TWI654300B - 用於細胞色素ｐ４５０單加氧酶生物催化作用之全細胞系統 - Google Patents
用於細胞色素ｐ４５０單加氧酶生物催化作用之全細胞系統Info
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Abstract
本發明之標的係用於將真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質轉化為有價值之生物技術產物之全細胞催化方法。本發明之標的亦係經遺傳改造以達成高比率該等生物轉化之微生物及製備該等微生物株之方法。
Description
本發明之標的係用於將真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質轉化為有價值之生物技術產物之全細胞催化作用方法。本發明之標的亦係經遺傳改造以達成高比率該等生物轉化之微生物及製備該等微生物株之方法。
細胞色素P450單加氧酶(P450)在多種疏水化合物之代謝中具有重要作用。其參與類固醇、脂肪酸、維生素之合成及其他生物過程，如異生物質之解毒(Maurer等人，2003；Urlacher et Girhard,2012)。P450催化眾多種反應，包括羥基化、N-氧化、N-、O-及S-去烷基化、磺化氧化、去胺、去硫、去鹵素、過氧化、N-氧化物還原、重排反應、C-C及C-O酚偶合、C-C鍵之裂解及其他反應(Bernhardt等人，1996；Bernhardt等人，2006)。
P450催化眾多種受質進行區域特異性、化學特異性及立體特異性氧化之能力反映其生物學作用並使其成為生物技術應用中之重要候選物。
具體而言，類固醇激素廣泛用作抗發炎藥、避孕藥及抗增殖藥。在哺乳動物中，該等類固醇之合成始於膽固醇至孕烯醇酮之側鏈裂解反應。孕烯醇酮用作產生諸如氫化可體松(hydrocortisone)等其他類固醇激素之基礎(Szczebara等人，2003)且業內非常關注其自低價受
質(例如膽固醇及其植物源類似物)之工業大規模轉化。
然而，膽固醇至孕烯醇酮之側鏈裂解反應係類固醇整體方法中之限制步驟。在哺乳動物中，該反應係藉由膜結合CYP11A1酶使用腎上腺皮質鐵氧還蛋白及腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶作為電子載體來催化。
人們已付出巨大努力在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)等重組微生物中重構固醇側鏈裂解酶系統(Sakamoto等人，EP2386634)，但仍難以獲得滿意程度之酶活性，此主要係由於以下事實：哺乳動物來源之CYP11A1係不溶性膜結合酶且CYP11A1似乎在原核宿主中無法適當摺疊。
已證實巨桿菌(B.megaterium)DSM319之無質粒衍生物係有價值之宿主，其用於共表現來自巨桿菌ATCC 13368之原核胞色素P450 CYP106A2與牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(AdR)及腎上腺皮質鐵氧還蛋白(Adx)；其已應用於具有萜結構之疏水酸(例如抗發炎五環三萜11-酮基-β-乳香酸(KBA))之全細胞轉化。在此工作中，與天然表現CYP106A2之巨桿菌株ATCC 13368及大腸桿菌(E.coli)全細胞系統比較來研究重組巨桿菌系統。來自巨桿菌ATCC 13368之原核細胞色素P450 CYP106A2係僅有的少數經選殖細菌類固醇羥化酶中之一者。其最近被鑒定為第一個被報導之能實施松脂酸之一步式區域選擇性烯丙型羥基化之細菌P450二萜羥化酶(Bleif等人，2012)。
然而，業內仍需要作為全細胞觸媒容許以高比率表現並催化真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質的生物轉化(例如藉由不溶性CYP11A1催化之膽固醇至孕烯醇酮之側鏈裂解反應)之微生物。
令人驚訝的是，發明者已發現，可能藉由使用微生物作為全細胞觸媒及藉由增加其依賴於聚羥基烷酸酯顆粒之儲存容量以高比率表
現並催化真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質的生物轉化。
發明者尤其藉由將牛來源之不溶性CYP11A1、牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(AdR)及牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白(Adx)共表現至巨桿菌MS941中來達成膽固醇、膽固醇類似物及衍生物至孕烯醇酮、羥基化膽固醇類似物及開環類固醇之高比率轉化。
因此，本發明之第一態樣係能將膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物轉化為類固醇激素前體或衍生物之經遺傳改造之微生物，其中該微生物包含至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列。
本發明之第二態樣係用於產生類固醇激素前體之方法，其包含以下步驟：-提供如上文所述之微生物，-在容許表現外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與選自由膽固醇、膽固醇類似物及衍生物組成之群之受質接觸，及-回收類固醇激素前體或衍生物。
本發明之第三態樣係製備重組株之方法，該等株在將膽固醇、膽固醇類似物及衍生物轉化為類固醇激素前體或衍生物方面有所改良，該方法包含以下步驟：-提供微生物，-藉由遺傳改造技術向該微生物中引入至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列。
本發明之第四態樣係用於增加微生物用於疏水或親水化合物之儲存容量之方法，其包含以下步驟：-提供包含能構建聚羥基烷酸酯體(PHA體)之功能性內源聚合酶
系統之微生物；及-藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種參與構建PHA體之基因之表現，由此獲得用於疏水或親水化合物之儲存容量增加之微生物。
根據以下詳細說明以及隨附申請專利範圍可更全面地理解所揭示微生物及方法之該等及其他特徵及優點。
圖1：CYP11A1(A)及AdR/Adx(B)之免疫染色；泳道1：巨桿菌MS941之野生型株；泳道2：經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株。
圖2：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將膽固醇(「S」指受質)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖3：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將7-二氫膽固醇(「S」指受質)轉化為7-二氫孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖4：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將菜油固醇(「S」指受質)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖5：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將麥角甾二烯醇(「S」指受質)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖6：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將去氫膽固醇(「S」指受質)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖7：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將氧化固醇(「S1」、「S2」及「S3」指不同氧化固醇受質)
之混合物轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖8：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將麥角固醇(「S」指受質)轉化為羥基-麥角固醇(「P1」、「P2」、「P3」及「P4」指產物之不同羥基化形式)。
圖9：HPLC層析圖，其顯示藉由與巨桿菌MS941(虛線)相比之經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株(實線)將維生素D(「S」指受質)轉化為羥基維生素D(「P1」及「P2」指不同羥基維生素D形式)。
圖10：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將β-麥固醇(「S」指受質)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖11：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將豆固醇(「S」指受質)轉化為羥基豆固醇(「P」指產物)。
圖12：HPLC層析圖，其顯示藉由經pSMF2.1_SCCAA轉型之巨桿菌MS941株將吉納固醇100(「S1」、「S2」及「S3」指吉納固醇100中所含三種不同固醇)轉化為孕烯醇酮(「P」指產物)。
圖13：比較在反應24及48小時後，在聚羥基丁酸酯體不存在及存在下之CYP11A1活體內活性(KO：巨桿菌MS941之PhaC敲除株；WT：巨桿菌MS941株之野生型)。
圖14：過表現CYP11A1及其氧化還原配偶體之PHB空乏株(MS941_deltaphaC)中之受質轉化活性之恢復；在聚羥基丁酸酯體不存在(結構敲除株(MS941_deltaphaC)+CYP11A1)及存在下(野生型株+CYP11A1)及在其中已藉由用編碼結構操縱子之質粒轉型株來重構PHB體之株(結構敲除株(MS941_deltaphaC)+CYP11A1+結構重構(pMGBm19_RBCP)中比較CYP11A1活體內活性。
圖15：表現載體pSMF2.1_SCCAA之圖譜。
圖16：比較表現不同細胞色素P450之不同微生物產生之孕烯醇酮之產率。
令人驚訝的是，發明者已發現，可能藉由使用微生物作為全細胞觸媒以高比率表現並催化真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質之生物轉化。
發明者尤其藉由將牛來源之不溶性CYP11A1、牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(AdR)及腎上腺皮質鐵氧還蛋白(Adx)共表現至巨桿菌MS941中來達成膽固醇、膽固醇類似物及衍生物至孕烯醇酮之高比率轉化，如實例2及圖2-12中所述。
因此，本發明係關於能將膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物轉化為類固醇激素前體之經遺傳改造之微生物，其中該微生物包含至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列。
「遺傳改造之」微生物意指任何已藉由業內熟習此項技術者已知之遺傳改造技術修飾之本發明微生物。
除非另有指示，否則彼等技術係生物信息學、細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學領域中為熟習此項技術者熟知之習用技術。該等技術在文獻中已全面解釋。例如，參見Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son公司，Library of Congress,USA)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，(Sambrook等人，2001,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Mullis等人，美國專利第4,683,195號；Nucleic Acid Hybridization(B.D.
Harries及S.J.Higgins編輯1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames及S.J.Higgins編輯1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss公司，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；叢書Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson及M.Simon主編，Academic Press公司，New York)，特定而言第154卷及第155卷(Wu等人編輯)以及第185卷，「Gene Expression Technology」(D.Goeddel編輯)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編輯，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker編輯，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯，1986)；及Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
本發明之彼等技術係關於業內熟習此項技術者已知之容許調節基因表現之技術。「調節基因表現」或「藉由遺傳改造技術調節一種基因」或「其中一種基因經調節之經遺傳改造之微生物」係所涵蓋之容許一種所關注基因過表現或以其他方式下調或壓製一種所關注基因之表現的技術。「過表現」或「下調」一種所關注基因分別意指使該基因之表現達到高於或低於其正常表現程度之程度。作為非限制性實例，所關注基因之過表現可藉由將編碼所關注該基因之外源DNA序列引入細胞或微生物中來達成。所關注基因之下調可藉由熟習此項技術者已知之基因沉默技術(例如稱為基因敲低技術之反義及RNA干擾技術)來達成。基因之壓製可藉由所關注靶向基因之基因置換實驗(作為非限制性實例，藉由用該基因之非功能性拷貝置換該基因，如實例4中針對phaC基因缺失所述)或藉由敲除實驗(作為非限制性實例，藉由
使用特異性內切核酸酶使基因之一部分或全部缺失)來達成。
「藉由遺傳改造技術將一種DNA序列引入細胞或微生物中」意指藉由熟習此項技術者已知之任一轉型技術(非限制性實例例如實例1中所用之PEG介導之原生質體轉型技術(Barg H.等人(2005))用所關注DNA序列轉型該細胞或微生物之作用。
「外源DNA序列」意指並非最初及/或天然在所慮及微生物中表現或並非最初及/或天然以其在天然微生物株中之方式表現(例如，就表現程度而言)之核酸序列，且其已用於轉型該微生物以獲得如上文所提及之經遺傳改造之微生物。在特定實施例中，外源DNA序列源自另一物種而非所慮及微生物(例如另一微生物或生物體物種)。在另一特定實施例中，外源序列源自相同微生物。
術語「核酸」一般係指DNA、RNA或其衍生物或模擬物之至少一個分子或至少一個鏈，其包含至少一個核鹼基，例如在DNA(例如，腺嘌呤「A」、鳥嘌呤「G」、胸腺嘧啶「T」及胞嘧啶「C」)或RNA(例如A、G、尿嘧啶「U」及C)中發現之天然嘌呤或嘧啶鹼基。核酸可藉由熟習此項技術者已知之任一技術來製備(參見上文及例如Sambrook等人2000)。
在另一特定實施例中，已藉由遺傳改造技術將該等外源DNA序列引入該微生物中。可使用熟習此項技術者已知之任何技術引入彼等序列，非限制性實例例如實例1中使用之PEG介導之原生質體轉型技術(Barg H.等人(2005))。
該(等)外源DNA序列可編碼所關注蛋白質，例如細胞色素P450及氧化還原配偶體AdR及Adx，且表述「外源DNA」可指定每一個別序列或涵蓋包含每一個別序列之全序列。作為非限制性實例，該微生物已用一種包含該等外源DNA序列之質粒來轉型，如實例1中所述。作為另一非限制性實例，藉由業內已知之技術(例如同源重組)將該等外
源DNA序列整合至該微生物之基因組中。
「微生物」意指用於構築本發明之該經遺傳改造之微生物之微生物。在本發明之框架中，微生物可(例如)選自由以下組成之列表：大腸桿菌、地衣桿菌(Bacillus licheniformis)、巨桿菌(Bacillus megaterium)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
在本發明之特定實施例中，微生物係巨桿菌。在本發明之另一特定實施例中，微生物係選自由以下組成之群之巨桿菌株：由Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(下文中縮寫為「DSM」)存放之具有以下登錄號株：DSM 1517、DSM 1668、DSM 1669、DSM 1670、DSM 1671、DSM 1804、DSM 2894、DSM 30587、DSM 30601、DSM 30782、DSM 30787、DSM 30897、DSM 319、DSM 32、DSM 321、DSM 322、DSM 3228、DSM 333、DSM 337、DSM 339、DSM 344、DSM 3641、DSM 509、DSM 510、DSM 786及DSM 90株。
在本發明之特定實施例中，微生物係巨桿菌DSM 319株。在本發明之特定實施例中，微生物係無法表現主要細胞外蛋白酶基因nprM之巨桿菌株(例如主要細胞外蛋白酶基因nprM缺失或沉默之株)。在本發明之特定實施例中，微生物係稱為巨桿菌MS941之巨桿菌。巨桿菌MS941株意指如在Wittchen K.D.及Meinhardt F.,(1995)中以及在Jingwen Z.等人(2012)中所提及，且藉由敲除主要細胞外蛋白酶基因nprM衍生自野生型DSM319株之株。
本發明之一個態樣係關於能將膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物轉化為類固醇激素前體或衍生物之經遺傳改造之微生物，其中該微生物包含至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼
Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列。
「細胞色素P450」意指能催化多種反應之單加氧酶(如Van Bogaert,I.N.等人(2011)中或Urlacher V.B.及Girhard M.(2011)中或http：//dmelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html中所綜述)。本發明之細胞色素P450在其各別原始宿主中係膜結合型(不可溶)或細胞質型(可溶)。
在特定實施例中，本發明之該細胞色素P450選自由以下組成之群：CYP11A1(酶學委員會編號EC：1.14.15.6)、CYP17A1(EC：1.14.99.9或4.1.2.30)、CYP21A1、CYP11B1(EC：1.14.15.4)、CYP11B2、CYP3A4、CYP46A1、CYP27A1及CYP21A2(EC：1.14.99.10)。
在本發明之框架中，引入微生物中之細胞色素P450可如外源AdR及Adx一般具有真核來源。表述「具有真核來源」意指蛋白質最初表現於(即源自)作為非限制性實例之以下屬之真核生物體中：人屬(Homo)、鼠屬(Rattus)、小鼠屬(Mus)、豬屬(Sus)、牛屬(Bos)、原雞屬(Gallus)、草雀屬(Taeniopygia)、羊屬(Ovis)、恒河獼猴(Macacamulatta)、山羊屬(Capra)、牙漢魚屬(Odontesthes)、絲盤蟲屬(Trichoplax)、短吻鱷屬(Alligator)、擬蜥屬(Eublepharis)、獼猴屬(Macaca)、狒狒屬(Papio)、狨屬(Callithrix)、穴兔屬(Oryctolagus)、金倉鼠屬(Mesocricetus)、犬屬(Canis)、蛙屬(Rana)、腺蛙屬(Glandirana)、鉤吻鮭屬(Oncorhynchus)、石斑魚屬(Epinephelus)、棘鯛屬(Acanthopagrus)、隆頭魚屬(Tautogolabrus)、胖頭鱥屬(Pimephales)、鯽屬(Carassius)、鮈鯽屬(Gobiocypris)、鰻鱺屬(Anguilla)、魟屬(Dasyatis)、貓屬(Felis)及馬屬(Equus)；或在衍生自該等生物體之活體外培養物之細胞系或直接取自活組織或在活體外培養物中建立之初代細胞中表現。在特定實施例中，本發明之該細胞色
素P450係最初在選自由以下組成之群之物種之真核生物體中表現之蛋白質：智人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、溝鼠(Rattus norvegicus)、野豬(Sus scrofa)、歐洲牛(Bos taurus)、原雞(Gallus gallus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、綿羊(Ovis aries)、斑胸草雀、恒河獼猴(Macaca mulatta)、山羊(Capra hircus)、家馬(Equus caballus)、牙銀漢魚(Odontesthes bonariensis)、絲盤蟲(Trichoplax adhaerens)、密西西比鱷(Alligator mississippiensis)、豹紋壁虎(Eublepharis macularius)、食蟹獼猴(Macaca fascicularis)、豚尾狒狒(Papio ursinus)、普通狨(Callithrix jacchus)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、金倉鼠(Mesocricetus auratus)、家犬(Canis lupus familiaris)、牛蛙(Rana catesbeiana)、日本腺蛙(Glandirana rugosa)、麥奇鉤吻鮭(Oncorhynchus mykiss)、點帶石斑魚(Epinephelus coioides)、黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)、珠光擬梳唇隆頭魚(Tautogolabrus adspersus)、胖頭鱥(Pimephales promelas)、鯽魚(Carassius auratus)、稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)及美洲魟(Dasyatis Americana)。
在特定實施例中，引入微生物中之細胞色素P450係歐洲牛之細胞色素P450。在另一特定實施例中，該細胞色素P450係歐洲牛之CYP11A1(在UniProtKB/Swiss-Prot中以P00189提及)且催化膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物至孕烯醇酮或其他類固醇激素前體及衍生物之側鏈裂解反應。在另一特定實施例中，該細胞色素P450催化維生素D2羥基化為20-羥維生素D2、17,20-二羥維生素D2及17,20,24-三羥維生素D2(Nguyen M.N.等人2009)、維生素D3羥基化為20-羥維生素D3、20,23-二羥維生素D3及17,20,23-三羥維生素D3(Tuckey R.C.等人2008)。在另一特定實施例中，作為其他非限制性實例，該細胞色素P450催化麥角固醇氧化為17,24-二羥基麥角固醇、20-羥基-22,23-環
氧基-22,23-二氫麥角固醇及22-酮基-23-羥基-22,23-二氫麥角固醇(Tuckey R.C.等人2012)。在另一特定實施例中，該細胞色素P450之蛋白質序列係SEQ ID NO：2。在另一特定實施例中，該細胞色素P450之蛋白質序列係SEQ ID NO：2之變體，前提係其保留其生物活性。
本發明之該微生物包含至少一種編碼真核來源之細胞色素P450或該細胞色素P450之變體之DNA序列。本發明之所編碼真核來源之細胞色素P450或其變體並非融合蛋白。
「AdR」意指腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(EC：1.18.1.6)或腎上腺皮質鐵氧還蛋白-NADP+還原酶，該酶係以線粒體細胞色素P450電子轉移系統中之第一組份而為人所知，且參與所有類固醇激素之生物合成。
在特定實施例中，該AdR酶選自由以下組成之群：來自粟酒裂殖酵母或啤酒酵母之AR(由arh1基因編碼之NADPH：腎上腺皮質鐵氧還蛋白氧化還原酶(EC=1.18.1.6))及來自大腸桿菌之FNR(由fpr基因編碼之鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶(EC=1.18.1.2))。
在一個特定實施例中，引入微生物中之AdR酶係歐洲牛AdR(在UniProtKB/Swiss-Prot中以P08165提及)。在另一特定實施例中，該AdR之蛋白質序列係SEQ ID NO：3。在另一特定實施例中，該AdR之蛋白質序列係SEQ ID NO：3之變體，但其保留其生物活性。
「Adx」意指腎上腺皮質鐵氧還蛋白或鐵氧化還原蛋白1，已知該蛋白質之活性係將電子自腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶轉移至CYPA11。
在一個特定實施例中，該Adx酶選自由以下組成之群：哺乳動物來源之Fdx、粟酒裂殖酵母之Etp1fd、啤酒酵母之Yah1。
在一個特定實施例中，作為非限制性實例，引入微生物中之Adx酶係歐洲牛之Adx(在UniProtKB/Swiss-Prot中以P00257提及)。在另一
特定實施例中，該Adx之蛋白質序列係SEQ ID NO：4。在另一特定實施例中，該Adx之蛋白質序列係SEQ ID NO：4之變體，但其保留其生物活性。
本發明之該經遺傳改造之微生物進一步包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統。
「能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統」意指微生物物種之PHA合成酶調節子系統或相等系統，其容許該微生物產生聚羥基烷酸酯體(PHA體)或聚羥基烷酸酯顆粒或所慮及微生物物種之相等物，例如聚羥基丁酸酯體(PHB體)或聚羥基丁酸酯顆粒作為非限制性實例。在一個特定實施例中，本發明之經遺傳改造之微生物能產生聚羥基烷酸酯體(PHA體)或聚羥基烷酸酯顆粒。在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物能產生聚羥基丁酸酯體(PHB體)或聚羥基丁酸酯顆粒。
PHA合成酶調節子系統意指編碼聚羥基烷酸酯生物合成之關鍵酶之基因集合，其容許活化前體之共價鍵聯，該等活化前體例如鏈長度介於3-14個C原子之間之(R)-3-羥醯基-輔酶A硫酯，其係pha-合成酶之受質。已自超過45個細菌物種分離超過59種具有高同源性之pha-合成酶基因，其顯示廣泛特異性(如http：//mibi1.unimuenster.de/Biologie.IMMB.Steinbuechel/Forschung/PHA.html中以及Steinbüchel A.及Valentin H.E.1995、Stubbe J.及Tian J.2003、Sudesh K.等人2000、Liebergesell,M.等人1994中所述)。
本發明之該能構建聚羥基烷酸酯體之聚合酶系統可藉由用尼羅紅(nile red)或尼羅藍染色及螢光顯微鏡術來量測(如Ostle A.G.及Holt J.G.,1982；Spierkemann P.等人1999；Der-Shyan S.等人2000中所示)或如實例4中所提及來量測。
在表述「能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統」
中，涵蓋構建聚羥基烷酸酯體之能力無法藉由如上文所提及之常規活性量測來檢測，但此一內源聚合酶系統之基因可藉由基因組方法來檢測且在具體條件下(作為非限制性實例，例如在另一pha-合成酶基因過表現時)易於形成可檢測聚羥基烷酸酯體之情形。
在另一實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物進一步包含至少一種參與構建PHA體之基因，其中該基因表現係如上文所述來「調節」。在特定實施例中，該基因過表現。在另一特定實施例中，該基因下調。在另一特定實施例中，該基因被敲除。在另一特定實施例中，該基因係如上文參考文獻中所提及之pha-合成酶基因中之一者。在另一特定實施例中，該基因選自由以下組成之群：PhaR(PHA合成酶)、PhaP(菜豆凝血素)、PhaC(PHA合成酶)、PhaE(PHA合成酶)、PhaQ(聚-β-羥基丁酸酯反應性抑制劑)、PhaB(乙醯乙醯基-CoA還原酶)及PhaA(3-酮硫解酶)。在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含過表現之PhaC(PHA合成酶)。在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含過表現之PhaP(菜豆凝血素)。在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含過表現之PhaA(3-酮硫解酶)。在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物敲除Pha解聚酶基因(PhaZ、聚(3-羥基鏈烷酸)解聚酶、PhaZ1、PhaZ2及PhaZ3)。
在另一實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含一種以上參與構建PHA體之基因，其中該等基因表現經「調節」，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上基因。
在另一實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物係藉由使至少一種選自由PhaR、PhaP、PhaC、PhaE、PhaB及PhaA組成之群之基因過表現及/或使至少一種選自由PhaZ及PhaQ組成之群之基因下調或不活化來修飾。
在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含全部過表現之PhaA(3-酮硫解酶)、PhaB(乙醯乙醯基-CoA還原酶)、PhaC(PHA合成酶)及PhaR(PHA合成酶)。
在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含過表現之PhaC(PHA合成酶)及PhaR(PHA合成酶)作為相同IV類pha聚合酶之亞單元。
在另一特定實施例中，本發明之該經遺傳改造之微生物包含過表現之PhaC(PHA合成酶)及PhaE(PHA合成酶)作為相同III類pha聚合酶之亞單元。
在另一實施例中，本發明之經遺傳改造之微生物內之該等過表現基因係源自相同微生物物種之基因。在另一實施例中，本發明之經遺傳改造之微生物內之該等過表現基因係來自其他微生物物種之基因。作為非限制性實例，彼等基因屬來自富養羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)及酒色異著色菌(Allochromatium vinosum)之pha基因系統。
在另一特定實施例中，本發明之該微生物係巨桿菌。在另一特定實施例中，本發明之該微生物係巨桿菌株MS941。
在本發明之經遺傳改造之微生物能轉化之受質內，涵蓋衍生自環阿屯醇及羊毛固醇之植物固醇。在該等受質中，「膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物」意指一系列選自由以下組成之群之受質：膽固醇、菜子固醇、菜油固醇、麥角甾二烯醇(例如麥角甾5,22二烯醇、麥角甾5,24(28)二烯醇、麥角甾5,24(25)二烯醇)、麥角甾三烯醇(例如麥角甾5,22,24(25)三烯醇、麥角甾5,22,24(28)三烯醇、麥角甾5,7,22三烯醇)、麥角甾四烯醇(例如麥角甾5,7,22,24(25)或麥角甾5,7,22,24(28))、去氫膽固醇、β-麥固醇、吉納固醇(generol)、氧化固醇之混合物、豆固醇、維生素D、7-二氫膽固醇及麥角固醇，如實例
3-5中及圖2-12中所闡釋。
受質之此定義中亦涵蓋工業製程中目前使用之固醇混合物，例如吉納固醇100及ADM90(以不同比率包含菜子固醇+菜油固醇+豆固醇+β-麥固醇)。
「變體」意指蛋白質及核酸變體。變體蛋白質可係天然變體，例如剪接變體、等位基因及同種型。可藉由一或多個密碼子之取代、缺失或***將胺基酸序列之變化形式引入編碼蛋白質之核酸序列中，從而改變該蛋白質之胺基酸序列。變體蛋白質可係具有保守或不保守取代之蛋白質。舉例而言，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之變體可為在具體胺基酸殘基處具有至少一個取代之多肽。變體蛋白質可包括與本文所揭示多肽序列具有至少約80%胺基酸序列一致性之蛋白質。較佳地，變體蛋白質將與如本文所揭示之全長多肽序列或多肽序列之片段具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%胺基酸序列一致性。胺基酸序列一致性定義為在比對各序列並(若需要)引入空位以達成最大序列一致性百分比後，變體序列中與參考序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。序列一致性可在變體序列之全長、參考序列之全長或兩個範圍內測定。蛋白質序列之一致性百分比可藉由以下方式來計算：實施基於Needleman-Wunsch比對算法之成對總體比對以發現兩個序列延其整體長度之最佳比對(包括空位)，例如使用Needle，且使用BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為10且空位延伸罰分為0.5。
變體核酸序列可包括與本文所揭示核酸序列具有至少約80%核酸序列一致性之核酸序列。較佳地，變體核酸序列將與如本文所揭示之全長核酸序列或核酸序列之片段具有至少約80%、81%、82%、
83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%核酸序列一致性。核酸序列一致性可藉由熟習此項技術者熟知之方法來計算。一致性百分比可藉由以下方式來計算：實施基於Needleman-Wunsch比對算法之成對總體比對以發現兩個序列延其整體長度之最佳比對(包括空位)，例如使用Needle，且使用DNAFULL矩陣，且空位開放罰分為10且空位延伸罰分為0.5。核酸變體之實例可係編碼SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之蛋白質之核酸的變體及編碼pha系統基因之核酸的變體。
如本文所用「胺基酸」係指20個標準α-胺基酸以及天然及合成衍生物。多肽可含有L或D胺基酸或其組合。
發明者藉由將牛來源之不溶性CYP11A1、牛腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶(AdR)及腎上腺皮質鐵氧還蛋白(Adx)共表現至巨桿菌MS941中來達成膽固醇、膽固醇類似物及衍生物至孕烯醇酮、羥基化膽固醇類似物及開環類固醇之高比率轉化，如實例3-5及圖2-12中所示。
因此，本發明之第二態樣係關於用於產生類固醇激素前體及衍生物之方法，其包含以下步驟：-提供如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落所述之微生物，-在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與受質接觸，及-回收類固醇激素前體及衍生物。
在特定實施例中，該等「類固醇激素前體及衍生物」選自由以下組成之群：孕烯醇酮、7-二氫孕烯醇酮、羥基麥角固醇及羥基豆固
醇。在另一特定實施例中，該等類固醇激素前體及衍生物選自羥基化膽固醇類似物及開環類固醇(例如維生素D2及D3，如膽固醇類似物7-二氫膽固醇及麥角固醇之衍生物)之群。
「在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物」意指生物技術領域中之任何熟知培養及誘導方法。作為說明性實例，本發明微生物之培養條件闡述於實例1及2中。
本發明之經遺傳改造之微生物能轉化之「受質」涵蓋衍生自環阿屯醇及羊毛固醇之植物固醇。
在特定實施例中，本發明係關於用於產生類固醇激素前體及衍生物之方法，其包含以下步驟：-提供如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落所述之微生物，-在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與選自由膽固醇、膽固醇類似物及衍生物組成之群之受質接觸，及-回收類固醇激素前體及衍生物。
「膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物」意指一系列選自由以下組成之群之化合物：膽固醇、菜子固醇、菜油固醇、麥角甾二烯醇(例如麥角甾5,22二烯醇、麥角甾5,24(28)二烯醇、麥角甾5,24(25)二烯醇)、麥角甾三烯醇(例如麥角甾5,22,24(25)三烯醇、麥角甾5,22,24(28)三烯醇、麥角甾5,7,22三烯醇)、麥角甾四烯醇(例如麥角甾5,7,22,24(25)或麥角甾5,7,22,24(28))、去氫膽固醇、β-麥固醇、吉納固醇、吉納固醇100、固醇ADM90、氧化固醇之混合物、豆固醇、維生素D、7-二氫膽固醇及麥角固醇，如實例3-5中及圖2-12中所闡釋。
在特定實施例中，本發明係關於用於產生類固醇激素前體及衍生物之方法，其包含以下步驟：
-提供如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落所述之微生物，-在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與工業製程中目前使用之受質接觸，及-回收類固醇激素前體及衍生物。
「工業製程中目前使用之固醇混合物」意指受質，例如吉納固醇100及ADM90(以不同比率包含菜子固醇+菜油固醇+豆固醇+β-麥固醇)，如實例3-5中及圖12中所闡釋。
使該微生物培養物與受質「接觸」意指使本發明之該微生物與本發明之受質進行物理相互作用。此相互作用可在或不在培養基內達成。在特定實施例中，該培養基含有用於對本發明微生物進行透化處理及/或對本發明受質進行增溶之試劑。受質可在添加至微生物培養物之前溶解於該等試劑中。
該等試劑可選自由以下組成之群：乙醇、Tween-80、tergitol、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、皂素(例如皂樹(Quillaja)皂素，其含於皂莢樹(皂皮樹(Quillaja saponaria))之粗提物內)、環糊精及其衍生物(例如2-羥基丙基-β-環糊精)。在另一特定實施例中，可使用該等試劑之混合物，作為非限制性實例，例如乙醇與Tween-80之混合物、tergitol與乙醇之混合物、皂素(例如皂樹皂素)與環糊精之混合物。可使用環糊精衍生物，作為非限制性實例，例如2-羥基丙基-β-環糊精。在另一特定實施例中，使受質與聚乙烯吡咯啶酮(PVP)共結晶。
在另一特定實施例中，首先使受質溶於2-羥基丙基-β-環糊精中，之後將其添加至微生物培養物中，其中該培養物含有皂樹皂素。在另一特定實施例中，使受質溶於溶液中，該溶液中包含百分比介於10%至60%、較佳20%至50%、更佳40%至50%範圍內之2-羥基丙基-β-環糊精，及百分比介於1%至10%、較佳2%至8%、更佳3%至6%範圍
內之皂樹皂素。在另一特定實施例中，使受質溶於溶液中，該溶液包含45%之2-羥基丙基-β-環糊精及4%之皂樹皂素，如實例2中所提及。
在另一實施例中，2-羥基丙基-β-環糊精在微生物培養物中之最終濃度介於1%與4%之間，較佳介於2%與3%之間，更佳係2.25%，如實例2中所闡釋。在另一實施例中，皂樹皂素在微生物培養物中之最終濃度介於0.05%與0.25%之間，較佳介於0.075%與0.225%之間，更佳介於0.1%與0.2%之間，如實例2中所闡釋。
在特定實施例中，本發明係關於用於產生類固醇激素前體及衍生物之方法，其包含以下步驟：-提供如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落所述之微生物，-在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與受質接觸，其中該受質先前已溶於包含2-羥基丙基-β-環糊精及皂樹皂素之溶液中，及-回收類固醇激素前體及衍生物。
在另一特定實施例中，本發明係關於用於產生類固醇激素前體及衍生物之方法，其包含以下步驟：-提供如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落所述之微生物，-在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，-使該微生物培養物與受質接觸，i.其中該受質先前已溶於包含2-羥基丙基-β-環糊精及皂樹皂素之溶液中，ii.其中該等組份在培養基中之最終濃度分別係2.25%及0.2%，及-回收類固醇激素前體及衍生物。
本發明之第三態樣係製備重組株之方法，該等株在如上文所述之將諸如膽固醇及衍生類似物等受質轉化為類固醇激素前體方面有所改良，該方法包含以下步驟：-提供本發明微生物，-藉由遺傳改造技術向該微生物中引入至少一種本發明之編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列。
在特定實施例中，該方法包含選自由以下組成之群之真核來源之細胞色素P450：CYP11A1、CYP17A1、CYP11B1、CYP21A1、CYP11B2、CYP3A4、CYP46A1、CYP27A1及CYP21A2(EC：1.14.99.10)。
在另一特定實施例中，該方法包括包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統之微生物，如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落中所述。
在另一特定實施例中，本發明方法中之該微生物係巨桿菌。在另一特定實施例中，本發明方法中之該微生物係巨桿菌MS941株。
在另一實施例中，本發明方法進一步包含藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種參與構建PHA體之基因之表現之步驟，如上文標題為「本發明經遺傳改造之微生物」之段落中所述。
令人驚訝的是，發明者現已發現，可能藉由使用微生物作為全細胞觸媒及藉由增加其依賴於聚羥基烷酸酯顆粒之儲存容量以高比率表現並催化真核來源之細胞色素P450單加氧酶之受質之生物轉化。
因此，本發明之第四態樣係關於用於增加微生物用於疏水或親水化合物之儲存容量之方法，其包含以下步驟：
a.提供如上文段落中所述包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統之微生物；及b.藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種參與構建PHA體之基因之表現，如上文段落中所述，由此獲得用於疏水或親水化合物之儲存容量增加之微生物。
在特定實施例中，該等疏水化合物係：-(i)膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物，及/或-(ii)類固醇激素前體及其衍生物。
因此，本發明之此態樣亦關於用於增加微生物於(i)膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物及/或(ii)類固醇激素前體及其衍生物之儲存容量之方法，其包含以下步驟：a.提供如上文段落中所述包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統之微生物；及b.藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種涉及構建PHA體之基因之表現，如上文段落中所述，由此獲得於(i)膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物及/或(ii)類固醇激素前體及其衍生物之儲存容量增加之微生物。
本發明之該能構建聚羥基烷酸酯體之聚合酶系統之活性可藉由用尼羅紅或尼羅藍染色及螢光顯微鏡術(Ostle A.G.及Holt J.G.,1982；Spierkemann P.等人1999；Der-Shyan S.等人2000)且如實例4中所提及測量。
在一個特定實施例中，該儲存容量相對於PhaC聚合酶基因表現成比例增加。換言之，引入編碼PhaC基因之外源DNA序列容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。作為非限制性實例，藉由外源phaC基因過度表現於過度表現CYPA11及其氧化還原配偶體之巨桿菌MS941中，
發明人提高該經遺傳改造之微生物將膽固醇、膽固醇類似物及衍生物轉化為類固醇激素前體、羥基化膽固醇類似物及開環類固醇之能力，如實例3至5中所述。
在另一特定實施例中，該儲存容量相對於PhaP基因表現成比例增加。換言之，編碼PhaP基因之外源DNA序列之過度表現容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。
在另一特定實施例中，該儲存容量相對於PhaA基因表現成比例增加。換言之，編碼PhaA基因之外源DNA序列之過度表現容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。
在另一特定實施例中，該儲存容量相對於Pha解聚酶基因(PhaZ、聚(3-羥基鏈烷酸)解聚酶、PhaZ1、PhaZ2及PhaZ3)之下調成比例增加。換言之，敲除Pha解聚酶基因(PhaZ、聚(3-羥基鏈烷酸)解聚酶、PhaZ1、PhaZ2及PhaZ3)並壓製或下調該(等)基因編碼之蛋白質容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。
在另一特定實施例中，該儲存容量相對於PhaA(3-酮硫解酶)、PhaB(乙醯乙醯基-CoA還原酶)、PhaC(PHA合成酶)及PhaR(PHA合成酶)之同時過表現成比例增加。換言之，編碼PhaA、PhaB、PhaC及PhaR基因之外源DNA序列之過表現容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。
在另一特定實施例中，該儲存容量相對於作為相同IV類pha聚合酶之亞單元之PhaC(PHA合成酶)及PhaR(PHA合成酶)之同時過表現成比例增加。換言之，編碼PhaC及PhaR基因之外源DNA序列之過表
現容許增加本發明微生物儲存聚羥基烷酸酯顆粒之容量，且容許提高該微生物將該受質轉化為產物之能力。
SEQ ID NO：1：pSMF2.1_SCCAA之質粒序列。
SEQ ID NO：2：CYP11A1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3：AdR之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4：Adx之胺基酸序列。
對於各別基因之選殖，使用以下限制酶：
●CYP11A1：SpeI/MluI
●AdR：KpnI/SacI
●Adx：BsRGI/SphI
質粒pSMF2.1_SCCAA衍生自巨桿菌穿梭載體pKMBm4(得自Dieter Jahn博士教授之小組，TU Braunschweig,Stammen S.等人(2010))。pKMBm4如下所述經修飾：A)藉由誘變使PacI限制位點缺失，B)***新的多選殖位點(Bleif等人，2012)C)***編碼腎上腺皮質鐵氧還蛋白、腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶及CYP11A1之片段。
所有三種基因皆在強誘導型啟動子PXylA之控制下。每種基因含有其自身之核糖體結合位點。
在大腸桿菌中，表現β-內醯胺酶，從而賦予胺苄青黴素抗性。
在巨桿菌中，表現四環素抗性蛋白質，從而賦予四環素抗性。
pSMF2.1_SCCAA之質粒圖譜及序列分別提供於圖15及SEQ ID NO 1中。
巨桿菌株MS941得自D.Jahn小組/Technische Universität Braunschweig(Wittchen K.D.及Meinhardt F.,1995)，衍生自DSM319/Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen。
根據Barg H.等人(2005)之PEG介導之原生質體轉型來轉型巨桿菌細胞。
使用LB-(25g/L)、TB-(24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白腖、0.4%甘油、10mM磷酸鉀緩衝液)或EnPressoTM Tablet培養基來培養巨桿菌。所有試劑皆列示於下表1中。
用來自板或甘油原液之細胞接種50mL含有10μg/mL四環素之培養基。
用500μL預培養樣品接種50mL含有10μg/mL四環素之培養基。
使主培養物生長至光學密度達到約0.4。在添加溶於1mL蒸餾水中之0.25g木糖後誘導蛋白質表現。
使類固醇溶於45% 2-羥基丙基-β-環糊精/4%皂樹皂素溶液中。在蛋白質誘導後將2.5ml該溶液直接添加至培養物中，從而使最終皂樹皂素濃度為0.2%且最終2-羥基丙基-β-環糊精濃度為2.25%。
將無固有吸收之類固醇轉化為其△4-3-酮基-衍生物，從而容許在240nm下進行光度檢測。
將1mL培養物樣品在水中沸騰1min。添加20μl膽固醇氧化酶溶液(5mg膽固醇氧化酶及5mg膽酸鈉溶於5ml含有0.05% Tween-20之
50mM HEPES緩衝液(pH 7)中)且將樣品在37℃及1000rpm振盪下培育1小時。對於HPLC分析，用1mL乙酸乙酯將樣品萃取兩次，且將萃取物溶於適當溶劑中。
巨桿菌株MS941已經遺傳修飾以表現類固醇生成酶CYP11A1及其氧化還原配偶體Adx及AdR。巨桿菌已經表現載體pSMF2.1_SCCAA(圖1)轉型，該表現載體包含如實例1中所述在強誘導型啟動子PXylA之控制下並分別編碼SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之蛋白質之CYP11A1、AdR及Adx之基因。迄今為止，巨桿菌中尚未表現線粒體細胞色素P450 CYP11A1。
藉由免疫染色確認所有三種蛋白質之表現(圖1)。
以下受質已經2-羥基丙基-β-環糊精及皂樹皂素增溶且在活體內經上文所提及之重組株轉化：膽固醇、7-二氫膽固醇、菜油固醇、麥角甾-5,24-二烯醇、去氫膽固醇、氧化固醇之混合物、麥角固醇、維生素D、B-麥固醇、豆固醇、吉納固醇。(圖2-12)。
總之，此系統容許疏水類固醇膽固醇、其植物源類似物及維生素D之全細胞生物催化作用，且能攝取高濃度之高水不溶性化合物並以高比率將其轉化。此系統之產物產率優於其他產生孕烯醇酮之系統(圖16)。
已顯示螢光膽固醇類似物25-NBD膽固醇在活巨桿菌細胞中定位於用作PHB體之碳儲存中(數據未顯示)。為將CYP11A1定位於巨桿菌細胞中，在活巨桿菌細胞中表現由螢光蛋白eGFP及CYP11A1組成之融合蛋白。與25-NBD膽固醇類似，CYP11A1eGFP定位於PHB體中，其身份係藉由尼羅紅染色來確認(數據未顯示)。
已藉由同源重組使產生聚合酶PhaC之PHB體自巨桿菌之基因組中缺失。簡言之，構築由PhaC基因之側接區域組成之缺失盒。在含有溫度敏感性複製起點之質粒上選殖此構築體。在兩個同源重組事件
後，藉由在非許可複製溫度下培育來達成質粒消除。藉由PCR驗證基因之缺失。為驗證PHB體在CYP11A1聚集及受質儲存中之作用，藉由尼羅紅染色監測PHB體在巨桿菌細胞中之所得缺乏(數據未顯示)。此形態變化導致經pSMF2.1_SCCAA轉型之PhaC敲除株之全細胞轉化活性顯著降低(圖13)。
表現結構空乏CYP11A1之株之受質轉化活性已藉由用在PhaR、PhaB及PhaC基因之原始啟動子控制下之編碼編碼PhaR、PhaB、PhaC及PhaP基因之結構操縱子之質粒轉型來恢復(pMGBm19_RBCP質粒，圖14)。在48小時後與結構空乏株相比，互補株展現產物產率增加超過100%。轉化活性仍顯著低於野生型株，此乃因結構操縱子之重組表現可能降低CYP11A1及其氧化還原配偶體之表現(由於其他蛋白質之共表現)。
該等數據有說服力地闡釋了顆粒結構對全細胞系統之重要性。
應用以下策略：
1)使菜豆凝血素基因(在巨桿菌phaP情形中)過表現以改變顆粒大小。將菜豆凝血素基因***在木糖誘導型啟動子控制下之載體中。用所得質粒轉型巨桿菌。過表現phaP之株中轉化為產物之受質之產率係如實例2及圖2-12中所述來量測。
2)敲除Pha解聚酶基因以以妨礙顆粒解聚。經由PCR藉由引入導致非功能性基因之基因座的缺失來擴增Pha解聚酶基因組基因座。在基因置換實驗中將此非功能性DNA片段***「敲除」載體中，以用非功能性基因置換原始基因組功能性基因。敲除解聚酶基因之株中受質
轉化為產物之產率係如實例2及圖2-12中所述來量測。
3)藉由將3-酮硫解酶基因(phaA)***在木糖誘導型啟動子控制下之載體中改造巨桿菌代謝以提高乙醯CoA(顆粒產生代謝之主要前體)之產量。用所得質粒轉型巨桿菌。過表現phaA之株中受質轉化為產物之產率係如實例2及圖2-12中所述來量測。
4)使顆粒合成中所涉及之基因(3-酮硫解酶(phaA)、乙醯乙醯基-CoA還原酶(phaB)、菜豆凝血素(phaP)及PHA合成酶(phaC/phaR))過表現。將上文所提及之基因***在木糖誘導型啟動子控制下之載體中。用所得質粒轉型巨桿菌。過表現phaA、phaB、phaP、phaC及phaR之株中受質轉化為產物之產率係如實例2及圖2-12中所述來量測。
5)將來自其他生物體之活性更強之PHA合成酶引入巨桿菌MS941株中以產生更多聚合物。使用來自富養羅爾斯頓氏菌、綠膿桿菌及酒色異著色菌之Pha基因。將外源PHA合成酶基因***在木糖誘導型啟動子控制下之載體中。用所得質粒轉型巨桿菌。過表現來自其他微生物之PHA合成酶之株中受質轉化為產物之產率係如實例2及圖2-12中所述來量測。
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Claims (17)
- 一種經遺傳改造之微生物，其能將膽固醇、膽固醇類似物及衍生物轉化為類固醇激素前體，其中該微生物包含至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列，其中該微生物為巨桿菌(Bacillus megaterium)，且其中該真核來源之細胞色素P450係選自由以下組成之群：CYP11A1、CYP17A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP3A4、CYP46A1、CYP27A1、CYP21A1及CYP21A2。
- 如請求項1之經遺傳改造之微生物，其中該等外源DNA序列已藉由遺傳改造技術引入該微生物中。
- 如請求項2之經遺傳改造之微生物，其中該微生物已用至少一種包含該等外源DNA序列之質體轉型。
- 如請求項1之經遺傳改造之微生物，其中該等外源DNA序列整合入該微生物之基因組中。
- 如請求項1之經遺傳改造之微生物，其中該微生物進一步包含能構建聚羥基烷酸酯體(PHA體)之功能性內源聚合酶系統。
- 如請求項1之經遺傳改造之微生物，其中該微生物係巨桿菌MS941株。
- 如請求項1之經遺傳改造之微生物，其中調節至少一種涉及構建聚羥基烷酸酯體之基因之表現，其中該涉及構建聚羥基烷酸酯體之基因係選自由PhaR、PhaP、PhaC、PhaE、PhaB、PhaA、PhaZ及PhaQ所組成之群。
- 一種用於產生類固醇激素前體之方法，其包含以下步驟：a.提供如請求項1至7中任一項之微生物，b.在容許表現該等外源DNA序列之條件下培養該微生物，c.使該微生物培養物與選自由膽固醇、膽固醇類似物及衍生物組成之群之受質接觸，及d.回收類固醇激素前體。
- 如請求項8之方法，其中：a.該受質選自由以下組成之群：膽固醇、菜油固醇(campesterol)、麥角甾二烯醇(ergostadienol)、去氫膽固醇(desmosterol)、β-麥固醇(sitosterol)、吉納固醇(generol)及氧化固醇(oxysterols)之混合物，及b.該類固醇激素前體係孕烯醇酮(pregnenolone)。
- 如請求項8或9之方法，其中使該等受質增溶至β-環糊精及皂素(saponin)中。
- 一種製備重組株之方法，該等重組株在膽固醇、膽固醇類似物及衍生物轉化為類固醇激素前體方面經改良，該方法包含以下步驟：a.提供微生物，b.藉由遺傳改造技術向該微生物中引入至少一種編碼真核來源之細胞色素P450之DNA序列、編碼Adx之外源DNA序列及編碼AdR之外源DNA序列，其中該微生物為巨桿菌，且其中該真核來源之細胞色素P450係選自由以下組成之群：CYP11A1、CYP17A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP3A4、CYP46A1、CYP27A1、CYP21A1及CYP21A2。
- 如請求項11之方法，其中該微生物包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統。
- 如請求項11之方法，其中該微生物係巨桿菌MS941株。
- 如請求項11之方法，其進一步包含藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種涉及構建PHA體之基因表現之步驟，其中該基因係選自由PhaR、PhaP、PhaC、PhaE、PhaB、PhaA、PhaZ及PhaQ所組成之群。
- 一種用於增加微生物儲存聚羥基烷酸酯體於顆粒之容量以增加該微生物轉化(i)膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物為(ii)類固醇激素前體及其衍生物之容量之方法，其中該方法包含以下步驟：a.提供包含能構建聚羥基烷酸酯體之功能性內源聚合酶系統之微生物；及b.藉由遺傳改造技術在該微生物中調節至少一種涉及構建PHA體之基因之表現，其中該基因係選自由PhaR、PhaP、PhaC、PhaE、PhaB、PhaA、PhaZ及PhaQ所組成之群，其中該微生物為巨桿菌。
- 如請求項15之方法，其中該容量相對於PhaC聚合酶基因表現成比例增加。
- 如請求項15或16之方法，其中該微生物係巨桿菌MS941株。
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