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Hinweis auf staatliche
Förderung
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Die
Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung, Fördernummern NS24679 und CA53524
gemacht. Der Staat hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
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Verwandte Anmeldungen
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Die
Anmeldung ist eine Teilfortsetzung der Anmeldung Nr. 08/881,172,
angemeldet am 23. Juni 1997, welche eine Teilfortsetzung der Anmeldung
Nr. 08/615,944, angemeldet am 14. März 1996, und eine Teilfortsetzung
der Anmeldung PCT/US97/03461, angemeldet am 14. März 1997,
ist.
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Hintergrund der Erfindung
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(1) Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft allgemein Nahrungs- oder Wachstumsfaktoren und
insbesondere neue Wachstumsfaktoren der Neurturin-GDNF-Familie von
Wachstumsfaktoren.
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(2) Beschreibung des Standes
der Technik
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Die
Entwicklung und die Instandhaltung von Geweben in komplexen Organismen
erfordert die präzise Kontrolle über die
Prozesse der Zellvermehrung, -differenzierung, des Zellfortbestands
bzw. -überlebens
und der Zellfunktion. Ein Hauptmechanismus, durch den die Prozesse
kontrolliert bzw. reguliert werden, verläuft über die Wirkungen von Polypeptiden,
welche als "Wachstumsfaktoren" bekannt sind. Diese
strukturell unterschiedlichen Moleküle wirken durch spezifische
Zelloberflächenrezeptoren
unter Hervorrufen dieser Wirkungen.
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Wachstumsfaktoren,
bezeichnet als "neurotrophe
Faktoren", fördern die
Differenzierung, das Wachstum und den Fortbestand/das Überleben
von Neuronen und befinden sich in dem Nervensystem oder in innervierten
Geweben. Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) war der erste neurotrophe
Faktor, welcher identifiziert und charakterisiert wurde (Levi-Montalcini
et al., J. Exp. Zool. 116: 321, 1951, welches als Referenz aufgenommen
wird). NGF existiert als ein nicht-kovalent gebundenes Homodimer,
welches das Überleben
und das Wachstum von sympathischen, Neuralleisten-abgeleiteten Sensoren
und von cholinergen Basalvorderhirnneuronen fördert. In sympathischen Neuronen
bildet diese Substanz einen Neurit-Auswuchs in vitro und ein erhöhtes axonales
und dendritisches Wachstum in vivo. (Siehe Levi-Montalcini und Booker, Proc Nat'l Acad Sci 46: 384,
1960; Johnson et al. Science 210: 916–918, 1980; Crowley et al.,
Cell 76: 1001–12,
1994, welche als Referenz aufgenommen werden).
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NGF
weist Wirkungen auf die Erkennung und neuronale Formbarkeit auf
und kann den Fortbestand bzw. das Überleben von Neuronen, welche
aufgrund einer Vielzahl von mechanischen, chemischen, viralen und
immunologischen Einflüssen
einen Schaden erlitten haben, unterstützen bzw. fördern (Snider und Johnson,
Ann Neurol 26: 489–506,
1989; Hefti, J Neurobiol 25: 1418–35, 1994, welche hierin durch
Bezugnahme aufgenommen sind). NGF ist ebenso dafür bekannt, mit dem endokrinen
System und Immun- und Entzündungsprozessen
erheblich wechselzuwirken. (Zusammengefasst in Scully und Otten,
Cell Biol Int 19: 459–469, 1995;
Otten und Gadient, Int. J. Devl Neurosci 13: 147–151, 1995, welche hierin durch
Bezugnahme aufgenommen sind). Beispielsweise fördert NGF das Überleben
von Mastzellen. (Horigome et al. J Biol Chem 269: 2695–2707, 1994,
welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist).
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In
den vergangenen Jahren zeigte sich, dass Wachstumsfaktoren sich
in Klassen, d. h. Familien oder Superfamilien, auf der Basis von Ähnlichkeiten
in deren Aminosäuresequenzen
einteilen lassen. Diese Familien umfassen beispielsweise die Familie
der Fibroblast-Wachstumsfaktoren, die Neurotrophin-Familie und die Familie
der transformierenden Wachstumsfaktoren-beta (TGF-β). Als ein
Beispiel für
Familienmitglied-Sequenzähnlichkeiten
besitzen die TGF-β-Familienmitglieder
sieben kanonische Gerüst-Cystein-Reste,
welche die Mitglieder dieser Superfamilie identifizieren.
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NGF
ist der Prototyp solch einer Familie von Wachstumsfaktoren. Der
Hirn-abgeleitete neurotrophe Faktor (brain-derived neurotrophic
factor, BDNF), das zweite Mitglied dieser entdeckten Familie, zeigte
sich als zu NGF verwandt aufgrund des Erhalts sämtlicher sechs Cysteine, welche
die drei inneren Disulfide des NGF-Monomeren bilden (Barde, Prog
Growth Factor Res 2: 237–248,
1990 und Liebrock et al. Nature 341: 149–152, 1989, welche als Referenz
aufgenommen werden). Unter Verwendung der durch BDNF vermittelten Information über die
hochkonservierten Anteile der zwei Faktoren wurden zusätzliche
Mitglieder (NT-3, NT-4/5) dieser Neutrotrophinfamilie durch verschiedene
Gruppen schnell gefunden (Klein, FASEB J 8: 738–44, 1994, welches als Referenz
aufgenommen wird).
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Strukturell
zu NGF unverwandte neutrotrophe Faktoren wurden kürzlich identifiziert.
Diese umfassen Faktoren, welche ursprünglich auf der Basis einer "neurotrophen Wirkung" isoliert wurden,
wie der ziliäre
neurotrophe Faktor (CNTF) (Lin et al., Science 246: 1023–5, 1989,
welches als Referenz aufgenommen wird), zusammen mit anderen ursprünglich als
ein Ergebnis von nicht-neuronalen Aktivitäten isolierten Faktoren (z.
B. Fibroblast-Wachstumsfaktoren (Cheng und Mattson, Neuron 1: 1031–41, 1991,
welches als Referenz aufgenommen wird), IGF-I (Kanje et al, Brain
Res 486: 396–398,
1989, welches als Referenz aufgenommen wird), Leukämie-inhi bierender
Faktor (Kotzbauer et al., Neuron 12: 763–773, 1994, welches als Referenz
aufgenommen wird)).
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Der
Glial-abgeleitete neurotrophe Faktor (GDNF) ist ein solcher neurotropher
Faktor, welcher strukturell unverwandt zu NGF ist. GDNF war folglich
ein einzigartiger Faktor, welcher bis jetzt nicht als ein Mitglied irgendeiner
Subfamilie von Faktoren bekannt war. Die Entdeckung, Reinigung und
Klonierung von GDNF ergab sich aus der Suche nach Faktoren, welche
für das Überleben
von dopaminergen Mittelhirnneuronen entscheidend sind, welche in
der Parkinsonschen Krankheit degenerieren. GDNF wurde aus Ratten-B49-Glial-Zellen-konditionierten
Medien (Lin et al., Science 260: 1130–2, 1993) aufgereinigt. Die
Sequenzanalyse zeigte, dass es ein entferntes Mitglied der TGF-β-Superfamilie
von Wachstumsfaktoren mit ungefähr
20 % Identität
in erster Linie auf der Basis der charakteristischen Aneinanderreihung
(Alignment) der sieben kanonischen Gerüstcysteinreste ist (Lin et
al., Science 260: 1130–2,
1993, welches als Referenz aufgenommen wird). Folglich könnte GDNF
möglicherweise
eine neue Unterfamilie innerhalb der TGF-β-Superfamilie darstellen.
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In
Bakterien gebildetes rekombinantes GDNF fördert spezifisch den Fortbestand
bzw. das Überleben und
die morphologische Differenzierung von dopaminergen Neuronen (Lin
et al., Science 260: 1130–2,
1993); Tomac et al., Nature 373: 335–9, 1995; Beck et al., Nature
373: 339–41,
1995 und Ebendal et al., J Neurosci Res 40: 276–84, 1995, welche als Referenz
aufgenommen werden) und Motorneuronen (Henderson et al., Science
266: 1062–4,
1994; Yan et al., Nature 373: 341–4, 1995; Oppenheim et al.,
Nature 373: 344–6,
1995, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind). Insgesamt
war GDNF ein potenterer Faktor für
die Förderung
des Fortbestands bzw. das Überleben
von Motorneuronen als die anderen Faktoren, und es war der einzige
Faktor, welcher eine neuronale Atrophie als Antwort auf diese Läsionen verhinderte,
wodurch es sich als ein vielversprechendes Therapeutikum für Motorneuronerkrankungen
darstellte.
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Es
wird jetzt allgemein angenommen, dass neurotrophe Faktoren viele
Aspekte der neuronalen Funktion regulieren, einschließlich des
Fortbestands bzw. Überlebens
und der Entwicklung im fötalen
Stadium, sowie der strukturellen Beständigkeit und Formbarkeit im
Alter. Da sowohl akute Nervensystemerkrankungen als auch chronische
neurodegenerative Erkrankungen durch strukturelle Schädigungen
und möglicherweise durch
erkrankungsinduzierte Apoptose gekennzeichnet sind, ist es wahrscheinlich,
dass neurotrophe Faktoren in diesen Erkrankungen eine gewisse Rolle
spielen. In der Tat sprechen viele Beweise dafür, dass neurotrophe Faktoren
wertvolle therapeutische Mittel zur Behandlung dieser neurodegenerativen
Erkrankungen/Bedingungen darstellen können, welche möglicherweise
die sozial und ökonomisch
zerstörerischsten
Erkrankungen darstellen, welche derzeit unsere Gesell schaft bedrohen.
Nichtsdestotrotz verbleibt ein anhaltender Bedarf an der Identifizierung
neuer Mitglieder von Familien neurotropher Faktoren zur Verwendung
in der Diagnose und Behandlung von einer Vielzahl von akuten und
chronischen Erkrankungen des Nervensystems, weil unterschiedliche
neurotrophe Faktoren potenziell vorzugsweise durch unterschiedliche
Rezeptoren und auf unterschiedliche neuronale oder nicht-neuronale
Zellarten wirken.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Kurz
gesagt richtet sich die vorliegende Erfindung daher auf die Identifizierung
und Isolierung von im Wesentlichen aufgereinigten Faktoren, welche
den Fortbestand bzw. das Überleben
und das Wachstum von Neuronen sowie von nicht-neuronalen Zellen
unterstützen.
Folglich hatten die Erfinder hierin Erfolg in der Entdeckung neuer
Proteinwachstumsfaktoren, welche zu einer Familie von Wachstumsfaktoren
gehören,
für die GDNF
das erste bekannte Mitglied war. Das erste solche neu entdeckte
Familienmitglied war Neurturin. Auf der Basis der Sequenz von GDNF
und Neurturin haben die Erfinder hierin ein weiteres Mitglied der
GDNF-Neurturin-Familie von Wachstumsfaktoren entdeckt, welches hierin
als Persephin (PSP) bezeichnet wird. Man nimmt an, dass dieser Wachstumsfaktor
mindestens 75% Sequenzidentität
unter homologen Sequenzen unterschiedlicher Säugerarten zeigt, obwohl die
Sequenzhomologie in Nichtsäuger-Arten,
wie bei Vogelarten, lediglich 65% betragen kann. Tatsächlich zeigen
die reifen Maus-, Ratten- und Menschpersephin-Sequenzen von ungefähr 80% bis ungefähr 94% Sequenzidentität. Reife
Persephinproteine, welche hierin angegeben sind, umfassen Maussequenzen,
wie sie in den SEQ ID NOS: 79 und 187 angegeben sind (1B; jeweils die Aminosäuren 66 bis 154 und 61 bis
156), Rattensequenzen, wie sie in den SEQ ID NOS: 82 und 196 angegeben
sind (2B; jeweils Aminosäuren 6 bis
94 und 1 bis 96), und Menschsequenzen, wie sie in den SEQ ID NOS:
221 und 223 angegeben sind.
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Persephin
wurde durch ein Verfahren, welches auf den erhaltenen konservierten
Regionen der GDNF-Neurturin-Familie beruht, von den Erfindung hierin
identifiziert und erhalten. Dementsprechend wurde ein neues Verfahren
entwickelt, welches degenerierte Primer, die aus den Sequenzen dieser
erhaltenen konservierten Regionen aufgebaut sind, zur Verwendung
in dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren verwendet. Unter Verwendung
dieses Verfahrens wurden die Maus-, Ratten- und Menschorthologen des neuen Familienmitglieds,
Persephin, identifiziert und erhalten.
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Das
vorliegende Verfahren offenbart folglich sowohl Aminosäuresequenzen
als auch Nucleotidsequenzen, welche für menschliches Persephin kodieren,
einschließlich
der Aminosäuresequenzen
von SEQ ID NOS: 221 und 223 und der Nucleotidsequenzen von SEQ ID
NOS: 183, 193 und 199 und 201 sowie der Komplementäre sol cher
Nucleotidsequenzen (SEQ ID NOS: 184, 194, 200 und 202). Zusätzlich schließt die vorliegende
Erfindung Pre-, Pro- und Pre-Pro-Bereiche ebenso wie Pre-Pro-Persephinaminosäure- und
-nucleotidsequenzen ein.
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Erfindungsgemäß wird folglich
ein isolierter und gereinigter Wachstumsfaktor vorgesehen, welcher
die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 217 oder SEQ ID NO: 223 umfasst,
wobei der Wachstumsfaktor das Überleben
in Mittelhirnzellen fördert.
Die Erfindung stellt auch zur Verfügung:
- – einen
isolierten und gereinigten Wachstumsfaktor, umfassend eine Persephin-Sequenz, wie in SEQ
ID NO: 217, SEQ ID NO: 221 oder SEQ ID NO: 223 dargestellt;
und
- – ein
isoliertes und gereinigtes Polypeptid, umfassend:
(a) einen
Pre-Pro-Abschnitt von Persephin, wie dargestellt in SEQ ID NO: 218;
(b)
einen Pre-Abschnitt von Persephin, wie er in SEQ ID NO: 219 dargestellt
ist; oder
(c) einen Pro-Abschnitt von Persephin, wie er in
SEQ ID NO: 220 dargestellt ist.
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Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereit,
umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend für einen erfindungsgemßen Wachstumsfaktor
oder ein Fragment der Nucleotidsequenz umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nucleotide, oder ein Nucleinsäuremolekül, welches dazu
komplementär
ist.
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Zusätzlich liefert
die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül umfassend:
- (a) eine Pre-Pro-Persephin-Nucleotid-Sequenz,
wie in SEQ ID NO: 203 dargestellt, oder das Komplement davon;
- (b) einen Pre-Pro-Abschnitt eines Persephin-Polynucleotids,
wie in SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215 dargestellt, oder das Komplement
von einem der beiden;
- (c) einen Pre-Abschnitt eines Persephin-Polynucleotids, wie
in SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 dargestellt, oder das Komplement
von einem der beiden;
- (d) einen Pro-Abschnitt eines Persephin-Polynucleotids, wie
in SEQ ID NO: 211 dargestellt, oder das Komplement davon; oder
- (e) ein Fragment einer Sequenz, wie sie in irgendeinem von (a)
bis (d) dargestellt ist, umfassend mindestens 15 zusammenhängende Nucleotide,
worin das Fragment nicht in SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 190 oder
dem Komplement von einem der beiden auftritt.
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Expressionsvektoren
und stabil transformierte Zellen, umfassend Persephin-Polynucleotide, sind ebenfalls
innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung. Die transformierten
Zellen können
in einem Verfahren zur Herstellung von Persephin verwendet werden.
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Folglich
stellt die Erfindung ein rekombinantes Verfahren bereit, umfassend:
- (a) Subklonieren eines Polynucleotids, welches
für den
Wachstumsfaktor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert, in einen
Expressionsvektor, umfassend Regulationselemente, operabel verknüpft mit
dem Polynucleotid;
- (b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor;
- (c) Anwachsen der Wirtszelle in einer Wirtszellenkultur; und
- (d) Gewinnen des Wachstumsfaktors und/oder des Polynucleotids
aus der Wirtszellenkultur.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Persephins
zur Vorbeugung oder Behandluung von zellulärer Degeneration verwendet
werden. Ebenfalls kann ein Patient durch Implantieren von transformierten
Zellen, welche Persephin exprimieren, oder einer DNA-Sequenz, welche
für Persephin
kodiert, in einen Patienten, oder von Zellen, welche in Persephin
kultiviert oder durch Wachstum vermehrt wurden, behandelt werden.
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Die
Erfindung stellt folglich bereit:
- – einen
erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor
oder ein Polynucleotid, welches für einen solchen Wachstumsfaktor
kodiert, zur Verwendung in der Vorbeugung oder Behandlung von Zelldegeneration
oder -insuffizienz in einem Individuum,
- – Verwendung
eines Wachstumsfaktors der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments
zur Verwendung in der Behandlung einer Zelldegeneration oder -insuffizienz,
wobei die Zelldegeneration oder -insuffizienz (a) eine neuronale
Degeneration ist, die verursacht wird durch eine periphäre Neuropathie,
amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer Krankheit, Parkinsonsche Krankheit,
Hungtington Erkrankung, Ischämischen
Infarkt, akute Hirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumore
des Nervensystems, Multiple Sklerose oder Infektionen; (b) hämatopoetische
Zelldegeneration oder -insuffizienz, die verursacht wird durch Eosinopenie,
Basopenie, Lymphopenie, Monocytopenie, Neutropenie, Anämien, Thrombocytopenie
oder Stammzell-Insuffizienzen
davon; oder (c) Herzmuskeldegeneration oder -insuffizienz, die verursacht
wird durch Kardiomyopathie oder kongestive Herzinsuffizienz;
- – eine
mit einem erfindungsgemäßen Vektor
transformierte Zelle, und welche den erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor
exprimiert zur Verwendung in der Vorbeugung oder Behandlung von
Zelldegeneration oder -insuffizienz in einem Individuum;
- – ein
Verfahren zur Detektion der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in
einer Probe aus einem Patienten, umfassend Detektion und/oder Quantifizierung
der An wesenheit in der Probe von mRNA, kodierend für einen
erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor;
- – ein
in vitro Verfahren zur Detektion von Persephin-Gen-Veränderungen,
umfassend Nachweisen der Anwesenheit eines nicht-inakten Persephingens
in einer Zelle wobei die Anwesenheit des nicht-intakten Gens die
Anwesenheit von Genveränderungen
anzeigt;
- – Verfahren
zur Förderung
des Wachstums und/oder der Differenzierung einer Zelle in einem
Kulturmedium, umfassend Zugeben zu dem Kulturmedium den erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor;
- – ein
isoliertes und gereinigtes Antisense-Polynucleotid, umfassend eine
Sequenz komplementär
zu einer Nucleotid-Sequenz der Erfindung mit der Fähigkeit
zur Hybridisierung mit einer natürlich
vorkommenden DNA- oder mRNA-Polynucleotid-Sequenz, kodierend für Persephin
zur Verhinderung der Transkription und/oder Translation eines kodierten
Persephinpolypeptids; und
- – ein
Antisense-Polynucleotid, wie oben beschrieben, zur Verwendung in
der Behandlung einer Erkrankung, ausgelöst durch Expression von Persephin
in einer Zellpopulation.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso Zusammensetzungen und Verfahren
zur Detektion von Persephin zur Verfügung. Ein Verfahren basierend
auf Persephin-Antikörpern,
und andere Verfahren beruhen auf der Detektion von mRNA oder cDNA
oder Genom-DNA, welche für
Persephin kodieren, unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken.
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Die
Erfindung stellt folglich bereit:
- – isolierte
und gereinigte Antikörper,
welche zur spezifischen Reaktion mit einem erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor
oder einem Epitop davon in der Lage sind;
- – ein
Verfahren zur Detektion der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in
einer Probe aus einem Patienten, umfassend Reagierenlassen der Antikörper, wie
oben beschrieben, mit einem Wachstumsfaktor, welcher in einer Probe
anwesend ist, und Detektion des Bindens der Antikörper an
den Wachstumsfaktor; und
- – ein
Kit zur Detektion der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer
Probe aus einem Patienten, umfassend Antikörper, wie oben beschrieben,
welche in der Lage sind, detektierbar mit dem Wachstumsfaktor zu
reagieren, verpackt in einem Behälter.
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Unter
den zahlreichen gefundenen Vorteilen, welche von der vorliegenden
Erfindung erzielt werden, können
daher die Bereitstellung eines neuen Wachstumsfaktors, Persephin,
zur Verwendung in der Vorbeugung von Atrophie, der Degeneration
oder dem Tod von bestimmten Zellen, insbesondere Neuronen, das heißt zur Vorbeugung
oder Behandlung von Erkrankungen, hervorgerufen durch zelluläre Degenerati on,
und im Besonderen neuronaler Degeneration; die Bereitstellung von
menschlichem Persephin; die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung
von Persephin durch rekombinante Techniken; die Bereitstellung von
Verfahren, welche Persephingehalte in einer Probe aus einem Patienten
detektieren und verfolgen bzw. aufzeichnen können; und die Bereitstellung
von in vitro Verfahren, welche Veränderungen in dem Persephin-Gen
detektieren können,
genannt werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen/Figuren
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Die 1 zeigt (A) Mauspersephin-Gen in voller
Länge (SEQ
ID NO: 177) mit Pfeilen, die ein 88 Basenpaar Intron von Positionen
155–242
anzeigen, und (B) die Nucleotidsequenz von Maus-Pre-Pro-Persephin (SEQ
ID NO: 179) mit kodierter Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 185);
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2 zeigt (A) Rattenpersephin-Gen in voller
Länge (SEQ
ID NO: 188) mit Pfeilen, die ein 88 Basenpaar Intron von Positionen
155–242
anzeigen, und (B) die Nucleotidsequenz von Ratten-Pre-Pro-Persephin (SEQ
ID NO: 190) mit kodierter Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 196);
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3 zeigt chimäre Mausmoleküle (A) PSP/NTN,
enthaltend das Persephinfragment (Reste 1–63) und das Neurturinfragment
(Reste 68–100)
und (B) NTN/SPS, enthaltend das Neurturinfragment (Reste 1 bis 67)
und das Persephinfragment (Reste 64 bis 96) mit Pfeilen, die den
Kreuzpunkt (crossover point) in beiden anzeigen;
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4 zeigt den überlebensfördernden Effekt von Persephin
in Maus-Mittelhirnzellen am embryonalen Tag 14, kultiviert innerhalb
von drei Tagen (a) in Abwesenheit von Persephin, wobei fast alle
Zellen abgestorben sind, und (b) in Anwesenheit von Persephin (100
ng/ml), wobei ein deutliches Überleben
der neuronalen Zellen ersichtlich ist;
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5 zeigt
RT/PCT-Studie für
Persephinexpression in Geweben von adulten Mäusen, welche Persephinexpression
in Nierenzellen zeigen.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung, Isolierung
und Sequenzierung eines DNA-Moleküls, welches für einen
neuen Wachstumsfaktor, Persephin, kodiert. Persephin fördert das
Zellüberleben
und insbesondere das Überleben
von neuronalen Zellen. Vor dieser Erfindung war Persephin unbekannt und
war weder als eine einzelne biologische Substanz identifiziert,
noch war es in reiner Form isoliert.
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Der
Wachstumsfaktor Neurturin (NTN) wurde wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung
Nr. 08/519,777, eingereicht am 28. August 1995, angegeben identifiziert
und isoliert. Aus der Sequenz von Neurturin und der Sequenz des
eng verwandten Wachstumsfaktors, des Glial-abgeleiteten neurotrophen
Faktors (GDNF), haben die Erfinder hierin Strategien entwickelt
und verfolgt, um zusätzliche
verwandte Faktoren aufzufinden. Neurturin ist ungefähr zu 40%
identisch mit GDNF, allerdings weniger als 20% identisch mit irgendeinem
anderen Mitglied der TGF-β-Superfamilie.
Zusammen definieren diese beiden Proteine eine neue Subfamilie innerhalb
der TGF-β-Superfamilie.
Zahlreiche Sequenzabschnitte innerhalb von Neurturin und GDNF wurden
identifiziert, welche hochkonserviert sind, so dass sie mit hoher
Wahrscheinlichkeit in jedem zusätzlichen
Mitglied dieser Subfamilie vorliegen. Diese Sequenzinformation kann
daher verwendet werden, um vorher unbekannte Mitglieder dieser Subfamilie
durch den Entwurf von degenerierten Oligonucleotiden zu isolieren,
welche entweder als Primer in PCR-Reaktionen oder als Sonden in
Hybridisierungsstudien verwendet werden.
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Unter
Verwendung der PCR-Strategie mit dem neu degenerierten Primer, wie
in Beispiel 11 der ebenfalls anhängigen
Anmeldung Nr. 08/519,777 beschrieben, konnten die Erfinder hierin
einen dritten Faktor, Persephin, identifizieren, welcher ungefähr 40–50% identisch
zu sowohl GDNF als auch Neurturin ist. Die der Aminosäuresequenz
von erhaltenen/konservierten Abschnitten von Neurturin und GDNF
entsprechenden Primer (SEQ ID NO: 42 und SEQ ID NO: 44) wurden zur
Amplifizierung/Verstärkung
eines 77 nt-Fragments aus Rattengenom-DNA verwendet. Die resultierenden
Produkte wurden in das Bluescript-KS-Plasmid subkloniert und sequenziert.
Die Sequenz eines der amplifizierten Produkte sagte Aminosäuresequenzdaten,
intern in den PCR-Primern, voraus, welche von denen von GDNF oder
Neurturin unterschiedlich waren, wiesen aber mehr als 20% Identität mit GDNF
und Neurturin auf, wohingegen die Sequenzen anderer amplifizierter
Produkte, die wir erhalten haben, GDNF oder Neurturin entsprachen,
wie es erwartet wurde. Die 22-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 90) wurde
anschließend
mit den Rattensequenzen von GDNF und Neurturin aneinandergereiht/alignt und
als einzigartig gefunden. Diese neue Sequenz legte daher nahe, dass
ein neues Familienmitglied identifiziert worden war, welches hierin
als Persephin bezeichnet wird.
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Um
zusätzliche
Persephin-Sequenzinformationen zu erhalten, wurden Primer, welche
die einzigartige 22-Nucleotidsequenz des amplifizierten Fragments
enthalten, in der Technik der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden
(RACE-Technik) verwendet (Frohman M.A. Methods in Enzymology 218:
340–356,
1993), wobei cDNA verwendet wurde, die aus neonatalem Rattenhirn
erhalten wurde. Ein ungefähr
350 nt-Fragment
wurde in dieser PCR-Reaktion erhalten, welches eine Rattenpersephin-c-DNA-Teilsequenz von
ungefähr
350 Nucleotiden (SEQ ID NO: 106) darstellte. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz
dieser cDNA wurde mit der von GDNF und Neurturin verglichen, und
es wurde gefunden, dass sie ungefähr 40% Identität mit jedem
die ser Proteine aufwies. Wichtigerweise war der charakteristische
Abstand der kanonischen Gerüstcysteinreste
in den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie
anwesend. Darüber
hinaus war zusätzlich
zu dem Ähnlichkeitsabschnitt,
welcher durch die zur Isolierung von Persephin verwendeten degenerierten
Primer kodiert wird, ein weiterer Abschnitt hoher Homologie, welcher
von GDNF und Neurturin geteilt wird, allerdings in anderen Mitgliedern
der TGF-β-Superfamilie
nicht vorliegt, ebenso anwesend in Persephin.
![Figure 00100001](https://patentimages.storage.***apis.com/c0/cf/1a/4e44b020aa9daa/00100001.png)
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(Die
Aminosäure-Nummerierung
verwendet den ersten Cys-Rest als Aminosäure 1).
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Mit
der Bestätigung,
dass Persephin in der Tat ein neues Mitglied der GDNF/NTN-Subfamilie
darstellt, isolierten wir Mausgenom-Klone von Persephin, um zusätzliche
Sequenzinformationen zu erhalten. Es wurden der Ratten-cDNA-Sequenz
entsprechende Primer in einer PCR-Reaktion zur Verstärkung/Amplifizierung
eines 155-Nucleotid-
(nt) Fragments aus Mäusegenom-DNA
verwendet, welches zu der Rattenpersephin-cDNA-Sequenz homolog war.
Diese Primer wurden anschließend
verwendet, um Mauspersephin-Genomklone aus einer Maus-129/Sv-Bibliothek
in einem P1-Bakteriophagen-Vektor
zu erhalten (library screening service of Genome Systems, Inc.,
St. Louis, MO).
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Die
Restriktionsfragmente (3,4 kb Nco I und ein 3,3 kb Bam HI) aus diesem
P1-Klon, welche
das Persephingen enthielten, wurden durch Hybridisierung mit einem
210 nt-Fragment von Persephin, erhalten durch PCR unter Verwendung
von Mäusegenom-DNA
und persephinspezifischen Primern, identifiziert. Die Nco I- und
Bam HI-Fragmente
wurden sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie einen Abschnitt
von Aminosäuren
kodieren, welche denen entsprechen, die in dem Rattenpersephin-RACE-Produkt vorlagen,
und homolog zu den reifen bzw. entwickelten Abschnitten von sowohl
Neurturin als auch GDNF sind (11).
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Menschliches
Persephin wurde auf eine Weise erhalten, welche ähnlich der von Mauspersephin
ist. Degenerierte PCR-Primer wurden verwendet, um menschliche genomische
DNA zu amplifizieren, und ein Klon wurde mit einer Sequenz homolog
zu Mauspersephin bestimmt. Primer basierend auf der identifizierten Sequenz
wurden dann verwendet, um cDNA-Bibliotheken zu screenen. Positive
Klone wurden durch Hybridisierung mit einer DNA-Probe, abgeleitet
aus der identifizierten Sequenz, identifiziert, und diese Klone
wurden dann sequenziert.
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Wenn
die Aminosäuresequenzen
von reifem Maus-GDNF, -NTN und -PSP unter Verwendung des ersten
kanonischen Gerüstcysteins
als Ausgangspunkt aneinander gereiht/alignt werden, was erfolgt,
weil Änderungen
in den Spaltungsstellen zwischen den Familienmitgliedern eine Variabilität in den
Segmenten aufwärts des
ersten Cysteins hervorrufen, ist Persephin (91 Aminosäuren) etwas
kleiner als sowohl Neurturin (95 Aminosäuren) als auch GDNF (94 Aminosäuren). Die
Gesamtidentität
innerhalb dieses Bereichs beträgt
ungefähr 50%
mit Neurturin und ungefähr
40% mit GDNF.
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Ein
weiteres Nucleotid-Sequenzieren des Mauspersephin-NcoI-Fragments
ergab die Nucleotidsequenz des gesamten Mauspersephin-Gens, wie
in der 1 gezeigt. Zusätzlich wurde
das gesamte Rattenpersephin-Gen durch Sequenzieren eines PCR- verstärkten, PCR-amplifizierten
Fragments der Ratten-Genom-DNA bestimmt, wie in der 2 gezeigt.
In sowohl dem Maus- als auch dem Rattenpersephin-Gen erstreckte
sich von der Sequenz, welche für
ein Initiator-Methionin kodiert, bis zu einem Stoppkodon an den
Positionen 244–246
ein offener Leserahmen (open reading frame). Jedoch trat irgendwo
in dieser Sequenz eine erkennbare Anomalie auf, sodass die für die RXXR-Spaltungsstelle
kodierende Sequenz (Positionen 257–268) und die dem entsprechenden
reifen Persephinprotein entsprechende Sequenz (Positionen 269–556) mit
diesem offenen Leserahmen nicht co-linear sind. Anstelle dessen
kodiert ein zweiter Leserahmen für
die Spaltungsstelle und das reife Persephin. Unabhängig von
dieser erkennbaren Anomalie wurde gefunden, dass Säugerzellen
Persephin entweder von der Maus- oder der Ratten-Genomsequenz vollständiger Länge exprimieren
(siehe Beispiel 14 unten).
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Um
den Ursprung dieser Anomalie zu verfolgen, stellten wir Säugerexpressionsvektoren
für sowohl Maus-
als auch Rattenpersephin her. Zur Konstruktion des Mausplasmids
wurde ein P1-Klon, enthaltend das Mauspersephin-Gen, als ein Templat
in einem PCR-Assay verwendet. Primer wurden entworfen, so dass das erhaltene/resultierende
Fragment das Persephingen von dem Initiator-Methionin bis zum Stoppkodon
enthält. Die
PCR-Reaktion verwendete einen Vorwärtsprimer M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA] und
einen Rückwärtsprimer/Reverse-Primer M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC].
Zur Konstruktion des analogen Rattenplasmids wurde Rattengenom-DNA
als ein Templat in einem PCR-Assay verwendet. Die PCR-Reaktion verwendete
einen Vorwärtsprimer
M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA]
und einen Rückwärtsprimer/Reverse-Primer
M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC].
Die amplifizierten Produkte wurden in BSKS kloniert und sequenziert,
um zu bestätigen,
dass der korrekte Klon erhalten wurde. Die Ratten- und Mauspersephin-Fragmente wurden
unter Verwendung von Sma I und Hind III ausgeschnitten und in Asp718
(blunted) und Hind III-Schnittstellen des Säugerexpressionsvektors pCB6
kloniert.
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COS-Affenzellen
wurden mit entweder den Ratten- oder Mauspersephin-Expressionsvektoren
oder dem nicht-rekombinanten Vektor selbst (pCB6) transfektiert
bzw. transfiziert. Nach achtundvierzig Stunden wurden die Zellen
lysiert, die Proben auf ein 15% SDS-Polyacrylamid-Gel geladen, und
die Proteine wurden durch Elektrophorese getrennt. Die Proteine
wurden dann durch Elektroblotting auf Nitrocellulose übertragen. Diese
Nitrocellulosemembran wurde mit Anti-Persephin-Antikörpern inkubiert
(welche gegen ausgereiftes Persephin, hergestellt in Bakterien aus
einem pET-Plasmid, erzeugt wurden), um die Anwesenheit von Persephin in
den Lysaten zu detektieren. Die Lysate aus den transfektierten Zellen
mit entweder den Ratten- oder Mauspersephin-Expressionsvektoren,
jedoch nicht das Lysat aus den Zellen, welche mit pCB6 transfektiert
wurden, enthalten hohe Mengen an Persephin. Die Größe detektierten
Persephins war 10–15
kD, konsistent mit der vorhergesagten Größe für das prozessierte Persephin
(das heißt
reife Form des Persephins). Konditioniertes Medium, welches aus
diesen Zellen geerntet wurde, enthielt ebenfalls reifes Persephin.
Diese Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Maus- als auch die Rattenpersephin-Gene
dazu in der Lage sind, die Synthese eines ordentlich prozessierten
Persephinmoleküls
zu veranlassen.
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Zum
Auffinden des Mechanismus, durch welchen dieses geschieht, isolierten
wir RNA aus Zellen, welche mit entweder dem Ratten- oder dem Mauspersephin-Expressionsvektor
transfektiert wurden. RT/PCR-Analyse wurde unter Verwendung von
Primern, entsprechend dem Initiator-Met und dem Stoppkodon, durchgeführt. Wir
detektierten zwei Fragmente: eines korrespondierte mit der vorhergesagten
Größe des Persephingens,
und das andere war etwas kleiner, was darauf hinweist, dass RNA-Spleißen stattfindet.
Wir bestätigten
dies mit einer Anzahl anderer Primerpaare. Sowohl die großen als
auch die kleinen Persephinfargmente wurden kloniert und sequenziert.
Wie erwartet korrespondierte das größere Fragment mit dem Persephin-Gen. Das kleinere
Fragment korrespondierte mit einer gespleißten Version von Persephin.
Ein kleines 88 nt-Intron innerhalb der Pro-Domaine (lokalisiert
154 nt abwärts
des Start-Kodons) wurde ausgespleißt. Nach diesem Spleißvorgang
war der "Frameshift" nicht mehr vorhanden
(das heißt,
das Initiator-Met und der reife Abschnitt sind im gleichen Rahmen
(in-frame)) in sowohl dem Ratten- als auch dem Mauspersephin.
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Der
N-Terminus von Persephin wurde durch Bezugnahme auf die N-terminalen
Abschnitte von Neurturin oder GDNF vorhergesagt. Unter Verwendung
der Neurturin-Sequenzhomologie und der Spaltungssignale liegt ein
kennzeichnendes RXXR-Spaltungsmotiv,
beginnend 9 Reste aufwärts
des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins
von Persephin, vor, was nahelegt, dass reifes Mauspersephin 5 Aminosäuren (ALAGS)
(SEQ. ID NO: 103) aufwärts
dieses Cysteins enthält
(wie es ebenso bei Neu rturin der Fall ist). Die korrespondierenden
5 Aminosäuren
in dem Rattenpersephin sind ALPGL (SEQ. ID NO: 112), und die in
dem menschlichen Persephin sind ALSGP (SEQ. ID NO: 224). Unter Verwendung
dieser Parameter würde
reifes Persephin aus 96 Aminosäuren
bestehen und hat eine vorhergesagte Molekularmasse von 10,4 kD.
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Unter "reifem" Wachstumsfaktor
wird hierin die ab- bzw. ausgeschiedene Form des Wachstumsfaktors verstanden,
in der jegliche Pre- oder Pro-Abschnitte (ab)gespalten wurden, und
welcher als ein Monomer oder in Analogie zu anderen Mitgliedern
der TGF-β-Superfamilie
in der Form eines Homodimers, welches durch Disulfidbrücken verbunden
ist, vorliegen kann.
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Die
Entwicklung des neuen Wachstumsfaktors, Persephin, wie oben beschrieben,
ist ein Ergebnis der früheren
Entwicklung durch die Erfinder von Neurturin. Somit sind die Experimente,
welche zu der Entwicklung von Neurturin führten, relevant in der jetzigen
Entwicklung von Persephin ebenso wie der biologischen Aktivität von Persephin.
Die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung von Neurturin
ist detailliert unten in den Beispielen 1–5 beschrieben.
-
Im
Wesentlichen homologe Wachstumsfaktoren können nativ zu einem Gewebe
oder Arten sein, und ähnlich
kann die biologische Aktivität
in einer beliebigen Zahl von biologischen Assaysystemen charakterisiert werden.
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Der
Bezug auf Pre-Pro-Persephin soll derartig ausgelegt werden, dass
Pre-Pro-Wachstumsfaktoren eingeschlossen
sind, welche einen Pre- oder Führungs-
oder Signalsequenzabschnitt, einen Pro-Sequenzbereich und Persephin,
wie hierin definiert, enthalten.
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Der
Begriff "biologisch äquivalent" soll bedeuten, dass
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zum Zeigen eines
Teils oder sämtlicher
Wachstumsförderungseigenschaften
in ähnlicher
Weise, allerdings nicht notwendigerweise zu demselben Grad, in der
Lage sind, wie das rekombinant hergestellte Mensch-, Maus- oder
Ratten-Persephin, wie hierin identifiziert.
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Unter "im Wesentlichen homolog" wird verstanden,
dass der Grad der Sequenzidentität
von Persephin-Orthologen, einschließlich Mensch-, Maus- und Rattenpersephin,
sowie Persephin aus irgendeiner anderen Art, größer ist als der zwischen Paralogen,
wie Persephin und Neurturin oder Persephin und GDNF, und größer als
der früher
für Mitglieder
der TGF-β-Superfamilie
angegebene ist. (Hinsichtlich der Diskussion der Homologie von TGF-β-Supferfamilien-Mitgliedern
siehe Kingsley, Genes and Dev. 8: 133–46, 1994).
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Die
Sequenzidentität
oder prozentuale Identität
soll der Prozentanteil der selben Reste zwischen zwei Sequenzen
bedeuten. Die Referenzsequenz ist menschliches Persephin bei Bestimmung
der prozentualen Identität
mit Maus- oder Rattenpersephin und mit den Nicht-Persephin-Wachstumsfaktoren,
menschliches Neurturin oder menschliches GDNF. Die Referenzsequenz
ist Mauspersephin bei Bestimmung der prozentualen Identität mit Maus-GDNF
und Mausneurturin und Rattenpersephin bei Bestimmung der prozentualen Identität mit Ratten-GDNF
und Rattenneurturin. Auf menschliches Neurturin wird Bezug genommen
bei Bestimmung der prozentualen Identität mit nicht-menschlichem Neurturin,
und auf menschliches GDNF. In allen der obigen Vergleiche werden
die zu vergleichenden Sequenzen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins
et al., Cabios 8: 189–191,
1992) der mehrfachen Sequenzaneinanderreihung (Alignment) in der
Lasergene biocomputing Software (DNASTAR, INC, Madison, WI) aneinandergereiht/alignt.
In diesem Verfahren werden mehrfache Aneinanderreihungen in progressiver
Weise durchgeführt,
wobei größere und
größere Vergleichsgruppen
unter Verwendung von Ähnlichkeitszahlen,
berechnet aus einer Reihe von paarweisen Vergleichen, aufgebaut
werden. Die optimalen Sequenzaneinanderreihungen werden durch das
Auffinden der maximalen Aneinanderreihungszahl erhalten, welche
der Mittelwert aller Zahlen zwischen den getrennten Resten in der
Aneinanderreihung, bestimmt aus einer Restgewichtstabelle, welche
die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines gegebenen Aminosäurewechsels
in zwei verwandten Proteinen innerhalb eines angegebenen Evolutionsabschnitts
darstellt, ist. Abzüge
für das Öffnen und
Verlängern
von Lücken
in der Aneinanderreihung tragen zu der Zahl bei. Die bei diesem
Programm verwendeten Grundeinstellungen sind wie folgt: Lückenabzug für mehrfache
Aneinanderreihung = 10; Lückenlängenabzug
für mehrfache
Aneinanderreihung = 10; k-Tupel-Wert in paarweiser Aneinanderreihung
= 1; Lückenabzug
in paarweiser Aneinanderreihung = 3; Fensterwert bei der paarweisen
Aneinanderreihung = 5; gesicherte Diagonalen in paarweiser Aneinanderreihung
= 5. Die Restgewichtstabelle, welche für das Vergleichsprogramm verwendet
wird, ist PAM 250 (Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence
and Structure, Dayhoff, Hrgb., NBRF, Washington, Band. 5, Ergänzung 3,
S. 345, 1978).
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Der
prozentuale Erhalt bzw. die prozentuale Konservierung wird aus der
obengenannten Aneinanderreihung durch Addition des Prozentanteils
der identischen Reste zu dem Prozentanteil der Positionen, an denen
die zwei Reste eine bewahrte/konservierte Substitution darstellen
(definiert als einen log ungerade Zahlen-Wert von größer als
oder gleich 0,3 in der PAM250-Restgewichtstabelle aufweisend), berechnet.
Die bevorzugten Aminosäure-Änderungen,
unter Verwendung dieses Kriteriums sind: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I,
Q-H. Die Bewahrung/Konservierung ist bezogen auf menschliches Persephin,
wenn die prozentuale Bewahrung/Konservierung mit Persephin von anderen
Arten oder mit Nicht-Persephin-Wachstumsfaktoren bestimmt wird;
sie ist auf menschliches Neurturin bezogen, wenn die prozentuale
Bewahrung mit nicht-menschlichem Neurturin oder mit Nicht-Persephinen-Nicht-Neurturin-Wachstumsfaktoren
bestimmt wird.
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Die
Tabelle 1 zeigt die Vergleiche der Identität (I) und der Bewahrung bzw.
Konservierung (C) für
Vergleiche von reifem Persephin, reifem Neurturin und reifem GDNF
für verschiedene
Arten. Die Vergleiche wurden zwischen reifem menschlichem Persephin
(hPSP) und reifem Maus- und Rattenpersephin (mPSP bzw. rPSP) und
zwischen reifem menschlichem Persephin und reifem menschlichem GDNF
oder Neurturin (jeweils hGDNF bzw. hNTN) durchgeführt. Neurturin-Vergleiche
wurden zwischen reifem menschlichem und reifem Mausneurturin (jeweils
hNTN bzw. mNTN) und zwischen jedem dieser und reifem menschlichem,
Ratten- und Maus-GDNF (jeweils hGDNF, rGDNF bzw. mGDNF) durchgeführt, wie
in der Tabelle gezeigt.
-
-
Der
Homologiegrad zwischen dem menschlichen Persephin und dem Maus-
oder Rattenpersephin beträgt
ungefähr
80%, während
der Homologiegrad zwischen dem Maus- und Rattenpersephin bei ungefähr 94% liegt.
Die Neurturin-Vergleiche, wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind, zeigen
an, dass die reifen Maus- und menschlichen Neurturin-Proteine ungefähr 90% Sequenzidentität aufweisen.
Darüber
hinaus nimmt man an, dass sämtliche
Persephin- und Neurturin-Homologen von nicht-menschlichen Säugerarten in ähnlicher
Weise mindestens ungefähr
75% Sequenzidentität
mit menschlichem Persephin, menschlichem Neurturin oder menschlichem
GDNF aufweisen. Für
Nichtsäugetier-Arten,
wie beispielsweise Vogelarten, wird ange nommen, dass der Grad an
Homologie mit Persephin bei mindestens ungefähr 65% Identität zu menschlichem
Persephin oder Neurturin, menschlichem Neurturin oder menschlichem
GDNF liegt. Zum Vergleich können
die Variationen zwischen Familienmitgliedern der Neurturin-Persephin-GDNF-Familie
von Wachstumsfaktoren durch den Vergleich von Persephin und GDNF
oder Neurturin und GDNF erkannt werden. Menschliches Persephin hat
ungefähr
40% Sequenzidentität
und ungefähr
43% Sequenzerhalt/-konservierung mit menschlichem GDNF; und ungefähr 49% Sequenzidentität und ungefähr 50% Sequenzerhalt/-konservierung
mit menschlichem Neurturin. In ähnlicher
Weise besitzt menschliches Neurturin ungefähr 40% Sequenzidentität und ungefähr 50% Sequenzbewahrung
mit menschlichem GDNF. Es wird angenommen, dass die unterschiedlichen
Familienmitglieder ebenso eine ähnliche
Sequenzidentität
von ungefähr
40% der von Neurturin, ungefähr
40% der von Persephin und ungefähr
40% der von GDNF aufweisen, und innerhalb eines Bereiches von ungefähr 30% bis
ungefähr
75% Identität
mit Neurturin, innerhalb eines Bereiches von ungefähr 30% bis
ungefähr
75% Identität
mit Persephin oder innerhalb eines Bereiches von ungefähr 30% bis
ungefähr
75% Sequenzidentität
mit GDNF vorliegen.
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Folglich
wird erwartet, dass ein gegebenes Mitglied der GDNF-Neurturin-Persephin-Familie
eine geringere Sequenzidentität
mit irgendeinem anderen Familienmitglied derselben Art aufweist
als das, welches in Orthologen dieses Familienmitgliedes in anderen
Arten vorliegt, ebenso wie menschliches GDNF und menschliches Neurturin
zu Maus-GDNF und Maus-Neurturin jeweils enger verwandt sind als
zueinander oder zu GDNF, und es wird angenommen, dass irgendein
gegebenes Familienmitglied eine größere Sequenzidentität mit einem
anderen Familienmitglied als zu irgendeinem anderen bekannten Mitglied
der TGF-β-Superfamilie
aufweist (Kingsley, supra).
-
Homologe
von Pre-Pro-Persephin in nichtmenschlichen Säugerarten können mittels des Persephinanteils
der Aminosäuresequenz
mit mindestens ungefähr
75% Sequenzidentität
mit menschlichem Persephin identifiziert werden, und Homologe von
Pre-Pro-Persephin in Nichtsäugerarten
können
mittels des Persephinanteils der Aminosäuresequenz mit mindestens ungefähr 65% Identität mit menschlichem
Persephin identifiziert werden.
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Persephin,
wie der Begriff hierin verwendet wird, kann ebenso Hybrid- und modifizierte
Formen von Persephin einschließen,
einschließlich
Fusionsproteine und Persephinfragmente und Hybrid- und modifizierte Formen,
in denen bestimmte Aminosäuren
deletiert oder ersetzt wurden, sowie Modifikationen, in welchen
beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht wurde(n)
gegen eine modifizierte Aminosäure
oder ungewöhnliche
Aminosäure,
und Modifikationen, wie beispielsweise Glycosolierungen, solange
die Hybrid- oder modifizierte Form die bi ologische Aktivität von Persephin
beibehält.
Unter Beibehalten der biologischen Aktivität wird verstanden, dass das
neuronale Überleben
gefördert
wird, obwohl nicht notwendigerweise auf demselben Potenzniveau,
wie das des Human-, Maus- oder Ratten-Persephins, wie hierin identifiziert.
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Ebenso
enthalten in der Bedeutung von im Wesentlichen homolog ist ein beliebiges
Persephin, welches mittels Kreuzreaktivität bzw. Cross-Reaktivität mit Antikörpern gegen
Persephin isoliert werden kann oder dessen kodierende Nucleotidsequenzen,
einschließlich
Genom-DNA, mRNA oder cDNA, durch Hybridisierung mit der komplementären Sequenz
der Genom- oder Subgenom-Nucleotidsequenzen oder cDNA von Persephin
oder deren Fragmente isoliert werden können. Es ist ebenso für den Durchschnittsfachmann
von Wert, dass degenerierte DNA-Sequenzen für menschliches Persephin kodieren
können,
und diese sollen ebenso innerhalb der vorliegenden Erfindung liegen,
wie es für
allelische Varianten von Persephin der Fall ist.
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Konservativ/erhaltend
substituierte Persephin-Proteine sind ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der
vorliegenden Erfindung. Konservativ/erhaltende Aminosäure-Substitutionen
beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Resten mit ähnlichen
Seitenketten. Konservativ/erhaltend ausgetauschte Aminosäuren können gemäß ihrer
chemischen Eigenschaften ihrer Seitenketten gruppiert werden. Zum
Beispiel schließt
eine Gruppierung von Aminosäuren
solche Aminosäuren
mit neutralen und hydrophoben Seitenketten ein (A, V, L, I, P, W,
F und M); eine andere Gruppierung ist eine solche von Aminosäuren mit
neutralen und polaren Seitenketten (G, S, T, Y, C, N und Q); eine
andere Gruppierung ist eine solche von Aminosäuren mit basischen Seitenketten
(K, R und H); eine andere Gruppierung ist eine solche von Aminosäuren mit
sauren Seitenketten (D und E); eine andere Gruppierung ist eine
solche von Aminosäuren
mit aliphatischen Seitenketten (G, A, V, L und I); eine weitere
Gruppierung ist eine solche von Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxyl-Seitenketten
(S und T); eine weitere Gruppierung ist eine solche von Aminosäuren mit
aminenthaltenden Seitenketten (N, Q, K, R und H); eine weitere Gruppierung
ist eine solche von Aminosäuren
mit aromatischen Seitenketten (F, Y und W); und eine weitere Gruppierung
ist eine solche von Aminosäuren
mit Schwefel enthaltenden Seitenketten (C und M). Bevorzugte erhaltene/konservative
Aminosäure-Substitionsgruppen
sind: R-K,; E-D, Y-F, L-M; V-I und Q-H. Zusätzlich wird angenommen, dass
Q-R-H und A-V bevorzugte Substitutionen für Persephin in sofern sind,
dass sie innerhalb Mensch-, Maus- und Ratten-Paraloga von Persephin
auftreten.
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In
dem Fall von Pre-Pro-Neurturin können
alternativ gespleißte
Proteinprodukte, resultierend aus einem Intron, lokalisiert in der
Kodierungssequenz des Pro-Ab schnitts existieren. Es wird angenommen,
dass das Intron in der Genomsequenz an einer Position vorliegt,
welche der Position zwischen den Nucleinsäuren 169 und 170 der cDNA entspricht,
welche wiederum einer Position innerhalb der Aminosäure 57 in
sowohl den Maus- als auch Mensch-Pre-Pro-Neurturin-Sequenzen entspricht.
Folglich kann ein alternatives Spleißen an dieser Position eine
Sequenz bilden, die sich von der hierin für Mensch- und Maus-Pre-Pro-Neurturin
identifizierten Sequenz (jeweils SEQ ID NO: 11 bzw. SEQ ID NO: 12)
an der identifizierten Aminosäurestelle
durch Einfügen
und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheidet. Es sollen
sämtliche
alternativ gespleißten
Pre-Pro-Neurturin-Proteine innerhalb des Begriffes Pre-Pro-Neurturin
enthalten sein, und ähnlich sollen
sämtliche
alternativ gespleißten
Pre-Pro-Persephin-Proteine innerhalb des hierin verwendeten Begriffes Pre-Pro-Persephin
enthalten sein.
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Obwohl
die Erfinder der vorliegenden Erfindung an keine Theorie gebunden
sein wollen, wird angenommen, dass die hierin identifizierten Mensch-,
Maus- und Ratten-Proteine sowie die Homologen aus anderen Geweben
und Arten als Dimere in ihrer biologisch aktiven Form auf eine Weise
existieren können,
die konsistent mit dem ist, was für andere Faktoren der TGF-β-Superfamilie
bekannt ist.
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Zusätzlich zu
Homodimeren können
die monomeren Einheiten der Dimeren von Persephin zum Aufbau von
stabilen Wachstumsfaktor-Heterodimeren oder -Heteromultimeren, umfassend
mindestens eine Monomereinheit, welche von Persephin abgeleitet
ist, verwendet werden. Dieses kann durch Dissoziieren eines Homodimers
von Persephin in seine monomeren Komponenteneinheiten und Reassoziierung
in Gegenwart einer monomeren Einheit eines zweiten oder folgenden
homodimeren Wachstumsfaktors erfolgen. Dieser zweite oder folgende
homodimere Wachstumsfaktor kann aus einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren
ausgewählt
sein, einschließlich
Neurturin, GDNF, einem Mitglied der NGF-Familie, wie NGF, BDNF,
NT-3 und NT-4/5, einem Mitglied der TGF-β-Superfamilie, einem Endothelgewebe-Wachstumsfaktor,
einem Mitglied der CNTF/LIF-Familie oder ähnlichem.
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Man
nimmt an, dass Wachstumsfaktoren als spezifische Rezeptoren wirken.
Beispielsweise wurden die Rezeptoren für TGF-β und Aktivine identifiziert
und einer Familie von Ser/Thr-Kinase-Transmembran-Proteinen zugeordnet
(Kingsley, Genes and Dev. 8: 133–146, 1994; Bexk et al. Nature
373: 339–341,
1995). In der NGF-Familie bindet NGF an den TrkA-Rezeptor in peripheren,
sensorischen und sympathischen Neuronen und in den Neuronen des
basalen Vorderhirns; BDNF und NT-4/5 binden an trkB-Rezeptoren;
und NT-3 bindet primär
an trkC-Rezeptoren, welche innerhalb des ZNS eine besondere Verteilung
besitzen (Tuszynski et al., Ann. Neurol. 35: S9–S12, 1994). Es scheint, dass
Persephin-Neurturin-GDNF-Familien-Mitglieder über spezifische Rezeptoren
mit besonderen Verteilungen wirken, wie es für andere Wachstumsfaktor-Familien
gezeigt wurde. Kürzlich
wurde gezeigt, dass GDNF über
einen Multikomponenten-Rezeptorkomplex wirkt, in welchem eine Transmembran-Signal transduzierende
Komponente, das Ret-Tyrosin-Kinase-Protein (Ret PTK), beim Binden
des GDNF mit einem anderen Protein, genannt GDNF-Rezeptor α (GDNFR-α), welches
keine Transmembran-Domäne
hat und an die Zelloberfläche über Glycosylphosphatidylinositol-
(GPI) Bindung verknüpft ist,
aktiviert wird (Durbec et al., Nature 381: 789–793, 1996; Jing et al., Cell
85: 1113–1124,
1996; Treanor et al., Nature 382: 80–83, 1996; Trupp et al., Nature
381: 785–789,
1996). Überdies
wurde gezeigt, dass die Signalgebung von Neurturin und GDNF über den
Ret-Tyrosin-Kinase-Rezeptor durch eine Familie von Co-Rezeptoren
bewirkt wird, einschließlich
dem Co-Rezeptor-Protein GDNFR-α,
ebenfalls bezeichnet als TrnR1, und den Co-Rezeptor-Protein TrnR2,
wobei jedes einen funktionellen Rezeptorkomplex mit Ret bilden kann
für sowohl
Neurturin als auch GDNF (Baloh et al., Neuron 18: 793–802, 1997).
Es wird erwartet, dass durch die Bildung von Heterodimeren oder
Heteromultimeren von Persephin und einem oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren
der resultierende Wachstumsfaktor zum Binden an mindestens zwei
verschiedene Rezeptortypen mit vorzugsweise einer unterschiedlichen
Gewebeverteilung in der Lage ist. Die resultierenden Heterodimere
oder Heteromultimere hätten
erwartungsgemäß ein verschiedenes
und möglicherweise
ein vergrößertes Spektrum
an Zellen, auf die sie wirken könnten,
oder eine größere Potenz.
Es ist ebenso möglich,
dass das Heterodimer oder Heteromultimer synergistische Effekte
bereitstellen, welche bei Homodimeren oder Homomultimeren nicht
beobachtet werden. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Kombination
von Faktoren unterschiedlicher Klassen das Langzeitüberleben
von Oligodendrozyten fördert,
wohingegen einzelne Faktoren oder Kombinationen solcher Faktoren
innerhalb derselben Klasse ein Kurzzeitüberleben förderten (Barres et al., Development
118: 283–295,
1993).
-
Heterodimere
können
durch eine Vielzahl von Verfahren gebildet werden. Beispielsweise
können
Homodimere gemischt und Bedingungen unterzogen werden, bei denen
Dissoziation/Auffalten auftritt, wie in Gegenwart eines Dissoziations/Entfaltungsmittels,
gefolgt von dem Anwenden von Bedingungen, welche die Monomer-Reassoziierung
und Bildung von Heterodimeren erlauben. Dissozations-/Entfaltungs-Mittel umfassen jegliche
Mittel, welche zum Fördern
der Dissoziation von Proteinen bekannt sind. Solche Mittel umfassen,
allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff,
Kaliumthiocyanat, pH-erniedrigende Mittel, wie gepufferte HCl-Lösungen,
und polare, wassermischbare organische Lösungsmittel, wie Acetonitril oder
Alkohole, wie Propanol oder Isopropanol. Zusätzlich können für durch Disulfidbindungen kovalent
verbundene Homodimere, wie es bei TGF-β-Familienmitgliedern der Fall
ist, Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol und β-Mercapto ethanol, zur Dissoziation/Entfaltung
und zur Reassoziierung/Rückfaltung
verwendet werden.
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Heterodimere
können
ebenso zum Transfektieren/Transfizieren einer Zelle mit zwei oder
mehreren Faktoren hergestellt werden, sodass die transformierte
Zelle Heterodimere produziert, wie es mit den Neurotrophinen durchgeführt wurde.
(Heymach und Schooter, J. Biol. Chem. 270: 12297–12304, 1995).
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Ein
weiteres Verfahren zur Bildung von Heterodimeren liegt in der Kombination
von Persephin-Homodimeren und einem Homodimer eines zweiten Wachstumsfaktors
und Inkubieren der Mischung bei 37°C.
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Wenn
Heterodimere aus Homodimeren hergestellt werden, können die
Heterodimere anschließend von
den Homodimeren unter Verwendung von dem Fachmann verfügbaren Verfahren
abgetrennt werden, wie beispielsweise durch Eluierung von präparativen,
nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen. Alternativ können Heterodimere
unter Verwendung von Hochdruckkationenaustauschchromatographie,
wie mit einer Mono-S-Kationenaustauschsäule, oder durch Sequenzimmunoaffinitätssäulen aufgereinigt
werden.
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Es
ist im Stand der Technik bekannt, dass viele Proteine in einer Zelle
mit einer Signalsequenz an dem N-Terminus der reifen Proteinsequenz
synthetisiert werden, und das solch eine Leitsequenz tragende Protein wird
als Preprotein bezeichnet. Der Pre-Teil des Proteins wird während des
zellulären
Prozessierens des Proteins abgespalten. Zusätzlich zu der Pre-Leitsequenz
enthalten viele Proteine eine besondere Pro-Sequenz, welche einen
Abschnitt auf einem Protein beschreibt, der ein stabiler Precursor
des reifen Proteins darstellt. Mit sowohl Pre- als auch Pro-Bereichen
synthetisierte Proteine werden als Preproproteine bezeichnet. Hinsichtlich
des Prozessierungsvorgangs, der bekanntermaßen bei anderen TGF-β-Familienmitgliedern
als auch bei den hierin bestimmten Sequenzen auftritt, nehmen die
Erfinder an, dass die Form des Persephin-Proteins, wie es innerhalb
einer Zelle synthetisiert wird, das Pre-Pro-Persephin ist. Man nimmt
an, dass das menschliche Pre-Pro-Persephin eine N-terminale 23-Aminosäuresignalsequenz
(menschliche Pre-Signalsequenz, SEQ ID NO: 219, kodiert durch SEQ
ID NOS: 208–209)
enthält.
Es ist bekannt, dass die volle Länge
einer Leitsequenz nicht notwendigerweise für das Wirken der Sequenz als
eine Signalsequenz erforderlich ist, und daher sind in der Definition
des Pre-Abschnitts von Persephin die Fragmente davon, gewöhnlich N-terminale
Fragmente, enthalten, welche die Eigenschaft der Fähigkeit
zur Wirkung als eine Signalsequenz beibehalten, d. h. die Erleichterung
von co-translatorischer Einfügung
in die Membranen von einer oder mehreren zellulären Organellen, wie dem endoplasmatischen
Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat, der Plasmamembran und ähnlichem.
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Der
Persephin-Signalsequenz schließt
sich eine Pro-Domäne
an, welche eine RXXR-Proteolyse-Prozessierungsstelle direkt vor
der N-terminalen Aminosäuresequenz
für das
reife Persephin enthält.
(Menschliche Pro-Bereich-Sequenz, SEQ ID NO: 220, kodiert durch
die Nucleinsäuresequenz
SEQ ID NO: 221).
-
Die
Persephin-Pre- und -Pro-Bereiche umfassen zusammen eine Pre-Pro-Sequenz,
welche als die menschliche Pre-Pro-Sequenz identifiziert wurde (SEQ
ID NO: 219, kodiert durch SEQ ID NOS: 213 and 215, Nucleinsäuren 1 bis
285). Die Pre-Bereichssequenzen
und Pro-Bereichssequenzen sowie die Pre-Pro-Bereichssequenzen können für nicht-menschliche
Säugerarten
und für
Nicht-Säugerarten
mittels der Sequenzen, welche innerhalb des Pre-Pro-Persephins,
wie es hierin definiert ist, enthalten sind, identifiziert und erhalten
werden.
-
Unter
Verwendung der obengenannten Charakteristika hat die menschliche
Persephin-cDNA einen 471 bp offenen Leserahmen kodierend für ein 156
Aminosäure
langes Protein (vorhergesagtes Molekulargewicht 16,6 kDA). Abspaltung
des 23 Aminosäure
langen vorhergesagten Signalpeptids führt zu einem 133 Aminosäure langen
Pro-Persephin-Molekül
(Molekularmasse 14,2 kDa). Proteolytische Abspaltung des Pro-Persephins
bei einer RXXR-Konsens-Sequenz sollte ein 96 Aminosäure langes
reifes Protein mit einer molekularen Masse von 10,3 kDa ergeben.
Das reife, sekretierte Persephin-Molekül wird wahrscheinlich ein über Disulfit
verbundenes Homodimer analog anderer Mitglieder der TGF-β-Familie
bilden.
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Die
Nucleotid-Sequenzen von Persephin-Pre- und/oder -Pro-Abschnitten
oder ähnlichen
Abschnitten, von denen man annimmt, dass sie mit Persephin-DNA verbunden
sind, können
zum Aufbau von chimären
Genen mit den Kodierungssequenzen anderer Wachstumsfaktoren oder
Proteine verwendet werden. (Booth et al., Gene 146: 303–8, 1994;
Ibanez, Gene 146: 303–8,
1994; Storici et al., FEBS Letters 337: 303–7, 1994; Sha et al., J. Cell.
Biol. 114: 827–839,
1991). Solche chimären
Proteine können
eine veränderte
Bildung oder Exprimierung der aktiven Proteinarten aufweisen.
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Ein
erfindungsgemäß bevorzugtes
Persephin wird durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt, obwohl angenommen
wird, dass Persephin in gereinigter Form aus zellkonditioniertem
Medium isoliert werden kann, wie es für Neurturin gemacht wurde.
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Unter "reiner Form" oder "aufgereinigter Form" oder "im Wesentlichen aufgereinigter
Form" wird hierin verstanden,
dass eine Persephin-Zusammensetzung im Wesentlichen frei von anderen
Proteinen ist, welche nicht Persephin sind. Vorzugsweise umfasst
eine im Wesentlichen aufgereinigte Persephin-Zusammensetzung mindestens
ungefähr
50% Persephin auf einer molaren Basis verglichen mit der Gesamtproteinmenge oder
anderen anwesenden makromolekularen Spezies. Bevorzug ter wird eine
im Wesentlichen aufgereinigte Persephin-Zusammensetzung mindestens
ungefähr
80 bis ungefähr
90 Mol-% der Gesamtproteinmenge oder anderen anwesenden makromolekularen
Spezies darstellen und stärker
bevorzugt mindestens ungefähr
95 Mol-% oder mehr.
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Rekombinantes
Persephin kann durch Exprimieren der DNA-Sequenzen, welche für Persephin
kodieren, in einer geeigneten transformierten Wirtszelle gebildet
werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren
kann die Persephin-kodierende DNA an einen Expressionsvektor gebunden
werden, in eine Wirtszelle transformiert werden und Bedingungen
unterzogen werden, welche zur Expression von Persephin durch die
transformierte Zelle geeignet sind.
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Ein
beliebiger geeigneter Expressionsvektor kann zur Herstellung von
rekombinantem menschlichen Persephin verwendet werden, wie beispielsweise
der Säuger-Expressionsvektor
pCB6 (Brewer, Meth. Cell. Biol. 43: 233–245, 1994), oder die E. Coli-pET-Expressionsvektoren,
insbesondere pET-30a (Studier et al., Methods Enzymol. 185: 60–89, 1990),
welche beide hierin verwendet wurden. Andere geeignete Expressionsvektoren
zur Expression in Säuger-
und Bakterienzellen sind im Stand der Technik ebenso wie Expressionsvektoren
zur Verwendung in Hefen oder Insektenzellen bekannt. Baculovirus-Expressionssysteme
können
ebenso eingesetzt werden.
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Persephin
kann in den monomeren Einheiten exprimiert werden, oder eine solche
monomere Form kann durch die Herstellung unter reduzierenden Bedingungen
gebildet werden. In solchen Fällen
kann das Rückfalten
und die Renaturierung unter Verwendung eines der oben angegebenen
Mittel erreicht werden, welches zur Förderung der Dissoziierung/Assoziierung
von Proteinen bekannt ist. Beispielsweise kann die monomere Form
mit Dithiothreitol inkubiert werden, gefolgt von der Inkubierung
mit oxidiertem Glutathion-Dinatriumsalz, gefolgt von der Inkubierung
mit einem Puffer, welcher ein Rückfaltungsmittel,
wie Harnstoff, enthält.
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Persephin
kann als ein Dimer oder ein anderes Multimer vorliegen und kann
glykosyliert oder auf andere Weise chemisch modifiziert sein. Reifes
menschliches Persephin enthält
keine N-verknüpften
glykosylierten Stellen (SEQ ID NO: 221). Mögliche O-verknüpften Glykosylierungsstellen
treten in reifem menschlichem Persephin an den Stellen 3, 10, 12,
14, 24, 36, 43, 67, 70 und 88 in SEQ ID NO: 221 auf.
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Wie
oben bezeichnet lässt
die Mensch-Nucleinsäuresequenz
vermuten, dass Persephin anfänglich
als Pre-Pro-Polypeptid translatiert wird und dass die proteolytische
Prozessierung der Signalsequenz und des "Pro"-Teils
dieses Moleküls
in der reifen Sequenz resultiert, welche hierin als "reifes Persephin" bezeichnet wird,
wie es in menschlichen und nicht-menschlichen Arten in homologer
Form existiert. Da her umfasst Persephin sämtliche "reife Persephin"-Sequenzen von menschlichen und nicht-menschlichen
Arten, sowie sämtliche
Pre-Pro-Persephin-Polypeptide, welche von dem Persephin-Gen translatiert
werden können.
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In
Analogie zu dem Neurturin-Protein ist es möglich, dass Isoformen von Persephin
existieren. Zum Beispiel können
verschiedene mögliche
Spaltungsstellen (wie beispielsweise RXXR-Stellen) in der Pre-Pro-Neurturin-Sequenz
vorliegen, sodass mehr als eine mögliche Isoform des Pre-Pro-Neurturins
existieren kann. Auf diese Weise kann das reife Neurturin-Protein
eine variable Anzahl von Aminosäuren
aufweisen, die dem ersten kanonischen Cystein vorangehen. Solche
sich verändernde
Spaltungsstellen könnten
bei verschiedenen Organismen und bei unterschiedlichen Geweben desselben
Organismus auf verschiedene Weise verwendet werden. Die N-terminalen Aminosäuren, welche
dem ersten der sieben erhaltenen/konservierten Cysteine in der reinen
Form der Mitglieder der TGF-β-Familie
vorangehen, variieren weitreichend sowohl in der Länge als
auch in der Sequenz. Darüber
hinaus beeinflusst das Einfügen
einer Sequenz von zehn Aminosäuren
zwei Reste aufwärts
des ersten erhaltenen/konservierten Cysteins nicht die bekannten
biologischen Wirkungen eines Familienmitglieds, Dorsalin (Basler
et al., Cell 73: 687–702,
1993). Analog ist es auch möglich,
dass Persephin-Proteine, welche Sequenzen von verschiedener Länge vor
dem ersten kanonischen Cystein enthalten, existieren können oder
hergestellt werden können
und dass diese ihre biologische Aktivität beibehalten können.
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Die
Erfinder glauben hierin, dass mindestens die Sequenz eines Persephin-Neurturin-GDNF-Wachstumsfaktors,
welcher biologische Wirkung zeigt, die Sequenz von dem ersten bis
zum siebten kanonischen Cystein enthalten wird. Diese Sequenz des
menschlichen Persephins reicht von Cystein 66 bis Cystein 154 wie gezeigt
in SEQ ID NO: 223. Die vergleichbare Sequenz für Maus-Persephin reicht von
Cystein 1 bis Cystein 87 (SEQ ID NO: 79), und die von Ratten-Persephin
reicht von Cystein 1 bis Cystein 87 (identifiziert als SEQ ID NO:
82). Aus diesem Grund liegen innerhalb des Umfangs der erfindungsgemäßen Persephin-Proteine
die Aminosäuresequenzen,
enthaltend die SEQ ID NO: 217 bis SEQ ID NO: 221 oder SEQ ID NO:
223, und die Nucleotidsäuremoleküle, enthaltend
Sequenzen, welche für
diese Aminosäuresequenzen
kodieren.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenso Nucleinsäuremoleküle, umfassend Sequenzen, welche
für Maus-,
Ratten- und Mensch-Persephin kodieren (8).
Ebenfalls eingeschlossen in den Umfang der Erfindung sind Sequenzen,
welche im Wesentlichen zu den Nucleinsäure-Sequenzen, welche für Persephin
kodieren, identisch sind. Solche im Wesentlichen identischen Sequenzen
sind beispielsweise substituiert mit Kodons, welche in einer gegeben
Wirtszelle, wie E. coli, gemäß bekannten
Verfahren und Standardverfahren leichter exprimiert werden. Solche
modi fizierten Nucleinsäure-Sequenzen
sind innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung enthalten.
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Spezifische
Nucleinsäure-Sequenzen
können
durch den Fachmann modifiziert werden, und folglich können sämtliche
Nucleinsäure-Sequenzen,
welche für
die Aminosäure-Sequenzen
von Pre-Pro-Persephin oder die Pre-Region oder die Pro-Region von
Persephin kodieren, in ähnlicher
Weise modifiziert sein. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls
Nucleinsäure-Sequenzen
mit einer oder mehreren Substitutionen, Deletionen oder Einfügungen ein,
wobei die Nucleinsäure-Sequenzen
mit einer Persephin-Nucleinsäure-Sequenz hybridisiert
wird, oder Komplemente davon, sofern diese geeignet sind.
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Spezifische
Hybridisierung bedeutet hierin die Bildung von Hybriden zwischen
einem Polynucleotid (z. B. einem Persephin-Polynucleotid, welches
eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen und/oder Einfügungen einschließen kann)
und einem spezifischen Referenz-Polynucleotid (z. B. Polynucleotide,
welche für
reifes Persephin kodieren und die die Sequenzen von SEQ ID NO: 183,
184, 194, 195, 199, 200, 201 oder 202 haben), wobei das Polynucleotid
vorzugsweise mit dem spezifischen Referenzpolynucleotid hybridisiert.
Zum Beispiel wird ein Polynucleotid, welches für ein reifes Persephin kodiert,
spezifisch mit einem Referenz-Persephin-Polynucleotid (z. B. SEQ
ID NO: 183, 184, 194, 195, 199, 200, 201 oder 202) hybridisieren
und nicht mit einem Referenz-Neurturin-Polynucleotid (z. B. SEQ
ID NO: 9 oder 10 oder Sequenzen, welche komplementär dazu sind).
Die spezifische Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter hochstringenten
Bedingungen, welche von dem Durchschnittsfachmann gut verstanden
sind, welche durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und
während
dem Waschverfahren bestimmt werden, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Zeitlänge und
Konzentration des Formamids (vergleiche zum Beispiel Sambrook et
al., 1989, supra).
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ebenfalls Nucleinsäure-Sequenzen
ein, welche für
Polypeptide kodieren, die eine überlebens-
oder wachstumsfördernde
Aktivität
aufweisen und welche von Antikörpern,
welche an Persephin binden, erkannt werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenso Vektoren, die ein die Expression
regulierendes Element, operabel verbunden mit einer beliebigen Nucleinsäure-Sequenz,
welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen
ist, umfassen. Die Erfindung umfasst ebenso Wirtszellen – irgendeiner
Art – welche
mit solchen Vektoren transformiert wurden.
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Verfahren
zur Herstellung von Persephin sind ebenso zur Verfügung gestellt.
Die Herstellung kann durch Isolierung von einem konditionierten
Medium von einer Vielzahl von Zellarten erfolgen, solange die Zellart
Persephin bildet. Ein zweites und bevorzugtes Verfahren schließt die Verwendung
von rekombinanten Verfahren zur Isolation einer Nucleinsäuresequenz,
die für
Persephin kodiert, Klonierung der Sequenz zusammen mit geeigneten
Regulationssequenzen in einen geeigneten Vektor und Zellarten, und
Expression der Sequenz zur Herstellung von Persephin ein.
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Eine
Säugergenfamilie,
welche vier neurotrophe Faktoren umfasst, wurde identifiziert, einschließlich des
Nervenwachstumsfaktors (NGF), des aus dem Hirn abgeleiteten neurotrophen
Faktors (BDGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4/5 (NT-4/5).
Diese Faktoren teilen ungefähr
60% Nucleinsäuresequenz-Homologie
(Tuszynski und Gage, Ann. Neurol. 35: S9–S12, 1994). Das Persephin-Protein
und das Neurturin-Protein zeigen keine signifikante Homologie zu
der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren. Entweder Persephin oder
Neurturin teilt weniger als ungefähr 20% Homologie mit der TGF-β-Superfamilie
von Wachstumsfaktoren. Jedoch zeigen sowohl Persephin als auch Neurturin
ungefähr
40% Sequenzidentität
mit GDNF und ungefähr 50%
Sequenzidentität
untereinander. Insbesondere sind die Positionen der sieben Cysteinreste,
welche in Persephin, Neurturin und GDNF vorliegen, annähernd exakt
erhalten/konserviert. Die Erfinder glauben hierin, dass andere unidentifizierte
Gene existieren könnten,
welche für
Proteine kodieren, die eine erhebliche Aminosäuresequenz-Homologie zu Persephin,
Neurturin und GDNF aufweisen und welche als Wachstumsfaktoren selektiv
für dieselben
oder unterschiedliche Gewebe und dieselben oder unterschiedlichen
biologischen Aktivitäten
fungieren und welche an denselben oder unterschiedlichen Rezeptoren
wirken können.
Ein unterschiedliches Wirkungsspektrum hinsichtlich der betroffenen
Gewebe und/oder der bewirkten Antwort könnte von einer vorherigen Aktivierung
von unterschiedlichen Rezeptoren durch unterschiedliche Familienmitglieder herrühren, wie
es für
Mitglieder der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren bekannt ist
(Tuszynski und Gage, 1994, supra).
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Als
eine Konsequenz für
Mitglieder einer besonderen Genfamilie, welche im Wesentlichen den
Erhalt/Konservierung der Aminosäuresequenz
in den Proteinprodukten der Familienmitglieder zeigen, kommt es zu
einem deutlichen Erhalt/Konservierung von Sequenzen auf der DNA-Stufe.
Dies bildet die Basis für
einen neuen Ansatz zur Identifizierung von anderen Mitgliedern der
Genfamilie, zu der GDNF, Neurturin und Persephin gehören. Das
für eine
solche Identifizierung verwendete Verfahren stellt die Kreuzhybridisierung
dar, welche von einem Familienmitglied abgeleitete Nucleinsäuresonden
verwendet, wobei ein stabiles Hybrid-Duplex-Molekül mit einer
Nucleinsäuresequenz
von unterschiedlichen Mitgliedern der Genfamilie gebildet wird oder
wobei Nucleinsäuresequenzen
von unterschiedlichen Familienmitgliedern verstärkt/amplifiziert werden. (Siehe
beispielsweise Kaisho et al., FEBS Letters 266: 187–191, 1990).
Die Sequenz aus dem unterschiedlichen Familienmitglied muss nicht
identisch mit der Sonde sein, wird allerdings nichtdestotrotz zu
der Sondensequenz ausreichend verwandt sein, um mit der Sonde zu
hybridisieren. Alternativ kann die PCR unter Verwendung von Primern
von einem Familienmitglied zur Identifizierung von zusätzlichen
Familienmitgliedern verwendet werden.
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Die
oben genannten Ansätze
waren bisher in der Identifizierung anderer Genfamilienmitglieder
nicht erfolgreich, weil nur ein Familienmitglied, GDNF, bekannt
war. Mit der Identifizierung von Neurturin in der ebenfalls anhängigen Anmeldung
Nr. 08/519,777 können
jedoch einzigartige neue Sonden und Primer hergestellt werden, welche
Sequenzen von den erhaltenen/konservierten Regionen dieser Genfamilie
enthalten. Dieselben erhaltenen/konservierten Regionen werden ebenso
in dem dritten Familienmitglied, Persephin, gefunden. Insbesondere
wurden drei erhaltene/konservierte Regionen hierin identifiziert,
welche als eine Basis zum Aufbau neuer Sonden und Primer verwendet
werden können.
Die neuen Sonden und Primer, welche durch die Arbeit mit Neurturin
und Persephin zugänglich
wurden, ermöglichen
diesen vielseitigen neuen Ansatz, welcher nun erfolgreich andere
Genfamilienmitglieder identifizieren kann. Unter Verwendung dieses
neuen Ansatzes kann nach zu GDNF, Neurturin und Persephin hinsichtlich
der Sequenzhomologie verwandten Genen durch Herstellen von DNA-
oder RNA-Sonden auf der Basis der erhaltenen/konservierten Abschnitte
in den GDNF- und Neurturin-Molekülen
gescreent werden. Daher umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung Sonden und Primer, welche einer Nucleotidsequenz, welche
für solche
erhaltenen/konservierten Abschnitte kodieren, entsprechen oder davon
abgeleitet sind, sowie ein Verfahren zur Identifizierung weiterer
Mitglieder der Neurturin-Persephin-GDNF-Genfamilie.
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Die
Aminosäuresequenzen
des erhaltenen/konservierten Abschnitts/Bereichs wurden hierin identifiziert
und umfassen Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr,
worin Xaa1 Ser, Thr oder Ala und Xaa2 Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 108);
Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys, worin
Xaa1 Thr, Glu oder Lys darstellt, Xaa2 Val, Leu oder Ile darstellt, Xaa3 Leu oder Ile darstellt, Xaa4 Ala
oder Ser darstellt und Xaa5 Ala oder Ser
darstellt (SEQ ID NO: 113); und Cys-Cys-Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Asp-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-Leu-Asp-Xaa9, worin Xaa1 Arg
oder Gln darstellt, Xaa2 Thr oder Val oder
Ile darstellt, Xaa3 Ala oder Ser darstellt,
Xaa4 Tyr oder Phe darstellt, Xaa5 Glu, Asp oder Ala darstellt, Xaa6 Glu, Asp oder keine Aminosäure darstellt,
Xaa7 Val oder Leu darstellt, Xaa8 Ser oder Thr darstellt und Xaa9 Asp
oder Val darstellt (SEQ ID NO: 114). Die Nucleotidsequenzen, welche
eine Kodierungssequenz für
die obigen erhaltenen/konservierten Sequenzen oder Fragmente der
obigen erhaltenen/konservierten Sequenzen aufweisen, können als
Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primersequenzen
kodieren für Aminosäuresequenzen
und SEQ ID NOS: 125–129;
Primer, deren reverse komplementäre
Sequenzen für
Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 130 kodieren; und insbesondere
Nucleotidsequenzen, SEQ ID NOS: 115–124. Zusätzliche Primer auf der Basis
von GDNF und Neurturin umfassen Nucleinsäuresequenzen, kodierend für Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41; Primer,
deren reverse komplementäre
Sequenzen SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 39 kodieren;
und insbesondere Nucleinsäuresequenzen
SEQ ID NOS: 42–48.
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Die
Hybridisierung unter Verwendung der neuen Sonden von erhaltenen/konservierten
Abschnitten der Nucleinsäuresequenzen
werden unter verminderten Stringenzbedingungen durchgeführt. Die
in der Bestimmung der Stringenzbedingungen involvierten Faktoren
sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Sambrook
et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1989). Nucleinsäurequellen
zum Screenen umfassen Genom-DNA-Bibliotheken von Säugerarten
oder cDNA-Bibliotheken, welche unter Verwendung von RNA, erhalten
von Säugerzellen,
erstellt wurden, kloniert in irgendeinen geeigneten Vektor.
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PCR-Primer
werden unter PCR-Bedingungen einer verminderten Annealtemperatur,
welche die Vervielfältigung
der Sequenzen von Genfamilienmitgliedern abgesehen von GNDF, Neurturin
und Persephin erlauben, verwendet. Nucleinsäurequellen zum Screenen umfassen
Genom-DNA-Bibliotheken aus Säugerarten,
welche in irgendeinen geeigneten Vektor kloniert sind, von RNA transkribierte
cDNA, erhalten aus Säugerzellen,
und Genom-DNA von Säugerarten.
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Auf
der Basis der Hybridisierung oder von PCR-Assays identifizierte
DNA-Sequenzen werden sequenziert und mit GDNF, Neurturin und Persephin
verglichen. Die DNA-Sequenzen, welche für die Gesamtsequenz des neuen
Faktors kodieren, würden
anschließend
auf die gleiche Weise wie hierin beschrieben erhalten. Genom-DNA oder Bibliotheken
von Genom-Klonen können
ebenso als Template verwendet werden, weil die Intron-/Exon-Strukturen
von GDNF und Neurturin erhalten/konserviert werden und die Kodierungssequenzen der
reifen Proteine nicht von Introns unterbrochen werden.
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Unter
Verwendung dieses oben beschriebenen Ansatzes wurden die von den
erhaltenen/konservierten Abschnitten von Neurturin und GDNF entworfenen/designten
Primer zur Identifizierung und zum Erhalt der Sequenz des neuen
hierin beschriebenen Familienmitglieds, Persephin, verwendet. Degenerierte
Primer, welche von Persephin, Neurturin und GDNF entworfen/designt
sind, können
weiterhin zur Identifizierung und zum Erhalt zusätzlicher Familienmitglieder
verwendet werden.
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Es
wird angenommen, dass sämtliche
GDNF-Neurturin-Persephin-Familienmitglieder einen hohen Grad an
Sequenzidentität
mit einem oder mehreren der drei Consensusabschnitten der identifizierten
Familienmitglieder in dem Abschnitt der Sequenz zwischen dem ersten
und siebten kanonischen Gerüstcystein
aufweisen. Insbesondere wird bei einem neuen Familienmitglied mindestens
eine Identität
von 62,5% mit dem Consensusabschnitt-Octapeptid, Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa1 Ser, Thr oder Ala darstellt, und Xaa2 Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 108),
oder mindestens eine Sequenzintensität von 62,5% mit dem Consensusabschnitt-Octapeptid,
Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys,
worin Xaa1 und Xaa2 Alanin
oder Serin darstellen (SEQ ID NO: 109), oder mindestens eine Sequenzintensität von 50%
mit dem Consensusabschnitt-Octapeptid, Asp-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Asp-Xaa4, worin Xaa1 Asparaginsäure oder
Glutaminsäure oder
keine Aminosäure
darstellt, Xaa2 Valin oder Leucin ist, Xaa3 Serin oder Threonin darstellt; und Xaa4 Valin oder Asparaginsäure ist (SEQ ID NO: 110), erwartet.
Die Erfinder glaubten hierin, dass jedes neue Familienmitglied 28
Aminosäuren
in der aneinander gereihten Sequenz zwischen dem ersten und siebten
kanonischen Gerüst-Cystein-Rest
aufweist, wie es in 15 gezeigt ist,
wobei die Reste von dem N-terminalen Ende der aneinander gereihten
Sequenz des Familienmitglieds (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu,
(14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26)
Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu,
(58) Cys, (59) Cys, (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71)
Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys und (89) Cys sind. Jedoch ist
es möglich,
dass es bis zu drei Nicht-Übereinstimmungen
kommt.
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Auf
der Basis der strukturellen Ähnlichkeiten
von Persephin zu den Sequenzen von Neurturin und GDNF wird ebenso
angenommen, dass Persephin das Überleben
und das Wachstum von neuronalen sowie von nicht-neuronalen Zellen
fördert.
Beispielsweise wurde gezeigt, dass Neurturin das Überleben
von oberen Halswirbel-Gangliazellen
und Knoten- (Nodose)-Sensor-Ganglia-Neuronen fördert (siehe Beispiele 1 bis
3). Es wurde weiterhin gezeigt, dass GDNF auf dopaminerge, symphatische
Motor- und verschiedene Sensorneuronen wirkt (Henderson et al. supra,
1994; Miles et al, J Cell Biol 130: 137–148, 1995; Yan et al, Nature
373: 341–344,
1995; Lin et al, Science 260: 1130–1132, 1993; Trupp et al, J
Cell Biol 130: 137–148,
1995; Martin et al Brain Res 683: 172–178, 1995; Bowenkamp et al
J Comp Neurol 355: 479–480,
1995). Folglich zeigten alle anderen bisher isolierten Wachstumsfaktoren
eine Wirkung auf viele unterschiedliche Zellarten (siehe beispielsweise
Scully und Otten, Cell Biol Int 19: 459–469, 1005; Hefti, Neurotrophic
Factor Therapy 25: 1418–1435,
1994). Folglich ist es wahrscheinlich, dass Persephin Aktivität auf eine
Vielzahl von verschiedenen neuronalen Zellen, sowohl peripherale
als auch zentrale, ebenso wie auf nicht-neuronale Zellen zeigt.
Bezüglich
der peripheral-neuronalen Zellen scheint das Zellprofil, für welches
Persephin eine das Überleben
fördernde
Aktivität
zeigt, verschieden von dem von Neurturin oder GDNF zu sein. Im Gegen satz
zu der das Überleben fördernden
Aktivität,
welche durch Neurturin und GDNF in sympathischen und sensorischen
Neuronen verursacht wird, zeigt Persephin keine Aktivität in diesen
Geweben bei den getesteten Konzentrationen. Nichts desto weniger
zeigt Persephin eine das Überleben
fördernde
Aktivität
in Mittelhirnzellen, welche aus embryonalen Rattenhirnen erhalten
wurden. Weiterhin kann eine Persephin-Aktivität auf einen speziellen Zielzelltyp
durch Routine-Experimentation unter Verwendung von Standardreferenzmodellen
bestimmt werden. Weiterhin haben die Erfinder hierin Hirn- und Herzgewebe
als Persephin exprimierende Gewebe identifiziert, was die Schlussfolgerung
weiter stützt,
dass Persephin wirken kann, um das Überleben und das Wachstum in
einer Vielzahl von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen zu fördern.
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Als
ein Beispiel für
die Wirkungen von neurotrophen Faktoren auf nicht-neuronale Gewebe
wirkt der prototypische neurotrophe Faktor, NGF, ebenso auf Mastzellen,
sodass deren Anzahl bei Injektion in neugeborene Ratten erhöht wird
(Aloe, J. Neuroimmunol. 18: 1–12,
1988). Zusätzlich
exprimieren Mastzellen den trk-Rezeptor und antworten auf NGF, sodass
NGF ein Mastzellen-Sekretagogum und ein das Überleben fördernder Faktor ist (Horigome
et al., J. Biol. Chem. 269: 2695–2707, 1994). Darüber hinaus
wirken Mitglieder der TGF-β-Superfamilie
auf viele Zelltypen mit unterschiedlicher Funktion und embryologischem
Ursprung.
-
Die
Erfinder haben hierin Gehirn und Herz als Gewebe identifiziert,
worin Persephin exprimiert wird, und es wird weiterhin angenommen,
dass Persephin in einer Anzahl von anderen neuronalen und nicht-neuronalen
Geweben exprimiert wird. Das verwandte Familienmitglied, Neurturin,
wird in einer Anzahl von nicht-neuronalen Geweben exprimiert, einschließlich Blut,
Knochenmark, neonatalen Leber- und
Mastzellen. Dieses legt eine Rolle für Neurturin in der Hämatopoesie,
Entzündung,
Allergie und Kardiomyopathie nahe. Persephin kann ein ähnliches
Aktivitätsprofil
aufweisen.
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Es
wird angenommen, dass neurotrophe Faktoren der NGF-Familie über Faktor-spezifische
Rezeptoren hoher Affinität
wirken (Tuszynski und Gage, 1994, supra). Nur besondere Abschnitte
des Proteins, welche an einer Rezeptorstelle wirken, sind für das Binden
an den Rezeptor erforderlich. Solche besonderen Abschnitte oder
diskreten Fragmente können
als ein Agonist wirken, wenn die Substanz den Persephin-Rezeptor
unter Auslösen
der fördernden
Wirkung auf das Zellüberleben
und das -wachstum aktiviert, und als Antagonisten zu Persephin,
wenn sie an den Rezeptor binden, allerdings diesen nicht aktivieren,
oder ein Überleben
und Wachstum fördern.
Solche Abschnitte oder Fragmente, welche Agonisten darstellen, und
jene, die Antagonisten sind, liegen ebenso innerhalb des Umfangs
der vorliegenden Erfindung.
-
Synthetische
Form(pan)-Wachstumsfaktoren können
ebenso durch Kombinieren der aktiven Domainen von Persephin mit
den aktiven Domainen von ein oder mehreren anderen Nicht-Persephin-Wachstumsfaktoren
aufgebaut werden. (Siehe beispielsweise Ilag et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92:
607–611,
1995). Diese Form-Wachstumsfaktoren,
so wird angenommen, weisen die kombinierten Aktivitäten oder
andere vorteilhafte Eigenschaften von Persephin und dem einen oder
den mehreren anderen Wachstumsfaktoren auf. Ebenso wird angenommen,
dass diese Form-Wachstumsfaktoren
potente und multispezifische Wachstumsfaktoren darstellen, welche
in der Behandlung eines breiten Spektrums von degenerativen Erkrankungen
und Zuständen,
einschließlich
von Erkrankungen, welche durch sämtliche
der zugrunde liegenden Faktoren, von denen die aktiven Domainen
erhalten wurden, behandelt werden können, nützlich sind. Solche Form-Wachstumsfaktoren
können
ebenso synergistische Effekte jenseits der Aktivitäten der
Eltern-Faktoren zur Verfügung
stellen (Barres et al., supra).
-
Form-Wachstumsfaktoren
können
ebenso chimäre
oder Hybrid-Polypeptide einschließen, welche aus Abschnitten
von Fragmenten von mindestens zwei Wachstumsfaktoren aufgebaut sind.
Wachstumsfaktoren der TGF-β-Superfamilie
sind strukturell verwandt mit hoch-konservierten Sequenzgrenzen,
wodurch die Familienmitglieder identifiziert werden. Insbesondere
sind sieben kanonische Grundgerüst-Cystein-Reste annähernd invariant
in den Mitgliedern der Superfamilie (Kingsley, Genes & Dev. 8: 133–146, 1994)
(siehe 1). Chimäre Polypeptidmoleküle können daher
aus einer Sequenz aufgebaut sein, welche im Wesentlichen identisch
zu einem Abschnitt des Persephin-Moleküls ist, bis zu ein oder mehreren
Kreuzpunkten, und ein oder mehreren Sequenzen, die jeweils im Wesentlichen
identisch sind mit einem Abschnitt eines anderen TGF-β-Superfamilien-Mitglieds,
welches sich auf der anderen Seite des/der entsprechenden ein oder
mehreren Kreuzpunkte erstreckt. Beispielsweise kann ein Abschnitt
des amino-terminalen Endes des Persephin-Polypeptids mit einem Abschnitt
des carboxy-terminalen Endes eines Neurturin-Polypeptids kombiniert
werden, oder alternativ kann ein Abschnitt des aminoterminalen Endes
eines Neurturin-Polypeptids mit einem Abschnitt des carboxy-terminalen
Endes eines Persephin-Polypeptids kombiniert werden. Solche Abschnitte
von Neurturin- oder
Persephin-Polypeptiden reichen vorzugsweise von ungefähr 5 bis
ungefähr
95, besonders bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 90, noch
mehr bevorzugt von ungefähr
20 bis ungefähr
80 und am meisten bevorzugt von ungefähr 30 bis ungefähr 70 zusammenhängenden
Aminosäuren,
und solche Abschnitte eines anderen Nicht-Persephin- oder, je nach dem, Nicht-Neurturin-TGF-β-Superfamilien-Mitglieds
beinhalten bevorzugt ungefähr
5 bis ungefähr
95, besonders bevorzugt ungefähr
10 bis ungefähr
90, noch mehr bevorzugt ungefähr
20 bis ungefähr
80 und am meisten be vorzugt ungefähr 30 bis ungefähr 70 zusammenhängende Aminosäuren. Beispielsweise
kann ein besonderer Kreuzpunkt zwischen den dritten und vierten
kanonischen Gerüst-Cystein-Resten
liegen. Ein solches beispielhaftes Konstrukt würde an dem 5'-Ende eine Sequenz,
welche eine Persephinsequenz vom Rest 1 bis zum dritten kanonischen
Gerüst-Cystein-Rest
37 und bis zu einem Kreuzpunkt irgendwo zwischen dem Rest 37 und
dem Rest 63, allerdings ohne den vierten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest
64 einzuschließen,
umfasst, enthalten (zur Verdeutlichung siehe das reife Persephin,
SEQ ID NO: 80). Das 3'-Ende
des Hybrid-Aufbaus würde
eine Sequenz darstellen, welche von einem anderen TGF-β-Superfamilienmitglied
abgeleitet ist, wie beispielsweise Neurturin, welches ein anderes
TGF-β-Superfamilienmitglied
darstellt, welches Persephin nah verwandt ist. Unter Verwendung
von Neurturin als anderes TGF-β-Familienmitglied
würde der
Hybrid-Aufbau jenseits des Kreuzpunktes eine Sequenz umfassen, welche an
dem gewünschten
Kreuzpunkt in der Neurturin-Sequenz zwischen dem dritten kanonischen
Gerüst-Cystein-Rest
37 und dem vierten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest 67 von Neurturin
beginnt und über
den Rest 100 an dem 3'-Ende
von Neurturin sich fortsetzt. Ein zweiter beispielhafter Hydrid-Aufbau
würde den
Rest 1 über
einen Kreuzpunkt zwischen den Resten 37 und 67 von Neurturin umfassen,
angrenzend verknüpft
mit Resten von dem Kreuzpunkt zwischen den Resten 37 und 64 bis
zum Rest 96 von Persephin. Die obengenannten Konstrukte mit Persephin
und Neurturin sollen lediglich als Beispiele dienen, wobei das spezifische TGF-β-Familienmitglied
aus den Familienmitgliedern ausgewählt ist, einschließlich, allerdings
ohne darauf begrenzt zu sein, dem transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFß1), dem
transformierenden Wachstumsfaktor-β2
(TGFβ2),
dem transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin-β A (INH-βA),
Inhibin-β B
(INHβB),
dem Nodal-Gen (NODAL), den morphogenetischen Knochenproteinen 2
und 4 (BMP2 und BMP4), dem Drosophila decapentaplegic-Gen (dpp),
den morphogenetischen Knochenproteinen 5–8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8),
der Drosophila-60A-Genfamilie (60A), dem morphogenetischen Knochenprotein
3 (BMP3), dem Vgl-Gen, den Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und
3 (GDF1 und GDF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α (INHα), dem MIS-Gens (MIS), Wachstumsfaktor
9 (GDF-9), dem Glial-abgeleiteten neutrotropen Wachstumsfaktor (GDNF),
Neurturin (NTN) und Persephin. Zusätzlich kann der Kreuzpunkt
irgendeinen Rest zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüst-Cystein-Molekülen von
Neurturin und dem speziellen anderen Familienmitglied darstellen.
Darüber
hinaus können
zusätzliche
Kreuzpunkte zum Einführen
irgendeiner erwünschten
Zahl von Persephin-Abschnitten oder -Fragmenten mit Abschnitten
oder Fragmenten von irgendeinem oder mehreren anderen Familienmitgliedern
verwendet werden.
-
Beim
Aufbau eines besonderen chimären
Moleküls
werden die Abschnitte von Persephin und die Abschnitte des anderen
Nicht-Persephin-Wachstumsfaktors unter Verwendung von PCR vervielfältigt/amplifiziert, gemischt
und als Templat für
eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Forward-Primers (Vorwärts-Primer) von
dem einen und des Reverse-Primers (Rückwärts-Primer) von dem anderen
der beiden Komponentabschnitte des chimären Moleküls eingesetzt. Folglich sind
beispielsweise ein Vorwärts-
und Rückwärts-Primer ausgewählt, um
den Abschnitt von Persephin von dem Anfang bis zu dem ausgewählten Kreuzpunkt
zwischen den dritten und vierten kanonischen Cystein-Resten zu vervielfältigen bzw.
zu verstärken,
wobei ein Persephin-Plasmid als Templat verwendet wird. Ein Vorwärts-Primer
mit einem mit der Persephinsequenz überlappenden 5'-Abschnitt und ein
Rückwärts-Primer
werden anschließend
zur Vervielfältigung
des Abschnitts des anderen Nicht-Persephin-Wachstumsfaktors-Mitglieds der TGF-β-Superfamilie
von dem entsprechenden Kreuzpunkt bis zum 3'-Ende unter Verwendung eines Plasmid-Templats,
welches die Kodierungssequenz für das
Nicht-Persephin-TGF-β-Familienmitglied
enthält,
verwendet. Die Produkte der zwei PCR-Reaktionen werden gelgereinigt
und zusammen vermischt, und eine PCR-Reaktion wird durchgeführt. Unter
Verwendung eines Aliquots dieser Reaktion als Templat wird eine
PCR-Reaktion unter Verwendung des Persephin-Vorwärts-Primers und des Rückwärts-Primers
für den
Nicht-Persephin-Wachstumsfaktor
durchgeführt.
Das Produkt wird anschließend
in einen Expressionsvektor zur Bildung des chimären Moleküls kloniert.
-
Man
nimmt an, dass die chimären
Wachstumsfaktoren in der Förderung
des Wachstums und der Entwicklung von Zellen und zur Verwendung
in der Vorbeugung der Atrophie, der Degeneration oder dem Tod von Zellen,
insbesondere in Neuronen, wirksam sind. Die chimären Polypeptide können ebenso
als Rezeptor-Antagonisten einer oder beider der Wachstumsfaktoren
in voller Länge,
von denen das chimäre
Polypeptid abgeleitet wurde, oder als ein Antagonist irgendeines
anderen Wachstumsfaktors, der an demselben Rezeptor oder denselben
Rezeptoren wirkt, dienen.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenso therapeutische oder pharmazeutische
Zusammensetzungen, welche Persephin oder Neurturin in einer wirksamen
Menge enthalten, zur Behandlung von Patienten mit einer zellulären Degeneration
oder Fehlfunktion und Persephin zur Verwendung in einem Verfahren
zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers. Eine
Vielzahl von degenerativen Erkrankungen kann unter Verwendung von
Persephin und den oben beschriebenen Zusammensetzungen behandelt
werden. Wenn die zelluläre
Degeneration die neuronale Degeneration einschließt, umfassen
diese Erkrankungen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, die
periphäre
Neuropathie, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinsonismus,
Huntington-Chorea, den ischämichen
Infarkt, akute Hirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumore
des Nervensystems, Multiple Sklerose, periphäre Nerventraumata oder -verletzungen,
Aussetzung gegenüber
Neurotoxinen, metabolische Erkrankungen, wie Diabetes oder Nierenfehlfunktionen
und die durch infektiöse
Mittel bedingte Schäden.
Insbesondere die Fähigkeit
von Persephin, das Überleben
in Mittelhirnzellen zu fördern,
legt eine Anwendbarkeit dieses Wachstumsfaktors in der Behandlung
von neuronalen degenerativen Erkrankungen des ZNS, wie der Parkinsonschen
Erkrankung, nahe.
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Wenn
die zelluläre
Degeneration eine Knochenmarkzellendegeneration einschließt, umfassen
diese Erkrankungen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, Erkrankungen
unzureichender Blutzellen, wie beispielsweise Leukopenien, einschließlich Eosinopenie
und/oder Basopenie, Lymphopenie, Monocytopenie, Neutropenie, Anämien, Thrombocytopenie
sowie eine Insuffizienz der Stammzellen bei einer der obengenannten
Erkrankungen. Die zelluläre
Degeneration kann ebenso Herzmuskelzellen bei Krankheiten, wie der
Kardiomyopathie und der kongestiven Herzinsuffizienz, einschließen. Die
oben genannten Zellen und Gewebe können ebenso hinsichtlich einer
unterdrückten
bzw. verminderten Funktion behandelt werden.
-
Das
Persephin und die Zusammensetzungen hierin können ebenso zur Vorbeugung
der Degeneration und/oder zur Förderung
des Überlebens
in anderen nicht-neuronalen
Geweben verwendet werden. Der Fachmann kann unter Verwendung einer
Vielzahl von Assays, welche im Stand der Technik zur Identifizierung
bekannt sind, leicht bestimmen, ob Persephin in der Förderung
des Überlebens
oder der Funktion in einem spezifischen Zelltyp nützlich ist.
-
Unter
bestimmten Umständen
kann es ebenso wünschenswert
sein, die Menge an exprimiertem Persephin zu modulieren oder zu
verringern. Folglich können
in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung Persephin-Anti-Sense-Oligonucleotide
bereitgestellt werden zur Verwendung in der Verminderung des Anteils der
Expression von Persephin durch eine Zelle durch Verabreichung eines
oder mehrerer Persephin-Anti-Sense-Oligonucleotide. Unter Persephin-Anti-Sense-Oligonucleotiden
werden hierin Oligonucleotide verstanden, welche eine Nucleotidsequenz
aufweisen, die über
Basenpaarung mit einer spezifischen komplementären Nucleinsäuresequenz,
welche in der Exprimierung von Persephin involviert ist, wechselwirken,
sodass die Exprimierung von Persephin vermindert wird. Vorzugsweise
ist die in der Exprimierung von Persephin involvierte spezifische
Nucleinsäuresequenz
ein Genom-DNA-Molekül oder mRNA-Molekül, welches
Sequenzen des Persephin-Gens enthält. Dieses Genom-DNA-Molekül kann flankierende
Abschnitte des Persephin-Gens, untranslatierte Abschnitte von Persephin-mRNA,
die Pre- oder Pro-Abschnitte des Persephin-Gens oder die Kodierungssequenz
für reifes
Persephin-Protein umfassen. Der Begriff komplementär zu einer
Nucleotid-Sequenz im Kontext von Persephin-Anti- Sense-Oligonucleotiden und Verfahren
dafür bedeutet
ausreichend komplementär
zu einer solchen Sequenz, um die Hybridisierung mit dieser Sequenz
in einer Zelle, d.h. unter physiologischen Bedingungen, zu erlauben.
Die Persephin- Anti-Sense-Oligonucleotide umfassen vorzugsweise
eine Sequenz, welche ungefähr
8 bis ungefähr
100 Nucleotide enthält,
und besonders bevorzugt umfassen die Persephin-Anti-Sense-Oligonucleotide
ungefähr
15 bis ungefähr
30 Nucleotide. Die Persephin-Anti-Sense-Oligonucleotide können ebenso
eine Vielzahl von Modifikationen enthalten, die eine Resistenz gegenüber nucleolytischem
Abbau verleihen, wie beispielsweise modifizierte Internucleosid-Bindungen
(Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90: 543–548, 1990; Schneider und Banner,
Tetrahedron Lett. 31: 335, 1990), modifizierte Nucleinsäurebasen
und/oder Zucker und ähnliches.
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Die
therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung können
durch eine jegliche geeignete im Stand der Technik bekannte Route
verabreicht werden, einschließlich beispielsweise
der intravenösen,
subkutanen, intramuskulären,
transdermalen, intrathecalen oder intracerebralen Verabreichung.
Die Verabreichung kann entweder schnell durch Injektion oder innerhalb
einer Zeitdauer durch langsame Infusion oder Verabreichung von einer
langsam freisetzenden (slow realease) Zubereitung erfolgen. Zur
Behandlung von Geweben in dem Zentralnervensystem kann die Verabreichung
durch Injektion oder Infusion in das cerebrospinale Fluid (CSF)
erfolgen. Wenn Persephin zu Zellen in dem Zentralnervensystem verabreicht
werden sollen, kann die Verabreichung mit ein oder mehreren Mitteln,
welche zur Förderung des
Eindringens von Persephin durch die Blut-Hirn-Schranke in der Lage
sind, erfolgen.
-
Persephin
kann ebenso mit Mitteln verbunden oder konjugiert werden, welche
die erwünschten
pharmazeutischen oder pharmakodynamischen Eigenschaften verleihen.
Beispielsweise kann Persephin an irgendeine im Stand der Technik
zur Förderung
der Penetration bzw. des Eindringens oder des Transports durch die
Blut-Hirn-Schranke
bekannten Substanz gekoppelt sein, wie beispielsweise ein Antikörper an
den Transferrin-Rezeptor, und mittels intravenöser Injektion verabreicht werden.
(Siehe beispielsweise Friden et al., Science 259: 373–377, 1993).
Darüber
hinaus kann Persephin an ein Polymer, wie Polyethylenglykol, stabil
gebunden sein, um wünschenswerte
Eigenschaften hinsichtlich der Solubilität, Stabilität, der Halbwertszeit und anderer
pharmazeutisch annehmbarer Eigenschaften zu erhalten. (Siehe beispielsweise
Davis et al., Enzyme Eng. 4: 169–73, 1978; Burnham, Am. J.
Hosp. Pharm. 51: 210–218,
1994).
-
Die
Zusammensetzungen werden gewöhnlich
in der Form von pharmazeutischen Zubereitungen eingesetzt. Solche
Zubereitungen werden in einer im pharmazeutischen Stand der Technik
bekannten Weise hergestellt. Eine bevorzugte Zuberei tung verwendet
ein Vehikel von physiologischer Salzlösung, allerdings wird in Erwägung gezogen,
dass andere pharmazeutisch annehmbare Träger, wie physioglogische Konzentrationen
anderer nichttoxischer Salze, 5%-ige wässrige Glucoselösung, steriles
Wasser oder ähnliches,
ebenso verwendet werden können.
Es kann ebenso wünschenswert
sein, dass ein geeigneter Puffer in der Zusammensetzung vorliegt.
Solche Lösungen
können,
sofern dieses erwünscht
ist, lyophilisiert und in einer sterilen Ampulle, welche für die Wiederherstellung
durch Zugabe von sterilem Wasser für die Injektion vorgesehen sind,
gelagert werden. Das primäre
Lösungsmittel
kann wässrig
oder alternativ nicht wässrig
sein. Persephin kann ebenso in eine feste oder halbfeste biologisch
kompatible Matrix, welche in eine Behandlung erfordernde Gewebe
implantiert werden kann, eingefügt
werden.
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Der
Träger
kann ebenso andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten zur Modifizierung
oder zum Erhalt des pH-Wertes, der Osmolarität, der Viskosität, der Klarheit,
der Farbe, der Sterilität,
der Stabilität,
der Auflösungsrate
oder des Geruchs der Zubereitung enthalten. In ähnlicher Weise kann der Träger noch
weitere pharmazeutisch annehmbare Hilfsmittel/Exzipienten zur Modifizierung
oder zum Erhalt der Freisetzung oder der Absorption oder der Penetration
durch die Blut-Hirn-Schranke
enthalten. Solche Exzipienten sind solche Substanzen, welche gewöhnlich und
herkömmlich
zur Formulierung von Dosierungen für die parenterale Verabreichung
in entweder Einheitsdosierungs- oder Mehrfachdosierungs-Form oder
für die
direkte Infusion in das cerebrospinale Fluid durch kontinuierliche
oder periodische Infusion eingesetzt werden.
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Die
Dosierungsverabreichung kann in Abhängigkeit von den pharmakokinetischen
Parametern der Dosierungsformulierung und der verwendeten Verabreichungsroute
wiederholt werden.
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Es
wird ebenso in Erwägung
gezogen, dass bestimmte Formulierungen, welche Persephin enthalten, oral
verabreicht werden. Solche Zubereitungen sind vorzugsweise verkapselt
und mit geeigneten Trägern
in festen Dosierungsformen formuliert. Einige Beispiele geeigneter
Träger,
Exzipienten und Verdünnungsmittel umfassen
Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärken, Akaziengummi,
Calciumphosphat, Alginate, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose,
Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Gelatine, Sirup, Methylcellulose, Methyl-
und Propylhydroxybenzoate, Talk, Magnesium, Stearat, Wasser, Mineralöl und ähnliches.
Die Zubereitungen können
zusätzlich
Schmier- bzw. Gleitmittel, Benetzungsmittel, Emulgierungs- und Suspendierungsmittel,
Konservierungsmittel, Süßstoffe
und Geschmacksstoffe enthalten. Die Zusammensetzungen können derartig
formuliert sein, dass eine schnelle, andauernde oder verzögerte Freisetzung
der Wirkstoffbestandteile nach der Verabreichung an den Patienten
durch Einsetzen von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Verfügung gestellt
wird. Die Zubereitungen können
ebenso Substanzen enthalten, welche den proteolytischen Abbau vermindern
und die Absorption fördern,
wie beispielsweise oberflächenaktive
Mittel.
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Die
spezifische Dosierung wird gemäß dem ungefähren Körpergewicht
oder der Körperoberfläche des Patienten
oder dem Volumen des zu belegenden Körperraums berechnet. Die Dosierung
wird ebenso in Abhängigkeit
der ausgewählten
spezifischen Verabreichungsroute berechnet. Eine darüber hinausgehende
Verfeinerung der Berechnungen, welche zur Bestimmung der geeigneten
Dosierung für
die Behandlung notwendig ist, wird routinemäßig vom Fachmann vorgenommen.
Solche Berechnungen können
ohne unzumutbares Experimentieren vom Fachmann im Lichte der Aktivität von Persephin
vorgenommen werden. Für
Neurturin sind die Daten hinsichtlich der Aktivität in den
Zielzellen hierin sowie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung Nr. 08/519,777
beschrieben, und es wird angenommen, dass die für die Aktivität in einen
zellulären
Niveau erforderliche Konzentration von Persephin ähnlich zu
der von Neurturin ist. Die Persephin-Aktivität auf Mittelhirnzellen ist
unten in Beispiel 17 beschrieben. Die Persephin-Aktivität auf einem
spezifischen Zielzellentyp kann durch Routine-Experimente bestimmt
werden. Die exakten Dosierungen werden in Verbindung mit Standard-Dosierungs-Antwort-Studien
bestimmt. Es versteht sich von selbst, dass die Menge der letztendlich
verabreichten Zusammensetzung durch einen praktischen Arzt im Lichte
der relevanten Umstände,
einschließlich der
zu behandelnden Erkrankung oder Erkrankungen, der Wahl der zu verabreichenden
Zusammensetzung, des Alters, des Gewichts und der Antwort des einzelnen
Patienten, der Schwere der Symptome des Patienten und der gewählten Verabreichungsroute,
bestimmt wird.
-
Das
erfindungsgemäße Persephin
kann therapeutisch durch Implantieren von Vektoren oder transformierten
Zellen in Patienten verabreicht werden, welche in der Lage sind,
eine biologisch aktive Form von Persephin oder einen Precursor von
Persephin, d.h. ein Molekül,
welches leicht in eine biologisch aktive Form von Persephin durch
den Körper überführt werden
kann, zu produzieren. In einem Ansatz können Persephin-ausschüttende Zellen
in semipermeable Membranen zur Implantierung in einen Patienten
eingekapselt werden. Die Zellen können Zellen darstellen, die
Persephin oder eine Vorstufe davon normal exprimieren, oder die
Zellen können
zur Expression von Persephin oder eines Vorläufers davon transformiert werden.
Es ist bevorzugt, dass die Zelle menschlichen Ursprungs ist und
dass das Persephin menschliches Persephin darstellt, wenn der Patient
ein Mensch ist. Jedoch können
die Zubereitungen und Verfahren hierin für veterinäre sowie für menschliche Anwendungen verwendet
werden, und der Begriff "Patient", wie er hierin verwendet
wird, soll menschliche und veterinäre Patienten einschließen.
-
Zellen
können
ex vivo für
die Verwendung in der Transplantation oder der Verpflanzung in Patienten gezüchtet werden
(Muench et al., Leuk & Lymph
16: 1–11,
1994). In einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann Persephin zur Förderung der ex viuo-Vermehrung
von einer Zelle für
die Transplantation oder Verpflanzung verwendet werden. Bisherige
Verfahren haben Bioreaktor-Kultur-Systeme, welche Faktoren enthalten,
wie Erythropoietin, koloniestimulierende Faktoren, Stammzellenfaktor
und Interleukine, zur Vermehrung der hämatopoethischen Stammzellen
für Erythrocyten,
Monocyten, Neutrophile und Lymphocyten verwendet (Verfaillie, Stem
Cells 12: 466–476,
1994). Diese Stammzellen können
aus dem Knochemark eines menschlichen Spenders, aus menschlichem
periphären
Blut oder aus Nabelschnurblutzellen isoliert werden. Diese erweiterten
Blutzellen werden zur Behandlung von Patienten verwendet, denen
es an diesen Zellen als ein Ergebnis spezifischer Erkrankungen oder
als ein Ergebnis einer hochdosierten Chemotherapie zur Behandlung
eines bösartigen
Tumors mangelt (George, Stem Cells 12 (Suppl. 1): 249–255, 1994).
In dem Fall eines Zelltransplantats nach der Chemotherapie können autologe
Transplantate durch Entfernung von Knochenmarkzellen vor der Chemotherapie,
das Vermehren/Expandieren der Zellen ex vivo unter Verwendung von
Verfahren, welche ebenso zum Eliminieren von bösartigen Zellen dienen, und
durch Transplantieren der vermehrten Zellen zurück in den Patienten nach der
Chemotherapie durchgeführt
werden (als Überblick
siehe Rummel und Van Zant, J. Hematotherapy 3: 213–218, 1994).
Da Persephin und der verwandte Wachstumsfaktor Neurturin in dem
sich entwickelnden Tier in besonderen Geweben, bei denen die Proliferation
und Differentation von Progenitor-Zellen auftritt, exprimiert wird,
nimmt man an, dass Persephin zur Regulierung bzw. Kontrolle der
Proliferation von hämatopoetischen
Stammzellen und der Differentiation von reifen hämatopoetischen Zellen dienen
kann. Folglich könnte
die Zugabe von Persephin zu Kultursystemen, welche für die ex vivo-Vermehrung
von Zellen verwendet werden, die Rate, bei der bestimmte Populationen
von Zellen sich vermehren oder differenzieren, stimulieren und die
Effektivität
dieser Vermehrungssysteme in der Bildung von für die Transplantation benötigten Zellen
verbessern.
-
Es
wird ebenso angenommen, dass Persephin für die ex vivo-Vermehrung von
Vorläuferzellen
in dem Nervensystem verwendet werden kann. Die Transplantation oder
Verpflanzung von Zellen wird momentan als eine Therapie für Erkrankungen
untersucht, bei denen bestimmte Populationen von Neuronen aufgrund
der Degeneration verloren gingen, wie beispielsweise in der Parkinsonschen
Krankheit (Bjorklund, Curr. Opin. Neurobiol. 2: 683–689, 1992).
Neuronale Vorläuferzellen
können
von tierischen oder menschlichen Spendern oder von menschlichem
Fötalgewebe
erhalten werden und anschließend
in einer Kultur unter Verwendung von Persephin vermehrt werden.
Diese Zellen können
dann in die Patienten verpflanzt werden, wo sie zum Ersatz einiger
der aufgrund der Degeneration verlorenen Zellen dienen können. Weil
sich gezeigt hat, dass Neurotrophine zur Stimulierung des Überlebens
und der Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage sind, wie
beispielsweise zur NT-3-Stimulierung von sympathischen Neuroblast-Zellen
(Birren et al., Develop. 119: 597–610, 1993), könnte Persephin
ebenso in ähnlicher
Weise während
der Entwicklung des Nervensystems fungieren und könnte in
der ex vivo-Vermehrung von neuronalen Zellen nützlich sein.
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In
einer Anzahl von Umständen
wäre es
wünschenswert,
die Anteile von Persephin in einem Patienten zu bestimmen. Die Identifizierung
von Persephin zusammen mit dem vorliegenden Bericht, dass Persephin durch
bestimmte Gewebe exprimiert wird, liefert die Basis für den Rückschluss,
dass die Anwesenheit von Persephin eine normale physiologische Funktion
hinsichtlich des Zellenwachstums und -überlebens ausübt. In der Tat
sind andere neurotrophe Faktoren dafür bekannt, dass sie eine Rolle
in der Funktion von neuronalen und nichtneuronalen Geweben spielen.
(Als Überblick
siehe Scully und Otten, Cell. Biol. Int. 19: 459–469, 1995; Otten und Gadient,
Int. J. Devl. Neurosciences 13: 147–151, 1995). Endogen gebildetes
Persephin kann ebenso eine Rolle in bestimmten Erkrankungen spielen,
insbesondere wo eine zelluläre
Degeneration auftritt, wie in neurodegenerativen Zuständen oder
Erkrankungen. Andere neurotrophe Faktoren sind dafür bekannt,
dass sie sich während
des Erkrankungsverlaufs ändern.
Beispielsweise werden bei der Multiplen Sklerose die Anteile an
NGF-Protein in dem cerebrospinalen Fluid während den akuten Phasen der
Erkrankung erhöht
(Bracci-Laudiero et al., Neuroscience Lett. 147: 9–12, 1992),
und bei systemischem Lupus erythematosus besteht ein Zusammenhang
zwischen den Entzündungsabschnitten
und NGF-Anteilen in den Seren (Bracci-Laudiero et al., NeuroReport
4: 563–565,
1993).
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Unter
der Annahme, dass Persephin in bestimmten Geweben exprimiert wird,
ist es wahrscheinlich, dass der Anteil an Persephin sich in einer
Vielzahl von Erkrankungen ändern
kann und dass die Quantifizierung des Persephin-Niveaus klinisch
nützliche
Informationen zur Verfügung
stellen kann. Darüber
hinaus können
in der Behandlung von degenerativen Erkrankungen Zusammensetzungen,
welche Persephin enthalten, verabreicht werden, und es wäre äußerst wünschenswert,
bestimmte Zielniveaus von Persephin in dem Serum, in dem cerebrospinalen
Fluid oder in irgendeinem gewünschten
Gewebe-Abschnitt zu erhalten. Es wäre daher von Vorteil, dazu
in der Lage zu sein, die Anteile an Persephin in einem Patienten
zu verfolgen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ebenso
Verfahren zur Detektierung der Anwesenheit von Persephin in einer
Probe von einem Patienten zur Verfügung.
-
Der
Begriff "Detektierung", wie er hierin in
dem Kontext der Detektierung der Anwesenheit von Persephin in einem
Patienten verwendet wird, soll die Bestimmung der Menge von Persephin
oder der Fähigkeit, eine
Menge an Persephin in einem Patienten zu exprimieren, die Unterscheidung
von Persephin von anderen Wachstumsfaktoren, die Abschätzung der
Vorhersage hinsichtlich des möglichen
Ausbruchs einer degenerativen Erkrankung und der Aussicht auf Heilung,
die Verfolgung des Persephin-Niveaus innerhalb einer Zeitdauer als
Maß des
Status der Erkrankung sowie das Verfolgen des Persephin-Niveaus
zur Bestimmung einer bevorzugten therapeutischen Behandlung für den Patienten
einschließen.
-
Um
die Anwesenheit von Persephin in einem Patienten zu detektieren,
wird eine Probe von dem Patienten genommen. Die Probe kann eine
Gewebebiopsieprobe oder eine Blut-, Plasma-, Serum-, CSF- oder eine ähnliche
Probe darstellen. Persephin wird in Nieren- und Gehirngeweben exprimiert,
wie in Beispiel 18 gezeigt ist, und es wird angenommen, dass Persephin
ebenso in einer Vielzahl von anderen noch nicht getesteten Geweben
exprimiert wird. Folglich können
Proben für
die Detektierung von Persephin von jeglichen Geweben genommen werden,
welche Persephin exprimieren. Wenn das Periphär-Niveau von Persephin beurteilt wird,
ist es bevorzugt, dass die Probe eine Blut-, Plasma- oder Serum-Probe
oder alternativ eine Gewebebiopsie-Probe darstellt. Wenn das Niveau
von Persephin in dem zentralen Nervensystem bestimmt wird, ist eine bevorzugte
Probe eine aus dem cerebrospinalen Fluid stammende Probe.
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In
einigen Fällen
ist es wünschenswert,
zu bestimmen, ob das Persephin-Gen in dem Patienten oder in einem
Gewebe oder einer Zelllinie innerhalb des Patienten intakt ist.
Unter einem intakten Persephin-Gen wird verstanden, dass keine Veränderungen
in dem Gen, wie Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, Chromosomenbrüche, Chromosomen-Neuanordnungen
und ähnliches,
auftreten, wobei solche Veränderungen
die Bildung von Persephin oder deren biologische Aktivität, Stabilität oder ähnliches ändern kann,
was zu Erkrankungsprozessen oder Empfänglichkeit gegenüber zellulären degenerativen
Erkrankungen führt.
Umgekehrt wird hierin unter einem nicht-intakten Persephin-Gen verstanden,
dass solche Veränderungen
vorliegen. Folglich wird in einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zur Detektierung und Charakterisierung jeglicher
Veränderungen
in dem Persephin-Gen zur Verfügung
gestellt. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines Oligonucleotids,
welches die Persephin-cDNA, Genom-DNA oder ein Fragment davon oder ein
Derivat davon enthält.
Unter einem Derivat eines Oligonucleotids wird verstanden, dass
das abgeleitete Oligonucleotid im Wesentlichen dasselbe ist wie
die Sequenz, von der es abgeleitet ist, dahingehend dass die abgeleitete
Sequenz ausreichende Sequenzkomplementarität zu der Sequenz aufweist,
von der sie abge leitet ist, um an das Persephin-Gen zu hybridisieren.
Die abgeleitete Nucleotidsequenz ist nicht notwendigerweise physisch
bzw. physikalisch von der Nucleotidsequenz abgeleitet, sondern kann
in irgendeiner Weise gebildet werden, einschließlich beispielsweise der chemischen
Synthese oder DNA-Replikation oder der reversen Transkription oder
Transkription.
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Typischerweise
wird eine Patienten-Genom-DNA von einer Zellprobe des Patienten
isoliert und mit ein oder mehreren Restriktions-Endonukleasen, wie
beispielsweise TagI und AluI, verdaut. Unter Verwendung des Southern-Blot-Protokolls,
welches im Stand der Technik bekannt ist, bestimmt dieser Assay,
ob ein Patient oder ein bestimmtes Gewebe in einem Patienten ein
intaktes Persephin-Gen oder eine Persephin-Gen-Anomalität aufweist.
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Die
Hybridisierung an das Persephin-Gen würde die Denaturierung der Chromosomen-DNA
unter Erhalt einer Einzelstrang-DNA; das Kontaktieren der Einzelstrang-DNA
mit einer Gensonde, welche mit der Persephin-Gen-Sequenz verbunden
ist; und die Identifizierung der hybridisierten DNA-Sonde zur Detektierung
der Chromosomen-DNA, welche mindestens einen Teil des menschlichen
Persephin-Gens enthält,
einschließen.
-
Der
Begriff "Sonde", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf eine Struktur, welche ein Polynucleotid umfasst,
das eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz aufgrund der Komplementarität der Sondensequenz
mit einer Sequenz in dem Zielbereich bildet. Die Sonden müssen nicht
die exakte Sequenz der Zielsequenz wiedergeben, jedoch muss sie
ausreichend komplementär
sein, um selektiv mit dem zu amplifizierenden Strang zu hybridisieren.
Unter selektiver Hybridisierung oder spezifischer Hybridisierung
wird verstanden, dass ein Polynucleotid vorzugsweise an ein Ziel-Polynucleotid
hybridisiert. Oligomere, welche zur Verwendung als Sonden geeignet
sind, können
ein Minimum von ungefähr
8 bis 12 aufeinanderfolgenden Nucleotiden enthalten, welche zu der
Zielsequenz komplementär
sind, und vorzugsweise ein Minimum von ungefähr 15 Nucleotiden aufweisen,
obwohl Polynucleotide mit bis zu 20 Nucleotiden und bis zu 100 Nucleotiden
oder sogar mehr innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen.
-
Die
Persephin-Gen-Sonden der vorliegenden Erfindung können DNA-
oder RNA-Oligonucleotide
darstellen und können
durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren hergestellt
werden, wie beispielsweise durch Ausschneiden, Transkription oder
chemische Synthese. Sonden können
mit jeglichen im Stand der Technik bekannten Labeln, wie beispielsweise
mit radioaktiven oder fluoreszierenden Labeln oder enzymatischen
Markern, gelabelt sein. Das Labeln der Sonde kann durch irgendein
im Stand der Technik bekanntes Verfahren erfolgen, wie durch PCR,
Randompriming, End-Labeln, Nick-Translation oder ähnliches. Der
Fachmann wird ebenso feststellen, dass andere Verfahren, welche
keine gelabelte Sonde einsetzen, zur Bestimmung der Hybridisierung
verwendet werden können.
Beispiele für
Verfahren, welche zur Detektierung der Hybridisierung verwendet
werden können,
umfassen den Southern-Blot, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und
Einzelstrangkonformationspolymorphismus mit PCR-Amplifikation.
-
Die
Hybridisierung wird typischerweise bei 25 bis 45°C, besonders bevorzugt bei 32
bis 40°C
und ganz besonders bevorzugt bei 37 bis 38°C durchgeführt. Die für die Hybridisierung erforderliche
Zeit reicht von ungefähr
0,25 bis ungefähr
96 Stunden, besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis ungefähr 72 Stunden
und am meisten bevorzugt von ungefähr 4 bis ungefähr 24 Stunden.
-
Persephin-Gen-Anomalien
können
ebenso unter Verwendung des PCR-Verfahrens und von Primern, welche
innerhalb des Persephin-Gens liegen oder dieses flankieren, detektiert
werden. Das PCR-Verfahren ist im Stand der Technik bekannt. Kurz
gesagt wird dieses Verfahren durchgeführt unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern,
welche zur Hybridisierung der Nucleinsäuresequenzen, welche eine Zielsequenz
flankieren, die innerhalb eines Persephin-Gens liegt, in der Lage
sind, sowie unter Amplifizieren der Zielsequenz. Der Begriff "Oligonucleotid-Primer", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen kurzen Strang der DNA oder RNA typischerweise
im Längenbereich
von ungefähr
8 bis ungefähr
30 Basen. Die Aufwärts-
und Abwärts-Primer
reichen typischerweise von ungefähr
15 bis ungefähr
20 Basenpaaren und bis ungefähr
30 Basenpaare oder mehr in der Länge.
Die Primer können
an die flankierenden Bereiche zur Replikation der Nucleotidsequenz
hybridisieren. Die Polymerisation wird durch eine DNA-Polymerase
in Gegenwart von Deoxynucleotid-Triphosphaten oder Nucleotid-Analoga
unter Bildung von doppelsträngigen
DNA-Molekülen
katalysiert. Die Doppelstränge
werden anschließend
durch irgendein Denaturierungsverfahren, einschließlich dem
physikalischen, chemischen oder enzymatischen, getrennt. Normalerweise
wird das Verfahren der physikalischen Denaturierung verwendet, welches
das Erwärmen
der Nucleinsäure,
typischerweise auf Temperaturen von ungefähr 80°C bis 105°C innerhalb von Zeitdauern im
Bereich von ungefähr
1 bis ungefähr
10 Minuten einschließt.
Das Verfahren wird bis zur gewünschten
Anzahl von Zyklen wiederholt.
-
Die
Primer sind derartig ausgewählt,
dass sie zu dem Strang der zu amplifizierenden DNA im Wesentlichen
komplementär
sind. Daher müssen
die Primer nicht die exakte Sequenz des Templats wiedergeben, sondern
müssen
ausreichend komplementär
sein, um mit dem zu amplifizierenden Strang selektiv zu hybridisieren.
Unter selektiver Hybridisierung oder spezifischer Hybridisierung
wird verstanden, dass ein Polynucleotid vorzugsweise an ein Ziel-Polynucleotid
hybridisiert.
-
Nach
der PCR-Verstärkung
bzw. -Amplifizierung wird die DNA-Sequenz, welche Persephin oder Pre-Pro-Persephin
oder ein Fragment davon umfasst, anschließend direkt sequenziert und
durch Vergleich der Sequenz mit den hierin offenbarten Sequenzen
analysiert, um die Veränderungen
zu identifizieren, welche die Aktivität oder das Expressionsniveau
oder ähnliches ändern könnten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Detektierung von Persephin auf der Basis einer
Gewebeanalyse, welche das Persephin-Gen exprimiert, zur Verfügung gestellt.
Es wurde gefunden, dass bestimmte Gewebe, wie die unten in Beispiel
18 identifizierten, dass Persephin-Gen exprimieren. Das Verfahren
umfasst das Hybridisieren einer Polynucleotid-Sonde an mRNA aus
einer Probe von Geweben, welche normalerweise das Persephin-Gen
exprimieren, oder aus einer cDNA, hergestellt aus der mRNA der Probe. Die
Probe wird von einem Patienten, welcher unter dem Verdacht steht,
eine Anomalität
in dem Persephin-Gen aufzuweisen, oder aus einem speziellen Patienten-Gewebe
oder -Zelltyp erhalten, welche unter dem Verdacht stehen, eine Anomalität in dem
Persephin-Gen aufzuweisen. Die Referenz-Persephin-Polynucleotid-Sonde kann die
SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191,
SEQ ID NOS: 203 bis 206 oder deren Derivate oder deren Fragmente
umfassen, solange solche Derivate oder Fragmente spezifisch an die
Persephin-mRNA hybridisieren, oder aus einer cDNA hergestellt aus
einer Persephin-mRNA.
-
Zur
Detektierung der Anwesenheit von das Persephin-Protein kodierender
mRNA wird eine Probe von einem Patienten entnommen. Die Probe kann
dem Blut oder einer Gewebebiopsie-Probe entstammen. Die Probe kann
zur Extraktion der Nucleinsäuren,
welche darin enthalten sind, behandelt werden. Die resultierende
Nucleinsäure
aus der Probe wird einer Gelelektrophorese oder einer anderen Technik
zur Größentrennung unterzogen.
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Die
mRNA der Probe wird mit einer Nucleinsäure-Sequenz, welche als eine
Sonde fungiert, unter Bildung von Hybrid-Duplexen in Kontakt gebracht.
Die Verwendung von gelabelten Sonden, wie oben diskutiert, erlaubt
die Detektierung des resultierenden Duplex.
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Bei
Verwendung der Persephin-Protein kodierenden cDNA oder eines Derivats
der cDNA als Sonde können
hochstringente Bedingungen verwendet werden, um falsch-positive
Ergebnisse zu verhindern, d. h. die Hybridisierung und scheinbare
Detektion von Persephin-Nucleotidsequenzen, wobei eigentlich ein
intaktes und funktionierendes Persephin-Gen nicht vorliegt. Bei
Verwendung von Sequenzen, welche von Persephin-cDNA abgeleitet sind,
können
weniger strikte Bedingungen verwendet werden. Jedoch würde dieses
einen weniger bevorzugten Ansatz darstellen, da die Wahrscheinlichkeit
von falsch-positiven Ergebnissen existiert. Die Stringenz der Hybridisierung
wird durch eine Vielzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des
Waschverfahrens, einschließlich
der Temperatur, der Ionenstärke,
der Zeitdauer und der Konzentration an Formamid, bestimmt. Diese
Faktoren sind beispielsweise in Sambrook et al. ausgeführt (Sambrook et
al., 1989, supra).
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Um
die Empfindlichkeit der Detektierung in einer Probe der das Persephin-Protein
kodierenden mRNA zu erhöhen,
kann die Technik der reversen Transkription/Polymerisationskettenreaktion
(RT/PCR) verwendet werden, um von mRNA transkribierte cDNA, welche
für das
Persephin-Protein kodiert, zu amplifizieren. Das Verfahren der RT/PCR
ist im Stand der Technik bekannt (siehe Beispiel 9).
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Das
RT/PCR-Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden. Die gesamte zelluläre RNA wird
beispielsweise durch das Standard-Guanidiniumisothiocyanat-Verfahren
isoliert, und die gesamte RNA wird revers-transkribiert. Das Reverse-Transkriptions-Verfahren
umfasst die Synthese von DNA auf einem Templat von RNA unter Verwendung
eines Reverse-Transkriptase-Enzyms und eines 3'-End-Primers. Typischerweise enthält der Primer
eine Oligo(dT)-Sequenz. Die so gebildete cDNA wird anschließend unter
Verwendung des PCR-Verfahrens und Persephin-spezifischen Primern
amplifiziert. (Belyavsky et al., Nucl. Acid. Res. 17: 2919–2932, 1989;
Krug und Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.
152, Seiten 316–325, 1987).
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Das
Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, wobei
zwei Oligonucleotid-Primer verwendet werden, welche zu den zwei
flankierenden Bereichen des zu verstärkenden bzw. zu amplifizierenden
DNA-Segments im Wesentlichen komplementär sind.
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Nach
der Amplifizierung wird das PCR-Produkt anschließend einer Elektrophorese unterzogen
und durch Ethidiumbromid-Färbung
oder durch Phospho-Kennzeichnung (Phospho-Imaging) detektiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Detektierung
der Anwesenheit des Persephin-Proteins in einer von einem Patienten
erhaltenen Probe zur Verfügung.
Ein jedes im Stand der Technik zur Detektierung von Proteinen bekanntes
Verfahren kann verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, allerdings
ohne darauf begrenzt zu sein, die Immunodiffusion, Immunoelektrophorese,
immunochemische Verfahren, Binder-Ligand-Assays, immunohistochemische
Techniken, Agglutinierung und Komplementär-Assays. (Siehe beispielsweise
Basic and Clinical Immunology, Sites und Terr, Herausgeber, Appleton & Lange, Norwalk,
Conn. Seiten 217–262,
1991). Bevorzugt sind Binder-Ligand-Immunoassay-Verfahren, welche
die Umsetzung von Antikörpern
mit einem Epitop oder Epitopen des Persephin-Proteins oder deren
Derivate oder das kompetitive Ersetzen eines gelabelten Persephin-Proteins
oder eines Derivats davon umfassen.
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Wie
hierin verwendet soll ein Derivat des Persephin-Proteins ein Polypeptid
einschließen,
in welchem bestimmte Aminosäuren
deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt oder gegen modifizierte
oder unübliche
Aminosäuren
ausgetauscht wurden, worin das Persephin-Derivat biologisch äquivalent
zu Persephin ist und/oder worin das Polypeptid-Derivat mit Antikörpern, welche
gegen jeweils das Persephin-Protein erzeugt wurden, kreuzreagieren.
Unter Kreuzreaktion bzw. Cross-Reaktion wird verstanden, dass ein
Antikörper
mit einem Antigen reagiert, welches sich von dem Antigen unterscheidet,
welches seine Bildung induziert hat.
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Eine
Vielzahl kompetitiver und nichtkompetitiver Proteinbindungsimmunoassays
sind im Stand der Technik bekannt. In solchen Assays verwendete
Antikörper
können
ungelabelt sein, wie sie beispielsweise in Agglutinierungstests
verwendet werden, oder zur Verwendung in einer breiten Vielfalt
von Assay-Verfahren gelabelt sein. Labels, welche verwendet werden
können,
umfassen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Label, chemilumineszierende
Label, Enzymsubstrate oder Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, Teilchen,
Farbstoffe und ähnliches
zur Verwendung in Radioimmunoassays (RIA), Enzymimmunoassays, z.
B. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Fluoreszenzimmunoassays
und ähnliches.
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Polyklonale
oder monoklonale Antikörper
für das
Persephin-Protein oder für
ein Epitop davon können zur
Verwendung in Immunoassays durch irgendeines der Vielzahl der im
Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Bei Epitop
wird auf eine antigene Determinante eines Polypeptids Bezug genommen. Der
Begriff Epitop kann auch Persephin-spezifische B-Zellepitope oder
T-Helferzellenepitope einschließen.
Ein Epitop könnte
drei Aminosäuren
in einer räumlichen
Konformation umfassen, welche für
das Epitop einzigartig ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus
mindestens 5 solcher Aminosäuren.
Verfahren zur Bestimmung der räumlichen
Konformation bzw. Anordnung der Aminosäuren sind im Stand der Technik
bekannt und umfassen beispielsweise die Röntgenkristallographie und zweidimensionale
Kernspinresonanz.
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Ein
Ansatz für
die Herstellung von Antikörpern
für ein
Protein ist die Auswahl und Herstellung einer Aminosäuresequenz
des gesamten oder eines Teils des Proteins, die chemische Synthese
der Sequenz und deren Injektion in ein geeignetes Lebewesen/Tier,
gewöhnlich
einen Hasen oder eine Maus (siehe Beispiel 10).
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Oligopeptide
können
als Kandidaten für
die Herstellung eines Antikörpers
für das
Persephin-Protein auf der Basis der in hydrophilen Bereichen liegenden
Oligopeptide ausgewählt
werden, welche folglich leicht in das reife Protein exponiert werden.
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Antikörper für Persephin
können
ebenso gegen Oligopeptide erzeugt sein, welche ein oder mehrere der
erhaltenen bzw. konservierten Bereiche aufweisen, die hierin identifiziert
wurden, sodass der Antikörper mit
anderen Familienmitgliedern kreuzreagieren kann. Solche Antikörper können zur
Identifizierung und Isolierung der anderen Familienmitglieder verwendet
werden.
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Verfahren
zur Herstellung des Persephin-Proteins oder eines Epitops davon
umfassen, allerdings ohne auf die chemische Synthese begrenzt zu
sein, rekombinante DNA-Techniken oder die Isolierung aus biologischen
Proben. Die chemische Synthese eines Peptids kann beispielsweise
durch die klassische Merrifeld-Methode der Festphasenpeptid-Synthese
(Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963) oder durch die FMOC-Strategie
auf einem Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis System durchgeführt werden
(DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino und Han, J. Org. Chem.
37: 3404, 1972).
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Polyklonale
Antikörper
können
durch Immunisieren von Hasen oder anderen Lebewesen/Tieren durch Injizierung
des Antigens, gefolgt von anschließenden Boosts in geeigneten
Intervallen hergestellt werden. Man lässt die Tiere ausbluten und
untersucht die Seren gegenüber
gereinigtem Persephin-Protein gewöhnlich durch ELISA oder durch
einen Bioassay auf der Basis der Fähigkeit, die Wirkung von Persephin
zu blockieren. Wenn Vogelarten verwendet werden, z. B. Hühner, Truthähne oder ähnliches,
kann der Antikörper
aus dem Dotter des Eis isoliert werden. Monoklonale Antikörper können nach
dem Verfahren von Milstein und Kohler durch Verschmelzen von Splenozyten
aus immunisierten Mäusen
mit kontinuierlich replizierenden Tumorzellen, wie Myelom- oder
Lymphom-Zellen, hergestellt werden. (Milstein und Kohler, Nature
256: 495–497,
1975; Gulfre und Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical
Techniques 73: 1–46,
Langone und Banatis Herausgeber, Academic Press, 1981). Die so gebildeten
Hybridoma-Zellen werden anschließend durch limitierende Verdünnungsverfahren
kloniert, und die Überstände werden
hinsichtlich der Antikörperbildung
durch ELISA, RIA oder Bioassays geprüft.
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Die
einzigartige Fähigkeit
von Antikörpern,
Zielproteine zu erkennen und spezifisch zu binden stellt einen Ansatz
zur Behandlung einer Überexprimierung
des Proteins dar. Folglich können
die spezifischen Antikörper
gegen das Persephin-Protein zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen,
welche eine Überexprimierung
des Persephin-Proteins einschließen, durch Behandlung eines
Patienten verwendet werden.
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Spezifische
Antikörper,
entweder polyklonal oder monoklonal, für das Persephin-Protein können durch jegliche
im Stand der Technik, wie oben diskutiert, bekannte geeignete Verfahren
gebildet werden. Beispielsweise können Maus- oder menschliche
monoklonale Antikörper
durch die Hybridoma-Technologie hergestellt werden, oder alternativ
können
das Persephin-Protein oder ein immunologisch wirksames Fragment
davon oder ein antiidiotpyischer Antikörper oder ein Fragment davon
einem Lebewesen/Tier verabreicht werden, um die Bildung von Antikörpern auszulösen, welche
zur Erkennung von und Bindung an das Persephin-Protein in der Lage
sind. Solche Antikörper
können
aus irgendeiner Klasse von Antikörpern
gebildet sein, einschließlich, allerdings
ohne darauf begrenzt zu sein, IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, oder in
dem Fall von Vogelarten IgY sowie aus jeder Subklasse der Antikörper.
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Andere
Ausführungsformen
innerhalb des Umfangs der Ansprüche
hierin werden dem Fachmann in Betrachtung der Beschreibung oder
der Praxis der Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, ersichtlich
werden. Die Beschreibung soll zusammen mit den Beispielen nur exemplarisch
verstanden werden.
-
Beispiel 1
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Reinigung von Neurturin
aus einem konditionierten CHO-Zellen-Medium.
-
Herstellung des konditionierten
CHO-Zellenmediums:
-
Ein
Derivat von DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (CHO)-Zellen,
wurde verwendet (Day et al., J. Biol. Chem. 265: 15253–15260,
1990). Die Erfinder haben ebenso Neurturin in teilweise gereinigter
Form aus anderen Derivaten der DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters
erhalten. Die CHO-Zellen wurden in 20 ml Medium gehalten, welches
minimales essentielles Medium (MEM)-alpha (Gibco-BRL Nr. 12561,
Gaithersburg, MD) enthielt, das 10% fötales Kalbserum (Hyclone Laboratories,
Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin
und 25 nM Methotrexat unter Verwendung von 150 cm2-Flaschen
(Corning Inc., Corning NY) aufwies. Für den Durchlass und die Vermehrung
wurde Medium aus einer konfluenten Flasche eingezogen; die Zellen
wurden mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend in g/l
0,144 KH2PO4, 0,795
Na2HPO4 und 9,00
NaCl, gewaschen; und die Flasche wurde anschließend zwei bis drei Minuten
mit 2 ml 0,25% Trypsin in PBS inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von
der Flaschenoberfläche
entnommen, 8 ml des Mediums wurden zugesetzt, und die Zellen wurden
mehrere Male mit einer Pipette trituriert. Die Zellen wurden 1:5
oder 1:10 aufgeteilt, bei 37°C
unter einer Atmosphäre
von 5% CO2 in Luft inkubiert und 3 bis 4
Tage lang bis zum Zusammentreffen (Konfluenz) wachsen gelassen.
-
Anschließend ließ man die
Zellkultur in 850 cm2-Rollflaschen (Becton
Dickinson, Bedford, MA) sich vermehren. Eine konfluente 150 cm2-Flasche wurde trypsinisiert und in eine
Rollflasche, enthaltend 240 ml des obengenannten modifizierten MEM-Mediums
ohne Methotrexat, gesetzt. Der pH wurde entweder durch Überlagern
des Mediums mit 5% CO2 in Luft oder durch
Herstellen des Mediums mit 25 mM HEPES pH 7,4 (Sigma, St. Louis,
MO) gehalten. Die Rollflaschen wurden bei 0,8 bis 1,0 Umdrehungen
pro Minute routieren gelassen. Die Zellen erreichten eine Konfluenz
in 4 Tagen.
-
Zum
Sammeln des konditionierten Mediums wurde serumfreies CHO-Zellen-Medium (SF-CHO) verwendet.
SF-CHO wurde unter Verwendung von 1:1 DME/F12-Basis-Medium hergestellt, welches durch
Mischen von 1:1 (v/v) DMEM (Gibco-BRL Produkt Nr. 11965, Gibco-BRL,
Gaithersburg, MD) mit Ham's
F12 (Gibco-BRL Produkt Nr. 11765) hergestellt wurde. Das fertige
SF-CHO-Medium enthielt 15 mM HE-PES
pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 mg/ml bovines Serum-Albumin (BSA,
Sigma, St. Louis, MO), 25 μg/ml
Heparin, (Sigma, St. Louis, MO), ein 1X Insulin-Transferrin-Selenit-Supplement
(bovines Insulin, 5 μg/ml;
humanes Transferrin, 5 μg/ml;
Natriumselenit, 5 ng/ml; Sigma, St. Louis, MO), 2 mM 1-Glutamin,
100 U/ml Penezillin und 100 μg/ml
Streptomycin. Das Medium aus den konfluenten Rollflaschen wurde
entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 30 ml SF-CHO-Medium zur
Entfernung der Serumproteine gewaschen. Die Zellen wurden anschließend bei
37°C 16
bis 24 Stunden lang in 80 ml SF-CHO-Medium zur weiteren Entfernung
von Serumproteinen inkubiert. 80 ml Medium wurden entfernt und verworfen.
Es wurde ein Volumen von 120 ml SF-CHO-Medium zu der Flasche zugesetzt,
und die Zellen wurden bei 37°C
inkubiert. Weitere 48 Stunden später
wurden 120 ml entnommen und durch dasselbe Volumen SF-CHO-Medium
ersetzt. Die gesammelten Medien wurden gepoolt und bei 4°C in konischen
Polypropylenrohren zur Entfernung von zellulärer Debris zentrifugiert, und
der Überstand
wurde bei –70°C gelagert.
Die Medien wurden fünfmal
innerhalb von 10 Tagen gesammelt, um insgesamt ungefähr 600 ml
konditioniertes Medium pro Rollflasche zu erhalten.
-
Die
gesammelten Fraktionen aus den Säulen
wurden bei jeder Reinigungsstufe hinsichtlich der biologischen Aktivität unter
Verwendung des neuronalen Überlebensassays
und hinsichtlich des Proteingehalts durch den Farbstoffbindungsassay
von Bradford (Anal. Biochem. 72: 248 et seq., 1976) untersucht.
Die Gesamt-mg an Protein in dem Ausgangsvolumen, typischerweise
50 1, des konditionierten Mediums wurden bestimmt.
-
Höheres Cervical-Ganglion-Überlebens-Assay
(Superior Cervical Ganglion Survival Assay):
-
Die
neurotrophe Aktivität
von konditioniertem CHO-Medium-Ausgangsmaterial wurde bei verschiedenen
Aufreinigungsstufen unter Verwendung des höheren Cervial-Ganglion-Überlebens-Assay-Systems,
von dem bereits früher
berichtet wurde (Martin et al., J. of Cell Biology 106: 829–844; Deckwerth
und Johnson, J. Cell. Bio. 123: 1207–1222, 1993), welches hierin
durch Bezugnahme eingeschlossen ist, untersucht. Es wurden primäre Kulturen
sympathischer Neuronen aus dem höheren/oberen
Cervical-Ganglion (SCG) durch Entnahme von Gewebe aus dem Rattenembryo
am Tag 20–21
(E20–E21)
hergestellt. Die SCG's
wurden in Leibovitz's
L15-Medium mit 1-Glutamin (Cat #11415–023 Gibco-BRL, Gaithersburg,
MD) gegeben, 30 Minuten lang mit 1 mg/ml Kollagenase (Cat #4188
Worthington Biochemical, Freehold, NJ) in Leibovitz's L15-Medium bei
37°C digeriert,
gefolgt von einer 30-minütigen
Digerierung in lyophilisiertem und bestrahltem Trypsin (Typ TRLVMF
Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), welches in modifizierter
Hanks'Balanced Salt
Solution (Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert
wurde. Die Digerierung wurde unter Verwendung von AM50 gestoppt,
welches minimales essentielles Medium (Minium Essential Medium)
mit Earle's Salzen
und ohne 1-Glutamin (Cat #11090–016
Gibco-BRL), 10% fötales
Kalbsserum (Cat #1115 Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin
(Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM Uridine (Cat #3003 Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 ng/ml
2,5 S NGF enthält.
Die Zellen wurden in eine Suspension einzelner Zellen unter Verwendung
einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette aufgetrennt. Nach
der Filtration der Suspension durch einen Nitex-Filter (Größe 3–20/14,
Tetko Inc., Elmsford, NY) wurden die Zellen in ein AM50-Medium wie
oben angegeben überführt und
auf eine 100 mm Falcon- oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson
Labware, Lincoln Park, NJ) gegeben, um die Anzahl von nichtneuronalen
Zellen zu vermindern. Nach 2 Stunden wurde das Medium, welches die
ungebundenen neuronalen Zellen enthielt, von diesen Platten entfernt
und wiederum durch eine silanierte und flammpolierte Pasteur-Pipette
trituriert. Die Einzelzellsuspension wurde auf 24-Well-Gewebekulturplatten
(Costar, Wilmington, MA) gegeben, welche vorher mit einer Doppelschicht
aus Kollagen überzogen
wurden, wobei eine Kollagenschicht ammonisiert wurde und eine zweite
Kollagenschicht luftgetrocknet wurde. Man ließ sie 30 Minuten bis 2 Stunden
lang anhaften. Eine spezifische Zahl viabler bzw. lebensfähiger Zellen,
gewöhnlich
ungefähr
1.200 bis ungefähr
3.000 Gesamtzellen pro Well, oder ein spezifischer Prozentanteil
des Ganglions, gewöhnlich
25% der pro Ganglion erhaltenen Zellen, wurden in jedes Well gegeben.
Sofern das Auszählen
der Zellen durchgeführt
werden musste, wurden sie in 24-Well-Platten, wie oben angegeben,
oder alternativ in 2-Well-Kammer-Slides (Nunc, Naperville, IL) überführt. Die
Kulturen wurden anschließend
5 bis 6 Tage bei 37°C
in AM50-Medium in einer 5% CO2/95% Luftatmosphäre inkubiert.
Der Tod der kultivierten Neuronen wurde durch Austausch des Mediums mit
Medium ohne NGF und mit 0,05% Ziegen-Anti-NGF (finaler Titer in
den Wells ist 1:10) induziert. Dieser NGF-Verlust resultiert in
dem Tod der Neuronen innerhalb einer Zeitdauer von 24 bis 72 Stunden.
Aliquots von teilweise aufgereinigtem oder gereinigtem Faktor oder
geeignete Kontrollen wurden zu den Kulturen zur Zeit der NGF-Entfernung
zugesetzt, um die Fähigkeit
des Vorbeugens bzw. Verhinderns des neuronalen Tods zu bestimmen.
-
Die
Evaluierung der Fähigkeit
der Säulenfraktion,
der Gel-Eluate oder des gereinigten Faktors zur Vorbeugung des neuronalen
Tods wurde durch visuelle Inspektion der Kulturen unter dem Phasen-Kontrast-Mikroskop
vorgenommen. Die viablen Neuronen verblieben in der hellen Phase
mit intakten Neuriten, wohingegen die toten Neuronen zusammengeschrumpft
in der dunklen Phase waren, unregelmäßige Membranen aufwiesen und
fragmentierte Neuriten zeigten. Wenn eine genaue Quantifizierung
des neuronalen Überlebens
erforderlich war, wurden die Kulturen in 4% Paraformaldehyd oder
10% Formalin in PBS fixiert und mit Crystal Violet-Lösung angefärbt (Huntoon
Formula Harleco E. M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ). Wenn 24-Well-Platten
verwendet wurden, wurde 1 μl
Crystal Violet-Lösung
zu jedem Well, enthaltend 10% Formalin, zugesetzt, und die Zellen
wurden unter Verwendung eines Phasen-Kontrast-Mikroskops gezählt. Wenn
die 2-Well-Kammer-Slides verwendet wurden, wurden die Kulturen fixiert,
mit Crystal Violet angefärbt,
mit Wasser gewaschen, in steigenden Ethanolkonzentrationen gegenüber Toluol
entwässert
und in einer Toluol-basierten Mounting-Lösung befestigt. Die Neuronen
wurden als lebensfähig
gezählt,
wenn sie einen klaren Nucleolus aufwiesen, und die Kerne mit Crystal
Violet deutlich gefärbt
waren.
-
Die
Aktivität
wurde durch Berechnung einer "Überlebenseinheit" quantifiziert. Die
Gesamtüberlebenseinheiten
in einer Probe wurden als das minimale Volumen eines Aliquots der
Probe definiert, welches ein maximales Überleben, geteilt durch/in
das Gesamtvolumen der Probe, hervorruft. Die spezifische Aktivität wurde als
die Überlebenseinheiten,
geteilt durch die mg-Gesamtprotein, berechnet.
-
Überlebenseinheiten
wurden in einem Assay unter Verwendung von ungefähr 1.200 lebensfähigen Neuronen
in einem 0,5 ml-Kulturassay und einer Kulturierungsdauer von 48
Stunden, die der Zugabe der Fraktion folgt, bestimmt. Das Überleben
wurde visuell nach den 48 Stunden bestimmt. Die intrinsische Aktivität wurde
in einen Assay unter Verwendung von ungefähr 2.700 Neuronen und einer
Kulturierungsdauer von 72 Stunden bestimmt. Das Überleben wurde durch Fixieren
der Neuronen und Zählen
der Anzahl der überlebenden Neuronen
beurteilt. Weil die Stabilität,
wie mittels des Halbwertslebens der Aktivität beurteilt, für Neurturin
mit steigender Anzahl der Neuronen abnimmt, wurde angenommen, dass
die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch
die Specific Activity-Bestimmungen vorausgesagten. Man würde ebenso
erwarten, dass die Messung der intrin sischen Aktivität geringer
ist als die durch die spezifische Aktivität vorausgesagte, da das Überleben
nach 72 Stunden anstelle von 48 Stunden gemessen wurde.
-
Um
die Wiederholbarkeit dieser Aktivitätseinheitsassays sicher zu
stellen, war es notwendig, die primären Neuronal-Kulturen bei reproduzierbaren
Zelldichten zu plattieren, da die Stabilität der Aktivität deutlich mit
einem Anstieg der neuronalen Dichte abnimmt. Der Bereich der Zelldichten
reichte von ungefähr
1.200 bis 2.700 Zellen pro Well. Die Anwesenheit von löslichem
Heparin in dem Assay-Medium hatte keinen Effekt auf die Kurzzeit-
(ungefähr
3 Tage) Stabilität
der Überlebensaktivität.
-
Reinigung von Neurturin:
-
Gepooltes
konditioniertes Medium wurde durch 0,2 μl-Poren-Flaschenaufsatz-Filter (Celluloseacetatmembran,
Corning Inc., Corning, NY) filtriert. Typischerweise wurden 50 1
des konditionierten Mediums verwendet und in 25-1-Ansätzen verarbeitet.
Jeder 25-1-Ansatz wurde in einer Rate von 20 ml/Min auf eine 5 × 5 cm Säule geleitet,
welche 100 ml Heparin-Agarose (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, äquilibriert
mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer mit 150 mM NaCl. Die Säule wurde
anschließend
mit ungefähr
1.000 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, bei
20 ml/Min gewaschen, und die Aktivität wurde anschließend mit
25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl eluiert. Nach
dem Umschalten auf den 1,0 M NaCl-Elutions-Puffer wurden die ersten
50 ml Puffer verworfen, und anschließend wurde eine 300 ml-Fraktion
gesammelt.
-
Gepooltes
Material, eluiert aus der Heparin-Agarose-Säule, wurde anschließend 1:1
(v/v) mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,04% TWEEN 20,
auf eine NaCl-Konzentration von 0,5 M verdünnt und in eine 1,5 cm × 9 cm-Säule, enthaltend
16 ml SP SEPHAROSE® High Performance-Ionenaustauschharz
(Pharmacia, Piscataway, NJ), äquilibriert
in 25 mM HEPES 7,4, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, geleitet.
Die Säule
wurde anschließend
mit 160 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02%
TWEEN 20, gewaschen, und die Aktivität wurde mit 25 mM HEPES, pH
7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,02% TWEEN 20 bei einer Fließrate von
2 ml/Min eluiert. Eine 50 ml-Fraktion wurde nach den ersten 7 ml
Eluat von der Säule
entnommen.
-
Das
von der SP SEPHAROSE®-Säule eluierte Material wurde
unter Verwendung von schneller Protein-Flüssigchromatographie (fast protein
liquid chromatography; FPLC) auf einer Chelating Superose HR 10/2-Säule, welche
mit Cu++ beladen war (Pharmacia, Piscataway,
NJ), fraktioniert. Die Säule
wurde durch Waschen mit 10 ml Wasser, beladen mit 3 ml 2,5 mg/ml
CuSO4·5H2O, Waschen mit 10 ml Wasser und Äquilibrieren
mit 10 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und
0,02% TWEEN 20, hergestellt. Das Eluat wurde in die Säule in 25
mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl in einer Rate von
1,0 ml/Min eingeleitet. Die gebundenen Proteine wurden mit einem
linearen Gradienten steigender Glycin-Konzentration (0–300 mM)
in 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, in einer Rate
von 1,0 ml/Min. eluiert. Der Gradient wurde durch ein Pharmacia-FPLC-System unter Verwendung
eines LCC-500-Controllers und P-500-Pumpen gebildet, sodass ein
0–300
mM-Glycin-Gradient in 40 ml bei 1,0 ml/Min. bereitgestellt wurde. So
stieg der Gradient um 7,5 mM Glycin pro Minute. Es wurden 1 ml-Fraktion
gesammelt und hinsichtlich der SCG-Überlebenspromotion untersucht.
Die Peak-Aktivität
wurde in den Fraktionen 17–20
beobachtet, d. h. 17 bis 20 Minuten oder ml von dem Startpunkt des
Gradienten.
-
Die
Absorbanz-Messungen bei 280 mM durch einen Inline-UV-Monitor zeigte
an, dass die meisten Proteine vor der Überlebensaktivität in den
Fraktionen 17–20
eluiert wurden. Somit wurde eine deutliche Aufreinigung bei diesem
Schritt erreicht. Ein 25 kD-Band wurde mit der Überlebensaktivität co-gereinigt.
-
Die
kombinierten eluierten Fraktionen der Cu++-Superose-Säule wurden
auf 0,45 M NaCl unter Verwendung von 25 mM HEPES pH 7,4 Puffer,
enthaltend 0,02% TWEEN 20, verdünnt
und in eine Mono-S-HR 5/5-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway,
NJ) für
die weitere FPLC-Reinigung geleitet. Die Säule wurde mit 25 mM HEPES pH
7,4-Puffer, enthaltend 0,45 M NaCl, enthaltend 0,02% TWEEN 20, äquilibriert. Die
gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten ansteigender
NaCl-Konzentration (0,45–1,0 M)
eluiert. Der Gradient wurde wie oben beschrieben aus 0,45 M–1,0 M NaCl
in 35 ml bei 1,0 ml/Min gebildet, wodurch die Konzentration um 0,0157
M pro ml oder Minute stieg. Dreizehn 1,0 ml-Fraktionen (Fraktionen 1–13) wurden
gesammelt, gefolgt von 44 0,5 ml-Fraktionen (Fraktionen 14–53). Die
Peak-Aktivität
in dem SCG-Assay lag in den Fraktionen 26–29. Eine jede Fraktion wurde
in dem SCG-Überlebens-Assay
innerhalb eines Bereichs von Volumina von 0,1 bis 1,0 μl pro 0,5
ml Kulturmedium untersucht.
-
Ein
Prozent (5 μl)
einer jeden Fraktion wurde auf ein nichtreduzierendes, 14%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel
gegeben und für
750 V-Stunde bei 25°C
einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden mittels Silberfärbung visualisiert.
-
Ein
25 kD-Band erschien bei den Fraktionen 25–30, ein 28 kD-Protein wurde
früher
in dem Gradienten eluiert, und ein 18 kD wurde später in dem
Gradienten eluiert.
-
Um
zu zeigen, dass das 25 kD-Band für
die überlebensfördernde
Aktivität
verantwortlich ist, wurde das 25 kD-Protein von dem Polyacrylamid-Gel
nach der Elektrophorese eluiert und hinsichtlich der Überlebensaktivität in dem
SCG-Assay untersucht. Nach der Elektrophorese von 150 μl der SP
SEPHAROSE® 1,0
M NaCl-Fraktion in einer Reihe eines oben beschriebenen nichtreduzierenden
14%-igen SDS-Polyacrylamid-Gels wurde die Reihe in 12 Streifen geschnitten,
und jeder Streifen wurde zerstoßen
und durch Diffusion unter Schwenken in Puffer, enthaltend 25 mM
HE-PES, pH 7,4,
0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20, innerhalb von 18 Stunden bei 25°C eluiert.
BSA wurde zugesetzt, um eine finale Konzentration von 200 μg/ml zu eluieren, und
das Eluat wurde durch einen 0,45 μm-Filter
filtriert, um Acrylamidgel-Fragmente zu entfernen. Das Filtrat wurde
anschließend
einer SP SEPHAROSE®-Säule zugesetzt, um die Probe
aufzukonzentrieren und zu reinigen. Vor der Elution der Probe wurde
die Säule
einmal in 400 ml μl
25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20
und 200 μg
BSA pro ml, und einmal in 400 μl
25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro
ml, gewaschen. Die Säule
wurde anschließend
wiederum in 400 μl
25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20
und 200 μg
BSA pro ml, gewaschen. Die Probe wurde mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer,
enthaltend 1,0 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, eluiert. Die Proben
wurden anschließend
hinsichtlich ihrer Überlebensaktivität analysiert.
Nur der Streifen, welcher dem 25 kD-Band entsprach, zeigte den Beweis
für eine Überlebensaktivität. Das 25 kD-Protein,
gereinigt aus den konditionierten CHO-Zellenmedien, wird als ein
Homodimer angenommen.
-
Die
Ausbeute aus der oben beschriebenen Aufreinigung betrag typischerweise
1–1,5 μg für 50 1 konditioniertes
CHO-Zellenmedium. Die Gesamtgewinnung wird auf 10 bis 30% geschätzt, was
in einer Aufreinigung von ungefähr
390.000-fach resultiert.
-
Die
progressive Reinigung unter Verwendung der obigen Schritte ist in
Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2
- a. mg Protein wurde bestimmt
unter Verwendung der Farbstoffbindungsmethode von Bradford (Anal
Biochem 72:248, 1976)
- b. Die Gesamtaktivitätseinheiten
oder Überlebenseinheiten
in einer Probe wurden als das minimale Volumen eines Aliquots der
Probe definiert, welches ein maximales Überleben, geteilt in/durch
das Gesamtvolumen der Probe, bildete.
- c. Die Aktivität
für das
konditionierte Medium wurde von der Annahme abgeleitet, dass 100%
der Aktivität in
der Heparin-Agarose-Fraktion gewonnen wurde, weil die Aktivität des konditionierten
Mediums zur direkten Bestimmung zu gering war.
- d. Spezifische Aktivität
war die Aktivitätseinheiten,
geteilt durch Gesamt-mg Protein.
-
Beispiel 2
-
Diese
Probe verdeutlicht die Charakterisierung von Neurturin und verschiedenen
Mitgliedern der TGF-β-Familie
von Wachstumsfaktoren in dem SCG-Assay sowie die Abwesenheit der
Kreuzreaktivität
von Anti-GNDF-Antikörpern
mit Neurturin.
-
Der
SCG-Assay des aufgereinigten Proteins zeigte, dass der Faktor bei
einer Konzentration von ungefähr
3 ng/ml oder ungefähr
100 pM maximal wirksam bzw. aktiv ist, und dass der EC50 ungefähr 1,5 ng/ml oder
ungefähr
50 pM in dem erwarteten Bereich für einen diffusionsfähigen Peptid-Wachstumsfaktor
lag.
-
Mehrere
Mitglieder der TGF-β-Familie
beeinflussen die Neuropeptid-Gen-Expression in sympathischen Neuronen,
während
andere das Überleben
unterschiedlicher neuronaler Populationen fördern. Neurturin, welches ein
entferntes Mitglied dieser Proteinfamilie darstellt, ist zur Förderung
des annähernd
vollständigen Überlebens
von sympathischen Neuronen innerhalb von drei Tagen in der Lage.
Zusätzlich
zeigte ein weiteres Kultivieren der SCG-Zellen, dass Neurturin den
Erhalt dieser Neuronen innerhalb von mindestens 10 Tagen nach der
Entfernung von NGF fortsetzen konnte.
-
Wir
haben verschiedene andere Mitgleider der TGF-β-Familie hinsichtlich ihrer
Fähigkeit
zur Unterstützung
des Überlebens
in dem SCG-Assay untersucht, einschließlich von TGF-β1, Aktivin,
BMP-2, BMP-4, BMP-6 und GDNF. Unter diesen Faktoren zeigte nur GDNF
eine überlebensfördernde
Aktivität.
Jedoch war die Aktivität
von GDNF viel weniger potent als die von Neurturin hinsichtlich
dieser Aktivität,
welches einen EC50 von 2–4 nM in dem 3-Tages-Überlebensassay
zeigt. Das in diesem Assay untersuchte GDNF war rhGDNF, welches
von E. Coli, erhalten von Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.,
gebildet wurde. Die Dauer der Wirkung von GDNF war ebenso geringer
als die von Neurturin, dahingehend, dass die Fähigkeit von GDNF (50 ng/ml), ein Überleben
von länger
als 3 Tagen zu bewerkstelligen, wesentlich nachließ. Diese
Experimente legen die Möglichkeit
nahe, dass GDNF ein schwacher Agonist für den Neurturin-Rezeptor ist.
Darüber
hinaus legt die Unfähigkeit
von Ak tivin und BMP-2, das Überleben
im Gegensatz zu ihrer starken Induktion der Transmitter-bezogenen
Gen-Expression in diesen Neuronen zu fördern (Fann und Paterson, Int.
J. Dev. Neurosci. 13: 317–330,
1995; Fann und Patterson, J. Neurochem. 61: 1349–1255, 1993), nahe, dass sie über andere
Rezeptoren oder Signalübertragungswege
signalisieren.
-
Um
die Kreuzreaktivität
von Anti-GDNF-Antikörpern
mit teilweise aufgereinigtem Neurturin zu bestimmen, wurden SCG-Neuronen,
welche wie in Beispiel 1 beschrieben entnommen und plattiert wurden,
am Tag 6 mit 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml oder 30 ng/ml GDNF (Prepro
Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.) in Gegenwart von Anti-NGF allein oder in
Gegenwart von Anti-NGF und Anti-GDNF (Ziegen-IgG-Antikörper gegenüber E. coli-abgeleitetem
rhGDNF, R & D
Systems, Minneapolis, Minn) behandelt. Eine teilweise gereinigte
1,0 M SP Sepharose-Fraktion von Neurturin wurde in dem Assay in
geeigneten Konzentrationen von 375 pg/ml, 750 pg/ml, 1,5 ng/ml und
3 ng/ml verwendet. Diese Fraktion wurde in Gegenwart von Anti-NGF
alleine und in Anwesenheit von Anti-NGF und Anti-GDNF untersucht.
Der Anti-GDNF-Antikörper
blockierte die überlebensfördernde
Aktivität
von GDNF bei einer Konzentration bis zu 30 ng/ml, blockierte allerdings
nicht die überlebensfördernde Aktivität von Neurturin.
-
Beispiel 3
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht die Wirkung von Neurturin auf Sensorneuronen
in einem Knoten-Ganglion-Überlebensassay.
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Konditionierte
CHO-Zellen-Medien, welche teilweise auf der SP Sepharose-Säule gereinigt
wurden, wurden hinsichtlich der neurotrophen Aktivität gegenüber Sensorneuronen
unter Verwendung von Knoten-Ganglien untersucht. Der Überlebensassay
stellt eine Modifikation des vorstehend Beschriebenen hinsichtlich
der höheren
Cervical-Ganglien dar. Primär
dissoziierte Kulturen von Knoten-Ganglien wurden durch Entnahme
von Gewebe von E18-Sprague-Dawley-Ratten-Jungen hergestellt. Die
Knoten-Ganglien (Nodose-Ganglien) wurden in Leibovitz's L15 mit 2 mM 1-Glutamin
(Cat # 11415–023,
GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) gegeben und die Gewebe wurden entnommen,
30 Minuten mit 1 mg/ml Collagenase (Cat #4188, Worthington Biochemical,
Freehold, New Jersey) in Leibovitz's L15-Medium bei 37°C digeriert, gefolgt von 30
minütiger
Digerierung in Trypsin (lyophilisiert und bestrahlt, Typ TRLVMF,
Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), und auf eine finale
Konzentration von 0,25% in modifizierter Hank's Balanced Salt Solution (Cat #H8389,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert. Die Digerierung
wurde unter Verwendung von AMO-BDNF100, einem Medium, welches Minimum
Essential Medium mit Earle's
Salzen und ohne 1-Glutamin (#11090–016 GIBCO-BRL), 10% fötales Kalbsserum
(Cat #1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin (Cat
#G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503, Sigma Chemical
Co.), 20 μM
Uridine (Cat #3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml
Penizillin, 100 μg/ml
Streptomycin und 100 ng hirnabgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF,
Amgen, Thousand Oaks, CA) enthält,
gestoppt. Die Zellen wurden in eine Suspension von Einzelzellen
unter Verwendung einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette
in das AM0-BDNF100-Medium dissoziiert und auf einer 100 mm-Falcon-
oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park,
NJ) zur Entfernung von nichtneuronalen Zellen präplattiert. Nach 2 Stunden wurde
das Medium, welches die nichtbefestigten neuronalen Zellen enthielt,
von diesen Platten entfernt und erneut durch eine silanierte und
flammpolierte Pasteur-Pipette trituriert. Die Einzelzellensuspension wurde
auf 24-Well-Gewebe-Kultur-Platten (Costar, Wilmington, MA) gegeben,
welche vorher mit einer Kollagendoppelschicht überzogen wurden, wobei eine
Schicht ammonisiert wurde und die zweite Schicht luftgetrocknet
wurde. Die Ganglien von 10 E18-Rattenembryos wurden in 2,5 ml Medium
dissoziiert, und 100 μl
dieser Suspension wurde zu jedem Well zugesetzt. Die Zellen ließ man 30
Minuten in einem 37°C-Inkubator
mit 5% CO2/95% Luft anhaften. Die Wells wurden mit AM0-BDNF100-Medium über Nacht
versehen.
-
Am
nächsten
Tag wurden die Zellen dreimal 20 Minuten lang jeweils mit AM0-Medium, welches kein BDNF
enthielt, gewaschen. Diese Wells wurden mit 0,5 ml dieses Mediums
alleine oder dieses Mediums, welches entweder 50 ng/ml NGF, 100
ng/ml BDNF (Amgen, Thousand Oaks, CA), 100 ng/ml GDNF (Prepro Tech, Inc.,
Rocky Hill, N. J.) oder 3 ng/ml Neurturin enthielt, versehen. Die
Zellen wurden bei 37°C
in einem 5% CO2/95% Luft-Inkubator drei Tage lang inkubiert, mit
10% Formalin fixiert, mit Crystal Violet gefärbt (1 μl/ml 10% Formalin) und gezählt. Das Überleben
wurde wie vorstehend angegeben festgestellt.
-
Das
neuronale Überleben
von Knoten-Neuronen, kultiviert in BDNF, wurde kürzlich vorgestellt (Thaler et
al., Develop. Biol. 161: 338–344,
1994). Dieses wurde als Standard für das Überleben dieser Neuronen verwendet,
und ihm wurde der Wert von 100% Überleben
bzw. Fortbestand verliehen. Knoten-Ganglien, welche keinen trophischen
Träger
(AMO) aufwiesen, zeigten 20% bis 30% Überleben, genau so wie Neuronen,
welche in Gegenwart von 50 ng/ml NGF kultiviert wurden. Die in Gegenwart
von 3 ng/ml Neurturin und in Abwesenheit von BDNF kultivierten Neuronen
zeigten ein Überleben,
welches dem von in Gegenwart von BDNF (100 ng/ml) kultivierten Neuronen ähnlich ist.
GDNF bei einer Konzentration von 100 ng/ml förderte das Überleben von Knoten-Neuronen
in höherem
Maße als
BDNF (100 mg/ml). Ähnliche
Ergebnisse mit GDNF wurden kürzlich für Sensorneuronen
vom Huhn vorgestellt (Ebendal, T. et al., J. Neurosci. Res. 40:
276–284,
1995).
-
Beispiel 4
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht die Bestimmung von Teilaminosäuresequenzen
von Neurturin, isoliert aus konditioniertem CHO-Zellenmedium.
-
Um
eine N-terminale Aminosäuresequenz
aus einer aufgereinigten Zubereitung von ungefähr 1 μg Neurturin zu erhalten, wurden
die Mono-S-Fraktionen 26 bis 29, welche den Peak der Aktivität enthielten,
auf 25 μl
durch Zentrifugalultrafiltration in einem Microcon-3-Konzentrator
(Amicon, Inc., Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes
14%-iges SDS-Polyacrylamidgel beladen. Nach elektrophoretischer
Trennung wurden die Proteine gegen eine PVDF-Membran elektrogeblotted
(Bio-Rad, Hercules, CA) und mit 0,1%-igem Coomassie Blue gefärbt. Das
25 kD-Band wurde ausgeschnitten und in die Reaktionskartusche eines
automatischen Sequenzierers (Model 476, Applied Biosystems, Foster
City, CA) eingesetzt. Eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Gewinnung
(PTH-aa) in den ersten 2–3
Zyklen eines automatischen Sequenzierens durch Edman-Abbau zeigte
eine Sequenzierungsausbeute von 4 pMol, was ungefähr 10% der
abgeschätzten
Menge des auf das SDS-Gel beladenen Proteins entspricht.
-
Zwei
N-terminale Sequenzierungsdurchläufe
wurden aus zwei 50 1-Aufreinigungszubereitungen durchgeführt. In
dem ersten Durchlauf wurden 1 μg
Protein in drei gepoolten Fraktionen mit 1,5 ml Gesamtvolumen auf
25 μl aufkonzentriert
und bei 100 V zwei Stunden lang bei 25°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers
aus 10 mM CAPS pH 11,0 Puffer (Sigma, St. Louis, MO), enthaltend
5% Methanol, elektrogeblotted. Die Aminosäuresequenz wurde aus 13 Zyklen
Edman-Abbau erhalten, und die Sequenzierungsausbeute betrug 4 pMol,
wie oben.
-
In
dem zweiten Durchlauf wurden 1,5 μg
Protein in vier gepoolten Fraktionen mit 2,0 ml Gesamtvolumen auf
25 μl aufkonzentriert
und bei 36 V 12 Stunden lang bei 4°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers
aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04% SDS und 17% MeOH elektrogeblotted.
Die Sequenzierungsausbeute betrug 15 pMol, und die Sequenz nach
16 Zyklen war SGARPXGLRELEVSVS (SEQ ID NO: 3). Die nach 16 Zyklen
erhaltene Sequenz entspricht der kürzeren Sequenz, welche in dem
ersten Durchlauf erhalten wurde. Definitive Zuordnungen konnten
bei drei der Aminosäurereste
in der Sequenz nicht vorgenommen werden (Reste 1, 6 und 11 vom N-terminalen
Ende). Eine Recherche in Protein-Datenbanken detektierte keine deutlich homologen
Sequenzen, was nahelegt, dass der aufgereinigte Faktor ein neues
Protein war.
-
Diese
ersten N-terminalen Aminosäuresequenzdaten
ermöglichten
nicht die Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von degenerierten
Oligonucleotiden als PCR-Primer oder Sonden zum Screenen von Bibliotheken.
Um diese Ansätze
zu erleichtern, wurde zusätzliches
Protein aufgereinigt, um eine interne Aminosäuresequenz aus proteolytischen
Fragmenten zu erhalten. Um die interne Aminosäurese quenz aus Neurturin zu
erhalten, wurden zusätzliche
50 1 des konditionierten CHO-Zellenmediums
unter Verwendung nur der ersten drei Chromatographieschritte, wie
sie oben angegeben sind, aufgereinigt, außer dass der zum Eluieren der
Cu++-Chelating-Superose-Säule verwendete
Gradient wie folgt lautete: 0–60
mM Glycin (4 ml), 60 mM Glycin (10 ml), 60–300 mM Glycin (32 ml). Die
Fraktionen Nr. 20–23,
welche Neurturin enthielten, wurden auf 25 μl durch Ultrafiltration (Amicon
Microcon 3, Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes
SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurde das
Gel mit Coomassie Blue angefärbt, und
das 25 kD-Neurturinband wurde ausgeschnitten. Neurturin wurde in
dem Gelstreifen mit Endoproteinase-Lys-C digeriert bzw. aufgeschlossen,
und die eluierten proteolytischen Fragmente wurden durch reverse Phasen-HPLC
aufgereinigt. Nur ein Peak wurde durch HPLC-Auftrennung der eluierten
Peptide beobachtet, welcher eine Aminosäuresequenzinformation aus 23
Zyklen bei dem 1 pMol-Signallevel unter Verwendung des automatischen
Sequenzierers ergab (internes Fragment P2, SEQ ID NO: 5).
-
Die
Aminosäureanalyse,
welche bei 10% der oben angegebenen Probe vor deren Unterziehen
einer Digerierung durchgeführt
wurde, zeigte, dass 150 pMol Protein in dem Gelstreifen vorlagen,
bestehend aus 7,6% Lysin und 19,5% Arginin. Der einzige Peak niedrigen
Niveaus aus der Lys-C-Digerierung deutete an, dass die Digerierung
und Eluierung der Peptide ineffizient war. Derselbe Gelstreifen
wurde erneut mit Trypsin digeriert, und die eluierten Peptide wurden
durch HPLC aufgetrennt. Zwei Peaks wurden in der HPLC beobachtet,
was in der Sichtbarmachung von zwei zusätzlichen Aminosäuresequenzen
mit 10 Resten resultierte (4–5
pMol Signalanteil, internes Fragment P1, SEQ ID NO: 4, und internes
Fragment P3, SEQ ID NO: 6), welche sich von den N-terminalen und
vorstehenden internen Aminosäuresequenzen
unterschieden. Die in situ-Digerierung, Elution und Aufreinigung
von Peptiden und das Peptidsequenzieren wurde durch die W. M. Keck
Foundation Biotechnology Resource Laboratory an der Yale University
gemäß Standardprotokollen
für diesen
Service durchgeführt.
-
Beispiel 5
-
Das
folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Sequenzanalyse
von Maus- und Human-Neurturin-cDNA-Klonen.
-
Es
wurden entartete bzw. degenerierte Oligonucleotide, welche verschiedene
Strecken zuverlässiger Aminosäuresequenzdaten
entsprachen, synthetisiert und als Primer in der Polymerasekettenreaktion
(PCR) zur Amplifizierung von cDNA-Sequenzen von revers-transkribierter
mRNA verwendet. Ein Vorwärts-Primer (M1676;
5'-CCNACNGCNTAYGARGA,
SEQ ID NO: 50), entsprechend der Peptidsequenz P2 Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa3-Val-Ser-Phe- Leu-Ser-Val, worin Xaa1 und
Xaa2 unbekannt waren, Xaa3 Gln
oder Glu war (SEQ ID NO: 5), in Kombination mit einem Rückwärts-Primer
(M1677; 5'-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA
(SEQ ID NO: 52), entsprechend der Peptidsequenz P3 (Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg)
(SEQ ID NO: 6), wurden zur Amplifizierung eines 69-Nucleotid-Produkts
von aus E21-Ratten- und erwachsenem Mäusehirn abgeleiteten cDNA-Templaten
verwendet. Die PCR-Parameter waren: 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden;
72°C für 1 Minute
für 35
Zyklen. Das Produkt wurde in den Bluescript KS-Plasmid subkloniert
und sequenziert. Sämtliche
Nucleotidsequenzierungen wurden unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffterminator-Technologie
gemäß den Herstellerangaben auf
einem automatischen Applied Biosystems-Sequenzierer vom Modell Nr.
373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die
Plasmid-DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard Miniprep-Kits
(Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Herstellerangaben
hergestellt. Die Sequenz des amplifizierten Produkts sagte die Aminosäuresequenzdaten
innerhalb der PCR-Primer
korrekt voraus.
-
Die
Primer, welche der amplifizierten Sequenz entsprechen, wurden in
Kombination mit den entarteten Primern in der schnellen Verstärkung der
cDNA-Enden (RACE)-Technik (Frohman, M. A. Methods in Enzymology
218: 340–356,
1993) unter Verwendung des Marathon-RACE-Kits (CLONTECH, Palo Alto,
CA) gemäß den Herstellerangaben
verwendet, außer
dass die Synthese des ersten cDNA-Strangs bei 50°C unter Verwendung von Superscript-II-Reverse-Transkriptase
(Gibco-BRL) durchgeführt
wurde. Kurz gesagt wurde ein Doppelstrang-Adaptor-Oligonucleotid
an die Enden einer Doppelstrang-cDNA ligiert, synthetisiert aus
Rattenhirn-mRNA am postnatalen Tag 1. Unter Verwendung von verschachteltem
Vorwärts-Neurturin-PCR-Primer (M1676:
5'-CCNACNGCNTAYGARGA,
SEQ ID NO: 50 und 1678: 5'-GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA,
SEQ ID NO. 53) in Kombination mit Primern des in dem Kit bereitgestellten
gebundenen Adapters (AP1, AP2) wurde das 3'-Ende der Neurturin-cDNA durch zwei
aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen amplifiziert (Erstens: M1676
und AP1 unter Verwendung von 94°C
für 30
Sekunden, 55°C
für 30
Sekunden und 72°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen; Zweitens: M1678 und AP2 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden
und 68°C für 2 Minuten
für 35
Zyklen). Ein 5'-Abschnitt
der Ratten-Neurturin-cDNA wurde durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen
unter Verwendung der gelinkerten cDNA als Templat erhalten. Die
erste Reaktion verwendete Primer M1677 (SEQ ID NO: 52) und AP1;
unter Verwendung von 94°C
für 30
Sekunden; 55°C
für 30
Sekunden; und 72°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete M1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT
(SEQ ID NO: 54) und AP2 bei 94°C
für 30
Sekunden und 68°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen. Diese Reaktionen resultierten in einer trunkierten Form
des 5'-Endes der
Neurturin-cDNA, dem Anschein nach das Ergebnis von vorzeitigem Abbruch
der cDNA während
der reversen Transkription. Die 5'- und 3'-RACE-Produkte
wurden in das Plasmid Bluescript KS subkloniert und sequenziert.
Die Sequenz dieser 3'-
und 5'-RACE-Produkte
resultierte in einer teilweisen Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz mit 220 nt. Die Primer
(#467921 5'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG,
SEQ ID NO: 55; und M1679, SEQ ID NO: 54), entsprechend der teilweisen
Ratten-cDNA-Sequenz, wurden verwendet (PCR-Parameter 94°C für 30 Sekunden
und 68°C
für 1 Minute
für 35
Zyklen) zur Amplifizierung eines 101-Nucleotid-PCR-Produkts aus
Maus-Genom-DNA, welches zu der Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz homolog war.
-
Diese
Primer wurden anschließend
verwendet, um murine Neurturin-Genom-Klone durch Amplifizieren von Genfragmenten
in einer Maus-129/Sv-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor
zu erhalten (library screening service von Genome Systems, Inc.,
St. Louis, MO). Ein 1,6 kb Nco I-Fragment aus diesem P1-Klon, enthaltend
das Neurturin-Gen, wurde mittels Hybridisierung mit dem Primer (#465782;
5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTACACAGCCGCTAYCAYAC,
SEQ ID NO: 56) identifiziert. Dieses Nco I-Fragment wurde sequenziert,
und es wurde gefunden, dass es einen Abschnitt der Kodierungssequenz
enthielt, welche den N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen,
welche durch das Sequenzieren des aktiven Proteins, isoliert aus
konditionierten CHO-Zellenmedien, erhalten wurde, entsprach. Beginnend
mit der N-terminalen Aminosäuresequenz
des gereinigten Proteins kodiert diese Nucleotid-Sequenz ein 100-Aminosäure-Protein
mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 11,5 kD. Eine Recherche
in Protein- und Nucleinsäure-Datenbanken identifizierte
Neuturin als ein neues Protein, welches ungefähr 40% identisch zu Glial-abgeleitetem
neurotrophen Faktor (GDNF) ist. GDNF wurde aufgereinigt und als
ein Faktor kloniert, welcher das Überleben von dopaminergen Mittelhirn-Neuronen
förderte
und welcher ein entfernt verwandtes Mitglied der TGF-β-Superfamilie
darstellt, welche nun mehr als 25 unterschiedliche Gene enthält, die
eine breite Vielfalt von vielfältigen
und unterschiedlichen Wirkungen zeigen. Obwohl GDNF weniger als
20% identisch ist zu jeglichen anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie,
enthält
es die sieben Cystein-Reste, welche innerhalb der gesamten Familie
erhalten sind und von denen man annimmt, dass sie die Basis für eine erhaltene
Cystein-Knoten-Struktur darstellt, welche in der Kristallstrukturbestimmung
von TGF-β2
beobachtet wurde. Neurturin enthält
ebenso diese sieben Cystein-Reste, allerdings ist es wie GDNF weniger
als 20% homolog zu irgendeinem anderen Mitglied der TGF-β-Familie.
Folglich scheinen Neurturin und GDNF eine Subfamilie von Wachstumsfaktoren
zu repräsentieren,
welche sich von dem Rest der TGF-β-Superfamilie
deutlich unterscheidet.
-
Um
die Sequenz der vollen Länge
der Maus-Neurturin-cDNA zu bestimmen, wurde eine 5'- und 3'-RACE-PCR durchgeführt, wie
sie oben für
die Ratte angegeben ist, wobei verschachtelte Primer, die von der Maus-Genom-Sequenz
vorausgesagt wurden, und cDNA aus neonatalem Mäusehirn verwendet wurden. Die erste
Reaktion für
das 3'-Ende verwendete
Primer: M1777 5'-GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG
(SEQ ID NO: 57) und AP1 bei 94°C
für 30
Sekunden; 65°C
für 15
Sekunden; und 68°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer #467921 (SEQ ID NO:
55) und AP2 bei 94°C
für 30
Sekunden; 65°C
für 15
Sekunden; und 68°C
für 2 Minuten
für 20
Zyklen. Das 5'-Ende
wurde erhalten unter Verwendung des Primers M1759 für die erste
Reaktion, 5'-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGT
(SEQ ID NO: 58) und AP1 bei 94°C
für 30
Sekunden; 65°C
für 15
Sekunden; und 68°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer M1785, 5'-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG
(SEQ ID NO: 59) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden;
65°C für 15 Sekunden;
und 68°C
für 2 Minuten
für 20
Zyklen. Beide Sätze
an PCR-Reaktionen verwendeten 5% DMSO. Die 5'- und 3'-Maus-RACE-Produkte wurden in das Plasmid
Bluescript KS subkloniert und sequenziert. Unter Verwendung der
Sequenz von RACE-Produkten konnte eine 1,0 kb-Maus-Neurturin-cDNA-Sequenz
zusammengestellt werden. Diese cDNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen
von 585 Nucleotiden, welcher ein Protein mit einem Molekulargewicht
von 24 kD kodiert. Diese Maus-cDNA-Sequenz ist in voller Länge in SEQ
ID NO: 12 gezeigt. In Übereinstimmung
mit den Prozessabläufen,
welche bekanntermaßen
bei den TGF-β-Familienmitgliedern
auftreten, enthält
das 24 kD-Neurturin-Protein eine Amino-terminale 19-Aminosäure-Signalsequenz,
gefolgt von einer Pro-Domäne,
die eine proteolytische RXXR-Prozessstelle unmittelbar vor der N-terminalen
Aminosäuresequenz,
die beim Sequenzieren des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien gereinigten
Proteinen erhalten wird, enthält.
Unter Verwendung dieser Charakteristika wird vorausgesagt, dass
das reife 11,5 kD-Neurturin-Molekül 11,5 kD aufweist, und es
wird durch Analogie zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie
vorausgesagt, dass es ein Disulfid-gebundenes Homodimer mit 23 kD
bildet, was mit der 25 kD Masse des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien
gereinigtem Protein konsistent ist, wie es durch SDS-PAGE-Analyse
abgeschätzt
wurde.
-
Zur
Isolierung von Human-Genom-Klonen wurden Primer (#467524; 5'-CGCTACTGCGCAGGCGCGTGCGARGCGC, SEQ ID
NO: 60 und # 1005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA,
SEQ ID NO: 61), vorausgesagt von der Sequenz von Maus-Neurturin,
zur Amplifizierung (PCR-Parameter: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 1 Minute
30 Sekunden, gefolgt von 94°C
für 30
Sekunden; 60°C
für 15
Sekunden; und 68°C
für 60
Sekunden für
35 Zyklen) eines 192-Nucleotid-Fragments aus Human-Genom-DNA verwendet.
Die Sequenz des PCR-Produkts zeigte, dass es das menschliche Homologe
von Maus-Neurturin war. Die Primer wurden anschließend verwendet,
um eine Humangenom-Bibliothek zu screenen, aufgebaut in dem P1-Vektor (library
screening service, Genome Systems, Inc.), und es wurden zwei Klone
erhalten, welche den Human-Neurturin-Genom-Lokus enthielten.
-
Dieselbe
Strategie wurde verwendet zur Bestimmung der menschlichen Sequenz,
wie sie oben für
die Maus-Sequenz diskutiert wurde. Ein Oligo (#30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG,
SEQ ID NO: 62) wurde als eine Sonde in einer Southern-Blot-Analyse
zur Identifizierung der Restriktions-Fragmente der P1-Klone verwendet,
welche die Human-Neurturin-Kodierungssequenz enthielten. Diese Restriktionsfragmente
(Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I) wurden in das Bluescript K5-Plasmid
subkloniert und sequenziert.
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Die
Ergebnisse des Subklonierens und Sequenzierens von Human-Genom-Fragmenten
war wie folgt. Es wurde gefunden, dass das Eag I-Fragment eine Größe von ungefähr 6 kb
aufwies mit der 3'-Eag
I-Stelle 60 bp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Pvu II-Fragment
war ungefähr
3,5 kb groß mit
der 3'-Pvu II-Stelle
250 bp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Hind III-Fragment
war ungefähr
4,8 kb groß mit
der 3'-Hind III-Stelle
3 kp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Kpn I-Fragment war
ungefähr
4,2 kb groß mit
der 3'-Kpn I-Stelle
3,1 kb unterhalb des Stopkodons angeordnet.
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Das
zweite Kodierungsexon wurde unter Verwendung dieser subklonierten
Fragmente sequenziert. Zusätzlich
wurde eine Sequenz von 250 bp, die die 3'-Seite des zweiten Exons flankiert,
erhalten. Die Sequenz wurde ebenso von 1.000 bp erhalten, welche
die 5'-Seite des
Kodierungsexons flankieren. Von diesen Flankierungs-Sequenzen wurden
der Vorwärts-Primer
30341 (5'-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3', SEQ ID NO: 71)
und der Rückwärts-Primer
30331 (5'-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3', SEQ ID NO: 72) derartig
entworfen, dass die Gesamt-Kodierungssequenz des zweiten Exons durch
PCR amplifiziert werden konnte.
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Das
erste Kodierungsexon wurde nicht relativ zu den Restriktionsstellen
oben gemapped, sondern war in dem Eag I-Fragment enthalten. Die
Sequenz dieses Exons wurde aus dem subklonierten Eag I-Fragment unter
Verwendung des Maus-Primers 466215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', SEQ ID NO: 73), erhalten,
welcher das ATG-Initialisierungskodon enthält. Die weitere Sequenz des
ersten Kodierungsexons wurde erhalten mit dem reversen Primer 20215
(5'-CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3', SEQ ID NO: 74),
entworfen aus der mit dem Primer 466215 erhaltenen Sequenz. Der
Vorwärts-Primer
20205 (5'-CCATGTCATTATCGACCATTCGGC-3', SEQ ID NO: 75)
wurde aus der mit dem Primer 20215 er haltenen Sequenz entworfen.
Die Primer 20205 und 20215 flankieren die Kodierungssequenz des
ersten Kodierungsexons und können
zur Amplifizierung dieser Kodierungssequenz unter Verwendung von
PCR verwendet werden.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Expressionsvektoren, welche
Neurturin-cDNA enthalten.
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Zur
Expression von rekombinantem Neurturin in Säugerzellen wurde der Neurturin-Vektor pCMV-NTN-3-1
hergestellt. Der offene 585-Nucleotid-Leserahmen der Neurturin-cDNA
wurde durch PCR unter Verwendung eines Primers, welcher die ersten
27 Nucleotide der Neurturin-Kodierungssequenz (5'-GCGACGCGTACCATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG,
SEQ ID No. 63) enthält,
und eines Primers, welcher die letzten 5 Kodons und das Stopkodon
(5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC)
(SEQ ID NO: 64) enthält,
amplifiziert, wobei revers-transkribierte Maushirn-mRNA am postnatalen
Tag 1 als Templat verwendet wurde, wobei PCR-Parameter eingesetzt
wurden: 94°C
für 30
Sekunden; 60°C
für 15
Sekunden; und 68°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen, einschließlich
5% DMSO in der Reaktion. Das PCR-Produkt wurde in die Eco RV-Stelle
von BSKS subkloniert und sequenziert, um zu verifizieren, dass es
keine PCR-generierten Mutationen enthielt. Die Neurturin-Kodierungssequenz
wurde anschließend
aus diesem Vektor ausgeschnitten, wobei Mlu I (5'-Ende) und Bam H1 (3'-Ende) verwendet wurden, und unterhalb
des CMV IE-Promoters/Enhancers in den Säugerexpressionsvektor pCB6
eingesetzt (Brewer, C. B. Methods in Cell Biology 43: 233–245, 1994),
um den pCMV-NTN-3-1-Vektor unter Verwendung dieser Stellen zu bilden.
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Zur
Expression von rekombinantem Protein in E. Coli wurde der reife
Kodierungsabschnitt von Maus-Neurturin durch PCR amplifiziert, wobei
ein Primer, der die ersten sieben Kodons von der reifen Kodierungssequenz
(5'-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG)
(SEQ ID NO. 65) enthielt, und ein Primer, welcher die letzten fünf Kodons
und das Stopkodon 5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC
(SEQ ID NO: 66) enthielt, unter Verwendung eines Fragments, enthaltend
das Murin-Neurturin-Gen als Templat, verwendet wurde, wobei PCR-Parameter
verwendet wurden: 94°C
für 30
Sekunden; 60°C
für 15
Sekunden und 68°C
für 90
Sekunden für
25 Zyklen mit 5% DMSO, welches zu der Reaktion zugesetzt wurde.
Das amplifizierte Produkt wurde in die Eco RV-Stelle von BSKS subkloniert,
die Nucleotid-Sequenz wurde verifiziert, und dieses Fragment wurde
anschließend
in dem Expressionsvektor pET-30a (Novagen, Madison, WI) unter Verwendung
einer Nde 1-Stelle (5'-Ende)
und einer Eco R1-Stelle (3'-Ende)
transferiert. Der pET-Neurturin-Vektor (pET-NTN) kodiert für ein Initiator-Methionin
vor der ersten Aminosäure
des reifen Maus-Neurturin-Proteins, vorausgesagt auf der Basis der
N-termi nalen Aminosäuresequenz
von Neuturin, welche aus dem konditionierten CHO-Zellenmedium gereinigt
wurde.
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Beispiel 7
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die vorübergehende
Transfizierung von NIH3T3-Zellen
mit dem Neurturin-Expressions-Vektor pCMV-NTN-3-1, und dass das
Produkt der Genom-Sequenz in Beispiel 5 biologisch aktiv ist.
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Um
zu zeigen, dass geklonte Neurturin-cDNA ausreichte, um die Synthese
von biologisch wirksamem Neurturin hervorzurufen, wurde das pCMV-NTN-3-1-Plasmid
in NIH3T3-Zellen vorübergehend
eingefügt,
wobei das Lipofectamin-Verfahren der Transfizierung verwendet wurde.
Die NIH3T3-Zellen wurden bei einer Dichte von 400.000 Zellen pro
Well (34,6 mm Durchmesser) auf 6 Well-Platten (Corning, Corning,
NY) 24 Stunden vor der Transfizierung gegeben. DNA-Liposom-Komplexe
wurden hergestellt und zu den Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll zugesetzt,
wobei 1,5 μg
CMV-Neurturin-Plasmid-DNA (isoliert und gereinigt unter Verwendung
einer Qiagen- (Chatsworth, CA) Tip-500-Säule gemäß dem Herstellerprotokoll)
und 10 μl
Lipofectamin-Reagenz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) in 1:1 DME/F12-Medium,
enthaltend 5 μg/ml
Insulin, 5 μg/ml Transferrin
und 5 ng/ml Natriumselenit (Sigma, St. Louis, MO), verwendet wurde.
Fünf Stunden
nach der Zugabe von DNA-Liposom-Komplexen
in 1 ml Medium pro Well wurden 1 ml DME-Medium, enthaltend 20% Kalbsserum,
zu jedem Well zugesetzt. 24 Stunden nach der Zugabe der DNA-Liposom-Komplexe
wurden die obigen 2 ml Medium durch 1 ml DME-Medium, enthaltend
10% Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μ/ml Streptomycin
und 25 μg/ml
Heparin, ersetzt. Die Zellen wurden zusätzliche 24 Stunden inkubiert,
bevor das konditionierte Medium geerntet, zur Entfernung von zellulärer Debris
zentrifugiert und eingefroren wurde.
-
Als
Kontrolle wurden NIH3T3-Zellen wie oben transfiziert, wobei 1,5 μg CMV-Neo-Expressions-Plasmid
(enthaltend keinen cDNA-Einsatz) anstelle von 1,5 μg CMV-Neurturin-Plasmid
verwendet wurden. Das konditionierte Medium aus NIH3T3-Zellen, welches mit
entweder Kontrollplasmid oder CMV-Neurturin-Plasmid transfiziert
worden ist, wurde durch direkte Zugabe zu dem SCG-Kulturmedium zu
der Zeit der NGF-Deprivation untersucht. Die Zugabe von 0,25 ml
konditioniertem Medium aus CMV-Neurturin-transfektierten Zellen
förderten
70% Überleben
der sympathischen Neuronen, und ein Überleben von > 90% konnte mit 0,45
ml dieses konditionierten Mediums erhalten werden. Es konnte keine
signifikante überlebensfördernde
Wirkung in dem konditionierten Medium der transfizierten Kontroll-NIH3T3-Zellen
detektiert werden.
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Beispiel 8
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Eierstockzellen des chinesischen
Hamsters, welche stabil mit Neurturin-cDNA transformiert wurden.
DG44-Zellen, ein Eierstockzellen-Derivat des chinesischen Hamsters,
dem es an Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) mangelt (Urlaub et al. Cell.
3: 405–412,
1983), wurden mit Expressionsplasmid (pCMV-NTN-3-1) und einem DHFR-Expressionsplasmid
(HLD) (McArthur, und Stanners J. Biol. Chem. 266: 6000–6005, 1991)
stabil cotransfiziert.
-
Am
Tag 1 wurden DG44-Zellen in 1 × 106 Zellen pro 10 cm Platte in Ham's F12-Medium mit 10% fötalem Kalbsserum
(FCS) platziert. Diese Dichte darf nicht überschritten werden, oder die
Zellen würden überwuchern,
bevor das Selektionsmedium am Tag 5 zugesetzt wird.
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Am
Tag 2 wurden die Zellen mit einem 9:1-Verhältnis von pCMV-NTN zu DHFR-Expressionsplasmid unter
Verwendung der Calciumphosphatmethode (10 μg DNA/10 cm Platte) (Chen und
Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752, 1987 welche durch Bezugnahme
hierin eingeschlossen ist) transfiziert.
-
Am
Tag 3 wurden die transfizierten Zellen mit Ham's F12-Medium und mit 10% FCS gefütterten
Ham's F12 gewaschen.
-
Am
Tag 5 wurden die Zellen mit MEM-alpha-Medium gewaschen und mit Selektionsmedium,
welches MEM-alpha mit 10% FCS und 400 μg/ml G418 darstellt, gefüttert. Die
Zellen wurden in dem Selektionsmedium gehalten und alle 4 Tage gefüttert. Die
Kolonien begannen ungefähr
14 Tage nach der Transfizierung sichtbar zu werden. Die in dem Selektionsmedium
wachsenden Kolonien wurden anschließend in eine 24-Well-Platte überführt und
am nächsten
Tag trypsinisiert, um die Zellen zu dispergieren. Man ließ die Zellen
in entweder 24-Well- oder 6-Well-Platten zur Konfluenz zusammenwachsen,
um die Zellen hinsichtlich der Expression von rekombinantem Protein
zu screenen. Die Expression von Neurturin wurde in 10 Klonreihen
bestimmt, und zwei hochexprimierende Reihen wurden unter Verwendung
des SCG-Überlebensassays
detektiert. Diese Klonreihen wurden vermehrt, und die Expression
in diesen ausgewählten
Zellreihen wurde durch Selektion in 50 mM Methotrexat (MTX) amplifiziert.
Für die
Selektion in MTX ließ man
Zellen bis auf 50% Konfluenz in einer 150 cm2-Flasche
in dem Selektionsmedium wachsen. Das Medium wurde nach MEM-alpha,
enthaltend 50 nM MTX-Konzentration geändert (es war nicht notwendig,
G418 während
der MTX-Amplifikation zu verwenden). Nach Platzieren in 50 mM MTX
starb die Mehrzahl der Zellen ab, und Kolonien der resistenten Zellen
traten in 1 bis 2 Wochen erneut auf. Dann wurden die Zellen trypsinisiert,
um die Kolonien zu dispergieren, und aufgeteilt, wenn die Zellen
die Konfluenz erreichten. Die Zellen erreichten letztendlich dieselbe
Wachstumsrate wie vorher. Die ausgewählten Zellen wurden hinsichtlich
der Expression von rekombinantem Protein gescreent. Ein 2–3-facher
Anstieg in der Expression wurde nach der Selektion in 50 mM MTX
beobachtet. Gefrorene Stocks wurden gehalten für Zelllinien, die von der ursprünglichen
Selektion und der 50 mM MTX-Selektion erhalten wurden. Eine weitere
Selektion konnte in zunehmendem MTX fortgesetzt werden, bis erwünschte Expressionsniveaus
erhalten wurden.
-
Unter
Verwendung des obengenannten Verfahrens konnten als DG44CHO5-3(G418) (pCMV-NTN-3-1)
und DG44CHO5-3 (50nMMTX) (pCMV-NTN-3-1) identifizierte Zellen isoliert
werden. Die Zellen des DG44CHO5-3 (50nMMTX) (pCMV-NTN-3-1)-Stammes exprimierten
Mengen von ungefähr
100 μg biologisch
aktives Protein pro Liter konditioniertem Medium, wie es durch direkte
Untersuchung des konditionierten Mediums in dem SCG-Assay gemäß dem Verfahren
im Beispiel 1 bestimmt wurde.
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Beispiel 9
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Expression von Neurturin in verschiedenen
Geweben.
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Es
wurde eine Studie der Neurturin- und GDNF-Expression in Rattenembryo-Geweben (E10, Tag
10 nach der Empfängnis),
neonatalen Geweben (P1, postnataler Tag 1) und erwachsenen Geweben
(> 3 Mos) unter Verwendung
von semiquantitativer RT/PCR durchgeführt (Estus et al., J. Cell.
Biol. 127: 1717–1727, 1994).
Die RNA-Proben wurden aus verschiedenen Geweben erhalten, und PCR-Produkte
wurden entweder durch Autoradiographie nach der Inkorporierung von α-32P-dCTP in der PCR und Elektrophorese auf
einem Polyacrylamidgel oder durch Ethidiumbromid-Färbung der
DNA nach der Elektrophorese auf Agarosegelen (Tabellen 3 und 4)
detektiert. Das Neurturin-Fragment mit 101 Basenpaaren wurde unter
Verwendung des Vorwärts-Primers
CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG (SEQ ID NO: 67) und des Rückwärts-Primers
TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 68) erhalten, und
das GDNF-Fragment mit 194 Basenpaaren wurde unter Verwendung des
Vorwärts-Primers
AAAAATCGGGGGTGYGTCTTA (SEQ ID NO. 69) und des Rückwärts-Primers CATGCCTGGCCTACYTTGTCA
(SEQ ID NO: 70) erzielt.
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Es
wurde keine Neurturin- oder GDNF-mRNA im frühesten embryonalen Alter (embryonaler
Tag 10, E10), welches erfasst wurde, detektiert.
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Bei
Neugeborenen (postnataler Tag 1, P1) wurden beide Transkripte/Kopien
in vielen Geweben exprimiert, obwohl Neurturin dazu neigte, eine
größere Expression
in den meisten Geweben zu zeigen, als es bei GDNF der Fall war (siehe
Tabelle 3).
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Wie
in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden Unterschiede in den Gewebeverteilungen
von Neurturin und GDNF verzeichnet. Insbesondere wurde kein GDNF
in Leber und Thymus detektiert, worin eine Neurturin-Expression
detektiert wurde, und kein Neurturin wurde in dem Ischiasnerv detektiert,
wo GDNF detektiert wurde.
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Neuturin-
und GDNF-mRNA wurden in vielen Geweben in dem erwachsenen Tier detektiert,
allerdings war das gewebespezifische Muster der Expression für diese
zwei Gene äußerst unterschiedlich
(Tabelle 4).
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Wie
in Tabelle 4 gezeigt ist, wurde gefunden, dass Neurturin im Gehirn
und Rückenmark
sowie im Blut und Knochenmark exprimiert wurde, wo kein GDNF detektiert
wurde. Das Expressionsniveau von Neurturin im Gehirn und Blut war
jedoch geringer als das, welches in neonatalem Gewebe detektiert
wurde.
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Neuturin
wurde ebenso in frisch isolierten Rattenbauchfell-Mastzellen hoch
exprimiert, wohingegen GDNF nur eine geringe oder keine Expression
zeigte.
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Beispiel 10
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Antiseren gegenüber Neurturin
durch Immunisieren von Kaninchen mit einem Neurturinpeptid.
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Die
Peptidsequenz, welche den Aminosäuren
73–87
des reifen Murin-Neurturin-Proteins
entsprach, wurde synthetisiert und an Keyhole-Limpet-Hemocyanin
(KLH) gekoppelt, wie bereits früher
beschrieben wurde (Harlow und Lane, Antibodies: a laboratory manual,
1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY., Seiten 72–81). Das
KLH-gekoppelte Peptid wurde an die Caltag, Inc. geschickt, und ein
jeder von zwei Hasen wurden immunisiert. Die Immunisierung wurde
durch subkutane Injektion an 7–10
Stellen durchgeführt.
Die erste Injektion erfolgte mit 150 μm KLH-gekoppeltem Peptid, welches in 0,5 ml
Salzlösung
resuspendiert wurde und mit 0,5 ml Freundschem kompletten Adjuvants
emulgiert wurde. Es wurden Boost-Injektionen 4 Wochen nach der ersten
Injektion begonnen und einmal in 7 Tagen wie oben für insgesamt
5 Injektionen durchgeführt, außer dass
100 μg KLH-gekoppeltes
Peptid und Freundsches inkomplettes Adjuvants verwendet wurde. Serumproben
wurden 1 Woche nach dem fünften
Boost gesammelt.
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Ein
gepooltes Volumen von 20 ml Serum, welche von beiden Kaninchen eine
Woche nach der fünften Injektion
gesammelt wurde, wurde aufgereinigt. Für die Aufreinigung wurde eine
Peptidaffinitätssäule durch Kupplung
des obengenannten Peptids and Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose
4B gemäß dem Herstellerprotokoll
(Pharmacia Biotech) präpariert.
Das Serum wurde 10-fach in 10 mM Tris pH 7,5 Puffer verdünnt und durch
behutsames Schwenken 16 Stunden lang bei 4°C mit 0,5 ml Peptid-Agarose-Matrix,
enthaltend 5 mg gekoppeltes Peptid, gemischt. Die Matrix wurde auf
eine Säule
gegeben, mit 5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl gewaschen, mit
5 ml 10 mM Tris pH 7,5-Puffer, enthaltend 0,4 M NaCl, gewaschen
und mit 5,5 ml 100 mM Glycin pH 2,5-Puffer eluiert. Ein zehntel
Volumen von 1,0 M Tris pH 8,0 Puffer wurde zu dem Eluat direkt nach
der Elution zugesetzt, um den pH zu neutralisieren. Das Glycin-Eluat
wurde über
Nacht gegenüber
10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert.
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Die
Affinitäts-gereinigten
Antikörper
wurden in einem Western Blot verwendet, um die spezifische Erkennung
des rekombinanten Neurturin-Proteins zu zeigen. 10 ml konditioniertes
Medium, gesammelt aus DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)- Zellen, wurden über SP-Sepharose,
wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, und die Proteine wurden
auf einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel in dem Tricine-Puffer-System (Schagger
und von Jagow Analytical Biochemistry 166: 368–479, 1987) elektrophoresiert.
Die Proteine wurden an eine Nitrocellulose-Membran in 25 mM Tris,
192 mM Glycin, 0,04% SDS, 17% Methanol bei 4°C 16 Stunden lang elektrogeblotted.
Die Membran wurde mit den Affinitäts-gereinigten Anti-Neurturin-Peptid-Antikörpern und anschließend mit
Meerettich-Peroxidase-gekoppelten Schaf-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert
(Harlow und Lane, supra, Seiten 498–510). Die gebundenen Antikörper wurden
mit verstärkter
Chemilumineszenz detektiert (ECL Kit, Amersham, Buckinghamshire,
England). Die Anti-Neurturin-Antikörper erkannten ein einzelnes
ungefähr 11,5
kD-Protein-Band in dem konditionierten Medium der DG44CHO5-3 (G418)
(pCMV-NTN-3-1)-Zellen. Unter Verwendung dieser Anti-Neurturin-Antikörper konnte
Neurturin-Protein in 10 ml konditioniertem Medium aus DG44CHO5-3
(G418) (pCMV-NTN-3-1)-Zellen detektiert werden, konnte allerdings
nicht in 10 ml Medium, konditioniert mit DG44-Zellen detektiert
werden, welche nicht mit dem Neurturin-Expressionsvektor transformiert
worden waren.
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Beispiel 11
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Das
folgende Beispiel verdeutlicht die Identifizierung von zusätzlichen
Mitgliedern der GDNF/Neurturin/Persephin-Gen-Subfamilie.
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Die
TGF-β-Superfamilie
enthält
derzeit über
25 unterschiedliche Genmitglieder (als Überblick siehe Kingsley, Genes
and Development 8: 133–146,
1994). Die einzelnen Familienmitglieder zeigen unterschiedliche
Homologiegrade miteinander auf, und nähere Subgruppen können innerhalb
der Superfamilie durch phylogenetische Analyse unter Verwendung
des Clustal V-Programms (Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189–191, 1992)
und durch Bootstrap-Analyse von phylogenetischen Bäumen (Felsenstein,
Evolution 39: 783–791,
1985) definiert werden. Neurturin oder Persephin ist ungefähr 40% identisch
zu GDNF, allerdings weniger als 20% identisch zu jedem anderen Mitglied
der TGF-β-Superfamilie.
Nähere
Sequenzbereiche in Neurturin können
identifiziert werden (5), welche innerhalb der GDNF/Neurturin/Persephin-Subfamilie,
allerdings nicht innerhalb der TGF-β-Superfamilie hoch konserviert
bzw. hoch erhalten sind. Diese erhaltenen Bereiche können wahrscheinlich
eine Subfamilie kennzeichnen, die bisher unisolierte Gene enthält, welche
nun unter Verwendung der erhaltenen Sequenzbereiche isoliert werden
können,
die durch die Entdeckung und Sequenzierung der Neurturin- und Persephin-Gene
identifiziert wurden. Die Bereiche hoher Sequenz-Konservierung bzw.
hohem Sequenzerhalt zwischen Neurturin, Persephin und GDNF erlauben
den Entwurf von entarteten bzw. degenerierten Oligonucleotiden,
welche entweder als Sonden oder Primer verwendet werden können. Aminosäuresequenzen
konservierter Bereiche wurden hierin identifiziert und umfassen Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr,
worin Xaa1 Ser, Thr oder Ala ist, und Xaa2 Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 108);
Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys, worin
Xaa1 Thr, Glu oder Lys darstellt, Xaa2 Val, Leu oder Ile ist, Xaa3 Leu
oder Ile darstellt, Xaa4 Ala oder Ser ist
und Xaa5 Ala oder Ser darstellt, (SEQ ID
NO: 113); und Cys-Cys-Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Asp-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-Leu-Asp-Xaa9, worin Xaa1 Arg
oder Gln ist, Xaa2 Thr oder Val oder Ile
darstellt, Xaa3 Ala oder Ser ist, Xaa4 Tyr oder Phe ist, Xaa5 Glu,
Asp oder Ala darstellt, Xaa6 Glu, Asp oder
keine Aminosäure
ist, Xaa7 Val oder Leu ist, Xaa8 Ser
oder Thr darstellt und Xaa9 Asp oder Val
ist (SEQ ID NO: 114). Nucleotidsequenzen, welche eine Kodierungssequenz für die obengenannten
konservierten Sequenzen oder Fragmente der obengenannten konservierten
Sequenzen enthalten, können
als Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primer-Sequenzen,
welche aus diesen Bereichen bzw. Abschnitten erstellt werden können, sind
die folgenden:
-
Vorwärts-Primer,
-
- Primer A (M3119): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTA
(SEQ ID NO: 115) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr
kodiert, worin Xaa1 Thr, Ser oder Ala darstellt
und Xaa2 Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 125);
- Primer B (M3123): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANG
(SEQ ID NO: 116) 19 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5 kodiert, worin Xaa1 Asp
oder Glu darstellt, Xaa2 Val oder Leu ist, Xaa3 Thr oder Ser ist, Xaa4 Asp
oder Glu ist, und Xaa5 Asp oder Val ist
(SEQ ID NO: 126);
- Primer C (M3126): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANGW
(SEQ ID NO: 117) 20 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5 kodiert, worin Xaa1 Asp
oder Glu darstellt, Xaa2 Val oder Leu ist, Xaa3 Thr oder Ser ist, Xaa4 Asp
oder Glu ist, und Xaa5 Asp oder Val ist
(SEQ ID NO: 126);
- Primer D (M3121): 5'-TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTG
(SEQ ID NO: 118) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys
kodiert, worin Xaa1 Ser oder Ala darstellt
und Xaa2 Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 127);
- Primer E (M3122): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTNGG
(SEQ ID NO: 119) 20 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly
kodiert, worin Xaa1 Thr, Ser oder Ala darstellt
und Xaa2 Asp oder Glu ist (SEQ ID NO: 128);
und
- Primer F (M3176): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTT
(SEQ ID NO: 120) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz
Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Phe
kodiert, worin Xaa1 Thr, Ser oder Ala darstellt
und Xaa2 Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 129).
-
Rückwärts-Primer,
-
- Primer G (M3125): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNTC
(SEQ ID NO: 121) 20 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz
für die
Aminosäuresequenz
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5 kodiert, worin
Xaa1 Asp oder Glu darstellt, Xaa2 Val oder Leu ist, Xaa3 Thr
oder Ser ist, Xaa4 Asp oder Glu ist und
Xaa5 Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
- Primer H (M3124): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNT
(SEQ ID NO: 122) 19 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz
für die
Aminosäuresequenz
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5 kodiert, worin
Xaa1 Asp oder Glu darstellt, Xaa2 Val oder Leu ist, Xaa3 Thr
oder Ser ist, Xaa4 Asp oder Glu ist und
Xaa5 Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
- Primer I (M3120): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAA
(SEQ ID NO: 123) 23 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz
für die
Aminosäuresequenz
Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys kodiert,
worin Xaa1 Ser oder Ala darstellt und Xaa2 Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 127); und
- Primer J (M3118): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAANA
(SEQ ID NO: 124) 25 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz
für die
Aminosäuresequenz
Xaa1-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa2-Gly-Xaa3-Cys kodiert, worin Xaa1 Ile
oder Leu darstellt, Xaa2 Ser oder Ala ist
und Xaa3 Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 130).
-
Zusätzlich zu
den Obengenannten basieren die folgenden Primer auf konservierten
Abschnitten in GDNF und Neurturin (SEQ ID NOS: 33–35).
- Primer
1, GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42), welche für die Aminosäuresequenz Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr
kodiert, worin Xaa1 Ser oder Thr ist und
Xaa2 Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO:
33);
- Primer 2, TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC (SEQ ID NO: 43),
welche für
die Aminosäuresequenz
Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala kodiert, worin
Xaa1 Ala oder Ser darstellt, Xaa2 Ala oder Ser ist, Xaa3 Glu
oder Asp ist und Xaa4 Ser oder Ala ist (SEQ
ID NO: 36);
- Primer 3, reverse GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA (SEQ ID NO:
44), dessen reverse komplementäre
Sequenz für
die Aminosäuresequenz
Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala kodiert, worin
Xaa1 Ala oder Ser darstellt, Xaa2 Ala oder Ser ist, Xaa3 Glu
oder Asp ist und Xaa4 Ser oder Ala ist (SEQ ID
NO: 37);
- Primer 4, reverse TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA (SEQ ID NO: 45),
dessen reverse komplementäre
Sequenz für
die Aminosäuresequenz
Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa1-Ala-Xaa2-Xaa3-Asp-Xaa4 kodiert,
worin Xaa1 Ile oder Thr oder Val darstellt,
Xaa2 Try oder Phe ist, Xaa3 Glu
oder Asp ist und Xaa4 Glu oder Asp ist (SEQ
ID NO: 38);
- Primer 5, reverse TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (SEQ ID NO:
46, dessen reverse komplementäre
Sequenz für
die Aminosäuresequenz
Ala-Xaa1-Xaa2-Asp-Xaa3-Xaa4-Ser-Phe-Leu-ASp kodiert, worin Xaa1 Tyr oder Phe darstellt, Xaa2 Glu
oder Asp ist, Xaa3 Glu oder Asp ist und
Xaa4 Val oder Leu ist (SEQ ID NO: 39);
- Primer 6, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (SEQ ID NO: 47), welche für die Aminosäuresequenz Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys kodiert, worin Xaa1 Glu oder Thr darstellt, Xaa2 Leu
oder Val ist und Xaa3 Ile oder Leu ist (SEQ
ID NO: 40);
- Primer 7, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (SEQ ID NO:
48), welche für
die Aminosäuresequenz
Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys-Xaa6 kodiert,
worin Xaa1 Glu oder Thr darstellt, Xaa2 Leu oder Val ist, Xaa3 Ile
oder Leu ist, Xaa4 Ser oder Ala ist, Xaa5 Ser oder Ala ist und Xaa6 Glu
oder Asp ist. (SEQ ID NO: 41).
-
Die
obigen Sequenzen können
als Sonden zum Screenen von Bibliotheken für Genomklone oder Primer zur
Amplifizierung von Genfragmenten aus Genom-DNA oder Bibliotheken
von Genomklonen oder von revers-transkribierter cDNA unter Verwendung
RNA-Templaten aus einer Vielzahl von Geweben verwendet werden. Genom-DNA
oder Bibliotheken von Genom-Klonen als Template verwendet werden,
weil die Neurturin-, Persephin- und GDNF-kodierenden Sequenzen für die reifen
Proteine nicht durch Introns unterbrochen sind.
-
Ein
entartetes Oligonucleotid kann als eine Mischung von Oligonucleotiden
synthetisiert werden, welche sämtliche
der möglichen
Nucleotidsequenzen enthält,
die für
die konservierte Aminosäuresequenz
kodieren. Um die Anzahl unterschiedli cher Oligonucleotide in einer
entarteten Mischung zu vermindern, kann ein Inosin oder eine Universalbase
(Loakes et al., Nucleic Acids Res. 22: 4039–43, 1994) in die Synthese
an Positionen eingefügt
werden, wo sämtliche
vier Nucleotide möglich
sind. Das Inosin oder die Universalbase bildet Basenpaare mit jedem
der vier normalen DNA-Basen, welche weniger stabilisierend sind
als AT- und GC-Basenpaare, welche allerdings ebenso weniger destabilisierend
sind als Fehlordnungen zwischen den normalen Basen (d. h. AG, AC,
TG, TC).
-
Um
Familienmitglieder zu isolieren, kann ein obiger Primer mit 32P unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase
endgelabelt werden und an Bibliotheken humaner Genomklone gemäß Standardverfahren
hybridisiert werden.
-
Ein
bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von Familienmitglieds-Genen
wäre die
Verwendung verschiedener Kombinationen der obigen entarteten Primer
als Primer in der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von
Genom-DNA als ein Templat. Die verschiedenen Kombinationen von Primern
können
sequenzielle PCR-Reaktionen unter Verwendung von verschachtelten
Primern oder die Verwendung eines Vorwärts-Primers, gepaart mit einem
Oligo-dT-Primer, einschließen.
Zusätzlich
kann einer der entarteten Primer mit einem Vektorprimer verwendet
werden, ein einzelner Primer kann in einem invertierten PCR-Assay
verwendet werden, oder die PCR kann mit einem entarteten Primer
und einem randomisierten Primer durchgeführt werden. Als ein Beispiel,
welches den obigen Satz Primer verwendet, kann Primer 2 (SEQ ID
NO: 43) mit Primer 4 (SEQ ID NO: 45) in der PCR mit 1 μg Humangenom-DNA
und zyklierenden Parametern von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 60
Sekunden verwendet werden. Die obengenannten PCR-Bedingungen sind
nur beispielhaft, und der Fachmann wird leicht erkennen, dass ein
Bereich geeigneter Bedingungen und Primer-Kombinationen verwendet
oder optimiert werden können,
wie unterschiedliche Temperaturen und variierende Salzkonzentrationen
in dem Puffermedium und ähnliches.
Es ist bevorzugt, dass DMSO zu der PCR-Reaktion in einer finalen
Konzentration von 5% zugesetzt wird, da gefunden wurde, dass dieses
für die
Amplifizierung dieses Abschnitts des Neurturin-Gens notwendig ist.
Die PCR-Reaktion, wenn sie auf einem Agarose-Gel laufen gelassen
wird, sollte Produkte in dem Größenbereich
von 100–150
Basenpaaren enthalten, da eine Ein-Aminosäure-Spalte in die Neurturin-Sequenz
eingefügt
wird und eine Fünf-Aminosäure-Spalte in die Persephin-Sequenz
eingefügt
wird, wenn eine der beiden Sequenzen mit GDNF ausgerichtet/abgeglichen
wird, und folglich können
die Familienmitgliedsgene ebenso einen leicht variablen Abstand zwischen
den konservierten Sequenzen der Primer 2 und 4 enthalten. Die PCR-Produkte
in dem Bereich von 100 bis 150 Basenpaaren sollten mehrfach amplifizierte
Genprodukte enthalten, einschließlich GDNF, Neurturin und Persephin
sowie bisher unisolierte Familienmitglieder. Um die Se quenzen dieser
Produkte zu identifizieren, können
sie gelgereinigt und in das Bluescript-Plasmid (Stratagene) ligiert
werden und anschließend
in den XL1-Blue E. Coli-Wirtsstamm (Stratagene) transformiert werden.
Die Bakterienkolonien, welche einzelne Subklone enthalten, können für die Isolierung
herausgegriffen und auf Nitrocellulose-Filter in zwei Repliken platiert
werden. Jeder der Replikfilter kann mit einer Oligonucleotidsonde
nach entweder einzelner GDNF- oder einzelner Neurturin- oder einzelner Persephin-Sequenz
in dem amplifizierten Abschnitt gescreent werden. Subklone, welche
weder an GDNF noch an Neurturin oder Persephin hybridisieren, können sequenziert
werden und, sofern sie als die bisher unisolierten Familienmitglieder
kodierend gefunden werden, kann die Sequenz zur Isolierung der cDNA-Klone
voller Länge
und der Genomklone verwendet werden, wie es für Neurturin vorgenommen wurde
(Beispiel 5). Ein ähnliches
Verfahren wurde zur Isolierung neuer Genmitglieder (GDF-3 und GDF-9)
der TGF-β-Superfamilie
auf der Basis der Homologie zwischen den bisher identifizierten Genen
verwendet (McPherron, J. Biol. Chem. 268: 3444–3449, 1993).
-
Die
vorliegenden Erfinder glauben, dass der am meisten bevorzugte Weg
zur Isolierung der Familienmitgliedergene die Anwendung des obengenannten
PCR-Verfahrens als Screening-Verfahren zur Isolierung der einzelnen
Familienmitglieder-Genomklone
aus einer Bibliothek sein kann. Dieses liegt daran, weil nur ein Exon
für den
Kodierungsabschnitt sowohl von reifem Neurturin als auch von GDNF
existiert. Wenn beispielsweise die obengenannte PCR-Reaktion mit
den Primern 2 und 4 Produkte geeigneter Größe unter Verwendung von Humangenom-DNA
als Templat bildet, kann dieselbe Reaktion durchgeführt werden,
wobei als Templat Pools von Genomklonen in dem P1-Vektor gemäß im Stand
der Technik bekannten Verfahren verwendet werden, beispielsweise
jenes, das für
die Isolierung von Neurturin-Humangenomklonen verwendet wurde (Beispiel
5). Pools bzw. Datensammlungen, welche das Neurturin-Gen in dieser
Bibliothek enthalten, wurden früher
identifiziert, und Persephin und GDNF-enthaltende Pools können leicht
durch Screening mit GDNF-spezifischen Primern identifiziert werden.
Folglich werden Nicht-Neurturin-, Nicht-Persephin-, Nicht-GDNF-Pools, welche
ein Produkt der richtigen Größe bilden
unter Verwendung der entarteten Primer, leicht als die bisher unisolierten
Familienmitglieder erkannt werden. Die PCR-Produkte, welche aus
diesen Pools gebildet werden, können
direkt unter Verwendung automatischer Sequenzierer sequenziert werden,
und Genomklone können durch
weitere Unterteilung und Screenen der gepoolten Klone als ein von
Genom Systems, Inc. angebotener Standardservice isoliert werden.
-
Beispiel 12
-
Das
folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Identifizierung
von Persephin unter Verwendung der in Beispiel 11 beschriebenen
Verfahren und Primer.
-
Die
von den Erfindern hierin ausgearbeitete entartete bzw. degenerierte
PCR-Strategie wurde
nun erfolgreich zur Identifizierung eines dritten Faktors, Persephin,
verwendet, welches ungefähr
35 bis 50% identisch zu sowohl GDNF als auch Neurturin ist. Der
experimentelle Ansatz war der oben beschriebene und wurde detaillierter
wie folgt durchgeführt.
Primer, entsprechend der Aminosäuresequenz Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa1 Ser
oder Thr ist und Xaa2 Glu oder Asp darstellt,
SEQ ID NO: 33) [M1996; 5'-GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA
(SEQ ID NO: 42)], und Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala, worin Xaa1 Ala
oder Ser ist, Xaa2 Ala oder Ser ist, Xaa3 Glu oder Asp darstellt, und Xaa4 Ser oder Ala darstellt (SEQ ID NO: 37)
[M1999; 5'-GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRCARTANCKRAA
(SEQ ID NO: 44)], wurden zur Amplifizierung eines 77 nt-Fragments
aus Rattengenom-DNA unter Verwendung von Klentaq-Enzym und Puffer
unter den folgenden Bedingungen verwendet: 94°C für 30 Sekunden, 44°C für 30 Sekunden;
72°C für 30 Sekunden
für 40
Zyklen. Das resultierende Produkt wurde in das Bluescript KS-Plasmid subkloniert
und sequenziert. Sämtliches
Nucleotid-Sequenzieren wurde unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff-Terminatortechnologie
gemäß den Benutzeranweisungen
auf einem automatischen Sequenzierer von Applied Biosystems Modell
#373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die
Plasmid-DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard-Miniprep-Kits
(Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Betriebsanleitungen
hergestellt.
-
Die
Sequenz eines der amplifizierten Produkte sagte Aminosäuresequenzdaten
innerhalb der PCR-Primer voraus, welche unterschiedlich von denen
von GDNF oder Neurturin waren, welche allerdings mehr als 20% Identität mit GDNF
und Neurturin aufwiesen, wohingegen die Sequenzen anderer, die wir
beobachtet haben, GDNF oder Neurturin entsprachen, wie es erwartet
wurde. Es wird angenommen, dass die neue Sequenz ein neues Mitglied
dieser Familie identifiziert, welches wir Persephin genannt haben.
-
Die
Sequenz dieses Fragments innerhalb der Primer war 5'-TGCCTCAGAGGAGAAGATTATC
(SEQ ID NO: 90). Diese kodiert das letzte Nucleotid des Tyr-Codons
und kodiert anschließend
die Aminosäuren: Ala-Ser-Glu-Glu-Lys-Ile-Ile
(SEQ ID NO: 91). Diese Sequenz wurde anschließend mit den Rattensequenzen von
GDNF und Neurturin ausgerichtet/abgeglichen. Diese Analyse bestätigte, dass
Persephin einzigartig war.
-
-
Um
eine zusätzliche
Persephinsequenz zu erhalten, wurden Primer, welche Abschnitte der
einzigartigen 22 nt des amplifizierten Fragments oben enthalten,
in der schnellen Amplifizierung von cDNA-Enden (RACE)-Technik (Frohman,
M.A. Methods in Enzymology 218: 340–356, 1993) unter Verwendung
des Marathon-RACE-Kits (CLONTECH, Palo Alto, CA) gemäß der Betriebsanleitung
verwendet, außer
dass die Synthese des ersten cDNA-Strangs bei 50°C unter Verwendung von Superscript
II-Reverse-Transkriptase
(Gibco-BRL) ausgeführt
wurde. Kurz gesagt wurde ein Doppelstrang-Adapter-Oligonucleotid
an die Enden der Doppelstrang-cDNA legiert, synthetisiert aus Rattenhirn-mRNA
am postnatalen Tag 1. Unter Verwendung von verschachtelten Vorwärts-Persephin-PCR-Primern
(10135; 5'-AGTCGGGGTTGGGGTATGCCTCA,
SEQ ID NO: 95 und M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT,
SEQ ID NO: 96) in Kombination mit Primern zu dem in dem Kit zugeführten ligierten
Adapter (AP1, AP2) wurden die 3'-Enden
der Persephin-cDNA durch zwei sukzessive PCR-Reaktionen amplifiziert
(Erstens: 10135 und AP1 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 15 Sekunden
und 68°C
für 2 Minuten
für 35
Zyklen; Zweitens: M2026 und AP2 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden,
60°C für 15 Sekunden
und 68°C
für 2 Minuten
für 21
Zyklen). Ein ungefähr
350 nt-Fragment wurde aus dieser PCR-Reaktion erhalten, und dieses
Fragment wurde unter Verwendung des Primers M2026 direkt sequenziert.
Die Sequenz dieses 3'-RACE-Produkts
resultierte in einer partiellen Ratten-Persephin-cDNA-Sequenz mit
ungefähr
350 nt (SEQ ID NO: 97). Die vorausgesagte Aminosäuresequenz dieser cDNA wurde
mit der von GDNF und Neurturin verglichen, und es wurde gefunden,
dass sie ungefähr 40%
homolog zu jedem dieser Proteine ist. Wichtigerweise waren die charakteristischen
Abstände
der Cystein-Reste in den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie anwesend. Darüber hinaus
war zusätzlich
zu dem Ähnlichkeitsbereich,
welcher durch die zur Isolierung von Persephin verwendeten degenerierten
Primer kodiert wird, ein weiterer Bereich hoher Homologie, welcher
von GDNF und Neurturin geteilt wird, allerdings den anderen Mitgliedern
der TGF-β-Superfamilie
abwesend ist, ebenso anwesend in Persephin.
![Figure 00750002](https://patentimages.storage.***apis.com/9f/d7/a3/b9049cc2076bf0/00750002.png)
- (Aminosäurenummerierung
verwendet den ersten Cys-Rest als Aminosäure 1).
-
Mit
der Bestätigung,
dass Persephin in der Tat ein neues Mitglied der GDNF/Neurturin-Subfamilie
ist, isolierten wir murine Genomklone von Persephin, um zu sätzliche
Sequenzinformation zu erhalten. Die Primer (vorwärts, M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT, SEQ ID NO:
96 und rückwärts, M3028;
5'-TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA,
SEQ ID NO: 101), welche der Ratten-cDNA-Sequenz entsprechen, wurden in einer
PCR-Reaktion verwendet (PCR-Parameter: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden
und 72°C
für 30
Sekunden für
35 Zyklen), um ein 155 nt-Fragment aus Maus-Genom-DNA zu amplifizieren,
welches zu der Ratten-Persephin-cDNA-Sequenz homolog war. Diese
Primer wurden anschließend
verwendet, um murine Persephin-Genom-Klone aus einer Maus-129/Sv-Bibliothek
in einem P1-Bakteriophagen-Vektor zu erhalten (Library Screening
Service von Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
-
Restriktions-Fragmente
(3,4 kb Nco I und ein 3,3 kb Bam H1) dieses P1-Klons, welcher das
Persephin-Gen enthielt, wurden durch Hybridisierung mit einem 210
nt-Fragment identifiziert, welches durch PCR unter Verwendung von
Maus-Genom-DNA mit
Primern (vorwärts,
M2026; SEQ ID NO: 96 und rückwärts, M3159;
5'-CCACCACAGCCACAAGCTGCGGSTGAGAGCTG,
SEQ ID NO: 102) und den PCR-Parametern: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden
und 72°C
für 30
Sekunden für
35 Zyklen, erhalten wurde. Die Nco I- und Bam H1-Fragmente wurden
sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie einen Aminosäureabschnitt
kodieren, welcher dem entspricht, der in dem Ratten-Persephin-RACE-Produkt
vorlag, und welcher zu den reifen Abschnitten von sowohl Neurturin
als auch GDNF homolog ist.
-
Wenn
die Aminosäuresequenzen
von Murin-GDNF, Neurturin und Persephin unter Verwendung des ersten
Cysteins als Ausgangspunkt abgeglichen werden (was vorgenommen wird,
weil Änderungen
in den Spaltungsstellen zwischen den Familienmitgliedern eine Variabilität in den
Segmenten oberhalb des ersten Cysteins bilden), ist Persephin (91
Aminosäuren)
etwas kleiner als sowohl Neurturin (95 Aminosäuren) als auch GDNF (94 Aminosäuren). Die
Gesamtidentität
innerhalb dieses Bereichs beträgt
ungefähr
50% mit Neurturin und etwa 40% mit GDNF.
-
Ein
weiteres Nucleotid-Sequenzieren des murinen Persephin-Nco I-Fragments
ergab die Nucleotid-Sequenz des gesamten Murin-Persephin-Gens (SEQ
ID NO: 131; 1A). Ein offener Leserahmen
erstreckt sich von der Sequenz, welche für ein Initiator-Methionin kodiert,
bis zu einem Stopkodon an den Positionen 244–246. Jedoch ist irgendwo in
dieser Sequenz eine scheinbare Anomalie, sodass die Sequenz, welche
die RXXR-Spaltungsstelle (Nucleotide an den Positionen 257–268) kodiert,
und die Sequenz, welche das reife Perspephin-Protein (Positionen
269–556)
kodiert, nicht mit diesem offenen Leserahmen co-linear sind. Anstelle
dessen kodiert ein zweiter Leserahmen die Spaltungsstelle und das
reife Persephin.
-
Ein
zusätzliches
Sequenzieren des Ratten-Persephins wurde ebenso durchgeführt. Ratten-Genom-Fragmente
wurden durch PCR unter Verwendung von Klentaq und Ratten-Genom-DNA
als ein Templat amplifiziert. Der Vorwärts-Primer #40266 (5'-AATCCCCAGGACAGGCAGGGAAT;
SEQ ID NO: 137), entsprechend einem Abschnitt oberhalb des Maus-Persephin-Gens,
und ein Rückwärts-Primer
M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC,
SEQ ID NO: 138), entsprechend einem Abschnitt innerhalb der reifen
Ratten-Persephin-Sequenz, wurden mit den folgenden Parametern verwendet
(95°C für 15 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden,
68°C für 45 Sekunden × 30 Zyklen).
Das amplifizierte Produkt wurde einer T4-Polynucleotid-Kinase unterzogen,
die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgeschlossen
(gebluntet) und in BSKS-Plasmid kloniert.
-
Das
Nucleotid-Sequenzieren wurde durchgeführt, um die Sequenz des gesamten
Ratten-Persephin-Gens aufzufinden (SEQ ID NO: 134; 2A). Ein offener Leserahmen wurde als von einer
Sequenz, welche für
ein Initiator-Methionin kodiert, bis zu einem Stop-Kodon an den
Positionen 244–246
erstreckend gefunden, wie es bei Murin-Persephin der Fall war. Wie
ebenso bei Murin-Persephin wurde eine auftretende Anomalie zwischen
der Sequenz, welche das Initiator-Methionin kodiert, und der die
Spaltungsstelle für
das reife Ratten-Persephin kodierenden gefunden, sodass zwei überzeugende
Leserahmen existieren. Unabhängig von
dieser Anomalie exprimieren Säugerzellen
Persephin von entweder der Murin- oder Ratten-Genom-Sequenz in voller
Länge,
wie nachstehend angegeben ist (siehe Beispiel 14).
-
Um
dem Ursprung dieser Anomalie nachzugehen wurden Säugerexpressionsvektoren
für sowohl Maus-
als auch Ratten-Persephin hergestellt. Um das Maus-Plasmid zu bilden,
wurde ein P1-Klon, enthaltend das Maus-Persephin-Gen, als Templat
in einem PCR-Assay verwendet. Die Primer wurden derartig entworfen, dass
das resultierende Fragment das Persephin-Gen enthalten würde, erstreckend
von dem Initiator-Methionin zu dem Stoppkodon. Die PCR-Reaktion
verwendete einen Vorwärts-Primer
M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA]
und einen Rückwärts-Primer
M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC].
Um das analoge Ratten-Plasmid zu bilden, wurde Ratten-Genom-DNA
als ein Templat in einem PCR-Assay verwendet. Die PCR-Reaktion verwendete
einen Vorwärts-Primer
M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA]
und einen Rückwärts-Primer
M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC].
Die verstärkten
Produkte wurden in BSKS geklont und sequenziert, um zu verifizieren,
dass der korrekte Klon erhalten worden ist. Die Ratten- und Maus-Persephin-Fragmente wurden
unter Verwendung von Sma I und Hind III ausgeschniten und in Asp718-
(geblunted) und Hind III-Stellen des Säuger-Expressions-Vektors pCB6
kloniert.
-
COS-Affenzellen
wurden mit entweder den Ratten- oder Maus-Persephin-Expressions-Vektoren
oder dem nichtrekombinanten Vektor (pCB6) selbst transfiziert. Achtundvierzig
Stunden später
wurden die Zellen lysiert, die Proben wurden auf ein 15% SDS-Polyacrylamid-Gel
geladen, und die Proteine wurden durch Elektrophorese aufgetrennt.
Die Proteine wurden anschließend
in Nitrozellulose durch Elektroblotting transferriert. Diese Nitrozellulose-Membran
wurde mit Anti-Persephin-Antikörper
inkubiert (welche wir gegen reifes Persephin richteten, hergestellt
in Bakterien aus einem pET-Plasmid), um die Anwesenheit von Persephin
in den Lysaten zu detektieren. Lysate aus Zellen, welche mit entweder
dem Ratten- oder Maus-Persephin-Expressionsfaktor
transfiziert wurden, allerdings nicht die Lysate aus mit pCB6 transfiszierten
Zellen, enthalten hohe Mengen an Persephin. Die Größe des detektierten
Persephins betrug 10–15
kD, was mit der für
das prozessierte (d.h. der reifen Form von Persephin) vorausgesagten
Größe konsistent
ist. Konditionierte Medien, welche diesen Zellen entnommen wurden,
enthielten reifes Persephin. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl
die Maus- als auch Ratten-Persephin-Gene zur Führung der Synthese eines angemessen
prozessierten Persephin-Moleküls
in der Lage sind.
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Um
den Mechanismus, durch den dieses auftritt, zu erforschen, isolierten
wir RNA aus mit entweder Ratten- oder Maus-Persephin-Expressionsfaktor
transfizierten Zellen. Die RT/PCR-Analyse wurde unter Verwendung
von Primern durchgeführt,
welche zu dem Initiator Met und dem Stoppkodon korrespondierend
waren. Es wurden zwei Fragmente detektiert: eines entsprechend der
vorhergesagten Größe des Persephin-Gens
und das andere ein wenig kleiner, was darauf hindeutet, dass ein
RNA-Spleißen
(RNA-Splicing) auftrat. Wir bestätigten
dieses mit einer Vielzahl anderer Primerpaare. Sowohl das große als auch
das kleine Persephin-Fragment wurde kloniert und sequenziert. Wie
erwartet entsprach das größere Fragment
dem Persephin-Gen. Das kleine Fragment entsprach einer gespleißten Version
von Persephin. Ein kleines 88 nt-Intron innerhalb der Pro-Domäne (situiert
154 nt unterhalb des Startkodons) wurde herausgespleißt. Nach
diesem Spleißen
war der "Frameshift" nicht länger anwesend
(d.h. der Initiator Met und die reife Region waren innerhalb des
Rahmens) sowohl in dem Ratten- als auch dem Maus-Persephin (siehe 1B und 2B).
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Beispiel 13
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung eines bakteriellen Expressionsvektors
für murines
Persephin und dessen Einführen
in E. Coli zur Exprimierung von rekombinatem reifen Persephin.
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Das
Persephin-Polynucleotid, welches das reife Murin-Persephin-Protein
kodiert, das fünf
Aminosäuren
oberhalb des ersten Gerüst-Cys-Restes
beginnt (SEQ ID NO: 80), wurde in den pET-Expressionsvektor pET-30a
an den Nde I- und Bgl II-Stellen
geklont. Dieses Persephin-Polynucleotid wurde durch PCR unter Verwendung
des Murin-Persephin-P1-Genom-Klons als ein Templat gebildet. Ein
Vorwärts-Primer
M3157 (5'- GGACTATCATATGGCCCACCACCACCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGG
CCTTGGCTGGTTCATGCCGA, SEQ ID NO: 139), welcher eine Nde I-Stelle,
acht Histidin-Reste und eine Enterokinase-Stelle kodiert, und ein
Rückwärts-Primer
M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC,
SEQ ID NO: 138), welcher der Sequenz entspricht, welche die letzten
drei Aminosäurereste
der reifen Persephinsequenz, das Stopkodon und eine Bgl II-Stelle
kodiert, wurden verwendet. Die PCR-Reaktionsbedingungen betrugen
95°C für 15 Sekunden,
55°C für 15 Sekunden,
68°C für 60 Sekunden × 25 Zyklen.
Dieses PCR-Produkt wurde an der EcoRV-Stelle des BSKS-Plasmids subkloniert
und sequenziert, um zu verifizieren, dass es keine Mutationen aufwies.
Die Persephin-Sequenz wurde anschließend aus diesem Vektor ausgeschnitten
unter Verwendung von Nde I und Bgl II und in die Nde I-(5') und Bgl II-(3')-Stellen des bakteriellen Expressionsvektors
pET-30a (Novalgen, Madison, WI) kloniert. Dieser Expressionsfaktor
würde daher
die reife Form des Persephin-Proteins bilden, welches einen Amino-terminalen
Marker aufweist, bestehend aus acht Histidin-Resten, gefolgt direkt
von einer Enterokinase-Stelle.
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Das
Plasmid wurde in den E. Coli-Stamm BL21 (DE3) eingefügt. Um Persephin
zu bilden, wurden dieses Plasmid enthaltende Bakterien 16 Stunden
lang gezüchtet,
geerntet und unter Verwendung von 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris
bei pH 8,0 lysiert, und rekombinantes Persephin-Protein wurde aus
diesen Lysaten via Chromatographie über einem Ni-NTA-Harz (Qiagen)
gereinigt. Das Protein wurde unter Verwendung von drei Säulenvolumina
Puffer E, enthaltend 8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris, bei pH 4,5 eluiert. Das Persephin
wurde anschließend
durch Dialyse in einem Renaturierungspuffer, bestehend aus 0,1 M
NaH2PO4, 0,01 M
Tris bei pH 8,3, 0,15 M NaCl, 3 mM Cystein, 0,02% Tween-20, 10%
Glycerin und enthaltend abnehmende Konzentrationen an Harnstoff,
beginnend mit 4 M für
16 Stunden, gefolgt von 2 M für
16 Stunden, 1 M für
72 Stunden und 0,5 M für
16 Stunden, renaturiert. Die Persephinkonzentration wurde anschließend unter
Verwendung eines Dot Metric-Assays (Geno Technology, St. Louis,
MO) bestimmt und bei 4°C
gelagert.
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Dieses
bakteriell gebildete rekombinante Persephin wurde als ein Immunogen
in Hasen zur Bildung von Antikörpern
gegenüber
reifem Persephin verwendet. Sämtliche
der immunogenen Injektionen und Blutentnahmen wurden bei Cal Tag
Inc. (Healdsburg, CA) durchgeführt.
Es zeigt sich, dass das Anti-Persephin-Antiserum spezifisch Persephin
erkennt, allerdings nicht Neurturin oder GDNF, unter Verwendung
der Protein-Blot-Analyse. Dieses Persephin-spezifische Antiserum
wurde anschließend
zur Detektion von Persephin in Lysaten, welche aus transfizierten
COS-Zellen gebildet
wurden, verwendet.
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Beispiel 14
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Säuger-Expressions-Vektoren,
welche Murin- oder Ratten-Persephin-Gene enthalten, sowie deren
Einfügen
in Säugerzelllinien
zur Herstellung von reifem Persephin. Um das Murin-Plasmid zu bilden,
wurde ein P1-Klon, enthaltend das Murin-Persephin-Gen, als ein Templat
in einem PCR-Assay verwendet. Primer wurden derartig entworfen,
dass das resultierende Polynucleotid das Persephin-Gen enthält, welches
sich von dem Initiator-Methionin-Kodon
zu dem Stoppkodon 3' zu
der reifen Persephin-Kodierungs-Sequenz (SEQ ID NO: 131) erstreckt.
Die PCR-Reaktion verwendete einen Vorwärts-Primer M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ
ID NO: 140) und Rückwärts-Primer
M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC,
SEQ ID NO: 138). Um das analoge Ratten-Plasmid zu bilden, wurde
Ratten-Genom-DNA als ein Templat in einem PCR-Assay verwendet. Die
PCR-Reaktion verwendete einen Vorwärts-Primer M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ
ID NO: 140) und Rückwärts-Primer
M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC,
SEQ ID NO: 138). Beide PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von
Klentaq und den folgenden Parametern durchgeführt: 95°C für 15 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden,
68°C für 45 Sekunden × 25 Zyklen.
Die amplifizierten Produkte wurden einer T4-Polynucleotid-Kinase
unterzogen, die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment)
geblunted und in das BSKS-Plasmid kloniert. Ein Nucleotid-Sequenzieren
wurde durchgeführt,
um zu verifizieren, dass der korrekte Klon erhalten wurde. Die Ratten- und
Murin-Persephin-Polynucleotide wurden unter Verwendung von Sma I
und Hind III ausgeschnitten, und jedes wurde in eine Asp718- (gebluntet)
und Hind-III-Stelle des Säugerexpressionsvektors
pCB6 kloniert.
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COS-Affenzellen
wurde mit entweder den Ratten- oder Murin-Persephin-Expressionsvektoren
(16 μg pro
5 × 105 Zellen) oder dem nicht rekombinanten Vektor
(pCB6) selbst transfiziert, wobei das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren
(Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752, 1987) verwendet wurde.
48 Stunden später
wurden die Zellen in IP-Puffer, enthaltend 50 mM Tris bei pH 7,5,
300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Deoxycholat, 10 mM EDTA, 0,1% SDS,
5 μg/ml
Leupeptin, 7 μg/ml
Pepstatin und 250 μm
PMSF, lysiert. Die Proben wurden auf ein 15%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel
geladen, und die Proteine wurden durch Elektrophorese aufgetrennt.
Die Proteine wurden anschließend
in Nitrocellulose durch Elektroblotting transferiert. Diese Nitrocellulose-Membran
wurde mit Anti-Persephin-Antikörpern
inkubiert, um die Anwesenheit von Persephin in den Lysaten zu detektieren.
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Lysate
aus Zellen, welche mit entweder dem Ratten- oder Murin-Persephin-Expressionsvektor
transfiziert wurden, allerdings nicht die Lysate aus mit pCB6 trans fizierten
Zellen, enthalten hohe Mengen an Persephin. Die Größe des detektierten
Persephins betrug ungefähr
14 kD, was mit der für
das prozessierte, d. h. die reife Form von Persephin, vorausgesagten
Größe konsistent
ist. Dieses zeigt, dass sowohl die Murin- als auch Ratten-Persephin-Gene
zur Führung
der Synthese eines angemessen prozessierten Persephin-Moleküls in der
Lage sind.
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Beispiel 15
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Das
folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Identifizierung
von menschlichem Persephin (Human-Persephin).
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Um
das menschliche Homologe von Persephin oder zusätzlichen Mitgliedern der GDNF-Familie
zu identifizieren, wurden degenerierte PCR-Primer auf der Basis
von Human-Neurturin- und GDNF-Sequenzen entworfen und zur Amplifizierung
von Human-Genom-DNA verwendet. Die folgenden Primer wurden verwendet
(SEQ ID NOS: 225–228):
-
Human-Genom-DNA
(Clontech 6550–1
0,1 μg/μl) wurde
mit sämtlichen
4 möglichen
Primer-Kombinationen amplifiziert (DN1-DN3r, DN1-DN4r, DN2-DN3r,
DN2-DN4r). Die Reaktionsmischungen
enthielten 5 μl 10 × Klentaq-Puffer,
0,5 μl dNTP
(20 mM); 1 μl
Human-Genom-DNA, 0,6 μl
Klentaq (Clontech) und 1,5 μl
eines jeden Primers (0,1 OD/μl)
in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
Die DNA wurde durch Touchdown-PCR auf einem Perkin Elmer Gene AMP
9600 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: Eingangsdenaturierung
bei 98°C
für 2', anschließend 5 Zyklen
[98°C 30'', 72°C
1,5'], 5 Zyklen
(98°C 30'', 70°C
1,5'] und 25 Zyklen
[98°C 30', 68°C 1,5'], gefolgt von einem
letzten Verlängerungsschritt
bei 68°C
für 5'.
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Die
PCR-Produkte von ungefähr
130 bis 200 bp wurden nach der Elektrophorese auf einem Agarose-Gel
identifiziert, gereinigt und in einen pCR 2.1-Vektor unter Verwendung
eines In Vitrogen TA Cloning Kit (Cat # K2000–01) kloniert. Klone, enthaltend
einen 130–200
bp-Einschub (nach EcoR1-Digerierung), wurden sequenziert, und einer
von ihnen (Klon A3), erhalten mit dem Primer-Paar DN1-DN3r, hatte
eine zu Maus-Persephin homologe Sequenz und entsprach Human-Persephin.
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Die
Teilsequenz der Human-Persephin-Genom-DNA in Klon A3 ist nachstehend
gezeigt (SEQ ID NO: 229):
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Um
eine Quelle zu identifizieren, aus der ein cDNA-Klon von Human-Persephin
voller Länge
isoliert werden kann, wurden cDNA-Bibliotheken durch PCR-gescreent,
wobei exakt passende Primer, entworfen auf der Basis der oben beschriebenen
Genom-DNA-Sequenz, verwendet wurden. Zwei Sets von spezifischen
Human-Persephin-Primern wurden hergestellt (SEQ ID NOS: 230–233),
und zur
Amplifizierung der Einzelstrang-DNA von pRK5 cDNA-Bibliotheken (1 μl von 200
ng/μl) oder
dem Stratagene's
Quickscreen Pannel (3 μl
einer jeden Bibliothek) unter Verwendung derselben Bedingungen,
wie sie oben beschrieben wurden, verwendet. Die PCR-Produkte der
erwarteten Größe (108
bp für
hPSP-5'1 mit hPSP-3'.1 und 101 bp für hPSP-5'.3 mit hPSP-3'.4) wurden in fötaler Lunge,
fötaler
Leber, fötaler
Niere, in dem Dünndarm,
der Netzhaut, dem Kleinhirn und hT+13-Lymphoblasten detektiert.
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Um
cDNA-Klone, welche für
Human-Persephin kodieren, zu isolieren, wurden pRK5-Bibliotheken
aus Humangeweben hinsichtlich Persephin-cDNA-Klonen durch Verlängern von
Einzelstrang-DNA aus Plasmid-Bibliotheken, welche in einem dut
–/ung
–-Host
unter Verwendung von einem der beiden folgenden Primer (SEQ ID NOS:
233–234)
gezüchtet
wurden, angereichert:
in einer Reaktion, enthaltend
10 μl 10 × PCR-Puffer
(Perkin Elmer), 1 μl
dNTP (20 mM), 1 μl
Biobliotheks-DNA (200 ng), 0,5 μl
Primer, 86,5 μl
H
2O und 1 μl Amplitaq (Perkin Elmer), zugesetzt
nach einem warmen Start. Die Reaktion wurde für 1 Minute bei 95°C denaturiert,
für 1 Minute
bei 50, 60 oder 68°C
abkühlen
gelassen und anschließend
innerhalb von 20 Minuten bei 72°C
verlängert.
Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und
anschließend
durch Elektroporation in DH10B-Wirtsbakterien transformiert.
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Ungefähr 40.000
Kolonien einer jeden Transformation wurden auf Nylonmembranen gehoben
und mit einer DNA-Sonde, abgeleitet von der Sequenz des Klons A3
(oben beschrieben), gescreent. Das Fragment wurde unter Verwendung
des Random-Oligonucleotid-Verfahrens
unter Verwendung von [32P]-dCTP gelabelt. Filter wurden über Nacht
bei 42°C
in 50% Formamid, 5 × SSC,
10 × Denhardt's 0,05M Natriumphosphat
(pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 μg/ml beschallter Lachssperma-DNA
hybridisiert. Die Filter wurden anschließend in 2 × SSC gespült und gewaschen in 0,1 × SSC, 0,1%
SDS, und anschließend über Nacht
Kodak-Röntgenfilmen
ausgesetzt. Reine positive Klone wurden nach dem sekundären Screening
erhalten, und die isolierten Klone wurden anschließend sequenziert.
Human-Persephin-Klone wurden aus Bibliotheken fötaler Lunge, fötaler Niere
und fötaler
Leber isoliert. Sämtliche
dieser isolierten Persephin-Klone gehören zu zwei Kategorien: ungespleißt (10 Klone)
oder chimär
(6 Klone). Ungespleißte
Klone waren ungefähr
900 bp lang und enthalten ein Bereich, welcher für ein Fragment, welches Human-Persephin
entspricht, kodiert. Es liegt allerdings dort kein Initiations-Methionin
und Signalpeptid in dem Leserahmen (Rahmen +2) vor. Ein potentielles
Upstream-Initiations-Kodon (ATG) liegt in einem anderen Leserahmen
(+1) vor und wird von einer hydrophoben Sequenz, entsprechend einem
potentiellen Signal-Peptid, nachgefolgt. Dieses legt nahe, dass
solche cDNAs unvollständig
gespleißt
sind und dass ein Intron zwischen den Exons verbleibt, welches)
für das
Signal-Peptid und das Persephin-Protein kodieren. Übereinstimmende
Spleiß-Donor-
und Akzeptor-Sequenzen können
in der Tat an den Positionen 340 und 425 jeweils identifiziert werden.
Ein Spleißen
eines zwischen diesen Positionen befindlichen Introns würde zu einer
cDNA führen,
worin die Persephin-Kodierungs-Sequenz "innerhalb des Rahmens" mit dem Initiator
Methionin liegt. Interessanterweise wurden abweichende chimäre Klone
identifiziert, welche aus der Verbindung einer cDNA resultieren,
kodierend für
das vorausgesagte Exon 2 des Persephins, exakt an der Spleiß-Akzeptor-Stelle,
wie sie an Position 425 vorliegt. Das entsprechende Transkript wurde
wahrscheinlich durch irrtümliches
Spleißen
gebildet, bestätigt
allerdings die Anwesenheit einer Spleiß-Akzeptor-Stelle an Position
425.
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Als
ein alternativer Ansatz zur Isolierung eines Human-Persephin-cDNA-Klons
wurden 3 Millionen Klone einer Human-Kleinhirn-cDNA-Bibliothek in
Lambda-ZAP (Stratagene cat #935201) mit einer DNA-Sonde, entsprechend
Klon A3, gelabelt durch das Random-Oligonucleotid-Verfahren unter
Verwendung von [32P]-dCTP, gescreent. Die Bibliothek wurde unter äußerst stringenten
Hybridisierungsbedingungen gescreent. Die Filter wurden prähybridisiert
für 2 Stunden,
anschließend über Nacht
bei 42°C
in 50% Formamid, 5 × SSC,
10 × Denhardt's, 0,05 M Natriumphosphat
(pH 6,5), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 μg/ml beschallter Lachssperma-DNA hybridisiert.
Die Filter wurden anschließend
in 2 × SSC
abgespült
und einmal in 0,1 × SSC, 0,1%
SDS bei 60°C
gewaschen. Die Filter wurden über
Nacht Kodak-Röntgenfilmen
ausgesetzt.
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Vier
positive Klone (Cere 1.1, 1.2. 6.1, 6.2) wurden aufgenommen und
Plaquegereinigt. Der innerhalb der Lambda-ZAP-Phagenarme enthaltene
Plasmid wurde gemäß der Herstellerangaben
unter Verwendung einer Ex Assist Helper-Phage gerettet. Das Sequenzieren
der vier Klone gab an, dass diese Klone Geschwister waren und zwei
stille Mutationen enthielten, wenn sie mit Human-Persephin-Klonen,
die aus der oben beschriebenen pRK5-Bibliothek isoliert wurden,
verglichen wurden. Diese stillen Mutationen traten an den Positionen
30 (T → C)
und 360 (T → C)
der in 24 gezeigten Sequenz auf. Eine
direkte Sequenzierung des Human-Persephin-Gens ergab, dass diese
stillen Mutationen eigentlich Allel-Variationen in dem Gen darstellen.
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Um
zu bestimmen, ob das korrekte Protein aus der oben identifizierten
ungespleißten
cDNA exprimiert werden kann, wurden Konstrukte gebildet, worin die
Sequenz, welche für
ein Flag-Tag kodiert, kurz vor dem Stoppkodon an der Position 685
(Rahmen +1) oder an Position 746 (Rahmen +2), startend an dem an
Position 46 oder 193 vorliegenden ATG-Kodon, eingesetzt wurde. Alle
vier möglichen
Konstrukte wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer
(SEQ ID NOS: 235–238)
gebildet:
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In
allen vier PCR-Reaktionen wurde der Cere 1.2-Klon als Templat verwendet
und mit Pfu-Polymerase auf einem Stratagene Robocyler Gradient Cycler
96 amplifiziert. Die PCR-Bedingungen betrugen 95°C für 2', 30 Zyklen von [95°C 30'',
1' bei 52, 56, 60
oder 63°C,
72°C für 2 Minuten],
gefolgt von einer letzten Verlängerung
von 5 Minuten bei 72°C.
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Die
Vorwärts-Primer
besitzen eine Bam HI-Stelle, und die Rückwärts-Primer besitzen eine Hind
III-Restriktionsstelle. Die PCR-Produkte, die mit Bam HI und Hind
III digeriert wurden, wurden subkloniert in diese Stellen in pRK5.
DNA aus einem jeden dieser Konstrukte wurde über Nacht in 293 Zellen unter
Verwendung der CaPO4-Methode transfiziert. Serum-enthaltende Medien
wurden 24 Stunden lang konditioniert und anschließend geerntet.
Die Zellen wurden ebenso geerntet und in zwei Teile aufgeteilt;
1/4 einer jeden Platte für RT-PCR
und die restlichen 3/4 einer jeden Platte für die Immunopräzipitation.
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Die
Analyse der exprimierten Proteine wurde durch Immunopräzipitation
durchgeführt.
Das Zell-Pellet wurde in 1 ml Lysispuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150
mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, Aprotinin, Leupeptin, PMSF, 1 mM NaF
und 1 mM Natriumvanadat) 20 Minuten lang bei 4°C lysiert. Das Extrakt wurde
10 Minuten bei 10K U/Min. gedreht/zentrifugiert, und anschließend wurde
der Überstand
in ein neues Rohr überführt und mit
20 μl Protein-A-Sepharose
eine Stunde lang vorgeklärt.
Von dort wurde 1 ml des konditionierten Mediums parallel verarbeitet.
Die Protein-A-Sepharose wurde abzentrifugiert, und 1 μl Anti-Flag-Antikörper (3,6 μg) wurde
zu jedem Rohr zugegeben. Nach einer Inkubation bei 4°C über Nacht,
wurden 30 μl
Protein-G-Sepharose zugesetzt, und die Rohre wurden bei 4°C 1 Stunde
lang inkubiert. Die Protein-G-Kügelchen
wurden anschließend
1 Minute zentrifugiert, 3x mit Lysis-Puffer gewaschen, in 20 μl Laemli-Puffer
resuspendiert in Anwesenheit von β-Mercapto-Ethanol.
Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 100°C denaturiert und anschließend auf ein
16%-Polyacrylamidgel geladen. Die Proteine wurden anschließend auf
Nitrozellulose überführt und
durch Westernblot unter Verwendung derselben Anti-Flag-Antikörper über Nacht
bei 1 μg/ml
in Blockpuffer (PBS + 0,5% Tween + 5% fettfreier Trockenmilch +
3% Ziegenserum) analysiert. Anschließend wurde ein Anti-Maus-HRP.ECL
für die
Detektion verwendet, und die Membran wurde 90 Sekunden einem Röntgenfilm
ausgesetzt.
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Eine
spezifische Bande von 16 kDa wurde detektiert in dem Zellenpellet
von Zellen, welche mit dem Konstrukt transfiziert wurden, startend
bei ATG 193 des Rahmens +1 und mit dem Flag eingesetzt in den Rahmen
+2, und ein spezifisches Band von ungefähr 10 kDa konnte in dem entsprechenden Überstand
detektiert werden. Kein Flag-Tagged-Protein konnte in irgendeiner
anderen Transfizierung oder in einer vorgetäuscht transfizierten Zelle
detektiert werden.
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Die
korrekt gespleißte
mRNA wurde durch RT-PCR wie folgt identifiziert. Die Gesamt-RNA
wurde aus den transfizierten Zellen (1/4 eines jeden Pellets) unter
Verwendung von RNAzol B (Tel-Test Inc.) extrahiert und 40 Minuten
lang bei 37°C
mit DNase behandelt. RNA wurde anschließend auf einer RNAasy-Säule (Promega)
gereinigt und in einem finalen Volumen von 50 μl gesammelt. Der erste Strang
der cDNA wurde synthetisiert auf 4 μl RNA unter Verwendung von Superscript
RT (GIBCO-BRL) für 1 Stunde
bei 37°C,
anschließend 5' bei 95°C zur Inaktivierung.
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Zwei μl einer jeden
RT-Reaktion wurden anschließend
als Templat für
die Amplifizierung durch PCR in Anwesenheit der folgenden zwei Primer
(SEQ ID NOS: 236 und 239) verwendet:
auf einem Stratagene Robocyler
Gradient Cycler 96. Die PCR-Bedingungen betrugen 98°C für 1,5', 28 Zyklen von [98°C für 30'', Kühlen
1' zwischen 60°C und 76°C, 72°C für 1,5'], gefolgt von einer
letzten Verlängerung
für 5 Minuten
bei 72°C.
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Die
Analyse des PCR-Produkts auf Agarosegel gibt an, dass die PCR unter
Verwendung des pRK5.hPSP-FLAG.2-Plasmids als Templat das erwartete
Produkt von ungefähr
570 bp ergab, während
das RT-PCR-Produkt, welches RNA aus mit diesem Konstrukt als Templat
transfizierten Zellen verwendet, kleiner als 500 bp war. Das PCR-Produkt
aus der letzteren Reaktion wurde in den pCR 2.1-Vektor unter Verwendung des
In Vitrogen TA Kloning Kit (cat #K2000–01) subkloniert und sequenziert.
Die Sequenzanalyse ergab, dass das vorhergesagte 84 bp-Intron aus
dem Transkript herausgespleißt
wurde.
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Zusammenfassend
besitzt die Human-Persephin-cDNA einen offenen 471-bp-Leserahmen, welcher für eine 156
Aminosäuren
langes Protein kodiert (vorhergesagt Mr 16,6 kDA). Die Spaltung
des 23 Aminosäuren
langen vorhergesagten Signalpeptids führt zu einem 133 Aminosäure-Pro-Persephin-Molekül (Mr 14,2 kDa);
die proteolytische Spaltung des Pro-Persephins an der übereinstimmenden
RXXR-Sequenz sollte ein reifes 96 Aminosäure-Protein mit einem Molekulargewicht
von 10,3 kDa liefern. Diese vorhergesagte Größe entspricht der Größe des Flag-Tagged-Proteins,
welches aus dem konditionierten Medium der transfizierten 293 Zellen
immunopräzipitiert
wurde. Darüber
hinaus bestätigte
die Amino-terminale Sequenzierung des Flag-Tagged-Persephins, gereinigt
aus dem konditionierten Medium von 293 transfizierten Zellen, dass
der erste Rest der reifen Form Ala 61 darstellt. Der Abgleich zwischen
Human-Persephin und Human-Neurturin gibt eine 38%-Ähnlichkeit
zwischen den zwei Molekülen
an (50% für
die reife Region) und dass das Human-Persephin zu 30% ähnlich ist
zu Human-GDNF (40% in der reifen Region).
-
Beispiel 16
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Chimären- oder Hybrid-Polypeptid-Molekülen, welche von
Persephin abgeleitete Abschnitte (PSP) und von Neurturin abgeleitete
Abschnitte (NTN) enthalten.
-
Als
eng verwandte Mitglieder der TGF-β-Familie
wird vorausgesagt, dass sowohl Persephin als auch Neurturin eine äußerst ähnliche
Gesamtstruktur aufweisen, auch wenn Neurturin das Überleben
von sympathischen Neuronen fördert,
während
das eng verwandte Persephin dieses nicht tut. Zwei Chimären wurden durch
im Wesentlichen Ersetzen der Abschnitte von Persephin durch Neurturin
hergestellt, wobei der Kreuzpunkt zwischen den zwei benachbarten
hochbewahrten dritten und vierten Cystein-Resten lag. Die erste
Chimäre,
genannt PSP/NTN (SEQ ID NO: 141, 3),
enthält
die ersten 63 Reste des reifen Murin-Persephins, kombiniert mit
den Resten 68 bis 100 des reifen Murin-Neurturins (unter Verwendung
von E. Coli-bevorzugten Kodons). Um dieses Molekül zu bilden, wurden zwei PCR-Reaktionen
durchgeführt:
- 1) unter Verwendung des Vorwärts-Primers
M2012 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAA,
SEQ ID NO: 142) und des Rückwärts-Primers
M2188 (5'-TCGTCTTCGTAAGCAGTCGGACGGCAGCAGGGTCGGCAATGGGCTCGAC,
SEQ ID NO: 143) und dem pET30a-Murin-Persephin-Plasmid als Templat
(siehe Beispiel 13); und
- 2) unter Verwendung des Vorwärts-Primers
M2190 (5'-TGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGACGA,
SEQ ID NO: 144) und des Rückwärts-Primers
2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT,
SEQ ID NO: 145) und dem pET30a-Murin- (E. Coli-bevorzugte Kodons)
Neurturin-Plasmid als Templat (siehe Beispiel 6). Beide PCR-Reaktionen
wurden unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden,
55°C für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen.
Die Produkte dieser zwei PCR-Reaktionen wurden gelgereinigt, zusammen
vermischt, und eine PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt:
94°C für 30 Sekunden,
60°C für 20 Minuten,
68°C für 5 Minuten.
Nach 8 Zyklen wurde ein Aliquot dieser Reaktion als Templat in einer
dritten PCR-Reaktion
unter Verwendung des Vorwärts-Primers
M2012 und des Rückwärts-Primers
M2186 unter den folgenden Bedingungen verwendet: 94°C für 30 Sekunden,
55°C für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen.
Das resultierende Produkt wurde einer T4-Polynucleotid-Kinase unterzogen,
die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment)
geblunted und in BSKS-Plasmid kloniert. Ein Nucleotid-Sequenzieren
wurde durchgeführt,
um zu verifizieren, dass der korrekte Klon erhalten wurde. Das PSP/NTN-Fragment
wurde unter Verwendung von Nde I und Bam H1 ausgeschnitten und in
die korrespondierenden Stellen des Bakterien-Expressionsvektors
pET30a kloniert.
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Das
zweite Chimäre,
genannt NTN/PSP (SEQ ID NO: 146, 3),
kodiert das entgegengesetzte Molekül. Es enthält die ersten 67 Reste des
reifen Murin-Neurturins (unter Verwendung von E. Coli-bevorzugten Kodons),
kombiniert mit den Resten 64 bis 96 von reifem Murin-Persephin.
Um dieses Molekül
herzustellen, wurden die folgenden PCR-Reaktionen durchgeführt: 1)
unter Verwendung des Vorwärts-Primers
M2012 und des Rückwärts-Primers
M2183 (5'-CACTCAGCATAGCTGGTGGGCTGGCAGCACGGGTGAGCACGAGCACGTT,
SEQ ID NO: 147) und des pET30a-Murin- (E. Coli-bevorzugte Kodons)
Neurturin-Plasmids als Templat; und 2) unter Verwendung des Vorwärts-Primers
M2187 (5'-TGCTGCCAGCCCACCAGCTATGCTG,
SEQ ID NO: 148) und des Rückwärts-Primers
M2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT,
SEQ ID NO: 145) und des pET30a-Murin-Persephin-Plasmids
als Templat. Beide PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden
Parameter durchgeführt:
94°C für 30 Sekunden,
55°C für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen.
Die Produkte dieser zwei PCR-Reaktionen wurden zum Aufbau des finalen NTN/PSP-pET30a-Plasmids,
wie oben im Detail für
PSP/NTN beschrieben, verwendet, außer dass Bgl II anstelle von
Bam H1 verwendet wurde. Diese chimären Proteine wurden in E. Coli
hergestellt und durch Ni-NTA-Chromatographie gereinigt, wie es oben
beschrieben wurde (Beispiel 13).
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Die
gereinigten Proteine wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, dass Überleben
in dem SCG-Assay sympathischer Neuronen zu fördern. Das NTN/PSP-Protein förderte nicht
das Überleben,
wohingegen das PSP/NTN-Protein das Überleben von symphatischen
Neuronen ähnlich
dem, welches für
Neurturin selbst beobachtet wurde, förderte. Diese Ergebnisse zeigen,
dass Neurturin-Reste, welche unterhalb der zwei benachbarten hochkonservierten
Cystein-Reste liegen, für
die Wirksamkeit in der Förderung
des Überlebens in
SCG-sympathischen Neuronen kritisch sind. Im Gegensatz dazu sind
die entsprechenden Reste von Persephin nicht ausreichend zur Förderung
des Überlebens
in sympathischen Neuronen.
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Beispiel 17
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die neuronale überlebensfördernde Wirkung von Persephin
in Mittelhirnzellen.
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Das
Profil der überlebensfördernden
Wirkung von Persephin unterscheidet sich von dem von Neurturin und
GDNF. Im Gegensatz zur durch Neurturin und GDNF in sympathischen
und Sensorneuronen gebildeten überlebensfördernden
Wirkung zeigte Persephin keine überlebensfördernde
Wirkung in diesen Geweben. Wir haben weiterhin die neuronale überlebensfördernde
Wirkung von Persephin in Mittelhirnzellen untersucht.
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Getimed-schwangere
Sprague-Dawley-Ratten wurden von Harlan Sprague-Dawley gekauft.
Das Mittelhirn wurde den Ratten entnommen und maß 1,2 bis 1,4 cm in der Länge, wobei
als Zeit der embryonale Tag 14 datiert wurde. Die Schädeldecke
wurde entfernt, und das gesamte Mittelhirn wurde in kalte L15 gegeben. Das
gepoolte Mittelhirngewebe wurde in einem serumfreien Medium, bestehend
aus DME/Hams F12 (#11330–032,
Life Technologies), 1 mg/ml BSA, Fraktion V (A-6793, Sigma Chemical
Co.,), 5 μM
Insulin (I-5500, Sigma), 10 nM Progesteron (P0130, Sigma), 100 μM Putrescin,
(p7505, Sigma), 30 nM Selen (507150, Pflatz & Bauer), 10 ng/ml Ratten-Transferrin
(012–000–050, Jackson
Chrompure), 100 U/M1 Penizillin und 100 U/ml Streptomycin, resuspendiert.
Die gepoolten Mittelhirngewebe wurden ungefähr 80 mal unter Verwendung
einer Pipette mit gebogener Spitze (Bent-Tip) trituriert, und die
Zellen wurden auf eine 24-Well-Platte (Costar) in einer Dichte von
15.000 Zellen in einem 100 μl
Tropfen platiert. Diese Platten wurden mit 125 ng/ml Poly-d-Lysin
(p-7280, Sigma) und 25 ng/ml Laminin (#40232, Collaborative Biomedical
Products) beschichtet. Diese dissoziierten bzw. getrennten Zellen
ließ man
2 Stunden bei 37°C
in 5% CO2 anhaften und fütterte sie anschließend mit
weiteren 500 μl
des obengenannten serumfreien Mediums mit oder ohne ungefähr 100 ng/ml
rekombinantes Persephin. Diese Zellen wurden nach 3 Tagen Kultivierung
fotografiert.
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Die
Inspizierung der Zellen über
den Verlauf von 3 Tagen der Kultivierung zeigte eine graduelle Abnahme
der Zellanzahl. In der Abwesenheit jeglichen Wachstumsfaktors waren
annähernd
alle Zellen tot (4A). In Anwesenheit von Persephin
war ein starker Anstieg des Überlebens
von Mittelhirn-Neuronalzellen ersichtlicht (4B).
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Diese
Studie wurde wiederholt, um Vergleichseffekte gegenüber Mittelhirnzellen
für Persephin
und verwandte Wachstumsfaktoren, Neurturin und GDNF zu erhalten.
Mittelhirngewebe wurde aus E 14 par pps entnommen, gepoolt und 30
Minuten lang in Dispase dissoziiert. Die Zellen wurden anschließend trituriert
und in supplementiertes N2-Medium plattiert und bei einer Dichte
von 20.000 Zellen pro Well in einen 8-Well-Kammer-Slike plattiert.
Die Zellen wurde in einem gegebenen Well entweder unbehandelt oder
mit einem Wachstumsfaktor bei 50 ng/ml innerhalb von vier Tagen
behandelt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd
30 Minuten lang fixiert und mit Tyrosinhydroxylase-Antikörper (TOH)
(Chemicon, ABC-Vectastain kit) behandelt und gezählt. Die TOH-Behandlung diente
als ein Marker für
dopaminerge Zellen, insoweit als TOH ein synthetisches Enzym für Dopamin
darstellt. Die 5 zeigt die mittlere Zellanzahl für unbehandelte
und behandelte Zellen. Persephin (PSP), Neurturin (NTN) und GDNF
förderten
das Überleben
von Mittelhirnneuronalzellen in einem vergleichbaren Ausmaß.
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Beispiel 18
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die Expression von Persephin in verschiedenen
Geweben.
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Eine
Studie zur Persephin-Expression wurde in erwachsenen Mausgeweben
unter Verwendung von semiquantitativer RT/PCR (siehe Beispiel 9)
durchgeführt.
Poly-A-RNA wurde
aus dem Hirn, dem Kleinhirn, der Niere, der Lunge, dem Herz, den
Eierstöcken,
dem Ischiasnerv, den Rückenwirbelganglien,
dem Blut und der Milz isoliert. Diese wurde anschließend unter
Bildung von cDNA revers transkribiert (siehe Kotzbauer et al., Nature
384: 467–470,
1996, welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Die verwendeten PCR-Primer
waren wie folgt: Vorwärts-Primer:
5'-CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC
(SEQ ID NO: 149) und Rückwärts-Primer:
5'-TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA
(SEQ ID NO: 101). Die PCR wurde 26 Zyklen lang mit einer Anneal-Temperatur
von 60°C
durchgeführt.
Um die Anwesenheit von Genom-DNA zu regulieren bzw. kontrollieren,
wurden RNA-Proben, welche nicht revers transkribiert wurden, für die PCR
verwendet (beispielsweise wird die in 22 ge zeigte
Gewebekontrolle "Kidney
no RT" bezeichnet).
Es wurde gefunden, dass sämtliche
der Proben ohne Genom-DNA-Kontamination vorlagen.
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Wie
in 5 gezeigt ist, wurde ein Band der richtigen Größe (160
bp) in der Nierenprobe entdeckt. Bei höheren Zyklenanzahlen wurde
ebenso ein Persephinband in dem Gehirn beobachtet. Folglich unterscheidet sich
die Verteilung der Expression von Persephin in verschiedenen Mausgeweben
von denen von Neurturin in der Ratte (Beispiel 8).
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Hinterlegung des Stamms.
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Der
folgende Stamm wird unter dem Budapester Abkommen bei der American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD hinterlegt.
Das angegebene Aktenzeichen wurde nach erfolgreichem Lebensfähigkeitstest
zugeordnet, und die erforderlichen Gebühren wurden bezahlt. Sämtliche
Begrenzungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit
werden unwiderruflich durch die Erteilung eines Patents auf der
Basis der Anmeldung entfernt. Darüber hinaus werden die bestimmten
Hinterlegungen für
eine Dauer von dreizig (30) Jahren von dem Tag der Hinterlegung
an oder für
fünf (5)
Jahre nach dem letzten Antrag für
die Hinterlegung oder für
die durchsetzbare Zeitdauer des US-Patents beibehalten, je nach dem
was am längsten
ist. Sollte eine Kultur nicht überlebensfähig werden
oder unwiderruflich zerstört
werden oder, im Fall von Plasmid-enthaltenden Stämmen, bei Verlust des Plasmids,
wird sie durch eine lebensfähige Kultur
ersetzt werden. Die hinterlegten Materialien, welche hierin erwähnt sind,
sollen lediglich der Annehmlichkeit dienen und sind für die Praxis
der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die Beschreibung hierin
nicht erforderlich. Zusätzlich
sind diese Materialien hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
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Im
Hinblick auf das Obengenannte wird ersichtlich sein, dass die verschiedenen
Vorteile der Erfindung erzielt werden und andere vorteilhafte Ergebnisse
erreicht werden.
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Sämtliche
in der obengenannten Beschreibung enthaltene und in den angehängten Zeichnungen
gezeigte Gegenstände
sollen lediglich als verdeutlichend und keinesfalls in einer begrenzenden
Weise interpretiert werden.
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