UA72172C2

UA72172C2 - Послідовність нуклеїнової кислоти, що має дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазну активність, спосіб одержання білка, спосіб відновлення стеринів, ненасичених в положенні с-7, спосіб одержання прегненолону, трансформований штам saccaromyces cerevisiae, що накопичує вільний та етерифікований прегненолон та спосіб виявлення недостатності дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктази

Info

Publication number: UA72172C2
Application number: UA96020528A
Authority: UA
Inventors: Ксав'є Шенівес; Катрін Дюпор; Ерік Лікен; Дені Помпон
Original assignee: Abентіс Фарма С.А.
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 2005-02-15
Also published as: EP0727489A1; HUP9600325A3; CN1664107A; BRPI9600729B8; DK0727489T3; PT727489E; PL312828A1; US5965417A; EP0727489B1; RU2242517C2; AR053931A2; HU220587B1; BRPI9600729A; HUP9600325A1; JPH08289793A; IL162477A0; AR003407A1; BRPI9600729B1; US5759801A; CZ43296A3

Abstract

Послідовність ДНК, що кодує білок, що має дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазну активність, білок, що має дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазну активність, виділений з Аrаbіdорsіs thaliana, а також спосіб одержання зазначеної послідовності ДНК і білка. Описано різні способи відновлення стеринів, ненасичених у положенні З-7, способи одержання прегненолону, трансформований дріжджовий штам Saccaromyces cerevisiae, що накопичує вільний і етерифікований прегненолон, а також спосіб виявлення недостатності дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктази.

Description

Последовательность ДНК, кодирующая белок А. талиань), обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, белок дельта-7 Ред, способ их получения, трансформированнье дрожжевье штаммьї, видьї их применения.

Настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белок А. талиань,, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, белок дельта-7 Ред, к способу их получения, к трансформированньім дрожжевьм штаммам и к видам их применения.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза (Е.С.1.3.1.21) представляет собой микросомальньй фермент, присутствие которого бьіло обнаружено благодаря его действию в гомогенатах печени крьсь (М. Е. бОетрзеу с соавторами, Меїйоах Епгутої., 15, 501-.514, 1969г.), а также в препаратах растений 7єа тауз (М. Таюп с соавторами, Віоспет. Віорпу5. Ке5. Согатип., 181, 465-473, 1991г.). Указанная редуктаза зависима от НАДФН и обеспечиваєт іп мїго восстановление 7-дигидрохолестерина в холестерин.

Стериньї являются основньми компонентами мембран у зукариотов, однако, в зависимости от вида, они имеют различную структуру. В клетках зукариотов, таких как дрожжи, основньм Істерином является зргостерин, которьій содержит двойную ненасььщщенную связь в положений С-5 и С-7, разветвленную боковую цепь в положениий 0-24 и ненасьщенную связь в положениий С-22, в то время как у млекопитающих холестерин отличаєтся ненасьщщенной связью в положениий С-5 и насьщенной боковой цепью. Ситостерин, стигмастерин и кампестерин, которне представляют собой найболее распространенньсе у растений стеринь,, обладают разветвленной, но насьщенной боковой цепью и, так же как и стеринь! позвоночньїх, не имеют ненасьшщенной связи в положений С-7. Ферментом, вьізьівающим указанное различие структурь! стеринового ядра, является дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза никогда не очищалась до состояния гомогенности, и в специальной литературе встречается лишь описание частичной очистки (указаннье вьіше М. Е. Оетрзеу с соавторами, М, Тайоп с соавторами). При зтом белок не рассматривался с точки зрения его физико- химических свойств. Никакой информации относительно последовательности белка не приводилось, так же как не встречается описаний каких бьі то ни бьло антител к нему. Кроме того, очевидная нехватка 7- дегидрохолестеринредуктазь у человека бьіла описана в связи с синдромом ЕЗН/Смита-Лемли-Опитца (51 0) (9. М. Орії» с соавторами, Ат. 9. Мед. Сепеї., 50, 326-338, 1994г.).

Таким образом, клонирование кКДНК, кодирующей дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу, которое может позволить идентифицировать соответствующую последовательность белка, а также характеризовать ген человека или вьіявить их врожденную недостаточность, не может производиться обьічньми методами, использующими, например, методь! гибридизации и/или иммунологического обнаружения. Позтому особенно важное значение имеет поиск новьїх методов скрининга, позволяющих вьіполнять клонирование, в частности, при отсутствиий информации о белке.

Зргостерин, являющийся основньім стерином грибковьїх мембран, включаєт пару двойньїх сопряженньх связей в положений С-5,7, благодаря чему соединения из семейства полиенов, такие как нистатин, обладают антимикотичньмм действием (К. Війтап с соавторами, у). Віої. Спет., 260, 2884-2889, 1985г.). Сильная зависимость действия нистатина на мембранную концентрацию ненасьіщенньх стеринов в положенийи С-5,7 позволила отобрать в 5 сегемізіає мутантнье штаммьї относительно накопленньїх стеринов (5.М/, МоіІ2апп с соавторами, У. Сбеп. Місгобріо!., 72, 339-348, 1972г.). Так мутантьй егд2 и егд3 накапливают стеринь, не имеющие двойньїх сопряженньїх связей в положении С-5,7 вследствие недостаточности соответственно стерин дельта-8,7 изомеразь (МУ. А5ПпПтап с соавторами, Гірріа5, 26, 628, 1991г.) и стерин дельта-5 дегидрогеназьі (В. Агпйпіпіоп с соавторами, Сепе, 102, 39, 1991г.). Подобнье мутанть! жизнеспособньї, поскольку зргостерин, являющийся основньім природньім стерином дрожжей, может при некоторьїх условиях бьіть заменен различньіми стеринами-заменителями, включающими холестерин.

Преимущество повьішения устойчивости к нистатину дрожжевьхх штаммов, обогащенньїх стеринами, не имеющими двойной ненасьщенной срязи в положениий С-5,7, бьіло использовано изобретателями для клонирования кДНК, кодирующей гетерологичньй белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, методом скрининга, использующим метаболическую интерференцию в 5.

Сегемізіає. Тем не менее, на успех подобного подхода, преимуществом которого является его независимость от знания последовательностей ДНК или белка, а также от обнаружения, основьівающегося исключительно на ферментативной активности, рассчитьшать нельзя из-за многочисленньїх трудностей технического характера, с которьми он связан.

Первое ограничение вьізвано тем фактом, что действие нистатина не полностью изучено (І. М/. Рагк5 с соавторами, СКС Стйіса! Кеміему5 іп Місгобіоіоду, 301-304, 1978г.). Например, можно предвидеть слабую специфичность нистатинного отбора вследствиє его косвенного характера, что приводит у дрожжей к вниібору геномньїх спонтанньїх мутаций, таких как мутанть! егуд (указанньій вьише 5. МУ. МоІгапп с соавторами), или геномньїх мутаций, ведущих к устойчивости, не зависящей от метаболических путей стеринов. Так же и клетки, трансформированньсєе банком, могут виіражать гетерологичньсе геньї, обеспечивающие устойчивость к нистатину, не зависящую от метаболического пути стеринов.

Другой пример ожидаємого ограничения относится к тому факту, что гетерологичньій белок может иметь слабую активность в клетке, ведущую к отсутствию или ослаблению устойчивости к нистатину, например, по одной из нижеследующих причин: 1) слабая зкспрессия гена, кодирующего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу; 2) слабая активность или полное отсутствиє активности белка вследствие плохой свернутости или вследствиє ошибочной субклеточной адресации; 3) белок растения не признает стериньії дрожжей в качестве субстратов или 4) стеринь, которье могут бьіть субстратами, присутствуют в зтерифицированном виде или скапливаются в пузьірьках и не находятся в контакте с ферментом.

Таким образом, можно предвидеть, что накопленнье таким образом стериньй не подвергаются воздействию дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь, которая, в случає зукариотов, считается локализованной в микросомах.

Настоящее изобретение относится к клонированию кДНК А. талианьі, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, обозначаеємьй как дельта-7 Ред, по методу клонирования, вьіполняемого в дрожжах за счет .метаболической интерференции, основьівающейся на устойчивости к нистатину. Белок дельта-7 Ред обеспечиваєт восстановление стеринов, содержащих ненасьщенную связь в положении 07, методом биологического восстановления, которое, кроме того, используется как удачное решение проблемь! селективного восстановления в положении С-7 стеринов или стероидов, обладающих двойной ненасьщенной связью в положениий (С-5,7, что невозможно при использований методов химического восстановления.

Настоящее изобретение относится также к трансформированньмм клеткам дрожжей, зкспрессирующим дельта-7 Ред, которне удивительньм образом накапливают продуктьї, насьщенньюе в положенийи С-7, и, возможно, насьщенньюе в положении С-22, которье, в отличие от зргостерина, являются субстратами фермента расщепления боковой цепи холестерина, то есть цитохром Ра5об5СО.

Указаннье неожиданнье свойства. позволяют использовать трансформированнье дрожжи, являющиеся предметом настоящего изобретения, в способе получения стеринов или стероидов, представляющем промьшленньій и/или фармакологический интерес, в частности для получения прегненолона путем биологического окисления зндогенньїх стеринов дрожжей, восстановленньхх в положении С-7, с помощью цитохрома Раво5СС (РавоЗСС) в присутствиий адренодоксинредуктазьї (ДОК) и адренодоксина (АХ).

Трансформированнье дрожжи, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут также использоваться в способе получения промежуточньх стероидов пути метаболизации холестерина в гидрокортизон у млекопитающих и прочих позвоночньх. Указанное использование обладаєет тем преимуществом, что оно позволяєт получить гидрокортизон или его промежуточнье продукть! методом биологического окисления, не требующим использования в качестве исходного субстрата зкзогенного стерина, такого как холестерин, что позволяєт обойти проблему проникновения стерина в дрожжи, непроницаемость которьїх для зкзогенньїх стеринов в условиях азробиоза уже описьівалась (ЕК. Т. І огепі с соавторами, У. Васіегіоїоду, 981-985, 1986Гг.).

Настоящее изобретениеє оотносится также Кк использованию нуклеотидньїх последовательностей, полученньхх с применением метода клонирования, являющегося предметом настоящего изобретения.

Последовательность РНК или ДНК, кодирующая дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу, может использоваться при диагностике или лечении заболеваний, связанньїх с продуктом гена дельша-5,7 стерин, дельта-7 редуктазьї, Например, считаеєтся, что нехватка дельта-5,/ стерин, дельта-7 редуктазьі, которая преобразует 7-дегидрохолестерин в холестерин, приводит к синдрому КБЗН/ЗГО. Таким образом, последовательность ДНК человека может использоваться в качестве зонда при диагностике недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь, а также в генной терапии для корректировки указанной недостаточности. Таким образом, предметом настоящего изобретения является последовательность нуклеийновой кислотьї, включающей последовательность, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, причем указанной нуклеийновой кислотой может бьіть ДНК или РНК, и, в первую очередь кКДНК.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазная активность может бьїть обнаружена, например, с помощью ферментативного теста іп міо (в пробирке), описание которого приводится ниже, в зкспериментальной части.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является последовательность кКДНК, в которой кодирующая последовательность кодирует белок А. талианьі, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и обладающая последовательностью нуклеотидов последовательности 5ЕО ІО

Ме1:

ТЧІВГТКК ОТІТАГРТЦЯА ОЗАКАТУРІГ ОААІЦТТАРТЕ ЗДІА БЛАГА КА. я

КУКИ АКА ДІМА АХУ ПК ОАК МИ ТА ХУ Тр ОМ Оу ЖК ОМА т

Кох жк ї2у Урх бкх ско ЦО йо об бяя бро їхй 4 ЕІ т

ІПЖОУ АЕОЖТА тІГОЗг Об ТТ ПК ОА ЗТ ОТ ТАТІ ЩО за йсю ви бат ай бео 854 002 ла веч дит пре Яро оо» хе оз бай. к і-ї

З І ТАЖ аа «тб т ЦКУ ЩА ТАТ ТРУ УВІ БИТИ МАКОМ хе

Ж їх Тр Тра ух Яксо Гог оїкх со ох СМ йо» Зх бю» То бян з5 ЗБ. 35

ТО ТО ЩО ГАК АТ ТА ЯМ да ТА ЩпОАІромку АТ» ОДА «5

Ткч боса жжк о Тро лу Абе їхи Яке Те їлю ЯМІ ХОМ бух Же Ток ро «їх 2 5 5 агАОЩИЩО АНУ ТТ АТ ПИ ЗЛ ОЗАА АТ АТО ЛК ОТО ЇдТ ЇТА лап З лм Мут Тра За ле лох Тра Деу Ях5 Жде Фа Що ЗМф таж Ах ге ща Ко 75

ТАКО ДТ ОЦ ЯР ОЦ Б ДІ Об А» МА І МГ Оу щи Ш З гтЖж ких оз Як сок ЛУ ХЯй дея Про ях Аме ру бик озиж їхе Яке з 5 т

МТА МІ ЩДА ГУД ОТРИ АВ БА ЩО ТТ ТА ДИ ОГО АКОЗІЖ щу ду я йо Щи Про дБ їям Лов Коу йо бах Як дме Мю фотле МУЙ Якк за ром тд

ТК Ота СТУ СТО АЦОО ЦІА Ра М ВАТ МТ ОСТ що поро а й амк їмо ем ми Тро Ямй Асе брх їх ЛЯХ їз» УА То Тех Зам со в ле КУ

ХРО а ВІ ТЦК АТ ТЦ ТР ТАТ ВАХ ОТТО ТРУ гад Дт Я З щу

Хомойею охо Пхє со ххх со Тер бує Уюс 035 лю ху йде зах бяй шк 188 т 1

ТО ОВІВ АТА ЗОІТА А ОЯІЩ ЩА Ж: НТ ОІТЕ я І Тр ока а м

Ян де) Шо» йки Фо сСхроЗКо йхме жюх бко до» два йо ТУ Куб М 155 їз КК їтМ ДАХ 175 тДА ЩУКА ЗЩ М'Я ОО ЦІ ПУ УА ІГР ОА КВ ТЗН їх їх ом жк лро СЕ бер сов АВК бхр 210» сх ВХ їде о Дей

У 1 пе

АТМ тт УА Я АТ ДС ТЯ АМОАМОУОТАМ БУГ ОБОА АТ ОТТО ААК ГУ

Коло Жим одко фом ТЖюК Торо хе Веї Гоу пий їмр Про Арх бла пк дез пе . по з

АКОТ гАЩО КР АД ІТК ОТ АД ЗАТ ОТО АТ ТОРТА АТР ОА ЩЕ 5

Соб жин Асп ля дез Ши бою Тра бно ШО Ази збн обоз Жує Кет ох за т 10о

ТЕ РА ГТ ЦІЇ І» ГО АЦІ ЛАД ОТО АТА АХА ВАГ ОТАТ ОТАК АТА АХ КІ їм» Ах Яго УДО Але оз Тея Тер Яво жна Лиз Гек оТне лу Кке Аве о КУ лу 2

ТО ККА гів КІ АЖ ЩА АТО ДР ГТК ДАЙ ЛШ Ж ВІ АТ ОВО т

То» бкхх йо Св Абе» сор Кит йо Ж Аби Сбоо ре люд МУК Вк 22 ло зх зе

ТАрО сій аАцА КД ОТ ОТТО ОЗ Ол ГАК ТЕ ГТ ОЇКТ З А ОКщОдІТ М

Увр Вл Лоб Якх ос» Жено Три ро Глу Аа лю ТкроТря Ази Трй Я вн везя 2

ТАКИ ОАГТ пИЖ цАтТ гу ЦК ГЦ грХ їТИ ТАТ АТ ФОНІ РК ОЗ ДХ З б Кале Абу тк Ас» Арго Адя ле фом о Тяд ль Цеб Тра лю уки Лю - ке Ма

ТУР ОЯРР УКЕ ад ду І ЖД ОАДУ ЗЕ БА гц и ТА ОВО ОГО М поз й Яко Мох бхе йоз їх бро Соробмм бл» б бхх йно Фах ді з з ко. їм ЦО То гоАО ЦІВ її оц цАГО ТК ЧА АТ ТА АТР ВО гТЕ ОпА Уа тео Май Яка ау Люда Тов Тек бли Лобо бх Яке їбб Мамо обк» Лов о бкк тя зва 55 з и

ТРА АХУ ЩТУ ТО ЖТУ ТАНО ТВ авг ТАТ ГА ТКУ ГАЗО АГА ОЦВА АТО А т їхм йсо Кий ме Мем хи Мсо бохо їки со Зах Ахи Ар оГом Ям ли

З 295 З

ТАГОМЩОаГТ АК ЯКО КАДОГН лах РТ ОТ ІТК ТОРОРРА дов пд Оощг чи їху йде арк Діє Тро дим осо Фюу Ши Яка бом ри ях Арго кв пре зга 325 як

ЖД АКГОАТЕ ТТГ ОП Я ТАТО А м цс РАК ОАДІ амАОКЦ пн сви йно ов обкл доз сви Тмо Та Том Тре борогтм лу фра Лю я мк о ща

ЯГТ ТР ЗА ІТ ЖМРОЩЕ РА ЗК ОЖГЕ ТА ХТО СбрОМТ ДАР МА ДЯ бе

Ти ох Яка дов бре без їйк Лаб ТОх Тке 25 Ах; Аг таб же ги5 за КеЯ З як: гїт ЗКІ АГ ХТО їТ» 5) 27 тр; Та їітОУй ГТа Шк Р У 1-5

Тер 0» бро Її Кке Зоб схил» око же» Тр) ре бос» бук со б

КО ЗЕ З Ук

ТЯ ОА же т ЗУ тА їм СЯ са гр оце лот діт ХВ У їв ок оо ох єю ЦОй хе ер бук їхр бах Яка Тре ЗМ й Я с» ріс ха Ук

ТхТОщА ПО АК ОМА УА ТАТ ТА А ТО) ЗА ТК АТ КОТ ОА и

Мід о Апе аг йхе м ке оз бшх Аро Па йце Со) Лкх Хкроїлк ке

Ал ях Б

ТК ЖІ ОА ВІ ТАЖ ТТ МАМО ГІЦ ЗА МД ОТ ХВ АТ ЦЕ ОА зще

Теб Тра дих й» Тез Зко Тле Яку бл гу Ск; фре Зла Жуя ро хи

КУ я 5

ДТ АТ ТАРТАК: ТААРЧНРІ ЗУ ЯУНАРТЕ ОТАНТТАХІ АВРТТААТІ 15 ко ау

ТАМЩЧІ» ОХУБАТИМККА ГАК О2РХИКААНКУ УЦААЙТТКІ ГВІАСІ зх

ЖТЦУТУУЧІ ТОМА Ж за а также аллельнье варианть! данной последовательности.

Вьішеприведенная последовательность кКДНК, кодирующая белок, состоящий из 430 аминокислот, соответственно последовательности, представленной на рис.3 (ЗЕО ІО Мое2), является последовательностью

КДНК, которую можно получить, например, путем клонирования в дрожжах, на основе банка зкспрессии А.

Іпаїіапа с использованием метода скрининга, основанного на Появлении устойчивости дрожжей к нистатину, с соблюдением условий вьшполнения, подробное описание которьїх приводится ниже. Знание вьішеприведенной последовательности нуклеотидов ЗЕБЕО ІО Ме! позволяет воспроизвести настоящее изобретение обьчньми методами, хорошо известньми специалистам, например, путем вьполнения химического синтеза или скрининга геномного банка или банка кКДНК с помощью синтезированньх олигонуклеотидньїх зондов с использованием методов гибридизаций или амплификации методом РСК (роїутегазе спаїп геасіоп).

Предметом настоящего изобретения также является последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и гибридизирующаяся с последовательностью нуклеотидов 5ЕО ІО Ме! в условиях средней или повьшенной температурь гибридизации, или обладающая с данной последовательностью идентичностью на 60 или более процентов.

Последовательности, гибридизирующиеся поддающимся обнаружению образом в последовательности 5ЕО ІО Меї, гибридизируют в обьічньїх условиях средней температурьї гибридизации, например, при температуре ж42"С, в течение 12ч в 50-процентном растворе формамида, 55СХ6б, с последующей промьївкой, или при менее вьісокой температуре гибридизации, например, при температуре 42"С, в течение 24ч в 20-процентном растворе формамида, 55СХ6 с последующей промьівкой в общеизвестньїх обьічньх условиях (Т, Мапіайі5 с соавторами, МоїІесшіаг сіопіпд, Соїд Зргіпд Нагрог ІГарогаюгу Ргезв5, 1989Г.).

Процент идентичности последовательности нуклеотидов может бьть определен с использованием, например, программь ВІ АБ5Т (Базвзіс Іосаї аїїдптепі зеагсп (сої) (5. Е. Аїївснпиц! с соавторами, -. Мої. Віо!., 215, 403-410, 1990г.) на сервере МСВІ.

Настоящее изобретение относится также к последовательности ДНК, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, амплифицированной методом РСК, с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, кодирующих консенсусную последовательность, обладающую аминокислотной последовательностью 5ЕО ІЮ Ме3:

Лей Лей Хаа Хаа Гли Три Хаа Гли Хаа Хаа Арг Хаа Хаа Хаа Тир 1 5 10 15 в которой Хаа в положении 7 представляєт собой аминокислоту Трп или Тир, а Хаа в положений 12 представляет собой Гис или Лиз. Вьішеуказанная последовательность ЗЕО ІО МеЗ соответствует новой консенсусной последовательности, которая бьіла определена в результате сопоставления аминокислотньх последовательностей между новой последовательностью 5ЕО ІЮО Ме2, вьіведенной из последовательности нуклеотидов ЗЕО ІО Мої, и известньїх последовательностей либо других стеринредуктаз, обладающих специфическим действием в положениий, ином чем положение С-7, либо рецепторов для ламина В, как зто подробно описано ниже, в зкспериментальной части. На основе информации, полученной из аминокислотной последовательности 5ЗЕО ІЮ Ме3 может бьіть определена и синтезирована затравка, состоящая не более чем из 45 нуклеотидов, которая в сочетаниий со второй затравкой олиго-4Т (17 нуклеотидов) в качестве противоположной последовательности позволит, благодаря использованию готового набора РСЕ (например, набора 5ігаїадепе), амплифицировать ДНК, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью.

Настоящее изобретение относится также к белку А. ІШПаїїапа, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и аминокислотной последовательностью 5ЕО ІЮО Ме2:

Мат Ала Глу Тре Шал Тно Сер Про йле Вал Тра Тер ла бер ет Лев х Б 10 35 бер лей дей для Фен Цис Йро Про бен бал йо Лей лей Три кро Тра. " 25 Що

Мет Вал нс бли Ася Гли бер оБбало тре ин обро Фен о Тлх фен обфено Тра зи БІ 45 й п

Тлу Асно бля Взя Блю ли лей о йле фон ле їв Про ре про тро лей

Бо 55 во

Яла Аля Три Лидо йде ле Фен ци Те им ла беноГлу Ала Жде Леб «5. 70 75 80

Гли Лей лей Лей Нр Голи Лиз Арго бВалоблу Гли Про ле боро Про Але що ще

Би» си др Про бля Тир о Ляз ла АН бно лей яв обяз Тир. фан о Ввя о 95 по

Тор. Лей Алз Тов СГно Лей Тля Леб Три ро ви ля ла бен осно Про ов во 25 гАва ре бл Чий сп оно Лей о Гля Глу йла фен бер Айва Лей ле ди 136 З: то

Тли бер Фен яз Фен Цис бал Лей Лей Тно пе Люеюз іїпм о Гцо Зако йла 150 165 769

Про бер Сер бор Абап бр бля Сей Циб бля сно бвй Жив ле Ас Фен 155 то 175

Тир Три бли Веу лу Лей Тир Пру Арго ле Гли Лиз бви Фен о Абе Кл їв 185 159:

Зиз Вади фен брв жен Це де Фан оЄли Мет Мет бер Тра Ана бзя лей 385 200 25 дпа Вхя Тре Тир Цхб Мне Лиз ГаноТио Глу ле Аснобдлк Лихо бля Сер 2 зв 220

Асп обер Нет Лей бай Асе Толя яз Лей Нет Лей Вал ЛТкр За тре Ли

ТОБ 830 835 240 ози Фви Тря Тра Гау Ана Тля Жбкр Тра Абв оре Кеї вв йде Алла ас 245 250 755

Кри о Арго бля ля Фен Тер о йлю Ця о ТапоГли Цко Лей дало Хра бзло Про 260 І 255 975

Сер Вал. тир о Тре бер Про Гля Маг Тир Лей бал Абя Ти Про Ввлоїлу. . 275 2 285

Лей Рлио Тре Бпи Лей Але ле Тиб Кле лей бал оаАла лю ле лЛвй Цко 80 255 зба

Яле Тир Мле Лиз Ткр Аспо Це дет Арго тин оАрго ли Глу Фев Арт Арг за5 за 15 329

Тре Ася ви Люз Нве Лей вело Жри Гля Арго зла Про бер олив ле Вза 325 зю Ше йла бео Тнр Тре Тре Тре Сер Глю ТГлу Тре Лиз Тре бер Лей лей Лв 340 8 82

Тре Сер лю Тра СТри блю лей яз рогу Фено но Тир Ява Про Гу 325 зво З5

Мле лей Пер люв бен бен Тра Тре йшя йро ля Лей Фен Асп Ася бен

Ко чт зо

Тей Аляз Лир фен Тир бал лей бїре лей лей Лей бен оп Арг длз диз 365 50 295 40

АВ о лоп Ася Асп Арк Ци ре бор о лЛиз Таро бля Лиз бЛкроТра ймз Леьй яп 418 Й 415

Тир Чис лу Дня бай Лиз Ткрофрс ла ле Про Ган. Кв Тир с 450 а также аллельнье вариантьь и аналоги данной последовательности. Под аллелями и аналогами понимают последовательности, модифицированнье путем замещения, делеции или прибавления одной или нескольких аминокислот, при условии что зти продуктьі сохранят ту же функцию. Модифицированнье последовательности могут, например, бьіть полученьі с использованием метода направленного мутагенеза, хорошо известного специалистам.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является белок А. ТпаІйапа, обладающий дельта- 5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и вьиішеуказанной аминокислотной последовательностью ЗЕО

ІО Ме2, обозначаєемьїйй как дельта-7 Ред.

Настоящее изобретение относится также к белку, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и аминокислотной последовательностью, идентичной с последовательностью 5ЕО ІС Ме2 примерно на 60 и более процентов.

Процент идентичности может бьіть определен с использованием, например, указанной вьіше программь

ВІ АБТ.

Настоящее изобретение относится также к белку, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и перекрестной иммунореактивностью с белком А. ІПпаіапа вьішеуказанного белка дельта-7 Ред.

Белок может бьть обнаружен, например, путем иммуноосаждения с помощью антисьіворотки, направленной против белка дельта-7 Ред, полученной общеизвестньіми методами.

Один из аспектов настоящего изобретения касается белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, такого как полученньій зкспрессией в клетке-хозяине, содержащей определенную вьіше последовательность ДНК и, в первую очередь, белка А. ІПайійапа, такого, как полученньій зкспрессией в клетке-хозяине, включающей последовательность ДНК, кодирующую вьшеуказанную аминокислотную последовательность ЗЕО ІО Ме2.

Когда белок, являющийся предметом настоящего изобретения, получают зкспрессией в клетке-хозяйине, зто осуществляєтся с использованием методов генной инженерии и культур клеток, хорошо известньм специалистам.

Зкспрессия может осуществляться в прокариотических клетках-хозяевах, например, в БЕ. соїЇї, или в зукариотических клетках-хозяевах, например, в клетке млекопитающего, клетке насекомого или в дрожжах,

включающих последовательность, кодирующую белок дельта-7 Ред, являющийся предметом настоящего изобретения, которой предшествует соответствующий промотор.

Полученньй рекомбинантньй белок может бьїть как гликолизированньм, так и негликолизированньм.

Настоящее изобретение относится, в частности, к белку, являющемуся предметом изобретения, такому, как полученньій зкспрессией в дрожжах.

Настоящее изобретение относится также к антителу, направленному против белка, обладающего определенной вьіше дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью. Указанньім антителом может бьть поликлональноє антитело или моноклональноеє антитело, полученное методами, хорошо известньми специалистам.

Настоящее изобретение относится также к вектору зкспрессии, содержащему определенную вьіше последовательность ДНК, а также клетке-хозяину, трансформированной указанньїм вектором.

Векторами зкспрессии являются хорошо известнье векторь, обеспечивающие зкспрессию белка под контролем соответствующего промотора. В случає прокариотических клеток промотором может бьть, например, промотор Іас, промотор їгр промотор їас; промотор В-лактамазьй или промотор РІ. В клетках млекопитающих промотором может бьть промотор 5М40 или промоторьї аденовируса. Бакуловируснье векторьї могут также использоваться для зкспрессии в клетках насекомьх. В случаеє дрожжевьх клеток промотором может бьть, например, промотор РОК, промотор АОН, промотор СМОС1 или промотор

САІ 10/СУС1.

Клетками-хозяевами могут бьть опрокариотические клетки или зукариотические клетки.

Прокариотическими клетками являются, например, Е. соїї. Васійй5 или бігерютусевз. Зукариотические клетки- хозяеєва включают дрожжи и филаментньюе грибки, а также клетки вьісших организмов, например, клетки млекопитающих или клетки насекомьх. Клетками млекопитающих могут бьіть клетки СНО хомяка или клетки бо5 обезьяньі. Клетками насекомьх являются, например, клетки 5ЗЕ9У. Клетками дрожжей могут бьїть, например, Засспаготусез сегемівзіає, 5спігозасспаготусез ротре или Кісумеготусез Іасіїв.

Предметом настоящего изобретения также является метод клонирования нуклеиновой кислоть, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, в микроорганизме, включающий метод скрининга, вьібранньй среди: - устойчивости микроорганизма к нистатину или к аналогичному соединению, токсичность которого зависит от присутствия стеринов, содержащих ненасьіщенную связь в положений С-7, - гибридизации нуклейновой кислотьі с о последовательностью нуклеотидов указанной вьше последовательности 5ЕО ІЮ Мо1, - идентификации нуклеийновой кислотьї информационньм путем среди последовательностей ДНК, изолированньх произвольно, - прямой зкспрессии белка с последующим иммунологическим обнаружением с помощью антител, направленньїх против белка, обладающего указанной вьіше аминокислотной последовательностью 5ЕО ІЮ

Мо2.

Под микроорганизмом понимают дрожжи, такие как, например, 5. сегемізіає, 5. ротре или К. Іасіі5.

Соединения, аналогичнье нистатину, содержат, например, амфотерицин В или филипин.

Под гибридизацией понимают гибридизацию при средней или повьішенной температуре гибридизации в обьічньїх условиях, хорошо известньїх специалистам (указанньй вьіше Т. Мапіаїйі5 с соавторами).

Идентификация информационньім путем может осуществляться, например, с использованием указанной вьіше программь ВІ А5Т.

Описание примера указанного вьіше метода клонирования, при котором метод скрининга использует устойчивость к нистатину в дрожжах, приводится ниже, в зкспериментальной части.

Предметом настоящего изобретения также является последовательность нуклеийновой кислотьї, ДНК или

РНК, такой, как полученная указанньм вьше методом клонирования. Последовательность нуклеийновой кислоть! может бьіть прокариотического или зукариотического происхождения, в зависимости от материала, на основе которого производилось клонирование, например, человеческого происхождения.

Предметом настоящего изобретения также является клетка-хозяин, трансформированная вектором, содержащим последовательность ДНК, полученной с использованием описанного вьше метода клонирования. Клеткой-хозяином может бьіть прокариотическая клетка или зукариотическая клетка. Примерь! клеток-хозяев и векторов приводились вьіше.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является клетка-хозяин, вьібранная среди дрожжей или филаментного грибка, трансформированная вектором, содержащим последовательность ДНК, являющуюся предметом настоящего изобретения, определенную вьіше, или последовательность ДНК, такую, как полученная описанньїм вьіше методом клонирования.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу получения белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, в котором культивируют трансформированную клетку- хозяина, являющуюся предметом настоящего изобретения, и вьіделяют зкспрессированньй белок и, в первую очередь, к способу, в котором клеткой-хозяином являются трансформированнье дрожжи, в которьх кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора дрожжей.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления іп міїго стерина, ненасьщенного в положениий С-7, в котором инкубируют стерин, подлежащий восстановлению, с белком, полученньм описанньм вьше способом, после чего полученньій восстановленньй стерин может бьть вьіделен.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления іп мУйго зкзогенного стерина, ненасьщенного в положений С-7, в котором инкубируют стерин с трансформированной клеткой-хозяином, являющейся предметом настоящего изобретения, с возможностью вьіделения полученного восстановленного стерина. Клеткой-хозяином может бьть прокариотическая клетка или зукариотическая клетка, в частности, дрожжи или филаментньй грибок.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления іп мімо зндогенного ненасьщшщенного в положении С-7 стерина, в котором культивируется трансформированньй штамм-хозяин, являющийся предметом настоящего изобретения, вьбранньй среди дрожжей или филаментного грибка, с возможностью последующего вьіделения накопленного восстановленного стерина.

Настоящее изобретение относится, в первую очередь, к определенному вьіше способу восстановления іп мійго или іп мімо, в котором полученньм восстановленньм стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (Ра5о5СС), и, в первую очередь, относится к способу восстановления іп мімо, в котором зндогенньмм стерином, подлежащим восстановлению, является зргоста 5,7 диен 3-ол, зргоста 5,7,24 (28) триен 3-ол или зргоста 5,7,22 триен 3-ол или их смесь.

Предметом настоящего изобретения также являєтся - способ получения прегненолона, в котором культивируют трансформированньюе клетки-хозяева, являющиеся предметом настоящего изобретения, вьібраннье среди дрожжей или филаментного грибка, с возможностью последующего вьіделения накопленного восстановленного зндогенного стерина (накопленньїх восстановленньх зндогенньх стеринов) в положениий С-7, после чего инкубируют восстановленнье стериньі в присутствий РазоЗСС и, возможно, в присутствий адренодоксинредуктазьі (АК) и адренодоксина (АОХ), с возможностью последующего вьіделения полученного прегненолона.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является способ получения определенного вьіше прегненолона, в котором клеткой-хозяином являются дрожжи.

Настоящее изобретение относится также к способу получения прегненолона, в котором культивируют дрожжи, трансформированнье одним или несколькими векторами, обеспечивающими ко-зкспрессию белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и РахозЗСС, и, возможно, АОЕ и АОХ, с возможностью последующего вьіделения свободного или зстерифицированного прегненолона.

Настоящее изобретение относится, в частности, к описанному вьіше способу, в котором культивируют трансформированнье дрожжи, козкспрессирующие белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, РахозЗСС, АОРМ и АОХ, и, главньім образом, к вьнішеописанному способу, в котором белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок А. талиань, дельта-7 Ред, и, в первую очередь, к вьишеописанному способу, в котором дрожжевьм штаммом является штамм ЕСО1/рСОб3.

Примерь получения прегненолона в соответствий с настоящим изобретением приводятся ниже, в зкспериментальной части.

Трансформированньми дрожжами, используемьми для осуществления указанного вьше способа получения прегненолона, могут бьть, например, дрожжи, трансформированнье вектором зкспрессии, являющимся предметом настоящего изобретения, содержащим последовательность ДНК, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и вектором зкспрессии цитохрома

РахозЗСС и, возможно, АОХ и АОК. Описание известньїх векторов зкспрессии: цитохрома РахозЗСС и/или АХ приводится, например, в патентной заявке ЕЗС ЕРОЗ40878, а также ниже, в зкспериментальной части.

Используемьми трансформированньми дрожжами могут также бьть дрожжи, в которьх последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, интегрирована в частньй локус гена, например, в локус АОЕ2, и в которьїх зргостерином является уже не основной стерин ов условиях зкспрессии дельта-7 редуктазь. Полученнье «интегрированнье» дрожжи могут бьть затем трансформированьй с помощью интегрирующих кассет зкспрессии или векторов зкспрессии, содержащих последовательность ДНК, кодирующую цитохром РазоЗСС и, возможно, АОХ и АК.

Пример конструирования дрожжевьхх штаммов, продуцирующих іп мімо прегненолон или его сложньй уксуснозтиловьй зфир приводится ниже, в зкспериментальной части.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является также штамм трансформированньх дрожжей, козкспрессирующих белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью,

РагозСС, АОК и АОХ, и накапливающий прегненолон, свободньй или зстерифицированньй, в частности указанньїй вьіше дрожжевой штамм, в котором белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок А. ІПаїіапа, Дельта-7 Ред и, в первую очередь, дрожжевой штамм, обозначаемьй как ЕСО1/рСОб63, детальное конструирование которьїх приводится ниже, в зкспериментальной части.

Настоящее изобретение распространяеєтся также на последовательность ДНК человека, такую как полученная по описанному вьіше способу клонирования, используемую в качестве зонда для диагностики врожденной нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь. Нехватка дельта-5,/7 стерин, дельта-7 редуктазьї включаєт, например, нехватку 7-дегидрохолестеринредуктазьі, виізьівающую ненормально низкое содержание холестерина в плазме.

Настоящее изобретение относится также к способу вьіявления нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазьї, включающему инкубацию пробь, содержащей геномную ДНК человека, с помощью зонда, указанного вьіше, в условиях стандартной гибридизации и вьіявление фиксации или отсутствия фиксации зонда на геномной ДНК, отсутствие фиксации или его восстановление, указьивающее на врожденную нехватку дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь.

Способ согласно изобретению может позволить, например, віявление врожденной нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь, дородовой или у новорожденного, а также у пациентов, страдающих разнообразньіїми заболеваниями, в частности, у пациентов с клиническим проявлением синдрома Е5Н/БІ 0.

Прилагаємье рисунки иллюстрируют некоторье аспекть! настоящего изобретения:

На рисунке 1 представлен профиль общих стеринов, зкстрагированньїх из клона Е22, устойчивого к нистатину, полученному скринингом банка А. ІПпаійапа в дроюках ЕМ 1679. Анализ производился методом КР-

НРІС при 205нм или 285нм (рисунок ТА) или методом СРО путем сравнения с нетрансформированньми дрожжами ЕУ1679 (рисунок 18).

На рисунке 2 представлена карта рестрикции фрагмента Мої І плазмидь! рЕ22 и стратегия определения последовательности оснований в ДНК.

На рисунке З представлена последовательность нуклеотидов кКДНК дельта-7 Ред (ЗЕБЕО ІО Мое1) и соответствующая аминокислотная последовательность (ЗЕО ІЮ Мег2).

Рисунок 4 иллюстрируєт измерение іп мйго активности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь микросомной фракции ЕМ1679, трансформированной индуцируемьм вектором зкспрессии «дельта-7/У8».

Анализ вьіполняєтся методом СРО и показьшваєет трансформирование субстрата 7-дигидрохолестерина (Ті-16,528) в холестерин (ТК-15,887) в присутствийи зндогенньїх стеринов зргоста 5,22 диен 3З-ол (ТК-16,682); зргостерина (ТК-17,249);зргоста 5-ен 3-ола (ТК-17,664).

Рисунок 5 иллюстрирует получение прегненолона іп міо путем расщепления зргоста 5-ен 3-ола (рисунок

БА); зргоста 5,24 (28) диен З3-ола (58) или зргоста 5,22 диен З3-ола (5С), очищенного на основе трансформированньїх дрожжей, зкспрессирующим дельша-7 Ред, с последующей инкубацией в присутствий

РавозСС, АХ и АК. Анализ производится методом СРО сравнением с контрольньм расщеплением холестерина (сплошная линия).

На рисунке 6 показано конструирование интегративной плазмидьї рАбА7, позволяющей интегрировать

КДНК, кодирующую дельта-7 Ред (стерин А7 редуктаза), в локус АОЕ2.

Рисунок 7 представляєт анализ методом СРО общих стеринов, зкстрагированньїх омиілением щелочью из штамма ЕУ1679 и из интегрированного штамма ЕКО, культивированного в присутствий галактозь.

На рисунке 8 схематически показано построениє челночного вектора ЕЕ. соїі-5. сегемівіає 413, содержащего специфический участок заї І (За) в многоучастковом секторе клонирования.

На рисунке 9 представлень зтапьі построения интегративной плазмидььй рСОб2-1 и рсоб2-2, позволяющие включить интегрирующую кассету зкспрессии АОК в межгенную зону Іец2 и 5рітА.

ЗСМ!І1 и ЗСМ2: множественнье участки клонирования.

На рисунке 10 показана стратегия построения штамма СОКОТ1.

На рисунке 11 показаньі зтапьі построения плазмидьй зкспрессий рСОб63, содержащей обе кассеть зкспрессии: АОХ и Рахо5СС.

На рисунке 12 представлен анализ методом СРО стеринов, зкстрагированньїх из клеток (клеточньй лизат) или из культуральной средь! (среда), вьіделенньїх из штамма ЕСО1/рСОб63 после индукции галактозой в течение Уч (рисунок 12а) или 24 ч (рисунок 120).

На рисунке 13 представлена структура плазмидь! рто7457.

На рисунке 14 представлена структура плазмидь! рто7453.

На рисунке 15 представлена структура плазмидьі рТо10014.

На рисунке 16 представлена структура плазмидьі рТо10004.

На рисунке 17 представлена структура плазмидьі рТо10031.

На рисунке 18 представлена структура плазмидьі! рТо10033.

Приводимьсе далее примерьї иллюстрируют настоящее изобретение, вместе с тем не ограничивая его.

ПРИМЕР 1: Клонирование кДНК, кодирующей дельта-5,7 стеарин, дельта-7 редуктазу (дельта-7 Ред) А. талиань

А - Скрининг банка зкспрессии А. талиань!ї в дрожжах

Исходньй банк зкспрессии кКДНК представляеєет собой банк, описание которого дано М. Міпеї с соавторами (Ріапі ., 2, 417-422, 1992г.), которьйй бьл приготовлен на основе мРНК А. ІПпаїапа на зтапе прорастания на стадии двух листиков, КДНК которого, ограниченнье участком Мої І били включень! в участок В5і ХІ кассеть! зкспрессии челночного вектора БЕ. соїі/5. сегемізіае рг.61. Указанная кассета содержит последовательности промотора и терминатора гена фосфоглицераткиназьї (ФГК). Точка начала репликации дрожжевой последовательности 2н, и маркер отбора ШМКАЗ ообеспечивают репликацию вектора в дрожжах.

Распространение вектора в Е. соїї имеет в своей основе плазмиду рОС19.

Дрожжевой штамм ЕМ1679 (Мата), которьій представляет собой изогенньй штамм штамма 5288С, и описание которого дано А. ТПпіегу с соавторами (Уеаві, 6, 521-534, 1990г.), біл трансформирован банком

КДНК с применением метода, основанного на использований литийацетата, описанного 0. біеї? с соавторами (Мисієїс Асій5 Кез., 20, 1425, 1992г.).

Клетки бьли нанесеньй на поверхность синтетической средьй 50, содержащей 7г/л «дрожжевого азотистого основания» (Оіїсо), 1г/л бактоказаминокислот (Оіїсо), 20г/л глюкозьі, 20мг/л триптофана, и лишенной урацила. Бьли полученьй 107 прототрофньх трансформантов по урацилу, которье бьли сгруппированьі и вновь нанесеньй на поверхность той же синтетической средь, лишенной урацила и содержащей 2 или 5мкг/мл нистатина из расчета 5х10" клеток на чашку. Таким образом, бьіли перебрань 105 клеток для каждой концентрации нистатина. После З суток инкубации при температуре «28"С бьіло получено примерно 100 клонов, которье вьіросли при концентрации нистатина в 2мкг/мл и составили группь! из 5 клонов, стериновьй состав о которьїх бьл подвергнут анализу вьсокопроизводительньм методом обратнофазовой жидкостной хроматографии (обозначаемьм в дальнейшем КР-НРІ С), в то время как бьіл получен лишь один устойчивьїй клон, назьіваемьй Е22, при концентрации нистатина 5мкг/мл.

Б - Анализ стеринов, накопленньх в клоне Е22

Общие стериньї дрожжей получают с использованием метода омьіления щелочью, описанного І. Рагк5 с соавторами (Меїпод5 іп Епгутої, 111, 333-346, 1985г.), после чего вьіполняется: анализ с использованием КР-

НРГІС и/или: газовой хроматографии (обозначаемьм СРО).

Полученньй стериновьй остаток растворяют в смеси зтанол-тетрагидрофуран-вода (65:10:25 по обьему), после чего анализируют методом колоночной хроматографии КР-НРІ С на двуокиси кремния С 18 Арріїєа

Віозувієтев (100х2,1мм), с расходом Імл/мин, и при температуре ї557"С, с помощью линейного градиента метанола в воде (от 50905 до 10095 за 1в8мин.) и фотометрического анализа при 205нм и 285нм в сравнений со стандартньіми значениями для зргостерина, кампестерина и холестерина.

Стериновьій состав также анализируют методом СРО на капиллярной колонке 5Е-30 АїШесп (30м хХ 0,32мм) с использованием гелия в качестве газа-носителя, при температуре 280"С и «310"С соответственно для инжектора и для детектора, с исходньім повьішением температурь с жї-1107С до я245"С при скорости 45"С/мин., а затем З3"С/мин. для достижения температурь! 28076.

Анализ методом КР-НРІС (рисунок ТА) и анализ методом СРО (рисунок 18) показьвают профиль стеринов, накопленньїх в полученном вьше клоне Е22, отличающемся почти полньім исчезновением зргостерина, основньім стерином в нетрансформированном штамме ЕХУ1679 и его заменой двумя основньми стеринами в аналогичном количестве, которне не поглощают при 285нм и, следовательно, уже не обладают двойной сопряженной ненасьіщенной связью согласно анализу методом КР-НРІ С.

На рисунке 1А кампестерин (Сигма) (24-К-зргоста 5-ен 3-ол) содержит примерно 3595 дигидробрассикастерина (24-5-зргоста 5-ен 3-ол).

В - Клонирование кДНК дельта-7 Ред

Плазмидьі, происходящие из клона Е22, бьііли амплифицированьі в Е. соїї в соответствии с методом, описанньм -. М. зігавпет с соавторами (Меїподз іп Епгутої., 194, 319-329, 1991г.), и расщеплень Мої І. БьІіли полученьї фрагмент примерно из 600 пар оснований (п.о.) и фрагмент из 1,бтьіс.п.о. Штамм ЕМ1679 бьл трансформирован соответственно каждь/м из вьішеуказанньїх фрагментов. Стериновьїй состав каждого клона трансформированньїх дрожжей бьл подвергнут анализу, как указано вьіше, и позволил вьіявить плазмидьі, содержащие ген, ответственньій за изменение стеринового профиля. Идентифицированная таким образом плазмида бьіла названа реЕ22.

Г- Определение последовательности кКДНК дельта-7 Ред

Вставка кКДНК реЕ22 бьла субклонирована в сайте Мої | вектора руОСеМ, производного от рисе (Рпагтасіа), в котором участок Есо КІ множественного участка клонирования заменен вставкой участка рестрикции Мої І с одновременньім сохранением фазь! считьівания гена І ас7. Затем бьіла определена карта рестрикции (рисунок 2).

Фрагменть! рестрикции, обладающие внешним участком Мої І и внутренними участками ЕсоРВіІІ, РуціЇ или

Ніпанй соответственно, бьли подвергнутьь субклонированию в плазмиде рВі пезсгірі (5ігаїадепе).

Последовательность нуклеотидов бьіла определена методом Сангера с ДНК-полимеразой бЗедцепазе (набор бігаїадепе) на обеих нитях, с использованием прямьїх и обратньїх затравок рОСе, ТЗ и Т7 рВі пезсгірі или специфических затравок, вьіведенньїх из последовательности нуклеотидов кКДНК.

Составление совокупности полученньїх последовательностей даєт последовательность нуклеотидов

КДНК дельта-7 Ред А. ІПайійапа (ЗЕО ІО Ме1), представленную на рисунке 3. Она включаєет 1496 нуклеотидов, заканчивающихся последовательностью полиаденилирования. Она представляєт собой открьтую рамку считьівания, начинающуюся с исходного метионина с нуклеотгида 76 и заканчивающуюся терминаторньм кодоном с нуклеошидом 1366. В итоге возникает открьтая фаза считьшания из 1290 нуклеотидов, кодирующих белок из 430 аминокислот. Кодирующая область кКДНК дельта-7 Ред кодирует белок дельта-7

Ред, вьіведенная аминокислотная последовательность которого (ЗЕО ІЮ Ме2) представлена на рисунке 3.

Последовательность белка содержит 430 аминокислот с расчетной молекулярной массой 4 9,286кДа.

Образец штамма Е. соїї ОН5З-1, содержащего кКДНК дельта-7 Ред в векторе рисСеМ (обозначение: КкДНК дельта7ред/рОС9М), бьл подан 10 февраля 1995г. в НККМ (Национальная коллекция культур и микроорганизмов при Институте Пастера) под номером 1-1535.

Д - Определение консенсусно"! последовательности 5ЕО ІЮ МеЗ

Путем информационного поиска в базах последовательностей (сепрапк и ЕМВІ) бьіло вьіявлено, что последовательность белка дельта-7 Ред А. ІПпаійапа имеет некоторне сходства последовательности с другими стерин-редуктазами,. в частности, со стерин С-14 редуктазой и стерин С-24 (28) редукшазой 5. сегемізіає, описание которьїх приводится соответственно у К. Т. І огепі7 с соавторами (ОМА сеї! Віої., 11, 685-692, 1992Гг.) и у МУ. Спеп с соавторами (Уеавзі, 7, 305-308, 1991г.), а также с продуктом гена 515 145. ротре, описание которого дают М. Зпітапикі с соавторами (Мої. Віої. СеїІ, 3, 263-273, 1992г.-) и стерин С-14 редуктаза

Мецйгозрога сгазза (МеХ77955 в базе ЕМВІ). Кроме того, белок дельта-7 Ред имеет сходство с 400 аминокислотами С-концевого участка рецептора ламина В цьшпленка и с концевьм участком соответствующего рецептора человека, описание которьїх приводится у Н. 9. М/огтап с соавторами (у. СеїЇ

Віої., 111, 1535-1542, 1990г.) и у Е. 5спшег с соавторами (у. Віо!. Спет., 269, 11312-11317, 1994г.).

Бьіли установлень рядь! последовательностей, доказьиівающие идентичность между аминокислотной последовательностью 5ЕО ІО Ме2, вьведенной из ополученной вьше кКДНК дельта-7 Ред, последовательностью трех дрожжевьх стеринредуктаз и двух рецепторов ламина В, после чего бьла определена новая консенсусная последовательность, обладающая аминокислотной последовательностью (ЗЕО ІО Мео3):

Лей Лей Хаа Хаа Гли Трял Хаяа СГли Хаа Хаа Арг Хай Хва Хаа Тир 1 -Ї 10 15 в которой Хаа в положениий 7 представляєт собой аминокислоту Трп или Тир, а Хаа в положении 12 представляет собой Гис или Лиз, для получения олигонуклеотидов, используемьїх в качестве затравок для амплификации методом РСК новьїх последовательностей геномной ДНК или кКДНК, кодирующих белки, обладающие дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью.

Е - Зкспрессия белка дельша-7 Ред в дрожжах а) Конструирование индуцируемого вектора зкспрессии дельта-7//8 в дрожжах

Делеция некодирующих зон кДНК р22 бьла оосуществлена методом амплификации РОК, с использованием следующих специфических олигонуклеотидов:

ЦЕЦІГАТЦЦА ТТТЦТТАГАЦ О ТТАЦАТТЦО 3 0 (БОЮ ди 5 ЦАГГТТАЦЦТ ЦААТАААТТЦ ЦЦТТААТГО 30 (5БО ІД Ле 5)

которье бьли определеньй для ввода участка рестрикции ВатН | непосредственно после исходного кодона и участка Крп І непосредственно ниже стоп-кодона.

КДНК бьіла амплифицирована, используя їнг плазмидьі! «КДНК дельта7ред/рОСУМ» в присутствий 2-х единиц Ріш ДНК-полимеразьй и 0,2мМкМ каждой из вьішеуказанньх затравок с соблюдением следующих условий амплификации: ж947С, 10с; 5270, 50с; 74", 90с; 33 цикла с использованием набора РОСА

Знагадепе.

Бьл получен фрагмент примерно из 1300п.о., с последующим расщеплением ферментами рестрикции

ВатН І и Крп І и включением в участки Ватн І и Крп І челночного вектора Е. Соїї/5. сегемізіае руерР 1/8-2 (обозначение: М8), описание которого приводится у С. Сип с соавторами (сСепе, 65, 203-217, 1988г.). М8 включает маркер селекциий ШКАЗ и содержит кассету зкспрессиий в дрожжах, содержащую промотор

СА 10/СУС1 и терминаторную последовательность гена РОК. Полученньй таким образом вектор, обозначаемьїй дельта-7/У8, позволяєт вьіполнять индуцибельную зкспрессию галактозой белка дельта-7 Ред. б) Получение белка дельта-7 ред

Дрожжевой штамм ЕМ 1679 (Мата) бьіл трансформирован с помощью полученной вьіше плазмидь! дельта-7/У8, по методу, использующему литийацетат, описание которого, приводится у 0. бівеї? с соавторами (процитированному вьіше).

Трансформированнье дрожжи бьли культивированьь при температуре ж27"С в описанной вьіше селективной среде 50, но в которой концентрация глюкозь! составляеєт 5г/л, до получения насьищенности клеточной плотности (ЮОвоонм-12). Затем культура разбавляется добавлением обьема полной средь! УР (10г/л дрожжевого зкстракта (Оіїсо) и 10г/л бактопептона (Оіїсо)), с последующим добавлением зтанола (1,595 по обьему) в качестве источника углерода. Когда рост позволил достичь клеточной концентрации не менее 7Х107 клеток/мл, проявлениє дельта-7 Ред бьіло индуцировано добавлением галактозьї при концентрации 20г/л.

Индуцирование бьіло осуществлено в минимальной селективной среде 51, соответствующей среде 551, в которой глюкоза заменяется галактозой (20г/л), вплоть до получения клеточной концентрации в 2х107 клеток/мл. в) Ферментньй тест іп міо дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активности

Зкспрессия белка дельта-7 Ред бьіла вьіявлена с помощью ферментного теста, описанного М. Тайюп с соавторами (Віоспет. Віорп. Ке5. Согптип., 181, 465-473, 1991г.), однако без системь! регенерации НАДФН, с микросомньми или цитозольньми клеточньіми препаратами вьішеуказанньїх индуцированньїх дрожжей.

Клеточнье фракции бьіли получень! путем механического дробления индуцированньх клеток и изоляции фракций методом ультрацентрифугирования, как описано у Р. Ограп с соавторами (Єниг. 9. Віоспет., 222, 843- 850, 1994г.). Клетки собирают и затем дваждь! промьівают с использованием буфера. ТЕ-КС1 (Трис-НСІ 50мм, рН 7,5 ЗДТА їмм, КСІ 0,1М) и суспендируют в буфере лизиса ТЕ-сорбит 0,6М. Затем добавляются стеклянньіюе шарики диаметром 0,45-0,5мм (Вгацп) вплоть до достижения поверхности клеточной суспензии, с последующим взбалтьшаниеєм в течение 5мин. при температуре ж4"С. Клеточньйй лизат на поверхности собирают, а стекляннье шарики триждь! промьівают с использованием лизисного буфера. Лизат и промьвки обьединяют и центрифугируют при 200009 в течение 1Змин. при температуре я4"С, для удаления митохондриальньїх фракций. Собранную надосадочную жидкость центрифугируют в течение 1ч при 1000009 при температуре ї4"С. Осадок, содержащий микросомную фракцию, и надосадочную жидкость, которая представляет собой цитозольную фракцию, собирают раздельно.

Полученную микросомную фракцию или цитозольную фракцию соответственно инкубируют в течение 9Омин, при температуре «37"С в буфере Трис/НсСІ 100мм при рН 7,3, содержащем в качестве субстрата 7- дигидрохолестерин 150мкМ, змульгированньй с помощью твина 80 (1,5г/л) и в присутствий НАДФН 2мм.

Стериньі! зкстрагируют путем добавления 3-х обьеемов смеси метанола и дихлорметана (50:50 по обьему), после чего вьіполняют анализ методом СРО, сравнивая со стандартньіми продуктами.

Образование холестерина (ТК-15,887мин) на основе, 7-дегидрохолестерина (ТК-16,528мин.) показано на рисунке 4, с микросомной фракцией (3,5мг/мл по белку), полученной как указано вьіше, на основе дрожжей ЕУ 1679, трансформированньїх вектором дельта-7//8, индуцированньїх в течение Зч, и зндогеннье стеринь которьїх отличаются более продолжительньім временем задерживания (ТК-16,682мин. для зргоста 5-22 диен

З-ола; ТК-17,249мин. для зргостерина и ТК-17,664мин. для зргоста 5-ен 3-ола).

Приведенньюе результатьь свидетельствуют о том, что белок дельта-7 Ред, с одной сторонь,, зкспрессируется в трансформированньїх дрожжах, и, с другой стороньі, обладаєт дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью.

ПРИМЕР 2: Восстановление іп мімо зндогенньїх стеринов дрожжей, ненасьіщенньмх в положениий С-7.

Дрожжевье штаммь!, основнье стериньі! которьіх обладают двойной связью в положений С-5,7, бьли трансформированьі вектором дельта-7//8, полученньм в Примере 1, а затем бьли культивировань! и индуцированьі, как указано в Примере 1. Зндогеннье стериньії, профиль которьїх анализируется методом

СРО, бьіли зкстрагированьї и очищеньі методом КР-НРІ С, как описано в Примере 1, с использованием препаративной колонки С18 (100х4,б6мм), а затем идентифицировань ИК-, УфФ-, СМ- и ЯМР-методами.

Соответственно бьіли использованьі следующие три штамма: - Штамм ЕМ1679, описанньй в Примере 1; - Мутантньй штамм егд5, обозначаемьй РІС1051, отличающийся нехваткой стерин С-22 дезатуразь, которьй бьл получен скрещиванием штамма ЕМ1679 и оригинального штамма ро15, описание которого приводится у 5. ММ. Моггапп с соавторами (9. Сеп. Місгоріо!., 72, 339-348, 1972г.), и которьій накапливаєт зргоста 5,7-диен 3-ол; - Двойной мутантньй штамм егд4,5, обозначаємьй РІ С1451, отличающийся нехваткой стерин С-22 дезатуразь! (егд5) и стерин С-24 (28) редуктазь, (егд4), біл получен скрещиванием штамма ЕУ1679 и штамма ро15, описание которого приводится у 5. МУ. Моглапп с соавторами (указано вьіше), получившего спонтанную устойчивость к нистатину в результате систематического скрининга дрожжей с целью поиска стериновьх мутантов, и которьій накапливаєт зргоста 5, 7, 24 (28) триен 3-ол. Полученньійй в результате гаплоидньй штамм, содержащий двойную мутацию егод4, егд5, растет в присутствийи галактозьі и неспособного к брожению субстрата, и ауксотрофен к урацилу, триптофану и гистидину. Штаммь! РІ С1051 и РІ С1451 бьіли подань! в

НККМ 10 февраля 1995г. под номерами 1-1536 и 1-1537 соответственно.

Основнье редуцированньюе стеринь, соответственно идентифицированнье на основе трех вьішеуказанньїх трансформированньїх штаммов, приведеньї в нижеследующей таблице:

Таблица в полож. 0-7

Зргоста 5-ен 3-ол (дигидробрассикастерин)

ПРИМЕР 3: Получение прегненолона іп міо пушем расщепления зндогенньх стеринов дрожжей, восстановленньїхх в положениий С-7

Прегненолон получают, прибегая к ферментному тесту расщепления боковой цепи холестерина іп мімо, описание которого приводится у У/ада с соавторами (Агсп. Віоспет. Віорпув, 2 90, 376-380, 1991г.), в котором 260мкМ стерина, восстановленного в положениий С-7, полученного в Примере 2, подвергают инкубации в 150мкл фосфатного буфера 1Омм, рН 7,4, Мас! л00мм, твин 20 0,395 в оприсутствии 140нм адренодоксинредуктазьі, 1,16мкМ адренодоксина и 0,68мкМ цитохрома РахозСС животного происхождения, полученного из надпочечньїх желез бька, как описано, например, у 0. МУ. Зеубрегі с соавторами (у. Віої. Спет., 254, 12088-12098, 1979Г.).

Реакция запускаєтся путем добавления 150мкМ НАДФН. После инкубации в течение 8Омин. при температуре ї37"С, реакцию прекращают добавлением одного обьема смеси метанола и хдихлорметана (50:50 по обьему). Стериньї зкстрагируют методом СРО, как указано в Примере 1.

На рисунке 5 показано соответственно, что зргоста 5-ен 3-ол (рисунок 5А), зргоста 5,24 (28) диен 3-ол (рисунок 58) или зргоста 5,22 диен 3-ол (рисунок 5С) является субстратом цитохрома РахозЗСС и ведет к получению продукта, обладающего временем задерживания (ТК), идентичньм с ТЕ прегненолона, полученного в тех же условиях путем расщепления холестерина.

Полученнье результать! свидетельствуют о том, что трансформированнье дрожжи, зкспрессирующие дельта-7 Ред, накапливают стериньї, используемье непосредственно для получения прегненолона путем биологического окисления іп міїго.

ПРИМЕР 4: Конструированиє дрожжевьх штаммов, производящих іп мімо прегненолон или его сложньй уксуснозтиловьй зфир А - Конструирование штамма ЕГКО1, содержащего кассету зкспрессии дельта-7 Ред А.

Іпаїіапа, интегрированной в локус АОЕ2 гаплоидного штамма ЕУ1679 матинг типа а (ЕУ1679 Мата) а) Конструирование интегративной плазмидь! рАОдельта-7 (рАрА?7)

Построение плазмидьії рАЮА?7 проводилось, как показано на рисунке б. Фрагмент ВО! (2244п.0.), содержащий ген АОЕ2 5. сегемівіає, бьіл вьіделен из плазмидьі рАбА 11 (А. 51017 с соавторами, Сепе, 95, 91, 1990г.) и включен в вектор рВішезсгірійІ Ко (5іга(адепе) в сайт Ватні множественного участка клонирования.

Полученная плазмида, обозначаемая рво5Б-АОЕ2, бьла затем линеаризована в уникальном и дефосфорилированном сайте ЗИ І.

Фрагмент из примерно 2,44тьіс. пар оснований, содержащий промотор СА 10/СУС1, кодирующую фазу дельта-7 Ред (стерин А7 редуктазь)) и терминатор РОК (РОК), бьл получен из плазмидь! дельта-7/МУ8, полученной в Примере. 1Е методом РСК, с использованием в качестве затравок нижеследующих олигонуклеотидов:

ГАТТАЦІЦЦА АГЦТТТІЦГА ААЦО У (ЗВО Ю М б) и 5 АГАТЦТТГАГ ААГАТГЦІТЦ О ЦАГЦААААЦО 30 (5ЕО ПО Ме 7) которье бьіли определеньї для коньюгации соответственно с концом 3' гена терминатора ІРОК и концом гена ШРАЗ. При зтом бьли использовань плазмида дельта-7/М8 в качестве матриць (8Онг), вьшеперечисленнье олигонуклеотидьі (по 0,5мкМ каждьй), нативная Рїш ДНК-полимераза (1 единица в буфере, рекомендуемом фирмой 5бігаїадепе), при следующих условиях амплификации: 35 циклов; Імин. при температуре 95"С; 5с при 95"С; З0с при ж56"С; 4мин, 30с при -70"С). Затем полученньй фрагмент амплификации бьіл клонирован с четким ограничением в вьішеуказанной линеаризованной плазмиде рво-

АБЕ2 для получения плазмидьї рАЮА7, в которой фрагмент Мой-РЗИ из примерно 4720п.о. содержит ген

АБЕ2, не прерванньй кассетой зкспрессии дельта-7 Ред. б) Хромосомная интеграция в дрожжевой штамм ЕМ1679 Мата

Фрагмент МоИ-РаїІ (4720п.0,), вніделенньій из плазмидьі! рАбБА7, расщепленной ферментами рестрикции

МОЇ и РІЇ, бьл введен в дрожжи ЕМ1679 Маша путем трансформации по методу, использующему литийацетат, описание которого приводится у 0. біеї» с соавторами (процитированного вьіше).

Трансформанть!, интегрировавшие указанньй фрагмент путем гомологичной рекомбинации, бьли отобраньй по их устойчивости к нистатину, причем зто явление вьїзвано зкспрессией дельта-7 Ред с превращением дрожжевьїх дельта-5,7 стеринов в дельта-5 стеринь!.

Трансформированньє клетки бьіли подвергнуть! инкубации в течение 4ч при температуре 28"С в полной среде УР, описание которой приведено в Примере 1Е, содержащей глюкозу (20г/л) и, дополнительно, аденин

(20мг/л). Затем они бьли концентрированьй и нанесеньй на минимальную 5іІ-агаровую среду (г/л бактоказаминокислот; 7г/л «дрожжевого азотистого основания»; 20г/л галактозь!; 20мг/л аденина; 20г/л агара), а затем инкубировань! в течение одной ночи при температуре «28"С для индукции зкспрессии гена дельта-7

Ред. Отсутствие урациловой добавки позволяеєет ограничить рост клеток. Клонь бьіли собрань, сгруппировань! и нанесеньі на полную среду УР, содержащую галактозу (20г/л) и, дополнительно, аденин (20мг/л), и в присутствиий возрастающих концентраций нистатина (Омкг/мл, мкг/мл, 2мкг/мл, 5мкг/мл, 20мкг/мл соответственно). На четвертьй день бьіло получено примерно двадцать клонов, вьиіросших при концентрации 5мкг/мл нистатина. Двенадцать из указанньїх клонов бьіли перенесень на емкости с минимальной УМО-средой (7г/л «дрожюжевого азотистого основания» без аминокислот; 20г/л глюкозь)), обогащенной урацилом, лейцином, триптофаном, гистидином и аденином (по 20мг/л каждого).

Ауксотрофность к аденину, вьїзванная нарушением гена АОЕ2, бьла впоследствий подтверждена отсутствием роста на вьшеуказанной минимальной МуУО-среде, обогащенной урацилом, лейцином, триптофаном, гистидином, но лишенной аденина.

Присутствие кассеть! зкспрессии в геноме дрожжей бьіло проверено путем амплификации методом РОГ на основе геномной ДНК полученньїх клонов, с использованием затравок, включающих указаннье вьше последовательности 5ЕО ІО Моб и 5ЕО ІЮ Ме7.

Функциональность интегрированного гена дельта-7 Ред бьла подтверждена вьполнением анализа методом СРО содержания стеринов, накопленньїх в дрожжах и зкстрагированньїх омьілением щелочью в соответствии с методикой, описанной в Примере 1Б, с использованием 5-метровой капиллярной колонки 5Е- (АІйесі). Проведенньй анализ ввіявил модифицированньій профиль, содержащий насьіщенньєе стеринь! в положений С-7 в тех случаях, когда клонь! культивировались в присутствиий галактозьі. Полученньій штамм, обозначаемьй ЕЇ! КО1, накапливает зргоста 5-ен 3-ол и зргоста 5,22 диен 3-ол вместо зргоста 5, 7, 22 триен 3- ола (зргостерина), основного стерина исходного штамма ЕУ1679, как бьіло показано на рисунке 7.

Полученньй таким образом штамм ЕКГО1 зкспрессируєт ген дельта-7 Ред, в тех случаях, когда он культивируется в присутствийи галактозьї, вследствие траскрилционного контроля промотором СА 10/СУС1.

Хотя единица зкспрессии дельта-7 Ред имеет то же транскрипционное направление, что и ген АОЕ2, никакой зкспрессии дельта-7 Ред не вьявляєтся при анализе содержания стеринов методом СРО, когда культивирование осуществляется в присутствийи глюкозь! вследствие репрессии промотора СА 10/СУС1.

Б - Конструирование штамма СОМКОЇї, содержащего кассету зеспрессии зрелой формь! бьічьей адренодоксинредуктазьі (АОКт), интегрированной между локусами ГЕШ2 и 5РІ1 гаплоидного штамма ЕМ1679 матинг типа альфа (мат альфа) а) Конструирование челночного вектора Е. соїї - 5. сегемівіає М1З

Вектор М13 соответствуеєт вектору М8 (С. СшІп с соавторами, процитированнье ранеє), включающему маркер отбора ОКАЗ и кассету зкспрессии в дрожжах, содержащую промотор СА 10/СУС1 (ро/с), в котором дополнительньй участок 5аї І (За) биіл введен во множественном участке клонирования, в соответствии со схемой построения, приведенной на рисунке 8.

Вектор М8 бил расщеплен ферментами рестрикции Ніпа ІІ и Ватн І, а полученньій фрагмент Ватн І-Ніпа

ПІ («1722п.0.), содержащий ген ОКАЗ и промотор СА 10/СУС1 (обозначаемьй далее «ура-гал»), бьл субклонирован между соответствующими участками вектора рисів8 (Рпагтасіа), расщепленного ферментами рестрикции Ніпа ІІ и Ватн І.

Фрагмент «ура-гал» бьіл затем подвергнут амплификации методом РСЕК на основе ЗОнг полученной плазмидьї риС18в/«ура-гал», денатурированной в течение З30с при температуре ї957"С при следующих условиях: 30 циклов; 5с при температуре 86"С; 10с при 957С; 40с при 38"С; 5с при ї557С и 2мин. при 74"С, 2 единицьї Тад ДНК-полимеразьї (Воепгипдег) в буфере изготовителя и 1мкМ каждой из затравок, включающих нижеследующие последовательности нуклеотидов: я ТТТТАТЦІЕТ ГПЯАНІТТА ОАТТТАКХУТЕ ЗЕРАЖЕНЯКО ТЕН У (ЗО ПО Ж Ви

Ж РТААААЦІАН ГИЦАГЕ У воша»

Затравка 5ЕО ІО Ме8 включаєт один участок Ватн І ГГАТЦЦ, идентичньй участку фрагмента «ура-гал», З последовательньїх нуклеотида на участке Ватн І, не гибридизирующихся с матрицей, один участок заї

ГІЦГАЦ и одну последовательность, гомологичную последовательности промотора СА! 10/СУС1. Затравка

ЗЕБЕО І Ме9 коньюгируется с предьуідущей последовательностью участка Ніпа Ії множественного участка клонирования вектора рисС18. Фрагмент Ніпа П-Ватн І! из 1722п.0., полученньій после амплификации, бьіл расщеплен Хпо І и Ват НІ, вьісвобождая фрагмент из 254п.о., содержащий промотор САЦПО/СУСІ (ро/с), которьй бьл затем субклонирован в векторе У8, расщепленной ферментами рестрикции Ват НІ и Хпо І.

Полученньй в результате вектор М13 содержит участки рестрикции, позволяющие легко субклонировать

КДНК, кодирующие зрелую бьічью адренодоксинредуктазу (АОКт), зрельій бьічий адренодоксин (АОХт) и бьічий цитохром Ра5об5СС,

На основе вектора М13 бьіли соответственно получень, как указано ниже, вектор М13-АОК, вектор М13-

АОХ и вектор М13-50210: о) Конструирование вектора М13-АОВ

Один фрагмент заї І-Крп І из 1478п.0о., содержащий КДНК кодирующую АОКт, бьл вьіделен из плазмидь! рОавАЮВ-2, описание которой приводится в Примере 25 патентной заявки ЕЗС ЕРЗ340878, и субклонирован в соответствующие участки вектора М13 для получения вектора МІЗ-АОВ.

В) Конструирование вектора М13-АОХ

Фрагмент За! Ватн І! из 390п.о., содержащий кКДНК, кодирующую АОХт, бьл вьіделен из плазмидь рОавАЮХ-Ї, описание которой приводится в Примере 23 патентной заявки ЕЗС ЕРЗ40878, и субклонирован в соответствующие участки вектора М13 для получения вектора М13-АОХ.

У) Конструирование вектора М13-502210

Фрагмент 5аї І-ЕсоК І из 1554п.0о., содержащий кКДНК, кодирующую Разо5СС, бьіл вьіделен из плазмидь! рав5ос-10, описание которой приводится в Примере 6 патентной заявки ЕЗС ЕРЗ40878, и субклонирован в соответствующие участки вектора М13 для получения вектора М13-52210. в) Конструирование интегративньїх плазмид рСОб2-1 и рСОб62-2

Конструирование плазмид рСОб2-1 и рСОб62-2 вьіполнялось, как показано на рисунке 9. о) Конструирование плазмидь рег! 2600

Участок Мої | бьіл введен в плазмиду рЕ!/ 26 (М. Воппеаца с соавторами, Уеаві, 7, 609-615, 1991г.), в межгенную зону, разделяющую ген Іец2 от конца 5' гена 5ріЇ (обозначаємого 5ріІА) (С. Коїтап с соавторами, .).

Вастегіо!., 175, 1433, 1993г.), по нижеследующей методике:

Два фрагмента ДНК из 704п.0о. и 347п.о., содержащие соответственно конец 5' гена Іец2 и конец 3' гена 5ріА, бьли синтезировань методом РСЕВ с помощью затравок обладающих нижеследующими последовательностями нуклеодидов:

Т ТТЕАМТТТТИ ААЦАТЦААТЕ ТАКО У СВО НИ х т РЕМ ПРЦНТЦЕТТ ОТЗАТАТТАА ОПІАААЮ Ж

БЕБІ) для амплификации фрагмента из 704п.0. и последовательностей нуклеотидов

У ЦААГГАГТЦІ ГИЦГЦЦАЦАЦ АААААГІТАГ ОГІГТ У

' (БО ТО М п) и

У ТЦІТГЦТТЦЦЦ ТАГААЦНТТЦ ТТАТГ У (5БО ІД Ме 13) для амплификации фрагмента из 347п.о.

Затравки ЗЕО ІО Ме117 и 5ЕО ІЮО Ме12 включают последовательность ГГЦГТЦЦТ, соответствующую участку Мої І, ив которой З основания не коньюгируются с матрицей. Затравка ЗЕО 10 Ме10 коньюгируется с последовательностью, расположенной на 536бп.0о. вьіше стол-кодона Іец2, а затравка 5ЕО ІО Ме13 включает последовательность, расположенную на 194п.0. вьіше стоп-кодона 5рітА.

Для начала фрагменть из 704п.о. и 347п.о. амплифицируют методом РСК, с использованием в качестве матриць! плазмидь рр 26 и в качестве фермента - Ріш ДНК-полимеразу, в обьічньїх условиях, рекомендуемьмх поставщиком (5ігагадепе).

Оба полученньїх амплифицированньх фрагмента коньюгируются с 20п.о. на уровне концов, генерированньїх затравкой 5ЕО ІЮО Ме11 (фрагмент из 704п.0.) и затравкой ЗЕО І Ме12 (фрагмент из 347п.0.) на основе конца 5; указаннье 20п.о. соответствуют 20-ти первьм нуклеотидам каждой из затравок соответственно.

Продукт, полученньій в результате коньюгации фрагментов ДНК из 704п.о. (1Тнг) и из 347п.о. (2нг), бьіл амплифицирован с использованием затравок 5ЗЕО ІЮО Мое10 и 5ЕО ІО Мо13 с соблюдением следующих условий: циклов; 10с при температуре 957С, 5с при ї60"С, Імин. при ї45"С, 5с при ї657С и 2мин. при 72"С, за которьми следует один цикл из 7мин. при температуре ї72"С; 50пмоль каждой затравки и 1 единица Ріи ДНК- полимеразьї в 5О0мкл реакционного буфера (Зігаїадепе). В результате бьіл получен амплифицированньй фрагмент из 1031п.0о., включающий участок разрьшва Мої І. Затем указанньй фрагмент бьл расщеплен ферментами В5і Хі и М5і І, а полученньій фрагмент из 920п.0о., содержащий участок Мої І, биіл включен на место исходного фрагмента В5ї ХІ-М5і | плазмидьі! р! 26 для получения плазмидь ргї26С0, карта которой представлена на рисунке 8а.

В) Конструирование плазмидь! РСЮОбО

О) Получение плазмидьі РОР100О36б

Фрагмент зЗаї І-Ватн І из 390п. о., содержащий кКДНК, кодирующую зрельй бьічий адренодоксин (АОХт), бьл вьіделен из плазмидьі! М13-АОХ, а затем субклонирован на участках Заї І-Вді Ії множественного участка клонирования плазмидьі рто10033, по бокам которой находятся индуцибельньй промотор ЗАГ 10/СУС1 и терминатор їегРОК. Плазмида р/о10033, карта которой представлена на рисунке 18 и которая соответствует вектору зкспрессиий РТО10031 (рисунок 17), содержащему промотор СУСІ и їегРОК, в котором промотор

СУСІ1 бьл заменен на промотор СА 10/СУСІ1, бьіла получена в соответствии с методикой, описание которой приводится ниже.

Полученная таким образом плазмида, обозначаемая роР10034, содержит кассету зкспрессии АОХ, то есть ген, кюдирующий АОХт под транскрипционньіїм контролем СА 10/СУС1 и їегрРокК. В дальнейшем термин «кассета зкспрессии» будет использоваться для всех генов, находящихся в транскрипционной зависимости от

СА 10/СУС1 и їегРоОкК.

Фрагмент Ніпа І из 3593п.0о., содержащий маркер отбора СКАЗ и кассету зкспрессии АОБК, бьл вьіделен из плазмидьі! М13-АОК, расщепленной ферментом рестрикции Ніпа І, а затем введен в соответствующий участок плазмидьї роР10034, расщепленной ферментом рестрикции Ніпа І. Полученная плазмида, обозначаемая роР10034, содержит кассеть! зкспрессиий АЮХ и АОЕ, отделеннье одна от другой маркером

ОКАЗ (рисунок 96).

В) Получение плазмидьї рСОбоО

Фрагмент АЙ ППІ-Асе І из 2770п.о., содержащий кассету АОК, бьгл вьіделен путем частичного расщепления плазмидьї рОРТ10036 ферментами рестрикции АЙ І и Асе І. с четким ограничением за счет обработки фрагментом Кленова ДНК-полимеразь! І и субклонирован после лигирования с четким ограничением на участке Зта І плазмидь рВіне-5сгірі К5-- (Зігаїадепе). В полученной плазмиде, обозначаемой рСОбоО, кассета зкспрессии АОК ограничена с двух сторон участками Мої І, один из которьїх располагаєется на 209п.0. вьіше участка лигирования АЙ П/бгаа | и происходит из субклонированного фрагмента, а другой происходит из множественного участка клонирования (5СМ/І) плазмидь рВіне-зсгірі К5-- (рисунок 96). у) Конструирование плазмид рСОб2-1 и рСОб2-2

Фрагмент Мої І из 2558п.0., вьиіделенньй из плазмидьі рСОб60О, расщепленной ферментом рестрикции Мої І, бьіл затем субклонирован в уникальньій участок Мої | плазмидь! рг/26СО. В зависимости от направления встраивания фрагмента бьіли получень! две плазмидь, обозначаемье рСОбв2-1 и рСОб2-2 (рисунок 9в).

В плазмиде рСОб2-1 кассета зкспрессии АОК ориентирована в траскрипционном направлений гена Іецг2, в то время как указанное ориентирование в случає плазмидьі рСОб62-2 имеет обратное направление.

Для последующих конструирований бьіла вьібрана плазмида рСОб2-1. в) Хромосомная интеграция в дрожжевой штамм ЕУ1679 (Матальфа)

Плазмида рСОб62-1 включает зоньі, гомологичнье хромосомному локусу штамма ЕМ1679. Указанньсе зонь! соответствуют фрагментам Ваї 1І-Сіа І из 106О0п.о. (А), Есом І-МОї І из 707п.о. (В) и Мої І-Вад! ІІ из б02п.о. (С) соответственно, как показано на рисунке 10.

Зона, соответствующая фрагменту Сіа І-ЕсоЕ І из 486п.о. плазмидь! рРСОб62-1, била подвергнута делеции в штамме ЕМУ1679, что связано с ауксотрофией указанного штамма по отношению к лейцину (штамм СЕШ27) (К. 5. Біког5кКі с соавторами, Сепеїїісв, 122, 19, 1989г.).

Плазмида рСОб62-1 била линеаризована расщеплением ферментом рестрикции Хба І, участок разрьва которьм располагается вне гомологичньх зон, после чего она бьіла введена путем трансформации в штамм

ЕМ1679 (Матальфа) с помощью метода, использующего литийацетат (0. Сіеї: с соавторами, процитированньє вьіше).

Способность репарировать клеточную ДНК с помощью дрожжей («дар гераїг») и отбор рекомбинантов, обладающих фенотипом ГЕШ2", позволили отобрать на первом зтапе два типа рекомбинантов: первьїй тип получен в результате гомологичньїх рекомбинаций на уровне фрагментов А и В, а второй тип бьлл получен в результате гомологичньїх рекомбинаций на уровне фрагментов А и С. Только последний тип рекомбинации обеспечил интеграцию кассеть! зкспрессии АОЕ в дополнение к восстановлению фенотипа І ЕШ2».

С целью отбора указанного второго типа клона бьіл вьіполнен скрининг методом РСЕ, с использованием вьшеуказанной затравки ЗЕО ІЮ Ме10 и затравки, содержащей следующую последовательность нуклеотидов:

ТАЦАТТАГТТ ЦЦТПТТАГЦ 3' (ЗЕО ІЮ Ме14) с тем чтобьї одновременно подтвердить и присутствиє, и правильность локализации кассеть! зкспрессий

АОРК в геноме штамма ЕХ167 9 (Матальфа).

В указанном скрининге затравка ЗЕО ІО Ме14 коньюгируется исключительно с последовательностью, кодирующей АЮОКт, а затравка ЗЕО ІЮ Ме10 коньюгируется с хромосомной последовательностью (рисунок 10).

Реакция амплификации бьіла произведена с использованием в качестве матриць! геномной ДНК (20Онг), вьіделенной из штамма ЕУ1679 (Матальфа) (С. Нойтап с соавторами, Сепе, 57, 267, 1987г.), одной единиць

Тад ДНК-полимеразь! (Воепгипдег), 5О0пмоль каждой из затравок и 30 циклов методом РСК (10с при температуре 957С, Тмин. при «557С, Змин. при 472"С), в обьічньїх условиях, рекомендуемьїх поставщиком.

Амплификация привела к вьіделению фрагмента из 2,9тьІс.п.о., в случає интегрирования кассеть зкспрессии. В противном случає не бьгло вніявлено никакого продукта амплификации.

Отобранньй таким образом штамм ЕМ1679 (Матальфа), содержащий интегрированную кассету зкспрессии АОЕ бьіл обозначен СОКО1.

Зкспрессия АК указанньм штаммом бьла вьявлена на основе цитозольньїх клеточньїх фракций, полученньїх в соответствии с протоколом, описание которого приводится в Примере 1Е, путем иммунообнаружения белка, узнаваемого антителами анти-АОВ.

Функциональность АОК, зкспрессируемой штаммом СОКОТ, бьіла подтверждена в результате проведения ферментного теста расщепления боковой цепи холестерина іп міїго, описание которого приводится в Примере 3, в котором очищенная АОК (0,28пмоль) бьіла заменена на цитозольную клеточную фракцию штамма СОКО1 с содержаниеєм 100мкг общих белков. При зтом наблюдалась биоконверсия холестерина в прегненолон порядка 2595, что сравнимо с уровнем конверсии, полученной с очищенной АОМ.

В - Конструирование диплоидного штамма ЕСО1, козкспрессирующего дельта-7 Ред А. талианьі и АОКт

Диплоидньйй штамм ЕСО1 бьіл получен скрещиванием гаплоидньїх штаммов СОКОТ и ЕКО, полученньмх, как указано вьіше, в соответствии с протоколом, описание которого приводится у б. Зргадце с соавторами (Метпоаз іп Епгуто!Поду, 194, 77, 1991г.):

Первьй отбор в описанной вьіше минимальной селективной среде, обогащенной урацилом, триптгофаном и гистидином (по 20мг/л каждого), но лишенной лейцина, позволил изолировать диплоиднье клоньі ГЕШ2 (прототрофньій признак, свидетельствующий о присутствии кассеть! зкспрессимй АОК). Затем указаннье клоньі подверглись тестированию на устойчивость к нистатину при 5мкг/мл (признак устойчивости, свидетельствующий о присутствий кассеть! зкспрессии дельта-7 Ред) на твердой синтетической 51 І-агаровой среде, описание которой приводилось вьіше.

Таким образом, среди клонов, устойчивьх к нистатину, бьіл произвольно вьіделен штамм, обозначаемьй

ЕСО1.

Г- Конструирование штамма ЕСО1/рСОб63, продуцирующего прегненолон и прегненолон 3-ацетат а) Конструирование гшазмидь зкспрессии роб

Конструирование плазмидьі РСОб63З проводилось, как показано на рисунке 11.

Фрагмент Мої | из 4961п.0о. содержащий кассету зкспрессиий АОХ, маркер отбора ОКАЗ и кассету зкспрессим АБ, бьл вьіделен из плазмидьй рОР10036, полученной, как указано вьіше, и расщеплен ферментом рестрикции Мої І а затем клонирован на участке Мої | множественного участка клонирования плазмидь реЕї451 (М. Воппеаці с соавторами, Меаві, 7, 609, 1991). Полученньій таким образом вектор, обозначаемьй роР10037, представлен на рисунке 11.

С одной стороньі, плазмида рОР10037 бьла линеаризована расщеплением ферментом ТІЙп1111І, участок расщепления которьїм располагаєтся в гене, коюдирующем АОКт.

С другой стороньі, фрагмент Рми ІІ-ЕсокМ из 3476п.о., содержащий кассету зкспрессии РахозСС и конец 5" маркера ОКАЗ, бьіл очищен на основе плазмидь! М13-5С2С10, полученной ранее и расщепленной ферментами рестрикции Рми ІІ и ЕсокУ.

Обе линейнье, соответственно полученнье ДНК ообладают гомологичньми зонами, которье соответствуют, с одной стороньі, концу 5 гена ОКАЗ и промотору САЇ10/СУС1 и, с другой сторонь, терминатору їегРОК, как показано на рисунке 11а.

Зти два фрагмента бьіли затем введеньї в дроюкевой штамм ЕМ1679 (Мата) путем котрансформации методом, использующим литийацетат (0. Сіеї» с соавторами, процитированньсє ранее).

Нижеследующая селекция прототрофньїх рекомбинантов для урацила и триптофана (ШКАЗ", ТАР17) позволила вьіделить клоньі, в которьїх двухнитевьй разрьв, генерированньй поглощением ферментом рестрикции ТІйп111І, бьл репарирован вследствие встраивания кассетьій зкспрессии Разо5СС путем гомологичной рекомбинации.

Селекция рекомбинантов (ШРАЗ», ТАР17) била осуществлена на минимальной селективной среде УМО, обогащенной лейцином, гистидином и аденином (по 20мг/л каждого), но лишенной урацила и триптофана. На основе 50 обьединенньїх клонов общая ДНК бьїла зкстрагирована методом, описание которого приводится у

С. Нойтап с соавторами (Сепе, 57, 267, 1987г.), а затем введена злектропорацией в штамм БЕ. соїї ХІІ-Війе (Зігаїадепе). Клоньї, трансформированнье плазмидой, генерированной «дар гераїг», били селекционировань! на богатой среде ІВ (триптон 195, зкстрагированньй из дрожжей 0,595, Масі 195), содержащей 50мг/л ампициллина. На основе одного из селекционированньх клонов по методу, описание которого приводится у у.

Батюогоок с соавторами (Моїесшаг Сіопіпд, Соїй бргіпд Нагрог І арогаїогу Ргез5, 1989г.) била зкстрагирована плазмида, обозначаемая рСОб63. Полученная плазмида рСОб63 содержит кассеть! зкспрессии АХ и Разо5СС, отделеннье одна от другой маркером селекции ОКАЗ, как показано на рисунке 116. б) Трансформация штамма ЕСО1 плазмидой рСОб3

Плазмида рСОб3 бьла введена в полученньй вьшше штамм ЕСОЇї путем трансформации методом, использующим литийацетат (0. сіеї7 с соавторами, процитированнье ранееє). Затем трансформированнье дрожжи бьли культивировань на минимальной среде УМО, описанной вьше и лишенной урацила, триптофана, аденина и лейцина, но с добавлением гистидина (из расчета 20мг/л).

Таким образом бьіл вьіделен штамм, обозначаемьшй ЕСО1/рСО63. Образец штамма с обозначением

ЕСО1/рСоОб63 бьіл подан 10 февраля 1995г. в СМОМ под номером 1-1538. в) Получение іп мімо прегненолона и прегненолон 3-ацетата

Штамм ЕСО1/рСО63 бьіл культивирован при температуре ї28"С азробиозом (130об/мин.) в З-литровой зрленмейеровой колбе до достижения фазьі стационарного роста (00600:от 12 до 13) в селективной среде

Зо, описание которой приводится в Примере 1А, и в которой концентрация глюкозь! составляет 5г/л. Затем культуру разбавляют добавлением одного обьема описанной вьіше полной средьй УР и последующим добавлением зтанола (0,595 по обьему) в качестве источника углерода. По достижении новой фазь стационарного роста (0О600:от 12 до 13) в культуру добавляют галактозу (20г/л) в виде концентрированного раствора (500г/л), с тем чтобьї индуцировать одновременно зкспрессию генов, кодирующих АЮОХт, Акт,

РазозЗСС и дельта-7 Ред, которне находятся соответственно под контролем промотора АГ 10/СУС1.

Козкспрессия четьірех генов бьіла вьіявлена путем анализа стеринов, накопившихся соответственно в клетках и в надосадочной жидкости культурь, в соответствии со следующей методикой:

По истечении Уч и 24ч индукции бьли взять пробьії культурь по 50мл. Для отделения клеток от культуральной средьї каждая проба бьіла подвергнута центрифугированию (40009, 1Омин., 47).

С одной стороньї, клетки лизируют путем механического дробления в присутствиий стеклянньїх шариков, по методу, указанному в Примере 1Е. На основе полученного таким образом лизата межклеточнье стеринь! затем зкстрагируются путем добавления одного обьема гексана.

С другой стороньї, стериньії, присутствующие в культуральной среде, зкстрагируются непосредственно путем добавления одного обьема гексана.

Содержание зкстрагированньїх стеринов анализируют методом СРО, как указано в Примере 1, в сравнений со стандартньіми продуктами.

Результатьі, полученнье после 9 часов или после 24 часов индукции представленьі! соответственно на рисунках 12а и 126.

Рисунок 12а с результатами, полученньїми после 9 часов индукции, показьвает: присутствие в клеточном лизате основного соединения, обладающего тем же временем задерживания, что и у стандартного прегненолонацетата (ТК-11,8мин.), в то время как во времени задерживания прегненолона наблюдается лишь очень низкое пиковое значение (ТК-9,9мин.). Незначительнье количества редуцированньїх дрожжевьїх зндогенньїх стеринов в положений С-7 (зргоста 5-ен 3-ол и зргоста 5,22 диен 3- ол), идентифицированьі соответственно при ТК-18мин. и ТК-17мин. Омьіление клеточного лизата перед анализом приводит к присутствию основного соединения, комигрирующего с прегненолоном. Зто дает возможность подтвердить, что накопленное соединение, ТК которого равен 11,8мин., соответствует прегненолонацетату; - значимое отсутствиєе в культуральной среде прегненолона или его ацетата.

Рисунок 126 с результатами, полученньїми после 24 часов индукции, показьіваєт: - присутствие в клеточном лизате незначительньїх количеств прегненолона (ТК-10,2мин.) и прегненолонацетата (ТК-12мин.), а также редуцированньїх дрожжевьїх зндогенньіїх стеринов (ТК-17мин. и

ТК-18мМин.). Холестерин (ТК-16,2мин.) является внутренним стандартом, добавленньм перед зкстрагированием; присутствие в культуральной среде в основном прегненолонацетата и незначительного количества прегненолона.

Опьїтьї, проведеннье параллельно со штаммом ЕСО1, трансформированньмм контрольной плазмидой, такой как указанная ранее рБгї 451, не показали никакого пикового значения, соответствующего прегненолону, свободному или в виде ацетата.

Вьіполненная таким образом идентификация стеринов показьвает, что дрожжевой штамм ЕСО1/рСОб63 накопил прегненолон и прегненолонацетат, при полном отсутствии какого бь то ни бьло источника зкзогенньїх стеринов, после индукции в присутствийи галактозь! со значительной продукцией после 9-часовой индукции.

Указаннье результатьі показьвшвают, с одной стороньї, зффективную мобилизацию редуцированньмх зндогенньїх стеринов в положениий С-7 штамма ЕСОЇї и, с другой стороньії, зффективность связьввания реакции разреза боковой цепи зндогенньх стеринов.

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА ИНТЕГРИРОВАННЬЇХ ШТАММОВ

Штаммь! Локус ИнтегрированньійІГрансформирующая|Плазматический!| Ген (геньї) на| Маркерь интеграции ген плазмида маркер плазмиде отбора - НІБЗ сової Межгенньй ;

АрВАт ВАЗ,

ГЕО ВР юр ТАРІ

АОЕЗг,

ЕГО! ВАЗ, (Мата) АбЕ2 Дельта-7 Ред І ЕШ?,

НІЗЗ ТАРІ

ЕСОЇ Ментенньй | довт Дельта-7 ме (дипло-ид) | рі 17АОЕ? Ред ТАРІ

Межгенньй

ЕСОРСОЄЗ| ІЕО2- | Кт дельта 7 РСОБЗ ОВАЗТАРІ | висо | НІВЗ

ЗРІ1ЗАОЕ2 А 150

Приготовление Примера 4: Конструирование плазмидьї РТбЮОЗЗ 1. Производная рисС19, обладающая новьїм множественньїм участком клонирования:

Вектор клонирования МіЗтр19 (С. Мапізп-Регоп с соавторами, Сепе, 33, 103, 1985г.) бьіл подвергнут мутагенезу с использованием следующего олигонуклеотида:

ЕЦІЦТЦАГЦЕ ГІЦГЦТТТЦЦО АГІЦГ 3 5БО Ір Ме 15 для введения участка Мої | в последовательность усеченного гена Іас | и для получения плазмидь!

М13та724.

Затем в участок ЕсоЕК І плазмидь! М13То724 бьіл введен полилинкер, содержащий участки Есок І, пав и Мої І, с использованием следующих олигонуклеотидов:

У АТЦ ОПИТАМЩЕТАТ їх що о Же нея

У ААТТЦАТАЦІ ТАЦІ ННЦГ Бу ЗОВ ВІР для получения плазмидьї М13Т07244, в которой наблюдалась модификация вставки во время стадий амплификации. Вставка плазмидь! МІ3Т57244 обладаєт следующей последовательностью нуклеотидов:

ГААТІШАТАНІ ТАЦІ ШТ ІТ ЦААТТ ЦІ ГТАПТАТААТТЦАДТГТЦЦІТ в которой участки Есок І, зпав І и Мої І подчеркнуть, а участок Іас- плазмидьі рОсС19 вьіделен курсивом.

После расщепления плазмидьй М137057244 ферментами рестрикции ЕсомфК | и 551 | бьл введен полилинкер, содержащий участки Міс І и Амг Ії, с использованием следующих олигонуклеотидов: 5 ЦААЦГЦІТЦЦ ТАТО У 5ЕО ІО Ме 18 и 5 ААТІЦЦТАГІ АЦГЦІТІГАГ ЦТ У 5ЕО 1 Ме 19.

После расщепления ферментом Рмуи ІЇ полученньйй фрагмент Ру ІЇ бьіл субклонирован в рис19 (с.

Хапізп-Регтоп с соавторами, процитированньєе вьіше) для получения плазмидь рто7457 (рисунок 13). 2. Субклонирование терминатора РОК рисС19 бьіла расщеплена ферментами рестрикции Ватн І и ЕсоЕ І и бьіл введен новьїй полилинкер Ватн 55, с использованием следующих олигонуклеотидов: 5 ГАТЦЦГЦАГА ТАТЦАТЦТАГ АТЦИЦТТТТА ГАТТ 0 8БО Юм 20, 5 АГАГЦТЦААГ АТЦТАЦИЦІТ ГАТДТАГАТІ АТАТЦІГЦІ 3 5ЕО ІЮ Мо 21,

Х ЦІТАГНТИУ АШЦАТНІГ ЗУГАНАВИТа ТАБУ БОЮ мли

Х АЗПИТНЦТА ГГТРТНРАНІ ОАББХТНТУ 3 ка Ме З.

Таким образом бьла получена плазмида рто74 53 (рисунок 14), которая затем бьіла расщеплена ферментами рестрикции ВатН І и 551 І. Участки полилинкера между ВатН І и 551 | бьіли введень в производную полученной вьіше плазмидьі рТо7457 и расщепленной:ферментами рестрикции ВатнН І и 5511.

Новая полученная плазмида содержит участки Рми ІЇ, Ніпа Ії, Ватн І, Есог І, Хвба І, та І, ВО! Ії, 55! («ас І),

МІи І, Ам ІЇ, ЕсоВ І, пав І, Мої І, пав І, Рми І.

Указанная новая плазмида бьіла расщеплена ферментами рестрикции Ва) ІІ и Ніпа Ії, а фрагмент Ваї 11-

Ніпа І, содержащий промотор РОК (МК. А. Нішетап с соавторами, Мисіеїс Асіа5 Кев., 10, 7791, 1982г.; 0.

І оїзоп с соавторами, уеаві, 5, 497, 1989г.) биіл введен в неєе для получения плазмидьі РТО10014 (рисунок 15). 3. Субклонирование промоторов а) Промотор СУСІ1

Участки полилинкера между ВатнН І! и 55ї І плазмидьі рто7453 бьіли введеньі в производную плазмидь! рто745, как указано вьіше. Новая полученная плазмида бьіла расщеплена ферментом рестрикции 5Зпав І, а затем для получения плазмидь ртс7503 бьіл введен фрагмент Еза 1-Ога | из 456п.о. плазмидь! РЕМВІ 8 (І.

Вепе с соавторами, Мисіеїс Асіа Кев., 11, 1645, 1983г.), содержащий точку начала репликации фага ЇЇ.

Фрагмент Ватн І! Ніпа Ії из 0,7втьїс. пар оснований плазмидьї равесСсо-9, полученньйй в Примере 6 патентной заявки ЕЗС ЕРОЗ340378, содержащий промотор СМУС1 5, сегемізіає, полилинкер и лактазньй терминатор К. Іасі5, бьиіл субклонирован в плазмиде рто7503, расщепленной ферментами рестрикции Ніпа ЇЇ и Ватн І для получения плазмидьі рТо10004 (рисунок 16).

Затем участки Хпо І и Мій І промотора СУС1 бьли удаленьй методом направленного мутагенеза двухцепочечной ДНК плазмидь рто10004, с использованием следующих олигонуклеотидов:

У ГЦІТАТЦІТЦ ТЦГААГАТІТ ЦЦТОЦТЦГТТ ГІТЦТІГАТЦ 3" 5ЕО Ір Ме 24.

Полученная таким образом плазмида рто10005 бьіла затем расщеплена ферментами рестрикции заїїЇ и

Хпо І, после чего бьіл введен участок Міс І, с использованием следующих олигонуклеотидов:

У ТЦГАЦІГАЦІ ЦГТГГО 3 БЕО І Мо 25 й

У ТЦГАЦЦАЦІЦ ГЦ У 5ЕО Ір Мо 26 для получения плазмидьі рто10006, б) Промотор СА 10/СЖС1

Плазмида руеррР1/8-2 (С. Сшп с соавторами. Сепе, 203, 1988г.) била раскрьта с помощью фермента рестрикции Хпо І, Созданнье связующие концьі бьли свернуть с помощью фрагмента Кленова ДНК- полимеразьї, а затем плазмида бьла вновь лигирована. Полученная таким образом плазмида ртс10010, в которой промотор СА 10/СУС1 уже не содержал участка Хпо І используется в качестве матриць! для амплификации методом РОС. 4. Конструирование вектора зкспрессии рто10031

Оставшаяся часть кодирующей последовательности Іас7 бьіла удалена в плазмиде рто7503 с помощью направленного метода мутагенеза, с использованием следующих олигонуклеотидов:

У ТІТЦЦІтЦІТ ТТТАЦТЦЦІГ ПГПЦТГАТГЦ ТГТАТ У /8ЕО 1 Ме 27 для получения плазмидьі рто7549.

Промотор Іас7, присутствующий в плазмиде рто7549, бьіл затем подвергнут делеции с использованием следующих олигонуклеотидов:

У ГГЦЦЕЦАААА ПЦААА 3 5ЕО І Ме зви

АГІТТТТТГТ То У 5ЕО Ір М 29 которье затем вводятся в плазмиду, предварительно расщепленную ферментами рестрикции Мої | и Ніпа

І, и восстанавливают оба участка для получения плазмидьі рто7553.

Один фрагмент Ватн І Міси І, содержащий промотор СУС, бьіл получен на основе плазмидьі рто10006, расщепленной ферментами рестрикции Ваптн І и Міс І, а один фрагмент Міс І Ніпа Ії, содержащий промотор

РОК, бьл изолирован из плазмидьії рТо10015, расщепленной ферментами рестрикции Мій | и Ніпа 1. На указанньїх двух фрагментах бьло вьіполнено лигированиеє, а полученньйй продукт лигирования бьл введен в плазмиду рто7553, предварительно расщепленную ферментами рестрикции Міс | и Ніпа ПП.

Следующий олигонуклеотид:

У ГАТЦТАТЦІА ТГЦТТЦЦІЦІ з 5ЕО ІЮ Ле 30 гибридизированньйй со следующим олигонуклеотидом:

Х НГУ НШНАТНЕАТА ВОЮ ЗЕ образующий линкер ВатН !І Мій І. содержащий участки Сіа | и Мої І, бьіл добавлен и подвергнут дотированию для получения вектора зкспрессии р/о10031 (рисунок 17).

Фрагмент, амплифицированньй методом РОК, полученньй вьше из плазмидьй руерР1/8-2, бьл расщеплен ферментами рестрикции Сіа І. и з5аї І, а затем бьіл введен в плазмиду рТо10031І, предварительно расщепленную теми же ферментами рестрикции для получения плазмидьі рТо10033 (рисунок 18).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(1) ОБШАЯ ИНФОРМАЦИЯ (І) ЗАЯВИТЕЛЬ: (А) Наименование" РУССЕЛ УКЛАФ (Б) Улица: Рут де Нуази, 102 (В) Город: РОМЕНВИЛЬ (Д) Страна: ФРАНЦИЯ (Е) Почтовьй код:93230 (Ж) Телефон: 49.91.49.91 (3) Телефакс: 49.91.46.10 (І) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Последовательность ДНК, кодирующая белок А. талианьії, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, белок дельта-7 Ред, метод их получения, трансформированнье дрожжевье штаммь!, видь! их применения. (Н) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 31 (ІМ) ФОРМА, ЧИТАЕМАЯ КОМПЬЮТЕРОМ: (А) Тип носителя: Дискета (Б) Компьютер: Совместимьій с ІВМ РС (В) Опер, система: РС-0О5/М5-0О5 (Г) Програм, обеспеч.: Раїепіп КеІеазе 21.0, вариант Ж1.30 (ОЕВ) (МІ) ДАННЬЕ О ПРЕДЬІДУЩЕЙ ЗАЯВКЕ: (А) Номер заявки: ЕК9501723 (Б) Дата подачи: 15 февраля 1995г. (МІ) ДАННЬЕ О ПРЕДЬІДУЩЕЙ ЗАЯВКЕ: (А) Номер заявки: ЕК 9506517 (Б) Дата подачи: 01 июня 1995Гг. (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме1 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 1496 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: ДНКкК (МІ) ПРОИСХОЖДЕНИЕ: (А) Организм: Арабидопсис талиана (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен.Ключ: СО5 (Б) Местонахождение: 76..1365 (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме1:

ТТЕТГАТТАА ОТРАГЕТЦАА НАЦАГАТОАЄ АЖТЦТКАЄРЦ ЗТТРРЦЦСАЄ о АЦТААГАГАА 5о

ААРЦАГААГА ОАГААА АТРОГЦІ ЖАЄ АЦТ ГТА ПАТ ОТУТ г АатцогтТ АЦТ ТАКО п

Мет Але лу Тре Зало Ге; вро Лро Мне ВалоТре Тир 1 ВІ 15 гуд ТЦ АТО РА ЩЕ ТР ЦІ ГЦ ЦО г БДА Цут РИ: ГО АТТ ЦІ 155

Ана бер Мах лей бор лей Вей Ала Фея ЦЧиб Про Пре Фен Поло Нле Лей 18 20 25

ЦТЯ ЛГ ОЖАМОАЦА АТО РТ АТ ЦАГ ОАЄ ГТ ЦТ Гр ОАЦТ НАС АТ 8 лей ль тир оТре Мет Явя Гб Гльо Ася ТГли бей Бах ре бли ре Фен

Зо ЗЕ п

ТЛО ТТ РО ТАГОАДЖ ГА ГТ НАХ УГА ОЦЕТ АТО ААЦ АТА ТОГО А 258

Тли Фен фея ТейоГлу Аєм ля Ввло тям бли Лей Мле жсно Мле Тра бро! 45 50 Кк 80

КГА ЦИЦ ОА Я АТР ТЦ ТЕС АЛЛА АТТОАТА ТС ОТ ОТАТ ггА ГІ ОЛТТ З03

Жпс Про ре Лей бле Але Тра Лоз Мле йле фено Цисо Тир о ле Ада бен 65 то 75 гай Цт АГТ ЦТТ ЦАС ТЯ ЦОГО НЦТ БЕК ЖАВ АГА БО ОГАГОЯГО ЦуА З їлу пи йле Лей Глю Лей Лей Лей йро їли их лре Вай ГТву Тли Про 5 59.

АТА ЛЦІ ЧА ГЦ ОСГА ААНОЦА ЦНА ТТ ОТАЦОААГ ОТЦІ ОААТ ГОЛО КЦЕ 399

Млб бей Про из Гли Аби бро Про бяп Тер Яма: Ала ся бли лЛюй Ав

За 100 105

ГТ ОТАЦ ТТ ГР ОАЦА ТА ТЦА АБО АТО ЩТТ г ЦО ТРГО р ОТО ГгА ЩА спа Тир Фен Вал Тр лей Дяз Тре бис лей ГТля Лек Три Тр Феноїло 1 п 120

АТЦ ТТН ААНО ЦЦТОГЯА АТ ОТ ОтТАТ АТО ЦАНО ТУГО ГТ ГАК ОАТА ГЕ ОТ 95

Мле фен сно про дла сйле Валотир Аспобиб Лей Глю Глу пе обено Сер. 125 180 135 145

ТНА ТА КАТА ЗТ ГРА АРІ. ТО АТА ОТ ОТО ОЖУТ ЗТ ЛУгОТАЦОАТА АВК Б

Ала ЙшйЙ Упе фено Гли бер Фен ле бен Цис ВахоЛей Лей ЛийоМле о лЛиз за8 то л5.

ТРЦ ОЦАТ ГТ СЦА ЩЩУ ТЦА ЩА АТО ГАЦО ТЦК ТС А. ДТ ОТРТ АЛ ЦЕЙ. Бону

Бяй ис Вай дя про бер бер бро Аст бер їли бер Циб блю ся лей 150 155 т

АКТА АРІ ГАЦ ОТ ТАТО ЦО АТР ТАРОТТТ ТАЦО ВНІ ГА АТ ОТТО Аг 598

Мле Йле Абло фено Лепо Тра о бла Мет о їлу Лейо Твро бро йрк ле Го Ци

Я іо 185

АГЦО ТТ БА ОАТЦОААГО ГТК ОЛТТЕ АЦТ ААТ О ТЕО АГА ЛО ТГА АТР АТО ТЦ 57

Сер бен Ас! ле Люез бали фен оре сю Цис АрбоФфвяо бли Квт Мет Свро 180 155 200

ФГ ОНА ТЕ ОЦТТ СЦА ТЦ АБО ТАК ОТГ АТА ЗАЛА ОНАГОЛАТ ЕАА АТА АДУ 735

Тви Ана Ван оЛей дна Лалоїре Тир о Цис лю Лиз умо Лир лу ле Ас по5 то 215 2920

ТПЦрОААА ТА ТЦТ ГА ЩА АТР ОЦЕгО СІ ААУ ОАЦИ АТО ЦТРОАТ ЦЕ ОСТ 793

Гли Лиз Вап.обей спо бСер Меє Льй вра сно ре йлв Лев ех Лей Вал 225 230 235.

ТАТ ТТ АЦА ААА ОТТО ЛІЦ ТРК ІГЕОГАА ЕЩДУ ЕГО ТАТ ГР ААЦОАЦУО АТЕ 833

Чив о бапобре биз бок о фено Три Три бу дя бли Тир тру бно тТобо Мох 240 245. 25

ТАЙ ОАТТ ГА АТО ГАЦОЦТА СЦЕ ГРА ТЦ ОТАХ АТА ТЕЦ ЖРС ОТ ОЛІТ цА ГУ

АспоМлє на Гис бспоАре Ана Тли Фвя бер бле Цео ро гли Щисо Лей

БЕ 269 т855 сТГОТге РЕ дО ЦЕ т ЗАД ОАЦТ ТИТ ЦВА ГІ АТО ТАЦ ОЦК ГЕО ЛА 921

Вап ре Ваз бло бер оЯбвя Тир оре бер Про Гли Мет Тир Лей Вал.о Ас 278 215 280.

ЦАЦ ОУН ОТ ТАК ОН ОггА АЦІ ЦАЄ ТТГОСЦА ТА ТАЦОАТТ ЦОГО т

Кий бро оВЗзлоїлу Лей ли Тре бля лей Ада ве Тир ле лей Вало Аля 785 290 св Зо

ГРА АРТ ЩІ ТЕЦ О АТ ТАНОАТА ААРОСАТ ГАЦОСТ ГАК АГА ЦАА АГРОЦАА 1053 гли йле Лей Цис ле Тмр йре Люз Тив о Асе ЩЦиб ло Арг бли Арго бля 05 ваз ря

ТАГОЩ го АРГО АНА ААЦО ГГ ОААА ТОТОТТЕ гТТ ОТГ КсА АСА ЩЕ ОЦЦЕ Обі

Глу Фен Арго дого Тре Демо ли Лиз Пк Лей о Лей Трпоїбпи Аг оАла Пра 329 25 30

ТА ААГОАТР КТГО ГЦ ЩО ТАТ АЦТ АНА АША ТЦТ ТЕТ ТАА АЦТ ОАВА АЦТ ОВ бер Лиа Мле Балодла бер Тир Трео Тро Тре Сер Сай о блу Тре Диз тре 335 о 345

АТО ЦІН ТА АЦ ЦО ТА ТОЛІ ОбгА ОТТО ЦЕ ЦО ЦАК ТО ЦАТО з157

Сер лей Лей ей Тре бер ни Тр Тря Гли Лей лаз Арго Гиб о бея Таб зба Зо

ТАТ СТР ОЦЕ ГАСОАЖ ТтТА АгТ гу тот тТргОАЦЦО ТА ЦДГОуТ ут 1215

Тиб Ваня. Про Глу Мово Лей бер Аля фен бен три Тре Вай Про Ала Лей зба Зо. 375 зи

ЖЕ ОРАР ОА тт ЛТГОРЦА тАЦ тт тА ОСТ Цтц АЦУ ЦТК ТТ ОЦІ тт, 963

Фен дбпо Ася ФеноЛеай яз Тко Ффеу Лиро бло лей Тов лай йей Лай ен

З85 390 55

ТАТ ЦГА ГЦ ВАГ О АГА гАЦОАТ ГАЦО ГА ГЦ ОЦРА ТА ЛАГО ТАТ ОЇ АКА 1511

Асп орг о йдя Лиз Арго ойбсп дсп о Аси Арго Цис Абе обвроЛиз Тийпо бли Лиз зоб 405 о

ТАТ ТЕ ААГО ТО ТАТ ТРК АР ОЖАА РИ; АКА ТАЦОАРГОАКЦ АРТ ЧЕ гТА 7355 тМма Тов Лиз лей Ти Цис ву Ляз бай из било Адо ййє Мло Пра гли 415 424 425

ТТ ТАТО ТРАТТТААЦО ТААСТЦИСТТ. ТТЕЕЩАТТТ ТИТАЦТСАТТО АЦГЕТААТТ 1 ле тир «80

РААЦІТТСГА АТИАТЧАААА. ГАШГАГОЦА ААДЦААДАКТ ГУАВАТТГАТ ГУГАТАГАЦА 1А75

ТІЦТЕТЕЄЦТ СБААЛАДАКАХ А 1486 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме2 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 430 аминоксилот (Б) Тип: Аминоксилота (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/: Белок (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме2:

Мет Ала лу Тр бан ис обер бро Мне бапоТре Тед Ана бер Мет Вей 7 5 М ла

Сер дей Лей Ал фено Цис Про Яро бен обало не вий в4 ей їн оре

Нет балоГнб Ге Ас бли бер ббя ЛТре Гаю Тре Фен Гли фюм фено Тря

ЗЕ 49 ча

Гм Асно ни Явло бив Гли ДюйЙ Мле Абно ле рпо Про сАрс про тре лей 5В 50. ле ала Тря ил Мне Хле Фен Цкс Лкр оди па фен оГлу Ала Мне лей б5 7 75 а

Ган лей Лей Дей Про Гле Лиз Арго Балоглу Глб Пов бла Седо Пройде

В 90 95.

Гляю дснодбрг о Лро бло Тир оЛиз Ала бов бли Лей бла Аля бив Фан вл 100 т05 тю

Тре Лей Алла Тре Тис Люй їли Лей Трп о бТрп феноли Мле Фен Ася Про ть 125 125

Ала ле бап Тир дей ис Лей їли Глу ле Фен Сер Аля Лек ре обн за 135 чай

Гай бер Фен ве сен Циє Пвшя Лей Лей кр оМЙле Лезо пи Габобало ла 148 150 155 160

Мро бер осСеро свя дсп обвро блю бер о Цисобйи дскоЛей хе Мле ся Фен в то зб

Тип ТрпоБли Мет лу Лей Тяр бло Арбо бле Гл Лиз Серо Фен Лепо йле тво їв5 то

Лаз Було оФфен о Тре дсп о Цис ре фено бук о Кеу Кех Сер обїри ла Вело йей 135 200 205 фла ВалобТре їжа Циб Яке из Глю ЛТироГлу ів Аби о Гои Ява Вало бер ма 5 220

Аси Сер Мет Лей Вади сно Тра Йле Лея ет ей Бай Тир Зап бро Лиз 225 250 І35 24

Фев ен Три Тря лу дла ля Тир о Тр ско Тре Мет дспойле ла ис гав 250 255

Депо Аве обла Гди Фен Тир пе Цес о Тря ми Бис Лей Вся Тра бало йро 289. 255, 219

Сер ойбйзло тТьпо тре обей Пра бля Кек тир о Лей бЯдо Ас бий про Вал о Слх 275 280 288

Лев ТГлй Тре Ган о Лей Ара пе Тир йлз лей Бах Ала Типи Мле дей Чия

Зо 285 зо

Мле Емройлш Лиз Тир оася Циб дсп о дб блноАре бон о Блу Фен оре Арг 305 то Мо 320

Тре АСВ лю Лиз Цис Лей Важ Тахо Гле йргоАйа Про боро оЛиаз ле Вал 325 За З35.

Ана бею лЛио Тре Тре Тре бер Гли Єлу Тре.Лиз бТре Сер лей лей лей: 340 дБ 350

Жре Обев Гли їря бра ви ой ла Абгобис фено бис ТяроВапо Пра Глу аБ5 з Зв5 йле Лей ев два фен фено ри Тов Вяй бро лаз пейо фено асп о Асно фон 370 ЗВ ЗО

Дей ка Тир Фен о Тир бал лей тре Лей Дей Дей обеноАоп Арго Апла Лиз 435 зво З95 400

Как осАби дсп бло брт о Миб ре ПЕроЛиз Тир оГви Яма Чи їре Ли Ле «05 ч10 4в

Тиб Нас оГля Лаз Шай Люз Тир Арго йле ле Про ями. ле мир 480 ча «30 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО МеЗ () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 15 аминоксилот (Б) Тип: Аминоксилота (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Пептид (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: Пептид (Б) Местонахождение: 7 (Г) Проч. информация: /поїе- «остаток 7-Тгр или Туг» (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: Пептид (Б) Местонахождение: 12 (Г) Проч. информация: /поїе- «остаток 12-НІів или Гуз» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мез:

Лей Лей Хаа Хаз Гля Топ Хаа Глй о Хаз Хва Арго Хна Хза Хаа Тер у З Зо 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме4 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 29 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс ГТеашге (Б) Местонахождение: 10..29 (Г) Проч. информация: /поїе-«Последоват. ІЮ Ме1 от 76 до 95» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мед:

ЦГЦГГАТЦЦА ТГГЦГГАГАЦ ТГТТАЦАТТЦ 29 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме5 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 28 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ:тізсіеатге (Б) Местонахождение: 10..28 (Г) Проч. информация: /поїе-«Последоват. ІЮ Ме1 Дополнит, от 1350 до 1368» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме5:

ЦАГГГТАЦЦТ ЦААТАААТЦ ЦЦГГААТТГ 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Моб () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 23 парьї оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адПезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс ГТеашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..23)

(ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Моб:

ГАТТАЦГЦЦА АГЦТТТЦГА ААЦ 23 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме7 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 29 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме7:

АГАТЦТТГАГ ААГАТГЦГГЦ ЦАГЦААААЦ 29 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Мев () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 46 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /лаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме8:

ГГГГАТЦЦІТ ГГТЦГАЦГТА АТТТАГТТ ТТГ 46

ТГТАТТТГ ТТГ

(2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме9 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 17 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ІХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізсіеайтге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..17) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме9:

ГТААААЦГАЦ ГГЦЦАГТ 17 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме10 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 25 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме10:

ТТГААГПТЦ ААЦАТЦААТТ ГАТТ 25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме11 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 38 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..38) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме11: г уггу цгуцтуЦцттг тЦцААТАТТАА ТГТАААГ Зв (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме12 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 34 парьї оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме12:

ЦААГГАГГЦГ ГЦУЦГЦЦАЦАЦ АААААПТАГ ПІТ 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме13

() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 25 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..25) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме13:

ТЦТЦТТЦуЦЦ ТАГААЦЦТТЦ ТТАТГ 25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме14 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 20 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..20) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мо14:

ТАЦАТТАГГТ ЦЦТТТГТАГЦ 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме15 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 25 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме15:

ГЦГЦТЦАГЦГ ГЦЦГЦТТТуЦ АГТЦГ 25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме16 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 21 пара оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме16:

ААТТГЦГГЦЦ ГЦГТАЦІТАТ ГГ 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме17 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 21 пара оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..21) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме17:

ААТТЦАТАЦГ ТАЦГЦГГЦЦГ Ц 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме18 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 14 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезс-«ОПЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме18:

ЦААЦГЦГТЦЦ ТАГГ 14 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме19 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

(А) Длина: 22 парьї оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теайшге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..22) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме19:

ААТТЦЦТАГГ АЦГЦГТТГАГ ЦТ 22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме20 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 33 парьї оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мое20:

ГАТЦЦГЦАГА ТАТЦАТЦТАГ АТЦЦЦГГГТА ГАТ 33 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме21 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 39 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..39) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме21:

АГАГЦТЦААГ АТЦТАЦЦЦГГ ГАТЦТАГАТГ АТАТЦТГЦГ 39 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме22 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 34 парьї оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезс-«ОПЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мо22:

ЦТТГАГЦТЦТ АЦГЦАГЦТГГ ТЦГАЦАЦЦТА ГГАГ 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме23 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 28 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..28) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме23:

ААТТЦТЦЦТА ГПТТЦГАЦЦ АГЦТГЦІТ 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме24 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 40 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /лаехс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мо24:

ГЦГГАТЦТГЦ ТЦГААГАТТГ ЦЦТГуЩПТт ГГГЦТТГАТЦ 40 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме25 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 15 пар оснований

(Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мое25:

ТЦГАЦГГАЦГ ЦГТГГ 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме26 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 14 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ: Другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теайшге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..14) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме26:

ТЦГАЦЦАЦГЦ ГТЦЦ 14 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме27 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 35 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме27:

ТГгуЦцгТЦІ ТТТАЦТЦЦТГ ЦГЦЦТГАТГЦ ГГТАТ 35 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме28 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 15 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мое28:

ГГІЦЦГЦАААА ЦЦААА 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме29 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 15 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеиновая

А) Описание: /лпезс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наймен./Ключ: тізс Теайшге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..15) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Мо29:

АГЦТТтТТГ ТТТГЦ 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Мез0 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 20 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота (А) Описание: /адаезхс-«ОЛИГОНУКЛЕОТИД» (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МеЗ0:

ГАТЦТАТЦГА ТТЦГГЦЦГЦГ 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО 5ЕО ІО Ме31 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 20 пар оснований (Б) Тип: Нуклеотид (В) Число нитей: Простое (Г) Конфигурация: Линейная (І) ТИП МОЛЕКУЛЬ/!: Другая нуклеийновая кислота

(А) Описание: /де5с « «ЧЛИГОНУКЛЕОТИД»

ЇХ) ХАРАКТЕРИСТИКИ: (А) Наиймен./Ключ: тізс ГТеашге (Б) Местонахождение: Дополнит. (1..20) (ХІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО Ме31:

ЦГЦГЦгГуггЦ ЦГЦАТЦГАТА 20

У 2 1 х воль Е щ й Бо В 255 й к я камиастерци : 5 З ці (бив) ; дини

Е Кі 7 заг ї є клон ой

ОВ ; і содою ЗО: нм п. Б ння В гм : пен п п п в В 10 12 34 18 времи (мин

РВСУНОК 12

БОолЕї 0.03 г ї зресеїй 1 пат , 5-2 днен асом Во 4 тт зрисста 5 вн Зо В ї Н ЕЖ1б78 З поз Ей й т у 1 в.о - ши: сення і З ; ? 1 ве : в

Е В, | клон 22 1 оо - я 2100 2305 28500 б700 2960 ЗНню З вон (5 пруиувсльнимх вдимиНхх

РИСУНОК Ю

Кі

Я п : і і " "

Що !

РИСУНОК 7

ТП ТТАРІВА ТТАБТНЯМ ПАНАГАТНА акта ЖТНТНИКА АНА АКА з

ААГЗаГАМ а МААМ АЛЕ ГМО ТАКО АНІ ІТА НАХ ТЦ ННІ ОАТН ОЖТК АН ОТАВ

Мих их їз м ВМ пхоїхро Ше Мо Яке сСбріо Тк:

Н у Не

ГА ТБ АТО ТА БЕ ВІТ ЦО ТНН ТВ ЗР Не и Зжу ЖІ МК ВО 1 хх їмхроО МК б їхро й БИ АФ ее Пк: ху Про ме йо мо свй їй Е х

Цта т АЮ аца АТ ІТТ НАХ МДАБОГТАТ ТрЕ ОТ БТІ АЦТ ВМОАНН ОЇ що

МхйОфре їх» бро Маиб хх 105 бот осмамо їде їх Бах Тр: блю бро фея

КІ ке Я ящОт ТОМУ ТАС АХ ПАЇ НдА РА ЦЕР АН АУП АЛЛА ТО ВОД ІЙ їмє Цех обме Лем о їху ємо Тахо вх змо где ба о Мхе г На Тр Ве в Б 5 їх

ВА ОЦІ АЦЯ ЗО АТХ ДЖ ОК Ада АТІ АТА ЗУ ЗОБА Ж їтА ї1щА ОТ ОЗ ам йрх би ЮЖ бе лях Трмо дя: Бе йо; бе Ци бир їх лях б - т т5

НСХУ НЗОК Й Й

ТАА ТНРОАРУ НТ МАР ШІ ВТ: ЦІЮ ЗИМОЇРЕ ЗАЙ ОАРА ІТТ ТАЄ ОЇЖ МА З їз да хо Лю бе їх /юЬ дев Мр» їхх Чех Яр Ве Ї25 бхео Про

БУ хх о хі» ЗМІ ща ГЦ Ота ОАМОНРА ЦЯ БТІ тТАЦОЗАТ ОВ АЖ ІТТ БИ ОТНК ОЗ

Яхмо ух пох ох їхе мо лАМмоО про ЩШУб їх п дм мо Тух Любо АХ

КУ Я М

ТТ ОАНОУТ БЖ ОАЦЯ МТА ца АІЕОБАЖ ОЦЕ ОБР ЯКО ЖЕО ЛгУ тота жи йо Жме ех о Вмб їм й Ам бої Лех Тен Лех бух Трх Фк їхе т Не їк

АТ ОТНР АЛ ЩУТ РША АКТ ОТО ХУ ТАЙ ПАЮ ТИ РКК ТА АЧА ТЕ ОЯНЕ ла

Щка сфе хи бро ла Бім. хо Зих ом: Зх Дю їз лу Мк о бхх хг її Ж їх І

Їж міх АЖА ТІМ ОЗгА АБИ ОЖУВ ОАХА УРУ ПЖ ЖК їТ5 СК ТАЦ ОАТЯ Ам ОЗИ йо цк Му мМ о ї3х хро фе хх Мих Мк бЯго ЖЕ Лю бі Мо ле

З п --

ТТ ет гТТО ТНА МБТ ТЦА ЯНА АТО ТАЗ ТМТ ОКО ТИХ ЗРЖ ТЕТ ЗАВ ОНТЯ З їщє їж Зм дало 3ую сСоросхв см де» їх бо СМ Цю бю хх Же мо т а

ВЯСУНОК ЗІ

«т ТІ А ТТН оч; ТО ТИ АТ рМО ТЕ ТАБ ОБЦТ ЩА АЖ ЖГТ лаг Же

БЕео Щлє дкб фею емо СБТре її? Мох Гху Лю Яке фр; хм о Ме бю Лю пе Пк ї5х

ЗМ ОТ ОТАЦ АВ ААЄ ГО ТО АЩІ ЛАТ ЦО АБУ ОТ гтаА АТО АТО ОВ схе ме де Ме лах В ки мм мх бр бу б йхмо Ум хх о їхв

У НАУ хе

ЩО МАО ЕТ ЦтТР КцА ГУЦ АНТ ЗАКО ТУМ АТА АКА О НАЖ ЗАЖ ТАМ АРА ОАЖЖ ОО

Лех Ах Вп о лев зом ба бр бер бх Ву Дю гло їмро бу ж йо

ЩО м М КУ

МЛ лам ЇТА ЧИрохАТ БА АТО НЯ ОТО ДА МИ ОА ТР АБОРТ ОКО

Так мі ехо сором бе о Ме» Лев бо йох о Тр Маю Ко Хе ох бе

МЕ ї5 їх їх ЇВ ад» ллл ЩІТБОЗТ ТИ У ЖААО ГОЮ ТРЕК ТАТ ІК лЛАКОАНИ АХ КАТ

Те Якоб.» Лю» офхе ФУмо стро. Трмо хх бля їдм о їх» Три ойхе Тр мех мо рої Ме

ТАЦОАТЕЖ ПА ВАТ ТАБ ОБРА ТТ ІТ; ТИ ТАТ ТА ТВО ЗКРЕ О ЕКО Вб ШПта ще ми Мо Алею їм: АМО йМмО (хо га ех о бхк Му їВМмо їх їх фею Лех 2 ща КУ

ТНСУНОК з

ТТЕ ОР ІТ ЩІК лЦт ги АН АНТ ЗТ ЦИА ОБО АТО ТАБ ОНР ОБ АМ ОЯЖ

Шио Зх йо Бюе «се ба Їм бує СМ м. їм Ме Тхр Жх бо мк

КО х мо

ШАМ ОНИ ІТИ ТаА ТЦ ОА МТ ОНА Ж ЩА ХАТА ЗАЧ ОАТЕ ЗМО ОРТЖ ТА ЖК їж їбе Жиєб їду лу бл бує сл ЗХ лю ММ їм; Ммо ЯМ ій Ак м тк хо. КН

Полож о дт по АТР ТЧУ АЖ ЛАК О ЗАТ ІА СТ ГАК ОМА ЩА АК ОВМА ПХ йо Ми лез вх о бб сбжЖу Мхе лм: 3 мк о Чуб ою др їх уко ре хх за КНУ

ТАЖ ОТ ЖК АРК ОАЦУ МО ОТ Ада ЧТ ТЕО г г о (црх мА ТВ ЯК оч жо Яка мо ж би мо їй луг Цю Ле йо їх хо бжо хх Це

ЗА Б Я

Я» лаї тр Ой рщрОтуК ТАТ АВ МЕ АНЯ ТНК БТ о Іх5 ацТ АаАОЗНЕ ОЦЕ

Тл лох Жум же Ах ле бе їр о бх 1 їх о їй» їх ої?» Лем ту

АХ м зе

ТОБТО ВТ ОТ ОТЦІ МА ЩОБ ОА СЕ ГНЕ ЩЕ ОмаУ пт ОКО Н бе пед лев Я йжо хи обме їх Зре їх Лех Ах мо їх Ме бе

КУ У КУ

РНСУВОК Х

ТАЖ ТТ БЦ гАГО АТЦ ТТА АБ ОФИТ ТИ Оті ЛК А ачЧА ЯЗИК ОТ ЩО ШЕ бхко лето Мує блю о Кое Лейо бе о Фен осїжно Три Зуб Вк: Пре А Ле ча 3 їх ОЗ

ЖІ ОТАР ОАВОЛТИ КО 1ЦА ЗАНОТІЦ ТАКІ ЦИ АЦО МТ ПІЖ НІВ ОЖТР ЗМО

Лем ом див бе лм слмо Тщо Ям їмо їмо ОДюЕЙ Тр» Де сїжй Любо Чех лх тку ме

ТАТ ЦРА ТМЦ ОЗАГ АГА ТАВОТАТ ТАМ ОВІА БЦОЩА ЗЦО АЗЕ О ТАТ ТРАВА ОМ й ою Ах пк Амос: юн о йо Ам Ме: сук У Дю» ПТям о ах: Люх ад ах Я

ТУР ТЕР О АЛЕ ОЩУГ ТАТ ОТТО БАК йаАОГТЬ МА ТАЦО АТО АТЦОем не г пе

Йїже Лем о Лех Лю Тв Миб зу Люх Вк одву ЧЯме ми Мо» бе о Пує ле рАяУ Б ау

ТІ ТАЖ ЗКАУЛТАХЦО ТАМІИСІТКТХ КРИХТ ЗЦЖАНІТАТУ пгт ТАМУТИ че

Ме че «о

ТАМ ТИТА АІМАТИАААА ТАШШТАЄННА АЗАЦААЖАХУ ГИЗАМТІТАТ ГМТАЖТАТАЦА 1375

ПЕТ Я гАалаААА А

ВНСУНИК ЗА

Ф її « вопкт ї

М

0.1 г Не і їв

І 5

І з

Е ЕЯ

808 5

Н Я « ї 2 і Е 2,008 Кк Х 5

НІ вх г ї ФВ в

Ії в Е р

Н -У ЕЕ, ; 5

Ї Е ЖЕНЯ

Е о. й зоог І ни Не; : а й К/1 а

Г ре ГІ й Це і в Е- ХА но М данний 15 14 16 18 КІ врема імині

РИСУНОК Я вольх : прегненолон і оо3Е О - :

Е х а я і ій о Ф 5 1 0,025 г 5 «т Е г ф х І

Е : в ві 1 0,02 КЕ Ж М. ві

В І ГУ 1 їі - | З 3 0,015 2 :

М 1 о г ; Е 0,005 г ! 4 ' Я оо сет енже. Мини кю Кн СО НКЯ о 500 1000 1500 2000 2500 3000 время (мин. ж 1072)

РИСУНОК 5а вольт ; прегненолон й 5 оо: М о ж Го с: че 5) 0025 г | І Е : і | щ не БЯ і 002 у й Е ж В ; г (5) 0,015 г зі А я в. г і. 4

Од г с З 0,005 г І ї Л 1

Ге і : і дет жввня ше ий добові У б Пес Мк й наривів і ча о 500 1000 1500 2000 2500 3000 время (мин. сх 107)

РИСУНОК 56 вольт - прегвенолом 1 0,03 Е 4 г ; 5 і 0,025 г | 5 4 1

З . Зх Е 0,02 і в 4 » і 5 1 й ї я 1

Фо15 г у. їх 4

Фо 1 бо Ів. 8 Е в 1 0,005 В і Е 0 ес с рн с Агент наве 0 500 1000 1500 2000 2500. 3000 время (мин. х 10

РИСУНОК 5в з М ер опцій

Ше У й ще» щ їж д авля. | ропеветня І

Є рвв кв ДГ Ватні і 2 св

У Ка: імнежестваНимИ

У - участох клагвлонаниий

Сокіой Й

ВАК двтні у

Ватні ' Ван ло

Сол зни ст ен рбіцезещи КВ ра й Ж КЗ

Вей Вів

АБЕВ вагацьк ї клоун огідій т ве СІ" Ніпон (ват) щ- л- вена ання. рВя-АрЕ З ї АОЕ ій КО

Пк ї же ВСМ Я р й сера : - ниоННоті ще, НВО бОКіші

ТМСЕНОК

ВБАБЛИУСТС

ВЕО Ю аску стерня КТ ли пеодукєтаза

Ні

ВАЗ й ; дельта 7/ИВ ; х вок х ї

КК ЗБОНО пев ! вся ви роділастеї ТРОК зі : стврин А 7. д-падуктаза ;

ША ТАВЕЕ 07000 Я пигация т пе

І Ар? / 4: Ніваів пеки опідіп РОК ампя;ї, кас ї сторян їх 7 ї До рекуктаза

РАЮ АХ Мило 8 мок 0 нов ря Є ра Ех

Ззаеи ; раАЮНУСУСІ

СОЯ ог ; ЩІ. ніган поглощение Мегки вв М дрез

АршВ вок стерин А 7 І дОБо редуюєювла РОЗАБТЄЧС

РИСУНОК ба торт З - І дення Зргостя Б-22 диен З-оп у Сл як аргон Бе7- Во тривн Зб і , І ок скюй сргостарня)

Е й й й - й м пат, ри І 77 аргости 5. ен З-ол и і - х є в 5 г

З Е

) :

РИСУНОК ОЇ см ВІ щ си -

Ед унанни ен св й Ше Ей ери

М се чаш -

З ЕВ М Б ск ре а в Ми Еш В е В ши я ШЕ ш ВОЗ т

Ф 7 ка ЕЇ ми жо що 7 В х Ж в й Зх

Б х ї -і 2 Ва т ще 5 ж Е І я

Е | Ен жнн-н р в ІЗ 2 ж, - ш Е . Ж вд

ІЗ З «о лж м

ГІ ЖЕ КІ 3ї г: Бе й й жа ї г 1 сис м

З зх х ж а Се 12 Ех ве т

Що ; 5 т З щу Кк

З Зозех со | Ж

Я ще їх до Е ї ї роз

РИСУНОК 5

Мой участок инесврции храї

Ар у «ом ігце

РА ка

Во ак. 9 п Вес

Мой Мо

РИСУНОК 9а.

; чай-Ватні фовгаяені

У1ЗАПХ рОР1ІО034

Бас Ва

ПОЕЛККНЕНИЄ сло ч18-АСТ поглощенне ро 10033 Ні фовЕнезнт ри Ав ач

В й тер РОК де Б 5 . ; РОР'ООЗ дз вся зо х

АВ М. стер яви пор рус АПА й я дей

ВУ ро АНІ-АЄСЇ реіше-бБепрі КО «Ффрагмане ває поглощенив вом ме ой заз о даййлсуєт Ж, де Ба

ГЕО рСОБО хо ух БУ

У м

РИСУНОК У дою шк я

Модна :

См Мой рЕС26со рсрбо пн Мой фрагмент

МОЙ поглощениє

Храї тт оВаВ

Ван Є я рербаг-1 із? . ій 7 м ВЕК

Мі й й тергРок ее дай Олсусі димог б. АН Й сення КВ Во и ве / х

Ї і я ОВ вва РСОба-е ов у" свя

Мої ї;

Мох «- терувк дек зо до 4

РИСУНОК 9в клі ря два РОК май

Бена ОО Д і

Хрвавищ СІ бок ! Вени й Ха ня хрдіви ) інвіунн нак й - ВСІ 103 ЗрА хх

Р ШИ пн сн

А зри я їв рії чт

Хромосома БЖ) 679 зльфа ртентетттттетстнесттетсттнттететос

Ро Гомолотчнах іо рекоминкацня

Торо я сслекуву БЕБІ у Щодня їсва зві

ДВ - нн

Ки

Шабо рос АОдт пеРаК рі

АК ши Е ож А

Ї штами СОВО

ЕНСУНОК ОМ, яв

Гу рт.

Фрагмені Ме ра нпемоюкнииє х і і ї мою ях ен

ОСЖК кт В

КЗЗ А ІеПРОХ, г, "Кок я ра Аа ха вот

Б КЯ і песни Ї Ар узавссю 0 Дома бе ПАНА, х ск ! р й ро шк К ТЯ врвіоюз СМЕКУ раї ше склу а БОВУ опи АОВ. тевнах ліні

Ех 77 Н оі- май і і ! фрнгакотівои В-во ВУ пероохнне їй МІ : Бех, цада ПАБИУСУСІ а тевРОК, ЕужЕє

ШИ сек он нн

Н ІЗ

1 пагнУсхсї код пк ВТ АрВх о товок

ЛИН А звродж, СБ МИ

І Ген ! і ) ' '

ЖКогревнефермацях лах лигеризированимх ЛНКк я ЄХ1579

РИСУНОК ціх

' загін човоК сАНУСТСІ сг ово сти ЗВ ра: Га вок ЦВАЗ АрВА

Рекомбивзння Ммешлу томедесіовими ниетнаи с пеомоецьк «вар тераих ї ! пкстрагированис. і

Ї дрожжевих ДНК Н 1 Злектропорировання. І й Ї в ОНИ Н 1 мон ЗАНУСТО

Шини и ра У рр ре с ве

Ар ДА У ма

К рез |; ; " здиестою! ! ! й й Я іч Ї,

К в

Я й росі се Кая іх. як р " К ї ди ка Й шов РОК пкжжна

Мей висок не - шо ю ш о З од в з з з З з З з 5 (24 т ги. рі - -к -х - З шо в од п: и УМ Фо Х о ПК емова мем сла в м сла о мем паста Зк ло мили ЗЕ п пи и Пан

Ж її рі 5. і г МУ рі

ІЧ б доахечетючеячея ше

І КШННЬ п в ж і ок ж юю жає тея зятя тт, З ІЗ

І СЕЗ со З КУ СЯ

І ДЕК кн тт КЕ ж 12 я

ТЯ ЄуумумллтллилллллтлТлтттттАттнях І 3 ;

Ф Ж 7 прегвавопой ш і Щука Ан нт. я до б НЕ преєноволонацетят :

Ж ою ММК УКВ КДУКУ МУКА БО Кале пев елквлк.

З ія з Гу огогосогокюююттнлялих

Е У ж пе х НЕ дуужтктяялях жи НН нам - її 1 (оно -о ІВ

Фо (Мне зргостз 5,29 диенол

Ін як ик зргоста 5 еноя межу в г

РИСУНОК 125 ря. гом жі м

КН

ІНН кі - М чена д візозає ч ії - їі

СН

«нави со виє ни кадгізвизх лан о що о г: щі хх:

У: !

БО з ш «о сект К І х

Кох

ЕД їх жі В тності М х зизопенононннхй В х в 5 х Й мовна -е пт ЯОНЗНННЛаЙЮ зеетив ш ро х «і х 12: ій т

Ух хх пі г шва Я - х Ж Ф

В х Її х КО х 5 сек кю ро КЕ ї І т Ж п

Н : 4 І х Н -УйК Н

Н Н і й т У пав Н чи и лк Її «т м т я - КЗ її

Бо - Ф - Ф М

Се - ї- З о - ре Фд рес

РИСУНОК ме

Я й тих

Я

В щ пен, о й Я "В, - у з

А а : Ї. е- х щі г й ї і, а / ї вес ду 8 ї У о, у г, - їй | У їй с

Ге і й

ТЯ че с і; З сс ж | Бо сни ді д ОБО : шив Ва В | 5 ой ї Х З о ПИ Е і зи В В БЕ шов й в 5 8 З і 2

Бі й ж а я т я

І-я - ї Е 2 і

Е БЕ. : вв : вам ш ш ; щ

Е

З й

РИСУНОК ІЗ

Я нин р й ть ду Ж

З су «ву а т | не і

В й і! - В - й

КУ КУ

. ши і 8 . 0 - . в В ре се с, - - щк У

Ян. з Ко,

Ту ТК се х о : ях я / ТУ, У ш Ж є в я 5. і се» й ке

Ше ЩА сі ща» (я ; і - МОМ В - хиба не саван З шо шою що шо Ж д я

ЕВ 55

З А У Б ебоу ї ш

В в

Е

ІЗ

Е

- пе

РИСУНОК 14 ї-5 в шосе ЩО - ОО ШООСЗ ї - й 3 5

Ж пу й ж свй их є М в / ; їй ; ! ї- х ; м х ВАМ Є ся щ Ддопос о каен, -; й чу а й СУ, ау: а

С ха г ТЗ

А ех гі

ЕЕ З

- у де і с Е І

У г. Ї, щу. кі о ся ай щі щ 5 во щи

ЕЕ в в в а ме в хх Е - пе Е ях

РИСУНОК 15 з о дк дх - щш р -ї5 - 5 Гі 8

В Я в її ЕЕ шо шо жо Мо У ро 17 Е

Я- ш 5 з Ох « З т ше ШЕ гай я Б - ш і есе кві ,; її І 7, і -

В за. 8 Ф щоб ее - аз. у ; х

ЗЕ 5 пов гЇ ві (М БЕ ж чі Я й | со : щоожий - ик й в -к ї - СЯ . ІЗ

Е і оно зі я / С і

КО р су о і ду ч «о "Ж та "Мою з в й

Ж

Б АК

БЕ

ЧЕ ва

ЕЕ

85 віку

РИСУНОК 16 ж ке й

Жов

ВЕК

В Ве з Б Ж

Ба ш- З г

ЧІ що я Екс ОНИ ВВза се

АХ С З п -8 й ха жу - В о і ; Я в. "ву 2. 4 що ду я Й Ж 5, Кох й є 5-1 й з ше пвх і м пи а

Е - ї їк а с) го а З

Я ож Е в вок ше ч- 5 б. жов Ох т бе Жов

Он

РИСУНОК 17 ш щ як 5 ме щ БВ - о хе - |з від -к ООН, св. 5 у м. У х с і і г ЇЇ Фо З і, - л ие інь КЕ, 5 ЕЕ У -ш Е а Кох

З З Фн С т

В Ес и А -Е ше - дасть - ЖЕ м - , чик і Ж со І-Ш - , Еш в в А я б'вЕ що й ав

Я З 18 ще я яз

ЕЕ ях вів

ЧЕ

- шк

РИСУНОК ІВ

Claims

1. Последовательность нуклеиновой кислотьї, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и имеющая нуклеотидную последовательность 5ЕО І Мої или нуклеотидную последовательность, являющуюся аллельньм вариантом последовательности 5ЕО І Мої и обладающую указанной активностью.

2. Последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, которая гибридизуется с последовательностью, определенной в п.ї, в условиях средней температурь! гибридизации, соответствующих гибридизации при 422С в течение 12 часов в 5095-ном растворе формамида, 550 Хб, с последующей промьівкой, или которая обладает с данной последовательностью идентичностью на 60 или более процентов.

З. Последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, амплифицированная методом РОСА, с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, кодирующих консенсусную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность 5ЕО ІЮО МеЗ: Лей Лей Хаа Хаа Гли Трп Хаа Гли Хаа Хаа Арг Хаа Хаа Хаа Тир 1 5 10 15 , в которой Хаа в положении 7 представляєт собой аминокислоту Трп или Тир, а Хаа в положениий 12 представляет собой Гис или Лиз, в сочетании с затравкой олиго-ат.

4. Белок из Агарідорвів ІНаійапа, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и имеющий аминокислотную последовательность 5ЕО ІЮ Ме2 или последовательность, являющуюся ее вариантом и обладающую указанной активностью.

5. Белок А. ІШаїйапа, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и имеющий аминокислотную после довательность 5ЕО ІЮ Ме2, обозначаєемьій как дельта-7 Ред.

б. Белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, имеющий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью с последовательностью 5ЕСО ІО Мо2 по п.5 на 60 и более процентов.

7. Белок, ообладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и перекрестной иммунореактивностью с белком А. іІПпаїЇапа по п.5, кодируемьй последовательностью ДНК по п.2.

8. Белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, полученньій зкспрессией в дрожжевой клетке, содержащей последовательность ДНК по любому из пп.1-3.

9. Белок А. ІНайіїапа, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, полученньій зкспрессией в дрожжевой клетке, содержащей последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность ЗЕО ІЮО Мо2.

10. Вектор зкспрессии белка, содержащий последовательность ДНК по любому из пп.1-3.

11. Способ клонирования нуклейновой кислотьї, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, характеризующийся тем, что он включает в себя скрининг нуклеиновьх кислот, полученньхх на основе банка зкспрессии белка с указанной активностью из А. ІПпаійапа, посредством их гибридизации с нуклеотидной последовательностью 5ЕО ІЮ Ме1.

12. Последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, клонированная способом по п.11.

13. Последовательность ДНК по п.12, отличающаяся тем, что она является человеческой ДНК.

14. Зонд для диагностики врожденной недостаточности дельта-5,7-стерин, дельта-7 редуктазьї, представляющий собой последовательность ДНК человека по п.13.

15. Способ получения белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, отличающийся тем, что культивируют клетку-хозяин, трансформированную вектором по п.10 или вектором, содержащим последовательность ДНК по п.12 и вьіделяют зкспрессированньй белок.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что клеткой-хозяином являются трансформированнье дрожжи, в которьїх кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора дрожжей.

17. Способ восстановления іп міо стерина, ненасьщенного в положении С-7, отличающийся тем, что инкубируют стерин, подлежащий восстановлению, с белком, полученньм по п.15 или п.16, после чего полученньйй восстановленньй стерин может бьїть вьіделен.

18. Способ восстановления іп міо по п.17, отличающийся тем, что полученньім восстановленньім стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (Разо5 СС).

19. Способ восстановления іп мімо зкзогенного стерина, ненасьищщенного в положенийи С-1, отличающийся тем, что инкубируют стерин с клеткой-хозяином, трансформированной вектором по п.10 или вектором, содержащим последовательность ДНК по п.12, с возможностью вьіделения полученного восстановленного стерина.

20. Способ восстановления іп мімо по п.19, отличающийся тем, что полученньім восстановленньмм стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (Разо5 СС).

21. Способ восстановления іп мімо зндогенного стерина, ненасьшщенного в положенийи С-7, отличающийся тем, что культивируют штамм-хозяин, трансформированньй вектором по п.10 или вектором, содержащим последовательность ДНК по п.12 с возможностью последующего вьіделения накопленного восстановленного стерина.

22. Способ восстановления іп мімо по п.21, отличающийся тем, что полученньім восстановленньмм стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (Разо5 СС).

23. Способ восстановления іп ммо по п.22, отличающийся тем, что зндогенньм стерином, подлежащим восстановлению, является зргоста 5,7-диен 3-ол, зргоста 5,7,24(28) триен 3-ол или зргоста 5,7,22 триен 3-ол или их смесь.

24. Способ получения прегненолона, отличающийся тем, что культивируют клетки-хозяева, трансформированнье вектором по п.10 или вектором, содержащим последовательность ДНК по п.12 с возможностью последующего вьіделения накопленного озндогенного стерина (накопленньїх зндогенньмх стеринов), восстановленного в положений С-7, инкубируют восстановленнье стериньі в присутствии РахоЗСС и, возможно, в присутствиий адренодоксинредуктазьі! (АОК) и адренодоксина (АОХ), с возможностью последующего вьіделения полученного прегненолона.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что клеткой-хозяином являются дрожжи.

26. Способ получения прегненолона, отличающийся тем, что культивируют дрожжи, трансформированнье одним или несколькими векторами, обеспечивающими козкспрессию белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и Рахо5СС, и, возможно, АОК и АХ, с возможностью последующего вьіделения свободного или зстерифицированного прегненолона.

27. Способ получения прегненолона по п.26, отличающийся тем, что культивируют трансформированнье дрожжи, козкспрессирующие белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, Рако? СС, АОК и АОХ.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок А. ІПпаїііапа дельта-7 Ред.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что дрожжевьм штаммом является штамм ЕСО1/рСОб3.

30. Трансформированньй дрожюжевой штамм ЕСО1/рСОб63 Засспаготусев сегемізіає, козкспрессирующий белок

А. Шаїїапа дельта-7 Ред по п.5, Рахо5СОС, АЮА и АОХ и накапливающий свободньійй или зтерифицированньй прегненолон, депонированньїй в СМСМ под номером 1-1538.

31. Способ вьіявления недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь, отличающийся тем, что осуществляют инкубацию пробь, содержащей геномную ДНК человека, с зондом по п.14, в условиях стандартной гибридизации и вьіявление фиксации или отсутствия фиксации зонда на геномной ДНК, при зтом отсутствие фиксации или слабая фиксация указьвают на врожденную нехватку дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазь.