CN1042567A - 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞 - Google Patents

类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基团工程构建的宿主细胞，该细胞能够同时氧化类固醇，优选同时导入17α-羟基和C21-羟基基团。特别是氧化是用细胞进行的，在该细胞中***有编码至少两种涉及胆固醇向氢化可的松生化转化的蛋白质。合适的宿主细胞包括杆菌属、酵母属或Kluyreromyces菌珠。该新的宿主细胞适于胆固醇、孕甾烯醇酮、孕甾酮和17α-羟基-孕甾酮的生化氧化，它们都是所说的生化转化的中间产物。
该宿主细胞还可用于最终制备多基因***，该***能一步将胆固醇转化为氢化可的松。

Description

本发明涉及一种制备药学上有用的类固醇的多步氧化方法。
11β、17α、21-三羟基-4-孕甾-3，20-二酮（氢化可的松）是一种重要的药用类固醇，由于它的药理性质，可将其作为皮质甾类使用和作为制备许多有用类固醇（特别是其他皮质甾类）的起始化合物。氢化可的松由脊椎动物的肾上腺皮质产生，最初只能通过繁杂的提取方法从肾上腺皮质组织中得到很少的量。只有在阐明其结构后，才发展出一些新的生产途径，这些途径的特点是化学合成步骤与微生物转化相结合。只是因为所选用的初始化合物如甾醇、胆酸和皂草配基丰富而且便宜，因此目前的这些方法提供了不太昂贵的产品，但这些方法仍然相当复杂。设想了几种改进现行方法的可能性，生物化学的方法也已进行过尝试。
有一种尝试是使用分离的肾上腺皮质蛋白（这些蛋白已知与类固醇在体内的酶学转化有关）的一个体外生化***，将合适的初始类固醇转化为氢化可的松。然而，分离这些重要蛋白的困难性和必需的辅助因子的昂贵价格看来使有经济吸引力的大规模生产不能实现。另一种方法是使催化酶保留在其天然环境中，并使肾上腺皮质细胞在细胞培养中产生所需的氢化可的松。但是，由于在实践中这些细胞的生产力很低，因此，要使这样一种生化方法在经济上具有吸引力看来也是不可能的。
哺乳动物和其他脊椎动物肾上腺皮质中的体内过程构成了一种生化途径，它是以胆甾醇开始的，经由各种中间产物最终得到氢化可的松（图1）。这种途径中直接涉及8种蛋白质，其中有5种是酶，这些酶中有4种是细胞色素P450酶，其他3种是电子传递蛋白。
第一步是胆甾醇向3β-羟基-5-孕甾-20-酮（孕烯醇酮）的转化。在这种转化中（即一种单氧化酶反应）涉及3种蛋白质：侧链裂解酶（P450SCC，一种含血红素-铁的蛋白），肾上腺皮质铁氧还蛋白（ADX，一种含Fe2S2的蛋白）和肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（ADR，一种含FAD的蛋白）。此外，以胆甾醇作为底物的反应进一步需要分子氧和NADPH。
接着是通过脱氢作用/异构作用将孕烯醇酮转化为4-孕甾-3，20-二酮（孕酮）。该反应由蛋白质3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶（3β-HSD）催化，它需要孕烯醇酮和NAD+。
为了得到氢化可的松，再在孕酮的3个位置进行羟化，这种转化由单氧化酶催化。在孕酮转化为17α-羟基孕甾酮时涉及两种蛋白质：类固醇17α-羟化酶（P45017α，一种含血红素-铁的蛋白）和NADPH细胞色素P450还原酶（RED，一种含FAD-和FMN的蛋白质）。该反应消耗孕酮，分子氧和NADPH。
17α-羟基孕酮转化为17α-21-二羟基-4-孕甾-3，20-二酮（去氧可的松）时也需要两种蛋白质：类固醇-21-羟化酶（P450C21，一种含血红素-Fe的蛋白质）和前面提及的蛋白质RED。该反应消耗17α-羟基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松转化为氢化可的松涉及3种蛋白质：类固醇11β-羟化酶（P45011β，一种含血红素-Fe的蛋白质）和上面提及的蛋白质ADX和ADR。
如上所述，细胞色素P450蛋白质是胆甾醇向氢化可的松进行生化转化所必需的酶。这些酶隶属于一个更大的组群即细胞色素P450蛋白（或简称P450蛋白）。它们已经在原核生物（各种细菌）和真核生物（酵母、霉菌、植物和动物）中发现过。发现在哺乳动物的肾上腺皮质、卵巢、***和肝中，P450蛋白质含量较高。许多P450蛋白已进行了纯化及对其特性进行了很好的描述。它们的比活已经测定。最近，已经发表了许多有关这方面的综述，如K.Ruckpaul和H.Rein（编），“细胞色素P450”和P.R.Ortiz de Montellano（编）“细胞色素P450、结构、机制和生物化学。”细胞色素P450蛋白的特征在于用一氧化碳还原后，在450nm处有特异性最大吸收。在原核生物中，P450蛋白既可和膜结合也可存在于细胞质中。就目前对细菌P450蛋白的详细研究（如P450meg和P450cam）表明，在其羟化活性中涉及一种铁氧还蛋白和一种铁氧还蛋白还原酶。对真核生物的两类P450蛋白质，即Ⅰ和Ⅱ型已进行了描述。两者的不同点在于：
1.亚细胞定位：Ⅰ型定位于微粒体部分，而Ⅱ型位于线粒体内膜上。
2.将电子传递给P450蛋白的途径：Ⅰ型通过NADPH由P450还原酶还原，而Ⅱ型则通过NADPH由铁氧化蛋白还原酶（如肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶）和铁氧还蛋白（如肾上腺皮质铁氧还蛋白）还原。
根据EP-A-0281245，细胞色素P450酶可从链霉菌中制备并用于化合物的羟化作用。
该酶以分离形式使用，这是一个相当麻烦和昂贵的方法。
JP-A-62236485（德温特87-331234）中指出，可以将肝细胞色素P450酶的基因导入啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中并表达这些基因，以此提供可以利用其氧化活性的酶。
然而，在上述文献中没有说明用细胞色素P450酶来制备类固醇化合物。
按照1989.5.6所提交的申请（荷兰），提供了多种生产蛋白质的表达盒，这些蛋白质是在多基因***中将便宜的类固醇起始物氧化成稀有昂贵的终产物所必需的，其中，这种转化是在一些天然***中通过多酶催化和辅助因子中介的转化完成的。该发明的表达盒可用于最终产生进行这些多步转化的多基因***。
因此，一方面，该发明涉及能在重组的宿主细胞中表达异源DNA编码序列的表达盒，这里所说的编码序列编码一种酶，该酶能单独或与另外的蛋白质一起，在胆甾醇转化成氢化可的松的生物途径中催化一个独立的氧化步骤。因此，本发明的表达盒包括在重组宿主中能产生下列蛋白质的基因盒，这些蛋白质是：侧链裂解酶（P450SCC）;肾上腺皮质铁氧还蛋白（ADX）;肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（ADR）;3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶（3β-HSD）;类固醇17α-羟化酶（P45017α）;NADPH细胞色素P450还原酶（RED）;类固醇-21-羟化酶（P450C21）;和类固醇11β-羟化酶（P45011β）。
前文所提到的申请还披露了用这些载体或该发明的表达盒转化的重组宿主细胞，生产上述酶和用它们进行氧化的方法，在培养肉汤中使用所述宿主细胞进行特异氧化的方法和含有用该方法制备的化合物的药物组合物。
特别是该申请还涉及制备和培养适于在大规模生化生产反应器中采用的细胞，以及使用这些细胞进行化合物的氧化作用的方法，尤其是用于如图1所示的类固醇的生产。图示的每个反应可分别进行。包括在多步反应中的一些步骤的相互交换。优选的宿主是微生物，但是也可利用其他细胞，如可以是在细胞培养中或活的转移基因动植物组织中的植物或动物细胞。用载体对合适的受体细胞（最好是合适的微生物细胞）进行遗传转化可获得这些细胞，这些载体含有的DNA序列编码与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白，包括侧链裂解酶（P450SCC）、肾上腺皮质铁氧还蛋白（ADX）、肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（ADR）、3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶（3β-HSD）、类固醇-17α-羟化酶（P45017α）、NADPH细胞色素P450还原酶（RED）、类固醇-21-羟化酶（P450C21）和类固醇-11β-羟化酶（P45011β）。有些宿主细胞本身已能以足够的水平产生一种或多种必需蛋白质，因此，它们只需用补充的DNA序列转化。这种可能的自身蛋白为铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶、P450还原酶和3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶。
已经选择了一些合适的DNA源，以得到编码与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白的序列。编码与胆甾醇转化为氢化可的松有关的所有蛋白的一个合适的DNA来源是脊椎动物的肾上腺皮质组织，如牛肾上腺皮质组织。由各种微生物也能得到有关的DNA，如从睪丸素假单胞菌（Pseudomonas        testosteroni），灰色肉性链霉菌（Streptomyces        griseocarneus）或类固醇短杆细菌（Brevibacterium        sterolicum）得到编码3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶的DNA和从Curvularia lunata或布累克氏瘦克银汉霉菌（Cunninghamella blakesleeana）得到编码与11β-脱氧皮甾醇的11β-羟化作用有关的蛋白的DNA。分离编码牛P450SCC、牛P45011β蛋白或微生物的等同蛋白、牛肾上腺皮质铁氧还蛋白、牛肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶、3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶（牛或微生物的）、牛P45017α、牛或微生物的牛P450C21和NADPH细胞色素P450还原酶的DNA序列，分离步骤如下：
1，真核序列（cDNA）
a.由合适的组织制备全RNA。
b.将含多聚A+的RNA转录成双链cDNA，连接到噬菌体载体中。
c.得到的cDNA文库用32P标记的对所需cDNA特异的寡聚物进行筛选，或用一种特异性（125I标记的）抗体对异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖（IPTG）诱导的λ-gt11cDNA文库进行筛选。
d.将阳性噬菌斑形成单位（Pfu）的cDNA插段***合适的载体中以确定：
-用核苷酸测序法得到的cDNA的完整长度。
2.原核基因
a.由一个合适的微生物制备基因组DNA。
b.为了得到DNA文库，将DNA片段克隆到合适的载体中，并对一种合适的大肠杆菌宿主进行转化。
c.得到的DNA文库用32P标记并对目的基因特异的寡聚物进行筛选，或用一种特异（125I标记的）抗体对IPTG诱导的λ-gt11cDNA进行筛选。
d.分离阳性集落的质粒，将DNA插段亚克隆入合适的载体内以证明：
-基因的整个长度。
注：根据改进的方法，通过称为聚合酶链反应（PCR）（Saiki等人，Science        239：487-491，1988）的方法，用两种特异性寡聚物扩增特异的cDNA（真核序列）或基因（原核序列）。然后，再将扩增的cDNA或DNA***合适的载体中。
提供了一种合适的表达盒，其中，根据前述分离的异源DNA被置于适当的转录和转译的调控序列之间，使得DNA能在合适的宿主细胞环境中表达，以提供所需的一种或多种蛋白质。在这些起始控制序列后也可以含有一个分泌信号序列。
必须通过所述的表达盒将合适的调控序列与结构DNA一起导入。通过用含有调控序列（它与相关宿主一致，并以可操纵方式与所需表达的编码序列连接）的载体转化合适的宿主细胞，可以使表达变为可能。
另外，采用了存在于宿主基因组中合适的控制序列。用这样的载体转化合适的宿主细胞也可使表达成为可能，此载体含有的所需蛋白的编码序列与宿主的序列相连接，使它与宿主基因组以这样的方式形成同源重组体，即使宿主控制序列适当地控制导入DNA的表达。
正象一般所理解的那样，术语“控制序列”包括对以可操纵方式连于其上的编码序列表达的合适调节是必要的所有DNA片段，例如操纵基因、增强子和尤其是启动子和控制转译的序列。
启动子可受或可以不受环境调节的控制。原核生物的合适启动子有例如trp启动子（由色氨酸的丧失来诱导）、lac启动子（由乳糖类似物IPTG诱导）、β-内酰胺酶启动子和噬菌体衍生的Pl启动子（由温度变化诱导）。此外，尤其适用于在杆菌中表达的有用启动子有：α-淀粉酶、蛋白酶、Spoz、Spac和φ105的启动子以及合成的启动子序列。优选的启动子是在图5中表示的启动子，用“HpaⅡ”表示。适于在酵母中表达的合适启动子有3-磷酸甘油酸激酶启动子，以及其他糖酵解酶的启动子和乙醇脱氢酶和酵母磷酸酶的启动子。转录延长因子（TEF）和乳糖酶的启动子也是合适的。哺乳动物表达***通常采用来自病毒的启动子（如腺病毒启动子和SV40启动子），但是它们还包括可调节启动子（如金属硫因启动子，它由重金属或糖皮质激素的浓度控制）。近来，以病毒为基础的昆虫细胞表达***和以如胭脂碱合成酶启动子这样的植物细胞启动子为基础的表达***也是适宜的。
转译控制序列在原核生物***中有一个核糖结合位点（RBS），而在真核生物***中，转译可由含有如AUG这样的起始密码子的核苷酸序列来控制。
除了必需的启动子以外，许多其他的控制序列，包括调节终止（如真核生物***中的多聚腺苷化序列）的序列可用于表达的调控。某些***含有增强子，这些序列对于表达来说是有利的，但多数情况下不是必需的。
另一方面，前文提到的申请中还涉及各种载体，这些载体可用于转化宿主细胞。
一组载体用pGBSCC-n表示，其中n为1至17的任何整数，这些载体是为编码P450SCC酶的DNA专门设计的。
根据特殊的具体方案，载体pGBSCC-7被设计成能够携带编码pGBSCC/ADX-1的进一步异源基因，所述pGBSCC/ADX-1编码P450SCC和ADX两种蛋白，这两种蛋白都是以具有功能的形式产生的。
另一组载体用pGB17α-n表示，其中n为1至5的任何整数，它们是为编码P45017α酶的DNA专门设计的。
还有一组载体用pGBC21-n表示，其中n是1至9的任一整数，它们是为编码P450C21酶的DNA专门设计的。
还有另一组载体用pGB11β-n表示，其中n为1-4的任何整数。
根据该发明的另外一个方面，选择了能接受该发明的载体并使得导入DNA表达的合适宿主细胞。在培养转化的宿主细胞时，与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白质出现在其细胞成分中。可用DNA杂交方法证明所需DNA的存在，用RNA杂交方法证明它们的转录，通过免疫检测法证明它们的表达，通过在体外或体内与起始化合物一起保温以检测氧化产物的存在，从而证明它们的活性。
优选的宿主是转化的微生物，尤其是细菌（更优选的是大肠杆菌和杆菌和链球菌）和酵母（如酵母属和Kluyveromyces）。在植物和动物（包括昆虫）中还有其他合适的宿主生物，用它们的分离细胞进行细胞培养，如COS细胞、C127细胞、CHO细胞和Spodoptera frugiperda（Sfg）细胞。另外还可采用转化基因的动物或植物。
一种特殊的重组宿主细胞是导入了该发明的两个或更多表达盒（如pGBSCC/ADX-1），或已由一个至少编码两种异源蛋白的表达盒转化的细胞，使得细胞能产生至少两种与图1中途径有关的蛋白。
所制备的新细胞不仅能产生与类固醇的氧化作用有关的蛋白质，以最终得到氢化可的松，而且完全能使用这些蛋白，以就地氧化加至培养液中的相应的类固醇，以完成所期望的转化作用。类固醇是优选的底物。用异源DNA转化的细胞尤其适用于与图1中提到的类固醇培养，包括其他的甾醇如β-岩甾醇。结果获得被氧化的类固醇。
由于在宿主细胞中存在许多由异源DNA编码的与图1途径有关的蛋白质，因此有可能发生多种生物化学转化，包括甾醇的侧链裂解和/或C11、C17、C3和C21的氧化修饰。因此，该发明的表达盒可用于构建一个多基因***，该***能以图1所示的顺序同时进行多步骤的细胞内连续转化。可能必须在所需的宿主中导入一些表达盒，全部基因盒编码了所需的蛋白质。在某些情况中，所述途径涉及的一种或多种蛋白质可能已存在于宿主中，它（们）作为天然蛋白发挥相同的活性作用。例如，在宿主中可能已经存在铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和P450还原酶。在这些情况下，只有剩下的酶才必须通过重组转化作用提供。
直到前不久，还没有人成功地制备一个多基因***，以能够在一个生化方法中完成至少两步图1所示的生化途径。
按照本发明，在一个宿主生物中克隆了编码如下所述蛋白质的基因，该蛋白质能够催化类固醇分子的两个独立的氧化作用，特别是图1所示的蛋白。实际上，本发明已经实现了在同一宿主生物体内克隆如下两种蛋白质，即负责类固醇17α羟基化和类固醇C21羟基化的蛋白质，并且该宿主生物能以功能形式表达所述蛋白。另外，本发明还提供了一种方法，在该方法中。培养在发酵介质中的转化微生物能在类固醇分子的两个不同位置进行氧化，以氧化该介质中存在的类固醇底物。尤其是提供了引入17α和21羟基基团的一步方法。
优选的宿主生物是Kluyveromyces        lactis，但也可使用其他的宿主生物，尤其是微生物（特别是在前文提到的那些）。更具体地说，CN89104208所描述的微生物很适于克隆和表达图1所示生化途径的基因。
一种制备能进行多步类固醇氧化的宿主的方法是用两个或多个载体（每个载体都含有用于一个氧化步骤的基因）转化宿主。
另一种获得宿主的方法是用一个载体转化宿主，该载体所含有的表达盒包括所有编码多步氧化反应所需的蛋白的基因。
根据本发明，该表达盒含有至少两种结构基因，每种侧接有合适的控制序列。一种典型的表达盒含有编码P45017α蛋白和P450C21蛋白（pGB17-α/C21-1）的DNA。
利用本发明的方法及本领域其他的已知方法，有可能制备类似的表达盒，及含有该表达盒的宿主细胞，利用该宿主细胞可以在一步发酵过程中进行其他的多步类固醇氧化作用，以最终将胆甾醇转化为氢化可的松。
附图中所用的缩写字母：R1，EcoRⅠ;H，HindⅢ;K，KpnⅠ;X，XbaⅠ;Rv，EcoRV;SⅠ，SacⅠ;B，BamHⅠ;SⅡ;SacⅡ;Sal，SalⅠ;Xh，XhoⅠ。
图1概括说明了哺乳动物肾上腺皮质中进行的胆甾醇向氢化可的松连续转化的各步骤中所涉及的蛋白质。
图2是表达盒pGB17α-5的物理图。
图3是表达盒pGBC21-9的物理图。
图4表示表达盒pGB17α/C21-1的构建，它含有P45017α和P450C21的编码序列，它们都是由乳糖酶启动子驱动的。
通过下列实例对本发明做进一步的描述，但所举实例不应认为是对本发明的限制。
实例1
构建编码牛细胞色素P450类固醇17α-羟化酶和牛细胞色素P450类固醇C21-羟化酶的表达盒并将其转化至酵母菌K.lactis中。
（a）表达盒的构建
用SacⅡ和HindⅢ（部分）消化CN89104208（实例14）中所述的表达盒pGB17α-5（图2），利用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。分离含有部分乳糖酶启动子、编码P45017α的序列和乳糖酶终止子的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化，然后将其***CN89104208（实例19）所述的pGBC21-9（图3）中，pGBC21-9首先经XbaⅠ消化使其线性化。并用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。所获得的表达盒pGB17α/C21-1（图4）具有单一的SacⅡ限制性位点，因为在侧接于P45017α序列的乳糖酶启动子中的SacⅡ限制位点被填充反应所破坏。
（b）K，lactis的转化
如CN89104208实例5（c）中所述方法，用在单一的SacⅡ限制位点被线性化的pGB17α/C21-1转化K，lactisCBS2360。进一步对转化株17α/C21-101的P45017α和P450C21进行体内与体外活性分析（见实例2和实例3）。
实例2
K.lactis 17α/C21-101中的P45017α和P450C21的体外活性
把实例1中得到的K.lactis17α/C21-101、CN89104208（实例14）中所述的K.lactis17α-101和K.lactisCBS2360置于100ml培养基D中培养。在培养基D中，每升蒸馏水含有：
酵母膏（Difco）        10克
Bacto胨（Oxoid）        20克
右旋糖        20克
pH＝6.5
灭菌并冷却至30℃后，加入溶于1毫升蒸馏水（膜过滤灭菌）中的25mg geneticin（G418 Sulphate，Gibco Ltd）。培养物在30℃培养72小时。离心收集细胞（4000xg，15分钟）用磷酸缓冲液（50mMPH7.0）冲洗沉淀并离心收集细胞（4000xg，15分钟）。将沉淀置于磷酸缓冲液中（50mMPH7.0），得到每毫升湿重0.5g的悬浮液。用声处理（Braun Labsonic 1510;12×1minute，50W）破碎悬浮液。通过离心除去未破碎的细胞（12000xg 15分钟）。
在NADPH存在的条件下，通过测定17α、21二羟基孕甾酮的产生鉴定无细胞提取液中的P45017α和P450C21活性。检测混合物中含有以下溶液：
溶液A：50mM磷酸钾缓冲液（PH7.0），其中含有3mM EDTA，2mMNADPH，5mM葡萄糖-6-磷酸和每毫升16单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（NADPH再生***）。
溶液B（底物）：在磷酸钾缓冲液（75mM，PH7.5）中含有在10%（v/v）TergitolTMNP40/乙醇（1∶1 v/v）溶液中的80μM〔4-14C〕孕甾酮（30Ci/mole）胶囊溶液。
检测时，首先将75μl溶液A与50μl溶液B和125μl无细胞提取液混合。在30℃轻轻搅拌混合物。保温60分钟后抽取50μl试样，并加至由100μl甲醇和50μl氯仿组成的混合液中。随后再加入100μl氯仿和100μl水。通过离心收集氯仿层（5000xg，2分钟），并用100μl氯仿再次提取水/甲醇层。合并两个氯仿层并进行干燥。将干燥产物溶于100μl乙腈/水（9∶1，v/v）溶液中，并且采用HPLC柱（Chrompack        Lichr.10RP18，250×4.6mm）和乙腈/水（58∶42，v/v）混合液对50μl试样进行洗脱。用流闪计数器和紫外探测器检测洗脱液中的类固醇底物和产物。所收集组分的放射活性通过液闪计数器测定。
利用此检测法，发现由K.lactis17α/C21-101获得的无细胞提取液产生了17α、21二羟基孕甾酮，而从K.lactis17α-101和K.lactisCB2360获得的无细胞提取液却不能产生。由K.lactis17α-101产生的主要产物是17α羟基孕甾酮。
实例3
K.lactis17α/C21-101中的P45017α和P450C21的活体活性
用实例1中的K.lactis17α/C21-101和K.lactisCBS2360接种25ml培养基D。在培养基D中每升蒸馏水含有：
酵母膏（Difco）        10克
Bacto胨（Oxoid）        20克
右旋糖        20克
PH＝6.5
在灭菌并冷却至30℃后，将溶解于1ml蒸馏水（膜过滤灭菌）中的25mg        geneticin加入到1升培养基D中。
然后将含有底物〔4-14C〕孕甾酮的溶液100μl加入到25ml完全培养基中。该底物溶液在10%（v/v）TergitolTMNP40/乙醇（1∶1 v/v）中每毫升含有800μg〔4-14C〕孕甾酮（8Ci/mole）。
培养物在旋转摇床中（240rpm）于30℃下生长，在0和68小时后取2ml样品。每份样品和2ml甲醇混合。在4℃萃取24小时后，将混合物离心（4000xg，15分钟）。采用HPIC柱（Chrompack        Lichr.10RP18，250×4.6mm）和乙腈/水（58∶42，v/v）对所得到的200μl上清液进行洗脱。
检测洗脱液中的类固醇底物和产物。通过液闪计数法测定所收集组分的放射活性。从K.lactis17α/C21-101培养68小时的培养物中获得的一个组分清楚表明17α、21二羟基孕甾酮的存在，而在对照菌株K.lactisCBS2360的培养物中没有产生这种化合物。
实例4
编码蛋白质P450SCC和ADX的表达盒的构建及其在酵母菌K.lactis中的转化和表达
（a）表达盒的构建
将表达盒pGBADX-1（CN89104208实例23）用SacⅡ和HindⅢ（部分地）消化，利用Klenow        DNA聚合酶填充粘性末端。分离含有部分乳糖酶启动子（但仍保持其功能）、ADX编码序列和乳糖酶终止子的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化，然后将其***pGBSCC-7中，pGBSCC-7首先经XbaⅠ消化使其线性化（参见CN89104208实例5（6）），并用Klenow        DNA聚合酶填充粘性末端。按照这样一种方式进行构建，即产生单一的SacⅡ限制性位点，这个位点是将质粒转移至K.lactis中所必需的。这个单一的SacⅡ限制性位点位于邻接SCC序列的乳糖酶启动子序列中，而邻接ADX序列的乳糖酶启动子中的SacⅡ限制性位点被填充反应破坏。所得到的表达盒pGBSCC/ADX-1含有分别被乳糖酶启动子驱动的SCC和ADX的编码序列。
（b）K.lactis的转化
如CN89104208实例5（c）中所述方法，用在单一的Sac        Ⅱ限制性位点被线性化的15μg        pGBSCC/ADX-1进行K.lactis        CBS2360的转化。选择一种转化株（SCC/ADX-101）进行SCC及ADX表达的研究。
（c）转化株K.lactis        SCC/ADX-101的分析
如CN89104208实例5（d）中所述方法，从SCC/ADX-101及对照株CBS2360培养物制备细胞蛋白质成分，并对它们进行SDS/PAGE及Western印迹分析。印迹分别用SCC和ADX的特异抗体探测。与对照株相比较，转化株SCC/ADX-101的细胞蛋白组分显示出另外两个期望长度（分别为53和14KDa）的谱带，表明蛋白质SCC与ADX的表达。转化株SCC/ADX-101中两种蛋白质的表达水平可与只表达一种蛋白质的转化株中观察到的水平相比拟（对于SCC，参见CN89104208图15A，泳道3;对于ADX参见CN89104208图39，泳道5）。转化株SCC/ADX-101体外的SCC活性及ADX活性在CN89104208实例28中有描述。

Claims (13)

1、一种重组宿主细胞及其后代，包括微生物、植物和动物的细胞，该宿主细胞及其后代除了含有合适的控制序列外，还含有编码蛋白质的异源DNA，所述蛋白质选自由能够单独或协同一种或多种其他蛋白催化类固醇至氢化可的松的生化转化中的氧化步骤的蛋白质所构成的一组，该步骤选自下列转化过程：
胆固醇向孕(甾)烯醇酮的转化：
孕(甾)烯醇酮向孕甾酮的转化；
孕甾酮向17α-羟基孕甾酮的转化；
17α-羟基孕甾酮向11-脱氧皮(甾)醇的转化；
11-脱氧皮(甾)醇向氢化可的松的转化；或者，所述蛋白质是由天然蛋白构成的一组中选出，即由类固醇转化成氢化可的松的生化转化中的天然蛋白；
侧链裂解酶(P450SCC)；
肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX)；
3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶(3β-HSD)；
肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR)；
类固醇-17α-羟化酶(P45017α)；
NADPH细胞色素P450还原酶(RED)；
类固醇-21-羟化酶(P450C21)；
类固醇-11β-羟化酶(P45011β)；
其特征在于，异源DNA编码至少两个可表达的蛋白，它们催化至少两个独立的氧化步骤。
2、按照权利要求1的重组宿主细胞，其特征在于，异源DNA编码序列来自牛。
3、按照权利要求1或2的重组宿主细胞，其特征在于，异源DNA编码至少P45017α和P450C21蛋白。
4、按照权利要求1-3中任一项的重组宿主细胞，其特征在于宿主是微生物。
5、按照权利要求4的重组宿主细胞及其后代，其特征在于，所述的宿主是酵母、Kluyveromyces或杆菌（Bacillus）或大肠杆菌之一。
6、一种由重组宿主细胞制备蛋白质混合物的方法，包括在能使蛋白质形成并在培养物中积累的条件下在营养培养基中培养重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主是权利要求1-5之一所述定义的。
7、一种在体外对化合物进行选择性多步氧化的方法，该方法包括：
使待氧化的化合物与至少两种蛋白质与能进行所述氧化和在培养液中积累氧化化合物的条件下保温，接着回收被氧化的化合物，其特征在于，所述的蛋白质由权利要求6的方法生产。
8、一种对化合物进行选择性多步氧化的方法，该方法包括：
在该化合物存在下培养重组宿主细胞，所用培养条件能使所需要的氧化作用发生并使氧化化合物在培养液中积累，随后回收被氧化的化合物，其特征在于，所述的重组宿主细胞是权利要求1-5中的任何一种。
9、按照权利要求7或8的方法，其特征在于至少有两个氧化步骤发生，它们选自：裂解类固醇的侧链、将3-羟基-5（6）-脱氢基团氧化和异构成3-氧代-4（5）-脱氢基团、17α-羟基21-羟基或11β-羟基基团的***。
10、按照权利要求7或8的方法，其特征在于，氧化作用的结果是将C21-羟基基团和C17α-羟基基团同时导入孕甾烯醇酮或孕甾酮。
11、一种表达盒，它可在权利要求1-5中任一项的重组宿主中表达，并含有至少两种编码权利要求1所定义的蛋白质的基因。
12、按照权利要求11的表达盒，其特征在于异源DNA编码P450-17α和P450C21酶，并且所述的表达盒为pGB17α/C21-1。
13、含有一种活性化合物的药物制剂，它是按照权利要求9-12中任一项所述方法制备的。
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