DE69216600T2

DE69216600T2 - Synthetisches CDw52(CAMPATH-1) Peptidantigen

Info

Publication number: DE69216600T2
Application number: DE69216600T
Authority: DE
Inventors: Geoffrey Cambridge Hale; Mashide Cambridge Tone; Meng-Qi Cambridge Xia
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-04-16
Filing date: 1992-04-16
Publication date: 1997-07-03
Anticipated expiration: 2012-04-17
Also published as: DK0580672T3; US5494999A; DE69216600D1; GB9108056D0; ES2100340T3; EP0580672B1; ATE147406T1; GR3023063T3; EP0580672A1; WO1992018530A1; JPH06510521A; JP3329811B2

Description

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Antigen, das zum Test auf einen CDw52-Antikörper, dessen Reinigung oder Induktion verwendet werden kann.
Die CAMPATH-1-Familie monoclonaler Antikörper erkennt ein Antigen, das auf der Mehrzahl der menschlichen Lymphozyten und Monozyten [1-3, "CAMPATH" ist ein eingetragenes Warenzeichen] exprimiert wird. Bei dem vierten Leukozyten-Workshop wurden diese Antikörper provisorisch als CDw52 [4] bezeichnet. Das Antigen ist ein ungewöhnlich gutes Ziel für einen komplementvermittelten Angriff [1,5]. Deshalb wurde der IgM-Antikörper, CAMPATH-1M, vielfach zur Entfernung von T-Lymphozyten aus Spenderknochenmark verwendet, um die Graft-Versus-Host-Erkrankung zu verhindern [6,7].
Das CDw52-Antigen wird in den meisten Fällen einer lymphoiden Malignität exprimiert [8,9]. Die Serotherapie des Lymphoms und der Leukämie mit CAMPATH-1-Antikörpern wurde daher versucht. Das Ratten-IgG2b, CAMPATH-1G, das sowohl die komplementvermittelte als auch die zellvermittelte Abtötung aktiviert, wurde als ziemlich effektiv in dieser Umgebung befunden [9,10]. Jüngst wurde ein menschlicher IgG1-Antikörper (CAMPATH-1H) mit der gleichen Spezifizität gentechnisch konstruiert [11] und dieser konnte für eine längere Zeitspanne verabreicht werden und ergab noch bessere klinische Ergebnisse [12].
Es ist offensichtlich, daß nicht jede Differenzierung oder jedes tumorassoziierte Antigen ein gleich gutes Ziel für die Serotherapie darstellt, und die Gründe, weshalb das CAMPATH-1-Antigen so gut ist, sind noch nicht klar. Dessen reichliche Expression [5] und dessen fehlende Modulation [2] sind wahrscheinlich relevante Faktoren, aber die Kenntnis seiner Struktur würde für die Anwendung nützliche Hinweise ergeben.
Etwa 50% des CAMPATH-1-Antigens konnte aus den peripheren Blutlymphozyten durch Behandlung mit Glykosylphosphatidylinosit (GPI)-spezifische Phospholipase C (aus B. thuringiensis) entfernt werden [3]. Diese zeigt, daß mindestens ein gewisser Teil des Antigens durch GPI verankert ist und möglicherweise der Gesamtteil, da eine ähnlich Teilresistenz mit anderen GPI-verknüpften Antigenen beobachtet wurde [13,14].
Das CAMPATH-1-Antigen kann aus Zellhomogenaten in die wäßrige Phase eines Chloroform:Methanol:Wassersystems extrahiert werden [3] und es kann durch Western-Blotting als breite Bande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 21 bis 28 kD detektiert werden. Die Behandlung mit N-Glykanase verringert das offensichtliche Molekulargewicht auf etwa 6 kD, aber die Antigenität wird nicht vermindert. Das Molekül ist gegenüber der Behandlung mit Proteasen mit enger Spezifität resistent, aber die Behandlung mit Proteasen mit breiter Spezifität verringert dessen offensichtliches Molekulargewicht im wesentlichen, ohne die Antigenität zu beeinflußen. Jedoch ist das Antigen gegenüber einer Behandlung mit mildem Alkali sehr empfindlich [3].
Aus menschlicher Milz mit Chloroform/Methanol extrahiertes Antigen konnte affinitätschromatographisch unter Verwendung der CAMPATH-1-Antikörper weiter gereinigt werden. Dieses gereinigte Antigen wurde nun von den Erfindern als Ausgangsmaterial für Untersuchungen, die zur Charakterisierung der Primärstruktur des Peptidgrundgerüsts des CDw52-Antigens führten, verwendet. Ein synthetisches Peptid mit der Aminosäuresequenz des Peptidgrundgerüsts des CDw52-Antigens oder ein antigenes Fragment davon kann zum Test auf einen CDw52-Antikörper, dessen Reinigung oder Induktion verwendet werden.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der in SEQ ID NO : 1 bis 7 dargestellten Aminosäuresequenz oder ein antigenes Fragment des Peptids. Das antigene Fragment kann 2 bis 6 Aminosäurereste lang sein, beispielsweise 2, 3, 4, 5 oder 6 Aminosäurereste lang sein.
Das Peptid oder ein antigenes Fragment bilden ein synthetisches Antigen. Das Peptid oder Fragment davon können aus einzelnen Aminosäuren und/oder vorgebildeten Peptiden aus zwei oder mehreren Aminosäureresten chemisch synthetisiert werden. Festphasen- oder Lösungsmethoden können verwendet werden.
Das synthetische Antigen kann in einem einfachen und zuverlässigen Assay auf die Konzentration verwendet werden. Viele Assay-Typen können verwendet werden, beispielsweise kann das Antigen an Kunststoff-Mikrotiterplatten gekoppelt werden, und die Bindung des Antikörpers kann unter Verwendung eines Enzym-markierten Antiglobulins bestimmt werden. Ein auf einem synthetischen Antigen basierender Assay kann für Tests auf die Qualitätskontrolle während der Produktion des Antikörpers und auch zur Messung der Gehalte der CAMPATH-1-Antikörper in Patientenseren nützlich sein.
Die Erfindung betrifft daher weiter ein Verfahren zum Test auf einen CDw52-Antikörper in einer Probe, wobei man die Probe mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder Fragment davon in Kontakt bringt und bestimmt, ob der Antikörper an das Peptid oder Fragment davon gebunden hat. Das Verfahren kann zum Nachweis des CDw52-Antikörpers oder zur Bereitstellung einer semiquantitativen oder quantitativen Bestimmung der Menge eines derartigen Antikörpers in einer Probe verwendet werden.
Die Probe kann eine Serumprobe sein. Das Peptid oder Fragment davon kann auf einem festen Träger immobilisiert sein. Die Bindung des CDw52-Antikörpers an das Peptid oder Peptidfragment kann unter Verwendung eines markierten Antiglobulins, wie eines Enzym-markierten Antiglobulins, bestimmt werden. Ein Substrat für das Enzym müßte in diesem Fall zugesetzt werden. Der Assay kann ein gleichzeitiger oder ein Stufenassay sein.
Die Erfindung betrifft weiter ein Testkit, das sich zur Verwendung in einem solchen Assay eignet, umfassend:
(a) ein erfindungsgemäßes Peptid oder Fragment davon und
(b) Mittel zur Bestimmung, ob bei Verwendung der CDw52-Antikörper in einer Probe an das Peptid oder Fragment davon gebunden hat.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines CDw52-Antikörpers aus einem Rohpräparat davon, wobei man das Rohpräparat über einen festen Träger, der ein erfindungsgemäßes Peptid oder Fragment davon trägt, leitet und den CDw52-Antikörper, der an den Träger gebunden hat, eluiert.
Das synthetische Antigen kann daher für die Affinitätsreinigung des CDw52-(CAMPATH-1-)Antikörpers verwendet werden. Beispielsweise kann er an einen festen Träger gekoppelt werden, und Rohantikörperpräparate können darüber geleitet werden. Nur der Antikörper sollte binden, und er könnte durch eine Veränderung der Bedingungen, z.B. eine pH-Wertsverschiebung, eluiert werden.
Das synthetische Antigen kann folglich zur Auswahl von Varianten von CDw52-(CAMPATH-1-)Antikörpern mit höherer Affinität verwendet werden. Zwei komplementäre Typen der Durchführung können in Betracht gezogen werden. Einer von beiden kann unter Verwendung einer beliebigen Anzahl unterschiedlicher Systeme zur Erzeugung großer Anzahlen genetischer Varianten und deren Expression durchgeführt werden. Zuerst kann das neue Assayverfahren mit Fragmenten mit niedriger Affinität unter Bedingungen verwendet werden, unter denen der Stammantikörper eine geringe Bindung ergibt, um Mutanten mit erhöhter Bindungsfähigkeit zu identifizieren. Zweitens könnten die Affinitatssäulen verwendet werden, um direkt Zellen oder Mikroorganismen zu selektionieren, die Antikörpermutanten mit höherer Affinität exprimieren.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines CDw52-Antikörpers bereitgestellt, wobei man ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder Fragment davon immunisiert.
Ferner kann erfindungsgemäß eine immortalisierte Zellinie, die einen monoclonalen CDw52-Antikörper produziert, nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem man ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder Fragment davon immunisiert, Zellen lymphoiden Ursprungs aus dem immunisierten Säugetier mit Zellen einer immortalisierten Zellinie fusioniert und die so immortalisierten Zellen, die den CDw52-Antikörper produzieren, selektioniert. Die selektionierte immortalisierte Zellinie, die den CDw52-Antikörper produziert, wird gezüchtet, um einem monoclonalen CDw52-Antikörper zu erhalten.
Das Peptid oder Fragment davon kann als Konjugat, bei dem das Peptid oder Peptidfragment beispielsweise über eine Seitenkette einer der Aminosäurereste an einen geeigneten Träger gekoppelt ist, verabreicht werden. Das Trägermolekül ist typischerweise ein physiologisch verträglicher Träger. Solche Konjugate sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Herkömmliche Arten können verwendet werden, um Antiseren oder monoclonale Antikörper zu produzieren (Kohler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Hybridomazellen, die den monoclonalen Antikörper produzieren, können durch Fusion von Milzzellen aus einem immunisierter Tier mit einer Tumorzelle hergestellt werden. Das Säugetier, das immunisiert wird, kann eine Ratte oder eine Maus sein. Die Hybridome können in Kultur gezüchtet werden oder intraperitoneal zur Bildung einer Ascites-Flüssigkeit oder in den Blutstrom eines allogenen Wirts oder eines immunologisch verträglichen Wirts injiziert werden. Der menschliche Antikörper kann durch in-vitro-Immunisierung menschlicher Lymphozyten bezüglich des Peptids oder Fragments davon, gefolgt von einer Transformation der Lymphozyten mit dem Epstein-Barr-Virus, hergestellt werden.
Der Antikörper kann dann isoliert werden. Ein pharmazeutisches Präparat kann formuliert werden, das einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und als Wirkstoff den erfindungsgemäß hergestellten CDw52-Antikörper umfaßt.
Antikörpervarianten, beispielsweise mit einer höheren Affinität, können unter Verwendung der in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5728-5732, 1989 und Science, 246, 1275-1281, 1989, beschriebenen Technik hergestellt werden. Die mRNA wird aus einer B-Zellpopulation, beispielsweise Milzzellen oder Lymphknoten aus einem Säugetier, isoliert, das den CDw52-Antikörper produziert. Das Säugetier kann eine Ratte, Maus oder der Mensch sein. cDNA-Expressionsbanken für die schwere und leichte Kette des Immunglobulins werden in den Bakteriophagen-Lambda-Vektoren gebildet. Die Banken werden getrennt abgesucht oder kreuzweise auf die doppelte Expression der schweren und leichten Ketten abgesucht. Nach Infektion eines Wirts, wie E. coli, werden die Lambda- oder herausgeschnittenen Plasmidbanken auf für CDw52 spezifische Antikörpermoleküle abgesucht.
In dem Sequenzprotokoll sind SEQ ID NO : 1 bis 13 aufgeführt, worauf in der Beschreibung und in den Patentansprüche Bezug genommen wird.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung:
In den beigefügten Figuren zeigt Fig. 1 die Restriktionskarte und das Sequenziermuster der CAMPATH-1-cDNA. Die gepunkteten und dunklen Teile der Restriktionskarte zeigen die Signalpeptidsequenz bzw. die proteincodierende Region des CAMPATH-1-Antigens an. Die Lokalisation und die relative Länge der individuellen cDNA-Insertionen sind durch ausgezogene Linien gezeigt. Pfeile zeigen die Richtung und die relative Länge der bestimmten Sequenz. Die ausgefüllten Dreiecke zeigen die Positionen der Nukleotidsubstitutionen in der cDNA-Insertion von pCAM1 an.

BEISPIEL

1. Material und Methoden

Antikörper und Zellen

Die monoclonalen CDw52-Antikörper der Ratte, CAMPATH-1M und CAMPATH- 1G, waren von den Hybridomaclonen YTH66.9 (IgM) und YTH34.5 (IgG2a) abgeleitete Varianten, die ursprünglich durch Fusion der Myelomalinie Y3/Agl.2.3. mit Milzzellen aus einer mit menschlichen T-Lymphozyten immunisierten Ratte hergestellt wurden [1]. CAMPATH-1M ist eine Variante von YTH66.9, die die leichte Y3-Kette verloren hat, und CAMPATH-1G ist eine IgG2b-Switchvariante von YTH34.5, der ebenfalls die leichte Y3-Kette fehlt [16]. Die Antikörper wurden aus Ascites-Flüssigkeit oder einem Kulturüberstand durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat gereinigt. Die K422-Zellinie [15] wurde freundlicherweise von Dr. M.J.S. Dyer zur Verfügung gestellt. Sie wurde in Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium, das mit 5% fötalem Kälberserum supplementiert war, gezüchtet. Menschliches Milzgewebe wurde von Mr. P. Friend (Department of Surgery, University of Cambridge) zur Verfügung gestellt.

Extraktion und Reinigung des CAMPATH-1-Antigens

Das für die Extraktion von Gangliosiden ursprünglich entwickelte Verfahren [17] erwies sich für die anfängliche Reinigung des Antigens als sehr effektiv. Das Verfahren wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Frische oder gefrorene menschliche Milz wurde mit drei Vol. Wasser (das Gewicht des Gewebes in g wurde als ein Vol. in ml genommen) homogenisiert. Das Homogenat wurde unter Rühren zu 11 Vol. Methanol gegeben und dann wurden 5,4 Vol. Chloroform zugesetzt. Nach 30minütigem Rühren wurden das Gemisch durch ein Whatman-113V-Papier filtriert und der Rückstand wurde verworfen. Dann wurden 3,5 Vol. Wasser zugesetzt, das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mindestens 1 Stunde lang stehengelassen, bis sich die zwei Phasen getrennt hatten. Die obere (wäßrige) Phase wurde gewonnen und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 40ºC zur Trockene eingedampft. (Alternativ wurde es als in gleicher Weise zufriedenstellend befunden, das Lösungsmittel aus einem Becher bei Raumtemperatur in einem Abzug im Verlauf von mehreren Tagen abdampfen zu lassen.) Die Rückstände wurden in Wasser resuspendiert und gegen Wasser dialysiert, um Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Dieser konzentrierte Rohmilzextrakt wurde für die Affinitätsreinigung oder andere Analysen verwendet.
CAMPATH-1G (Ratten-IgG2b) wurden an 3 g CNBr-aktivierte Sepharose-4B (Pharmacia) in einer Menge von 5 bis 8 mg Protein pro ml gequollenes Gel gemäß den Angaben des Hersteller gekoppelt. Milzextrakt wurde mit 2% Natriumdesoxycholat in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) solubilisiert, mit mit einem unbedeutendenen Antikörper gekoppelter Sepharose vorgereinigt und dann mit 10 ml CAMPATH-1G-gekoppelter Sepharose durch sanfte Rotation für 2 Stunden bei Raumtemperatur (oder 16 Stunden bei 4ºC) vermischt. Die Sepharose wurde dann in eine Säule gepackt und gründlich mit PBS, die 0,5% Natriumdesoxycholat enthielt, gewaschen und mit 50 mM Diethylenamin pH 11,5, das 0,5% Natriumdesoxycholat enthielt, eluiert. Das Eluat wurde gewonnen, mit HCl neutralisert und gegen PBS und Wasser dialysiert.

Enzym-gekoppelter Assay auf das CAMPATH-1-Antigen

Doppelverdünnungen der Antigenproben wurden in Methanol in Mikrotiterplatten mit flachen Böden (Falcon) durchgeführt, und das Lösungsmittel wurde bei 37ºC abdampfen gelassen. Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit 0,1 ml PBS, die 2% Rinderserumalbumin (BSA), 20% hitzeinaktiviertes normales Kaninchenserum und 0,02% Natriumazid enthielt (Blockierungspuffer), blokkiert. Biotinylierter CAMPATH-1M (50 µm auf 200 µg/ml) wurde zugesetzt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden mit PBS, die 0,05% Tween-20 enthielt, gewaschen und 30 Minuten lang mit 50 µl eines Komplexes aus Streptavidin und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (Amersham) in einer Verdünnung von 1 zu 500 in PBS, die 0,1% BSA enthielt, inkubiert. Die Platten wurden erneut gewaschen und die Farbe wurde mit o-Phenylendiamin entwickelt und bei 495 nm gemessen.

Behandlung der Zellen mit PI-PLC

Etwa 4 × 10&sup6; K422-Zellen wurden 90 Minuten lang bei 37ºC in einem Endvolumen von 150 µl PBS, die 0,1 E/ml B. thuringiensis Phosphatiylinositspezifische Phospholipase C (PI-PLC) (ICN), zusammen mit einem Cocktail von Proteaseinhibitoren enthielt, inkubiert: 0,5 mM ETDA, 50 µg/ml PMSF, 5 µg/ml Pepstatin, 5 µg/ml Leupeptin und 5 µg/ml Antipain. Die Kontrollzellen wurden unter identischen Bedingungen, aber ohne die PI-PLC, inkubiert. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit PBS, die 0,1% BSA und 0,02% Natriumazid enthielt, gewaschen, und anschließend wurde eine Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung einer Vielzahl von monoclonalen Antikörpern, gefolgt von FITCmarkiertem Anti-(Ratte-Ig) durchgeführt [1]. Die Zellen wurden mit Formaldehyd fixiert und mit einem Zytofluorographen (Ortho-Modell 50H) analysiert.

Spaltung von gereinigtem Antigen mit N-Glykanase

Das Peptid: N-Glykosidase-F ("N-Glykanase" von Genzyme) wurde im wesentlichen gemäß den Angaben des Herstellers verwendet, aber ein Cocktail von Protease-Inhibitoren wurden ebenfalls aufgenommen. Proben des gereinigten CAMPATH-1-Antigens wurden zuerst 3 Minuten in 0,5% SDS, enthaltend 0,1 M 2- Mercaptoethanol, zum Sieden erhitzt. Die Spaltung mit N-Glykanase wurde bei 37ºC in 275 µl 0,2 M Natriumphosphat-Puffer pH 8,3, enthaltend 0,17% SDS, 1,25% NP40, 10 mM 1,10-Phenanthrolinhydrat, Inhibitor-Cocktail wie vorstehend und 5 Einheiten/ml N-Glykanase durchgeführt. Die Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bis zur Analyse durch SDS-Gelelektrophorese und Western-Blotting oder ELISA gefroren gehalten.

Behandlung des Antigens mit Alkali

Der Milzextrakt wurde in 0,05 M NaOH bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden zu verschiedenen Zeiten entnommen und durch Zugabe von 4 M Essigsäure neutralisiert und dann mittels SDS-Gelelektrophorese und Western-Blotting oder ELISA analysiert.

SDS-Polvacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotting

Antigenproben wurden auf SDS-Polyacrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli [18] elektrophoretisch untersucht. Ein Reduktionsmittel (2-Mercaptoethanol) wurde immer in den Probenpuffer aufgenommen, obwohl dessen Weglassen keinen Unterschied machte. Das Gel wurde nicht gefärbt, aber sofort für ein Western-Blotting unter Verwendung einer Polyvinylidendifluorid- (PVDF) oder Nylontransfermembran verwendet. Der elektrophoretische Transfer wurde unter Verwendung eines halbtrockenen Blot-Apparats in einem Puffer, der 38 mM Glycin, 48 mM Tris und 4% Methanol enthielt, bei einer Stromstärke von 0,8 mA/cm² für mindestens 1 Stunde durchgeführt. Die Immunfärbung wurde wie folgt durchgeführt. Die Membran wurde zuerst mit Blockierungspuffer für 2 Stunden blockiert. Dann wurde sie in CAMPATH-1G (100 µg/ml in Blockierungspuffer) 30 Minuten lang eingetaucht, mit PBS, enthaltend 0,1% BSA, gewaschen und mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-(Ratte-Ig) für 30 Minuten inkubiert. Sie wurde erneut gewaschen und Enzymsubstrat wurde zugesetzt (100 ml PBS, enthaltend 50 mg Diaminobenzidin, 30 mg Ammoniumnickelsulfat, 30 mg Kobalt(I)-chlorid und 30 µg 30%iges Wasserstoffperoxid). Sobald sich die Farbe entwickelt hatte, wurde die Membran gespült und getrocknet.
Um deglykosyliertes Antigen für die Proteinsequenzierung zu isolieren, wurde das N-Glykanase-behandelte Antigen auf einem 15%igen Gel elektrophoretisch untersucht und, wie vorstehend beschrieben, überführt, ausgenommen, daß drei Membranschichten verwendet wurden. Die dritte Membran (am weitesten entfernt von dem Gel) war Nylon. Dies erlaubte die Detektion von Material, das durch die zwei PVDF-Membranen passiert hatte. Diese Membran wurde immunologisch angefärbt, um die Position des Antigens auf den ersten beiden Schichten zu zeigen, aus denen die geeigneten Regionen herausgeschnitten wurden und zur Sequenzanalyse verwendet wurden.

Protein-Mikrosequenzierung

Die Protein-Sequenzanalyse des auf die PVDF-Membran elektrogeblotteten Antigens und des Affinitäts-gereinigten Materials wurde unter Verwendung eines Applied-Systems-Modell 477A gepulsten Flüssig-Protein-Sequenators durchgeführt.
Affinitäts-gereinigtes Antigen (etwa 80 pmol, gefriergetrocknet) wurde in 15 µl Trifluoressigsäure erneut aufgelöst und auf ein mit Biobrene beschichtetes Glasfaserfilter, das gemäß den Angaben des Herstellers präzykliert worden war, aufgebracht. Streifen aus nicht angefärbter PVDF-Membran, die gebundenes Antigen trugen, wurden mit der Klinge eines Skalpells "faserförmig aufgeschnitten" und als einzelne Schicht in die Reaktionskartusche des Sequenators auf die präzyklierte Biobrene-Glasfaserscheibe gegeben. Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung von modifizierten NORMAL-1-Zyklen durchgeführt, wobei die Spaltungszeit auf einen Standardwert von 500 s erhöht wurde. Die Identifikation der Phenylthiohydantoin-(PTH)-Aminosäuren erfolgte über einen On-Line Modell 120A PTH-Aminosäureanalysator.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde gemäß dem MOPAC-Verfahren (durch gemischte Oligonukleotide geprimte Amplifikation der DNA) [19] durchgeführt.
Gemischte Oligonukleotid-Primer zur Amplifikation der cDNA wurden in einem automatisierten DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems Modell 381A) gemäß der bestimmten Aminosäuresequenz durchgeführt. Primer A, (SEQ ID NO: 8) GG(GATC)CA(AG)AA(TC)GA(TC)AC, beruhte auf der N-terminalen Aminosäuresequenz GQNDT. Primer B1, (SEQ ID NO: 9) GA(TC)AC(GATC)TC(GATC)CA(AG)AC und Primer B2 (SEQ ID NO: 10) GA(TC)AC(GATC)AG(TC)CA(AG)AC beruhten auf den Resten 4 bis 8 (DTSQT). Vier Ser-Codons (TCG, TCA, TCT, TCC) und zwei Ser-Codons (AGT, AGC) wurden verwendet, um die Primer B1 bzw. B2 zu entwickeln. Jeder dieser Primer wurde seinerseits zusammen mit einem Oligo(dT)-Primer (SEQ ID NO: 11) GACTCGAGTCGACAGCTGCAG(T)&sub1;&sub7;, der Xhoi- SalI-, PvuII- und PstI-Restriktionsspaltstellen enthielt, verwendet.
Die Gesamt-RNA aus der menschlichen B-Zellinie K422 wurde 3 Minuten lang auf 65ºC erhitzt und die cDNA des ersten Stranges wurde unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers synthetisiert. Die Reaktion enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 µl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 1 mM DTT, 15 mM MgCl&sub2;, 1 mM jedes dNTPs, 400 ng Oligo(dT), 20 µg Gesamt-RNA aus den K422-Zellen, 5 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor RNasin und 40 Einheiten reverse Transkriptase. Dieses Gemisch wurden 2 Stunden lang bei 42ºC inkubiert, und dann wurde der mRNA:cDNA-Doppelstrang durch Ethanolfällung gewonnen.
Die cDNA des ersten Strangs wurde mit der PCR unter Verwendung des Primers A und des Oligo(dT)-Primers in einem Reaktionsvolumen von 100 µl, enthaltend 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine, 0,2 mM jedes dNTPS, 100 pmol Primer A, 120 pmol Oligo(dT)-Primer und die gesamte cDNA des ersten Strangs, amplifiziert. Nach zweiminütigen Erhitzen auf 95ºC wurden 8 Einheiten Taq-Polymerase (Koch Light) zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 Runden Temperaturzyklen unterworfen. Jeder Zyklus war 30 Sekunden bei 95ºC, 30 Sekunden bei 37ºC und 1 Minute bei 72ºC. Schließlich wurde das Gemisch 10 Minuten lang bei 50ºC inkubiert. Das amplifizierte PCR- Produkt wurden von den Primern mit QIAGEN-Tip abgetrennt und unter Verwendung des Oligo(dT)-Primers mit entweder Primer B1 oder B2 reamplifiziert. Die Hälfte des PCR-Produkts wurde jedem Reaktionsgemisch in einem Endvolumen von 100 µl unter ähnlichen Bedingungen wie vorstehend zugesetzt, aber nur 50 µl jedes Reaktionsgemisches wurden den Temperaturzyklen unterworfen, und der Rest wurde als Kontrolle verwendet. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mit einer 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert.

cDNA-Clonierung und Nukleotidseguenzierung

Das 350-bp-DNA-Fragment, das durch die PCR durch die Verwendung von Primer A und Oligo(dT)-Primer amplifiziert wurde, wurde aus einem 2%igen Agarosegel isoliert und mit dem Klenow-Fragment repariert. Nach der Reinigung wurde das DNA-Fragment mit XhoI gespalten (der Oligo(dT)-Primer hatte eine XhoI-Spaltstelle) und in die HincII-XhoI-Spaltstelle von PHSG397 [20] eingeschleust. Ein positiver Clon wurde erhalten und als pCAM-PCRA bezeichnet.
Eine cDNA-Bank wurde unter Verwendung des Lambda-gt10-Clonierungsvektors und der Poly(A)&spplus;-RNA aus K422-Zellen konstruiert. Etwa 8 × 10&sup4; unabhängige Plaques wurden unter Verwendung des ³²P-markierten 350-bp-HindIII- XhoI-Fragments aus pCAM-PCRA abgesucht. Die Hybridisierung wurde 40 Stunden lang bei 42ºC in einer Lösung, die 50% Formamid, 0,9 M NaCl, 50 mM Natriumphosphat pH 7,4, 5 mM EDTA, 10× Denhardt's Lösung, 0,1% SDS und 100 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthielt, durchgeführt. Die Filter wurden mit 1 × SSC bei 65ºC gewaschen. Positive Plaques wurden unter ähnlichen Bedingungen gereinigt.
Phagen-DNAS mit positiven Clonen wurden mit EcoRI gespalten und die cDNA-Insertionen wurden in die EcoRI-Spaltstellen des Plasmidvektors PUC18 subcloniert. Die Nukleotidsequenzen wurden nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von PUC18, PHSG396[20] und/oder Ml3mp18 bestimmt. Deletionsmutanten von pCAM1 und pCAM2 wurden nach Exonuklease-III-Verfahren [21] konstruiert und EcoRI-RsaI, RsaI-PvuII-, PvuII-EcoRI- und PvuII-Fragmente wurden in den Plasmidvektor PHSG396 zur Nukleotidsequenzierung subcloniert.

Reinigung der RNA und Northern-Blot-Analyse

Gesamt-RNA wurde als K422-Zellen nach Guanidinium-Chlorid-Verfahren isoliert [22]. Poly(A)-RNA wurde affinitätschromatographisch auf Poly(U)-Sepharose gereinigt. Für das Northern-Blotting wurden 10 µg Gesamt-RNA und 0,5 µg Poly(A)&supmin; elektrophoretisch über ein 1,5%iges Agarose-/Formamidgel untersucht und auf eine Nylonmembran überführt. Der RNA-Filter wurde mit ³²p- markierter CAMPATH-1-Antigen-cDNA (pCAM2) hybridisiert und mit 0,5 × SSC/0,1% SDS bei 65ºC gewaschen.

2. Ergebnisse

Reinigung des CAMPATH-1-Antigens und Untersuchungen zur Natur dessen antigenen Epitops

In einem typischen Versuch wurde das CAMPATH-1-Antigen aus einer einzelnen menschlichen Milz (Masse etwa 210 g) extrahiert und in drei Passagen über eine Affinitätssäule, die aus 10 ml CAMPATH-1G-gekoppelter Sepharose bestand, gereinigt. Die Gesamtausbeute des Antigens, abgeschätzt durch die Hemmung eines ELISA-Assays [23], betrug etwa 40 nmol, was mit der erwarteten Ausbeute von etwa 100 nmol vergleichbar ist, wobei angenommen wird, daß es etwa 5 × 10&sup5; Antigenmoleküle pro Zelle [5] gibt und etwa 5 × 10&sup8; Lymphozyten pro g gibt.
Die Hitzestabilität des gereinigten Antigens wurde durch Erhitzen der Proben, ihre Auflösung in Wasser bei 100ºC für 20 Minuten oder ihr Autoklavieren bei 121ºC für 15 Minuten, gefolgt von einem raschen Abkühlen auf Eis, getestet. Keine der Behandlungen beeinträchtigte die durch den ELISA-Assay nachgewiesene Antigenität. Allenfalls war der Titer des hitzebehandelten Antigens, verglichen mit einer nicht behandelten Kontrolle, erhöht.
Proben des affinitätsgereinigten CAMPATH-1-Antigens aus der Milz wurden bis zu 20 Stunden mit N-Glykanase gespalten und durch SDS-Gelelektrophorese und Immun-Blotting analysiert. Eine breite Bande bei etwa 21 bis 28 kD in der nicht behandelten Probe wurde bald in eine viel kleinere, aber immer noch offensichtlich heterogene Bande von etwa 6 kD ohne Auftreten wesentlichen Mengen einer Zwischenspezies umgewandelt. Dieses Ergebnis legt nahe, daß nur eine N-Glykanase-empfindliche Glykosylierungsstelle vorhanden ist, obwohl es möglich ist, daß es zwei oder mehrere Stellen gibt, die eine wesentliche Kooperativität mit der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung zeigen.
In einem Parallelversuch wurden Proben des CAMPATH-1-Antigens mit 50 mM NaOH für bis zu 26 Stunden behandelt und auf gleiche Weise analysiert. Diesmal ging die antigene Aktivität mit der Zeit verloren und keine kleineren Fragment konnten durch Immun-Blotting nachgewiesen werden. Das gleiche Ergebnis wurde erhalten, als 2 M Natriumborhydrid in den Inkubationsansatz während der Inkubation aufgenommen wurden. Diese Ergebnisse könnten erklärt werden, wenn das antigene Epitop Teil eines O-verknüpften Oligosaccharids ist, das durch diese Assays nicht nachgewiesen wird, selbst wenn es bei der alkalischen Spaltreaktion durch die Anwesenheit von Borhydrid geschützt ist. Jedoch können andere Alkali-labile Strukturen nicht ausgeschlossen werden.

CAMPATH-1-Antigen aus K422-Zellen: Vergleich mit dem Antigen aus Milzzellen und Empfindlichkeit gegenüber PI-PLC

Es wurde gefunden, daß die Zellinie K422, die aus einem Patienten mit einem Non-Hodgkin-Lymphom etabliert wurde, wesentliche Mengen des CAMPATH-1-Antigens exprimiert [15]. Dies machte sie potentiell für viele Experimente nützlich, einschließlich der Konstruktion einer cDNA-Bank. Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um zu prüfen, ob das Antigen dem, das durch normale Lymphozyten exprimiert wurde, ähnlich war.
Das CAMPATH-1-Antigen wurde aus etwa 2 × 10&sup8; K422-Zellen mit Chloroform/Methanol extrahiert. Die Ausbeute war mit der aus normalen Lymphozyten vergleichbar. Proben der Extrakte wurden bei Analyse mit SDS-Gelelektrophorese und Immun-Blotting als ähnlich befunden.
Es wurde vorher gezeigt, daß das CAMPATH-1-Antigen an peripheren Blutlymphozyten durch PI-PLC [3] teilgespalten werden kann. Ein ähnlicher Versuch wurde nun unter Verwendung von K422-Zellen durchgeführt und Extravorkehrungen wurden getroffen, um mögliche Artefakte infolge von Proteaseverunreinigungen der PIPLC zu vermeiden. Die K422-Zellen wurden mit dem Enzym oder mit Puffer alleine in Gegenwart eines Cocktails aus Protease-Inhibitoren behandelt, und dann durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von CAMPATH-1-, CD45- oder CD59-Antikörpern analysiert. Das CD45-Antigen wurde als negative Kontrolle gewählt, weil bekannt ist, daß es einen herkömmlichen Proteinanker besitzt, und das CD45R-Epitop besonders empfindlich gegenüber einer proteolytischen Spaltung ist [24]. Das CD59-Antigen wurde als positive Kontrolle gewählt, weil es ein bekanntes GPI-verankertes Protein ist [25] und es auf K422-Zellen exprimiert wird.
Es wurde gefunden, daß die Bindung von CAMPATH-1- und CD59-Antikörpern jeweils signifikant, obwohl nicht vollständig, verringert wurde, während die Bindung der CD45- und CD45R-Antikörper nicht beeinflußt wurde oder sogar leicht erhöht wurde. Dieses Ergebnis impliziert, daß mindestens ein Teil des CAMPATH-1-Antigens (und möglicherweise der Gesamtteil) in K422-Zellen GPI- verankert ist.

Proteinsequenz des CAMPATH-1-Glykoproteins

Aus dem affinitätsgereinigten CAMPATH-1-Antigen wurde die folgende N-terminale Sequenz erhalten:
Gly-Gln-?-Asp-Thr-Ser-Gln-Thr-Ser-Ser-Pro (SEQ ID NO: 12). Entsprechende Ergebnisse wurden aus mehreren Sequenzierläufen erhalten, aber in keinem Fall wurden irgendwelche anderen Aminosäuren nach dem Pro-11 nachgewiesen, obwohl bis zu 20 Abbauzyklen durchgeführt wurden. Die Menge des N-terminalen Glycins (55 pmol) entsprach der Menge des zur Sequenzierung verwendeten Antigens (80 pmol), abgeschätzt durch die Hemmung in einem ELISA-Assay. Die Alkylierung des reduzierten CAMPATH-1-Antigens mit Iodessigsäure ergab kein PTH-CmCys-Signal in Zyklus 3, so daß es unwahrscheinlich war, daß der Rest 3 ein Cystein ist.
Um zu bestimmen, ob der dritte Rest eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle ist, wurde eine Probe von affinitätsgereinigtem CAMPATH-1-Antigen 22 Stunden mit N-Glykanase behandelt, durch SDS-Gelelektrophorese getrennt, auf eine PVDF-Membran überführt und durch Immunfärbung einer doppelten Membran lokalisiert. Das offensichtliche Molekulargewicht wurde wesentlich von 21 bis 28 kD auf etwa 6 kD verringert. Fünf Edman-Abbauzyklen wurden auf der Membran, die das deglykosylierte Antigen enthielt, durchgeführt, und die gleiche Sequenz wurde gefunden, ausgenommen, daß der dritte Rest Asp war. Eine N-Glykanasebehandlung hydrolysierte die N-glykosidische Bindung zwischen Asn und N-Acetylgluosamin zu Asp, so daß angenommen wird, daß die Reste 3 bis 5 Asn-Asp-Thr sind, die eine N-Glyklosylierungsstelle bilden.
In dieser Stufe konnte man nicht sicher sein, welche Sequenz nach Pro-11 vorhanden ist. Ergebnisse aus dem Edman-Abbau legten stark nahe, daß das Ende des Peptids erreicht war, da die Hintergrundspiegel an Aminosäuren niedrig blieben und kein neuer N-Terminus durch Bromcyanbehandlung erhalten werden konnte.

Amplifikation der cDNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion

Weil drei Ser-Reste in den 11 Aminosäuren der N-terminalen Sequenz vorhanden sind und jeder einem von sechs DNA-Codons entsprechen kann, sind Oligonukleotide, die entsprechend dieser Information gebildet werden, sehr degeneriert und schlechte Sonden für ein cDNA-Screening. Die beste Region der Sequenz war von Rest 1 bis 5 (GQNDT), entsprechend der ein 32fach degeneriertes 14-meres (Primer A) erzeugt wurde. Ein Versuch zur Isolierung der cDNA- Clone unter Verwendung dieses als eine Hybridisierungssonde war nicht erfolgreich, so daß eine andere Variante durchgeführt wurde, wobei die Polymerase- Kettenreaktion zur Amplifikation der gewünschten cDNA verwendet wurde. Da ein spezifischer Primer nur für ein Ende der Sequenz verfügbar war, mußte ein Oligo(dT)-Primer an 3'-Ende verwendet werden. Um die Chancen der Amplifikation unwichtiger Sequenzen zu minimieren, wurde eine zweite Amplifikationsrunde unter Verwendung anderer 5'-Primer, basierend auf den Resten 4 bis 8 (DTSQT), eingeführt. Vier Ser-Codons wurden in Primer B1 und zwei in Primer B2 verwendet, so daß sie aus 64 bzw. 32 verschiedenen 14-meren bestanden.
Die Gesamt-RNA aus K422-Zellen wurde als Matrize für die Synthese der cDNA des ersten Stranges verwendet, die für die anschließende Polymerase- Kettenreaktion verwendet wurde. Vier Hauptbanden (510 bp, 470 bp, 440 bp, 350 bp) wurden auf einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese nach der ersten PCR-Amplifikation (Primer A und Oligo(dT)) beobachtet. Die Primer wurden entfernt und das PCR-Produkt wurde wieder unter Verwendung von Oligo(dT) mit entweder Primer B1 oder Primer B2 amplifiziert. Die so erhaltenen Produkte unterschieden sich von den Produkten der ersten Reaktion nur in der kleinsten Bande (350 bp), die in dem amplifizierten Produkt von Primer B2, aber nicht in dem von B1 vorhanden war. Es wurde gefolgert, daß die anderen drei Banden durch nicht-spezifisches Priming hervorgerufene Artefakte sein könnten, aber daß das 250-bp-PCR-Produkt die authentische cDNA sein könnte, da Primer mit einzigartiger Sequenz für das CAMPATH-1-Antigen in den Primer A und in entweder Primer B1 oder B2 (aber nicht in beide) aufgenommen wurden.
Das mit den Primern A und Oligo(dT) amplifizierte 350-bp-Fragment wurde aus dem Agarosegel isoliert und in den pHSG397-Clonierungsvektor cloniert. Die Nukleotidsequenz des insertierten Fragments des positiven Clons pCAMPCRA wurde von beiden Enden teilweise bestimmt. Die abgeleiteten sechs Aminosäurereste stromabwärts der Primer-A-Bindungsstelle entsprechen exakt den Proteinsequenzdaten. Dieses Fragment wurde dann als Hybridisierungssonde verwendet, um die Clone aus einer K422-cDNA-Bank zu isolieren.

Isolieren der cDNA-Clone und Sequenzanalyse

Eine aus der K422-Zellinie konstruierte cDNA-Bank wurde mit einem ³²P-markierten 350-bp-Fragment aus pCAM-PCRA abgesucht. Sechs positive Clone wurden isoliert und diese Insertionen wurden in die EcoRI-Spaltstellen von pUC18 und M13mp18 subcloniert. Die Nukleotidsequenzen der Clone wurden von beiden Enden teilweise bestimmt. Ihre Längen und die gesamte Sequenzierstrategie sind in Figur 1 gezeigt.
Die vollständigen Nukleotidsequenzen der cDNA-Insertion von pCAM1 und pCAM2 wurden bestimmt und es wurde gefunden, daß ihre Längen 443 bp bzw. 433 bp betrugen. Die cDNA hybridisierte an ein RNA-Molekül von etwa 580 bp in der Northern-Blot-Analyse. So macht die gesamte cDNA-Sequenz etwa 76% der RNA in voller Länge aus.
Die Nukleotidsequenz der cDNA-Insertion von pCAM2 ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt. Ein Polyadenylierungssignal AATAAA ist an der Nukleotidposition 417 bis 422 lokalisiert. Zwei lange offene Leseraster können an den Nukleotidpositionen 1 bis 221 und 1 bis 216 beobachtet werden. Das N-terminale Gly befindet sich im zweiten dieser Leseraster mit Met-Resten an den Positionen 24 und 9 Reste davor. Das erste Met ist eine plausible Initiationsstelle, und so besteht das durch die erfindungsgemäßen cDNA-Clone codierte CAMPATH-1-Antigen aus 37 Aminosäureresten mit einer wahrscheinlichen Leader-Sequenz von 24 Aminosäureresten. Diese Leader-Sequenz besteht aus typischen hydrophoben Aminosäuren und endet an einer plausiblen Spaltstelle.
Das 37 Reste lange Peptid, das am N-terminalen Gly beginnt, besteht aus einem 20 Reste langen hydrophilen Abschnitt, gefolgt von einem 17 Reste langen hydrophoben Abschnitt. Zwei potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (NDT und NIS) finden sich in dem hydrophilen Abschnitt, sowie 9 Seroder Thr-Reste, die 0-verknüpfte Glykosylierungsstellen sein könnten. Der C- terminale Abschnitt umfaßt hydrophobe Reste mit einer starken Neigung zur Bildung einer Alpha-Helix und ist den die Membran durchspannenden Domänen ähnlich, die vom C-Terminus der GPI-verankerten Proteine abgespalten werden.
Zwei Nukleotidsubstitutionen fanden sich zwischen pCAM1 und pCAM2 zwischen den Positionen 151 bis 156, an denen pCAM1 die Sequenz AGCATG, die Ser-Met codiert, besitzt, wohingegen pCAM2 AACATA besitzt, was Asn-Ile codiert. Einer der cDNA-Clone (pCAM7) war am 5'-Ende verkürzt, so daß ihm ein Teil der Sequenz fehlte, aber die drei anderen Clone (pCAM5, pCAM6 und pCAM11) und der aus dem PCR-Produkt erhaltene Clon (pCAM-PCRA) entsprachen alle pCAM2. Diese Substitutionen könnten ein Clonierungsartefakt sein, aber sofern dies nicht der Fall ist, könnte die von pCAM1 codierte Proteinvariante eine gewisse Signifikanz besitzen, da die betroffene Region eine potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstelle ist und auch sehr nahe zu der wahrscheinlichen Bindungsstelle des GPI-Ankers liegt.
Es wurden keine anderen DNA- oder Proteinsequenzen mit einer signifikanten Homologie zu pCAM2 oder der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz des CAMPATH-1-Antigens gefunden. Gegenwärtige Versionen von EMBL-, GENBANK- und NBRL-DNA-Datenbanken und der Doolittle-, PIR- Pseqip- und Swiss-Prot-Proteindatenbanken wurden im Januar 1991 unter Verwendung des FASTA-Analysenprogramms abgesucht [26].

Literaturstellen

1. Hale, G., Bright, S., Chumbley, G., Hoang, T., Metcalf, D., Munro, A.J., Waldmann, H., Biood 1983. 62, 873.
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26. Pearson, W.R., & Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. 85, 2444.

SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 12
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKULS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 13
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKULS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 14
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 4

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 15
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 5

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 16
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 6

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 17
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKULS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 7

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 18
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Synthetisches Peptid
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 8

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 14 Basen
b) ART: Nukleotid
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 9

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 14 Basen
b) ART: Nukleotid
(ii) ART DES MOLEKULS: cDNA
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 10

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 14 Basen
b) ART: Nukleotid
(ii) ART DES MOLEKULS: cDNA
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:10

SEQ ID NO: 11

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 38 Basen
b) ART: Nukleotid
(ii) ART DES MOLEKULS: cDNA
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 12

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 11 Reste
b) ART: Aminosäure
(ii) ART DES MOLEKULS: Peptid
(iii) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 13

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
a) LÄNGE: 433 Basen und 61 Reste
b) ART: Nukleotid mit abgeleiteter Aminosäuresequenz von der CAMPATH-1-Antigen-cDNA
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) MERKMALE
von Rest 1 bis 11 N-terminale Proteinsequenz bestimmt durch Edman-Abbau
152 bis 156 Basen Position der Nukleotidsubstitution in dem Clon pCAM1 (A bis G)
von Basen 417 bis 422 3 Reste Polyadenylierungssignal (Asn-3) N-Glykosylierungsstelle
16 Reste (Asn-16) mögliche Glykosylierungsstelle
Reste 12, 14, 15, 18 (Ser-12, Ser-14, Ser-15 und Ser-18 mögliche Glykosylierungsstellen
von Rest 12 bis 15 (Ser-12 bis Ser-15) wahrscheinliche Stelle für die Bindung des GPI-Ankers
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13

Claims

1. Peptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der folgenden:

oder ein antigenes Fragment eines solchen Peptids.

2. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Fragments davon wie in Anspruch 1 definiert, wobei man das Peptid oder Fragment chemisch synthetisiert.

3. Verfahren zum Test auf einen CDw5 2-Antikörper in einer Probe, wobei man die Probe mit einem Peptid oder Fragment davon, wie in Anspruch 1 definiert, in Kontakt bringt und bestimmt, ob der Antikörper an das Peptid oder Fragment davon gebunden hat.

4. Testkit, umfassend:

(a) ein Peptid oder Fragment davon wie in Anspruch 1 definiert und

(b) Mittel zur Bestimmung, ob bei Verwendung ein CDw52-Antikörper in einer Probe an das Peptid oder Fragment davon gebunden hat.

5. Kit nach Anspruch 4, wobei (b) ein markiertes Antiglobulin ist.

6. Verfahren zur Reinigung eines CDw52-Antikörpers aus einem Rohpräparat davon, wobei man das Rohpräparat über einen festen Träger, der ein Peptid oder Fragment davon, wie in Anspruch 1 definiert, trägt, leitet und den CDw52- Antikörper, der an den Träger gebunden hat, eluiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines CDw52-Antikörpers, wobei man ein Säugetier mit einem Peptid oder Fragment, wie in Anspruch 1 definiert, immunisiert.

8. Verfahren zur Herstellung einer immortalisierten Zellinie, die einen monodonalen CDw52-Antikörper produziert, wobei man ein Säugetier mit einem Peptid oder Fragment, wie in Anspruch 1 definiert, immunisiert, Zellen lymphoiden Ursprungs aus dem immunisierten Säugetier mit Zellen einer immortalisierten Zellinie fusioniert und die so immortalisierten Zellen, die den CDw52-Antikörper produzieren, selektiert.

9. Verfahren zur Herstellung eines monodonalen CDw52- Antikörpers, wobei man ausgewählte immortalisierte Zellen, die den CDw52-Antikörper produzieren und die nach einem Verfahren nach Anspruch 8 hergestellt wurden, züchtet.

10. Pharmazeutisches Präparat, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und als Wirkstoff einen CDw52-Antikörper, der nach einem Verfahren nach Anspruch 7 oder 9 hergestellt worden ist.

11. Konjugat, umfassend ein Peptid oder Fragment wie in Anspruch 1 definiert, in Kopplung an einen physiologisch verträglichen Träger.