BRPI9600729B1

BRPI9600729B1 - Expression vector, transgenic microorganism, cloning process of a nucleic acid and process for preparing a protein and processed yeast cepa

Info

Publication number: BRPI9600729B1
Application number: BRPI9600729-0A
Authority: BR
Inventors: Chenivesse Xavier; Duport Catherine; Lecain Eric; Pompon Denis
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2017-06-20
Also published as: EP0727489A1; HUP9600325A3; CN1664107A; BRPI9600729B8; DK0727489T3; PT727489E; PL312828A1; US5965417A; EP0727489B1; RU2242517C2; AR053931A2; HU220587B1; BRPI9600729A; HUP9600325A1; JPH08289793A; IL162477A0; AR003407A1; US5759801A; CZ43296A3; FI960663A0

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR DE EXPRESSÃO, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, PROCESSO DE CLONAGEM DE UM ÁCIDO NUCLÉICO E PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA E CEPA DE LEVEDURA TRANSFORMADA".

Seqüência de ADN codificando para uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, proteína delta-7-Red, processo de produção, cepas de leveduras transformadas, aplicações. A presente invenção refere-se a uma seqüência de ADN codificando para uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, a proteína delta-7-Red, seu processo de produção, as cepas de leveduras transformadas e suas aplicações. A delta-5,7-esterol, delta-7-redutase (E.C. 1.3.1.21) é uma enzima microssomal cuja presença foi posta em evidência por sua atividade em seus homogenados de fígado de rato (Μ. E. Dempsey e outros, Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) assim como em preparações de plantas de Zea mays M. Taton e outros, Biochem. Biophys. Res. Com- mun., 181, 465-473, 1991). Esta redutase é dependente do NADPH e reduz in vitro o 7-dehidrocolesterol em coleste-rol.

Os esteróis são os constituintes principais das membranas nos eucariotes mas apresentam diferenças de estrutura de acordo com as espécies. Nas células de eucariotes tais como as leveduras, o esterol principal é o er-gosterol que contém uma dupla insaturação em C-5 e C-7, uma cadeia lateral ramificada em C-24 e uma insaturação em C-22 ao passo que nos mamíferos o colesterol é caracterizado por uma insaturação em C-5 e uma cadeia lateral saturada. 0 sitoesterol, o estigmaesterol e o campeste-rol, que representam os esteróis mais comuns nas plantas, têm uma cadeia lateral ramificada porém saturada e, como os esteróis dos vertebrados, não têm uma insaturação em C-7. A enzima responsável desta diferença de estrutura do núcleo esterol é a delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. A delta-5,7-esterol, delta-7-redutase nunca foi purificada até homogeneidade e foi somente descrita uma purificação parcial (Μ. E. Dempsey e outros; M. Taton e outros, já citado). A proteína não foi caracterizada por suas propriedades físico-químicas. Nenhuma informação sobre a seqüência da proteína e nenhum anticorpo dirigido contra esta foram descritos. Além disso, uma aparente deficiência em 7-desidrocolesterol redutase foi descrita no homem associada à síndrome RSH/ Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz e outros, Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994) . A clonagem de um ADNc codificando para a delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, que pode permitir identificar a seqüência da proteína correspondente assim como a caracterização do gene humano ou a colocação em evidência congenital deste, não é portanto realizável com os métodos conhecidos que fazem uso por exemplo das técnicas de hibridização ou/e de detecção imunológica. A obtenção de métodos de seleção inventivos permitem realizar a clonagem, especialmente na ausência de informações sobre a proteína, é portanto particularmente procurada. 0 ergosterol, principal esterol das membranas de cogumelos, contém um par de duplas ligações conjugadas em C-5,7 que confere uma atividade antimicótica aos compostos da família dos polienos tal como a nistatina (R. Bi-ttman e outros, J. Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). A forte dependência da ação da nistatina â concentração da membrana em esteróis insaturados em C-5,7 permitiu selecionar em S. cerevisiae cepas de mutantes em relação aos esteróis acumulados (S. W. Molzahn e outros, J. Gen. Mi-crobiol., 72, 339-348, 1972). Assim os mutantes erg2 e erg3 acumulam esteróis que não têm as duplas ligações conjugadas em C-5,7 em virtude de uma deficiência em esterol delta-8,7 isomerase (W. Ashman e outros, Lipids, 26, 628, 1991) e um esterol delta-5 desidrogenase (B. Ar-thinton e outros, Gene, 102, 39, 1991) respectivamente. Tais mutantes são viáveis porque o ergosterol, o esterol natural principal da levedura, pode ser substituído em certas condições por diferentes esteróis de substituição inclusive o colesterol. A vantagem do aumento da resistência à nistatina de cepas de levedura enriquecidas em esteróis que não têm a dupla insaturação em C-5,7 foi percebida pelos inventores para clonar um ADNc que codifica uma proteína heteró-loga que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase com um método de seleção que utiliza uma interferência metabólica em S. cerevisiae. 0 sucesso desta abordagem que oferece a vantagem de ser independente do conhecimento de seqüências do ADN ou da proteína assim como de uma detecção apenas baseada na atividade enzimá-tica, entretanto não é previsível em virtude de numerosas dificuldades técnicas a serem contornadas.

Uma primeira limitação provém do fato de que o modo de ação da nistatina não está inteiramente elucidado (L. W. Parks e outros, CRC Criticai Reviews of Microbio-logy, 301-304, 1978). Por exemplo, a baixa especificidade da seleção pela nistatina é previsível em virtude da natureza indireta desta que conduz na levedura à seleção de mutações genômicas espontâneas tais como os mutantes erg (S. W. Molzahn e outros, jã citado) ou mutações genômicas que acarretam resistências independentes da via dos esteróis. Da mesma forma, as células transformadas por um banco podem exprimimr genes heterólogos que conferem uma resistência à nistatina sem relação com a via dos esteróis.

Um outro exemplo de limitação esperada refere-se ao fato de que a proteína heteróloga possa ser fracamente ativa na célula, conduzindo à ausência ou a uma fraca resistência à nistatina por exemplo por uma das seguintes razões: 1) o gene que codifica para a delta-5,7-esterol, delta-7-redutase é fracamente expresso; 2) a proteína é pouco ou nada ativa porque mal dobrada ou resultante de uma arrumação subcelular incorreta; 3) a proteína de planta não reconhece os esteróis próprios da levedura como substratos ou 4) os esteróis que podem ser substratos estão sob forma esterificada ou estocados em vesículas e não estão em contato com a enzima. Pode portanto ser previsto que os esteróis assim acumulados escapem à ação da delta-5,7-esterol, delta-7-redutase que, nos eu-cariotes, é reputada localizada nos microssomas. A presente invenção refere-se à clonagem de um ADNc de A. thaliana que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, designada delta-7-Red, de acordo com um processo de clonagem realizado em uma levedura por interferência metabó-lica baseada na resistência â nistatina. A proteína del-ta-7-Red permite reduzir esteróis que têm uma insaturação em C-7 por um processo de redução biológica que fornece também uma solução vantajosa ao problema da redução seletiva em C-7 de esteróis ou de esteróides que têm uma dupla insaturação em C-5,7 que os métodos de redução por via química não permitem. A invenção refere-se igualmente a células de levedura transformadas que exprimem a delta-7-Red que, de maneira surpreendente, acumulam produtos saturados em C-7 e eventualmente saturados em C-22 que, contrariamente ao ergosterol, são substratos da enzima de divagem da cadeia lateral do colesterol, ou seja o citocromo P450SCC.

Estas propriedades inesperadas permitem uma uti-5 lização das leveduras transformadas da invenção em um processo de preparação de esteróis ou de esteróides que têm um interesse industrial e/ou farmacológico, em particular a preparação de pregnenolona por oxidação biológica dos esteróis endógenos de levedura, reduzidos em C-7, ) pelo citocromo P450SCC (P450SCC) na presença de adrenodo-xina redutase (ADR) e de adrenodoxina (ADX). As leveduras transformadas da invenção podem ser também utilizadas em um processo de preparação dos esteróides intermediários da via de metabolização do colesterol em bidrocortisona > nos mamíferos e em outros vertebrados. Esta utilização apresenta a vantagem de permitir a preparação da hidro-cortisona ou de seus intermediários em um processo de oxidação biológica que não necessita o emprego de um es-terol exógeno tal como 0 colesterol como substrato inici-1 al e de contornar assim o problema da penetração de um esterol na levedura cuja impermeabilidade aos esteróis exógenos sob condições de aerobiose foi descrita (R. T. Lorentz e outros, J. Bacteriology, 981-985, 1986). A invenção refere-se também à utilização das se-qüências nucléicas obtidas com a ajuda do processo de clonagem da invenção. Uma seqüência ARN ou ADN que codifica para a delta-5,7-esterol, delta-7-redutase pode ser utilizada para o diagnóstico ou para o tratamento de afecções que implicam o produto do gene da delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. Por exemplo, uma deficiência em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase que converte o 7-dehidro colesterol em colesterol é presumida implicada na síndrome RSH/SLO. Assim uma seqüência de ADN humano pode ser utilizada como sonda para diagnosticar uma deficiência em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e pode ser também utilizada em terapia gênica para corrigir uma tal deficiência. A presente invenção tem portanto como objetivo uma seqüência de ácido nucléico que contém uma seqüência que codifica para proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase o dito ácido nucléico sendo um ADN ou um ARN e particularmente sendo um ADNc. A atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase pode ser posta em evidência por exemplo com a ajuda de um teste enzimático in vitro descrito mais adiante na parte experimental. A invenção tem mais particularmente como objetivo uma seqüência de ADNc na qual a seqüência que codifica para uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e que tem a seqüência nucleotídica da seqüência SEQ ID N°. 1: GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GRA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111 Met Ala Glu Thr Vai His Ser Pro Ile Vai Thr Tyr 15 10 GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCCA CCT TTC GTC ATT CTC 159 Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro 15 20 Phe Vai Ile Leu 25 CTA TGG ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207 Leu Trp Tyr Thr Met Vai His Gin Asp Gly Ser Vai Thr Gin 30 35 40 Thr Phe GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311 Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys 400 405 Tyr Gly Lys 410 TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359 Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Vai Lys Tyr Arg 415 420 Ile Ile Pro Gly 425 ATT TAT THATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 Ile Tyr 430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 assim como as variantes alélicas desta sequência. A seqüência de ADNc acima que codifica para uma proteína que tem 430 aminoácidos correspondente à seqüência mostrada na figura 3 (SEQ ID N°. 2) é uma seqüência de ADNc que pode ser obtida por exemplo por clonagem em uma levedura, a partir de um banco de expressão de A. thaliana, utilizando um método de seleção baseado no aparecimento de uma resistência da levedura â nistatina, segundo condições de operação das quais é fornecida uma descrição detalhada mais adiante. O conhecimento da seqüência nucleotídica SEQ ID N°. 1 aqui acima permite reproduzir a presente invenção por métodos conhecidos do perito da técnica, por exemplo por síntese química ou por seleção de um banco genômico ou de um banco de ADNc com a ajuda de sondas de oligonu-cleotídeos de síntese pelas técnicas de hibridização ou por amplificação por PCR. A invenção também tem como objetivo uma sequência de ADN que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e que hi-bridiza à sequência nucleotídica SEQ ID N°. 1 em condições de restrição média ou elevada ou que apresenta uma identidade de seqüência de aproximadamente 60% e mais com esta seqüência.

As seqüências que hibridizam de maneira detectá-vel â seqüência SEQ ID N°. 1 hibridizam em condições padronizadas de restrição média, por exemplo uma hibridiza-ção a 42 °C, durante 12 horas em uma solução a 50% de formamida, SSCX6 seguida de lavagens ou de restrição menos elevada, por exemplo uma hibridização a 42 °C, durante 24 horas em uma solução a 20% de formamida, SSCX6 seguida de lavagens nas condições padronizadas conhecidas (T. Maniatis e outros, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A percentagem de identidade de seqüência nucleotídica pode ser determinada utilizando por exemplo o programa BLAST "basic local alignment search tool" (S. F. Altschul e outros, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) "sur le serveur" NCBI. A invenção refere-se também a uma seqüência de ADN que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e amplificável pela técnica de PCR utilizando como iniciadores oligonucleotí-deos que codificam para uma seqüência consenso que tem a seqüência de aminoãcidos SEQ ID N°. 3: Leu Ley Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 15 10 Tyr 15 na qual Xaa em posição 7 é Trp ou Tyr e Xaa em posição 12 é His ou Lys. A seqüência SEQ ID N°. 3 acima corresponde a uma sequência consenso nova que foi definida por alinhamento de identidade de seqüências em aminoãcidos entre a seqüência nova SEQ ID M°. 2, deduzida da seqüência nucleo-tídica SEQ ID N°. 1 e seqüências conhecidas seja de outros esterol redutases que têm uma especificidade de ação a uma posição sem ser a posição C-7, seja de receptores â lamina B, como é detalhado mais adiante na parte experimental. A partir da informação dada para a seqüência em aminoácidos SEQ ID N°. 3, um iniciador constituído de no máximo 45 nucleotídeos pode ser definido e sintetizado que, associado a um segundo iniciador oligodT (17 nucleotídeos) como seqüência de rebond, permitirá com a ajuda de um kit PCR do comércio (por exemplo Stratagene) amplificar um ADN que codifica para uma proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. A invenção refere-se também a uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e que tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID N°. 2: Met Ala Glu Thr Vai His Ser Pro Ile Vai Thr Tyr Ala Ser 15 10 Met Leu Ser Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Vai Ile Leu Leu 15 20 25 Trp Tyr Thr Met Vai His Gin Asp Gly Ser Vai Thr Gin Thr 30 35 40 Phe Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Vai Gin Gly Leu Ile Asn 45 50 55 Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe 60 65 70 Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro 75 80 85 Gly Lys Arg Vai Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg 90 95 Pro Vai Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Vai 100 105 110 Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe 115 120 125 Asn Pro Ala Ile Vai Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Vai Leu Leu Tyr 145 150 Ile Lys Gly His Vai Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ser 155 160 165 Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu 170 175 180 Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile Lys Vai Phe Thr 185 190 195 Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Vai Leu Ala Vai 200 205 210 Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Vai Ser 215 220 Asp Ser Met Leu Vai Asn Thr Ile Leu Met Leu Vai Tyr Vai 225 230 235 Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met 240 245 250 Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly 255 260 265 Cys Leu Vai Trp Vai Pro Ser Vai Tyr Trh Ser Pro Gly Met 270 275 280 Tyr Leu Vai Asn His Pro Vai Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala 285 290 Ile Tur Ile Leu Vai Ala Glu Ile Leu Cys Ile Yyr Ile Lys 295 300 305 Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg Thr Asn 310 315 320 Gly Lys Cys Leu Vai Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Vai 325 330 335 Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu 340 345 350 Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His 355 360 Tyr Vai Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Vai Pro 365 370 375 Ala Leu Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Vai Leu Thr 380 385 390 Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys 395 400 405 Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys 410 415 420 Vai Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr 425 430 assim como as variantes alélicas e os análogos desta se-qüência.

Por alelos e análogos, incluem-se as seqüências modificadas por substituição, eliminação ou adição de um ou de diversos aminoácidos para que estes produtos conservem a mesma função. As seqüências modificadas podem ser por exemplo preparadas utilizando a técnica de muta-gênese dirigida conhecida do perito da técnica. A invenção tem especialmente como objetivo uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e que tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 2 acima e designada delta-7Red. A invenção refere-se também a uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase tendo uma seqüência de aminoácidos que apresenta uma identidade de seqüência de aproximadamente 60% e mais com a seqüência SEQ ID N°. 2. A percentagem de identidade pode ser determinada por exemplo utilizando o programa BLAST indicado acima. A invenção refere-se igualmente a uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e tendo uma reatividade imunológica cruzada coma proteína de A. thaliana delta-7Red definida acima. A proteína pode ser detectada por exemplo por imunoprecipitação com a ajuda de um anti-soro dirigido contra a proteína delta-7Red, preparada de acordo com métodos conhecidos.

Um dos aspectos da invenção refere-se a uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase tal como obtida por expressão em uma célula hospedeira que contém uma seqüência de ADN definida anteriormente e refere-se especialmente a uma proteína de A. thaliana tal como obtida por expressão em uma célula hospedeira que contém uma seqüência de ADN que codifica para a seqüência de aminoácidos SEQ ID N°. 2 acima.

Quando a proteína da invenção é obtida por expressão em uma célula hospedeira, esta é realizada de acordo com os métodos de engenharia genética e de cultura celular conhecidos do perito da técnica. A expressão pode ser realizada em uma célula hospedeira procariote, por exemplo E. coli ou em uma célula hospedeira eucariote, por exemplo uma célula de mamífero, uma célula de insetos ou uma levedura que contém a seqüência que codifica para a delta-7 Red da invenção precedida de um promotor conveniente. A proteína recombinante obtida pode ser glicosi-lada ou não-glicosilada. A invenção refere-se especialmente a uma proteína de acordo com a invenção tal como obtida por expressão em uma levedura. A invenção refere-se também a um anticorpo dirigido contra uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase definida anteriormente. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal preparado de acordo com os métodos conhecidos do perito da técnica. A invenção refere-se também a um vetor de expressão que contém uma seqüência de ADN definida antes assim como uma célula hospedeira transformada por este vetor.

Os vetores de expressão são vetores conhecidos que permitem a expressão da proteína sob o controle de um promotor conveniente. Para as células procariotes, o promotor pode ser por exemplo o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac, o promotor beta-lactamase ou o promotor PL. Para as células de mamíferos, o promotor pode ser o promotor SV40 ou os promotores do adenovírus. Vetores tipo Baculovírus podem ser também utilizados para a expressão em células de insetos. Para as células de levedura, o promotor pode ser por exemplo o promotor PGK, o promotor ADH, o promotor CYC1 ou o promotor GAL10/CYC1.

As células hospedeiras podem ser células procariotes ou células eucariotes. As células são por exemplo E. coli, Bacillus ou Streptomyces. As células hospedeiras eucariotes compreendem leveduras e cogumelos filamentosos assim como células de organismos superiores, por exemplo célplas de mamíferos ou células de insetos. As células de mamíferos podem ser células CHO de hamster ou células Cos de macaco. As células de insetos são por exemplo células SF9. As células de leveduras podem ser por exemplo Sac-charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ou Kluyveromyces lactis. A invenção tem também como objetivo um processo de clonagem de um ácido nucléico que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase em um microorganismo que compreende um método de seleção escolhido entre - a resistência do microorganismo à nistatina ou a um composto análogo cuja toxidez depende da presença de es-teróis que contêm uma insaturação em posição C-7, - a hibridização do ácido nucléico com a seqüência nucle-otídica da seqüência SEQ ID N°. 1 acima, - a identificação do ácido nucléico por via informática entre seqüências de ADN isoladas ao acaso, - a expressão direta da proteína seguida de imunodetecção com a ajuda de anticorpos dirigidos contra a proteína que tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID N°. 2 acima.

Por microorganismo, entende-se uma levedura tal como por exemplo S. cerevisiae, S. pombe ou K. lactis.

Os compostos análogos à nistatina compreendem por exemplo a anfotericina B ou a filipina.

Por hibridização, entende-se uma hibridização em condições de restrição média ou elevada de acordo com as condições padronizadas conhecidas (T. Maniatis e outros, já citado). A identificação por via informática pode ser realizada por exemplo de acordo com o programa BLAST indicado acima.

Um exemplo de processo de clonagem acima no qual o método de seleção utiliza a resistência à nistatina em uma levedura é descrito mais adiante na parte experimental . A invenção tem também como objetivo uma seqüên-cia de ácido nucléico, ADN ou ARN, tal como obtido pelo processo de clonagem acima. A seqüência de ácido nucléico pode ser de origem procariote ou eucariote de acordo com o material a partir do qual é realizada a clonagem, por exemplo de origem humana. A invenção tem também como objetivo uma célula hospedeira transformada por um vetor que contém uma seqüência de ADN tal como obtida pelo processo de clonagem acima. A célula hospedeira pode ser uma célula procariote ou uma célula eucariote. Exemplos de células hospedeiras e de vetores foram indicados anteriormente. A invenção tem especialmente como objetivo uma célula hospedeira, escolhida entre uma levedura ou um cogumelo filamentoso, transformada por um vetor que contém uma seqüência de ADN da invenção definida anteriormente ou uma seqüência de ADN tal como obtida pelo processo de clonagem acima.

Um dos objetivos da invenção refere-se também a um processo de preparação de uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase no qual se cultiva uma célula hospedeira transformada da invenção e isola-se a proteína expressa e refere-se particularmente a um processo no qual a célula hospedeira é uma levedura transformada na qual a sequência de ADN codificante é colocada sob o controle de um promotor de levedura.

Um dos objetivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vitro de um esterol insaturado em posição C-7 no qual se incuba o esterol a ser reduzido com a proteína obtida pelo processo acima e isola-se eventualmente o esterol reduzido obtido.

Um dos objetivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vivo de um esterol exógeno insaturado em posição C-7 no qual se incuba o esterol com uma célula hospedeira transformada da invenção e isola-se eventualmente o esterol reduzido obtido. A célula hospedeira pode ser uma célula procariote ou uma célula euca-riote, em particular uma levedura ou um cogumelo filamen-toso.

Um dos objetivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vivo de um esterol endógeno insaturado çm posição C-7 no qual se cultiva uma cepa hospedeira transformada da invenção escolhida entre uma levedura ou um cogumelo filamentoso e isola-se eventualmente o esterol reduzido acumulado. A invenção refere-se particularmente a um processo de redução in vitro ou in vivo definido acima no qual o esterol reduzido obtido é um substrato da enzima de divagem da cadeia lateral do colesterol (P45QSCC) e refere-se mais particularmente a um processo de redução in vivo no qual o esterol endógeno a ser reduzido é o er-gosta 5,7 dieno 3-ol, o ergosta 5,7,24(28) trieno 3-ol ou o ergosta 5,7,22 trieno 3-ol ou uma mistura dos mesmos. A invenção tem também como objetivo um processo de produção de pregnenolona no qual se cultiva uma célula hospedeira transformada da invenção escolhida entre uma levedura ou um cogumelo filamentoso, isolam-se eventualmente o ou os esteróis endógenos reduzidos em posição C-7 acumulados, incubam-se os esteróis reduzidos em presença de P450SCC e eventualmente em presença de adrenodoxima redutase (ADR) e de adrenodoxima (ADX), e isola-se eventualmente a pregnenolona obtida. A invenção tem particularmente como objetivo um processo de produção da pregnenolona definida acima no qual a célula hospedeira é uma levedura. A invenção refere-se também a um processo de produção de pregnenolona no qual se cultiva uma levedura transformada por um ou diversos vetores que permitem a co-expressão de uma proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase e de P450SCC e eventualmente da ADR e da ADX e isola-se eventualmente a pregnenolona livre ou esterifiçada. A invenção refere-se particularmente ao processo acima no qual se cultiva uma levedura transformada que co-exprime uma proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, o P450SCC, a ADR e a ADX, particularmente o processo acima no qual a proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase é a proteína de A. thaliana delta-7-Red e especialmente o processo acima no qual a cepa de levedura é a cepa EC01/ pCD63.

Exemplos de produção de pregnenolona de acordo com a invenção são fornecidos mais adiante na parte experimental . A levedura transformada utilizada para a realização do processo de produção de pregnenolona acima pode ser por exemplo uma levedura co-transformada por um vetor de expressão da invenção que contém uma seqüência de ADN que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5, 7-esterol, delta-7-redutase e um vetor de expressão do citocromo P450SCC e eventualmente do ADX e do ADR. Ve- ' tores de expressão do citocromo P450SCC e/ou do ADX são conhecidos e são descritas preparações por exemplo no pedido de patente européia EP 0.340.878 assim como mais adiante na parte experimental. A levedura transformada utilizada pode ser igualmente uma levedura na qual a seqüência de ADN que codifica para a proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase é integrada em um locus particular do genoma, por exemplo ao locus ADE2 e na qual o ergosterol não é mais 0 ergosterol majoritário nas condições de expressão da delta-7-redutase. A levedura "integrada" obtida pode ser em seguida transformada por cassetes de expressão integrativos ou por vetores de expressão contendo uma seqüência de ADN que codifica para o ci- tocromo P450SCC e eventualmente para 0 ADX e o ADR.

Um exemplo de construção de cepas de levedura que produzem in vivo a pregnenolona ou seu éster acético é fornecido mais adiante na parte experimental. A invenção tem portanto igualmente como objetivo uma cepa de levedura transformada que co-exprime uma proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, 0 P45QSCC, o ADR e o ADX e que acumula pregnenolona livre ou esterificada, particularmente uma cepa de levedura acima na qual a proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase é a proteína de A. thaliana delta-7-Red e especialmente uma cepa de levedura denominada EC0l/pCD63 cuja construção detalhada é fornecida mais adiante na parte experimental. A invenção estende-se também a uma seqüência de ADN humano tal como obtido de acordo com o processo de clonagem definido acima, utilizada como sonda para diagnosticar uma deficiência congênita em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. A deficiência em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase compreende por exemplo a deficiência em 7-desidrocolesterol redutase responsável pela taxa anormalmente baixa em colesterol no plasma. A invenção refere-se igualmente a um método de detecção da deficiência em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase que compreende a incubação de uma amostra que contém ADN genômico humano com a sonda definida acima em condições de hibridização padronizadas e a colocação em evidência da fixação ou da ausência de fixação da sonda ao ADN genômico, a ausência de fixação ou a redução desta indicando uma deficiência congênita em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. 0 método da invenção pode permitir por exemplo detectar uma deficiência congênita em delta-5,7-esterol, delta-7-redutase pré-natal ou no recém-nascido assim como nos pacientes atingidos de afecções variadas e especial-mente nos pacientes que têm as manifestações clínicas da síndrome RSH/SLO.

As figuras anexas ilustram alguns aspectos da invenção: A figura 1 representa o perfil em esteróis totais extraídos a partir do clone F22 resistente à nista-tina obtido por seleção do banco de A. thaliana na levedura FY 1679. A análise é feita por RP-HPLC a 205 nm ou a 285 nm (figura IA) ou por CPG comparativamente à levedura FY1679 não-transformada (figura 1B). A figura 2 representa uma carta de restrição do fragmento Not I do plasmídeo pF22 e a estratégia de se-qüenciamento. A figura 3 representa a sequência nücleotídica do ADNc delta-7Red (SEQ ID N°. 1) e a seqüência de amino-ácidos correspondentes (SEQ ID N° 2). A figura 4 ilustra a medida in vitro da atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase de uma fração mi-crossomal de FY1679 transformada com o vetor de expressão induzível "delta-7/V8". A análise é feita por CPG e mostra a transformação do substrato 7-desidrocolesterol (TR=16,528) em colesterol (TR=15,887) em presença dos es-teróis endógenos ergosta 5,22 dieno 3-ol (TR=16,682); er-gosterol (TR=17,249); ergosta 5-eno 3-ol (TR=17,664). A figura 5 ilustra a produção de pregnenolona in vitro por divagem de ergosta 5-eno 3-ol (fig. 5A); de ergosta 5,24(28) dieno 3-ol (5B) ou de ergosta 5,22 dieno 3-ol (5C) purificado a partir de uma levedura transformada que exprime a delta-7Red, depois incubado com P450SCC, ADX e ADR. A análise é feita por CPG comparativamente a uma divagem testemunha de colesterol (traço cheio). A figura 6 ilustra a construção do plasmídeo in- tegrativo pADÁ7 que permite a integração do ADNc que codifica para a delta-7Red (esterol Al redutase) ao locus ADE2. A figura 7 representa a análise por CPG dos es-teróis totais extraídos por saponificação alcalina da cepa FY1679 e da cepa integrada ELR01 cultivadas na presença de galactose. A figura 8 esquematiza a construção do vetor naveta E. coli-S. cerevisiae V13 que contém um sítio único Sall (Sa) no sítio de clonagem múltiplo. A figura 9 representa as etapas da construção dos plasmídeos integrativos pCD62-l e pCD62-2 que permitem inserir o cassete de experssão ADR na região intergê-nica dos genes leu2 e spllA. SCM1 e SCM2: sítios de clonagem múltiplos. A figura 10 representa a estratégia da constru- ção da cepa CDR01. A figura 11 representa as etapas da construção do plasmídeo de expressão pCD63 que contém os dois cassetes de expressão ADX e P450SCC. A figura 12 representa a análise por CPG dos es-teróis extraídos a partir das células (lisado celular) ou do meio de cultura (meio (isolados a partir da cepa EC01/pCD63 após uma indução pela galactose de 9 h (figura 12a) ou de 24 h (figura 12b). A figura 13 representa a estrutura do plasmídeo pTG 7457. A figura 14 representa a estrutura do plasmídeo pTG 7453. A figura 15 representa a estrutura do plasmídeo pTG 10014. A figura 16 representa a estrutura do plasmídeo pTG 10004. A figura 17 representa a estrutura do plasmídeo pTG 10031. A figura 18 representa a estrutura do plasmídeo pTG 10033.

Os exemplos a seguir ilustram a invenção sem todavia limitã-la. EXEMPLO 1: Clonagem de ADNc que codifica para a delta-5,7-esterol, delta-7-redutase (delta-7-Red) de A. thaliana A - Seleção do banco de expressão de A. thaliana na levedura 0 banco de expressão de ADNc de partida é o banco descrito por M. Minet e outros (Plant J., 2, 417-422, 1922) que foi preparado a partir de ARNm de A. thaliana no estágio de germinação ao estágio de duas folhas e cujos ADNc limitados pelo sítio Not I foram inseridos no sítio Bst XI do cassete de expressão do vetor naveta ("naveta") E. coli/S. cerevisiae pFL61. Este cassete contém as sequências do promotor e do terminador do gene da fosfoglicerato quinase (PGK). A origem de replicação da levedura derivada da seqüência 2μ e um marcador de seleção URA3 garantem a propagação do vetor na levedura. A propagação do vetor em E. coli é derivada do plasmídeo pUC19. A cepa de levedura FY 1679 (Mata) , que é uma cepa isogênica da cepa S288C descrita por A. Thierry e outros (Yeast, 6, 521-534, 1990), foi transformada pelo banco de ADNc utilizando o método de acetato de lítio descrito por D. Gietz e outros (Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992) .

As células foram espalhadas sobre um meio sintético SGI contendo 7 g/1 de "yeast nitrogen base" (Difco), 1 g/1 de bactocasaminoácidos (Difco), 20 g/1 de glicose, 20 mg/1 de triptófano e que é desprovido de uracila. 105 transformantes protótrofos para a uracila foram obtidos depois agrupados e espalhados de novo no mesmo meio sintético desprovido de uracila e contendo 2 ou 5 μg/ml de nistatina à razão de 5xl04 células por caixa. 106 células para cada concentração em nistatina foram assim selecio- nadas. Após 3 dias de incubação a 28 °C, aproximadamente 100 clones, que chegaram à concentração de 2 μ9/τη1 em nistatina, foram recuperados constituindo grupos de 5 clones cuja composição em esteróis foi analisada por cro-matografia líquida de alto desempenho em fase inversa (citado como RP-HPLC a seguir) ao passo que um único clone resistente, denominado F22, foi obtido à concentração de 5 μg/ml em nistatina. B - Análise dos esteróis acumulados no clone F22 Os esteróis totais da levedura são preparados de acordo com o método de saponificação alcalina descrita por L. Parks e outros (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), depois analisados por RP-HPLC ou/e por cromatogra-fia em fase gasosa (citado como CPG). 0 resíduo de esteróis obtido é dissolvido na mistura etanol-tetrahidrofurano-água (65:10:25 v/v) depois analisado por RP-HPLC sobre uma coluna de sílica en-xertada C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) à vazão de 1 ml/minuto e a 55 °C com a ajuda de um gradiente linear de metanol em água (50% até 100% em 18 minutos) e uma detecção fotométrica a 205 nm e 285 nm comparativamente a padrões de ergosterol, campesterol e colesterol. A composição em esteróis é também analisada por CPG sobre uma coluna capilar SE-30 Alltech (30 m x 0,32 m) com hélio como gás veículo, uma temperatura de 280 °C e 310 °C para o injetor e o detector respectivamente, com um aumento inicial da temperatura de 110 °C a 245 °C à velocidade de 45 °C/minuto, depois de 3°C/minuto para atingir 280°C. A análise de RP-HPLC (figura IA) e a análise por CPG (figura 1B) mostram o perfil dos esteróis acumulados no clone F22 obtido acima caracterizado pelo desaparecimento quase completo do ergosterol, esterol majoritário da cepa não-transformada FY 1679 e sua substituição por dois esteróis principais e em quantidade análoga que não absorvem a 285 nm e não possuem portanto mais uma dupla insaturação conjugada de acordo com a análise por RP-HPLC.

Na figura IA, o campesterol (Sigma) (24-R-er-gosta 5-eno 3-ol) contém aproximadamente 35% de dihidro-brassicasterol (24-S-ergosta 5-eno 3-ol). C - Clonagem do ADNc delta-7Red Os plasmídeos provenientes do clone F22 foram amplificados em E. coli segundo o método descrito por J. N. Strathern e outros (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), depois digeridos por Not I. Um fragmento de 600 pares de bases (bp) aproximadamente e um fragmento de 1,6 kbp foram obtidos. A cepa FY1679 foi transformada com cada um dos fragmentos acima respectivamente. A composição em esteróis de cada clone de levedura transformada foi analisada como indicado acima e permitiu distinguir o plasmídeo que contém o gene responsável pelo perfil modificado em esteróis. 0 plasmídeo assim identificado foi denominado pF22. D - Determinação da seqüência do ADNc delta-7Red A inserção ADNc depF22 foi subclonado no sítio Not I do vetor pUC9N derivado de pUC9 (Pharmacia) no qual o sítio Eco RI do sítio múltiplo de clonagem é substituído por inserção de um sítio de restrição Not I conservando ao mesmo tempo a fase de leitura do gene LacZ. Um mapa de restrição foi em seguida determinado (figura 2).

Fragmentos de restrição que têm o sítio externo Not I e os sítios internos EcoRI, PvuII ou HidnlII respectivamente foram subclonados no plasmídeo pBluescript (Stratagène). A seqüência nucleotídica foi determinada pelo método de Sanger com a ADN polimerase Sequenase (kit Stratagène) sobre os dois filamentos utilizando os inici-adores direto e inverso de pUC9, T3 e T7 de pBluescript ou dos iniciadores específicos deduzidos da seqüência nucleotídica do ADNc. A compilação do conjunto de seqüências obtidas fornece a seqüência nucleotídica do ADNc delta-7Red de A. thaliana (SEQ ID N°. 1) representada na figura 3. Ela envolve 1496 nucleotídeos terminando por uma seqüência de poliadenilação. Ela apresenta uma fase de leitura aberta começando por uma metionina iniciadora ao nucleotídeo 76 e terminando por um códon de terminação ao nucleotídeo 1366. Daí resulta uma fase de leitura aberta de 1290 nucleotídeos que codificam para uma proteína de 430 aminoá-cidos. A região codificante do ADNc delta-7Red codifica para a proteína delta-7Red cuja seqüência deduzida em aminoácidos (SEQ ID N°. 2) está mostrada na figura 3. A seqüência da proteína compreende 430 aminoácidos que têm uma massa molecular calculada de 49,286 kDa.

Uma amostra de cepa E. coli DH5-1 contendo o ADNc delta-7Red no vetor pUC9N (designado ADNc delta-7Red/ pUC9N) foi depositada à CNCM em 10 de fevereiro de 1995 sob o número 1-1535. E - Determinação da seqüência consenso SEQ ID N°. 3 Por pesquisa informatizada nas bases de seqüên-cias (Genbank e EMBL), foi posto em evidência que a seqüência da proteína delta-7Red de A. thaliana apresenta certas similaridades de seqüência com outras esterol re-dutases, em particular a esterol C-14 redutase e a esterol C-24(28) redutase de S. cerevisiae descritas por R. T. Lorentz e outros (DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) e W. Chen e outros (Yeast, 7, 305-308, 1991) respectivamente assim como o produto do gene sts 1+ de S. pombe descrito por M. Shimanuki e outros (Mol. Biol. Cell, 3, 263-273, 1992) e da esterol C-14 redutase de Neurospora crassa (N°. X77955 na base EMBL). Além disso, a proteína del-ta-7Red mostra uma similaridade com os 400 aminoácidos da extremidade C-terminal do receptor da lamina B de frango e com a do receptor humano correspondente descritos por H. J. Worman e outros (J. Cell Biol., 111, 1535-1542, 1990) e E. Shuler e outros (J. Biol. Chem., 269, 11312-11317, 1994).

Alinhamentos de identidade de seqüência foram estabelecidos entre a seqüência de aminoácidos na SEQ ID N°. 2 deduzida do ADNc delta-7Red obtido acima e as das três esterol redutases de levedura e dos dois receptores de lamina B, depois uma seqüência consenso nova que tem a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N° 3): leu leu xaa xaa gly trp xaa gly xaa xaa arg xaa xaa xaa 15 10 tyr 15 na qual Xaa em posição 7 é Trp ou Tyr e Xaa em posição 12 é His ou Lys, foi definida para preparar oligonucleotídeos utilizáveis como iniciadores para amplificar por PCR novas seqüências de ADN genômico ou de ADNc que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. F - Expressão da proteína delta-7Red na levedura, a) construção do vetor de expressão delta-7/V8 induzível na levedura A eliminação das regiões não-codificantes do ADNc de PF22 foi efetuada pela técnica de amplificação PCR utilizando os seguintes oligonucleotídeos específicos : 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAGC TGTACATTC 3' (SEQ ID N° 4) et 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' (SEQ ID N“ 5) que foram definidos para introduzir um sítio de restrição BamH I imediatamente a montante do códon de iniciação e um sítio Κρη I imediatamente a jusante do códon stop. 0 ADNc foi amplificado a partir de 1 ng de plas-mídeo "ADNc delta-7Red/ pUC9N" na presença de 2 unidades de Pfu DNA polimerase e 0,2 μΜ de cada um dos iniciadores acima utilizando as condições de amplificação seguintes: 94 °C, 10S; 52 °C, 50S; 74 °C, 90s; 33 ciclos com o kit PCR de Stratagène.

Um fragmento de 1300 bp aproximadamente foi obtido, depois digerido pelas enzimas de restrição BamH I e Κρη I e inserido nos sítios BamH I e Κρη I do vetor naveta E. coli/ S. cerevisiae pYeDPl/ 8-2 (denomimnado V8) descrito por C. Cullin e outros (Gene, 65, 203-217, 1988) . V8 contém o marcador de seleção URA3 e contém um cassete de expressão na levedura que contém o promotor GAL10/ CYCl e a sequência terminador do gene PGK. O vetor assim obtido, denominado delta-7/ VS, permite a expressão induzível para a galactose da proteína delta-7Red. b) Produção da proteína delta-7Red A cepa de levedura FY 1679 (Mata) foi transformada com o plasmídeo delta-7/ V8 obtido acima utilizando o método com acetato de lítio descrito por D. Gietz e outros (já citado). A levedura transformada foi cultivada a 27 °C, em meio seletivo SGI descrito acima mas no qual a concentração em glicose é de 5 g/1, até a obtenção de uma saturação de densidade celular (DO600nm=12)· A cultura é em seguida diluída por adição de um volume de meio completo YP (10 g/1 em extrato de levedura (Difco) e 10 g/1 em bactopeptona (Difco)), depois adição de etanol (1,5% v/v) como fonte de carbono. Quando o crescimento permitiu atingir uma concentração celular de pelo menos 7xl07 cé-lulas/ml, a expressão da delta-7Red foi induzida por adição de galactose à concentração de 20 g/1. A indução foi também realizada em meio mínimo seletivo SLI, que corresponde ao meio SGI no qual a glicose é substituída pela galactose (20 g/1), até a obtenção de uma concentração celular de 2 x 107 células/ ml. c) Teste enzimático in vitro da atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase A expressão da proteína delta-7Red foi posta em evidência utilizando um teste enzimático descrito por M. Taton e outros (Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991) mas sem sistema de regeneração do NADPH, com preparações celulares microssomais ou citossólicas da levedura induzida acima.

As frações celulares foram obtidas por ruptura mecânica de células induzidas e isolamento das frações por ultracentrifugação de acordo com o método descrito por P. Urban e outros (Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994) . As células são coletadas depois lavadas duas vezes com o tampão TE-KC1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, KC1 0,1 M) e recolocadas em suspensão no tampão de lise TE-sorbitol 0,6 M. Esferas de vidro de 0,45-0,5 mm de diâmetro (Braun) são adicionadas até aflorar â superfície da suspensão celular que se agita em seguida durante 5 minutos a 4 °C. 0 lisado celular em superfície é recuperado e as esferas de vidro são lavadas três vezes com o tampão de lise. 0 lisado e as lavagens são reunidos depois centrifugados a 20.000 g durante 13 minutos a 4 °C de maneira a eliminar as frações mitocondriais. O sobre-nadante recolhido é centrifugado durante 1 hora a 100.000 g e a 4 °C. O produto de fundo que contém a fração micro-mossomal e o sobrenadante que representa a fração citos-sólica são recolhidos separadamente. A fração micromossomal ou a fração citossólica obtidas são incubadas respectivamente durante 90 minutos a 37 °C em tampão Tris/ HC1 100 mM a pH 7,3 contendo como substrato 7-desidrocolesterol 150 μΜ emulsifiçado com tween 80 (1,5 g/1) e na presença de NADPH 2 mM. Os este-róis são extraídos por adição de 3 volumes de mistura me-tanol-diclorometano (50:50, v/v) depois analisados em CPG comparativamente aos produtos padronizados. A formação de colesterol (TR = 15,887 mn) a partir de 7-desidrocolesterol (TR = 16,528 mn) é mostrada na figura 4 com uma fração micromossomal (3,5 mg/ml em proteína) obtida acima a partir da levedura FY 1679 transformada com o vetor delta-7/ V8, induzida durante 3 horas e cujos esteróis endógenos têm tempos de retenção superiores (TR = 16,682 mn para o ergosta 5-22 dieno 3-ol; (TR = 17,249 mn para o ergosterol e TR = 17,664 mn para o ergosta 5-eno 3-ol).

Estes resultados mostram que a proteína delta-7Red, por um lado é expressa na levedura transformada, por outro lado possui uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase. EXEMPLO 2: Redução in vivo de esterois endógenos de levedura insaturados em posição C-7 Cepas de levedura cujos esterois majoritários têm uma dupla ligação em posição C-5,7 foram transformadas com o vetor delta-7/ V8 obtido no exemplo 1, depois cultivadas e induzidas como indicado no exemplo 1. Os es-teróis endógenos, cujo perfil é analisado por CPG, foram extraídos e purificados por RP-HPLC como indicado no exemplo 1 utilizando uma coluna C18 preparativa (100 X 4,6 m), depois identificados por IV, UV, e RMN. As três cepas seguintes foram utilizadas respectivamente: - A cepa FY1679 descrita no exemplo 1; - A cepa mutante erg5, denominada PLC 1051, caracterizada por uma deficiência em esterol C-22 desaturase, que foi construída por cruzamento entre a cepa FY1679 e a cepa original pol5 descrita por S. W. Molzahn e outros, J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972) e que acumula ergosta 5,7-dieno 3-ol. - A cepa dupla mutante erg4,5, denominada PLC 1451, caracterizada por uma deficiência em esterol C-22 desaturase (erg5) e esterol C-24(28) redutase (erg4), foi obtida por cruzamento entre a cepa FY1679 e uma cepa pol5 descrita por S. W. Molzahn e outros (já citado) que adquiriu uma resistência espontânea à nistatina durante uma seleção sistemática de leveduras à pesquisa de mutantes de esterois e que acumula ergosta 5,7,24(28) trieno 3-ol. A cepa haplóide resultante, que contém a dupla mutação erg4, erg5, cresce na presença de galactose e de substra- to não fermentável e é auxótrofo para a uracila, o trip-tófano e a histidina. As cepas PLC 1051 e PLC 1451 foram depositadas na CNCM em 10 de fevereiro de 1995 sob os números 1-1536 e 1-1537 respectivamente.

Os esteróis reduzidos principais identificados respectivamente a partir das três cepas transformadas acima estão indicados na tabela a seguir: EXEMPLO 3: Produção de pregnenolona in vitro por divagem de esteróis endógenos de levedura reduzidos em C-7 A produção de pregnenolona é realizada utilizando o teste enzimático de divagem da cadeia lateral do colesterol in vitro descrito por Wada e outros (Arch. Bi-ochem. Biophys., 290, 376-380, 1991) no qual 260 μΜ de um esterol reduzido em C-7 obtido no exemplo 2 são incubados em 150 μΐ de tampão fosfato 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 0,3% na presença de 140 nM de adrenodoxina redu-tase, de 1,16 μΜ de adrenodoxina e de 0,68 μΜ de citocro- mo P450SCC de origem bovina obtidos a partir de glândulas supra-renais por exemplo segundo D. W. Seybert e outros, J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979. A reação é deslanchada por adição de 150 μΜ de NADPH. Após uma incubação de 80 minutos a 37 °C, a reação é interrompida por adição de um volume de mistura metanol -diclorometano (50:50 v/v). Os esteróis são extraídos e analisados por CPG como indicado no exemplo 1. A figura 5 mostra respectivamente que o ergosta 5-eno 3-ol (fig. 5A), o ergosta 5,24(28} dieno 3-ol (fig. 5B) ou ergosta 5,22 dieno 3-ol (fig. 5C) é substrato do citocromo P450SCC e conduz a um produto que tem um TR idêntico ao da pregnenolona obtida nas mesmas condições por divagem do colesterol.

Os resultados obtidos mostram que uma levedura transformada que exprime a delta-7Red acumula esteróis utilizávies diretamente para preparar pregnenolona por oxidação biológica in vitro. EXEMPLO 4: Construção de cepas de levedura que produzem in vitro a pregnenolona ou seu éster acético A - Construção da cepa ELR01 contendo um cassete de expressão para a delta-7-Red de A. thaliana integrada no locus ADE2 da cepa haplóide FY1679 do tipo "mating"a (FY1679 Mata) a) Construção do plasmídeo integrativo pADdelta-7 (ρΑϋΔ7): A construção do plasmídeo pADÁ7 foi conduzida como descrito na figura 6. 0 fragmento BgiII (2244pb) contendo o gene ADE2 de S. cerevisiae foi isolado do plasmídeo pASZ 11 (A. Stotz e outros, Gene, 95, 91, 1990) e inserido no vetor pBluescriptII KS+ (Stratagène) ao sítio BamHI do sítio de clonagem múltipla. 0 plasmídeo obtido, denominado pBS-ADE2, foi em seguida linearizado em seu sítio Stu I único e desfosfo-rilado.

Um fragmento de 2,44 kb aproximadamente contendo o promotor GAL10/ CYC1, a fase codificante da delta-7Red (esterol Al redutase) e o terminador PGK (tPGK) foi obtido a partir do plasmídeo delta-7/ V8, obtido no exemplo 1F pela técnica de PCR utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos seguintes: 5 1GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3 1 (SEQ ID N° 6) et 5' AGATCTTGAG AAGATGCGGA CAGCAAAAC 3' (SEQ ID N° 7) que foram definidos para se emparelhar respectivamente com a extremidade 3' de tPGK e a extremidade 31 do gene URA3. Foi utilizado o plasmídeo delta-7/ V8 como matriz (80 ng), os oligonucleotídeos acima (0,5 μΜ cada um), a Pfu DNA polimerase nativa (1 unidade no tampão recomendado por Stratagène) e as condições de amplificação seguintes: 35 ciclos; 1 minuto a 95 °C; 5 s a 95 °C; 30 s a 56 °C; 4 minutos 30 s a 70 °C). 0 fragmento de amplificação obtido foi em seguida clonado com extremidades francas no plasmídeo pBS-ADE2 linearizado acima para fornecer o plasmídeo pADÁ7 no qual o fragmento NotI-PstI de 4720 aproximadamente contém o gene ADE2 interrompido pelo cassete de expressão da delta-7Red. b) Integração cromossômica na cepa de levedura FY1679 Mata: O fragmento NotI-PstI (4720 bp) , isolado a partir do plasmídeo pADÁ7 digerido com as enzimas de restrição Notl e PstI, foi introduzido na levedura FY1679 Mata por transformação utilizando o método com acetato de lí-tio descrito por D. Gietz e outros (já citado).

Os transformantes que integraram este fragmento por recombinação homóloga foram selecionados por sua resistência â nistatina, este fenótipo sendo conseqüência da expressão da delta-7Red que converte os delta-5,7-esteróis da levedura em delta-5 esteróis.

As células transformadas foram incubadas a 28 °C durante 4 horas em meio completo YP descrito no exemplo 1F contendo glicose (20 g/1) e suplementado em adenina (20 mg/1). Elas foram em seguida concentradas depois espalhadas sobre um meio mínimo SLI-ágar (1 g/1 de bactoca-saminoácidos; 7 g/1 de "yeast nitrogen base"; 20 g/1 de galactose; 20 mg/1 de adenina; 20 g/1 de ágar) e incubadas durante uma noite a 28 °C para induzir a expressão do gene da delta-7Red. A ausência de complementação em ura-cila permite limitar o crescimento das células. Os clones foram recuperados, agrupados depois espalhados em placas sobre um meio completo YP contendo galactose (20 g/1), suplementado em adenina (20 mg/1) e na presença de concentrações crescentes de nistatina (0 /xg/ml, 1 /ig/ml, 2 ^g/ml, 5 (ig/ml, 20 /ig/ml respectivamente). No 4o. dia, foram obtidos uns vinte clones que cresceram à concentração de 5 μg/ml em nistatina. Doze destes clones foram re-picados em placas em meio mínimo WO (7 g/1 de "yeast ni-trogen base" sem aminoácidos, 20 g/1 de glicose) enriquecido em uracila, leucina, triptófano, histidina e adenina (20 mg/1 cada um). A auxotrofia para a adenina em consequência da ruptura do gene ADE2 foi em seguida confirmada observando a ausência de crescimento sobre o meio mínimo WO descrito acima enriquecido em uracila, leucina, triptófano, histidina porém desprovido de adenina. A presença do cassete de expressão no genoma da levedura foi controlada por amplificação por PCR a partir do ADN genômico dos clones obtidos e utilizando os inici-adores que têm as seqüências SEQ ID N°. 6 e SEQ ID N°. 7 acima. A funcionalidade do gene delta-7Red integrado foi confirmada pela análise por CPG da composição em es-teróis acumulados na levedura e extraídos por saponifica-ção alcalina de acordo com o modo de operação descrito no exemplo 1B com uma coluna capilar SE 30 de cinco metros (Alltech). A análise mostra um perfil modificado que compreende esteróis saturados em C-7 quando os clones são cultivados na presença de galactose. A cepa obtida, denominada ELR01, acumula ergosta 5 eno 3-ol e ergosta 5,22 dieno 3-ol em lugar de ergosta 5, 7, 22. trieno 3-ol (ergosterol), esterol majoritário da cepa FY1679 inicial como foi mostrado na figura 7. A cepa ELR01 assim construída expressa 0 gene da delta-7Red quando ela é cultivada na presença de galacto-se por causa do controle transcripcional para o promotor GAL10/ CYC1. Se bem que a unidade de expressão para a delta-7Red tenha o mesmo sentido de transcrição que o gene ADE2, nenhuma expressão da delta-7Red é detectável por análise da composição em esteróis por CPG quando a cultura é efetuada na presença de glicose, como uma conseqüên-cia da repressão do promotor GAL10/ CYC1. B - Construção da cepa CDR01 que contém um cassete de expressão para a forma madura da adrenodoxina redutase bovina (ADRm) integrada entre os loci LEU2 e SPL1 da cepa haplóide FY1679 do tipo "mating" alfa (mat alfa). a) Construção do vetor naveta E. coli-S. cerevisiae V13 0 vetor V13 corresponde ao vetor V8 (C. Cullin e outros, já citado) que contém 0 marcador de seleção URA3 e um cassete de expressão na levedura que contém 0 promotor GAL10/ CYC1 (pG/C) e no qual um sítio Sall (Sa) suplementar foi introduzido no sítio de clonagem múltiplo, segundo o esquema de construção dado na figura 8. 0 vetor V8 foi digerido pelas enzimas de restrição HindIII e BamHI e 0 fragmento BamHI-HindIII obtido (1722 bp) que contém o gene URA3 e 0 promotor GAL10/ CYC1 (citado mais adiante como "ura-gal"). foi subclonado entre os sítios correspondentes do vetor pUC18 (Pharmacia) digerido pelas enzimas de restrição HindIII e BamHI 0 fragmento "ura-gal" foi em seguida amplificado por PCR a partir de 30 ng do plasmídeo obtido pUC18/"ura-gal" desnaturado durante 30 s a 95 °C utilizando as seguintes condições: 30 ciclos; 5 s a 86 °C; 10 s a 95 °C; 40 s a 38 °C; 5 s a 55 °C e 2 minutos a 74 °C), 2 unidades de Taq DNA polimerase (Boehringer) no tampão do fabricante e 1 |iM de cada um dos iniciadores que tem as se-qüências nucleotídicas seguintes: 5' GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3' (SEQ ID N° 8) e 5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3' (SEQ ID N° 9} O iniciador SEQ ID N°. 8 contém um sítio BamHI GGATCC idêntico ao do fragmento "ura-gal", 3 nucleotídeos consecutivos ao sítio BamHI hibridizando-se apenas na matriz, um sítio Sall GTCGAC e uma seqüência homóloga â do promotor GAL10/ CYC1. O iniciadoar SEQ ID N°. 9 se emparelha na seqüência anterior que precede o sítio HindIII do sítio de clonagem múltipla de pUCl8. O fragmento Hin-dlII-Bam HI de 1722 bp obtido após a amplificação foi digerido por Xhol e BamHI que libera um fragmento de 254 pb que contém o promotor GAL10/ CYC1 (pG/C) que foi em seguida subclonado no vetor V8 digerido pelas enzimas de restrição BamHI e Xhol. 0 vetor V13 resultante contém os sítios de restrição que permitem subclonar facilmente os ADNc que co- dificam para a adrenodoxina redutase bovina madura (ADRm), a adrenodoxina bovina madura (ADXm) e o citocromo P450SCC bovino.

A partir do vetor V13, o vetor V13-ADR, 0 vetor V13-ADX e 0 vetor V13-SCC10 foram respectivamente preparados da maneira a seguir: alfa) Construção do vetor V13-ADR

Um fragmento Sall-Kpnl de 1478 pb que contém o ADNc que codifica para ADRm foi isolado do plasmídeo pGBADR-2 descrito no exemplo 25 do pedido de patente européia EP 340.878 e subclonado nos sítios correspondentes do vetor V13 para fornecer o vetor V13-ADR. beta) Construção do vetor V13-ADX

Um fragmento Sall BamHI de 390 pb que contém 0 ADNc que codifica para ADXm foi isolado do plasmídeo pGBADX-1 descrito no exemplo 23 do pedido de patente européia EP 340.878 e subclonado nos sítios correspondentes do vetor V13 para fornecer o vetor V13-ADX. gama) Construção do vetor V13-SCC10 Um fragmento Sall EcoRI de 1554 pb que contém o ADNc que codifica para P450SCC foi isolado do plasmídeo pGBSCC-10 descrito no exemplo 6 do pedido de patente européia EP 340.878 e subclonado nos sítios correspondentes do vetor V13 para fornecer o vetor V13-SCC10. b) Construção dos plasmídeos integrativos pCD62-l e pCD62-2: A construção dos plasmídeos pCD62-l e pCD62-2 foi conduzida como descrito na figura 9.

alfa) Construção do plasmídeo pFL26CD

Um sítio Notl foi introduzido no plasmídeo pFL26 (N. Bonneaud e outros, Yeast, 7, 609-615, 1991), na região intergênica que separa o gene leu2 da extremidade 5' do gene spll (citada como spllÁ) (C. Kolman e outros, J. Bacteriol., 175, 1433, 1993) de acordo com o modo de operação a seguir: Dois fragmentos de ADN de 704 pb e 347 pb que contêm respectivamente a extremidade 5' de leu2 e a extremidade 3' de SpllA foram sintetizados por PCR com a ajuda dos iniciadores que têm as seguintes seqüências nu-cleotídicas: 5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3' (SEQ ID N° 10) e 5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3' (SEQ ID N° 11) para a amplificação do fragmento de 704 pb e as seqüências nucleotídicas 51 CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' (SEQ ID N° 12) e 5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3' (SEQ ID N° 13) para a amplificação do fragmento de 347 pb.

Os iniciadores SEQ ID N°. ll e SEQ ID N°. 12 possuem uma seqüência GGCGGCCG que corresponde a um sítio Notl e na qual 3 bases não se emparelham com a matriz. 0 iniciador SEQ ID N°. 10 se emparelha a uma sequência situada 536 pb a montante do códon stop de leu2 e o iniciador SEQ ID N°. 13 se emparelha a uma seqüência situada 194 pb a montante daquele de spllA.

Os fragmentos de 704 pb e de 347 pb são primeiro amplificados por PCR utilizando como matriz o plasmídeo pFL26 e como enzima a Pfu DNA polimerase nas condições padronizadas descritas pelo fornecedor (Stratagène).

Os dois amplificados obtido se emparelham sobre 20 pb ao nível das extremidades geradas pelo iniciador SEQ ID N°. 11 (fragmento 704 pb) e o iniciador SEQ ID N°. 12 (fragmento 347 pb) a partir da extremidade 5'; estes 20 pb correspondem respectivamente aos 20 primeiros nu-cleotídeos de cada um destes iniciadores. O produto resultante do emparelhamento dos fragmentos de ADN de 704 pb (1 ng) e de 347 pb (2 ng) foi amplificado, utilizando os iniciadores SEQ ID N°. 10 e SEQ ID N°. 13 e as seguintes condições: 30 ciclos de 10 s a 95°C, 5 s a 60°C, 1 minuto a 45°C, 5 s a 65°C e 2 minutos a 72°C seguidos de um ciclo de 7 minutos a 71°C; 50 pmo-les de cada iniciador e 1 unidade de Pfu DNA polimerase em 50 μΐ de tampão de reação (Stratagène) . Um fragmento amplificado de 1031 pb que contém um sítio de corte Notl foi obtido. Este fragmento foi em seguida digerido pelas enzimas BstXI e Nsil e o fragmento de 920 pb obtido, que contém o sítio Notl, foi inserido no lugar do fragmento BstXI-Nsil inicial de pFL26 para fornecer o plasmídeo pFL26CD, cujo mapa é representado na figura 9a beta) Construção do plasmídeo pCD60 - Preparação do plasmídeo pDP10036: Um fragmento SalI-BamHI de 390 pb que contém o ADNc que codifica para a adrenodoxina bovina madura (ADXm) foi isolado do plasmídeo V13-ADX depois subclonado nos sítios SalI-BglII do sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pTG10033 que é flanqueado do promotor induzível GAL10/ CYC1 e do terminador ter PGK. 0 plasmídeo pTG10033, cujo mapa é representado na figura 18 e que corresponde ao vetor de expressão pTGl003l (figura 17), que contém o promotor CYC1 e terPGK, no qual o promotor CYC1 foi substituído pelo promotor GAL10/ CYC1 foi preparado de acordo com o modo de operação descrito mais adiante . O plasmídeo assim obtido, denominado pDP10034, contém o cassete de expressão ADX, ou seja o gene que codifica para ADXm sob o controle transcripcional de GAL10/CYC1 e terPGK. Conseqüentemente, o termo "cassete de expressão" será empregado para qualquer gene sob a dependência transcripcional de GAL10/CYC1 e terPGK.

Um fragmento HindIII de 3593 pb que contém o marcador de seleção URA3 e o cassete de expressão ADR foi isolado a partir do plasmídeo V13-ADR digerido pela enzima de restrição HindIII depois inserido no sítio correspondente do plasmídeo pDP10034 digerido pela enzima de restrição HindIII. 0 plasmídeo obtido, denominado pDP10036, contém os cassetes de expressão ADX e ADR sepa- rados um do outro pelo marcador URA3 (figura 9c). - Preparação do plasmídeo pCD60: 0 fragmento AflIII-AccI de 2770 pb que contém o cassete ADR foi isolado por digestão parcial do plasmídeo pDP10036 com as enzimas de restrição AflIII e Accl, tornado livre de pontas por tratamento com o fragmento de klenow da ADN polimerase I e subclonado após ligação às superfícies retas ("à bouts francs") no sítio Smal do plasmídeo pBluescript KS+ (Stratagène). No plasmídeo obtido, denominado pCD60, o cassete de expressão ADR é enquadrado de um lado e do outro de um sítio Notl, um se situando a 209 pb a montante do sítio de ligação AflIII/Smal e proveniente do fragmento subclonado e o outro proveniente do sítio de clonagem múltipla (SCM1) de pBluescript KS+ (figura 9b). gama) Construção dos plasmídeos pCD62-l e pCD62-2: 0 fragmento Notl de 2558 pb, isolado a partir do plasmídeo pCD60 digerido pela enzima de restrição Notl, foi em seguida subclonado no sítio único Notl do plasmídeo pFL26CD. Segundo o sentido da inserção do fragmento, foram obtidos dois plasmídeos, denominados pCD62-l e pCD62-2 (figura 9c) .

No plasmídeo pCD62-l, o cassete de expressão ADR é orientado no sentido da transcrição do gene leu2 ao passo que esta orientação é inversa no plasmídeo pCD62-2. O plasmídeo pCD62-l foi mantido para as construções ulteriores. c) Integração cromossômica na cepa de levedura FY1679 (Matalpha): 0 plasmídeo pCD62-l contém regiões homólogas a um locus cromossômico da cepa FY1679. Estas regiões correspondem, respectivamente, aos fragmentos BglII-Clal de 1060 pb (A), EcoRI-Notl de 707 pb (B) e NotI-BglII de 602 pb (C) indicadas na figura 10. A região correspondente ao fragmento Clal-EcoRI de 486 pb do plasmídeo pCD62-l foi eliminada na cepa FY1679, implicando uma auxotrofia desta cepa em relação à leucina (cepa LEU2') (R. S. Sikorski e outros, Genetics, 122, 19, 1989). 0 plasmídeo pCD62-l foi linearizado por digestão com a enzima de restrição Xbal, cujo sítio de corte está situado no exterior das regiões homólogas, depois foi introduzido por transformação na cepa FY1679 (Matalpha), utilizando o método com acetato de lítio (D. Gietz e outros, já citado). A capacidade de reparação celular do ADN pela levedura ("gap repair") e a seleção de recombinantes que têm o fenótipo LEU2+ permitiram selecionar em um primeiro tempo dois tipos de recombinantes: o Io tipo é obtido após recombinações homólogas ao nível dos fragmentos A e B, o 2a tipo é obtido após recombinações homólogas ao nível dos fragmentos A e C. Apenas este último tipo de re-combinação permitiu a integração do cassete de expressão ADR além da restauração do fenótipo LEU2+.

Para seleciontar este 2° tipo de clone, foi realizada uma seleção por PCR, utilizando-se o iniciador SEQ ID N°. 10 aqui antes e o iniciador que tem a seqüência nucleotídica a seguir: 5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' (SEQ ID N° 14) de maneira a confirmar ao mesmo tempo a presença e a localização correta do cassete de expressão ADR no genoma da cepa FY1679 (Matalpha).

Nesta seleção, o iniciador SEQ ID N°. 14 se emparelha exclusivamente à seqüência que codifica para ADRm e o iniciador SEQ ID N°. 10 se emparelha a uma seqüência cromossômica (figura 10). A reação de amplificação foi realizada utilizando como matriz o ADN genômico (20 ng) isolado da cepa FY1679 (Matalpha) (C. Hoffman e outros, Gene, 57, 267, 1987), a Taq DNA polimerase (1U, Boehringer), 50 pmoles de cada iniciador e 30 ciclos de PCR (10 s a 95°C, 1 minuto a 55°C, 3 minutos a 72°C) nas condições padrões descritas pelo fornecedor. A amplificação conduziu ao isolamento de um fragmento de 2,9 kb correspondente ao caso em que o cassete de expressão foi integrado. No caso contrário, nenhum produto de amplificação foi detectado. A cepa FY1679 (Matalpha) assim selecionada que contém o cassete de expressão ADR integrado foi denominada CDR01. A expressão de ADR por esta cepa foi posta em evidência a partir de frações celulares citossólicas pre- paradas de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1F, por imunodetecção da proteína reconhecida por anticorpos anti-ADR. A funcionalidade do ADR expressa pela cepa CDR01 foi confirmada no teste de divagem enzimática da cadeia lateral do colesterol in vitro descrito no exemplo 3 e no qual o ADR purificado (0,28 pmol) foi substituído por uma fração celular citossólica da cepa CDR01 que contém 100 jtig de proteínas totais. Foi observada uma taxa de biocon-versão do colesterol em pregnenolona de aproximadamente 25%, comparável à obtida com o ADR purificado. C - Construção da cepa diplóide EC01 que coexpressa a delta-7Red de A. thaliana e o ADRm. A cepa diplóide EC01 foi obtida por cruzamento das cepas haplóides CDR01 e ELR01 obtidas acima segundo o protocolo descrito por G. Sprague e outros (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991): Uma primeira seleção sobre meio mínimo WO descrito anteriormente, enriquecido em uracila, triptófano e histidina (20 mg/1 cada um) mas desprovido de leucina, permitiu isolar clones diplóides LEU2+ (caráter de proto-trofia que testemunha a presença do cassete de expressão ADR). Estes clones foram em seguida testados para sua resistência à nistatina a 5 μg/ml (caráter de resistência que testemunha a presença do cassete de expressão da del-ta-7Red) sobre o meio sintético sólidio SLI-ágar descrito anteriormente.

Uma cepa, denominada EC01, foi assim isolada ar- bitrariamente entre os clones resistentes a nistatina. D - Construção da cepa EC01/pCD63 produtora de pregneno-lona e de 3-acetato de pregnenolona. a) Construção do plasmídeo de expressão pCD63. A construção do plasmídeo pCD63 foi conduzida como descrito na figura ll. 0 fragmento Notl de 4961 pb contendo o cassete de expressão ADX, o marcador de seleção URA3 e o cassete de expressão ADR foi isolado a partir do plasmídeo pDP10036 preparado acima e digerido com a enzima de restrição Notl, depois clonado no sítio Notl do sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pFL45L (N. Bonneaud e outros, Yeast, 7, 609, 1991). 0 vetor assim obtido, denominado pDP10037 é representado na figura 11.

Por um lado, o plasmídeo pDP10037 foi lineariza-do por digestão com a enzima Tthllll, cujo sítio de corte se situa no gene que codifica para ADRm.

Por outro lado, um fragmento PvuII-EcoRV de 3476 pb contendo o cassete de expressão P450SCC e a extremidade 5' do marcador URA3 foi purificado a partir do plasmídeo V13-SCC10 obtido anteriormente e digerido com as enzimas de restrição PvuII e EcoRV.

Os dois ADN lineares, respectivamente, obtidos têm regiões homólogas que correspondem por um lado â extremidade 5' do gene URA3 e a GAL10/ CYC1, por outro lado a ter PGK como está representado na figura 11a.

Estes dois fragmentos foram em seguida introduzidos na cepa de levedura FY1679 (Mata) por co- transformação pelo método com acetato de lítio (D. Gietz e outros, já citado). A seleção seguinte de recombinantes protótrofos para a uracila e o triptófano (URA3+, TRP1+), permitiu isolar clones nos quais fratura duplo filamento gerada por digestão pela enzima de restrição Tthllll foi reparada em conseqüência da integração do cassete de expressão P450SCC por recombinação homóloga. A seleção dos recombinantes (URA3+, TRPl+) foi realizada sobre 0 meio mínimo WO enriquecido em leucina, histidina e leucina (20 mg/1 cada um) mas desprovido de uracila e de triptófano. A partir de 50 clones reunidos, o ADN total foi extraído pelo método descrito por C. Ho-ffman e outros, (Gene, 57, 267, 1987), depois introduzido por eletroporação na cepa de E. coli XLl-Blue (Stra-tagène). Os clones transformados pelo plasmídeo gerado por "gap repair" foram selecionados sobre o meio rico LB (triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%) contendo 50 mg/1 de ampicilina. A partir de um dos clones selecionados, 0 plasmídeo, denominado pCD63, foi extraído segundo o método descrito por J. Sambrook e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. O plasmídeo pCD63 obtido contém os cassets de expressão ADX e P450SCC separados pelo marcador de seleção URA3, como está representado na figura 11 b. b) Transformação da cepa EC01 pelo plasmídeo pCD63. O plasmídeo pCD63 foi introduzido na cepa EC01 obtida acima por transformação pelo método com acetato de lítio (D. Gietz e outros, já descrito). A levedura transformada foi em seguida cultivada sobre o meio mínimo WO descrito anteriormente e desprovido de uracila, de trip-tófano, de adenina e de leucina, porém suplementado em histidina (20 mg/1). A cepa, denominada EC0l/pCD63, foi assim isolada. Uma amostra da cepa, sob a referência EC01/ pCDS3, foi depositada na CNCM em 10 de fevereiro de 1995 sob o número 1-1538. c) Produção in vivo de pregnenolona e de 3-acetato de pregnenolona. A cepa EC01/ pCD63 foi cultivada a 28°C em aero-biose (130 rotações por minuto) em um Erlenmeyer de 3 litros até que ela atingisse a fase estacionária de crescimento (D0600 = 12 a 13) no meio seletivo SGI descrito no exemplo IA e no qual a concentração de glicose é de 5 g/1. A cultura é em seguida diluída por adição de um volume do meio completo YP descrito acima, depois adição de etanol (0,5% v/v) como fonte de carbono. Quando foi atingida uma nova fase estacionária de crescimento (DO600 = 12 a 13), foi adicionada galactose (20 g/1) â cultura, sob forma de solução concentrada (500 g/1), de maneira a induzir simultaneamente a expressão dos genes que codificam para ADXm, ADRm, P450SCC e delta-7 Red que estão respectivamente sob o controle do promotor GAL10/ CYC1. A co-expressão dos quatro genes foi posta em evidência por análise dos esteróis acumulados, respectivamente, nas células e no sobrenadante da cultura de acordo com o modo de operação a seguir Amostras de 50 ml de cultura são recolhidas após 9 horas e 24 horas de indução. Cada amostra é centrifugada (4.000 g, 10 minutos, 4 °C) de maneira a separar as células do meio de cultura.

Por um lado, as células são lisadas por ruptur mecânica na presença de esferas de vidro de acordo com o método indicado no exemplo 1F. A partir do lisado assim obtido, os esteróis intracelulares são em seguida extraídos por adição de um volume de hexano.

Por outro lado, os esteróis presentes no meio de cultura são extraídos diretamente por adição de um volume de hexano. A composição de esteróis extraídos é analisada por CPG como indicado no exemplo 1, comparativamente a produtos padronizados.

Os resultados obtidos após 9 horas ou após 24 horas de indução são mostrados respectivamente na figura 12a e na figura 12b.

Após 9 horas de indução, a figura 12a mostra: - no lisado celular, a presença de um composto majoritário que tem um tempo de retenção idêntico ao do acetato de pregnenolona padrão (TR = 11,8 minutos) ao passo que um pico apenas muito fraco está presente no tempo de retenção da pregnenolona (TR = 9,9 minutos). Baixas quantidades de esteróis endógenos da levedura reduzidos em C-7 (ergosta 5-eno 3-ol e ergosta 5,22 dieno 3-ol) são identificados respectivamente a TR=18 minutos e TR=17 minu- tos. A saponificação alcalina do lisado celular antes da análise conduz à presença de um composto majoritário co-migrando com a pregnenolona. Isto permite confirmar que o composto acumulado que tem um TR de 11,8 minutos corresponde ao acetato de pregnenolona. - no meio de cultura, a ausência significativa de pregnenolona ou de seu acetato.

Após 24 horas de indução, a figura 12b mostra: - no lisado celular, a presença de baixas quantidades de pregnenolona (TR = 10,2 minutos), e de acetato de pregnenolona (TR = 12 minutos) assim como esteróis endógenos da levedura reduzidos (TR = 17 minutos e TR = 18 minutos). O colesterol (TR = 16,2 minutos) é um padrão interno adicionado antes da extração. - no meio de cultura, a presença majoritária de acetato de pregnenolona e de uma quantidade mínima de pregnenolona.

Experiências realizadas em paralelo com a cepa EC01 transformada por um plasmídeo de controle, tal como pFL45L já citado, não mostram pico algum correspondente â pregnenolona livre ou sob forma de acetato. A identificação dos esteróis assim realizada mostra que a cepa de levedura EC01/ pCD63 acumulou pregnenolona e acetato de pregnenolona na ausência de qualquer fonte de esteróis exógenos, após indução na presença de galactose com uma produção principal após uma indução de 9 horas.

Estes resultados demonstram por um lado a mobi- lização eficaz dos esteróis endógenos reduzidos em posição C-7 da cepa EC01, por outro lado a extrema eficácia de acoplamento da reação de corte da cadeia lateral dos esteróis endógenos.

Preparação do exemplo 4: construção do plasmídeo pTG10033 1. Derivado de pUC19 que tem um novo sítio de clonagem múltipla: 0 vetor de clonagem M13ampl9 (C. Yanish-Peron e outros, Gene, 33, 103, 1985) foi mutagenizado utilizando o seguinte oligonucleotídeo, 5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3' (SEQ ID N° 15) para introduzir um sítio Notl na seqüência do gene lacl truncado e fornecer o plasmídeo M13TG724.

Um "polylinker" contendo os sítios EcoRI, SnaBI e Notl foi em seguida introduzido no sítio EcoRI do plasmídeo M13TG724 utilizando os oligonucleotídeos seguintes, 5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3’ (SEQ ID N° 16) e 5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3' (SEQ ID N° 17) para fornecer o plasmídeo M13TG7244 no qual uma modificação da inserção foi observada durante o estágio de amplificação. A inserção do plasmídeo M13TG7244 tem a seqüência nucleotídica seguinte, GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCAGTGGGGGT na qual os sítios EcoRI, SnaBI e Notl são sublinhados e a seqüência lacZ de pUC19 está em itálico.

Após digestão do plasmídeo M13TG7244 pelas enzimas de restrição EcoRI e SstI, um "polylinker" contendo os sítios MluI e Avrll foi introduzido utilizando os oli-gonucleotídeos seguintes 5' CAACGCGTCC TAGG 3' (SEQ ID N° 18) e 5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3' (SEQ ID N° 19) .

Após digestão com a enzima PvuII, o fragmento PvuII obtido foi subclonado em pUC19 (C. Yanish-Perron e outros, já citado) para fornecer o plasmídeo pTG7457 (figura 13). 2. Subclonagem do terminador PGK: pUC19 foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e um novo polylinker BamHI SstI foi introduzido utilizando os oligonucleotídeos seguintes 5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' (SEQ ID N° 20), 5' AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3' (SEQ ID N°21), e 5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3' (SEQ ID N° 23) . O plasmídeo pTG7453 foi assim obtido (figura 14) depois foi em seguida digerido pelas enzimas de restrição BamHI e SstI. Os sítios do "polylinker" entre BamHI e SstI foram introduzidos em um derivado do plasmídeo pTG7457 obtido acima e digerido pelas enzimas de restri- ção BamHI e SstI. 0 novo plasmídeo obtido contém os sítios PvuII, HindIII, BamHI, EcoRI, Xbal, Smal, Bglll, SstI (=SacI), MluI, Avrll, EcoRI, SnaBI, Notl, Sna BI, Pvul.

Este novo plasmídeo foi digerido pelas enzimas de restrição Bglll e HindIII e um fragmento BglII-HindIII contendo o promotor PGK (R. A. Hitzeman e outros, Nucleic Acids Res., 10, 7791, 1982; G. Loison e outros, Yeast, 5, 497, 1989) foi inserido neste para fornecer o plasmídeo PTG10014 (figura 15). 3. Subclonagem de promotores: a) o promotor CYC1 Os sítios do "polylinker" entre BamHI e SstI do plasmídeo pTG7453 foram introduzidos em um derivado do plasmídeo pTG7457 como indicado acima. 0 novo plasmídeo obtido foi clivado pela enzima de restrição SnaBI, depois o fragmento Rsal-Dral de 456 bp do plasmídeo pEMBL8 (L. Dente e outros, Nucleic Acids Res., 11, 1645, 1983) contendo a origem de replicação do fago fl foi introduzido para fornecer o plasmídeo pTG7503. O fragmento BamHI HindIII de 0,78 kb do plasmídeo pGBSCC-9, preparado no exemplo 6 do pedido de patente européia EP 0.340.378 e contendo o promotor CYC1 de S. cerevisiae, um "polylinker" e o terminador lactase de K. lactis, foi subclonado no plasmídeo pTG7503 digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI para fornecer o plasmídeo pTG10004 (figura 16).

Os sítios Xhol e MluI do promotor CYC1 foram em seguida eliminados por mutagênese dirigida do ADN de filamento duplo do plasmídeo pTG10004 utilizando o oligonu-cleotídeo seguinte 5' GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3' (SEQ ID N° 24). 0 plasmídeo pTG10005 assim obtido foi em seguida digerido pelas enzimas de restrição Sall e Xhol depois um sítio MluI foi introduzido utilizando os oligonucleotí-deos seguintes, 5' TCGACGGACG CGTGG 3' (SEQ ID N° 25) e 5' TCGACCACGC CTCC 3' (SEQ ID N° 26) para fornecer o plasmídeo pTGl0006. b) o promotor GAL10/ CYC1. 0 plasmídeo pYeDPl/8-2 (C. Cullin e outros, Gene, 203, 1988) foi aberto com a enzima de restrição Xhol. As extremidades coesivas criadas foram preenchidas com a ajuda do fragmento de Klenow da ADN polimerase depois o plasmídeo foi religado. 0 plasmídeo pTGlOOlO assim obtido no qual o promotor GAL10/ CYC1 não contém mais sítio Xhol é utilizado como matriz para uma amplificação por PCR. 4. Construção do vetor de expressão pTG10031 A parte restante da seqüência codificante de lacZ foi eliminada no plasmídeo pTG7503 por mutagênese dirigida utilizando o oligonucleotídeo seguinte, 5' TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' (SEQ ID N° 27) para fornecer o plasmídeo pTG7549. 0 promotor LacZ presente no plasmídeo pTG7549 foi em seguida eliminado utilizando os seguintes nucleo-tídeos 5' GGCCGCAAAA CCAAA 3' (SEQ ID N° 28) e 5' AGCTTTTGGT TTTGC 3' (SEQ ID N° 29) que são inseridos no plasmídeo previamente digerido pelas enzimas de restrição Notl e HindIII e que restauram os dois sítios para fornecer o plasmídeo pTG7553.

Um fragmento BamHI MluI contendo o promotor CYC1 foi obtido a partir do plasmídeo pTG10006 digerido pelas enzimas de restrição BamHI e MluI, e um fragmento MluI HindIII contendo o promotor PGK foi isolado a partir do plasmídeo pTG10015 digerido pelas enzimas de restrição MluI e HindIII. Estes dois fragmentos foram ligados e o produto de ligadura obtido foi inserido no plasmídeo pTG7553 previamente digerido pelas enzimas de restrição MluI e HindIII. 0 oligonucleotídeo seguinte 5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3' (SEQ ID N° 30) hibridizado com o oligonucleotídeo seguinte, 5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3' (SEQ ID N° 31) . que constitui um "linker" BamHI MluI contendo sítios Ciai e Notl, foi adicionado e ligado para fornecer o vetor de expressão pTG 10031 (figura 17). 0 fragmento amplificado por PCR obtido acima a partir do plasmídeo pYeDPl/8-2 foi digerido com as enzimas de restrição Ciai e Sall depois foi introduzido no plasmídeo pTG10031 previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição para fornecer o plasmídeo pTG10033 (figura 18).

LISTA DE SEQÜÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) DEPOSITANTE: (A) NOME: ROUSSEL UCLAF (B) RUA: 102, Route de Noisy (C) CIDADE: ROMAINVILLE

(E) PAIS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 93230 (G) TELEFONE: 49,91,49,91 (H) FAX: 49.91.46.10 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Seqüência de ADN codificando para uma proteína de A. thaliana que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, proteína del-ta-7-Red, processo de produção, cepas de leveduras transformadas, aplicações. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 31 (iv) FORMA DECIFRÁVEL PELO COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Floppy disk (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA DE EXPLORAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIAL: Pantenln Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 9501723 (B) DATA DE DEPÓSITO: 15 DE FEVEREIRO DE 1995 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 9506517 (B) DATA DE DEPÓSITO: 01 DE JUNHO DE 1995 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1496 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (ix)CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CLE:CDS (B) LOCALIZAÇÃO; 76..1365 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 1: GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111 Met Ala Glu Thr Vai His Ser Pro Ile Vai Thr Tyr 15 10 GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159 Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Vai 15 20 25 Ile Leu CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207 leu trp tyr thr met vai his gin asp gly ser vai thr gin 30 35 40 thr phe GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255 gly phe phe trp glu asn gly vai gin gly leu ile asn ile 45 50 55 trp pro 60 AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303 Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly 65 70 Ala Phe 75 GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351 Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Vai Glu 80 85 90 Gly Pro ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399 Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Vai Tyr Lys Ala Asn Gly 95 100 105 Leu Ala GCT TAC TTT TGT ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447 Ala Tyr Phe Vai Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp 110 115 120 Phe Gly ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495 Ile Phe Asn Pro Ala Ile Vai Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile 125 130 135 Phe Ser 140 GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543 Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Vai Leu Leu Tyr 145 150 Ile Lys 155 GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591 Gly His Vai Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly ser Cys Gly 160 165 170 Asn Leu ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639 Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile 175 180 185 Gly Lys AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687 Ser Phe Asp Ile Lys Vai Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met 190 195 200 Met Ser TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735 Trp Ala Vai Leu Ala Vai Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu 205 210 215 Ile Asn 220 GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783 Gly Lys Vai Ser Asp Ser Met Leu Vai Asn Thr Ile Leu Met 225 230 Leu Vai 235 TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831 Tyr Vai Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn 240 245 250 Thr Met GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879 Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly 255 260 265 Cys Leu GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927 Vai Trp Vai Pro Ser Vai Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu 270 275 280 Vai Asn CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975 His Pro Vai Glu Lru Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu 285 290 295 Vai Ala 300 GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023 gly ile leu cys ile tyrile lys tyr asp cys asp arg glb 305 310 arg gin 315 GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071 Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Vai Trp Gly Arg 320 325 330 Ala Pro TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119 Ser Lys Ile Vai Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr 335 340 345 Lys Thr AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167 Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His 350 355 360 Phe His TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215 Tyr Vai Pro Glu lie Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Vai pro 365 370 375 Ala Leu 380 TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263 Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tur Phe Tur Vai Leu Thr Leu Leu 382 390 395 Leu Phe GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311 Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr 400 405 410 Gly Lys TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359 Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glyu Lys Vai Lys Tyr Arg Ile Ile 415 420 425 Pro Gly ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 Ile Tyr 430 GMCGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 430 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 2: Met Ala Glu Thr Vai His Ser Pro Ile Vai Thr Tyr Ala Ser 1 5 10 Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Vai Ile Leu 15 20 25 Leu Trp Tyr Thr Met Vai His Gin Asp Gly Ser Vai Thr Gin 30 35 40 Thr Phe Gly Phe Phe Trp Gllu Asn Gly Vai Gin Gly Leu Ile 45 50 55 Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile 60 65 70 Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu 75 80 Pro Gly Lys Atg Vai Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala Gly Asn 85 90 95 Arg Pro Vai Tur Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Vai 100 105 110 Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe 115 120 125 Asn Pro Ala Ile Vai Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Vai Leu Leu Tyr 145 150 Ile Lys Gly His Vai Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser 155 160 165 Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Gly Leu 170 175 180 Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile Lys Vai Phe Thr 185 190 195 Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Vai Leu Ala Vai 200 205 210 Thr Tyr Cys Ile Lys Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Vai Ser 215 220 Asp Ser Met Leu Vai Asn Thr Ile Leu Met Leu Vai Tyr Vai 225 230 235 Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met 240 245 250 Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly 255 260 265 Cys Leu Vai Trp Vai Pro Ser Vai Tyr Thr Ser Pro Gly Met 270 275 280 Tyr Leu Vai Asn His Pro Vai Glu Leu Gly Trh Gin Leu Ala 285 290 Ile Tyr Ile Leu Vai Ala Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys 295 300 305 Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arn Glu Phe Arg Arg Thr Asn Glu 310 315 320 Lus Cys Leu Vai Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Vai Ala 325 330 335 Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu 340 345 350 Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr 355 360 365 Vai Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Vai Pro Ala 370 375 Leu Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Vai Leu Thr Leu 380 385 390 Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg 395 400 405 Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Gly Lys Vai 410 415 420 Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr 425 430 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: Peptídeo (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /nota="resíduo=trp ou tyr" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: Peptídeo (B) LOCALIZAÇÃO: 12 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota* "resíduo 12 = His ou Lys" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 3: Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa 15 10 Tyr 15 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 10..29 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "SEQ ID N°. 1 de 76 A 95" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 4: CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: COMPLEMENTO (10..28) (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "SEQ ID N°. 1 COMPLEMENTAR DE 1350 A 1368" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 5: CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..23) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 6: GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 7: AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 29 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 8: (l) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 8: GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID F. 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..17) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA SEQ ID N° 10 TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..38) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 11: GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 38 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 12: CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..25) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 13: TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1 20) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 14: TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 15: GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 16: AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..21) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 17: AATTCATACG TACGCGGCCG C 21 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 18: CAACGCGTCC TAGG 14 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 19 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..22) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 19: AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 22 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 20: GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 33 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..39) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 21: AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 22: CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 34 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..28) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 23: AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 24: GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 40 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 25: TCGACGGACG CGTGG 15 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..14) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 26: TCGACCACGC GTCC 14 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 27: TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 28: GGCCGCAAAA CCAAA 15 NFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..15) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 29 AGCTTTTGGT TTTGC 15 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 30: GATCTATCGA TGCGGCCGCG 20 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID N°. 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE FILAMENTOS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucléico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CLE: raisc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..20) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°. 31: CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20 REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contém a sequência heteróloga SEQ ID NO: 1 ligada aos elementos regulatórios hete-rólogos.

2. Microorganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que é transformado ppelo vetor como definido na reivindicação 1.

3. Microorganismo transgênico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é uma levedura ou um fungo filamentoso.

4. Processo de clonagem de ácido nucléico que codifica para uma proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase no microorganismo como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende o método de seleção escolhido entre: a resistência do microorganismo à nistatina ou a um composto análogo, cuja toxicidade depende da presença de es-teróis que contêm uma insaturação em posição C-7, a hibridização do ácido nucléico com a sequência nucleotí-dica da sequência SEQ ID N° 1.

5. Processo de preparação de proteína que tem uma atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase, caracterizado pelo fato de que se cultiva uma célula hospedeira transformada como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 3, e isola-se a proteína expressa.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma levedura transformada na qual a sequência de ADNc codificante é colocada sob o controle de um promotor de levedura.

7. Cepa de levedura transformada, caracterizada pelo fato de que co-expressa uma proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase de sequência SEQ ID NO: 1, o P450SCC, a ADR e a ADX.

8. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína que tem a atividade delta-5,7-esterol, delta-7-redutase é a proteína de A. thaliana delta-7Red.

9. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é denominada EC01/ pCD63.