UA126992C2 - Спосіб ферментативного дегумування олії - Google Patents
Спосіб ферментативного дегумування олії Download PDFInfo
- Publication number
- UA126992C2 UA126992C2 UAA202007611A UAA202007611A UA126992C2 UA 126992 C2 UA126992 C2 UA 126992C2 UA A202007611 A UAA202007611 A UA A202007611A UA A202007611 A UAA202007611 A UA A202007611A UA 126992 C2 UA126992 C2 UA 126992C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- oil
- phospholipase
- polypeptide
- activity
- phospholipids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 15
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 84
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 65
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 81
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 81
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 claims description 41
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 claims description 29
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 23
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 16
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 15
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 7
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 abstract description 33
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 abstract 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 154
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 154
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 44
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 44
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 34
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 33
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- TWFGIHLFQWPEJC-HFKSONKOSA-N (2s,3s)-2-[4-[4-(diaminomethylideneamino)butyl]triazol-1-yl]-n-[11-[4-[4-[4-[11-[[(2s,3s)-2-[4-[4-(diaminomethylideneamino)butyl]triazol-1-yl]-3-methylpentanoyl]amino]undecanoyl]piperazin-1-yl]-6-[2-[2-(2-prop-2-ynoxyethoxy)ethoxy]ethylamino]-1,3,5-triazi Chemical compound N1([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCCCCCCCCCCC(=O)N2CCN(CC2)C=2N=C(NCCOCCOCCOCC#C)N=C(N=2)N2CCN(CC2)C(=O)CCCCCCCCCCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)N2N=NC(CCCCN=C(N)N)=C2)C=C(CCCCN=C(N)N)N=N1 TWFGIHLFQWPEJC-HFKSONKOSA-N 0.000 description 9
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 9
- 150000002315 glycerophosphates Chemical class 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 8
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 8
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 8
- -1 steroid alcohols Chemical class 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 7
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 7
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031417 Elongation factor-like GTPase 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 101000866914 Homo sapiens Elongation factor-like GTPase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000003444 succinic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- OXFUXNFMHFCELM-UHFFFAOYSA-N tripropan-2-yl phosphate Chemical compound CC(C)OP(=O)(OC(C)C)OC(C)C OXFUXNFMHFCELM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- ZMXHNPBUQVXPDM-LURJTMIESA-N (2s)-2-amino-6-(ethylamino)-6-oxohexanoic acid Chemical compound CCNC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O ZMXHNPBUQVXPDM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFWWGMKXCYLZEG-UHFFFAOYSA-N 3-methylmorpholine Chemical compound CC1COCCN1 SFWWGMKXCYLZEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 235000019737 Animal fat Nutrition 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 description 1
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 101100350067 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) oapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 101150055306 diaA gene Proteins 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- UOXRPRZMAROFPH-IESLQMLBSA-N lysophosphatidylinositol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(=O)OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)[C@@H](O)[C@H]1O UOXRPRZMAROFPH-IESLQMLBSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- NAIXASFEPQPICN-UHFFFAOYSA-O p-nitrophenylphosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 NAIXASFEPQPICN-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 244000144985 peep Species 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N spizofurone Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)C)=CC=C2OC21CC2 SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001870 spizofurone Drugs 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 125000002640 tocopherol group Chemical class 0.000 description 1
- 235000019149 tocopherols Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
- C11B3/00—Refining fats or fatty oils
- C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
- C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
- C11B1/02—Pretreatment
- C11B1/025—Pretreatment by enzymes or microorganisms, living or dead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01032—Phospholipase A1 (3.1.1.32)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії включає інкубацію зазначеної олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази А1 і містить поліпептид, щонайменше на 80 % ідентичний зрілій амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 1.
Description
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до способу зменшення кількості фосфоліпідів. у триацилгліцеридних оліях з використанням ферменту, який має активність фосфоліпази АТ.
Рівень техніки
Неочищені рослинні олії, отримані шляхом пресування або екстракції розчинниками, є сумішшю триацилгліцеридів, фосфоліпідів, стероїдних спиртів, токоферолів, вільних жирних кислот, мікродомішок, що містять метали та інших компонентів, присутніх в незначних кількостях. При переробці соєвої олії плоди сої (боби) спочатку очищають від оболонки й подрібнюють, одержуючи жирну соєву макуху ("пелюстки" роздавлених зерен), яку екстрагують гексаном; у результаті виходить екстракційна ("пелюсткова") олія. В іншому широко відомому варіанті переробки соєвих бобів перед екстракцією їх піддають експандуванню. З експандованої сої зазвичай отримують олію з більш високим виходом, проте вона містить більше фосфоліпідів. При виготовленні олії з іншої рослинної сировини, наприклад ріпаку, плоди/насіння спочатку пресують, у результаті чого отримують першу фракцію олії. Макуху, яка залишилася після пресування, можна обробити розчинником, і отримати екстракційну фракцію олії. Об'єднуючи фракцію, отриману пресуванням і екстракційну фракцію, як це практикують з ріпаком (як технічним, так і харчовим) і соняшником, отримують неочищену олію.
Щоб одержати високоякісну харчову рослинну олію, з неочищеного продукту бажано видалити фосфоліпіди, вільні жирні кислоти й мікродомішки, що містять метали. У промисловості для цього найчастіше застосовують гідротермічну, кислотну або лужну рафінацію й ферментативне дегумування. Як правило, основні втрати при дегумуванні рослинної олії припадають на видалення фосфоліпідів. У фосфоліпідів у молекулі присутні як гідрофільні функціональні групи, так і ліпофільна частина, яка складається з вуглецевого ланцюга гліцерину й жирнокислотних залишків; внаслідок такої хімічної структури фосфоліпіди є відмінними природними емульгуючими агентами. Для ослаблення емульгуючої здатності потрібно піддати фосфоліпіди гідролізу, перетворивши на лізофосфоліпіди або гліцерофосфати. Фосфоліпіди в рослинних оліях представлені в основному фосфатидилхоліном (РОС), фосфатидилетаноламіном (РЕ), фосфатидилінозитом (РІ) і фосфатидною кислотою (РА).
Зо Для ферментативного дегумування, або ферментативної рафінації застосовують різні способи, використовуючи ферменти з фосфоліпазною активністю, наприклад, фосфоліпази А1,
А2, С (включаючи фосфоліпазу С, яка розщеплює фосфатидилінозит).
У публікації УМО9705219 описується спосіб зниження вмісту компонентів, до складу яких входить фосфор, у рослинних оліях з використанням суміші фосфоліпаз із АзрегоіПи5 підег, яка має активність фосфоліпаз А2 і/або А1, а також лізофосфоліпазну активність.
У Європейському патенті Ме 0575133 обговорюються фосфоліпаза А1 (РІАЇ) зі штамів
Азрегоійи5 огулає і Азрегудйи5 підег та її використання для одержання лізофосфоліпідів з фосфоліпідів, наприклад, тваринного, рослинного або мікробного походження. У
Європейському патенті Ме 0575133 описується, що залишкова активність фосфоліпази А! з А. підег, що зберігається після теплової обробки за температури 70 "С, становить лише 30 95 від залишкової активності цього ферменту після теплової обробки за температури 50 "С і 60 с.
Фосфоліпаза АТ з А. огулає повністю інактивується після теплової обробки за температури 7070. У зазначеній роботі не обговорюється спосіб ферментативного дегумування якоїсь із харчових олій.
У патенті США Мо 20160289658 описується фосфоліпаза із ТаІаготусез5 Іеусецапи5. Цей фермент має відносно високу термостабільність і має більш високу активність за температури 70 "С, ніж наявний у продажу ферментний препарат І есійазе ОкКга.
У публікації М/О2011/051322 описується фосфоліпаза з Азрегойш5 Титідаги5, яка каталізує гідроліз фосфоліпідів у соєвій олії за температури 552С і 6096.
Потрібні вдосконалені способи зниження вмісту фосфоліпідів у триацилгліцеридних оліях з використанням фосфоліпаз, активних у широкому діапазоні температур.
Розкриття винаходу
Даний винахід відноситься до способу зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридних оліях, який перелбачає інкубацію олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази АТ, причому зазначена фосфоліпаза АТ містить поліпептид, який щонайменше на 80 95 є ідентичним до зрілої амінокислотної послідовності, яка в даному документі має назву
ЗБО ІЮ МО: 1. Було виявлено, що фосфоліпаза А1, амінокислотна послідовність якої щонайменше на 80 95 є ідентичною до зрілої амінокислотної послідовності ЕС ІЮО МО: 1, у широкому діапазоні температур, а саме від 55"С до 70 "С, здатна за 4 години скоротити бо кількість фосфоліпідів, які початково присутні у триацилгліцеридній олії, щонайменше на 85 95.
У способі, описаному в даному документі, фосфоліпаза А1 - це фермент, який здійснює гідроліз щонайменше 8595, 8695, 87 95, 88 95, 8995 або щонайменше 90 95 тієї кількості інтактних фосфоліпідів, які початково присутні в триацилгліцеридній олії, у результаті інкубації із зазначеною олією у кількості 0,28 активного білка на 1 кг олії за температури 55 "С, 60 С, 657 і 70 "С протягом 4 годин.
Визначення
Термін "зрілий поліпептид/зріла амінокислотна послідовність" у даному документі відноситься до кінцевої форми поліпептиду, отриманої після трансляції матричної РНК із утворенням поліпептидного ланцюга й посттрансляційних модифікацій останньої.
Посттрансляційні модифікації включають процесинг М-кінцевої частини поліпептидного ланцюга, скорочення С-кінцевої частини, глікозилювання, фосфорилювання й відщеплення лідерних послідовностей, наприклад сигнальних пептидів, пропептидів і/або препропептидів
Фосфоліпіди включають гліцерофосфоліпіди. У даному документі фосфоліпідом називають інтактний фосфоліпід, у якому до молекули гліцерину приєднані складноефірним зв'язком два залишки жирних кислот і один залишок фофсфорної кислоти. Фосфоліпіди також можна назвати диацидлгліцеридами, які містять фосфатну групу.
У лізофосфоліпідах до молекули гліцерину приєднана тільки одна ацильна група (залишок жирної кислоти) і залишок фосфорної кислоти. Лізофосфоліпід утворюється в результаті відділення ацильної групи від молекул фосфоліпіду під дією фосфоліпази АТ і/або фосфоліпази
А2.
Терміни "триацилгліцеридна олія" і "тригліцеридна олія" у даному документі вживаються як взаємозамінні. Триацилгліцеридні олії використовуються як харчові та як технічні (служать для одержання біодизельного палива).
Терміни "ідентичність послідовностей" і "гомологія послідовностей" у даному документі вживаються як взаємозамінні. Щоб визначити ступінь ідентичності/гомології (у відсотках) двох амінокислотних послідовностей, їх вирівнюють для оптимального порівняння. Для найкращого вирівнювання двох послідовностей можна ніби вносити розриви в ту або іншу з них.
Вирівнювання проводять по всій довжині порівнюваних послідовностей. Також можна робити часткове вирівнювання, порівнюючи відрізки нуклеотидних/амінокислотних послідовностей
Зо довжиною близько 20, близько 50, близько 100 або більше нуклеотидів/амінокислотних залишків. Ступінь ідентичності двох послідовностей - це виражене у відсотках співвідношення кількості збігів положень (тобто положень поліпептидного або полінуклеотидного ланцюга, які займають однакові амінокислотні залишки/нуклеотиди) та загального числа амінокислотних залишків/нуклеотидів у порівнюваних послідовностях (повністю або на даному відрізку). Для виконання вирівнювання й обчислення ступеню ідентичності використовують алгоритм
Нідлмана й Вунша (Меєадієтап 5. В. апа М/опесй б. 0. (1970) У. Мої. Віої. 48, 443-453). Цей алгоритм може використовуватись як для амінокислотних, так і для нуклеотидних послідовностей. Він входить у комп'ютерну програму МЕЕОІ Е. Для завдань даного винаходу використовувалася програма МЕЕОГЕ з пакета ЕМВО55 (версія 2.8.0 або наступні, ЕМВО55:
Тне Еигореап Моїесшціаг Віоюсду Ореп боптмаге Зийе (2000) Вісе Р. І опддеп І. апа Віваз5бу А.
Тгепавз іп Сепеїсз 16, (6) рр.276-277, пИр//етбровзв.ріоіптоптаїісв.пі/). У випадку поліпептидів для матриці амінокислотних замін використовували ЕВГОБИМб2. Брали наступні параметри: штраф на внесення делеції 10; штраф на продовження делеції 0,5. Фахівцям у даній галузі техніки повинно бути ясно, що всі ці параметри до певної міри впливають на результати, але загальний ступінь ідентичності (у відсотках) двох порівнюваних послідовностей при використанні різних алгоритмів суттєво не міняється. Після вирівнювання послідовностей за допомогою програми
МЕБЕОГЕ, як описано вище, розраховується ступінь ідентичності досліджуваної послідовності й послідовності запропонованої даним винаходом в такий спосіб: число відповідних положень у вирівняних послідовностях, зайнятих в обох послідовностях однаковими амінокислотними залишками/нуклеотидами ділиться на сумарну довжину вирівняної ділянки за винятком сумарної кілкості делецій. Ступінь ідентичності послідовностей відповідно до цього визначення одержують у програмі МЕЕОГЕ за опцією МОВЕАЧЕБК; у вихідній інформації цієї програми вона відзначена написом "ІЮюпдеві-ідепійу" ("чайдовша ідентичність").
Амінокислотні послідовності білків, описані в даному документі, можна далі називати досліджуваними послідовностями для пошуку в загальнодоступних базах даних, наприклад, з метою виявлення інших членів тієї ж родини білків або споріднені послідовності. Такий пошук здійснюють за допомогою програм МВІ АБ5Т і ХВІ А5Т (версія 2.0) згідно з роботою Аїйб5спиі 5.РЕ. еї аІ. (1990) У. Мої. Вісі. 215:403-10. Пошук нуклеотидних послідовностей, гомологічних до полінуклеотів запропонованих даним винаходом, за допомогою ВіАБТ здійснюють, бо використовуючи програму МВГА5Т за наступних параметрів: вага - 100, довжина слова - 12.
Пошук амінокислотних послідовностей, гомологічних до поліпептидів запропонованих даним винаходом, за допомогою ВІГА5Т здійснюють, використовуючи програму ХВІГА5Т за наступних параметрів: вага - 50, довжина слова - 3. Для вирівнювання з делеціями з метою порівняння послідовностей використовують програму Сарреа ВІ А5Т, як описано в роботі Ак5спиі 5.Р. еї аї., (1997) Мисівїс Асіа5 Не5. 25(17): 3389-3402. При використанні програм ВГА5Т їі Сарреа ВІ А5Т можна брати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, ХВІ А5Т і МВІ АТ).
Див. також головну сторінку сайту Національного центру біотехнологічної інформації США за адресою пир:/Лммли. пері. піт. піп. дом.
Термін "варіант" у даному документі відноситься до поліпептидів або до полінуклеотидів.
Варіанти включають послідовності із замінами, вставками, делеціями, скороченнями, перестановками й/або інверсіями в одному або кількох місцях у порівнянні з референсною послідовністю. Варіанти можна створювати із застосуванням різних типів мутагенезу - сайт- спрямованого (у тому числі сайт-насичувального), скануючого (наприклад, аланін-скануючого), інсерцційного, випадкового, а також шляхом спрямованої еволюції й різними іншими рекомбінантними методами, відомими фахівцям у даній галузі техніки. Крім того, можна синтезувати штучні варіанти генів відомими в даній галузі техніки методами.
Здійснення винаходу
Даний винахід відноситься до способу зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридних оліях, який передбачає інкубацію олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази А!ї, включаючи поліпептид, щонайменше на 8095 ідентичний до зрілої амінокислотної послідовності БЕ ІЮ МО: 1. Поліпептид, який має фосфоліпазну активність, який щонайменше на 80 95 ідентичний до зрілої амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО: 1 - це поліпептид, здатний знижувати або такий, що знижує щонайменше на 80 95, 81 95, 82 9о, 83 9, 84 95, 8595, 86 95, 87 95, 8895, 8995 або щонайменше на 90 95 кількість фосфоліпідів, які початково присутні у зазначеній олії, при інкубації олії із цією фосфоліпазою А, узятою в кількості 0,28 мг активного білка на 1 кг олії, за температури 55 "С, 60 С, 65 С і/або 707 протягом 4 годин, наприклад у ході способу, описаного в даному документі.
Поліпептид, який має активність фосфоліпази Аї, у способі зниження вмісту інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії, як описано в даному документі - це поліпептид, здатний
Зо зменшувати або, який зменшує щонайменше на 80 95, 81 Фо, 82 9о, 83 95, 84 96 або щонайменше на 85 95 кількість фосфоліпідів, які початково присутні у зазначеній олії, при інкубації олії із цією фосфоліпазою АТ, узятою в кількості 0,1 - 0,4 мг, наприклад 0,2- 0,3 або 0,28 мг активного білка на 1 кг олії, за температури 55 "С, 60 "С, 65 "С і/або 70 "С протягом 4 годин. Зазначена олія може містити також лимонну кислоту в концентрації 500 1/10-6 (рріт) і З 95 (маса/маса) води.
Було виявлено, що поліпептид, який має активність фосфоліпази А, у способі, описаному в даному документі, здатний зменшувати або зменшує щонайменше на 80 95, 81 9», 82 95, 83 Об, 84 95, 85 95, 86 95, 87 95, 88 95, 89 96 або щонайменше на 90 95, наприклад від 85 95 до 99 95, наприклад від 8695 до 9895, наприклад від 87 95 до 9795, наприклад від 8895 до 96 95, наприклад на 89 95-95 95, наприклад на 90 95-94 95 кількість фосфоліпідів, які початково присутні у зазначеній олії, у діапазоні температур 5570-70 "С. Фосфоліпазу АТ, описану в даному документі, інкубують із зазначеною олією за температури від 55 "С до 70 "С протягом 4 годин.
В одному із втілень даного винаходу спосіб для зменшення кількості інтактних фосфоліпідів, описаний у даному документі - це спосіб, у якому кількість інтактних фосфоліпідів зменшується щонайменше на 80 95, 81 9», 82 Фо, 83 95, 84 9, 85 95, 86 95, 87 Фо, 88 95, 89 96 або щонайменше на 90 95, наприклад від 85 95 до 99 95, наприклад від 86 95 до 98 95, наприклад від 87 95 до 97 95, наприклад від 88 до 96 95, наприклад від 89 95 до 95 95, наприклад від 90 95 до 94 95 від тієї кількості інтактних фосфоліпідів, які початково присутні у зазначеній олії. Було виявлено також, що кількість інтактних фосфоліпідів у олії зменшувалося за температури 55 "С, 607, 657С іабо за температури 70 "С після інкубації олії з фосфоліпазою АТ, узятою в кількості 0,1-0.4 мг активного білка на 1 кг олії, наприклад 0,28 мг активного білка на 1 кг олії, протягом 4 годин.
Компоненти олії, які містять фосфор, наприклад фосфоліпіди, лізофосфоліпіди й ефіри фосфорної кислоти, можна визначати методом ядерного магнітного резонансу з З'Р(І'Р-ЯМР) іабо високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С), наприклад так, як описано в даному документі в розділі "Матеріали й методи".
У даному документі під словосполученням "поліпептид, який має активність фосфоліпази
А1", мають на увазі фермент, який має номер Е.С.3.1.1.32 згідно міжнародної ієрархічної класифікації. Фермент фосфоліпаза АТ розщеплює фосфоліпідну молекулу в положенні ЗМ1, у результаті чого утворюються лізофосфоліпід і жирна кислота. Фосфоліпаза Ат, описана в даному документі, також розщеплює лізофосфоліпідну молекулу в положенні ЗМ1 у результаті бо чого утворюються гліцерофосфат і жирна кислота. У даному документі термін "фосфоліпаза А1"
і словосполучення "поліпептид, який має активність фосфоліпази Аї1" вживаються як взаємозамінні. Описаний у даному документі поліпептид, який має активність фосфоліпази А1, не має активності фосфоліпази А2.
У способі, описаному в даному документі, при інкубації олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази Ат, відбувається перетворення фосфоліпідів, які містяться в олії, на лізофосфоліпіди й вільні жирні кислоти. У способі, описаному в даному документі, при інкубації олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази Аї!ї, може також відбуватися перетворення фосфоліпідів, які містяться в олії, і/або лізофосфоліпідів у лізофосфоліпіди й/або гліцерофосфати й вільні жирні кислоти.
У способі, описаному в даному документі, інкубація олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази Ат, здійснюється при рН від 2 до 8, наприклад від З до 7, наприклад від 4 до 6.
У способі, описаному в даному документі, інкубація олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази А1, здійснюється в присутності кислоти. Бажано спосіб зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії, описаний у даному документі, включає додавання кислоти в такій кількості, що її концентрація в олії становить від 100 ррт до 1000 ррт, наприклад від 200 ррт до 900 ррт, наприклад від 300 ррт до 800 ррт, наприклад від 400 ррт до 600 ррт. Кислоти, придатні для способу, описаного в даному документі, включають лимонну, фосфорну, оцтову, виннокам'яну й/або бурштинову кислоти або будь-які придатні їх суміші.
Звичайно в способі, описаному в даному документі, використовується вода. Зазначений спосіб включає додавання води до олії в такій кількості, що її вміст у олії становить 0,5-5 95 (маса/маса), наприклад 1-4 95 (маса/маса), наприклад 2-3 95 (маса/маса).
Інкубація олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази А1!, здійснюється за температури від 40 "С до 75 "С, наприклад за температури від 45 "С до 70 "С, наприклад при 50-65 76.
У способі, описаному в даному документі, харчову олію інкубують з фосфоліпазою А протягом придатного періоду часу, що становить від 0,5 до 10 годин, наприклад від 1 до 8 годин або від 2 до 6 годин.
Олію інкубують з відповідною кількістю фосфоліпази АТ, яка повинна бути такою, щоб через 4 години інкубації за температури від 55 "С до 70 "С видалялося щонайменше 80 95, 81 95, 82 Об, 83 95, 84 95, 85 90, 86 90, 87 У, 88 У, 89 905, або щонайменше 90 Фо, 91 9, 92 90, 93 90, 94 905, або щонайменше 95 95 вихідної кількості інтактних фосфоліпідів, які містяться в триацилгліцеридній олії. Кількість фосфоліпази Ат, яка додається в олію, становить 0,02-3 мг активного білка, який має активність РІАТ1, на 1 кг олії, наприклад 0,05-1 мг активного білка РГІАЇ1 на 1 кг олії, наприклад 0,1-0,8 мг активного білка РІГ А на 1 кг олії, наприклад 0,15-0,5 мг активного білка
РГАЇ на 1 кг олії, наприклад 0,2-0,4 мг активного білка РІ А1 на 1 кг олії.
Джерелом фосфоліпази АТ може бути будь-який придатний організм, наприклад гриби.
Придатні види грибів включають філаментні гриби, наприклад з родів АзрегуйШи5, Таіаготусев,
Тпісподегта, і дріжджі, наприклад з родів Ріспіа і зЗасспаготусев5, наприклад види Азрегодійи5 огугає, Аврегадіїййв5 підег, Аврегуійи5 підшапе, Таіаготусе5 етеїзопії, Рісніа равіогів, засспаготусеб5 сегемізіае. Джерелом походження поліпептиду, який має активність фосфоліпази А1, може бути, наприклад, Азрегойи5 підег.
Фосфоліпаза Ат, яка використовується в способі, описаному в даному документі, містить поліпептид, щонайменше на 80 95 ідентичний до зрілої амінокислотної послідовності зЕО ІЮ
МО: 1; ступінь ідентичності цього поліпептиду й послідовності зХЕО ІЮ МО: 1 може становити, наприклад, щонайменше 8595, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895, або щонайменше 99 95.
Поліпептид, який має активність фосфоліпази Аї, може містити зрілу амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1 (або складатися із цієї послідовності). Зріла амінокислотна послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1 містить амінокислотні залишки з 30-го до 298-й послідовності ХЕО
ІО МО: 1 (або складається з них). Зріла амінокислотна послідовність 5ЕО ІЮ МО:1 може також містити амінокислотні залишки з 29-го до 297-й 5ЕО ІО МО: 1, наприклад з 28-го до 296-й 5ЕО
ІО МО: 1, наприклад з 31-го до 298-й 5ЕО ІЮО МО: 1, наприклад з 32-го до 297-й БЕО ІЮО МО: 1 (або складатися з них). Зазначена зріла амінокислотна послідовність також може містити ще один або більше амінокислотних залишків на С-кінці послідовності зЕО ІЮ МО: 1.
Фосфоліпаза АТ, використовується в способі, описаному в даному документі, може бути природним поліпептидом або ж його варіантом.
Фосфоліпазу Аї можуть продукувати будь-які придатні клітини-хазяїни, придатні для утворення в них описаного в даному документі поліпептиду, який має активність фосфоліпази
А1; це можуть бути прокаріотичні або еукаріотичні клітини. З поміж еукаріотичних клітин 60 придатними можуть бути клітини ссавців, комах, рослин або грибів.
Із поміж клітин грибів, відповідно до даного винаходу, придатними є, наприклад, клітини філаментних грибів і дріжджів, наприклад клітини представників родів Засспаготусев, Ріспіа,
АзрегоїПи5, Тгісподепта, наприклад видів засспаготусев сегемівзіає, Ріспіа равзіогі5, Азрегойив5 підег, Азрегоїйи5 огу/ає, Тгісподегта геезеї або Тгісподепта мігіде. Відомі в даній галузі техніки молекулярно-біологічні методи одержання клітин-продуцентів для цілей даного винаходу здійснюють відповідно до інструкцій Затрбгоок 4. КиззеїЇ, Моїесшаг СіІопіпод: А Гарогаїюгу МапааїЇ,
За Еа., СЗНІ. Ргезв, Соїа 5ргіпд Нагбог, МУ, 2001.
Клітини-хазяїни, здатні продукувати запропоновану даним винаходом фосфоліпазу А, культивують у придатному для цієї мети ферментаційному середовищі, яке створює можливість експресії фосфоліпази А1. Фахівцям у даній галузі техніки повинно бути відомо, як одержати поліпептид, який має активність фосфоліпази Аї, залежно від специфіки клітин-хазяїнів.
Потрібне для цього ферментаційне середовище, як правило, містить джерело азоту й вуглецю.
Зазвичай рН придатного ферментаційного середовища, відповідно до даного винаходу, становить від 4 до 8. Для культивування клітин-хазяїв зазвичай потрібна температура від 257 до 60 "С. З ферментаційного середовища виділяють фосфоліпазу АТ за допомогою відомих у даній галузі техніки методів, наприклад, шляхом центрифугування, фільтрації й/або ультрафільтрації.
У запропонованому даним винаходом способі фосфоліпаза Аї може мати вигляд композиції, яка містить описану в даному документі фосфоліпазу А1, наприклад водної або нерідкої композиції, що містить фосфоліпазу А1, описану в даному документі. Цією композицією може бути ферментаційне середовище, з якого видалені клітини й/або інші компоненти, наприклад шляхом центрифугування, фільтрації або ультрафільтрації.
Фосфоліпаза А1 також може мати вигляд чистої або ізольованої/виділеної фосфоліпази А, тобто поліпептиду, який має активність фосфоліпази АТ, відділеного від щонайменше одного компонента, наприклад іншого поліпептидного матеріалу, з яким він початково об'єднаний.
Фосфоліпіди, які містяться в триацилгліцеридній олії, містять фосфатидну кислоту (РА), фосфатидилетаноламін (РЕ), фосфатидилінозит (РІ) і фосфатидилхолін (РОС). Виявлено, що в результаті застосування способу, описаного в даному документі, вміст або кількість цих чотирьох фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії зменшується.
В одному із втілень даного винаходу описаний у даному документі спосіб включає етап додавання кислоти в олію. Придатні для цього кислоти включають лимонну, фосфорну, оцтову, виннокам'яну й/або бурштинову кислоти й будь-які їхні придатні суміші.
В іншому втіленні даного винаходу запропонований спосіб включає додавання до олії сполук, які підвищують лужність середовища. Для цього придатні, наприклад, гідроксид калію або гідроксид натрію, силікат натрію, карбонат натрію, карбонат кальцію, бікарбонат натрію, аміак, цитрат натрію або будь-які їхні придатні суміші.
Кислоту, воду або речовини, які підвищують лужність, можна додавати на будь-якому придатному для цього етапі способу зменшення кількості інтактних фосфоліпідів. у триацилгліцеридній олії, описаному в даному документі. Додавання зазначених агентів може відбуватися до, у процесі або після інкубації олії з фосфоліпазою. Бажано кислоту, воду й/або агент, який підвищує лужність, додають до інкубації олії з фосфоліпазою А1. Додавання агента, який підвищує лужність, можна здійснювати до або після додавання кислоти, наприклад, агент, який підвищує лужність, додають після додавання кислоти.
Спосіб зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії, описаний у даному документі, може також включати етап попередньої обробки олії в присутності кислоти й/або агента, який підвищує лужність. Для цього беруть названі раніше кислоти й/або агенти, які підвищують лужність. Попередня обробка олії включає її інкубацію з кислотою й/або речовиною, яка підвищує лужність, за температури від 50 "С до 75 "С, наприклад за температури від 55"7С до 70 "С. Попередня обробка олії триває від 1 хвилини до 2 годин, наприклад від 5 хв. до 1 год., наприклад від 10 хв. до 40 хв.
В одному із втілень даного винаходу спосіб, описаний у даному документі, також включає інкубацію олії з ферментом, який має активність фосфоліпази С, яка має активність фосфатидилінозит-фосфоліпази С, і/або з ферментом, який має активність фосфоліпази Аг.
Фосфоліпаза С (РІ С) - це фермент, який згідно міжнародної ієрархічної класифікації має номер ЕС 3.1.4.3, і який розщеплює молекулу фосфоліпіду за зв'язком, сформованим фосфорноою кислоти й ОН-групою гліцерину, з утворенням дигліцериду й похідного фосфату, наприклад холінфосфату або етаноламінфосфату. Фосфоліпаза С обговорюється, наприклад, у публікаціях УУО2005/086900, УМО2012/062817 або МО2016/162456. Фосфоліпаза С може бути представлена поліпептидом, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 3, описану 60 також на стор. 196 публікації У/О2005/086900. Фосфоліпаза С може бути представлена поліпептидом, щонайменше на 80 95, 85 95, 90 9», 95 90, 96 95, 97 95, 98 96 або щонайменше на 99 95 ідентичним до амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮО МО: 3.
Фосфоліпаза С також може бути фосфатидилінозит-фосфоліпазою С (РІ-РІ С). Кращим субстратом РІ-Р/С є фосфатидилінозит, але вона розщеплює й інші фосфоліпіди, наприклад фосфатидилхолін і фосфатидилетаноламін. Бактеріальна фосфатидилінозит-фосфоліпаза С позначається номером ЕС 4.6.1.13 згідно міжнародної ієрархічної класифікації. Придатний для даного винаходу фермент Рі-РЇС описаний, наприклад, у публікації. УМО2011/046812.
Придатний для цідей даного винаходу фермент РІ-РІ С містить амінокислотну послідовність
ЗБЕО ІЮО МО: 4, яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 8 з публікації УУМО2011/046812.
Фосфатидилінозит-фосфоліпаза С може бути представлена поліпептидом, щонайменше на 8095, 8595, 9095, 9595, 9б о, 9795, 9895 або щонайменше на 9995 ідентичним до амінокислотної послідовності 52ЕО ІЮО МО: 4.
Фосфоліпаза А2 (РГА2) відщеплює від молекули фосфоліпіду залишок жирноїй кислоти, зв'язаний із другим вуглецевим атомом гліцеринового скелету; цей фермент має номер ЕС 3.1.1.4 згідно міжнародної ієрархічної класифікації. Фосфоліпазою А2 у запропонованому даним винаходом способі може бути, наприклад, РІ А2 з підшлункової залози свині, яка експресується в придатних клітинах-хазяїнах, наприклад у клітинах представників роду Азрегодіи5, наприклад виду Азрегдіи5 підег.
Спосіб, описаний у даному документі, може також включати видалення з олії компонентів, які містять фосфор. Компоненти олії, які містять фосфор, можна відокремити будь-яким придатним для цього методом, відомим у даній галузі техніки, наприклад, шляхом центрифугування. Компоненти триацилгліцеридної олії, які містять фосфор, включають фосфоліпіди, лізофосфоліпіди й гліцерофосфати.
У способі зниження вмісту фосфоліпідів у харчовій олії, який описаний у даному документі, може надаватися або використовуватися будь-яка придатна триацилгліцеридна олія. Це може бути неочищена харчова олія або харчова олія, яка прошла рафінацію шляхом гідратації.
Термін "неочищена олія" (яка називається також нерафінованою) відноситься до олії, отриманої із сировини шляхом пресування або екстракції. Назва неочищена олія може поширюватися на рослинні олії, тваринний жир, риб'ячий жир або олію, отриману з водоростей. Для даного
Зо винаходу можна використовувати будь-яку придатну рослинну олію, наприклад соєву, ріпакову (як технічну, так і харчову), соняшниковк, пальмову, пальмоядрову, кокосову, кунжутну, маслинову, рисову, бавовняну, кукурудзяну, горіхову (наприклад, мигдальну, арахісову, з волоських горіхів) та їх суміші. Процес зменшення кількості інтактних фосфоліпідів. у триацилгліцеридній олії можна також назвати дегумуванням олії, або рафінацією олії.
Неочищена рослинна олія містить від 1 ррт до 2000 ррт атомів фосфору. Їхня кількість відображає кількість фосфоліпідів.
У даному документі також описується триацилгліцеридна олія, яка містить поліпептид, який має активність фосфоліпази АТ, який включає поліпептид, щонайменше на 80 95 ідентичний до зрілої амінокислотної послідовності 560) ІО МО: 1. Тиацилгліцеридну олію можна одержувати способом, описаним у даному документі. Усі описані в даному документі втілення цього способу можуть бути застосовані до триацилгліцеридної олії, описаної в даному документі.
Олія, описана в даному документі може містити також поліпептид, який має активність фосфоліпази С; поліпептид, який має активність фосфатидилінозит-фосфоліпази С (РІ-РІ С) і/або поліпептид, який має активність фосфоліпази А2. Олія, описана в даному документі, може також містити поліпептид, який має активність фосфоліпази С, який щонайменше на 80 95, 8595, 90 95, 95 95, 96 95, 97 9У5, 98 У6 або щонайменше на 99 95 ідентичний до амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3; поліпептид, який має активність фосфатидилінозит-фосфоліпази
С, який щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 9, 97 95, 98 96 або щонайменше на 99 95 ідентичний до амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 4 і/або фосфоліпазу А2 з підшлункової залози свині.
Ілюстрації
Фігура 1. Схематичне зображення плазміди рОоВТОРРІА-1, яку використовували для експресії фосфоліпази А1 А. підег.
Приклади
Матеріали й методи
Молекулярно-біологічні методи
Молекулярно-біологічні методи, відомі фахівцям у даній галузі техніки, застосовували відповідно до інструкцій ЗатбргооК 5 КиззеїІЇ, МоІесшіаг СіІопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї, Зга Еа.,
СЗНІ. Ргез5, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ, 2001. Полімеразну ланцюгову реакцію (РСК) проводили на 60 термоциклері за допомогою високоточної полімерази Ріизіоп Нідп-Рідейшу ОМА роїутегазе
(Ріпплутев ОУ, Еспоо, Фінляндія) відповідно до інструкцій виробника.
Ферменти
Використовували наступні наявні у продажу готові препарати ферментів і суміші ферментів: - Ригійпе? РІ С/РІ-РІС - містить фосфоліпазу С (ЗЕБЕО І МО 3) ії фосфатидилінозит- фосфоліпазу С (5ЕО ІО МО: 4) (виробництво ОЗМ); - Ригіїїпе? За: - містить фосфоліпазу С (ЗЕО ІЮ МО: 3), фосфатидилінозит-фосфоліпазу С (ЗЕО І МО: 4) і фосфоліпазу А2 з підшлункової залози свині (виробництво ОМ); - Гесіазе? Ойга від Момолутев5, фосфоліпаза А з Ризагішт охузрогит, була від Зідта
Аагісн.; - Вопаіазе? РІ-ХТВА - фосфоліпаза А Азрегоїїи5 Титідаси5 (виробництво АВ Епгутев).
Одержання штамів
Був отриманий штам А. підег (депонований у Центральному бюро мікологічних колекцій
Нідерландів під номером СВ5 513.88), який має делецію в гені, що кодує глюкоамілазу (ЛдіаА) і делецію в гені протеази рераА, згідно з методом, описаним у Європейському патенті Мо 0 635 574
ВІ і в роботі мап деп Нотрбегоі ..Р. еї а. (1997) Єиг. У. Віоспет. 247(2): 605-13). Потім зі штаму
А. підег з лодіаА і ДрерА, одержували штам А. підег, який не продукує щавлеву кислоту, згідно з методом, описаним у публікації М/О2004/070022. У результаті одержували штам А. підег, який має делеції в генах діаА (глюкоамілаза), рерА (кисла аспартатна протеаза) і оапА (оксалоацетат-ацетилгідролаза), тобто ЛдіаА, ДрерА, ДоанА.
Одержання штамів Азрегойиз підег, які продукують фосфоліпазу А1
Для експресії в штамі А. підег (ДодіаА, ДрерА, доайА) брали фосфоліпазу АТ (РІ АТ) А. підег (нуклеотидна послідовність, яка її кодує представлена 5ЕО ІО МО: 2, амінокислотна послідовність - «ЕО ІЮО МО: 1).
Ген, який кодує РІАТ, був отриманий синтетичним шляхом і клонований в експресійному векторі А. підег равВтТОР-12, як описано в публікаціях УМО 98/46772 і УМО 99/32617, під контролем промотору гена глюкоамілази. У результаті був отриманий експресійний вектор А. підег РраВТОРРІ А-1 (Фіг. 1); при цьому застосовували ті ж методи, які описані в публікаціях УМО 98/46772 і УМО 99/32617.
Штам, який продукує фермент РІ АТ, одержували шляхом ко-трансформації штаму А. підег
Зо (ДдіаА, АрерА, ДоапА) вектором рОВААЗ-1, що містять селектований маркер - ген атоб5, і вектором роОВТтТОРІА-1 і подальшого відбору трансформованих клітин. У результаті трансформації й антивідбору (як описано в публікаціях М/О98/46772 і ММО99/32617), з наступним відбором штамів були отримані штами, які продукують білок РІ А1. Із усіх трансформованих рОаВтТОРРІА-1 клітин з фенотипом (ЛдіаА, АрерА, ДЛоапА) був відібраний один штам, який ефективно продукував фосфоліпазу АТ; із цього зразка шляхом передруковування отримували одноштаммовий інокулят, який називали штамом РІГА1-1. Штам РГА1-1 використовували як продуцент ферменту РІ А1 у подальших експериментах.
Культивування А. підег у колбах, що струшуються для продукування фосфоліпази А1
Одержували свіжі спори штаму РІА17-1 А. підег. У чотири 100-мілілітрові колби, що струшуються, поміщали по 20 мл ферментаційного середовища 1 |склад ферментаційного середовища 1:10 95 (маса/об'єм) порошкового кукурудзяного екстракту Согп бБівер 5оїїав5; 1 95 (маса/об'єм) гідратної глюкози; 0,1 95 (маса/об'єм) МаНе»РО» х НгО; 0,05 95 (маса/об'єм) Ма5О»4 х 7НгО; 0,025 95 (маса/об'єм) піногасник (виробництво Вазіїдоп Спетіса! Сотрапу, (1Я.); рН 5,81. вносили по 107 спор. Ці попередні культури інкубували за температури 34 С їі швидкості обертання 170 об./хв. протягом 16-24 годин. З попередніх культур відбирали по 10-15 мл і за температури 34 "С та перемішуванні зі швидкістю 170 об./хв. вносили в 500-мілілітрові колби з перегородками, що струшуються, які містили по 100 мл ферментаційного середовища 2 наступного складу: 15 95 (маса/об'єм) мальтоза; 6 95 (маса/об'єм) соєвий пептон Васіо Зоуїопе; 1,5 95 (маса/об'єм) (МНа)250О4; 0,1 95 (маса/об'єм) МаНегРО»4 х НегО; 0,1 95 (маса/об'єм) Мо5О54 х 7НгО; 0,1 95 (маса/об'єм) І -аргінін; 8 Фо (маса/об'єм) полісорбат-80 (Пуееп-80); 2 9во (маса/об'єм) піногасник (виробництво Вавзіїдоп Спетіса! Сотрапу, І9.); 2 95 (маса/об'єм). 2-(М-морфоліно) етансульфонат (МЕ); рН 5,1. Через 7 діб культивування клітини вбивали, для чого додавали в культуру бензоат натрію (3,5 г/л) і тримали за температури 30 "С протягом 6 годин. Потім у культуру вносили Сасі»г (10 г/л) і перліт С25 (45 г/л), після чого фільтрували за один прийом через фільтрувальні серветки й фільтри ОЕбО/ЕКЗ Р і К250 (виробництво РаїЇ). Матеріал на фільтрі промивали стерильною водою (1,1 л), очищеною в системі МІПО). Після цього проводили стерильну фільтрацію, використовуючи фільтри 0,22 мкм СР Ехрге55 РІ Ш5 (виробництво
МіПіроге). Отриманий фільтрат, що містить РІ А, використовували в експериментах, описаних у розділі "Приклади". бо Визначення активності фосфоліпази А1 (РІ А1)
Готували наступні розчини: 1. Розчин субстратів - 1 г Ї-7-фосфатидилхоліну яєчного жовтка (Зідта РЗ3556, Звейндрехт,
Нідерланди) в 2 уо-ному розчині октилфенолетоксилату (Топ Х-100); 2. Буферний розчин - 0,2 М ацетатний, рН 4.5; 3. Розчин для припинення реакції - 1 М НСІ
Змішували 500 мкл розчину 1 і 300 мкл розчину 2 і доводили суміш до температури 37 "С.
Починали реакцію, додаючи 100 мкл розчину ферменту з активністю 0,05-1,0 Од./мл. Інкубували хв. за температури 37 "С, після чого реакцію зупиняли, додаючи 100 мкл розчину 3. Для контролю інкубували субстрат без зразка протягом 10 хв. за температури 37 "С, потім додавали 10 100 мкл реагенту, який припиняє реакцію, і після цього 100 мкл зразка. Визначали вміст вільних жирних кислот у досліді й у контролі за допомогою діагностичного набору Умако НЕ 5егіеєх МЕРБА-
НА (2) аіадповіїс Кії (пИр/лЛиумлу. маКодіадповіїс5.сот/г пеїа.піті) відповідно до інструкції на аркуші-вкладці. Розраховували активність за формулою ій - АЕРАхХмМіхаї ті. Увхі де
ШМ/ті - ферментативна активність (Од./мл)
АЕРА - зміна вмісту вільних жирних кислот (ЕРА у зразку - ЕРА у контролі) мкмоль/мл
М; - сумарний об'єм після припинення реакції (1 мл)
Ме - об'єм зразка (0,1 мл)
Ії - тривалість інкубації (10 хвилин) аг - кратність розбавлення зразка 1 Од. ферментативної активності - це кількість ферменту, при якій за 1 хвилину утворюється 1 мкмоль вільних жирних кислот за умов експерименту.
Визначення активності фосфоліпази С (РІ С)
Склад розчину субстрату: 10 мМ нітрофенілфосфорилхолін (рМР) (артикул М83020; Меїгога
І арогасогіє5 ца, Іпсуїч, Великобританія); буферний розчин 100 ММ 3- морфолінопропансульфонат (МОРБ) (рН 7,3); 0,2 96 Поп Х-100; 1 мМ 7п50»5. Змішували 40 мкл зразка (з активністю від 0,03 до 0,1 Од./мл) і 960 мкл розчину субстрату. Інкубували за температури 37 "С протягом 30 хв. Реакцію зупиняли, додаючи 1000 мкл реагенту для припинення реакції, який містить 1 М трис(гідроксиметил)амінометану (ТКІ5) і 50 мМ
Зо етилендиамінтетраацетата (ЕОТА) із рН 10, доведеного за допомогою 0,5 М розчину Маон. Для контролю до ферментного зразка додавали реагент, який припиняє реакцію. Визначали оптичну щільність (00) зразків і контролів на довжині хвилі 405 нм.
Для калібрування готували розчини рМР з концентрацією 0 -0,5-1,0-2,0-2,9-40мМ у зазначеному вище буферному розчині. По 40 мкл кожного зі стандартних розчинів змішували з 960 мкл розчину субстрату й 1000 мкл реагенту, який припиняє реакцію. Визначали оптичну щільність (00) розчинів на довжині хвилі 405 нм. Використовуючи лінійну регресію, розраховували нахил калібрувальної кривої.
Ферментативну активність розраховували за формулою у/ 0 ДАБехаї т - І" 8іоре ,де
ШМ/ті - ферментативна активність (Од./мл)
ДАБЗз - (Азразка - Аконтролю) аг - кратність розбавлення зразка 5іоре - нахил калібрувальної кривої по утворення пари-нітрофенолу (мл/мкмоль)
Ії - тривалість інкубації (30 хв.) 1 Од. ферментативної активності - це кількість ферменту, при якій за 1 хвилину утворюється 1 мкмоль пара-нітрофенолу за умов експерименту (рН 7,3; 37 "С).
Визначення активності фосфатидилінозит-фосфоліпази (РІ-РІ С)
Склад розчину субстрату: розчин М-метилморфоліну 4-метилумбеліферилміо-інозитол-1- фосфату (Віобупій М-571; Брюссель, Бельгія) з концентрацією 20 мМ у буферному розчині (200
ММ фосфату натрію; рН 7,5), який містить 0,1 95 Тийоп Х-100. Розчин субстрату (140 мкл) доводили до температури 37 "С. Починали реакцію, додаючи 10 мкл зразка з активністю від 0,2
Од./мл до 1,0 Од./мл. Інкубували за температури 37 "С, визначаючи зміну поглинання (у порівнянні з контролем) на довжині хвилі 380 нм. Мірою ферментативної активності був нахил (дОр/час) лінійної частини кривої.
Для калібрування готували стандартні розчини 4-метилумбеліферону концентрацією 0 - 1,0- 2,0-3,0 - 4,0-5,0 мМ у фосфатному буферному розчині (200 мМ) По 10 мкл кожного стандартного розчину змішували з 140 мкл субстрату. Вимірювали оптичну щільність (00) на довжині хвилі 380 нм. Використовуючи лінійну регресію, розраховували нахил калібрувальної кривої.
Ферментативну активність розраховували за формулою
Од./мл - (ДАБ5/тіп зразок - ДАРв5/тіпконтроль) х ав, де
Од./мл - ферментативна активність
ДАБр5/тіпзразок - Зміна поглинання зразка за хвилину
ДАБр5/тіпконтроль - Зміна поглинання контролю за хвилину аг - кратність розбавлення зразка
З - нахил калібрувальної кривої для 4-метилумбеліферону (мл/мкмоль) 1 Од. ферментативної активності - це кількість ферменту, при якій за 1 хвилину з 18,7 мМ розчину 4-метилумбеліферилміо-інозитол-1-фосфату утворюється 1 мкмоль 4- метилумбеліферону за умов експерименту (рН 7,3; 37 70).
Кількісне визначення вмісту фосфоліпідів, лізофосфоліпідів і гліцерофосфатів методом ядерного магнітного резонансу з фосфором-31 (УР -ЯМР)
Відважували точну кількість олії (500-1000 мг) у придатну ємність, додавали 10 г холодного ацетону й ретельно перемішували. Суміш олії з ацетоном витримували за температури 4 "С протягом щонайменше 30 хв., після чого центрифугували 10 хв. зі швидкістю 3000 об./хв.
Отриману рідку фазу відкидали. Осад суспендували в 500 мкл буферного розчину (який містить 25 г/л дезоксихолієвої кислоти; 5,84 г/л ЕОТА; 10,9 г/л ТКІ5, рН доводили до 9,0 за допомогою
КОН), і додавали 50 мкл розчину, який виконував роль внутрішнього стандарту (який містить 10 г/л триїзопропілфосфату в буферному розчині для екстракції).
Одномірні спектри (10 РУ'ЯМР) реєстрували за допомогою спектрометра ВгиКег Амапсе ЇЇ
НО (робоча частота З'Р 161,97 МГц), оснащеного кріозондом, який охолоджується рідким азотом; температура зразка З00К. Використовували інвертувальний затвор 13С (2С1С) програми імпульсів з розв'язкою від протонів Умай»16; реєстрували 4 скана до початку запису та по 128 сканів на спектр, використовуючи 90-градусний імпульс; час вибірки спаду вільної індукції 3,37 с; релаксаційна затримка 11,5 с.
Концентрації аналіта розраховували відносно триізопропілфосфату.
Для холінфосфату й етаноламінфосфату вводили поправочний коефіцієнт, щоб урахувати
Зо неповну релаксацію
Кількісне визначення диацилгліцеролів (САС) у оліях
Групи нейтральних ліпідів розділяли шляхом нормально-фазової високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С); дигліцериди визначали шляхом детекції за світлорозсіюванням випаруваного зразка (ЕЇ50О), використовуючи модифікацію методу Са 11а-96, офіційно схваленого Американським товариством олеохімії (24ОС5). Вміст аналітів виражали у відсотках (маса/маса).
Приклад 1. Дегумування неочищених соєвої й ріпакової олій за температури 55-70 С з використанням фосфоліпази А1
Використовували два варіанти неочищеної соєвої олії від американських підприємств з переробки олійного насіння і два варіанти неочищеної ріпакової олії від європейських виробників. Відважували 10 г олії, поміщали в колбу й нагрівали до температури 70 "С, потім додавали лимонну кислоту (у вигляді 50 Уо-ного розчину) до кінцевої концентрації лимонної кислоти в олії 500 ррт. Колбу з олією і лимонною кислотою інкубували за температури 70 С протягом щонайменше 30 хв.
Після цього суміш доводили до потрібної температури (55, 60, 65 і 702С) і підтримували Її.
Коли температура стабілізовулася, у олію підмішували фермент РІ АТ, отриманий, як описано вище, у кількості 0,28 мг активного білка на 1 кг олії (1,25 одиниць активності фосфоліпази А на 1 у) ії воду за допомогою диспергатора ОКга Тиггах; кінцева концентрація води в олії становила
З до (маса/маса). Реакція тривала 4 години, при цьому олію перемішували за допомогою магнітної мішалки (швидкість обертання 800 об./хв.). Після закінчення цих чотирьох годин відбирали зразки й визначали вміст фосфоліпідів (РІ), а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ), методом У'Р-
ЯМР, як описано вище.
Результати, представлені в 1-4 нижче, показують, що фосфоліпаза АТ, описана в даному документі, знижує вміст усіх чотирьох зазначених фосфоліпідів (РА, РС, РЕ і РІ). За 4 години фосфоліпазної реакції за температур 5520, 60 "С, 65 7С і 702С відбувався гідроліз більше ніж 85 95 сумарної кількості фосфоліпідів (РІ), які початково були присутні у олії.
Таблиця 1
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії (варіант А) до й після інкубації з фосфоліпазою А1. нн мкмоль/100 г олії 207,0 901,0 603,2 499,7 2211,0 55 "С, 4 год. 60 "С, 4 год. 113,5 65 "С, 4 год. 111,9 70 "С, 4 год. 180,5
Таблиця 2
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії (варіант В) до й після інкубації з фосфоліпазою А1. 111111111ПРА | РОС | РЕ | РІ | Сумарний вмістрРіІ. нн мкмоль/100 г олії 179,9 450,5 374,0 285,1 1289,5 55 "С, 4 год. 60 "С, 4 год. 65 "С, 4 год. 70 "С, 4 год.
Таблиця З
Вміст фосфоліпідів у неочищеній ріпаковій олії (варіант А) до й після інкубації з фосфоліпазою А1.
Неочищена ріпакова олія А
Сумарний
А теє мот нн мкмоль/100 г олії 477 А 762,3 334,0 442 2017,9 55 С, 4 год. 123,8 60 "С, 4 год. 145,8 65 "С, 4 год. 154,9 70 "С, 4 год. 171,5
Таблиця 4
Вміст фосфоліпідів у неочищеній ріпаковій олії (варіант В) до й після інкубації з фосфоліпазою А1.
Неочищена ріпакова олія В ні мкмоль/100 г олії 500,9 ЗО, 247,3 235,0 13332 55 "С, 4 год. 60 "С, 4 год. 65 "С, 4 год. 70 "С, 4 год. 142,0
Приклад 2. Порівняння ефективності РІАТ і готового препарату фосфоліпази А за температури 55"7С
Неочищена соєва олія й соєва олія, дегумована шляхом гідратації, надавалися американськими підприємствами з переробки олійного насіння. Відважували 10 г олії в придатну ємність, нагрівали до 70 "С, потім додавали лимонну кислоту (у вигляді 50 95-ного розчину) до кінцевої концентрації цитрату в олії 500 ррт. Посуд з олією, обробленою лимонною кислотою, інкубували за температури 70"С протягом щонайменше 30 хв., після чого температуру доводили до 55 "С і підтримували на цьому рівні.
Коли температура стабілізувалася, у суміш олії з лимонною кислотою додавали воду й 25 ррт ферменту РГАТ, отриманого, як описано вище, і перемішували за допомогою диспергатора
ОНга Тиїтах. Кінцева концентрація води в суміші становила З 95 (маса/маса).
У тому випадку, коли олію з лимонною кислотою, доведеною до температури 557С, обробляли готовими ферментними препаратами з активністю фосфоліпази А, у суміш олії й лимонної кислоти спочатку додавали розчин МасОнН (2М) до кінцевої концентрації 138 ррт
Маон, а після цього 25 ррт ферментного препарату з водою й перемішували диспергатором
ОНга Тиїтах; кінцева концентрація води становила З 95 (маса/маса).
Олію з лимонною кислотою, водою й ферментом інкубували протягом 4 годин за температури 55 "С, перемішуючи магнітною мішалкою зі швидкістю 800 об./хв. Після цього відбирали зразки й методом З'Р-ЯМР (див. вище) визначали в них вміст фосфоліпідів, а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ); вміст лізофосфоліпідів, а саме лізо-фосфатидної кислоти (І РА), лізо- фосфатидилхоліну (І РОС), лізо-фосфатидилетаноламіну (І РЕ) і лізо-фосфатидилінозиту (І РІ); і гліцерофосфатів, а саме гліцеролфосфатидної кислоти (СРА), гліцеролфосфатидилхоліну (СРС), гліцеролфосфатидилетаноламіну (ОРЕ) і гліцеролфосфатидилінозиту (ОРІ).
Результати, представлені в Таблицях 5 і б, показують, що при використанні для обробки соєвої олії фосфоліпази Аї, описаної в даному документі, за 4 години інкубації із цим ферментом, узятим у концентрації 25 ррт, за температури 552С як у неочищеній олії, такі в олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, вміст фосфоліпідів (фосфатидної кислоти, фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну й фосфатидилінозиту) був меншим, ніж при
Зо використанні готових ферментних препаратів І есйазе? Ойга і Копаіазе? РІ-ХТРА, за умов, оптимальних для кожного із зазначених ферментів. Також результати, представлені в Таблицях 5 і б, показують, що за температури 552С фосфоліпаза Аї1ї, описана в даному документі, проявляє активність лізофосфоліпази, перетворюючи зазначені чотири лізофосфоліпіди на відповідні гліцерофосфати, причому ця активність має місце як для неочищеної соєвій олії, так і для олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, і перевищує таку готових ферментних препаратів І есйазе? ОНга і Бопаіазе? РІ ХТРА. Оскільки емульгуюча здатність гліцерофосфатів нижча, ніж лізофосфоліпідів, перетворення лізофосфоліпідів на гліцерофосфати збільшує ефективність видалення фосфоліпідної Фракції з олії на етапі центрифугування.
Таблиця 5
Вміст фосфоліпідів, лізофосфоліпідів і гліцерофосфатів у неочищеній соєвій олії до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 55 "С. 11111111 (РАЇРСІРЕ РІ) Сумарнийвмістрі |ГРАЇГРС|ГРЕ|ГРІЇСРА|ОРС ОРЕ ОРІ) 11111111 мкмольймобголїї 77771111 « - не виявлено
Таблиця 6
Вміст фосфоліпідів, лізофосфоліпідів і гліцерофосфатів у соєвій олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 55 "С. 11111111 ІРАЇРСІРЕЇ РІЇ Сумарний вмістрі |ГРАЦІ РСЦ РЕ|Г РІЇ СРАГОРС |ОРЕ |ОРІ) 11111111 мкмольмобголї///////777777111111111111сСсС у 11111 РІАТЇЇ | «|«|«1| що |93|148|99|7| | 72 | 48 | «
Аопаавгее?РІХТВА | «| «| «| «| (Р 0 96 |155|97|85)| «| « | « | « « - не виявлено
Приклад 3. Порівняння ефективності обробки неочищеної соєвої олії запропонованим даним винаходом ферментом РІА1 й готовими ферментними препаратами з активністю фосфоліпази
А за температур 55,60165"7С
Використовували неочищену соєву олію, надану американськими підприємствами з переробки олійного насіння. Відважували 10 г олії в придатну ємність, нагрівали до 70 "С, потім додавали лимонну кислоту (у вигляді 50 95-ного розчину) до кінцевої концентрації цитрату в олії 500 ррт. Посуд з олією і лимонною кислотою інкубували за температури 70 "С протягом щонайменше 30 хв.
Після цього температуру доводили до 55 "С, 60 "С і 65 С і підтримували на зазначеному рівні. Коли температура стабілізовувалася, у суміш олії з лимонною кислотою додавали воду й 0,25 мг активного білка РІА1, отриманого, як описано вище, на 1 кг олії й перемішували за допомогою диспергатора Ойга Тиггах. Кінцева концентрація води в суміші становила З 95 (маса/маса).
У випадку обробки олії з лимонною кислотою готовими ферментними препаратами з активністю фосфоліпази А І есйазе? Ойга або Ропаїазе? РІ-ХТРВЕА у суміш додавали спочатку розчин Маон (2М) до кінцевої концентрації 138 ррт МаонН, щоб створити умови, оптимальні для цих ферментних препаратів, а після цього воду й ферментний препарат у кількості 0,25 мг активного білка на 1 кг олії й перемішували диспергатором Ойга Тиггах; кінцева концентрація води становила З 95 (маса/маса).
Ферментативна реакція тривала 4 години при перемішуванні магнітною мішалкою зі швидкістю 800 об./хв. Після цього відбирали зразки й методом У'Р-ЯМР (див. вище) визначали в них вміст фосфоліпідів, а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РОС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ).
Результати, представлені в Таблицях 7-9, показують, що через 4 години інкубації неочищеної соєвої олії з фосфоліпазою А1 А.підег (РІГАТ), описаною в даному документі, за температур 5520, 602С і 6522 вміст фосфоліпідів (фосфатидної кислоти, фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну та фосфатидилінозиту) був меншим, ніж при використанні готових
Зо ферментних препаратів І есіазе? ОКга ії Копаіазе? РІ-ХТРЕА, за умов, оптимальних для кожного їхніх зазначених ферментів.
Таблиця 7
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 55 "С рює и 11111111 мкмольйОбголї7//////7777111111111С (| ВопааввееРІ ХТВАЇ/ | 22. | 2 щ(68 | 2 ЮюЮю42 | 935 | 167 « - не виявлено
Таблиця 8
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 60 "С
ША 1Л хх | кої ки 11111111 мкмольмобголї7//////7/777711111111111с1С « - не виявлено
Таблиця 9
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 65 С
Сумарний 11 мо 11111111 мкмольйобголїї7///////7777771111111111
Приклад 4. Порівняння ефективності обробки соєвої олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратування, ферментом РГАТ запропонованим даним винаходом й готовими ферментними препаратами з активністю фосфоліпази А за температур 55,60165"7С
Використовували соєву олію, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, надану американськими підприємствами з переробки олійного насіння. Відважували 10 г олії в придатну ємність, нагрівали до 70 "С, потім додавали лимонну кислоту (у вигляді 50 95-ного розчину) до кінцевої концентрації цитрату в олії 500 ррт. Посуд з олією і лимонною кислотою інкубували за температури 70 "С протягом щонайменше 30 хв.
Після цього температуру доводили до 55"С, 60"С і 65"С. Коли температура стабілізовувалася, у суміш олії з лимонною кислотою додавали воду й фермент РГІА!1, отриманий, як описано вище, у кількості 0,25 мг активного білка на 1 кг олії й перемішували за допомогою диспергатора Ойга Титах. Кінцева концентрація води в суміші становила З 95 (маса/маса).
У випадку обробки олії з лимонною кислотою готовими ферментними препаратами з активністю фосфоліпази А І есйазхе? Ойга або Копаіахе? РІ-ХТРА у суміш додавали спочатку розчин Маон (2 М) до кінцевої концентрації 138 ррт Ман, щоб створити умови, оптимальні для цих ферментних препаратів, а після цього воду й ферментний препарат у кількості 0,25 мг активного білка на 1 кг олії й перемішували диспергатором ОКга Тиггах; кінцева концентрація води становила З 95 (маса/маса).
Ферментативна реакція тривала 4 години при перемішуванні магнітною мішалкою зі швидкістю 800 об./хв. Після цього відбирали зразки й методом З'Р-ЯМР (див. вище) визначали в них вміст фосфоліпідів, а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РОС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ).
Результати, представлені в таблицях 10-12, показують, що через 4 години інкубації соєвої олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, з фосфоліпазою А1 (РІ АТ), описаною в даному документі, за температури 5520-652С вміст фосфоліпідів (фосфатидної кислоти,
Зо фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну й фосфатидилінозиту) був меншим, ніж при використанні готового ферментного препарату І есіазе? ОКга; препарат Копаіазе? РІ-ХТВА теж забезпечував низький рівень фосфоліпідів за температур 602С і 650. У цих дослідах витримувалися умови, оптимальні для кожного із зазначених ферментів.
Таблиця 10
Вміст фосфоліпідів у соєвій олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 55 С
Соєва олія після рафінації шляхом гідратації, 552 нн"":нншшшн мкмоль/100 г олії
РІ-А! 25 | хх | 9 | « | 34
І есіаве? Ша
Вопаїазе? РІ-ХТВА « - не виявлено
Таблиця 11
Вміст фосфоліпідів у соєвій олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 60 "С
Соєва олія після рафінації шляхом гідратації, 602С пнн":"НнШЕВТ ПОЛО мкмоль/100 г олії
РІАТ
І есіаве? Ша
Вопаїазе? РІ-ХТВА « - не виявлено
Таблиця 12
Вміст фосфоліпідів у соєвій олії, яка пройшла рафінацію шляхом гідратації, до й після інкубації з різними фосфоліпазами протягом 4 годин за температури 6570
Соєва олія після рафінації шляхом гідратації, 652 нн мкмоль 00 г олії
РІАТ
І есікаєе? Шіка 7188. | 62 | 90 | 7 | 48
Вопаїазе? РІ-ХТВА « - не виявлено
Приклад 5. Дегумування олії з використанням комбінації ферментів РІ С/РІРІ С і РІ АТ
Використовували неочищені соєву й ріпакову олії, як описано в Прикладі 1. Відважували 10 г олії в придатну ємність і нагрівали до температури 70 "С. Проводили попередню обробку олії, а саме додавали в неї лимонну кислоту (у вигляді 50 У5-ного розчину) до кінцевої концентрації цитрату 500 ррт. Підготовлену в такий спосіб олію інкубували за температури 70 "С протягом щонайменше 30 хв., після чого додавали в неї Маон до концентрації 138 ррт. Потім приводили температуру до 55 "С і підтримували її на цьому рівні.
Суміш, яка включала фосфоліпазу АТ, отриману, як описано вище в даному документі, і ферментний препарат Ригіїйпе РІ С/РІ-РІ С разом з водою додавали в олію й перемішували за допомогою диспергатора Шга Тиїтах. РІ А1 брали в кількості 0,28 мг активного білка на 1 кг олії, препарат Ригіїйпе РІ-С/РІ-РІ С у кількості 0,013 Од. активності фосфоліпази С на 1 г олії й 0,05
Од. активності фосфотидилінозит-фосфоліпази С на 1 г олії; кінцева концентрація води становила З 95 (маса/маса).
Ферментативна реакція тривала 4 години при перемішуванні магнітною мішалкою зі швидкістю 800 об./хв. Після цього відбирали зразки й методом У'Р-ЯМР (див. вище) визначали в них вміст фосфоліпідів, а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РОС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ). Також визначали дигліцериди (САС) методом НРІ С.
Результати, представлені в Таблицях 13 і 14 нижче, показують, що при використанні РІ А1 одночасно з РІ С/РІ-Р С вміст інтактних фосфоліпідів у олії знижується значніше, ніж при використанні тільки РІ С/РІ-РІС. Через 4 години інкубації олії з комбінацією ферментів
РІАТ-РІ С/РІ-РІ С гідролізованими виявлялося більше 90 95 фосфоліпідів. При використанні
РІГАТ одночасно з РІ С/РІ-Р/С утворення дигліцеридів (БАС) зменшувалося, але їх вміст знижувався тільки на 5-15 95 від загальної кількості утворених без попередньої обробки олії рда.
Таблиця 13
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії до й після інкубації з фосфоліпазою С (РІ С), фосфотидилінозит-фосфоліпазою
С (РІ-РІ С) і фосфоліпазою А1 (РІ А1) за температури 55 С 11111111 1РАЇРСІРЕЇРІ| СумарнийвмістРІ | А-ОДО нннюнІНнН мкмоль/100 г олії 95 (маса/ маса) оМоментчасуо! 77771711 2101547 1455ІЗ2ВІ 1541 ні
РІ С/РІ-Р'І С, без
РІ С/РІ-РГСАРГА, без , «| « | «
Ї РІ С/РІ-РГІ С, з
РІ С/РІ-РГСАРГ А, з
РІ С/РІ-РГСАРГА, без ! | « к к к
Ї РІ С/РІ-РГСАРГ А, з 5 - Не ВИЯВЛенО
Таблиця 14
Вміст фосфоліпідів у неочищеній ріпаковій олії до й після інкубації з фосфоліпазою С (РІ С), фосфотидилінозит-фосфоліпазою
С (РІ-РІ С) ї фосфоліпазою А1 (РІ АТ) за температури 55 С 11111111 1РАЇРСІРЕЇРІ|СумарнийвмістРІ| Д-рАв 11111111 мкмольМОбсголії | 95 (маса/ масам
Моментчасуб! 77171711 БеЯИВІзавІМОЮ 19997771
РІ-С/РІ-РІ-С, без попередньої обробки олії 20 РІС/РІ-РІСЯРІАТ,безпопередньої обробки олії 327 0170! хх! 0008971 в. РІ-С/РІ-РІ.С, з попередньою обробкою олії
РІС/РІ-РІСЯРІ АТ, з попередньою обробкою олії П191149142Ї хх Ї.282 ояюдо РІ.С/РІ-РІ СР АТ, без попередньої обробки олії
РІС/РІРІСЯРІАТ, зпопередньою обробкою олії |98|х|60|х| (158..юЮДЮДЮ | 044. - - Не ВИЯВЛЕНО
Приклад 6. Рафінація олії з використанням ферментного препарату Ригійпе? зо і фосфоліпази А1
Використовували два варіанти"С і 0) неочищеної соєвої олії, надані американськими підприємствами з переробки олійного насіння. Відважували 10 г олії в придатну ємність і нагрівали до температури 60 "С.
Готовий ферментний препарат Ригіїпе? Зо і білок РГАЇ1 з А. підег, отриманий, як описано вище в даному документі, одночасно або послідовно додавали разом з водою в олію. Суміш олії з ферментами перемішували за допомогою диспергатора ОГга Тиггах. У тому випадку, коли
Ригійпе?2 Зб і РІГАЇ додавали разом, попередню обробку олії не проводили. У випадку послідовного додавання ферментів спочатку вносили в олію Ригіїпе? 30 та інкубували 2 години,
після чого додавали лимонну кислоту до кінцевої концентрації 500 ррт і потім вносили РІ А1.
Ритіїіпе? 30 брали в кількості 0,013 одиниць активності фосфоліпази С на 1 г олії й 0,05 одиниць активності фосфатидилінозит-фосфоліпази С на 1 г олії (150-200 ррт); РІ А1 брали 0,28 мг або 0,56 мг активного білка на 1 кг олії. Кінцева концентрація води становила 3 95 (маса/маса).
Ферментативна реакція тривала 4 години при перемішуванні магнітною мішалкою зі швидкістю 800 об./хв. Через 2 і 4 години інкубації за температури 60 "С відбирали зразки й методом З'Р-ЯМР (див. вище) визначали в них вміст фосфоліпідів (РІ), а саме фосфатидної кислоти (РА), фосфатидилхоліну (РОС), фосфатидилетаноламіну (РЕ) і фосфатидилінозиту (РІ).
Також визначали дигліцериди (БАС) методом НРІ С, як це було описано вище.
Результати, представлені в Таблицях 15 і 16 показують, що при комбінації препарату
Ритіїіпе? 30 з фосфоліпазою АТ відбувається гідроліз більшої кількості фосфоліпідів, ніж при використання одного тільки Ригіїйпе? 30. У деяких випадках (наприклад, з неочищеною соєвою олією С) попередня обробка олії не потрібна для того, щоб комбінація препаратів Ригіїїпе? 3 і
РІАТ у достатньому ступені знижувала рівень фосфору. При використанні Ригійпе? зо разом з
РІАТ зменшувалося утворення дигліцеридів (САС), а саме їхня сумарна кількість була на 5- 15 95 меншою, ніж після інкубації олії з окремо узятим Ригійпе? За.
Таблиця 15
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії С до й після інкубації з ферментним препаратом Ритіїпе? ЗО і фосфоліпазою АТ за температури 60 "С без попередньої обробки олії. 11111111 1РАЇРСІРЕ|РІЇСумарнийвмістРІЇ дода 9 11111111 мкмольМОбсголії // б(маса/масау
Моментчасуб! 77777171 328ЙО6ИИО ро 2763..ГЦГ/ | 02 щі
Ройпеєза 77777171 ра 90566017 847 | 160 сю. |Рмпозеевот звисати бла тя; вв, «165110 ооятдо Б в вно вана мол БВ х 15150202 2565 20803100 5 5 655 - -
Ригіїйпе"зсУРІАТ (0,56 мгактивного білканаїкголіїй | «| «|«|-| 0 | 086 «- не виявлено
Таблиця 16
Вміст фосфоліпідів у неочищеній соєвій олії О до й після інкубації з ферментним препаратом Ригійпе? 32 і фосфоліпазою А1 (у кількості 0,28 мг активного білка на 1 кг олії у всіх досвідах) за температури 60 С 11111 есе одсерцаюда 00000000 яюниоогом еЯ
Моментчасуб 77777171 876Б7БОТВОВІ 1846 | ЗШ сел Рие ст дно вдання рою БИ 0.
Ригійпе? З х лимонна кислота (500 ррт) х РІ-АТ (послідовне додавання)р4574 217172| 609 | 0,52
ШУ поееооеовслосоннни вое: ішеанкся «- не виявлено
ВІДОМОСТІ, ЩОДО ДЕПОНОВАНОГО МІКРООРГАНІЗМУ АБО ІНШОГО БІОЛОГІЧНОГО
МАТЕРІАЛУ
(РСТ правило 13ЗбБі5)
А. Зазначені нижче відомості відносяться до депонованого мікроорганізму або іншого біологічного матеріалу, посилання на який є в описі на сторінці 9, рядок 30
В. ВІДОМОСТІ ПРО ДЕПОНУВАННЯ Відомості про інші депонування наведені на додатковому аркуші С)
Сентрал Бюро фур Шхімелкалчерс (СБШ)
Адреса установи депонування (включаючи поштовий індекс і назва країни)
Упсалалан 8 3584 Сіті Утрехт
Нідерланди
Серпня 1988 Св5513.88 нюн"ш"єнкеиИйиинНнНнНнТТТТТнннинншш
С. ДОДАТКОВІ ВІДОМОСТІ (пропустити, якщо не може бути застосовано) Продовження на наступному аркуші С н"""НІНОЛІТТТОТЛООООООООООВОВЛВТООВОВОВОВОВОВОВОВЛВЛВЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОЛВОВОВОВОВОВОТОИОТООНИ р. ЗАЗНАЧЕНІ ДЕРЖАВИ, ДЛЯ ЯКИХ НАВЕДЕНІ ВІДОМОСТІ (якщо вони не для всіх держав) нин нн""Н:ІІТООЮОЛООВВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛОЛВОЛТЛТЛИТОИТИТЛТОТИТИЬИТЬОИОООТН
Е. ОКРЕМЕ ПОДАННЯ ВІДОМОСТЕЙ (пропустити, якщо не може бути застосовано) загальний характер цих відомостей, наприклад, "Реєстраційний номер депонованого матеріалу") лення рення ТТ даний лет оперний месник (11111111 Уповноважевнаособа.д// || Уповноваженаособа.:/77/7/7/:/3//СЕ7
Форма РСТ/ВО/134 (липень 1998; перевидано січень 2004) 10 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «1105 О5М ІР Авзеїв В.М. «120» СПОСІБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕГУМУВАННЯ ОЛІЇ -130» 32910-МО-РСТ «1505 ЕР1І8171015.3 -1515 2018-05-07 -160» 4 -170» ВІЗ55АР 1.3.6 -2105 1 «2115 298 «212» Білок «213» АзрегоуйШив підетг «220» «223» Амінокислотна послідовність фосфоліпази А1 «4005 1
Меї Рне І єи Агу Аг Спи Рне Су Аїа Маї Аа Аа І еи 5ег Маї І єи 151015
Аа Ніз Аа Аа Рго Аїа Рго Аа Рго Меї Сіп Ага Агу Авр Пе 5ег 20 25 30 зег ТНг Маї! Геи Авр Авп Їе Авр Геи РНе Аа Сп Туг Зег Аа Аа
Аа Туг Су Зег Зег Авзп Пе Сім Зег ТНг Спу ТАг ТАг ГГ еи Тиг Сувз 60
Ар Маї Су Авп Суз Рго І єм Маї Сім Аа Аа Сіу Аа Тнг Тнг Пе
65 70 75 80
Азр Спи РНе Авр Ар 5ег 5ег 5ег Туг Сіу Авр Рго Тиг Спу Ре Пе 85 90 95
АІа Ма! А5р Рго Тнг Азп Си І и Пе Маї І єи бег Рне Аг Стпу 5ег 100 105 110 зЗег Авр І єи Зег Авп Тр Іе Аа Авр Гей Авр РНе Су І єи ТАг Зег 115 120 125 маї Зег 5ег Пе Суз Азр Сіу Суз Спи Меї Ні І уз СПУ Рпе Туг Си 130 135 140
Аа Тр Сіи Маї Пе Аа Авр ТНг Пе Тнг 5ег Гуз Ма! Спи Аа Аа 145150 155 160 ма! Зег 5ег Туг Рго Ар Туг ТНг І єи Маї Рне Тнг Спу Нів 5ег Туг 165 170 175
Сту Аа Айа І еи Айа Аїа Маї Аа Аа Тнг Ма! Гей Агу Азп Аа Спіу 180 185 190
Туг ТигГ еи Авр Г еи Туг Азп РНе Сту Сіп Рго Ага Пе Спіу Авп І єи 195 200 205
Аа Гей Аїа Ар Туг Пе Тиг Ар Сп Авп Меї Спу Зег Авп Туг Ага 210 215 220 маї Тнг Ніз Тнг Азр Азр Пе Маї Рго Гуз І єи Рго Рго Сім І єи Ї єи 225 230 235 240
Сіу Тут Ні Ні Ріє 5ег Рго Сім Туг Тгтр Пе ТАг Зег Спу Авп Ар 245250 255 маї Тнг Маї Тник Тнг Зег Авр Маї Тнг Спи Маї Маї Спу Маї Азр 5ег 260 265 270
Тиг Авіа Сіу Азп Авр Сту ТНг Гей ГГ еи Авр 5ег ТНиг ТНг Ага Ніз Аг 2752280 285
Тер Туг ТА Пе Ту Пе бег Спи Суз Бег 290 295
Зо -21052 «2115» 897 «2125» ДНК «213» А5регоуйШив підетг «220» «223» Нуклеотидна послідовність, яка кодує фосфоліпазу АТ (йепрапк: ХМ 001393495) «40052 адншсісс дсадддааїй! дддосщії дсадсссіаї сідідсіюддс ссадсіосі 60 сссдсассід сіссдадса дсдіададас аїсіссісіа ссаіснода сааїаїсдас 120 сісйсдссс аагасадідс адсадснас дсіссісса асаїісдадіс сассддсасо 180 асісідассії дсдасдіада саайодсссі сісдісдаду садссоддідс сасдассаїс 240 дащадшо асдасадсад садсіасддс дасссдасодад донсаїсдс сундассса 300 асдаасдаді їааїсонсі дісшсосдо ддсаднсосо ассісісдаа сіддайдсс 360 дассіадасі іІсддссісас аїссдіаадс адсаїстщід аддсиюютща дадсасааяд 420 доснсіаса аддссіддда адісайодсс дасассаїса саїссаадаї ддадассосс 480 дісіссадсі аїссоддасіа сасссісдід Нсассддас асадсіасдд сдсідсана 540 дсодсідісд сддссассаої дсіссдсаас дссддаїаса сіснодассі діасааснсе 600 ддссадсссс діайддсаа ссісдссна дссдасіаса Ісассдасса ааасададс 660 адсаасіасс дсдісасдса сассдаїдас аїсдідссіа адсідссісс ддадсідсід 720 дусіассасс асисадісс ддадіасіда аїсассадсду дсааюающі дасдаїдаса 780 асдісддасод іІсассдадаї сатдддадю дансдасод сідадааіцда сдасасасід 840 сідасацдіа сдасідссса ісддідаїас асдаїсіаса Надідаац сісдіад 897 «2105 З «2115 245 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Фосфоліпаза С згідно УУХО2005/086900 «4005 З
Тр Зег Аа Сіи Авр Гуз Нів Авп Спи Спу Пе Авп 5ег Нів ГГ еи Тр бо 151015
Пе Маї Авп Аг Аїа Іе Авр Пе Меї Зег Агу Авзп Тнг ТАг Пе Маї 20 25 30
Авп Рго Азп Сім ТНг Аа І ей ЇЇ еи Азп Ст Ттр Ага Аа Авр І еи Си 35 40 45
Азп сту Пе Туг Зег Аіа Ар Туг Сіи Авп Рго Туг Туг Азр Авр 5ег 50 55 60
Тиг Туг Авіа 5ег Ні РНе Туг Авр Рго Авр Тниг Спу Тиг ТАг Тут Пе 65 70 75 80
Рго РНе Аїа Гуз Ні Ага Гуз Спи Тнг Спу Аа Гуз Туг Рпе Авп ГГ еи 85 90 95
Аа Спу Сп Аа Туг Сіп Авп Сп Авр Меї Сп Сіп Аа Рне РНе Туг 100 105 110
Ї ви Спу І єм Зег Геи Нів Туг І еи Спу А5р Маї Авзп Сп Рго Меї Нів 115120 125
Аа Аа 5ег РНе ТНг Азвр І єи 5ег Туг Рго Меї Сіу РНе Ні 5ег Гуз 130 135 140
Туг ам Ап Рне Маї Ар Тнг Пе Гуз Авп Авп Туг Пе Маї Зег Азр 145150 155160 зЗег Авп Су Туг Тр Авп Тр Гуз Спу Аа Авп Рго Сім Авр Тгр Пе 165 170 175
Сім Спу Айа Аа Маї Аа Аа Гуз Сп Авр Туг Рго Су Маї МаїЇ А5п 180 185 190
Азр Тпиг ТАг Гуз Авр Ттр Ре Маї Гуз Аїа Аа Маї Зег Сип Спи Туг 195 200 205
Аа Азвр Гуз Тгр Агу Аїа Сім Маї ТАг Рго Маї Тнг Спу Гуз Ага Гей 210 215 220
Меї Сім Аїа Сіп Аго Маї ТАг Аїіа Стпу Туг Пе Нів І еи Ттр Рне Азр 225230 235 240
ТАг Туг Маї Ап Агу 245 «2105» 4 «2115 298 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Фосфатидилінозит-фосфоліпаза С згідно УХМО2011/046812 «400» 4
Меї Аїа 5ег 5ег Пе Авзп Маї І єи Спи Авп Тгр бег Агу Ттр Меї І ув 151015
Рго Пе Авп Авр Авр ПІе Рго І єи Аа Ага Іе Зег Пе Рго Сіу ТНг 20 25 30
Нів Авр бег Сіу Тнг РНе Гуз І єи Сіп Авп Рго Іе І уз Сіп Маї Тгтр 35 40 45
Сіу Меї Тнг Сип См Туг Авр Ріє Аго Туг Сп Меї Авр Ніз Су Аа 60
Ага Пе Ріє Азр Іе Аго Сіу Аго Гей ТНг Азр Ар Авп ТА Пе Маї 65 70 75 80
І еи Нів Нів Сту Рго І єи Туг І еи Туг Ма! ТНг ГГ еи Ні Спи РНе Пе 85 90 95 50 Азп Сти Аа Гуз Сп РНе Геи Гуз Авр Авп Рго 5ег Спи ТНг Пе Пе 100 105 110
Меї 5ег І єи Гуз І уз Спи Туг СІ Авр Меї І уз Спу Аа Спи бег 5ег 115120 125
Ре 5ег Зег ТНиг Рне Си Гуз Азп Туг Рпє Агу Авр Рго Іе РнНе І єи 55 130 135 140
Гуз Тиг Сім Стпу Авп Пе Гуз І еи СпПу Авр Аїйа Ага Су Гуз Пе Маї 145150 155160
Ї еи Г єи Гуз Агу Туг Зег Спу Зег Авп Спи Зег Сіу Спу Туг Ап Рпе 165 170 175 60 Рпе Туг Тр Рго Авр Авп Си ТНг Ре Тнг Зег Тнг Пе Авп Сіу Авп
180 185190 маї Авп Маї Тнг Маї Сіп Авр Гуз Туг Гуз Маї 5ег Гей Авр Спи Гуз 195 200 205
Пе Авп Аїа Іе Гуз Авр ТНг ГГ еи Авп Си ТАг Пе Авп Авп 5ег Си 210 215 220
Азр Маї Авп Ніз І єи Туг Пе Ап РНе ТНг зЗег ГГ еи Зег Зег Сіу Спу 225 230 235 240
ТАг Аа Тгр ТНг 5ег Рго Туг Туг Туг Аа бег Агу Пе Авзп Рго Сім 245 250 255
Пе Аа Авп Тут Пе Гуз Сп Гуз Авп Рго Тнг Ага Маї Сіу Тгр Пе 260 265 270
Пе Сп Ар РНе Іе Авп Си Гуз Тр Нів Рго Г єи Геи Туг Сп Спи 275 280 285 ма! Ме Авп Аїа Авп Гуз зе" Геи Маї Г ув
Claims (14)
1. Спосіб зменшення кількості інтактних фосфоліпідів у триацилгліцеридній олії, що включає інкубацію зазначеної олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази Аї і містить поліпептид, щонайменше на 80 95 ідентичний зрілій амінокислотній послідовності ФЕО ІО МО: 1.
2. Спосіб за п. 1, у якому зріла амінокислотна послідовність 5ЕО 10 МО: 1 включає амінокислотні залишки з 30-го по 298-й послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1.
3. Спосіб за п. 1 або 2, при якому кількість інтактних фосфоліпідів зменшується щонайменше на 8595 та у якому поліпептид здатний щонайменше на 85 95 зменшувати кількість інтактних фосфоліпідів, первинно присутніх у триацилгліцеридній олії, у результаті інкубації цієї олії з фосфоліпазою АТ, узятою в кількості 0,28 мг активного білка на 1 кг олії, за температури 55, 60, 65 і/або 70 "С протягом 4 годин.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, у якому фосфоліпіди включають фосфатидну кислоту, Зо фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозит і/або фосфатидилхолін.
5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який додатково включає етап додавання кислоти в олію.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який додатково включає етап додавання води в олію.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який додатково включає етап додавання залуговуючого агента в олію.
8. Спосіб за будь-яким з пп. 5-7, у якому етапи додавання кислоти, води й/або залуговуючого агента здійснюють до інкубації олії з фосфоліпазою.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який додатково включає інкубацію олії з поліпептидом, який має активність фосфоліпази С, з поліпептидом, який має активність фосфатидилінозит- фосфоліпази С, і/або з поліпептидом, який має активність фосфоліпази Аг.
10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який додатково включає виділення з олії компонентів, які містять фосфор.
11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, у якому олія є неочищеною або була рафінована шляхом гідратації.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, у якому олія є рослинною, тваринною, рибною або отриманою з водоростей.
13. Триацилгліцеридна олія, яка містить поліпептид, що має активність фосфоліпази А! і включає поліпептид, щонайменше на 80 95 ідентичний зрілій амінокислотній послідовності з«»ЕО ІО МО: 1.
14. Олія за п. 13, яка додатково містить поліпептид, який має активність фосфоліпази С, поліпептид, який має активність фосфатидилінозит-фосфоліпази С, і/або поліпептид, який має активність фосфоліпази Аг.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18171015 | 2018-05-07 | ||
| PCT/EP2019/061538 WO2019215078A1 (en) | 2018-05-07 | 2019-05-06 | Process for enzymatic oil degumming |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126992C2 true UA126992C2 (uk) | 2023-03-01 |
Family
ID=62235788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202007611A UA126992C2 (uk) | 2018-05-07 | 2019-05-06 | Спосіб ферментативного дегумування олії |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11999923B2 (uk) |
| EP (1) | EP3790946A1 (uk) |
| CN (1) | CN112424326A (uk) |
| AR (1) | AR114877A1 (uk) |
| BR (1) | BR112020022516A2 (uk) |
| CA (1) | CA3097285A1 (uk) |
| EA (1) | EA202092612A1 (uk) |
| UA (1) | UA126992C2 (uk) |
| WO (1) | WO2019215078A1 (uk) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114574281A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-06-03 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 一种浓香型风味油脂的酶法脱胶方法 |
| WO2023116569A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Novozymes A/S | Composition comprising a lipase and a booster |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| WO2024121058A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Novozymes A/S | A composition comprising a lipase and a peptide |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0575133T4 (da) | 1992-06-16 | 2008-10-20 | Sankyo Lifetech Company Ltd | Hidtil ukendt Phospholipase A1, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelsen deraf |
| ATE238425T1 (de) | 1993-07-23 | 2003-05-15 | Dsm Nv | Selektionmarker-genfreie rekombinante stämme: verfahren zur ihrer herstellung und die verwendung dieser stämme |
| DE19527274A1 (de) | 1995-07-26 | 1997-01-30 | Metallgesellschaft Ag | Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase |
| EP0948608A1 (en) * | 1996-10-31 | 1999-10-13 | Novo Nordisk A/S | Novel phospholipase, production and use thereof |
| WO1998046772A2 (en) | 1997-04-11 | 1998-10-22 | Dsm N.V. | Gene conversion as a tool for the construction of recombinant industrial filamentous fungi |
| ES2287989T3 (es) | 1997-12-22 | 2007-12-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Clonacion de expresion en hongos filamentosos. |
| AU3026399A (en) * | 1998-04-08 | 1999-11-01 | Novo Nordisk A/S | An enzymatic oil-degumming process |
| US7226771B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-05 | Diversa Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| CN1836033A (zh) | 2003-02-05 | 2006-09-20 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株生产多肽的用途 |
| US7968312B2 (en) * | 2004-06-16 | 2011-06-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Production of polypeptides by improved secretion |
| UA109884C2 (uk) | 2009-10-16 | 2015-10-26 | Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування | |
| DE102009051013A1 (de) | 2009-10-28 | 2011-06-09 | Ab Enzymes Gmbh | Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen |
| US8394618B2 (en) * | 2010-06-21 | 2013-03-12 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Lipase-containing polymeric coatings for the facilitated removal of fingerprints |
| US9121016B2 (en) * | 2011-09-09 | 2015-09-01 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| BR122020023911B1 (pt) | 2010-11-12 | 2022-02-15 | Novozymes A/S | Construto de ácido nucleico, célula microbiana hospedeira recombinante, e, método de produção do polipeptídeo |
| ES2676455T3 (es) | 2012-02-17 | 2018-07-19 | Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh | Procedimiento para la desmucilaginación enzimática de aceite |
| EP2664630B1 (en) * | 2012-05-15 | 2016-12-21 | Rohm and Haas Company | Enzymatic conversion of volatile organic compounds |
| CN105073985A (zh) * | 2013-03-21 | 2015-11-18 | 诺维信公司 | 具有磷脂酶a活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸 |
| AR104205A1 (es) | 2015-04-09 | 2017-07-05 | Dsm Ip Assets Bv | Fosfolipasa c |
-
2019
- 2019-05-06 EP EP19720909.1A patent/EP3790946A1/en active Pending
- 2019-05-06 CA CA3097285A patent/CA3097285A1/en active Pending
- 2019-05-06 UA UAA202007611A patent/UA126992C2/uk unknown
- 2019-05-06 WO PCT/EP2019/061538 patent/WO2019215078A1/en unknown
- 2019-05-06 BR BR112020022516-9A patent/BR112020022516A2/pt unknown
- 2019-05-06 EA EA202092612A patent/EA202092612A1/ru unknown
- 2019-05-06 US US17/052,907 patent/US11999923B2/en active Active
- 2019-05-06 CN CN201980030375.3A patent/CN112424326A/zh active Pending
- 2019-05-07 AR ARP190101208A patent/AR114877A1/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112020022516A2 (pt) | 2021-02-09 |
| US20210371770A1 (en) | 2021-12-02 |
| CA3097285A1 (en) | 2019-11-14 |
| EP3790946A1 (en) | 2021-03-17 |
| WO2019215078A1 (en) | 2019-11-14 |
| CN112424326A (zh) | 2021-02-26 |
| AR114877A1 (es) | 2020-10-28 |
| EA202092612A1 (ru) | 2021-02-17 |
| US11999923B2 (en) | 2024-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA126992C2 (uk) | Спосіб ферментативного дегумування олії | |
| CN102712671B (zh) | 磷脂酶、编码其的核酸以及制备和使用它们的方法 | |
| EP0191217B1 (en) | Process for producing glycerides in the presence of lipases | |
| CA2837215C (en) | Algal lipid compositions and methods of preparing and utilizing the same | |
| US6337414B1 (en) | Process for producing partial glyceride | |
| ES2459217T3 (es) | Producción enzimática de productos de lecitina hidrolizados | |
| EA020035B1 (ru) | Способы | |
| CN106460018A (zh) | 采用碱处理进行脂肪酸烷基酯生产 | |
| JP2706778B2 (ja) | 油脂の改質法 | |
| US11685939B2 (en) | Method for producing cis-unsaturated fatty acid by recombinant Candida rugosa lipase 1 (rCRL1) | |
| US10982171B2 (en) | Methods for oil degumming | |
| JPH0730352B2 (ja) | 酵素による油脂の精製法 | |
| US20090104672A1 (en) | Novel Microbe, Lipid Modifying Agent, Process for Producing 2-Acyl-Lysophospholipid, Process for Producing Diacylglycerol, Process for Producing Ceramide, and Method of Degumming Oil or Fat | |
| JP2014027908A (ja) | バイオディーゼル燃料の製造方法 | |
| Haas et al. | Biochemical and molecular biological characterization of a lipase produced by the fungus Rhizopus delemar | |
| JP4266644B2 (ja) | ホスファチジルセリンの製造方法 | |
| CN110951621B (zh) | 一种产磷脂酶的黑曲霉菌株 | |
| JPS639835B2 (uk) | ||
| CA3241854A1 (en) | Process for enzymatic oil degumming involving phospholipase a2 | |
| JPS6314695A (ja) | γ―リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法 | |
| JPH0216989A (ja) | ω６系不飽和脂胞酸含有リン脂質の製造法 | |
| JPS5867183A (ja) | ホスホリパ−ゼｄの製造方法 | |
| King et al. | The Effect of Clostridium Histolyticum on the Tyrosine in Proteins | |
| JPH01187089A (ja) | パルミトレイン酸及びそのグリセライドの製造方法 | |
| CA2036128A1 (en) | Fatty acid-specific lipase |