JP7334898B2 - 花粉への物質導入方法 - Google Patents
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Description
<1> 花粉に物質を導入する方法であって、
パーティクルボンバードメント法により、物質で被覆した微粒子を支持体に載せた花粉に撃ち込む工程を含み、かつ
前記支持体が、親水性ポリテトラフルオロエチレン及び親水性混合セルロースエステルのうちの少なくとも1の高分子を含む支持体である、方法。
<2> 前記物質が、ヌクレオチド及び/又はペプチドである、<1>に記載の方法。
<3> 前記微粒子が金属微粒子である、<1>又は<2>に記載の方法。
<4> 親水性ポリテトラフルオロエチレン及び親水性混合セルロースエステルのうちの少なくとも1の高分子を含む、パーティクルボンバードメント用花粉支持材。
<5> <4>に記載のパーティクルボンバードメント用花粉支持材を備える、パーティクルボンバードメント用装置。
パーティクルボンバードメント法による花粉への物質導入において、適した花粉支持体を見出すべく、プラスミドDNAを金の微粒子表面に被覆して、各種支持体に載せたベンサミアナタバコの花粉に撃ち込んだ。そして、プラスミドDNAが導入され、生存していた花粉数を計測した。具体的には以下のようにして行なった。
花粉に導入するプラスミドDNAは、シロイヌナズナUBQ10(ポリユビキチン10;AT4G05320)遺伝子プロモーター下流にsGFP遺伝子をつないだ配列(AtUBQ10p::sGFP)を、ベンサミアナタバコ用のバイナリーベクター(Addgene社製、pGreen0029)に挿入し、調製した。当該プラスミドDNAが導入された花粉の細胞質(花粉及び花粉管)にて蛍光タンパク質(GFP)が発現することになるので、これを指標として、プラスミドDNA導入花粉を判別することができる。
0.6μm径の金粒子(BIO-RAD社、#165-2262)を100%エタノールで洗浄し、滅菌水で懸濁して30mg/mL金粒子含有水を調製した。後記のDNA被覆金粒子含有エタノールを1回の撃ち込みにつき10μL使用することとし、当該エタノール中のプラスミドDNAが1回の撃ち込みにつき500ngになるよう混合して加え、撹拌した。この金粒子及びプラスミドDNAの混合液に対し、4μLの0.1Mスペルミジンと10μLの2.5M塩化カルシウムとを撹拌しながら加え、スピンダウンによりプラスミドDNAがコーティングされた金粒子を沈殿させた。その後、上清を除き、20μLの70%エタノールで洗浄したのち、10μLの100%エタノールで再懸濁し、DNA被覆金粒子含有エタノールを調製した。
パーティクルボンバードメントによる導入に用いるマクロキャリア1枚につき、前記DNA被覆金粒子含有エタノールを10μL使用した。当該エタノールをマクロキャリア上に滴下し、風乾した後に、導入装置(PDS-1000/He、BIO-RAD社、#165-2257 J1)本体の最上段、すなわちラプチャーディスクからの距離が3cmの位置となるようマクロキャリアを配置した。生育しているベンサミアナタバコの花から花粉(葯3個分)を採取し、各種支持体上に花粉を散布し、マクロキャリアからの距離が3cm又は6cmの位置に配置した。
花粉管伸長培地の組成:0.01w/v% ホウ酸、1mM 塩化カルシウム、1mM 硝酸カルシウム、1mM 硫酸マグネシウム、10w/v% スクロース(水酸化カリウムにてpH6.5に調整)(Hao Wang & Liwen Jiang、Nature protocols、2011年、6巻、419~426ページ 参照のほど)。
実施例1にて花粉(細胞質)への導入数が一番良かった親水性PTFEを用い、花粉内の雄原細胞に対しても効率良く物質を導入できるかにつき、上記AtUBQ10p::sGFPを有するプラスミドDNAの代わりに、花粉の核を標識可能な下記35Sp::H2B-tdTomatoを有するプラスミドDNAを用いた。
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター下流に、シロイヌナズナヒストンH2B(AT1G07790)由来の核移行シグナル及びtdTomatoからなる融合タンパク質をコードする遺伝子をつないだ配列(35Sp::H2B-tdTomato)を、SpUCベクターに挿入し、花粉に導入するプラスミドDNAを調製した。当該プラスミドDNAが導入された花粉の核(雄原細胞の核を含む)にて蛍光タンパク質(tdTomato)が発現することになる。
Claims (1)
- 花粉に物質を導入する方法であって、
パーティクルボンバードメント法により、物質で被覆した微粒子を支持体に載せた花粉に撃ち込む工程を含み、
前記支持体が、親水性ポリテトラフルオロエチレン及び親水性混合セルロースエステルのうちの少なくとも1の高分子を含む支持体であり、
前記物質が、ヌクレオチド及び/又はペプチドであり、かつ
前記微粒子が金属微粒子である、方法。
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Non-Patent Citations (2)
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Nature Communications,2016年,Vol.7:12617,pp.1-8 |
日本植物学会第82回大会研究発表記録,2018年,pp.256, PL-069 |
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