dem HT7-Protein, ausgedrückt. Reinigung, Klo¬ nierung und Expression dieses Moleküls zeigten, daß es sich um ein neues Transmembran-Glykoprotein mit zwei Im unglobulin-artigen Domänen handelt. Dieses Protein kann ein Rezeptor sein, der bei der Zelloberflächen- Erkennung an der Blut-Hirn-Schranke mitwirkt.
Die spezifische neural- Mikroumgebung ist bedeutsam für die neuronale Funktion und wird durch die Blut-Hirn- Schranke aufrechterhalten. Impermeable "tight junctions" (Zonula occludens) und spezifische Transportsysteme in Endothelzellen der Hirn-Kapillaren sind für die Blut- Hirn-Schranke in höheren Wirbeltieren verantwortlich (T.S. Reese & M.J. Karnovsky, J. Cell Biol. 34, 207-217 (1967) und A.L. Betz & G.W. Goldstein, Annu. Rev. Physiol. 48, 241-250 (1986)). Die einzigartigen Eigen¬ schaften der Endothelzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) im Vergleich zu denen in anderen Organen sind nicht genetisch durch gehirnspezifische Endothel-Vor- läufer-Moleküle bestimmt, sie werden hingegen durch die neurale Umgebung während der Entwicklung des vaskulären Systems induziert (P.A. Stewart & M.J. Wiley, Dev. Biol. 84, 183-192 (1981) und W. Risau, R. Hallmann U. Albrecht und S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179 83 (1986) ). Es ist bekannt, daß Astrozyten, deren Endfüße auf der Ablu enseite von ZNS-Kapillaren dicht anliegen, Blut-Hirn-Schranken-Eigenschaften in Endothelzellen in vivo induzieren (R.C. Jan-er und M.C. Raff, Nature 325, 253-257 (1987)). Zwei Prozesse sind bei der Bildung eines funktionalen vaskulären Systems der Blut-Hirn-Schranke beteiligt. Zuerst bewirkt die Angiogenese, die Bildung von Kapil¬ laren aus dem vorhandenen perineuralen vaskulären System, die Wanderung und Proliferation von Endothel¬ zellen. Dieser Vorgang wird vermutlich durch lösliche, aus dem Hirn stammende Faktoren reguliert (W. Risau, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3855-3859 (1986)). An¬ schließend differenzieren die so gebildeten Blutgefäße zu Schranken-Kapillaren. Obwohl Astrozyten eine große Rolle bei dem letzten Vorgang spielen, bleiben die Mechanismen unklar (R.C. Janzer und M.C. Raff, Nature 325, 253-257 (1987)). Dies ist hauptsächlich durch das Fehlen eines in vitro Modellsystems bedingt. Demzufolge sind Marker, die spezifisch in vitro Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke erkennen, wertvoll zur Entwicklung eines solchen Systems.
Das Blut-Hirn-Schranke spezifische HT7-Antigen kann unter Verwendung von Antikörpern charakterisiert werden (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht & S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). Monoklonale Antikörper gegen HT7 sind aus Mäusen erhältlich, die mit nasaler Netzhaut von 7 Tage alten Hühnern immunisiert, nach dem Protokoll von Mattew and Patterson (Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 48. (1983), 625-631) mit Cyclophos- pha id immunsupprimiert wurden und bei denen die Anti¬ körperbildung durch Gabe von Schlafenhalbnetzhaut stimuliert wurde. Die so behandelten Mäuse enthalten polyklonale Antikörper. Durch Fusion von NSl-Myelomzel- len mit Milzzellen dieser Mäuse kann auf übliche Weise ein monoklonaler Antikörper gegen HT7 hergestellt werden. Die Spezifität der erhaltenen Antikörper kann auf Gefrierschnitten aus Netzhaut und Tektum getestet werden. Dabei wurde gefunden, daß die Expression des Zelloberflächen-Markers HT7 in Endothelzellen induziert wurde, die in transplantiertes Hirngewebe eingedrungen waren (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht & S. Henke- Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). Er wird ebenfalls in den Epithelzellen von Nierentubuli, im Choroidplexus und in der retinalen Pigmentschicht, in Erythroblasten und Pinealozyten exprimiert. Neben der Aufklärung der Funktion dieses Proteins und seiner Beziehung zu anderen Proteinen, von denen man annimmt, daß sie spezifisch in der Blut-Hirn-Schranke exprimiert werden, kann das Pro¬ tein HT7 eine erhebliche diagnostische und therapeuti¬ sche Bedeutung besitzen. Demnach war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, dieses Protein durch Reinigung, Klonierung und Expression auf molekularer Ebene zu cha¬ rakterisieren.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Mem¬ branprotein mit zwei Immunglobulin-artigen Domänen, das die in Fig. 3D dargestellte Aminosäuresequenz, natürlich vorkommende allelische Variationen dieser Aminosäurese¬ quenz oder eine zu dieser Aminosäuresequenz homologe Sequenz mit im wesentlich denselben biologischen Eigen¬ schaften und Funktionen besitzt. Das erfindungsgemäße Protein besitzt mehrere Glykosylierungsstellen und kann je nach seiner Lokalisierung in unterschiedlich glyko- sylierten Formen vorliegen. Die N-terminalen Amino¬ säuresequenzen des Proteins, gereinigt aus Hühnerhirn- Kapillaren, Nieren und Erythroblasten, sind identisch. Aufgrund von Teilinformationen der Aminosäuresequenz konnten spezifische Oligonukleotid-Primer konstruiert werden, so daß durch die Polymerase-Kettenreaktion ein cDNA-Klon erhalten wurde. Die Nukleotidsequenz des HT7- Proteins offenbart, daß es sich um ein Mitglied der Iminunglobulin-Superfamilie handelt, das zwei C2-artige Domänen enthält. In gewissen Bereichen besteht be¬ trächtliche Homologie zum v-fms-Onkogen. Im vermutlich cytoplasmatischen Ende des Proteins wurde eine Region mit deutlicher Homologie zum p53-Kernonkogen gefunden. Bislang wurde die Sequenz nicht in Membranproteinen entdeckt. Weiterhin ist ihre biologische Bedeutung noch • unbekannt. Auf Basis dieser Ergebnisse kann man vor¬ schlagen, daß es sich bei HT7 um einen Rezeptor handelt, der bei der Zelloberflächen-Erkennung an der Blut-Hirn- Schranke beteiligt ist. Es kann sich daher um einen wertvollen Marker für diese bedeutsamen Vorgänge an der Blut-Hirn-Schranke handeln. Weiterhin könnte HT7 den spezifischen Transport von Arzneimitteln und Toxinen in das Hirn erlauben.
Zur Charakterisierung von geeigneten Zellen oder Gewebe zur Reinigung des HT7-Proteins wurden monoklonale und polyklonale Antikörper gegen immungereinigtes HT7-Anti¬ gen verwendet (W. Risau, R. Hallmann, U. Albrecht und S. Henke-Fahle, EMBO J. 5, 3179-3183 (1986)). Solche Anti¬ körper sind für den Fachmann nach dem oben beschriebenen Verfahren ohne größere Schwierigkeiten herstellbar. Ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 45 bis 52 kD wurde in Extrakten aus Hühnerhirn- Mikrogefäßen (45 kD) Niere (52 kD) und Erythroblasten
(52 kD) gefunden (Fig. 1A) . Die Erythroblasten-Zellinie HD3 ist eine mit dem Geflügel-Erythroblastosis-Virus transformierte Zellinie (H. Beug, G. Doederlein, C. Freudenstein und T. Graf, J. Cell. Physiol. 115, 295-309
(1982)). Das HT7-Antigen wurde auf der Zelloberfläche dieser Zellen ähnlich wie in einer Zellkultur von Hühnerhim-Endothelzellen exprimiert (Fig. 1B, C) .
Die Erythroblasten-Zellinie HD3 stellt somit eine gute Quelle für das Antigen dar. Sie ist jedoch zur Reinigung des HT7-Proteins nicht unbedingt erforderlich. Das Antigen wurde von Erythroblasten-Plasmamembran-Protei- nen, die mit Nonidet P40 solubilisiert waren, mit Hilfe von HT7-monoklonalen Antikörpern gereinigt, die an Bromcyan aktivierte Sepharose 4B gebunden waren. Das Eluat dieser Affinitätssäule wurde über eine reverse Phase C4-HPLC-Säule geleitet. Die Protein-haltigen Peakfraktionen wurden in Immunoblots aui die Anwesenheit des HT7-Antigens analysiert. Fig. 2A zeigt eine HPLC (a) und I munoblot (b) Analyse von immungereinigtem HT7- Antigen. Der einzige Peak (4), der das Antigen enthielt, wurde durch Gelelektrophorese und Silberstaining analy¬ siert (Fig. 2B) und anschließend mit der Gasphasen- Aminosäure-Mikrosequenzier-Methode sequenziert. Die N-terminale Aminosequenz wurde mit
TGPVITGQYSSSADKWLSXXISAPXTLIK bestimmt, wobei X für eine nicht identifizierte Aminosäure steht.
Die Suche in Datenbänken (MIPSX) ergab keine homologen Sequenzen. Um auszuschließen, daß das Antigen in der Blut-Hirn-Schranke sich signifikant vom Erythro"- dsten- Antigen unterschied, wurde das Antigen aus Hir likro- gefäßen und Niere unter Verwendung derselben Verfahren gereinigt. Es wurden HPLC-Profile erhalten, die sehr ähnlich zu den in Fig. 2A gezeigten waren. Nach diesem Schritt war das HT7-Antigen aus Hirn und Niere homogen (Fig. 2C). Die N-terminalen Aminosäuresequenzen waren miteinander und mit dem Erythroblasten-Antigen iden¬ tisch. Um sicherzustellen, daß diese Sequenz vom echten HT7-Antigen stammt, wurde nach üblichen Verfahren ein Antiserum gec°n das synthetische Peptid TGPVITGQYSSSADK hergestellt. Da die Anti-r*eptid-Antikörper in Immuno¬ blots mit dem immun gereinigten Antigen reagi- en (Fig. 2D), konnte man folgern, daß aus unterschiedlichen Ge¬ weben das gleiche Antigen gereinigt wurde. Das Auftreten in Immunoblots als breite Bande, die Bin¬ dung an Concanavalin-Sepharose und der partielle Abbau durch Endoglykosidase F ließen vermuten, daß das Antigen glykosyliert ist. Behandlung der kultivierten Erythro¬ blasten mit Tunicamycin ergab eine Änderung des Moleku¬ largewichts des Antigens von ungefähr 52 kD auf 25 kD (Fig. 2D), was auf einen hohen Glykosylierungsgrad hin¬ weist. Weitere Sequenzinformation wurde durch Analyse von Fragmenten des HPLC-gereinigten Proteins nach Spal¬ tung mit Trypsin oder CNBr erhalten (Fig. 2E) .
Aufgrund der Aminosäuresequenz des CNBr-Fragments (Fig. 3A) wurden zwei Oligonukleotid-Primer konstruiert und für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. Es wurde ein resultierendes amplifiziertes DNA-Fragment mit der erwarteten Größe von 120 bp gefunden, das mit einem Pool von degenerierten Oligonukleotiden hybridi¬ sierte, der unter Verwendung einer internen Sequenz konstruiert wurde. Der als Kontrolle verwendete, andere Pool an degenerierten Oligonukleotiden hybridisierte nicht (Fig. 3B) . Das amplifizierte Fragment wurde in einen Vektor kloniert und zur Untersuchung einer Erythroblasten-λ-gtll-cDNA-Bank verwendet. Die Untersu¬ chung von 1,5 x 105 Klonen ergab 30 positive Klone.
Die Nukleotidsequenzanalyse einer 2 kb Insertion eines dieser Klone (4 cDNA-Klone wurden sequenziert, der Klon pCHT7.2 aus Fig. 3C entspricht einer cDNA mit voller Länge) ergab einen offenen Leserahmen, der sich vom ATG an Position 100 bis 103 bis zum Stopcodon (TGA) an Position 1013 bis 1016 erstreckte, gefolgt von einer 3 '-untranslatierten Region mit einem Poly(A)+ -Schwanz (Fig. 3D) . Im Leserahmen existieren zwei ATG-Codons an Position 100 bis 103 und 196 bis 199, von denen beide die Translation initiieren können, da die umgebenden Nukleotidsequenzen dei egeln der Translations-Initia- tion entsprechen (M. Kozak, Nucl. Acids Res. 15, 8125- 8148 (lf37)). Vermutlich wird die Translation durch das ATG an Position 196 bis 199 initiiert, da
1. eine ungewöhnlich lange (P. Rotwein, R.J. Folz und J.I. Gordon, J. biol. Chem. 262, 11807-11812 (1987)) Leadersequenz mit 58 Aminosäuren durch Initiation an Position 100 bis 103 entstehen würde, und
2. die Hydropathieanalyse (Fig. 3E) der erhaltenen Pro¬ teinsequenz eine typische hydrophobe Leadersequenz vorhersagt, die direkt nach dem zweiten ATG (Position 196 bis 199) beginnt.
Die Abspaltung des Signalpeptids geschieht vermutlich zwischen dem Alanin (-1)- und Threoninrest *-l), was mit der durch Aminosäuresequenz-Analyse erhaltenen N-termi- nalen Aminosäuresequenz übereinstimmen würde. Eine Transmembranregion, die einen typischen Membrananker mit basischen Aminosäuren enthält, erstreckt sich von Alanin (187) bis Isoleucin (207). Die Hydropathieanalyse des vorausgesagten Proteins stimmt mit diesen Interpreta¬ tionen überein (Fig. 3E).
Das vorhergesagte Molekulargewicht des reifen Proteins ist 24075 D, was in guter Übereinstimmung mit de Schät¬ zung von 25 kD steht, die nach Gelelektrophorese von mit Tunicamycin behandelten Erythroblasten erhalten wurde (Fig. 2D). Es existieren 5 potentielle Glykosylierungs¬ stellen: ASN 21, 80, 138, 144, 166. Die entsprechenden PTH-Aminosäuren waren nicht an den Positionen 21, 80 und 138 identifizieroar, was darauf hindeutet, daß minde¬ stens diese Reste im reifen Protein glykosyliert sein könnten. Aus den vom cDNA-Klon abgeleiteten 246 Aminosäuren wur¬ den 150 durch Aminosäure-Sequenzanalyse identifiziert (in Fig. 3D unterstrichen). Die vorausgesagte Amino¬ säuresequenz des cDNA-Klons stimmte mit allen erhaltenen Aminosäuresequenzen überein. Durch Untersuchung der MIPSX-Datenbank wurde bestätigt, daß dieses Gen zuvor noch nicht sequenziert wurde.
Die Anordnung der Nukleotidsequenz des HT7-Gens mit veröffentlichten Sequenzen erlaubt die eindeutige Ein¬ ordnung des HT7-Gens in die Immunglobulin-Superfamilie. Zwei Immunglobulin-artige Domänen mit dem charakteri¬ stischen ß-Faltblatt-Sandwich (vorhergesagt durch Chou- Fassmann-Analyse) , stabilisiert durch Disulfidbrücken, werden aus der Analyse von Homologie-Regionen und kon¬ servierten Cysteinresten vorhergesagt (Fig. 4A und D) . Ein Vergleich der Immunglobulin-Domänen des HT7-Proteins mit anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie weist darauf hin, daß es sich um solche des C2-Typs nach den Kriterien von Williams und Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405 (1988) handelt. Auf der Aminosäure¬ ebene beträgt die Gesamthomologie mit einem Protein gp70 (M. Ozawa, R.P. Huang, T. Furukawa und T. Muramatsu, J. Biol. Chem. 263, 3059-3062 (1988)) 30 %, bei dem es sich um ein Entwicklungs-reguliertes Maus-Gen mit unbekannter Funktion handelt. Die Homologie zum v-fms-Onkogen, das ein Wachstumsfaktor-Rezeptor ist (J. Woolford, A. McAuliffe und L.R. Rohrschneider, Cell 55, 965-977 (1988) ) beträgt 20 %.
In der Transmembran-Region wurde das Vorhandensein einer Reihe von Leucinresten gefunden. Ein als Leucin-Zipper bezeichnetes Motiv, das aus 4 bis 5, jede 7. Aminosäure wiederholten Leucinresten besteht, ist bedeutsam für die funktioneile Dimerisierung von DNA-bindenden Proteinen (T. Kouzarides und E. Ziff, Nature 336, 646-651 (1988), W.H. Landshultz, P.F. Johnson und S.L. McKnight, Science 243, 1681-1688 (1988). Es ist bekannt, daß das Leucin- Zipper-Motiv auch in Membran-Transport-Proteinen und Ionenkanälen auftritt (K. McCormack et al., Nature 340, 103 (1989) und M.K. White und M.J. Weber, Nature 340, 103-104 (1989)), seine Bedeutung jedoch in Frage ge¬ stellt wird (V. Brendel und S. Karlin, Nature 341, 574- 575 (1989)). In der HT7-Sequenz werden drei Leucinreste in der Transmembran-Region jede 7. Aminosäure wiederholt und ein Phenylalaninrest, der von einigen hydrophoben Aminosäuren umgeben ist, befindet sich an der erwarteten vierten Stelle. Es ist unbekannt, ob dies für einen funktionalen Zipper ausreichend ist, aber die Anwesen¬ heit dieses Motivs in homologen Proteinen (z.B. gp70 und CD8) der Immunglobulin-Superfamilie (Fig. 4B) ist er¬ staunlich. Es ist erwähnenswert, daß nur einige Proteine innerhalb der Immunglobulin-Familie dieses Motiv bein¬ halten. In Analogie zur Rolle des Zippers in DNA-bin¬ denden Proteinen und in Anbetracht der Untereinheiten- Struktur von vielen Proteinen der Immunglobulin-Super- familie, z.B. CD8 (P. Johnson und A.F. Williams, Nature 232, 74-76 (1986)), kann dies Bedeutung für Protein- Protein-Wechselwirkungen von Membranproteinen besitzen.
Ein neues Motiv, das im vorhergesagten cytoplasmatischen Ende des HT7-Gens kodiert ist, besitzt Homologie zu einer Sequenz des p53-Kernonkogens (Fig. 4C) (T. Soussi et al., Nucl. Acids Res. 16, 11383 (1988)). Es sind 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren identisch und einige in der Nachbarschaft konserviert (38 % Identität in 29 Aminosäuren), bisher wurde diese Sequenz noch nicht in Membranproteinen gefunden und ihre biologische Bedeutung ist unklar. Aufgrund der Homologien wird ein Modell für die Struktur des HT7-Proteins vorgeschlagen (Fig. 4D) .
Southern blots zeigten, daß das HT7-Gen nur einmal im Hühnergenom vorkommt (Fig. 5A) . Northern blots unter Verwendung von Poly A-RNA aus Hühnerhirn-Mikrogefäßen, Niere und Erythroblasten zeigten ein ähnliches majores Transkript mit 2 kb Länge (Fig. 5B). Im Vergleich zu Actin ist mehr mRNA, die für das HT7-Protein kodiert, in Erythroblasten als in Hirn-Mikrogefäßen anwesend.
Die Transfektion der cDNA unter Kontrolle eines Cyto- megalovirus-Promotors in COS-Zellen ergab die Expression des HT7-Proteins, wie durch Immunfluoreszenz mit mono- klonalen Antikörpern nachgewiesen wurde (Fig. 5C). Diese Experimente zeigen, daß das klonierte Gen für das HT7- Protein kodiert.
Bei dem HT7-Antigen handelt es sich um ein neues Pro¬ tein. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse handelt es sich um einen Rezeptor, der bei der Zelloberflächen- Erkennung an der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist. Der Ligand ist bisher unbekannt. Das HT7-Antigen ist ein spezifisches Protein von Hühner-Endothelzellen der Blut- Hirn-Schranke. Es wurde nicht in anderen Endothelzellen gefunden. Daher ist es ein Marker für ein organspezifi¬ sches Endothel. Es ist jedoch nicht gehirnspezifisch. Zusätzlich findet man Expression in Erythroblasten, Epithelzellen von Nierentubuli, Choroidplexus und Netzhaut-Pigmentschicht. Das läßt vermuten, daß das HT7- Protein an Transportvorgängen in diese Zellen teilnimmt. Es ist interessant, daß zwei andere Mitglieder der Immunglobulin-Familie, der Poly-Ig-Rezeptor und der Fc- Rezeptor transcytosierende Transportmoleküle in Epi¬ thelzellen sind (K.E. Mostov et al., Nature 308, 37-43 (1984) und N.E. Simister und K.E. Mostov, Nature 337, 184-187 (1989)). Das Vorhandensein solcher Transportmo¬ leküle wurde ebenso an der Blut-Hirn-Schranke postuliert (K.R. Duffy und W.M. Pardridge, Brain Res. 420, 32-38 (1987) ) .
Eine weitere mögliche Funktion des HT7-Proteins kann eine Rolle bei der Zelladhäsion sein. In kultivierten Hirn-Endothelzellen konzentrierte sich das Antigen in Bereichen mit Zell-Zell-Kontakt (Fig. IB). Es existiert eine gewisse Homologie des HT7-Proteins zu den Zell- Adhäsions-Molekülen ICAM (D.E. Staunton et al. , Nature 339, 61 (1989)) und N-CAM (B.A. Cunningham et al. , Science May 15, 799 (198"')), die ebenso zur Immunglobu¬ lin-Superfamilie gehören.
Trotz der Homologie mit dem v-fms-Onkogen ist das HT7- Protein wahrscheinlich kein Wachstumsfaktor-Rezeptor, da ( 1 ) seine Expression nicht mit dem Wachstumsstatus der Zelle übereinstimmt und (2) im cytoplasmatischen Ende Tyrosin-Phosphorylierungs-Stellen fehlen.
Zellulärer Transport, der durch spezifische Zellober¬ flächen-Rezeptoren vermittelt wird und Zell-Zell-Ad- häsion sind bedeutsame Aspekte der Bildung der Blut- Hirn-Schranke und ihrer Aufrechterhaltung (T.S. Reese und M.J. Karnovsky, J. Cell Biol. 34, 207- 217 (1967) und A.L. Betz und G.W. Goldstein, Annu. Rev. Physiol. 48, 241-250 (1986)). Das HT7-Protein kann ein wertvoller Marker zur Aufklärung dieser Prozesse und ihrer Störung unter pathologischen Bedingungen wie bei Gehirntumoren (D.R. Groothuise und N.A. Vick, TINS 5, 232-235 (1982)), Alzheimer Krankheit (C.L. Masters und K. Beyreuther, Neurobiol. Aging 9, 43-44 (1988)), AIDS (R.T. Johnson und J.C. McArthur, TINS 9, 91-94 (1986)) und Multiple Sklerose (H. Wekerle et al., TINS 9, 271-277 (1986)) sein. Das erfindungsgemäße HT7- Protein könnte auch zum spezifischen Transport von Arz¬ neimitteln in und möglicherweise durch die Blut-Hirn- Schranke verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung zusammen mit den Figuren 1A bis 5B erläutern. Es zeigen:
Fig. 1A Immunoblots des HT7-Antigens unter Verwendung polyklonaler HT7-Antikörper,
Fig. IB und C Immunfluoreszenz-Nachweis des HT7-Anti- gens,
Fig. 2A reverse Phase C4-HPLC des immungereinigten Erythroblasten HT7-Antigens,
Fig. 2B Immunoblots der Peakfraktionen,
Fig. 2C Immunoblots von immun- und HPLC-gereinigtem HT7-Antigen aus Hirn und Niere,
Fig. 2D Immunoblot-Analyse des HT7-Antigens,
Fig. 2E Aminosäuresequenzen des N-Terminus, des CNBr- Fragments und des Trypsinfragments von HPLC- gereinigtem HT7-Antigen,
Fig. 3A Konstruktion von Oligonukleotiden für die PCR- Reaktion,
Fig. 3B Hybridisierung des PCR-Fragments mit ver¬ schiedenen Oligonukleotid-Pools, Fig. 3C Restriktionskarte der cDNA-Klone pCHT7.1 und pCHT7.2,
Fig. 3D Nukleotidsequenz des HT7-Gens und davon abge¬ leitete Aminosäuresequenz,
Fig. 3E Hydropathieanalyse der vorhergesagten Amino¬ säuresequenz des HT7-Proteins,
Fig. 4A zum HT7 verwandte Aminosäuresequenzen,
Fig. 4B das vorgeschlagene Leucin-Zipper-Motiv des Proteins HT7,
Fig. 4C Homologie mit dem Onkoprotein p53,
Fig. 4D ein mögliches StruV - odeil für das HT7-Pro- tein,
Fig. 5A Southernblot-Analyse von Hühner-DNA,
Fig. 5B Northernblot-Analyse von Poly A+RNA aus ver¬ schiedenen Geweben,
Fig. 5C und D Expressionsnachweis des HT7-Antigens in
COS-Zellen
B e i s p i e l 1
Nachweis des HT7-Antigens in verschiedenen Geweben
Aus Hirn von erwachsenen Hühnern wurden Mikrogefäße durch eine einzige Pronase-Verdauung (0,5 % Gewicht/Vo¬ lumen in serumfreiem DMEM, eine Stunde bei 37°C) aus Stücken des Cerebral-Cortex isoliert, die von Meningen gereinigt waren. Die Mikrogefäße setzten sich nach Zen- trifugation (20 Minuten, 1000 g) in 25 % Rinderserumal- bumin in Salzlösung ab, während Neuralgewebe unter diesen Bedingungen schwamm. Mikrogefäße, Erythroblasten (H. Beug et al., J. Cell. Physiol. 115, 295-309 (1982)) und Stücke von Nierengewebe wurden in PBS, 1 mmol/1 Phenylmethyl-sulfonylfluorid homogenisiert, in SDS-Gelpuffer gekocht, durch Zentrifugation geklärt und auf das Gel geladen. Immunoblots unter Verwendung von HT7-Antikörpern wurden nach üblichen Verfahren durchge¬ führt. In DMEM, 10 % FCS (fötales Kälberserum) , 2 % Hühnerserum kultivierte Erythroblasten wurden geerntet, auf Glasplättchen ausgestrichen, fixiert und unter Ver¬ wendung monoklonaler HT7-Antikörper und Rhodamin mar¬ kierter sekundärer Antikörper gefärbt. Hirn- Endothelzellen wurden aus Embryogehirn (Tag 18) Mikro- gefaß-Fragmenten in DMEM, 10 % Kälberserum und 1 % Rinder-Netzhau extrakt (enthaltend Fibroblasten- Wachstumsfaktoren) wie bereits beschrieben, kultiviert (W. Risau et al., J. Cell Biol. (1989)). Endothel-Kolo- nien wurden durch die Expression von FVIIIrAg-vWF iden¬ tifiziert und mit monoklonalen HT7-Antikörpern (10 μg IgG pro ml) inkubiert. Anschließend wurden sie unter Verwendung von 4 % gepuffertem Paraformaldehyd fixiert und mit sekundären Rhodamin-markierten Antikör¬ pern gefärbt. Kontrollen unter Verwendung von Isotyp entsprechenden monoklonalen Antikörpern oder Präimmun¬ serum bei Immunfluoreszenz und Immunoblots waren jeweils negativ. Figur 1A zeigt 70 μg Protein von Hühnerhirn- Mikrogefäßen (Spur 1), Niere (2) und Erythroblasten (3), die durch PAGE in einem 7,5 bis 17,5%igen Polyacryl- amidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und unter Verwendung von polyklonalen HT7-Antikörpern immungeblottet wurden. Figuren IB und C zeigen indirekte Immunfluoreszenz von Hühnerhirn-Endothelzellen (B) und Erythroblasten (C) . B e i s p i e l 2
Reinigung des HT7-Antigens
Erythroblasten wurden in Bioreaktoren (1 1 ) unter kon¬ tinuierlichem Rühren kultiviert und durch Zentrifugation abgeerntet. Daraus wurden Plasmamembran-Proteine iso¬ liert (S. Hoffman et al., J. Biol. Chem. 257, 7720-7729 (1982)). Das HT7-Antigen wurde aus, mit Nonidet P40 solubilisierten Membranproteinen durch Immun-Affinitäts- Chromatographie gereinigt, wobei HT7 monoklonale Anti¬ körper gebunden an Sepharose verwendet wurden (2 mg IgG pro ml gepacktes Gel, 50 ml Gel). Das gebundene Material wurde mit gepuffertem 3,5 M Natriumthiocyanat eluiert, dialysiert, lyophilisiert, in Wasser aufgenommen und auf eine VYDAC-C4-reverse Phase Säule aufgetragen (25 cm, 4,5 mm Innendurchmesser). Das gebundene Material wurde mit Hilfe eines linearen Gradienten von 25 bis 75 % Lösungsmittel B eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden lyophilisiert und in Immunoblots analysiert (vgl. Bei¬ spiel 1). Die Aminosäuresequenzierung wurde mit einer Gasphasen-Mikrosequenzier-Apparatur von Applied Bio¬ systems durchgeführt. Die Festphasen-Peptidsynthese wurde in einem automatischen Peptid-Synthesizer von Applied Biosystems, Modell 431A unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren durchgeführt. Das Peptid wurde an Keyhole limpet Hämocyanin gebunden (H. Shapira et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 2461-2465 (1984)). Damit wurden Kaninchen immunisiert. Die Seren der Kaninchen wurden in Immunoblots getestet. Das HPLC- gereinigte HT7-Antigen wurde mit CNBr 10 % (Gew. /Vol.) in 70 % (V/V) Ameisensäure und Trypsin (Boehringer Mannheim, sequencing grade) gespalten und die Fragmente durch C4-reverse Phase HPLC-gereinigt. Figur 2A zeigt ein reverse Phase C4-HPLC-Diagraιm_ι des immungereinigten Erythroblasten-HT7-Antigens. Die Proteine in den ange¬ gebenen Peak-Fraktionen wurden lyophilisiert, auf einem 12%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und in Immunoblots analysiert (Figur 2B) . Das Antigen ist in Fraktion 4 enthalten, die bei 55 % Lösung B (95 % Acetonitril, 0,1 % TFA) eluiert. Das Antigen erscheint nach silver staining homogen (Figur 2B, Spur S, Pfeil). Das in Peak 2 eluierte Material ist hauptsächlich Nonidet P40. Figur 2C zeigt PAGE (Spuren 1 und 2) und Immunoblotanalyse (Spuren 3 und 4) von immungereinigtem und C4-HPLC-gereinigtem HT7-Antigen aus Gehirn (1,3) und Niere (2,4) Plasmamembran-Proteinen. Figur 2D zeigt eine Immunoblotanalyse des HT7-Antigens aus Hirn-Mikrogefäßen unter Verwendung von Antikörpern gegen das N-terminale Peptid (Spur 1). I munoblot-Analyse des HT7-Antigens nach Tunicamycin-Behandlung (1 μg/ml für 24 Stunden) von Erythroblasten ist in Spur 3 dargestellt. Eine immun- reaktive Bande mit 25 kD (Pfeil) wird nach Tunicamycin- Behandlung gefunden, während das 52 kD Antigen aus unbehandelten Zellen (Spur 2) verschwindet. Figur 2E zeigt die Aminosäuresequenzen des N-Terminus, des CNBr- Fragments und von Trypsinfragmenten des HPLC-gereinigten HT7-Antigens. X bedeutet eine nicht identifizierte Aminosäure.
B e i s p i e l 3
Isolierung und Charakterisierung des HT7-Gens
Oligonukleotide wurden mit einem Applied-Biosystems DNA- Synthesizer 381A hergestellt. Zu mRNA aus Erythroblasten (C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biology 7, 2745-2752 (1987)) komplementäre cDNA wurde nach bekannten Verfah¬ ren hergestellt (U. Gubler, Nucl. Acids Res. 16, 2726 (1988)) und als Matrize für die PCR-Reaktion (S.I. Girgis et al., Nucl. Acids Res. 16, 10371 (1988)) ver¬ wendet, wobei die degenerierten Sense- und Antisense- Primermoleküle (vgl. Figur 3A) bei den angegebenen Annealing-Te peraturen (Fig. 3B)verwendet wurden. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden auf 2,5%igen Agaro- segelen aufgetrennt, auf Nylonmembranen geblottet und mit den 2P-markierten Testoligonukleotiden hybridi¬ siert. Das 120 bp Fragment wurde eluiert und in den kommerziell erhältlichen Bluescript KS Vektor kloniert. Eine auf eine dem Fachmann bekannte Weise hergestellte Erythroblasten-λ-gtll-cDNA-Bank wurde unter Verwendung des 120 bp Fragments getestet. Insertionen von zwei positiven Klonen (von insgesamt 30) wurden sequenziert (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3918- 3921 (1979)), wie in Figur 3C angegeben. Figur 3A zeigt die Sequenz von Primer und Testoligonukleotiden für die PCR-Reaktion, beruhend auf der Aminosäuresequenz des CNBr-Fragments von HT7. Figur 3B zeigt Pool B der Test- Oligonukleotide (SOb), die eine starke Hybridisierung mit dem erwarteten 120 bp-Fragment (Pfeil) ergeben, während dagegen Pool A (SOa) negativ war. Figur 3C zeigt eine Restriktionskarte der cDNA-Klone pCHT7.1 und pCHT7.2. Die Pfeile bedeuten Richtung und Umfang der Nukleotidsequenz-Analyse. Figur 3D zeigt die Nukleotid- sequenz des HT7-Gens. Die zwei Initiations-Codons und die vermutete Transmembran-Region sind eingerahmt. Die vermutete hydrophobe Signalsequenz, die Polyadenylie- rungssignale und die durch Aminosäure-Sequenzierung bestimmten Aminosäuren sind unterstrichen. Potentielle N-Glykosylierungsstellen sind durch Sternchen gekenn¬ zeichnet. Es existieren drei zusätzliche kurze offene Leserahmen (Nukleotide 37 bis 78, 1390 bis 1476, 1492 bis 1506). Figur 3E zeigt einen Hydropathie-Blot der vermuteten Aminosäuresequenz des HT7-Proteins unter Verwendung des Algorithmus von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).
B e i s p i e l 4
Zum HT7-Protein verwandte Sequenzen
Verwandte Immunglobulin-Sequenzen zu HT7 wurden unter Berücksichtigung der durch die Chou-Fasman-Analyse (P.Y. Chou und G.D. Fasman, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47, 45-148 (1978)) vorhergesagten ß-Falt¬ blatt-Struktur untersucht. Identische Aminosäuren sind umrahmt. Figur 4D zeigt das vermutete Leucin-Zipper- Motiv. Leucin- oder Isoleucinreste, die am hypo¬ thetischen Zipper teilnehmen, sind umrahmt. Figur 4C zeigt die Homologie des HT7-Proteins mit dem Onkoprotein p53. Figur 4D stellt ein mögliches Strukturmodell für das HT7-Protein dar. Die durch Disulfidbrücken zusam¬ mengehaltenen Kreise stellen mögliche Immunglobulin- Domänen dar. Angenommene N-Glykosylierungsstellen sind mit kleinen Kreisen gekennzeichnet.
B e i s p i e l 5
Expression des HT7-Proteins in COS-Zellen
Hochmolekulare genomische Hühner-DNA wurde aus der Leber eines erwachsenen Huhns hergestellt. Jeweils Proben von 20 μg wurden durch Restriktionsenzyme gespalten, auf einem 0,9%igen Agarosegel aufgetragen und auf Genescreen Nylonmembranen (DuPont) geblottet. 5 μg Poly-A-RNA, isoliert aus den jeweiligen Geweben (P. Chomczynski und N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)), wurde in einem 0,9-igen Formaldehyd denaturierenden Agarosegel elektrophoretisiert und auf einen Hybond-N-Nylonfilter (Amersham) geblottet. Die Hybridisierungsreaktionen wurden in einer 50%igen Formamidlösung, 5X SSC, 5X Denhardt's Lösung, 5 % SDS und 100 μg/ml Lachssperma- DNA 12 Stunden lang bei 42°C durchgeführt. Es wurden dreimal mit 0,lxSSC, 1 % SDS jeweils 15 Minuten bei 65°C gewaschen. Das EcoRI/Pstl-Fragment des pCHT7.2-Klons (Fig. 3A) wurde in den Vektor pCMV (S. Andersson et al., J. Biol. Chem. 264, 8222-82229 (1989)) kloniert und damit COS-Zellen transfiziert (P. Chomczynski und N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). Indirekte Immunofluoreszenz wurde wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Kontrollexperimente bei Verwendung des pCMV-Vektors alleine ebenso wie mit Isotyp-artigen monoklonalen Antikörpern waren negativ. Figur 5A zeigt eine Southern-Blot-Analyse von mit BamHI, EcoRI und PstI gespaltener Hühner-DNA. Es ist daraus ersichtlich, daß das HT7-Gen nur einmal im Hühnergenom vorkommt. Figur 5B zeigt eine Nothern-Blot-Analyse von Poly-A-RNA aus Gehirn (Spur 1), Niere (2) und Erythroblasten (3). Die Blots wurden mit dem 120 bp-Fragment aus Figur 3C hybridisiert. Figur 5C und D zeigen die Expression des HT7-Proteins durch transfizierte COS-Zellen. Indirekte Immunfluoreszenz (C) und Phasenkontrast (D) von COS- Zellen unter Verwendung von HT7 monoklonalen Antikörpern wurden durchgeführt. 20 bis 30 % der Zellen zeigten helle Membranen und intrazelluläre Fluoreszenz. Die Vergrößerung ist 250fach.

Claims

- , -P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Membranprotein mit zwei Immunblobulin-artigen Domä¬ nen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es
(a) die aus Figur 3D ersichtliche Aminosäure-Sequenz besitzt,
(b) eine natürlich vorkommende, allelische Variation dieser Aminosäuresequenz besitzt oder
(c) eine dazu homologe Sequenz besitzt, die einem Protein mit im wesentlichen denselben biologi¬ schen Aktivitäten und Funktionen entspricht.
2. Membranprotein nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es glykosyliert ist.
3. Rekombinante DNA, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie
(a) die aus Figur 3D ersichtliche Nukleotidsequenz besitzt,
(b) eine ihr im Rahmen der Degeneration des geneti¬ schen Codes entsprechende Sequenz besitzt oder
(c) eine homologe Sequenz besitzt, die für ein Pro¬ tein mit im wesentlichen denselben biologischen Aktivitäten und Funktionen wie die in Figur 3D dargestellte Aminosäuresequenz kodiert.
4. Rekombinanter Vektor, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß er eine oder mehrere Kopien der rekombinanten DNA nach Anspruch 3 enthält. _ 2\ -
5. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es ein Derivat des Vektors pCMV ist.
6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach An¬ spruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Zellinie, die das Protein exprimiert, kultiviert und das Protein auf übliche Weise aus den Membranpro¬ teinfraktionen gewinnt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellinie eine Erythroblasten- oder eine Hirnendothelzellinie ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach An¬ spruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Zellen mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 3 oder einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transfor¬ miert, in einem geeigneten Medium kultiviert und das Protein auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Medium gewinnt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zelle eine COS-Zelle ist.
10. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 beim Transport von Arzneimitteln oder toxischen Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke.
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Title
The EMBO Journal, Band 5, Nr. 11, November 1986, IRL Press Ltd, W. Riseau et al.: "Brain induces the expression of an early cell surface marker for blood brain barrier-specific endothelium", Seiten 3179-3183 *
The EMBO Journal, Band 9, Nr. 7, Juli 1990, Oxford University Press, H. Seulberger et al.: "The inducible blood-brain barrier specific molecule HT7 is a novel immunoglobulin-like cell surface glycoprotein", Seiten 2151-2158 *

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