UA122558C2 - Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання - Google Patents

Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання Download PDF

Info

Publication number
UA122558C2
UA122558C2 UAA201307747A UAA201307747A UA122558C2 UA 122558 C2 UA122558 C2 UA 122558C2 UA A201307747 A UAA201307747 A UA A201307747A UA A201307747 A UAA201307747 A UA A201307747A UA 122558 C2 UA122558 C2 UA 122558C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
herbicide
plant
polynucleotide
event
dna
Prior art date
Application number
UAA201307747A
Other languages
English (en)
Inventor
Давід Джордж Чарне
Давид Джордж Чарне
Венпін Чен
Венпин Чен
Чадвік Брюс Кошелні
Чадвик Брюс Кошелни
Джейантилал Девабай Пател
Джэйантилал Девабай Пател
Фердінанд Джерард Тунен
Фердинанд Джерард Тунен
Ломас Тулсирам
Янпин Чан
Жонсен Лі
Жонсен Ли
Original Assignee
Піонер Хай-Бред Інтернешнл, Інк.
Пионер Хай-Бред Интернешнл, Инк.
Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані
Э. И. Дю Пон Де Немур Энд Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Піонер Хай-Бред Інтернешнл, Інк., Пионер Хай-Бред Интернешнл, Инк., Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані, Э. И. Дю Пон Де Немур Энд Компани filed Critical Піонер Хай-Бред Інтернешнл, Інк.
Publication of UA122558C2 publication Critical patent/UA122558C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91051—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується рослини Brassica, стійкої до гліфосату, що містить у своєму геномі полінуклеотид, що включає SEQ ID NO: 12, полінуклеотид, що кодує гліфосат-N-ацетилтрансферазу, і полінуклеотид, що містить SEQ ID NO: 13. Винахід також стосується трансгенного насіння, що містить вказані полінуклеотиди; рослинного матеріалу; виділеного полінуклеотиду, що містить SEQ ID NOs: 12 та 13; набору для детектування ДНК; способу ідентифікації події DP-073496-4 у біологічному зразку.

Description

(54) РОСЛИНА ВВАЗЗ5БІСА, ЯКА Є СТІЙКОЮ ДО ГЛІФОСАТУ, ТА СПОСІБ ЇЇ ОДЕРЖАННЯ (57) Реферат:
Винахід стосується рослини Вгазвіса, стійкої до гліфосату, що містить у своєму геномі полінуклеотид, що включає 5БЕО 10 МО: 312, полінуклеотид, що кодує гліфосат-М- ацетилтрансферазу, і полінуклеотид, що містить 5ЕО ІЮ МО: 13. Винахід також стосується трансгенного насіння, що містить вказані полінуклеотиди; рослинного матеріалу; виділеного полінуклеотиду, що містить 5ЕО ІЮ МО5: 12 та 13; набору для детектування ДНК; способу ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічному зразку.
Посилання на список послідовностей, поданий у вигляді текстового файлу за допомогою
ЕЕ5З-ЖЕВ
Офіційна копія списку послідовностей подана одночасно зі специфікацією у вигляді текстового файлу за допомогою ЕЕ5-Уер, відповідно до Атегісап зіападага Соде ог Іптогтайоп
ІпТегспапде (АЗСІЇ), під іменем файлу 3990805едії5і їх з датою створення 24 листопада 2010 р. і з розміром 40 Кбайт. Список послідовностей, поданий за допомогою ЕЕ5-Уер, є частиною специфікації й включений сюди повністю в якості посилання.
Ділянку техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до ділянки молекулярної біології. Конкретніше, даний винахід відноситься до експресії послідовності, яка забезпечує стійкість до гліфосату.
Рівень техніки, що передує винаходу
Експресія чужорідних генів у рослинах, як відомо, залежить від їхньої локалізації в геномі рослини, можливо, через структуру хроматину (наприклад, гетерохроматину) або від близькості розташування елементів регуляції транскрипції (наприклад, енхансерів) до ділянки інтеграції (МУ/еїзіпа, єї а!., (1988) Апп. Рем. Сепеї 22:421-477). У той же час, присутність трансгена в різних ділянках генома в цілому різними способамі впливає на фенотип рослини. Із цієї причини часто є необхідним здійснювати скринінг великої кількості подій для ідентифікації одного з них, що характеризується оптимальною експресією введеного гена інтересуючого. Наприклад, У рослинах і інших організмах спостерігалося, що може мати місце більша варіація рівня експресії введеного гена серед різних подій уведення. Можуть мати місце відмінності в просторових і тимчасових профілях експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різних рослинних тканинах, які можуть не відповідати профілям експресії, очікуваним у результаті дії елементів регуляції транскрипції, присутніх в уведеній генній конструкції. Також спостерігалося, що вставка трансгена може впливати на експресію ендогенних генів. Із цієї причини звичайною практикою є створення сотень або тисяч різних подій і скринінг даних подій для пошуку єдиної події з необхідним рівнем і профілем експресії трансгена для комерційних цілей. Подія, яка характеризується необхідним рівнем або профілем експресії трансгена, може використовуватися для інтрогресії трансгена в інші варіанти генетичного середовища шляхом ауткроссінга з використанням загальноприйнятих способів селекції. Потомство таких гібридів
Зо зберігає характеристики експресії трансгена, що були у вихідного трансформанта. Дану стратегію застосовують, щоб гарантувати надійну генну експресію в декількох сортах, добре пристосованих до місцевих умов росту.
Кращої є можливість детектувати присутність конкретної події для визначення того, чи буде потомство схрещування містити інтересуючий трансген. Крім того, спосіб детектування конкретної події може сприяти доданню відповідності з вимогамі регуляції для передпродажного дозволу й маркування їжі, отриманої з рекомбінантних культурних рослин, або для застосування в моніторингу навколишнього середовища, моніторингу сортів культур в ділянки моніторингу продуктів, що відбуваються із урожаю культури, а також для застосування при забезпеченні відповідності партій продукції, піддаваних регуляторним або контрактним умовам.
У комерційному виробництві культур потрібно легко й швидко вилучити небажані рослини (тобто, «бур'яни») з поля культурних рослин. Ідеальною обробкою буде та, яка може використовуватися на цілому полі, але знищить тільки небажані рослини, залишивши культурні рослини неушкодженими. Одна така система обробки використовує культурні рослини, стійкі до гербіциду, так що, коли гербіцид розпорошують на поле стійких до гербіциду культурних рослин, вони продовжують активно рости, тоді як не стійкі до гербіциду бур'яни знищуються або значно ушкоджуються.
Внаслідок місцевих і регіональних відмінностей у домінуючих видах бур'янів, а також у кращих видах культурних рослин, існує постійна необхідність у системах захисту культур і керування бур'янамі, які можуть адаптуватися до потреб конкретного регіону, конкретної географії й/або місцевості. Потрібен спосіб і композиції, що забезпечують швидку ідентифікацію подій у рослинах, що приводять до появи таких якостей. Наприклад, існує постійна необхідність у способах захисту культур і керування бур'янамі, здатних знижувати число обробок гербіцидом, необхідних для контролю бур'янів у полі, знижувати кількість гербіциду, необхідного для контролю бур'янів у полі, знижувати кількість оранок, необхідних для виробництва культури й/"або сповільнювати або запобігати розвитку й/або появи стійких до гербіциду бур'янів. Існує постійна необхідність у способах захисту культур і керування бур'янамі, що забезпечують спрямоване застосування конкретного гербіциду й ефективне детектування такої події.
Коротка сутність винаходу
Надані композиції й способи, що відносяться до трансгенних, стійких до гліфосату рослинам 60 Вгаззіса. Конкретніше, даний винахід відноситься до рослин Вгаззіса, що містять трансген, що забезпечує стійкість до гліфосату. Подія може являти собою, наприклад, ОР-073496-4. Рослина
Вгаззіса, що несе трансген у зазначеній хромосомній локалізації, містить унікальні точки сполучення генома/грансгена, що характеризуються, щонайменше, послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 2, або, щонайменше, послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 12 і/або 13. Крім того, надані насіння, що зберігаються у вигляді патентного депозиту під номером РТА- хі рослини, рослинні клітини, продукти насінь і рослин, що відбуваються з них. Дослідження ділянки геномної вставки
ОР-073496-4 або будь-якої іншої події, що включає інтеграцію трансгена стійкості до гліфосату, надає підвищену ефективність селекції й забезпечує застосування молекулярних маркерів для відстеження вставки трансгена в підлягаючих селекції популяціях і їх потомстві. Надані різні способи й композиції для ідентифікації, детектування й застосування події трансформації гліфосат-п-ацетилтрансферазою («САТ» або «діуаї») в Вгазвіса.
Короткий опис креслень
На фігурі 1 показаний синтез плазміди РНР28181. Плазміду РНР28181 застосовували для продукції ліній Вгаззіса САТ.
На фігурі 2 представлена схематична карта плазміди РНР28181.
На фігурі З представлена схематична карта вставки ДНК, фрагмента РНР281814А.
На фігурі 4 показана схематична представлення фрагмента А з РНР28181 (РНР28181А), більш конкретно, схематична карта фрагмента Ніпа ПИМої І (РНР28181А), що містить касету, гена даї4621, який використовували для трансформації з одержанням Вгаззіса ОР-073496-4.
Розмір фрагмента становить 2112 п.о. Розташування специфічних відносно конструкції праймерів 09-0-3290/09-0-3288 зазначене на карті.
Фігура 5.Саузерн-аналіз продуктів специфічної відносно конструкції ПЛР ДНК листів від
Вгаззіса ОР-073496-4 і не модифікованої генетично контрольної Вгаззіса. Ампліфікації ПЛР із набором праймерів 09-0-3290/09-0-3288, спрямованих на унікальний промотор убіквітину й ділянка сполучення даї4621, присутні в каноле ОР-073496-4. Очікуваний розмір амплікона ПЛР становить 675 п.о.
Фігура 6.Саузерн-аналіз продуктів ПЛР гена РагА Вгаззіса на ДНК листів з Вгаззіса ОрР- 073496-4 і не модифікованої генетично контрольної Вгаззіса. Ампліфікація ПЛР ендогенного гена РафА Вгабзіса з набором праймерів 09-0-2812/09-02813 у якості позитивного контролю
Зо ампліфікації ПЛР. Очікуваний розмір амплікона ПЛР становить 506 п.о.
Докладний опис винаходу
Даний винахід буде тепер описаний більш докладно тут і далі з посиланням на супровідні креслення, на яких показані деякі, але не всі варіанти здійснення винаходу. Більше того, даний винахід може здійснюватися в багатьох різних видах, і мається на увазі, що він не обмежений наведеними тут варіантамі здійснення; скоріше дані варіанти здійснення надані для того, щоб опис задовольняв застосовним юридичним вимогам. У межах документа подібні номери відносяться до подібних елементів.
Багато модифікацій і інші варіанти здійснення винаходу, наведені в даному документі, можуть бути зрозумілі фахівцеві в ділянки, до якої відноситься даний винахід, як і переваги ідей, представлених у наступних описах і асоційованих з ними кресленнях. Тому слід розуміти, що винахід не обмежений конкретними описаними варіантамі здійснення, і що модифікації й інші варіанти здійснення, як мається на увазі, включені в обсяг прикладеної формули винаходу.
Хоча в даному документі й використовуються конкретні терміни, вони застосовуються лише в загальному й описовому змісті, а не для цілей обмеження.
Надані композиції й способи, що відносяться до трансгенних, стійких до гліфосату рослинам
Вгаззіса. Конкретно, даний винахід відноситься до рослин Вгаб5зіса подією, що характеризується, ОР-073496-4 або іншою подією, що містять РНР28181А або його функціональний фрагмент або варіант. Рослина Вгаззіса, що містить подію ЮР-073496-4, наприклад, модифікована шляхом вставки гена гліфосатуцетилтрансферази (діуаї4621), що відбувається від Васійи5 Ііспепітогтіє. Ген діуа(4621 може функціонально поліпшуватися в процесі тасування генів для оптимізації кінетики активності гліфосатуцетилтрансферази (С МАТ) по ацетилуванню гербіциду гліфосату. Вставка гена діуа(4621 у рослину забезпечує стійкість до активного інгредієнта гербіциду гліфосату за допомогою перетворення гліфосату в нетоксичну ацетилювану форму. Таким чином, рослина Вгаззіса, що характеризується подією
ОР-073496-4, стійко до гліфосату.
Полінуклеотиди, що забезпечують стійкість до гліфосату, вбудовують у конкретне положення в геномі Вгаззіса, і за рахунок цього відбувається, наприклад, подія ОР-073496-4.
Рослина Вгаззіса, що несе подію ОР-073496-4 у конкретній локалізації в хромосомі, містить ділянки сполучення геном/транген, що мають унікальну полінуклеотидну послідовність, 60 прикладамі якої служить 5ЕО ІЮ МО: 2, або, щонайменше, полінуклеотидну послідовність ЗЕО
ІО МО: 12 і/або 13; 5ЕО ІО МО: 14 і/або 15; або 5ЕО ІЮ МО: 16 і/або 17. Дослідження ділянки геномної вставки будь-якої події надає підвищену ефективність селекції й забезпечує застосування молекулярних маркерів для відстеження вставки трансгена в підлягаючих селекції популяціях і їх потомстві У даному документі надані різні способи й композиції для ідентифікації, детектування й застосування події Вгаззіса ОР-073496-4. В одному з варіантів здійснення надана рослина Вгаззіса, що містить у своєму геномі наступний порядок: полінуклеотид , що містить 5БЕО ІО МО: 12, полінуклеотид , що кодує гліфосат-п- ацетилтрансферазу, і полінуклеотид , що містить ЗЕО ІЮ МО: 13. Термін «специфічний відносно події ОР-073496-4» відноситься до полінуклеотидної послідовності, яка є підходящою для ідентифікації, що дискримінує, події ОР-073496-4 у рослинах, рослинному матеріалі або в продуктах, у якості необмежуючих прикладів, що представляють собою масло, зроблене з насінь, або харчові або кормові продукти (свіжі або оброблені), що містять рослинний матеріал або, що відбуваються з нього.
Композиції далі включають насіння, що зберігаються у вигляді патентного депозиту під номером РТА- , рослини, рослинні клітини й насіння, що відбуваються з них. Справжній (- ї) заявник(-и) здійснив(-или) депонування щонайменше 2500 насінь Вгазбвіса з подією Ор- 073496-4 в Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп (АТСС), Мапазза5, МА 20110-2209 О5А, 24 листопада 2010 року, і депозит буде зберігатися згідно з положеннями Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Депонування здійснювали винятково для зручності фахівців у даній ділянки, і це не допускає того, що потрібне депонування згідно 35 О.5.С. 5112. Насіння, депоновані в АТСС, узяті з депозиту, який підтримується Ріопеег Ні-Вгей Іпіегпаїйопаї, Іпс., 7250 ММУ 6274 Амепив,
Чоппвіоп, Іоула 50131-1000. Доступ до даного депозиту можливий під час розгляду заявки по запиту для Комісара по патентах і торговельним маркам і для осіб, призначених для цього
Комісаром. Згідно з дозволом кожного з пунктів формули винаходу даної заявки, заявник(-и) зробить(-лять) доступним громадськості зразок(-и) з депозиту відповідно до 37 С.БЕ.К. 51808.
Депозит насінь, що містять подію Вгаззіса ОР-073496-4, буде зберігатися в депозиторії АТСС, який є суспільним, протягом періоду 30 років або протягом 5 років після останнього запиту або протягом законної дії патенту, якщо воно протриває довше, і буде замінений протягом цього
Зо періоду, якщо стане нежиттєздатним. Додатково, заявник(-и) задовольнить(-ять) усі вимоги 37
С.Б.К. 551801-1809, включаючи надання ознак життєздатності зразка після депонування.
Заявник(-и) не має(-ють) повноважень для відмови від яких-небудь обмежень, що накладають законом на переміщення біологічного матеріалу або його комерційне транспортування.
Заявник(-и) не відмовляється(-ються) від своїх прав, отриманих по даному патенту, або прав, відповідних до події ОР-073496-4, у випадку їх порушення, згідно із Законом про охорону сорту рослин (7 Ш5С 52321, еї зед.). Неавторізоване розмноження насінь заборонене. Застосування насінь може регулюватися.
Застосовуваний у даному документі термін «Вгаззіса» означає будь-яку рослину Вгаззіса і включає будь-які різновиди рослин, які можуть бути вирощені з Вгаззіса. Застосовуваний у даному документі термін «рослина» включає рослинні клітини, рослинні органі, рослинні протопласти, тканеві культури рослинних клітин, з яких можуть регенеруватися рослини, рослинні калуси, кущі рослин і рослинні клітини, які в інтактному виді перебувають у рослинах, або частини рослини, такі як зародки, пілок, семязачатки, насіння, листи, квіти, гілок, плід, стебла, коріння, кореневі кінчики, пільовики, і т.п. Зроблені зрілі насіння можна використовувати в їжу, на корм, для палива або для інших комерційних або промислових цілей, або для цілей вирощування й репродукції виду. Потомство, варіанти й мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг винаходу, при забезпеченні того, що ці частини містять подію ОР-073496-4.
Трансгенна «подія» продукується шляхом трансформації рослинних клітин гетерологічною(- ими) конструкцією(-ями) ДНК, що включає(-ними) експресуючу касету нуклеїнової кислоти, що містить інтересуючого трансген, регенерації популяції рослин із клітин, кожна з яких містить вбудований трансген, і селекції конкретної рослини, що характеризується вставкою в конкретній локалізації генома. Подія характеризується фенотиповою експресією трансгенас-ів). На генетичному рівні подія являє собою частину генетичної будови рослини. Термін «подія» також відноситься до потомства, продукуваному шляхом схрещування між трансформантом і іншим різновидом, який містить гетерологічну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентним батьком, вбудована ДНК і фланкуюча ДНК із трансформованого батька присутні в потомстві схрещування в тій же хромосомній локалізації. Термін «подія» також відноситься до
ДНК із вихідного трансформанта, що містить вбудовану ДНК і фланкуючу послідовність, що безпосередньо прилягає до вбудованої ДНК , яка, як очікується, переноситься потомству як бо результат схрещування однієї батьківської лінії яка включає вбудовану ДНК (наприклад,
вихідного трансформанта й потомства, що відбувається від самозапилення), і батьківської лінії, яка не містить вбудовану ДНК.
Застосовувана в даному документі «вставка ДНК » відноситься до гетерологічної ДНК в експресуючей касеті, застосовуваної для трансформації рослинного матеріалу, тоді як «фланкуюча ДНК » може включати або геномну ДНК , що присутствующую в природі в організмі, наприклад, рослинну, або чужорідну (гетерологічну) ДНК , уведену в процесі трансформації, зовнішньому стосовно вихідної вставки молекули ДНК , наприклад, фрагментамі, асоційованими з подією трансформації. «Фланкуюча ділянку» або «фланкуюча послідовність», як даний термін застосовують у даному документі, відноситься до послідовності із щонайменше 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 або 5000 пара основ або більш, яка розташовується безпосередньо вище й суміжно з вихідною чужорідною вбудованою молекулою ДНК , або безпосередньо нижче й суміжно з нею. Необмежуючі приклади фланкуючих ділянок події ОР-073496-4 включають полінуклеотидні послідовності, які наведені в
ЗЕО ІЮ МО: 2, 8 і/або 9, і їх варіанти й фрагменти.
Процедури трансформації, що приводять до випадкової інтеграції чужорідної ДНК , приводять до утвору трансформантів фланкуючі ділянки, що містять різні, характерні й унікальні для кожного трансформанта. Коли рекомбінантну ДНК уводять у рослину шляхом традиційного схрещування, її фланкуючі ділянки, в основному, не змінюються. Трансформанти також можуть містити унікальні ділянки сполучення між фрагментом гетерологічної вставки ДНК їі геномної
ДНК або двома фрагментамі геномної ДНК або двома фрагментамі гетерологічної ДНК . «Ділянка сполучення» є точкою, де з'єднуються два специфічні фрагменти ДНК . Наприклад, ділянка сполучення існує там, де вставка ДНК з'єднується із фланкуючими ДНК . Точка сполучення також існує в трансформованому організмі, де два фрагменти ДНК з'єднані разом, так що відбувається модифікація в порівнянні з нативним організм. Застосовуваний у даному документі термін «ДНК сполучення» відноситься до ДНК , яка містить ділянку сполучення.
Необмежуючі приклади ДНК сполучення з події ОР-073496-4 наведені в 5ЕО ІЮО МО: 2, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 і/або 19 або в їхніх варіантах і фрагментах.
Рослина ОРО73496-4 може вирощуватися шляхом першого полового схрещування першої батьківської рослини Вгаззіса, вирощеного від трансгенної рослини Вгаззіса ОР-073496-4 (або
Зо його потомства, що відбувається від трансформації експресуючими касетамі - варіантамі здійснення даного винаходу, які забезпечують стійкість до гербіциду) і другої батьківської рослини Вгаззіса, яке не має фенотип стійкості до гербіциду, з одержанням за рахунок цієї безлічі рослин потомства першого покоління, а потім добору рослини потомства першого покоління, яке характеризується необхідною стійкістю до гербіциду, і самозапилення рослини потомства першого покоління, з одержанням за рахунок цієї безлічі рослин потомства другого покоління, а потім добору з рослин потомства другого покоління тих, які характеризуються необхідною стійкістю до гербіциду. Ці стадії можуть, крім того, включати зворотне схрещування потомства першого покоління, стійкого до гербіциду, або потомства другого покоління, стійкого до гербіциду, із другою батьківською рослиною Вгавзвзіса або із третьою батьківською рослиною
Вгаззіса, з одержанням за рахунок цієї рослини Вгаззіса, яке характеризується необхідною стійкістю до гербіциду. Далі мається на увазі, що аналіз потомства на фенотип не потрібно. Різні способи й композиції, описані тут і далі в даному документі, можна використовувати для детектування й/або ідентифікації ОРО7 3496-4 або іншої події.
Два різні трансгенних рослини можуть також зазнати полового схрещуванню для одержання потомства, яке містить два, що незалежно розщеплюють екзогенних гена. Самозапилення придатного потомства може продукувати рослини, гомозиготні по обом екзогенним генам. Також розглядається зворотне схрещування з батьківською рослиною й зовнішнє схрещування з нетрансгенною рослиною, як і вегетативне розмноження. Опису інших способів селекції, які широко застосовуються для різних ознак і культур, можна знайти в одній з декількох посилань, наприклад, Ренйг, іп Вгеєдіпу Меїнодз їог Сийімаг ОемеІортепі, Муйсов, єд., Атегісап Босієїу ої
Адгопоту, Мадізоп М/і5. (1987).
Термін «зародкова плазма» відноситься до будь-якого індивідуума, групи індивідуумів або до клону, що представляє генотип, різновид, вид або культуру або їх генетичний матеріал. «Лінія» або «сорт» являє собою групу індивідуумів ідентичного походження, які, в основному, інбредни певною мірою і які, загалом, ізогенні або близькі до ізогенності.
Інбредні лінії мають тенденцію до високого ступеня гомогенності, гомозиготності й відтворюваності. Багатьма аналітичними способамі можна визначити гомозиготність і фенотипову стабільність інбредних ліній.
Фраза «гібридні рослини» відноситься до рослин, які є результатом схрещування між бо генетично різними індивідуумамі.
Термін «, що схрещується» або «схрещування» у контексті даного винаходу означає злиття гамет, наприклад, шляхом запилення для одержання потомства (тобто, клітин, насінь або рослин) у випадку рослин. Термін охоплює як полове схрещування (запилення одного рослини іншим), так і самозапилення, у випадку рослин ( тобто, коли пілок і семязачаток походять від того самого рослини).
Термін «інтрогресія» відноситься до переносу необхідного алеля генетичного локусу від одного генетичного середовища в іншу. В одному зі способів необхідні алели можуть інтрогресувати шляхом полового схрещування між двома родителями, де щонайменше один з батьків містить необхідний алель у своєму геномі.
У деяких варіантах здійснення полінуклеотиди, що несуть подію Вгаззіса ОР-073496-4 по винаходу, конструюють у молекулярну батарею. В інших варіантах здійснення молекулярна батарея додатково містить щонайменше один додатковий полінуклеотид , які забезпечує стійкість до другого гербіциду. В одному з варіантів здійснення послідовність забезпечує стійкість до глуфосинату, і в конкретному варіанті здійснення послідовність містить ген раї. В іншому варіанті здійснення додатковий полінуклеотид надає стійкість до гербіцидів-інгібіторам
А 5.
В інших варіантах здійснення подія за винаходом містить один або кілька інтересуючих ознак, і в більш конкретних варіантах здійснення рослину постачають якою-небудь поєднанням інтересуючих полінуклеотидних послідовностей для створення рослин з необхідною поєднанням ознак. Ознака, як цей термін застосовують у даному документі, відноситься до фенотипу, що відбувається від конкретної послідовності або групи послідовностей. Наприклад, полінуклеотиди стійкості до гербіциду можуть бути з'єднані з будь-якими іншими полінуклеотидамі, що кодують поліпептиди з активністю пестицидів і/або інсектицидів, такі як токсичні білки Васійи5 Шигіпдієпвіз (описані в патентах США МоМо 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; Сівівег, єї а!., (1986) Сепе 48:109; І еє, еї аї., (2003) Аррі. Епмігоп. Містобіо|. 69:4648-4657 (МірЗА); СаїйКу, єї аї., (2001) Асіа Сгувіаійодг. 0. Віої. Стузіаійодг. 57:1101-1109 (СтуЗВЬїт) ії Нептап, еї аї., (2004) 9. Адгіс. Боод Спет. 52:2726-2734 (СтуїЕ)), лектини (Мап
Оаттве, евї аї., (1994) Ріапі Мої. Віої. 24:825), пентин (описаний у патенті США Мо 5981722), і т.п.
Утворені поєднанням можуть також включати множинні копії якого-небудь одного інтересуючого полінуклеотида.
У деяких варіантах здійснення події за винаходом може бути об'єднане з іншими ознакамі стійкості до гербіциду для створення трансгенні рослини за винаходом із ще більш поліпшеними властивостями. Інші полінуклеотиди стійкості до гербіциду, які можуть використовуватися в таких варіантах здійснення, включають ті, які забезпечують стійкість до гліфосату іншими механізмамі дії, такі як, наприклад, ген, що кодує фермент гліфосатоксидоредуктазу, як описано більш докладно в патентах США МоМо 5776760 і 5463175. Інші ознаки, які можуть сполучатися з подією по винаходу, включають ознаки, що відбуваються від полінуклеотидів, які надають рослині здатність продукуватися більш високий рівень 5-енолпірувилшикимат-3- фосфатсинтетази (ЕРБР5), наприклад, як більш докладно описане в патентах США МоМо 6248876 В1; 5627061; 5804425; 5633435; 5145783; 4971908; 5312910; 5188642; 4940835; 5866775; 6225114 В1; 6130366; 5310667; 4535060; 4769061; 5633448; 5510471; Не. 36449; ВЕ 37287 Е і 5491288 і Міжнародних публікаціях МоМо УМО 97/04103; МО 00/66746; УМО 01/66704 і
УМО 00/66747. Інші ознаки, які можуть сполучатися з подією по винаходу, включають ознаки, що забезпечують стійкість до сульфонілсечовіни й/або імидазолінону, наприклад, як більш докладно описане в патентах США МоМо 5605011; 5013659; 5141870; 5767361; 5731180; 5304732; 4761373; 5331107; 5928937 і 5378824 і Міжнародної публікації УМО 96/33270.
У деяких варіантах здійснення подія за винаходом може бути об'єднане, наприклад, з гідроксифенілпіруватдіоксигеназамі, ферментамі, які каталізують взаємодію, у якому пари- гідроксифенілпіруват (НРР) перетвориться в гомогентизат. Молекули, які інгібують даний фермент і які зв'язуються з ферментом для інгібування перетворення НРР у гомогентизат, придатні як гербіциди. Ознаки, що забезпечують стійкість до таких гербіцидів у рослинах, описані в патентах США МоМо 6245968 В1; 6268549 і 6069115 і Міжнародної публікації Ме М/О 99/23886. Інші приклади підходящих ознак стійкості до гербіциду, які можуть поєднуватися з подією по винаходу, включають полінуклеотиди арилоксіалканоатдіоксигенази (яка, за наявними відомостями, забезпечує стійкість до 2,4-0 і іншим гербіцидам на основі феноксіауксину, а також до гербіцидів на основі арилоксифеноксипропіонату, як описано, наприклад, у Міжнародній публікації МЛО 05/107437) і полінуклеотиди стійкості до дикамбе, як описано, наприклад, в Нептанп, еї аї., (2005) 9. Віої. Снет. 280:24759-24767.
Інші приклади ознак стійкості до гербіциду, які можуть сполучатися з подією, описуваної в 60 даному документі, включають ознаки, забезпечувані полінуклеотидамі, що кодують екзогенну фосфінотрицинацетилтрансферазу, як описано в патентах США МоМо 5969213; 5489520; 5550318; 5874265; 5919675; 5561236; 5648477; 5646024; 6177616 і 5879903. Рослини, що містять екзогенну фосфінотрицинацетилтрансферазу, можуть проявляти поліпшену стійкість до гербіцидів на основі глуфосинату, які інгібують фермент глутамінсинтазу. Інші приклади ознак стійкості до гербіциду, які можуть сполучатися з подією, описуваної в даному документі, включають ознаки, забезпечувані полінуклеотидамі, що надають змінену активність протопорфіриногеноксидази (ргоїох), як описано в патентах США МоМо 6288306 В1; 6282837 В1 і 5767373 і Міжнародної публікації Мо МУО 01/12825. Рослини, що містять такі полінуклеотиди, можуть проявляти поліпшену стійкість до кожного з різноманітних гербіцидів, які спрямовано діють на фермент ргоїох (також позначуваних як «інгібітори ргоїох»).
В інших варіантах здійснення ознака стійкості АЇ З комбінують із подією, описуваним у даному документі. Застосовуваний у даному документі термін «поліпептид стійкості А 5» містить будь-який поліпептид, який при експресії в рослині забезпечує стійкість до щонайменше одному інгібітору АЇ 5. Відомі різноманітні інгібітори АЇ5, і вони включають, наприклад, сульфонілсечовину, імідазолінон, тріазолопіримідини, піримідинілокси(тіо)бензоати й/або гербіцид сульфоніламінокарбонілтріазолінон. Додаткові інгібітори АЇ 5 відомі й описані в інших розділах у даному документі. Відомо в даній ділянки, що мутації АЇ5 розділяються на різні класи щодо стійкості до сульфонілсечовинам, імідазолінонам, тріазолопіримідинум (|і піримідиніл(тіо)бензоатам, включаючи мутації, що мають наступні характеристики: (1) широка стійкість до всіх чотирьом із цих груп; (2) стійкість до імідазолінонам і піримідиніл(тіо)бензоатам; (3) стійкість до сульфонілсечовинам і тріазолопіримідинум; і (4) стійкість до сульфонілсечовинам і імідазолінонам.
Можуть використовуватися різні поліпептиди стійкості до інгібітору АЇ 5. У деяких варіантах здійснення полінуклеотиди стійкості до інгібітору АЇ 5 містять щонайменше одну нуклеотидну мутацію, що приводить до одній амінокислотній заміні в поліпептиді А! 5. У конкретних варіантах здійснення заміна відбувається в одній із семи по суті консервативних ділянок ацетолактатсинтази. Див., наприклад, Найогі еї а). (1995) МоїІесшіаг Сепеїйс5 апа Сепоте5 246:419-425; І ее єї а. (1998) ЕМВО дуоштпаї 7:1241-1248; Магиг евї аї. (1989) Апп. Нем. Ріапі Рпуз. 40:441-470; і патент США Мо 5605011, причому кожний із цих джерел включений повністю в якості посилання. Поліпептид стійкості до інгібітору А. 5 може кодуватися, наприклад, локусом
ЗиИКА або 5,иКВ АЇ 5. У конкретних варіантах здійснення поліпептид стійкості до інгібітору А 5 включає мутант А 5 С3, мутант АЇ 5 НКА, мутант 54 або мутант 54/НКА або будь-яка їхня поєднання. Різні мутації в АЇ 5, як відомо, забезпечують стійкість до різних гербіцидів і групам (і/або підгрупам) гербіцидів; див., наприклад, Тгапеї і МУмгідчні (2002) М/еейа Зсіепсе 50:700-712.
Див., також, патент США Мо 5605011, 5378824, 5141870 і 5013659, кожний з яких включений у даний документ повністю в якості посилання. Див., також 5ЕО ІЮ МО:65, що містить, послідовність НКА сої; 5ЕО ІЮ МО:66 утримуючу послідовність НКА кукурудзи; ЗЕО ІЮ МО:67 утримуючу послідовність НКА Агарідорвіз; і 560 ІЮ МО:86 утримуючу послідовність НКА, використовувану в бавовнику. Мутація НКА в АГ 5 знаходить конкретне застосування в одному з варіантів здійснення винаходу. Мутація приводить до продукції поліпептиду ацетолактатсинтази, стійкого до щонайменше одному хімічному інгібітору АГ 5, у порівнянні з білком дикого типу. Наприклад, рослина, експресуюча поліпептид стійкості до інгібітору АГ 5, може бути стійким до сульфонілсечовини, імідазолінону, тріазолопіримідинум, піримідинілокси(тіо)бензоатам, і/або гербіциду сульфоніламінокарбонілтріазолінону, доза яких у щонайменше 2, 3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 125, 150, 200, 500 або 1000 раз вище, чим доза гербіциду, яка викличе ушкодження відповідної контрольної рослини. У деяких варіантах здійснення поліпептид стійкості до інгібітору АЇЗ містить ряд мутацій.
Додатково, рослини, що містять поліпептид стійкості до інгібітору АЇ5, можна одержувати шляхом селекції природних мутацій, що надають стійкість до гліфосату.
У деяких варіантах здійснення поліпептид стійкості до інгібітору АЇ 5 забезпечує стійкість до гербіцидів на основі сульфонілсечовини й імідазолінона. Гербіциди на основі сульфонілсечовини й імідазолінона інгібують ріст вищих рослин шляхом блокування ацетолактатсинтази (АГ 5), також відомої як синтетаза ацетогідроксикислот (АНАБ). Наприклад, рослини, що містять конкретні мутації в АЇ 5 (наприклад, мутації 54 і/або НЕА), толерантні відносно гербіцидів на основі сульфонілсечовини. Одержання стійких до сульфонілсечовини рослин і стійких до імідазолінону рослин більш докладно описане в патентах США МоМо 5605011; 5013659; 5141870; 5767361; 5731180; 5304732; 4761373; 5331107; 5928937; і 5378824; і в міжнародній публікації ММО 96/33270, які повністю включені в даний документ як посилання для всіх цілей. У конкретних варіантах здійснення поліпептид стійкості до інгібітору АГ 5 включає бо стійку до сульфонаміду ацетолактатсинтазу (по-іншому відому, як стійка до сульфонаміду синтетаза ацетогідроксикислот) або стійку до імідазолінону ацетолактатсинтазу (по-іншому відому, як стійка до імідазолінону синтетаза ацетогідроксикислот).
Інші приклади ознак стійкості до гербіциду, які можуть комбінуватися з подією, описуваному в даному документі, включають ознаки, що забезпечують стійкість рослини до щонайменше одному гербіциду, такого як, наприклад, рослина Вгазхзіса або мелкопелюстник канадський.
Бур'яни, стійкі до гербіциду, відомі в даній галузі, оскільки є рослинамі з мінливістю по стійкості до конкретних гербіцидів. Див., наприклад, Сгееп апа Умійатв, (2004) "СоггеІайоп ої Сопт (7еа таув) Іпргеа Кезропзе (о Місозийигоп апа Мезоїгіопе", постер, представлений на МУЗ5А Аппиаї
Мееїіпд в Капза5 Сйу, Міззошгі, лютий 9-12, 2004; Стеєп, (1998) М/еєд Тесппоіїоду 12:474-477;
Стееп апа Шігісн, (1993) Меєд Б5сієпсе 41:508-516. Ознакас-и), відповідальна(с-ї) за дані види стійкості, можна комбінувати з подією, описуваним у даному документі, шляхом селекції або іншими способамі для надання рослини по винаходу, а також способів його застосування.
Подія, описувана в даному документі, може також сполучатися із щонайменше одним з інших ознак для одержання рослин по даному винаходу, які додатково містять різні необхідні поєднанням ознак, що включають у якості необмежуючих прикладів ознаки, бажані для використання у якості корму для тварин, такі як високий зміст олії (наприклад, патент США Мо 6232529); збалансований зміст амінокислот (наприклад, гордотіонінів (патенти США МоМо 5990389; 5885801; 5885802 і 5703409; патент США Мо 5850016); високий рівень лізину в ячмені (УМПіатвопг, сеї аї., (1987) Єиг. У. Віоспет. 165:99-106 і УМО 98/20122) і високий рівень метіоніну в білках (Редегзеп, еї аї., (1986) 9. ВіоЇї. Спет. 261:6279; Кігіпага, еї а!І., (1988) Сепе 71:359 і
Мизитига, еї аї., (1989) Ріапі Мої. ВіоІЇ. 12:123); підвищена засвоюваність (наприклад, модифікованих білків, що запасаються (патентна заявка США із серійним Мо 10/053410, зареєстрована 7 листопада 2001 року) і тіоредоксини (патентна заявка США із серійним Мо 10/005429, зареєстрована З грудня 2001 року); описи яких включені в даний документ як посилання. Необхідні поєднанням ознак також включають ГІЇ МС (низький зміст ліноленової кислоти; див., наприклад, Юуег, еї аї., (2002) Аррі. МісгобіоїЇ. ВіоїесппоїЇ. 59:224-230) і ОЇ СН (високий зміст олеїнової кислоти; див., наприклад, Регпапае:-Моуа, сеї а!., (2005) 9. Адгісє. оса
Сет. 53:5326-5330).
Подія, описувана в даному документі, може також комбінуватися з іншими необхідними
Зо ознакамі, такими як, наприклад, гени детоксикації фумонизину (патент США Мо 5792931), невірулентність і гени стійкості до захворювань (Чопев, еї аї!., (1994) Зсіепсе 266:789; Мапіп, еї а!., (1993) бсіепсе 262:1432; Міпагіпо5, еї аї., (1994) Сеї! 78:1089) і ознаки, бажані для переробки або продуктів переробки, наприклад, модифіковані олії (наприклад, гени десатурази жирних кислот (патент США Митбрег 5952544; УМО 94/11516)); модифіковані крохмалі (наприклад, пірофосфорилази АОРО (АсСРази), синтази крохмалю (55), ферменти утвору розгалуженої структури крохмалю (ЗВЕ) і ферменти розщеплення розгалуженої структури крохмалю (5ОВЕ)) і полімери або біопластики (наприклад, патент США Мо 5602321; бета-кетотіолаза, полігідроксибутиратсинтаза й ацетоацетил-СоА-редуктаза (5спибегі, еї аї., (1988) у. Васіегіо!. 170:5837-5847), знижена експресія полігідроксіалканоатів (РНА)); опис яких включені в даний документ як посилання. Також можна поєднувати стійкі до гербіциду полінуклеотиди з полінуклеотидамі, що забезпечують агрономічні ознаки, такі як чоловіча стерильність (наприклад, див., патент США Мо 5583210), сила стебла, час цвітіння, або ознаки, пов'язані з технологією трансформації, такі як регуляція клітинного циклу або спрямована дія на гени (наприклад, УУО 99/61619, УМО 00/1 7364 і УМО 99/25821), опису яких включені в даний документ в якості посилання.
В іншому варіанті здійснення подія, описувана в даному документі, може також комбінуватися з послідовністю Ксді або його біологічно активним варіантом або його фрагментом. Послідовність КсС91 являє собою ген стійкості до стеблевої гнили внаслідок антракноза в кукурудзи. Див., наприклад, патентні заявки США із серійним Мо 11/397153, 11/397275 і 11/397247, кожна з яких включена в даний документ як посилання.
Ці об'єднані поєднанням можуть створюватися будь-яким способом, включаючи в якості необмежуючих прикладів селекцію рослин по будь-якій загальноприйнятій методології або генетичну трансформацію. Якщо послідовності з'єднані генетичною трансформацією рослин, інтересуючії полінуклеотидні послідовності можна комбінувати в будь-який час і в будь-якому порядку. Ознаки можуть уводитися одномоментно по протоколу одночасної трансформації інтересуючими полінуклеотидамі, наданими будь-який поєднанням касет для трансформації.
Наприклад, якщо будуть уведено дві послідовності, вони можуть утримуватися в роздільних касетах для трансформації (транс) або втримуватися в одній касеті для трансформації (цис).
Експресуючі послідовності можуть управлятися одним промотором або різними промоторамі. У 60 певних випадках може бути бажаним уводити касету для трансформації, яка буде пригнічувати експресію інтересуючого полінуклеотида. Це можна поєднувати з будь-якою поєднанням інших експресуючих касет або гіперекспресуючих касет для утвору в рослини необхідної поєднанням ознак. Далі мається на увазі, що полінуклеотидні послідовності можуть поєднуватися в необхідної геномной локалізації з використанням сайт- специфічної системи репоєднанням. Див., наприклад, ММО99/25821, УМО99/25854, УМО99/25840, ММО99/25855 і ММО99/25853, кожна з яких включена в даний документ як посилання.
Застосовуваний у даному документі термін «полінуклеотид », як мається на увазі, не обмежує даний винахід полінуклеотидамі, що містять ДНК . Фахівцям у даній ділянки зрозуміло, що полінуклеотиди можуть включати рибонуклеотиди й поєднанням рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Такі дезоксирибо-нуклеотиди й рибонуклеотиди включають природні молекули й синтетичні аналоги. Полінуклеотиди за винаходом також охоплюють усі форми послідовностей, включаючи в якості необмежуючих прикладів, одноланцюгові форми, двохланцюгові форми, шпильки, структури стебло-петля, і т.п.
Рослина Вгаззіса ЮОР-073496-4 містить експресуюча касету, що включає оптимізований полінуклеотид гліфосатуцетилтрансферази. Касета може включати 5'- і 3'-кінцеві регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з полінуклеотидамі діуаї. «Функціонально зв'язаний», як передбачається, означає функціональний зв'язок між двуми або більш елементамі. Наприклад, функціональний зв'язок між інтересуючим полінуклеотидом і регуляторною послідовністю ( тобто, промотором) є функціональним зв'язком, який забезпечує експресію інтересуючого полінуклеотида. Функціонально зв'язані елементи можуть бути суміжними або несуміжними.
При використанні для посилання на сполучення двох кодуючих білок ділянок, під функціонально зв'язаними слід розуміти, що кодуючи ділянки перебувають в одній рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, яким також трансформується організм. Альтернативно, додатковий(-ї) ген(-и) може(-уть) надаватися в множинних експресуючих касетах. Така експресуюча касета надана з безліччю ділянок рестрикції й/або ділянок репоєднанням для вставки полінуклеотида під вплив регуляції транскрипції регуляторними ділянкамі. Експесуюча касета може додатково містити гени селективних маркерів.
Експесуюча касета в напрямку транскрипції 5-3" може включати ділянку ініціації транскрипції
Зо й трансляції ( тобто, промотор) кодувальну ділянку і ділянку, термінації транскрипції й трансляції, функціональні в рослинах. «Промотор» відноситься до нуклеотидної послідовності, здатної контролювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. В основному, кодуюча послідовність розташована в 3'-сапрямку від промоторної послідовності. Промоторна послідовність може включати проксимальні й більш дистальні вищележачі елементи, причому останні часто позначають як енхансери. Таким чином, «енхансер» являє собою нуклеотидну послідовність, яка може стимулювати активність промотору й може бути елементом, властивим промотору вихідне, або може бути гетерологічним елементом, вбудованим для посилення активності або додання промотору тканинної специфічності. Промотори можуть відбуватися повністю з нативного гена або можуть складатися з різних елементів, що відбуваються з різних промоторів, що перебувають у природі або навіть утримуючих синтетичні нуклеотидні сегменти.
Фахівцям у даній галузі слід розуміти, що різні промотори можуть управляти експресією гена в різних тканинах або типах клітин або на різних стадіях розвитку або у відповідь на різні умови навколишнього середовища. Промотори, які викликають експресію фрагмента нуклеїнової кислоти в багатьох типах клітин більшу частину часу, звичайно позначають як «конститутивні промотори». Постійно відкривають нові промотори різних типів, які можуть використовуватися в рослинних клітинах; численні приклади можна знайти в огляді ОКатиго апа Соїдрего, (1989)
Віоспетівігу ої Ріапіб5 15:1-82. Далі мається на увазі, що оскільки в більшості випадків точні границі регуляторних послідовностей не повністю визначені, фрагменти нуклеїнової кислоти різної довжини можуть мати ідентичну промоторну активність.
Експресуючі касети також можуть містити 5'-кінцеві лідируючи послідовності. Такі лідируючи послідовності можуть діяти, підсилюючи трансляцію. Регуляторні ділянки (тобто, промотори, ділянки регуляції транскрипції, ділянки процесінг а або стабільності РНК, інтрони, сигнали поліаденілювання, ділянки термінації транскрипції й ділянки термінації трансляції) і/або кодувальну ділянку можуть бути нативними/аналогічними стосовно клітини-хазяїнові або друг до друга або можуть бути гетерологічними. «Лідируюча послідовність трансляції» відноситься до нуклеотидної послідовності, розташованої між промоторною послідовністю гена й кодувальною послідовністю. Лідируюча послідовність трансляції присутня в повністю процесованої мРНК вище послідовності старту трансляції. Лідируюча послідовність трансляції може впливати на багато параметрів, бо включаючи процесінг первинного транскрипта в мРНК, стабільність мРНК і/або ефективність трансляції. Описані приклади лідируючих послідовностей трансляції (Тигпег і Єовіег, (1995) МОЇ.
Віоїесппої. 3:225-236). «3-Кінцеві не кодувальні піследовательности» относятся к нуклеотидним піследовательностям, лежащим ниже кодувальної піследовательности, и включают піследовательности распознавания поліаденілювання и інші піследовательности, кодувальні регуляторние сигнали, способние воздействовать на процесінг мРНК или на експрессію гена.
Сигнал поліаденілювання, як правило, характеризується впливом на додавання поліаденілових тяжей на 3'-кінець мРНК-попередника. Застосуванн різн 3'-кінцевих не кодидувальних піследовательностей описано ІпдеїБбгесні,, (1989) Ріапі сеї! 1:671-680.
Застосовуваний у даному документі термін «гетерологічний» стосовно послідовності являє собою послідовність, яка походить із чужорідного виду, або якщо походить із того ж виду, по суті модифікована в порівнянні зі своєї нативною формою в композиції й/або в геномном локусі за допомогою навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з гетерологічним полінуклеотидом, походить із виду, відмінного від того, від якого відбувається даний полінуклеотид , або, якщо він походить із того ж аналогічного виду, одна або обидві послідовності по суті модифіковані від їхньої вихідної форми й/або геномного локусу, або промотор не є нативним промотором для функціонально зв'язаного полінуклеотида.
При одержанні експресуючої касети можна маніпулювати різними фрагментамі ДНК, так що надаються послідовності ДНК у належній орієнтації й, при необхідності, у належній рамці зчитування. Для цього, при об'єднанні фрагментів ДНК можуть використовуватися адаптери або лінкери, або можуть задіятися інші маніпуляції для забезпечення зручних ділянок рестрикції, видалення зайвої ДНК , видалення ділянок рестрикції, або т.п. Для цієї мети може використовуватися мутагенез іп міо, відновлення праймерів, рестрикція, відпал, повторні заміни, наприклад, перестановки й трансверсии. Експесуюча касета також може включати ген селективного маркера для добору трансформованих клітин. Гени селективних маркерів використовують для добору трансформованих клітин або тканин.
Надані виділені полінуклеотиди, які можна використовувати в різних способах детектування й/або ідентифікації події Вгаззіса ОР-073496-4. «Виділений» або «очищений» полінуклеотид або його біологічно активна частина є, по суті або в основному, вільним від компонентів, які звичайно супроводжують полінуклеотид у або взаємодіють із ним у його природному оточенні.
Таким чином, виділений або очищений полінуклеотид по суті вільний від іншого клітинного матеріалу або середовища для культивування при продукції рекомбінантними способамі або по суті вільний від хімічних попередників або інших хімікатів при хімічному синтезі. Оптимально, «виділений» полінуклеотид вільний від послідовностей (необов'язково білок, що кодують, послідовностей), які в природі фланкують полінуклеотид ( тобто, послідовностей, розташованих 3 5 ї 3-кінців полінуклеотида) у геномної ДНК організму, з якого відбувається полінуклеотид .
Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений полінуклеотид може містити менш ніж приблизно 5 т.п.н., 4 т.п.н., З т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. або 0,1 т.п.н. нуклеотидної послідовності, яка в природі фланкують полінуклеотид у геномной ДНК клітин, з яких відбувається полінуклеотид .
У конкретних варіантах здійснення полінуклеотиди за винаходом містять з'єднуючу послідовність ДНК, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 2, або її варіанти й/або фрагменти, або з'єднуючу послідовність ДНК , наведену в 5ЕО І МО: 12 і/або 13. В інших варіантах здійснення полінуклеотиди за винаходом містять з'єднуючу послідовність ДНК, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 14, 15, 16, 17, 18 і/або 19 або її варіанти й фрагменти. У конкретних варіантах здійснення по способах Детектування, описуваним у даному документі, ампліфікують полінуклеотид ділянка, що містить, сполучення специфічної події ОР-073496-4. Фрагменти й варіанти з'єднуючої послідовності ДНК підходять для дискримінуючий ідентифікації події ОР-073496-4. Як обговорювалося в іншій частині даного документа, такі послідовності знаходять застосування в якості праймерів і/або зондів.
В інших варіантах здійснення полінуклеотиди за винаходом містять полінуклеотиди, які можуть детектувати подію ОР-073496-4 або ділянку, специфічну у відношенні ОР-073496-4. Такі послідовності включають будь-який полінуклеотид, наведений в ЗЕО ІЮ МО: 2,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, або його варіанти й фрагменти.
Фрагменти й варіанти полінуклеотиди, які детектируют подію ОР-073496-4 або ділянку, специфічну у відношенні ОР-073496-4, підходять для дискримінуючий ідентифікації події ОР- 073496-4. Як обговорювалося в іншій частині даного документа, такі послідовності знаходять застосування в якості праймерів і/або зондів. «Варіанти», як мається на увазі, означають по суті подібні послідовності. Для полінуклеотидів варіант включає полінуклеотид , що містить делеції ( тобто, укорочення) з 5' 60 іабо 3'-кінця; делецию й/або додавання одного або декількох нуклеотидів в один або кілька внутрішніх ділянок нативного полінуклеотида й/або заміну одного або декількох нуклеотидів в одному або декількох ділянках нативного полінуклеотида.
Застосовуваний у даному документі термін «зонд» являє собою виділений полінуклеотид , до якого приєднана загальноприйнята детектируемая мітка або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний засіб, фермент, і т.д. Такий зонд комплементарен ланцюгу полінуклеотида-мишени. У випадку даного винаходу зонд комплементарен ланцюги виділеному ДНК із події Вгаззіса ОР-073496-4, з рослини Вгаззіса або зі зразка, який включає ДНК від події. Зонди по даному винаходу включають не тільки дезоксирибонуклеїнову або рибонуклеїнову кислоти, але також поліаміди й інші матеріали зондів, які можуть специфічно детектувати присутність ДНК-послідовності-мішені.
Застосовувані в даному документі «праймери» є виділеними полінуклеотидамі, які отжигаются з комплементарної ДНК-ланцюгом-мішенню шляхом гібридизації нуклеїнової кислоти з утвором гібрида між праймером і ДНК -ланцюгом-мішенню, потім продовжуються по
ДНК-ланцюги-мішені полімеразой, наприклад, ДНК-полімеразой. Пари праймерів за винаходом відносяться до їхнього застосування для ампліфікації полінуклеотида-мішені, наприклад, шляхом полімеразной ланцюгової реакції (ПЛР) або інших загальноприйнятих способів ампліфікації нуклеїнової кислоти. «ПЛР» або «полімеразна ланцюгова реакція» є способом, використовуваним для ампліфікації специфічних сегментів ДНК (див., патенти США МоМо 4683195 і 4800159, включені в даний документ у якості посилання). Будь-яка поєднання праймерів можна використовувати так, що їх пари забезпечить детектування події ОР-073496-4 або ділянки, специфічної для ОР-073496-4.
Зонди й праймери мають достатню довжину нуклеотидної ланцюги для зв'язування із ДНК- послідовністю-мішенню й для специфічного детектування й/або ідентифікації полінуклеотида, що містить подію ЮОР-073496-4. Установлене, що умови гібридизації або умови реакції для досягнення даного результату може визначати оператор. Ця довжина може бути будь-який, достатньої для обраного способу детектування. Загалом, використовують 8, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 нуклеотидів або більш або приблизно 11-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600- 700, 700-800 або більш нуклеотидів. Такі зонди й праймери можуть специфічно гібридизуватися
Зо з послідовністю-мішенню в умовах гібридизації з високою твердістю. Зонди й праймери по варіантах здійснення даного винаходу можуть характеризуватися повною ідентичністю послідовності ДНК суміжних нуклеотидів з послідовністю-мішенню, хоча загальноприйнятими способамі можна конструювати зонди, які відрізняються від ДНК-послідовності-мішені й зберігають здатність до специфічного детектуванню й/або ідентифікації ДНК-послідовності- мішені. Таким чином, зонди й праймери можуть характеризуватися приблизно 8095, 8595, 90965, 9196, Уго, УЗов, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більшою ідентичністю або комплементарностью послідовності у відношенні полінуклеотида-мішені, або можуть відрізнятися від послідовності-мішені на 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більш нуклеотидів. Зонди можна використовувати в якості праймерів, але перші, загалом, сконструйовані для зв'язування із ДНК або РНК-мішенню й не використовуються в процесі ампліфікації. В одному з необмежуючих варіантів здійснення зонд може включати полінуклеотид, що кодує послідовність діуа!ї4621 або будь-який її варіант або фрагмент.
Специфічні праймери можна використовувати для ампліфікації фрагмента інтеграції з утвором амплікона, який можна використовувати в якості «специфічного зонда» або який може сам детектуватися для ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічних зразках. Альтернативно, зонд за винаходом можна використовувати під час реакції ПЛР для забезпечення детектування події ампліфікації (тобто, зонд Тадтап"м або зонд МОВ, так звана ПЛР у реальному часі). Коли зонд гібридизують з полінуклеотидамі біологічного зразка в умовах, які забезпечують зв'язування зонда зі зразком, дане зв'язування може детектуватися й у такий спосіб забезпечувати вказівка на присутність події ОР-073496-4 у біологічному зразку. Така ідентифікація зв'язаного зонда описана в даній ділянки. В одному з варіантів здійснення винаходу специфічний зонд являє собою послідовність, яка в оптимізованих умовах специфічно гібридизується з ділянкою в 5' або 3'-кінцевій фланкуючій ділянки події й також містить частина чужорідної ДНК у суміжному положенні стосовно неї. Специфічний зонд може включати послідовність на щонайменше 8095, від 80 до 8595, від 85 до 9095, від 90 до 9595 і від 95 до 100905 ідентичну (або комплементарну) специфічної ділянки події ОР-073496-4.
Застосовуваний у даному документі термін «ампліфікована ДНК » або «амплікон» відноситься до продукту ампліфікації полінуклеотида-мішені, який є частиною матриці нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення того, чи містить рослина Вгаззіса, яке є бо результатом полового схрещування, подія ОР-073496-4, ДНК , екстрагована зі зразка тканини рослини Вгаззіса, може зазнати способу полінуклеотидної ампліфікації, з використанням пари праймерів ДНК , яка включає перший праймер, що відбувається із фланкуючої послідовності, що прилягає до ділянки вставки вбудованої гетерологічної ДНК , і другий праймер, що відбувається із вбудованої гетерологічної ДНК для продукції амплікона, діагностичного відносно присутності ДНК події ОР-073496-4. У специфічних варіантах здійснення амплікон включає з'єднуючий полінуклеотид ОР-073496-4 ( тобто, частина 5ЗЕО ІЮО МО: 2, яка перекриває ділянку сполучення, таку як, наприклад, 562 ІЮ МО: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 і/або 19 або їх варіанти й фрагменти). Під «діагностичним» відносно події ОР-073496-4 мається на увазі застосування будь-якого способу або аналізу, який відрізняє наявність або відсутність події ОР- 073496-4 у біологічному зразку, призначеному для аналізу. Альтернативно, другий праймер може походити із фланкуючої послідовності. В інших варіантах здійснення пари праймерів можуть походити із фланкуючої послідовності із двох сторін вбудованої ДНК , так що буде отриманий амплікон, який включає цілий вбудований полінуклеотид експресуючої конструкції, а також послідовність, що фланкуючу трансгенну вставку. Див., фігуру 3. Амплікон має потрібну довжину й має послідовність, яка також є діагностичною відносно події ( тобто, містить з'єднуючу ДНК із події ОР-073496-4). Амплікон може змінюватися в довжину від поєднанням пари праймерів плюс один нуклеотид до будь-якої довжини амплікона, який може виходити по протоколу ампліфікації ДНК . Один з пари праймерів, що відбуваються із фланкуючої послідовності, може бути локалізований на відстані від вбудованої послідовності ДНК, причому дана відстань може змінюватися від однієї пари нуклеотидних основ до границь можливостей реакції ампліфікації або приблизно до двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. Застосування терміна «амплікон» специфічно виключає димери праймерів, які можуть утворюватися при термальній реакції ампліфікації ДНК.
Способи одержання й застосування зондів і праймерів описані, наприклад, в Моїесшаг
Фіопіпд: А Іарогаїту Мапиаї, 2.зир.па ей, мої. 1-3, ед. ЗатрьгоокК, єї аї., бод ріпу Натог
ІГарогаїогу Ргез55, Со Зргіпд Нагрог, М.У. 1989 (далі в даному документі, "Затрбгоок, еї аї, 19897); Сиггепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшціаг Віоіоду, ей. Ає!йзибреї, еї аїІ., Сгеепе Рибії5піпд і Уміеу-
Іпіегесіепсе, Мем МогК, 1992 (з періодичними відновленнями) (далі в даному документі, "А!изибеї, еї а. 19927) і Іппі5, еї аіЇ, РСЕК Ргоїосої5: А сціде то Меїнодз апа Арріїсайоп5, Асадетіс Ргезв: Зап
Зо Біедо, 1990. Пари праймерів ПЛР можуть бути обрані з відомої послідовності, наприклад, з використанням комп'ютерної програмі, призначеної для цієї мети, такий як інструмент для аналізу праймерів для ПЛР в Месіог МТІ мегвіоп 6 (Іптоптах Іпс., ВеШевзаа Ма.); Ргітегзеїесі (ОМАЗТАК Іпс., Мадізоп, УМі5.); і Ргїтег (Мегвіоп 0.5. СОРУКСТ., 1991, УУпнепеай Іпзійше ог
Віотедіса! Кезеагсй, Сатргідде, Ма55.). Додатково, послідовність може бути віртуально сканована, а праймери ідентифіковані вручну з використанням вказівок, відомих фахівцеві в даній галузі.
Слід розуміти, що застосовуваний у даному документі термін «трансгенний» включає будь- яку клітину, клітинну лінію, калус, тканина, частину рослини або рослину, генотип якої був змінений присутністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, що включає трансгени, змінені спочатку, а також створені шляхом полового схрещування або полового розмноження вихідних трансгенних організмів. Застосовуваний у даному документі термін «трансгенний» не охоплює зміни генома (хромосомні або внехромосомні) шляхом загальноприйнятих способів селекції рослин або шляхом природних подій, таких як випадкове перехресне запилення, інфекція нерекомбінантним вірусом, трансформація нерекомбінантною бактерією, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. «Трансформація» відноситься до переносу фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму хазяїна, що приводить до генетично стабільного спадкування.Організми-хазяї, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, позначають як «трансгенні» організми.
Приклади способів трансформації рослин включають опосередковану Адгорасієгійт трансформацію (Оє Віаеєге, єї аї., (1987) Мей. Епгутої. 143:277) і технологію трансформації прискореними часткамі або « генною гарматою» (Кіевїп, еї аї, (1987) Майшиге (Гопдоп) 327:70-73; патент США Мо 4945050, включений у даний документ як посилання). Додаткові способи трансформації описані нижче.
Таким чином, виділені полінуклеотиди за винаходом можуть вбудовуватися в рекомбінантні конструкції, як правило, конструкції ДНК, які здатні до введення в клітину-хазяїна й до реплікації в ній. Така конструкція може бути вектором, який включає систему реплікації й послідовності, здатні до транскрипції й трансляції з кодуючої поліпептид послідовності в даної клітині-хазяїні.
Ряд векторів, що підходять для стабільної трансфекціїї рослинних клітин або для одержання трансгенних рослин, описані, наприклад, в Рошмеї5, еї аї., (1985; Зирр. 1987) Сіопіпд Месіоге: А 60 Іарогаїогту Мапиа!, М/єізврасп апа МУеєїз5раси, (1989) МеїШоайвз то Ріапі МоїІесшаг Віоіоду
(Асадетіс Рге55, Мем/ Могк) апа Ріеміп, еї аї., (1990) Ріапі МоїІесшіаг Віоїюду Мапиа! (Кішжмег
Асадетіс Рибіїзпег5). Як правило, рослинні експресуючі вектори включають, наприклад, один або кілька клонованих генів рослини під транскрипційним контролем 5 і 3'-кінцевих регуляторних послідовностей і домінантний селектируемий маркер. Такі рослинні експресуючі вектори також можуть містити промоторну регуляторну ділянку (наприклад, регуляторну ділянку індукуєму контрольованої або конститутивної, регульованої факторамі середовища або розвитку або специфічної для клітини або тканеспецифічної експресії), ділянка старту ініціації транскрипції, ділянка зв'язування рибосоми, сигнал процесінг а РНК, ділянка термінації и транскрипції й/або сигнал поліаденілирования.
Надані різні способи й композиції ідентифікації події ОР-073496-4. Такі способи знаходять застосування в ідентифікації й/або детектування події ОР-073496-4 у будь-якому біологічному матеріалі. Такі способи включають, наприклад, способи підтвердження чистоти насінь і способи скринінга партії насінь на наявність події ОР-073496-4. В одному з варіантів здійснення наданий спосіб ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічному зразку, і він включає контакт зразка з першим і другим праймером і ампліфікацію полінуклеотида, що містить специфічну ділянку ОР- 073496-4.
Біологічний зразок може включати будь-який зразок, у якому потрібно визначити, чи присутствует там ДНК , що містить подію ОР-073496-4. Наприклад, біологічн зразок мог місти будь-який рослинний матеріал або матеріал, що містить або відбува з рослинного матеріала, необмежувальними примерамі которого являются піщевие або кормові продукти.
Застосовуваний у даному документі термін «рослинний матеріал» відноситься до матеріалу, який виходить або походить із рослини або частини рослини. У конкретних варіантах здійснення біологічний зразок являє собою тканину Вгазв5іса.
Праймери й зонди, засновані на послідовностях фланкуючої ДНК і вставки, описуваних у даному документі, можна використовувати для підтвердження (і якщо необхідно, для корекції) описаних послідовностей загальноприйнятими способамі, наприклад, шляхом повторного клонування й секвенування таких послідовностей. Полінуклеотидні зонди й праймери по даному винаходу специфічно виявляють ДНК-послідовність-мішень. Для ідентифікації присутності в зразку ДНК із трансгенної події можна використовувати загальноприйнятий спосіб гібридизації
Зо або ампліфікації нуклеїнової кислоти для ідентифікації присутності ДНК від трансгенного рослини в зразку. Під «специфічним детектуванням» слід розуміти, що полінуклеотид можна використовувати в якості праймера для ампліфікації специфічної для ОР-073496-4 ділянки, або полінуклеотид можна використовувати в якості зонда для гібридизації в жорстких умовах з полінуклеотидом з події ЮОР-073496-4. Рівень або ступінь гібридизації, які забезпечують специфічне детектування події ОР-073496-4 або специфічної ділянки події ОР-073496-4, є достатніми для того, щоб відрізнити полінуклеотид зі специфічною ділянкою ЮР-073496-4 від полінуклеотида, що не містить даної ділянки, і за рахунок цього забезпечується ідентифікація, що дискримінує, події ЮОР-073496-4. Під вираженням «характеризується достатньою ідентичністю або комплементарностью послідовності для забезпечення ампліфікації специфічної для ЮР-073496-4 події» мається на увазі послідовність, що характеризується щонайменше 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичністю або комплементарностью відносно фрагмента або повноразмірного полінуклеотида зі специфічної ділянки ОР-073496-4.
Що стосується ампліфікації полінуклеотида-мішені (наприклад, шляхом ПЛР) з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, « жорсткі умови» являють собою умови, які забезпечують гібридизацію пари праймерів з полінуклеотидом-мішенню, з яким буде зв'язуватися один праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або комплементарну їй), і інший праймер, що має відповідну до вставки ЮР-073496-4 послідовність ДНК , і, переважно, буде здійснюватися одержання продукту ампліфікації (амплікона), який можна ідентифікувати при наявності специфічної ділянки ОР-073496-4 у термальній реакції ампліфікації ДНК . У підході ПЛР олігонуклеотидні праймери можуть конструюватися для застосування в реакціях ПЛР для ампліфікації специфічної ділянки ЮОР-073496-4. Способи конструювання праймерів для ПЛР і клонування шляхом ПЛР, в основному, відомі в даній галузі й описані в затрьгоок, еї а!., (1989) МоїІесшіаг СіІопіпд: А Гарогагу Мапаиаї (24 ед., Соїа 5ргіпа
Нагбог Гарогайогу Ргезв, Ріаіпмієм/, Мем МогК). Див. також, Іппів, еї а!., ед5. (1990) РСК Ргогосо!5:
А Сиціде о Меїпоавз ії Арріїсаноп5 (Асадетіс Ргез5, Мем/ МогК); Іппі5 апа СепГапа, едз5. (1995) РСК зігаїедіез (Асадетіс Ргез5, Мем/ МогК) і Іппіз апа СеїГапа, єд5. (1999) РОСА Меїноде Мапиаї! (Асадетіс Рге55, Мем/ МогК). Способи ампліфікації далі описані в патентах США МоМо 4683195, 4683202 і в Спеп, еї аї., (1994) РМАЗ 91:5695-5699. Ці способи, а також інші відомі в даній галузі бо способи ампліфікації ДНК можна використовувати в практичній реалізації варіантів здійснення даного винаходу. Слід розуміти, що може знадобитися адаптувати ряд параметрів конкретного протоколу ПЛР до конкретних лабораторних умов, і їх можна злегка модифікувати й все-таки забезпечити одержання подібних результатів. Ці зміни можуть бути зрозумілі Фахівцеві в даній галузі.
Ампліфікований полінуклеотид (амплікон) може бути будь-якої довжини, яка забезпечує детектування події ОР-073496-4 або специфічної ділянки ОР-073496-4. Наприклад, амплікон може становити приблизно 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2000, 3000, 4000, 5000 нуклеотидів у довжину або більш.
У конкретних варіантах здійснення детектують специфічну ділянку події ОР-073496-4.
У способах за винаходом може використовуватися будь-який праймер, який забезпечує ампліфікацію й/або детектування специфічної ділянки ОР-073496-4. Наприклад, у конкретних варіантах здійснення перший праймер включає фрагмент полінуклеотида з 5ЕО ІО МО: 2 або 3, де перший або другий праймер характеризується достатньою ідентичністю або комплементарностью по послідовності у відношенні полінуклеотида для ампліфікації специфічної ділянки ОР-073496-4. Пари праймерів може включати фрагмент ЗЕО ІЮ МО: 2 або 3. В іншому варіанті здійснення пара праймерів містить перший праймер фрагмент, що включає, ЗЕО ІО МО: 8, і другий праймер фрагмент, що включає, 5ЕО ІЮ МО: 9 або 10; або, альтернативно, пара праймерів включає перший праймер фрагмент, що містить, з«ЕО ІЮ МО: 9, і другий праймер фрагмент, що містить, ХЕО ІЮ МО: 8 або 10. Праймери можуть бути будь-якої довжини, достатньої для ампліфікації специфічної ділянки ОР-073496-4, включаючи, наприклад, щонайменше 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 15 або 30 або приблизно 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30- 35, 35-40, 40-45 нуклеотидів або більш. Додаткові праймери також наведені в даному документі в таблиці 11.
Як обговорювалося в іншому місці даного документа, може використовуватися будь-який спосіб ампліфікації шляхом ПЛР події або специфічної ділянки ЮР-073496-4, включаючи, наприклад, ПЛР у реальному часі. Див., наприклад, І їмак, еї а!., (1995а). Олігонуклеотиди із флуоресцентними барвникамі на протилежних кінцях надають систему гасіння зондів для детектування продукту ПЛР і гібридизації нуклеїнової кислоти. РСЕ Меїподз апа Арріїсайіопв5. 4:357-362; патент США 2 5538848; патент США Мо 5723591; Арріїєа Віозухтет5 О5ег ВиПеїіп Мо.
Зо 2, "КеІайме Очапійайоп ої Сепе Ехргезвіоп", Р/М 4303859 і Арріїєа Віозухтет5 Овег ВиПеїйіп Мо. 5, "Мийіріех РСК м/йй Тадтап МІС ргобе5", Р/М 4306236, кожний з яких включений у даний документ як посилання.
Таким чином, у конкретних варіанти здійснення наданий спосіб детектування наявності
Вгазвзіса з подією ЮОР-073496-4 або його потомства в біологічному зразку. Спосіб включає (а) екстракцію зразка ДНК із біологічного зразка; (Б) надання пари праймерних молекул ДНК , спрямованих на вставку й/або місце сполучення; (с) надання умов реакції ампліфікацій ДНК ; (4) проведення реакції ампліфікації ДНК, із продукцією за рахунок цього ДНК -молекули-амплікона; і (е) детектування ДНК-молекули-амплікона, де детектування зазначеної ДНК -молекули- амплікона в реакції ампліфікації ДНК означає присутність події Вгаззіса ОР-073496-4. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила праймером або зондом, їй лише необхідно бути досить комплементарної по послідовності, щоб утворювати стабільну двохланцюгову структуру в конкретному використовуваному розчиннику й концентрації солей.
У способах гібридизації використовує весь полінуклеотид або його частина, яка селективно гіобридизуєтся з полінуклеотидом-мішенню, що містять специфічну подію ЮОР-073496-4. Під « жорсткими умовамі» або « жорсткими умовамі гібридизації» мається на увазі посилання на умови для полінуклеотидного зонда, у яких зонд гібридизуєтся зі своєю послідовністю-мішенню в детектуємої більшої ступені, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше, в 2 рази вище тла). Відносно ампліфікації полінуклеотида-мішені (наприклад, шляхом ПЛР) з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, « жорсткі умови» є умовамі, які забезпечують гібридизацію пари праймерів з полінуклеотидом-мішенню, з яких один праймер характеризується відповідною послідовністю дикого типу, і інший праймер характеризується відповідною послідовністю ДНК вставки ОР-073496-4. Жорсткі умови є залежними від послідовності й міняються в різних обставинах. Шляхом контролю твердості умов гібридизації й/"або відмивання можуть ідентифікуватися послідовності-мішені, які на 10095 комплементарни зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, твердість умов може підбиратися з допущенням деякої невідповідності послідовностей, так що будуть детектуватися більш низькі значення (гетерологічне зондування). Загалом, зонд становить менш ніж приблизно 1000 нуклеотидів у довжину або менш ніж 500 нуклеотидів у довжину.
Застосовувана в даному документі, по суті ідентична або комплементарна послідовність бо являє собою полінуклеотид , який специфічно гібридизуєтся з комплементарною молекулою нуклеїнової кислоти, з якої його порівнюють, в умовах високої твердості. Підходящі умови твердості, які сприяють гібридизації ДНК , наприклад, бх хлорид натрію/цитрат натрію (55ХХ) приблизно при 45 "С, з наступним промиванням 2х 55С при 50 "С, відомі фахівцям у даній галузі, або їх можна знайти іп Ситепі Ргоїосоів іп МоІесшаг Віоіоду, Чопп УМПеу в 5Боп5, М.У. (1989), 6.3.1-6.3.6. Як правило, жорсткі умови гібридизації й детектування є такими, що концентрація солей становить менш ніж приблизно 1,5 М іона Ма, як правило, приблизно від 0,01 до 1,0 М іона Ма (або інших солей) при рН від 7,0 до 8,3, і температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більш ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також досягатися додаванням дестабілізаторів, таких як формамід. Типові умови низької твердості включають гібридизацію буферним розчином з концентрацією формаміду від
З0 до 3595, 1 М Масі, 195 505 (додецилсульфат натрію) при 37 "С, і промивання при концентрації від їх до 2х 550 (20х 55С - 3,0 М Масі/0,3 М трицитрат натрію) при температурі від 50 до 55"С. Типові умови помірної твердості включають гібридизацію в розчині з концентрацією формаміду від 40 до 4595, 1,0 М Масі, 1906 505 при 37 "С, і промивання при концентрації від О0,5х до їх 55С при температурі від 55 до 60 "С. Типові умови з високою твердістю включають гібридизацію в 5095 формаміді, 1 М Масі, 195 505 при 37 "С і промивання в 0їх 550 при температурі від 60 до 65 "С. Необов'язково, буфери для промивання можуть включати приблизно від 0,195 приблизно до 195 505. Тривалість гібридизації, в основному, становить приблизно менш 24 годин, як правило, від приблизно 4 до приблизно 12 годин.
Тривалість промивання становить, щонайменше, час, достатнє до досягнення рівноваги.
У реакціях гібридизації специфічність, як правило, є функцією промивань після гібридизації, причому критичними факторамі є іонна сила й температура кінцевого розчину для промивання.
Для гібридів ДНК -ДНК Тл може апроксимуватися з рівняння Меїіпкоїй апа Умапйі, (1984) Апаї.
Віоспет. 138:267-284: Тт - 81,5 70 ж 16,6 (09 М) ж 0,41 (9005) - 0,61 (96 форм.) - 500/л; у якому
М являє собою молярність моновалентних катіонів, 9005С являє собою процентну частку нуклеотидів гуанозину й цитозину в ДНК, 96 форм. є процентною часткою формаміду в розчині для гібридизації, і Ї. являє собою довжину гібрида у парах основ. Тт являє собою температуру ( при певній іонній силі й рН), при якій 5095 комплементарної послідовності-мішені гібридизуєтся з повністю відповідним зондом. Тт знижується приблизно на 1 "С на кожну розбіжність; таким чином, Тт, гібридизація, або умови промивання можуть бути підібрані для гібридизації послідовностей необхідної ідентичності. Наприклад, якщо маються на увазі послідовності з ідентичністю 29095, Тл може знижуватися на 10 "С. Загалом, жорсткі умови обрані так, що вони на приблизно 5 "С нижче температури термального плавлення (Тт) конкретної послідовності й комплементарної їй послідовності при певній іонній силі й рН. Однак, у дуже жорстких умовах може використовуватися гібридизація й/або промивання при температурі на 1, 2, З або 47С нижче температури термального плавлення (Тт); у помірковано жорстких умовах може використовуватися гібридизація й/або промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 "С нижче температури термального плавлення (Тт); в умовах низької твердості може використовуватися гіоридизація й/(або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 С нижче температури термального плавлення (Тт). З урахуванням даного рівняння, композицій для гіоридизації й промивання й необхідної Тя фахівцям буде зрозуміло, що зміни твердості розчинів для гібридизації й/(або промивання по суті описані. Якщо необхідний ступінь розбіжності приводить до Тят менш ніж 45 "С ( водяний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), оптимально підвищити концентрацію 55С, так що можна буде використовувати більш високу температуру. Докладний посібник з гібридизації нуклеинових кислот наведене в Тііб55еп, (1993)
ІГарогагогу Тесппідцев іп Віоспетівігу ії Моїесшіаг Віоіоду-Нубргідіганйоп м/п Мисієїс Асій Ргобев,
Рап І, Спарієег 2 (ЕІземіег, Мем/ МогКк) і А!,Мзибеї, еї аї., еаз. (1995) Сигтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг
Віоіоду, Спаріег 2 (Сгеепе Рибіїхпіпод і УМіеу-Іп(егзсіепсе, Мем/ МогК). Див., затюогоок, еї аї., (1989) Моіесшіаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї (24 єд., Соїд 5ргіпуд Нагог І абогаюгу Ргевзв, Ріаіпмівему,
Мем ХогКк) і Наутев, еї аї., (1985) Іп: Мисіевїс Асіа Нубгіаігайноп, а Ргасіїса! Арргоасі, ІК. Ргев5,
Муазпіпдіюп, 0.0.
Полінуклеотид , як зазначено, є «комплементарним» у відношенні іншого полінуклеотида, якщо він характеризується комплементарностью. Застосовувані в даному документі молекули, як зазначено, проявляють «повну комплементарность», коли кожний нуклеотид однієї полінуклеотидної молекули комплементарен нуклеотиду іншої. Дві молекули зазначені як «мінімально комплементарні», якщо вони можуть гібридизуватися одна з іншої зі стабільністю, достатньої для того, щоб вони залишалися гібридізованими один з одним, щонайменше, у загальноприйнятих умовах « низької твердості». Подібним образом, молекули вказуються як 60 «комплементарні», якщо вони можуть гібридизуватися одна з іншої зі стабільністю, достатньої для того, щоб вони залишалися гібридізованими один 3 одним, щонайменше, у загальноприйнятих умовах « високої твердості».
Далі надані способи детектування присутності в зразку ДНК, відповідної до події ОР-073496- 4. В одному з варіантів здійснення спосіб включає (а) приведення біологічного зразка в контакт із полінуклеотидним зондом, який гібридизуєтся в жорстких умови гібридизації із ДНК із події
Вгазвзіса ОР-073496-4 і специфічно детектує подію ОР-073496-4; (Б) вплив на зразок і зонд жорстких умов гібридизації й (с) детектування гібридизації зонда із ДНК , де детектування гібридизації вказує на присутність події ОР-073496-4.
Для детектування специфічної ділянки ОР-073496-4 або її амплікона можна використовувати різні способи, включаючи в якості необмежуючих прикладів, аналіз генетичного біта (Мікіюгом, еї а!., (1994) Мисівіс Асій Нев. 22:4167-4175), у якому конструюють олігонуклеотид ДНК , який перекриває як прилягаючу фланкуючу послідовність ДНК, так і вбудовану послідовність ДНК .
Олігонуклеотид імобілізують у лунках планшета з мікролункамі. Після ПЛР ділянки інтересуючого (з використанням одного праймера із вбудованої послідовності й одного із прилягаючої фланкуючої послідовності) одноланцюговий продукт ПЛР може випалюватися з іммобілізованим олігонуклеотидом і служити в якості матриці для реакції продовження одної основи з використанням ДНК -полімерази й мічених ЯаМТР, специфічних у відношенні очікуваного наступної основи. Зчитування може бути флуоресцентним або заснованим на
ЕГІЗБА. Сигнал указує на наявність вставки/рфланкуючої послідовності через успішну ампліфікацію, гібридизацію й продовження на одну основа.
Інший спосіб детектування являє собою спосіб піросеквенування, як описано М/іпде, ((2000)
Іппом. РНапта. Тесп. 00:18-24). По даному способу конструюють олігонуклеотид, який перекриває як прилягаючу ДНК , так і сполучення із вбудованої ДНК . Олігонуклеотид відпалюють з одноланцюговим продуктом ПЛР із ділянки інтересуючого (один праймер із вбудованої послідовності й один із фланкуючої послідовності) і інкубують у присутності ДНК - полімерази, АТФ, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5-фосфосульфата й люциферину. аМТР додають індивідуально, і їхнє впровадження приводить до утвору свіфонвого сигналу, який вимірюють. Свіфонвий сигнал указує на присутність вставки трансгена/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації й
Зо продовження на одне або кілька основ.
Поляризація флуоресценції, описана Спеп, евї а!., (1999) Сепоте Вев. 9:492-498), також є способом, який можна використовувати для детектування амплікона по винаходу. По даному способу конструюють олігонуклеотид, який перекриває як прилягаючу ДНК,, так і сполучення із вбудованої ДНК . Олігонуклеотид отжигают з одноланцюговим продуктом ПЛР із ділянки інтересуючого (один праймер із вбудованої послідовності й один із фланкуючої послідовності) і інкубируют у присутності ДНК -полімерази й флуоресцентно мічених ЗаМТР. Продовження на одну основа приводить до вбудовування ЗаМТР. Вбудовування можна вимірювати як зміну поляризації з використанням флуориметра. Зміна поляризації вказує на присутність вставки трансгена/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації й продовження на одну основа.
Тадтапт (РЕ Арріїед Віозувіет5, Ров5іег Сйу, Саїй.) описаний як спосіб детектування й кількісного аналізу присутності послідовності ДНК , і він може бути повністю зрозумілий з інструкції, наданої виробником. У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд
ЕКЕТ, який перекриває сполучення фланкуючої й вбудованої ДНК . Зонд ЕКЕТ і праймери для
ПЛР (один праймер із вбудованої послідовності й один із фланкуючої геномной послідовності) піддають циклічної реакції в присутності термостабільної полімерази й аМТР. Гібридизація зонда ЕКЕТ приводить до розщеплення й вивільненню флуоресцентної складеної групи від складеної групи гасіння на зонді ЕКЕТ. Флуоресцентний сигнал указує на присутність вставки трансгена/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації й гібридизації.
Молекулярні бакени запропоновані для застосування при детектування послідовностей, як описано в Туаподі, еї аї., (1996) Маїшиге Віотесй. 14:303-308). У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, який перекриває сполучення фланкуючої й вбудованої ДНК .
Унікальна структура зонда ЕКЕТ забезпечує наявність у ньому вторинної структури, яка тримає флуоресцентну складену групу й складену групу гасіння в безпосередній близькості. Зонд ЕКЕТ і праймери для ПЛР (один праймер із вбудованої послідовності й один із фланкуючої послідовності) піддають циклічної реакції в присутності термостабільної полімерази й аМТР.
Після успішної ампліфікації ПЛР, гібридизація зонда ЕКЕТ з послідовністю-мішенню приводить до порушення вторинної структури зонда й просторовому поділу флуоресцентної складеної групи й складеної групи гасіння. Результатом цього є флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал указує на присутність фланкуючої/вбудованої трансгенной послідовності внаслідок успішної ампліфікації й гібридизації.
Реакція гібридизації з використанням зонда, специфічного відносно послідовності, що перебуває усередині амплікона, є ще одним способом, використовуваним для детектування амплікона, продуцируемого в реакції ПЛР.
Застосовуваний у даному документі термін «набір» відноситься до набору реагентів для мети проведення варіантів здійснення способу по винаходу, більш конкретно, для ідентифікації й/"або детектування події ЮОР-073496-4 у біологічних зразках. Набір за винаходом можна використовувати для цілей контролю якості (наприклад, чистоти партій насінь), детектування події ОР-073496-4 у рослинному матеріалі або матеріалі, що містить рослинний матеріал або, що відбувається з нього, наприклад, у якості необмежуючих прикладів, у харчових або кормових продуктах, а компоненти набору можуть специфічно підбиратися під ці цілі.
У конкретних варіантах здійснення надається набір для ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічному зразку. Набір включає перший і другий праймер, де перший і другий праймер ампліфікують полінуклеотид , що містить специфічну ділянку ЮР-073496-4. У додаткових варіантах здійснення набір також включає полінуклеотид для детектування специфічної ділянки
ОР-073496-4. Набір може включати, наприклад, перший праймер фрагмент, що містить, полінуклеотид ЗЕО ІЮ МО: 2, 3, 8, 9, або 10, де перший або другий праймер характеризується гомологією або комплементарностью по послідовності, достатньої для ампліфікації зазначеної специфічної ділянки ЮОР-073496-4. Наприклад, у специфічних варіантах здійснення перший праймер включає фрагменти полінуклеотиду 5ЕО ІЮ МО: 2 або 3, де перший або другий праймер характеризується гомологією або комплементарностью по послідовності, достатньої для ампліфікації зазначеної специфічної ділянки ОР-073496-4. В інших варіантах здійснення перший праймер включає фрагмент полінуклеотиду 5ЕО ІО МО: 8, і другий праймер включає фрагмент ЗЕО ІЮ МО: 9 або 10, де перший або другий праймер характеризуються гомологією або комплементарностью по послідовності, достатньої для ампліфікації зазначеної специфічної ділянки ОР-073496-4. Альтернативно, перша пара праймерів містить 5ЕО ІО МО:9 або її варіант або фрагмент, і другий праймер містить 5ЕО ІЮ МО: 8 або 10 або їх варіант або фрагмент. В інших варіантах здійснення пари праймерів може містити фрагмент 5ЕО ІЮО МО: 2 і фрагмент
Зо ЗЕО ІЮ МО: 3. Праймери можуть бути будь-якої довжини, достатньої для ампліфікації ділянки
ОР-073496-4, включаючи, наприклад, щонайменше 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 або 30 або приблизно 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 нуклеотидів або більш. Далі надані набори для детектування ДНК, що містять щонайменше один полінуклеотид , який може специфічно детектувати специфічну ділянку ОР-073496-4 або вставку ДНК ЮОР-073496-4, де зазначений полінуклеотид включає щонайменше одну молекулу ДНК із достатньою довжиною суміжних нуклеотидів, гомологічних або комплементарних у відношенні ЗЕО ІО МО: 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, або 27.
В одному з варіантів здійснення надається набір для ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічному зразку. Набір включає перший і другий праймер, де перший і другий праймер ампліфікують полінуклеотид , що містить специфічну ділянку ЮР-073496-4. У додаткових варіантах здійснення набір додатково містить полінуклеотид для детектування специфічної ділянки ЮОР-073496-4. Таким чином, в одному необмежуючому варіанті здійснення, перший праймер включає перший фрагмент 5ЕО ІО МО:11, і другий праймер включає другий фрагмент
ЗЕО ІЮО МО:11, де перший і другий праймери фланкують специфічну ділянку ОР-073496-4 і характеризуються гомологією або комплементарностью по послідовності, достатньої для ампліфікації зазначеної специфічної ділянки ОР-073496-4. Як такий, набір, таким чином, може включати перший праймер фрагмент, що містить, зЕО ІО МО:8, і другий праймер фрагмент, що містить, зХЕО ІЮ МО:9; або перший або другий праймер, що містить щонайменше 8 наступних один за одним полінуклеотидів з «ЕО ІЮ МО: 11; або перший або другий праймер, що містить
БО щонайменше 8 наступних один за одним полінуклеотидів з зБЕО ІЮ МО:8 або 9.
У додаткових варіантах здійснення надані способи детектування поліпептиду гліфосат-М- ацетилтрансферази, що включають аналіз тканин рослини Вгабззіса з використанням імунологічного аналізу із застосуванням специфічного антитіла або антитіл проти поліпептиду гліфосат-М-ацетилтрансферази. В інших варіантах здійснення надані способи детектування присутності полінуклеотида, що кодує поліпептид гліфосат-М-ацетилтрансферазу, і вони включають аналіз тканини рослини Вгабхзіса з використанням ампліфікації ПЛР. Крім того, надані набори для виконання таких способів.
Будь-які полінуклеотиди і їх фрагменти й варіанти, використовувані в способах і композиціях по винаходу, можуть характеризуватися ідентичністю послідовності відносно ділянки 60 трансгенной вставки події, що з'єднує послідовності події ОР-073496-4 або ділянки вставки в поєднанням з ділянкою фланкуючої послідовності події ОР-073496-4. Відомі способи визначення взаємини різних послідовностей. Застосовувана в даному документі «референсна послідовність» являє собою певну послідовність, застосовувану як основу для порівняння послідовностей. Референсна послідовність може бути підмножиною з певної послідовності або цілою певною послідовністю; наприклад, вона може представляти сегмент повноразмірної послідовності КДНК або гена, або повну послідовність КДНК або гена. Застосовуваний у даному документі термін «вікно порівняння» посилається на суміжний і певний сегмент полінуклеотидної послідовності, у якому полінуклеотидна послідовність у вікні порівняння може включати додавання або делеції ( тобто, пропуски) у порівнянні з референсною послідовністю (яка не включає додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох полінуклеотидів.
В основному, вікно порівняння становить щонайменше 20 суміжних нуклеотидів у довжину й необов'язково може становити 30, 40, 50, 100 нуклеотидів або більш. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що щоб уникнути високої подібності з референсною послідовністю внаслідок включення пропусків у полінуклеотидної послідовності, як правило, уводять штраф за пропуск і віднімають із числа збігів.
Способи вирівнювання послідовностей для їхнього порівняння добре відомі в даній галузі.
Таким чином, визначення процентної ідентичності послідовності між будь-якими двома послідовностями може виконуватися з використанням математичного алгоритму. Необмежуючі приклади таких математичних алгоритмів являють собою алгоритм Муєг5 апа МіШег, (1988)
САВІОБ5 4711-17; алгоритм локального вирівнювання Зтійй, еї а!., (1981) Аду. Аррі. Майн. 2:482; алгоритм глобального вирівнювання Мееадієтап апі УмМип5сі, (1970) 9У. Мої. Віої. 48:443-453; спосіб пошуку локального вирівнювання Реагзоп апа Гіртап, (1988) Ргос. Май. Асай. 5бі. 85:2444-2448; алгоритм Капіп ап АййвсНш, (1990) Рос. Май). Асай. З5сі. ОБА 872264, модифікований Каїіїйп апа Айї5спиї, (1993) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90:5873-5877.
Комп'ютерні реалізації цих математичних алгоритмів можуть використовуватися для порівняння послідовностей з метою визначення ідентичності послідовності. Такі реалізації як необмежуючі приклади включають: СГ О5ТАЇ у програмі РС/зепе (доступна від Іпіеїйїдепеїїсв5,
Моипіаійп Міем", СаїІШогпіа); програму АСОМ (Мегвзіоп 2,0) і ЗАР, ВЕЗТРЇІТ, ВІ А5Т, ЕА5ЗТА і
ТЕАЗТА в СО УМі5сопзіп Сепеїйс5 5оймаге РасКаде, Мегвіоп 10 (доступний від Ассеїгув Іпс.,
Зо 9685 Бсгапіоп Коай, Зап Оіедо, Саїйогпіа, ОБА). Вирівнювання з використанням цих програм можна проводити, застосовуючи параметри за замовчуванням. Програма СГ О5ТАЇ добре описана Ніддіп5, еї аі!., (1988) Сепе 73:237-244 (1988); Ніддіпве, єї а!., (1989) САВІО5 5:151-153;
Согреї, еї а!., (1988) Мисієїс Асій5 Нез. 16:10881-90; Ниапа, єї аї., (1992) САВІО5 8:155-65 і
Реаїгзоп, вї а!., (1994) Мей. Мої. Віої. 24:307-331. Програма АГІСМ заснована на алгоритмі Муегв5 апа мійег, (1988) вище. Таблицю ваг залишків РАМ120, штраф за продовження пропуску 12 і штраф за пропуск 4 можна використовувати для програмі АГІСМ при порівнянні амінокислотних послідовностей. Програмі ВГАБ5Т від Айбепиї, еї аїІ., (1990) У. Мої. ВіоїЇ. 215:403 засновані на алгоритмі Кагіїп апа Айб5спиІ, (1990) вище. Нуклеотидні пошуки ВГА5БТ можна проводити програмою ВІАБТМ, коефіцієнт - 100, довжина слова - 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидної послідовності, що кодує білок по винаходу. Білкові пошуки ВГА5Т можна проводити програмою ВІ АЗТХ, коефіцієнт - 50, довжина слова - 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду по винаходу.
Для одержання вирівнювань із пропускамі з метою порівняння можна використовувати сСаррей
ВІАЗТ (в ВІАБЗТ 2.0), як описано в АйЙбспиі, еї аїЇ.,, (1997) Мисієвїс Асій5 Ке5. 25:3389.
Альтернативно, РБІ-ВІ АТ (в ВГАБ5Т 2.0) можна використовувати для проведення ітеративного пошуку, що виявляє віддалені взаємини між молекуламі. Див., Ай5СпиЇї, еї аї., (1997) вище. При використанні ВГАБТ, Саррей ВІАБТ, РБІ-ВГА5Т можна використовувати параметри за замовчуванням відповідних програм (наприклад, ВГАЗТМ для нуклеотидних послідовностей,
ВГА5ТХ для білків). Див. м/млму/.пебрі.піт.піп.дом. Вирівнювання також можна проводити вручну шляхом перегляду.
Якщо не зазначене інше, значення ідентичності/подібності послідовності, надані в даному документі, відносяться до значення, отриманого з використанням САР версії 10 з використанням наступних параметрів: 95 ідентичності й 95 подібності для нуклеотидної послідовності з використанням ваги пропуску 50 і ваги довжини 3, і оцінної матриці пмуздарапа.стр; 95 ідентичності й 95 подібності для амінокислотної послідовності з використанням ваги пропуску 8 і ваги довжини 2, і оцінної матриці ВОБИОМб62, або з використанням будь-якого еквівалента даної програмі. Під « еквівалентною програмою» мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовностей, яка генерує для будь-яких двох інтересуючих послідовностей вирівнювання, що містить збіг ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків і процентної ідентичності послідовності, при порівнянні з відповідним вирівнюванням за допомогою САР версії 10.
В САР застосовується алгоритм МеєаІетап апа УМипзсй, (1970) 9. Мої. Віо!І. 48:443-453, для пошуку вирівнювання двох повноразмірних послідовностей, у якому доведено до максимуму число збігів і до мінімуму число пропусків. ЗАР ураховує всі можливі положення вирівнювання й пропуску й створює вирівнювання з максимальним числом співпадаючих основ і з мінімальним числом пропусків. Це забезпечується наданням штрафу за створення пропуску й штрафу за продовження пропуску в одиницях співпадаючих основ. (ЗАР повинен додавати коефіцієнт за кожне число збігів штрафів за створення пропуску для кожного пропуску, що вбудовується.
Якщо обраний штраф за продовження пропуску перевищує нуль, САР, крім того, повинен додавати коефіцієнт за кожний пропуск, убудований по довжині пропуску з його початку.
Значення за замовчуванням штрафу за створення пропуску й штрафу за продовження пропуску у версії 10 СО УМібсопзіп Сепеїїс5 Зоймаге РасКаде для білкових послідовностей рівні 8 і 2, відповідно. Для нуклеотидних послідовності штраф за створення пропуску за замовчуванням рівний 50, тоді як штраф за продовження пропуску за замовчуванням рівний 3. Штрафи за створення пропуску й продовження пропуску можна виражати як ціле число, обране із групи цілих чисел, що полягає від 0 до 200. Таким чином, наприклад, штрафи за створення пропуску й продовження пропуску можуть становити 0, 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 або більш.
САР є одним із представників групи кращих програм для вирівнювання. У цій групі може бути багато представників, але жоден з них не характеризується кращою якістю. ЗАР проявляє чотири ознаки добротності вирівнювання: Якість, Відношення, Ідентичність і Подібність. Якість являє собою метрику, доведену до максимуму при вирівнюванні послідовностей. Відношення являє собою Якість, розділене на число основ більш короткого сегмента. Процентна
Ідентичність являє собою відсоток символів, які дійсно збігаються. Процентна Подібність являє собою відсоток символів, які подібні. Символи, що лежать напроти пропусків, ігноруються.
Подібність налічується, коли значення оцінної матриці для пари символів перевищує або рівно 0,50, що є порогом подібності. Оцінна матриця, застосовувана у версії 10 Со М/ізсопвіп
Сепеїійс5 ЗБоймаге РасКкаде, являє собою ВІ О5ИМб2 (див., Непікоїї апа Непікоїї, (1989) Ргос.
Зо Майї. Асад. сі. ОБА 89:10915).
Застосовуваний у даному документі термін «ідентичність послідовності» або «ідентичність» у відношенні двох полінуклеотидів або поліпептидних послідовностей посилається на залишки у двох послідовностях, які збігаються при вирівнюванні на максимальну відповідність у межах установленого вікна порівняння. Коли процентну ідентичність послідовностей використовують по відношенню к білкам, установлене, що положення залишків, які не ідентичні, часто відрізняються консервативними амінокислотними замінамі, де амінокислотні залишки заміщені іншими амінокислотними залишкамі з подібними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобность) і, таким чином, не міняють функціональних властивостей молекули. Коли послідовності відрізняються консервативними замінамі, процентна ідентичність послідовності може підвищуватися для корекції консервативної природи заміни. Послідовності, які відрізняються такими консервативними замінамі, зазначені, що як володіючи «подібністю послідовності» або «подібністю». Засоби для такого настроювання добре відомі фахівцям у даній галузі. Як правило, вони використовують облік для консервативних замін, як часткове, а не повна невідповідність, з підвищенням у такий спосіб процентної ідентичності послідовності.
Таким чином, наприклад, там де ідентична амінокислота одержує коефіцієнт 1, і неконсервативна заміна одержує коефіцієнт що дорівнює нулю, консервативна заміна одержує коефіцієнт між нулем і 1. Підрахунок коефіцієнтів консервативних замін розраховується, наприклад, за допомогою реалізації в програмі РС/ЗЕМЕ (ІпіеїйПдепеїйіс5, Моипіаійп Міем/,
Саїїотіа).
Застосовуваний у даному документі термін «процентна ідентичність послідовностей» представляє значення, обумовлене порівнянням двох оптимально вирівняних послідовності за допомогою вікна порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто, пропуски) у порівнянні з референсной послідовністю (яка не містить додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей.
Процентну частку обчислюють визначенням числа положень, у яких має місце ідентична основа нуклеїнової кислоти або ідентичний амінокислотний залишок в обох послідовностях з одержанням числа співпадаючих положень, ділячи число співпадаючих положень на загальне число положень у вікні порівняння й множачи результат на 100 з одержанням процентної частки ідентичності послідовності.
Даний винахід відноситься до способів контролю бур'янів на оброблюваних землях, запобігання розвитку або появи на оброблюваних землях бур'янів, стійких до гербіциду, продукції культури й підвищення безпеки. Термін «контроль» і його похідні, наприклад, як «контроль бур'янів» відноситься до одного або декільком з інгібування росту, дозрівання, розмноження й/або поширення й/або зі знищення, видалення, руйнування або іншого способу зменшення зустрічальності й/або активності бур'яну.
Застосовуваний у даному документі термін «оброблювані землі» включає будь-яку ділянку, у якій їсти намір вирощувати рослину. Такі оброблювані землі як необмежуючі приклади включають поле, на якому культивується рослина (наприклад, нива, застава, поле з деревамі, керований ліс, поле для культивування фруктів і овочів, і т.д.), теплицю, вегетаційну камеру, і т.д.
Способи за винаходом включають засаджування оброблюваних земель насіннями або рослинамі Вгаззіса ОР-073496-4 і, у конкретних варіантах здійснення, нанесення на культуру, насіння, бур'яни або на оброблювані землі ефективної кількості інтересуючого гербіциду .
Установлене, що гербіцид може наноситися до або після посадки культури на оброблювані землі. Такі нанесення гербіциду можуть включати нанесення гліфосату.
В одному з варіантів здійснення спосіб контролю бур'янів включає посадку на землі насінь або рослин Вгаззіса ОР-073496-4 і на нанесення на культуру, частину культивуємих рослин, насіння зазначеної культури або на оброблювані землі з даною культурою ефективної кількості гербіциду, де зазначене ефективна кількість включає кількість, яка не переноситься другою контрольною культурою при нанесенні на другу культуру, частину культивуємих рослин, насіння зазначеної культури або на оброблювані землі з даною культурою, де зазначена друга контрольна культура не експресує полінуклеотид СІ МАТ.
В іншому варіанті здійснення спосіб контролю бур'янів включає посадку на землі насінь або рослин Вгазвзіса ОР-073496-4 і на нанесення на культуру, частину культивуємих рослин, насіння зазначеної культури або на оброблювані землі з даною культурою ефективної кількості гербіциду гліфосату, де зазначене ефективна кількість включає рівень, який перебуває вище рекомендованого етикеткою рівня застосування в даній культурі, де зазначене ефективна кількість переноситься при нанесенні на культуру Вгаззіса ОР-073496-4, частина культивуємих
Зо рослин, насіння або на оброблювані землі с даною культурою. «Контроль» або «контрольна рослина» або «клітина контрольної рослини» надає референсную точку для виміру змін фенотипу випробуваної рослини або рослинної клітини, і може являти собою будь-яка підходящу рослину або рослинну клітину. Контрольна рослина або рослинна клітина може включати, наприклад: (а) рослину або клітину дикого типу, тобто, того ж генотипу, що й вихідний матеріал для генетичних змін, які привели до утвору випробуваної рослини або клітини; (Б) рослину або клітину того ж генотипу, що й вихідний матеріал, але трансформовану нульовою конструкцією ( тобто, конструкцією, яка не виявляє відомої дії на інтересуючу ознаку, наприклад, конструкцією утримуючою маркерний ген); (с) рослину або рослинну клітину, яка не трансформована і є результатом розщеплення потомства випробуваної рослини або рослинної клітини; (4) рослину або рослинну клітину, яка генетично ідентична випробуваній рослині, але не піддана тієї ж обробці (наприклад, обробці гербіцидом), як випробувана рослина або рослинна клітина; (є) сама випробувана рослина або рослинна клітина в умовах, у яких не експресується інтересуючий ген, або (ї) сама випробувана рослина або рослинна клітина в умовах, у яких воно не піддане конкретній обробці, такий як, наприклад, обробці гербіцидом або поєднанням гербіцидів і/або інших хімікатів. У деяких випадках контрольна підходяча рослина або контрольна рослинна клітина може мати відмінний від випробуваної рослини або рослинної клітини генотип, але може мати подібні властивості чутливості до гербіциду вихідного матеріалу, підданому генетичному(-им) зміні(-ам), результатом чого стала випробувана рослина або клітина (див., наприклад, Сгееп, (1998) М/еєйд
Тесппоіоду 12:474-477; ОСгееп і Огісп, (1993) Ууеей Бсієпсе 41:508-516). В інших варіантах здійснення як контролю можна використовувати нульовий результат розщеплення, оскільки такі рослини є генетично ідентичними у відношенні ОР-073496-4 за винятком наявності трансгенної вставки ДНК.
Класифікація гербіцидів (тобто, угруповання гербіцидів на класи й підкласи) добре відома в даній галузі й включає класифікацію НКАС (Негбісіде Кезізіапсе Асіоп Соттіеє) і МУЗА (МУєед Ббсіепсе Зосієїу ої Атегіса) (див. також, Кеїгіпдег апа МаїйЙогу-бтіїй, (1997) М/єей
Тесппооду 11:384-393). Скорочена версія класифікації НКАС (із заміткамі щодо відповідних груп М/55А) наведена нижче в таблиці 1.
Гербіциди можуть класифікуватися по їхньому способу дії й/або місцю дії й також можуть 60 класифікуватися за часом, коли їх наносять (наприклад, предвсходові або післевсходові), по способу нанесення (наприклад, нанесення на листи або нанесення на грунт) або по тому, як вони засвоюються або впливають на рослину. Наприклад, тифенсульфурон-метил і трибенурон-метил наносяться на листя культури, і в основному, метаболізуються там, тоді як римсульфурон і хлоримурон-етил, в основному, засвоюються через коріння й листя рослини. «Спосіб дії», загалом, відноситься до метаболічному або фізіологічному процесу усередині рослини, який інгібується або інакше послабляється гербіцидом, тоді як «місце дії», загалом, відноситься до фізичного розташування або біохімічної ділянки в рослині, де діє або безпосередньо взаємодіє гербіцид. Гербіциди можуть класифікуватися різними способамі, включаючи спосіб дії й/або місце дії (див., наприклад, таблицю 1).
Часто ген стійкості до гербіциду, який забезпечує стійкість до конкретного гербіциду або іншому хімічної речовини в експресуючим його рослині, також забезпечує стійкість до інших гербіцидів або хімічних речовин того ж класу або підкласу, наприклад, класу або підкласу, наведеного в таблиці 1. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу трансгенна рослина за винаходом стійка більш ніж до одного гербіциду або хімічній речовині того ж класу або підкласу, такому як, наприклад, інгібітор РРО, сульфонілсечовина або синтетичний ауксин.
Як правило, рослини по даному винаходу можуть переносити обробку різними типамі гербіцидів ( тобто, гербіцидів, що мають різні способи дії й/або різні ділянки дії), а також більш високими кількостями гербіцидів, у порівнянні з раніше відомими рослинамі, із забезпеченням за рахунок цього поліпшених стратегій керування бур'янамі, які рекомендуються для зниження появи й переваги стійких до гербіциду бур'янів. Конкретні поєднанням гербіцидів можуть використовуватися для ефективного контролю бур'янів.
Таким чином, винахід надає трансгенна рослина Вгаззіса, яке можна вибирати для застосування у виробництві сільськогосподарських культур, заснованому на перевазі в галузі, де планується вирощувати трансгенну культуру, стійких до гербіцидів бур'янів. У даній галузі відомі способи оцінки стійкості до гербіцидів різних видів бур'янів. У даній галузі також відомі способи керування бур'янамі, такі як, наприклад, ротація культур з використанням культури, стійкої до гербіциду, до якого не стійкі місцеві види бур'янів. Ряд організацій займаються моніторингом і повідомляють громадськість про зустрічальність і характеристики стійких до гербіцидів бур'янів, у тому числі Негрісіде Кезісїапсе Асіоп Соттйее (НКАС), УУеей Зсієепсе
Зо зБосієїу ої Атегіса і різні державні агентства (див., наприклад, коефіцієнти стійкості до гербіцидів різних широколистих бур'янів від 2004 ПШіпої5 Адгісикига! Ре5ї Мападетепі Напабоок), і фахівець у даній галузі може застосовувати дану інформацію для визначення комбінацій культур і гербіцидів, які слід використовувати в конкретній місцевості.
Ці організації також публікують ради й керівництва для запобігання розвитку й/або появи стійких до гербіцидів бур'янів і контролю їх поширення (див., наприклад, Ожмеп апа Нагілієг, (2004), 2005 Негбісіде Мапиаї! тог Адгісийига! Ргоїезвіопаіє, Рир. М/С 92 Вемізед (Юма з5іаїе
Опімегтезйу Ехіепвзіоп, суха 5іаїе Опімегейу ої Зсіеєпсе апа Тесппоіоду, Атев, Ісула); М/еєй Сопігої! ог бот, Вгавзвзісаз, апа богапит, СПарієї 2" "2004 Шіпої5 Адгісинкига! Реб5і Мападетепі
Напароок" (Опімегтейу ої ПШіпої Ехіепзіоп, Опімегейу ої Шіпоїз аї Ограпа-Спатраїйдп, ПШіпоів); М/еєа
Сопіої Сціде бог Ріє Сторв, МБО Ехіепвіоп ВиїІейп Е434 (Міспідап 5іаїе Опімегейу, Еаві І апвіпод,
Міспідап)).
Таблиця 1
Скорочена версія класифікації гербіцидів НКАС
І. Інгібітори АГ 5 (група 2 МУ55А)
А. Сульфонілсечовини 1. Азимсульфурон 2. Хлоримурон-етил 3. Метсульфурон-метил 4. Никосульфурон 5. Римсульфурон 6. Сульфометурон-метил 7. Трифенсульфурон-метил 8. Трибенурон-метил 9. Амідосульфурон 10. Бенсульфурон-метил 11. Хлорсульфурон 12. Циносульфурон 13. Циклосульфамурон
14. Етаметсульфурон-метил 15. Етоксисульфурон; 16. Флазасульфурон 17. Флупірсульфурон-метил 18. Форамсульфурон 19. Імазосульфурон 20. Йодосульфурон-метил 21. Мезосульфурон-метил 22. Оксасульфурон 23. Примисульфурон-метил 24. Просульфурон 25. Піразосульфурон-етил 26. Сульфосульфурон 27. Тріазосульфурон 28. Трифлоксисульфурон 29. Трифлусульфурон-метил 30. Тритосульфурон 31. Галосульфурон-метил 32. Флуцетосульфурон
В. Сульфоніламінокарбонілтріазолінони 1. Флукарбазон 2. Прокарбазон
С. Тріазолопіримідини 1. Клорансулам-метил 2. Флуметсулам 3. Диклосулам 4. Флорасулам 5. Метосулам 6. Пеноксулам 7. Піроксулам р. Піримідинілокси(тіо)бензоати 1. Біспірибак 2. Пірифталид 3. Пірибензоксим 4. Піритіобак 5. Піриминобак-метил
Е. Імідазолінони 1. Імазапір 2. |Імазетапір 3. Імазаквін 4. Імазапик 5. Імазаметабенз-метил 6. Імазамокс
ІІ. Інші гербіциди - активні інгредієнти/Додаткови способи дії
А. Інгібітори ацетил-СоА-карбоксилази (АССази) (група 1 М/У55А) 1. Арилоксифеноксипропіонати («ЕОР») а. Квизалофоп-Р-етил р. Диклофоп-метил с. Клодинафоп-пропаргил а. Феноксапроп-Р-етил е. Флуазифоп-Р-бутил
Ї. Пропаквизафоп 9. Галоксифоп-Р-метил п. Цигалофоп-бутил і. Квизалофоп-Р-Етил 2. Циклогександіони («ОІМ») а. Аллоксидим р. Бутроксидим с. Клетодим а. Циклоксидим е. Сетоксидим
Ї. Тепралоксидим 9. Тралкоксидим
В. Інгібітори фотосистеми ІІ - група С1 НЕКАС/група 5 МУ55ЗА 1. Тріазини а. Аметрин р. Атразин с. Ціаназин а. Десметрин е. Диметаметрин
Ї. Прометон 9. Прометрин
А. Пропазин і. Симазин; . Симетрин
К. Тербуметон;
Ї. Тербутилазин т. Тербутрин п. Триетазин 2. Тріазинони а. Гексазинон р. Метрибузин с. Метамітрон 3. Тріазолінон а. Амікарбазон 4. Урацили а. Бромацил р. Ленацил с. Тербацил 5. Піридазинони а. Піразон 6. Фенілкарбамати а. Десмедифам
Б. Фенмедифам
С. Інгібітори фотосистеми ІІ - Група С2 НКАС/Група 7 М/І55А 1. Сечовини а. Флуометурон р. Лінурон с. Хлорбромурон а. Хлортолурон е. Хлорксурон
Її. Димефурон 9. Діурон п. Етидимурон і. Фенурон ). Ізопротурон
К. Ізоурон
Ї. Метабензтіазурон т. Метобромурон п. Метоксурон о. Монолинурон р. Небурон а. Сидурон г. Тебутіурон 2. Аміди а. Пропаніл р. Пентанохлор р. Інгібітори фотосистеми ІІ - Група 33 НКАС/Група 6 М/У55А 1. Нітрили а. Бромфеноксим р. Бромоксиніл с. Бромоксиніл 2. Бензотіадіазинон (Бентазон) а. Бентазон 3. Фенілпіридазини а. Піридат р. Піридафол
Е. Фотосистема-! - відвід електрона (біпіридиліуми) (Група УУЗБА 22) 1. Дикват 2. Паракват
ЕР. Інгібітори РРО (протопорфіриногеноксидази) (Група 14 МУЗА) 1. Дифенілефири а. Ацифлуорфен-Ма р. Біфенокс с. Хлометоксифен а. Фторглікофен-етил е. Фомесафен
Ї. Галосафен 9. Лактофен п. Оксифлуорфен 2. Фенілпразоли а. Флуазолат р. Пірафлуфен-етил 3. М-Фенілфталіміди а. Цинидон-етил р. Флуміоксазин с. Флумиклорак-пентил 4. Тіадіазоли а. Флутіацет-метил р. Тидіазимн 5. Оксадіазоли а. Оксадіазон р. Оксадіаргил 6. Тріазолінони а. Карфентразон-етил р. Сульфентразон 7. Оксазолидиндіони а. Пентоксазон 8. Піримідиндіони а. Бензфендізон р. Бутафеницил 9. Інші а. Піразогил р. Профлуазол б. Знебарвлення: інгібування біосинтезу каротиноїдів на стадії фітоіндесатурази (РОБ) (Група 12 УУ55А) 1. Піридазинони а. Норфлуразон 2. Піридинкарбоксаміди а. Дифлуфеникан р. Піколинафен
З. Інші а. Бефлубутамід р. Флуридон с. Флурохлоридон а. Флуртамон
Н. Знебарвлення: інгібування
4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази (4-НРРО) (Група 28 М/З5А) 1. Трикетони а. Мезотріон р. Сулькотріон с. Топремезон а. Темторіон 2. Ізоксазоли а. Ізоксахлортол р. Ізоксафлутол
З. Піразоли а. Бензофенап р. Піразоксифен с. Піразолінат 4. Інші а. Бензобіциклон
І. Знебарвлення: інгібування біосинтезу каротиноїдів (невідома мішень) (Групи 11 і 13 МУ/55А) 1. Тріазоли (Група 11 МУ55А) а. Амітрол 2. Ізоксазолідинони (Група 13 М/55А) а. Кломазон 3. Сечовини а. Флуометурон 3. Дифенілефир а. Аклонифен
У. Інгібування ЕРОР-Синтази 1. Гліцини (Група 9 М/55А) а. Гліфосат р. Сульфосат
К. Інгібування глутамінсинтетази 1. Фосфінові кислоти а. Глуфосинат-амоній р. Біалафос
Г. Інгібування ОНР (дигідроптероат)синтази (Група 18 МУ55А) 1 Карбамати а. Азулам
М. Інгібування складання мікротрубочок (Група З МУЗ5А) 1. Динітроаніліни а. Бенфлуралін р. Бутралін с. Динтрамін а. Еталфлуралін е. Оризалін
Ї. Пендиметалін 9. Трифлуралін 2. Фосфороамідати а. Ампрофос-метил
Б. Бутаміфос
З. Піридини а. Дитіопір р. Тіазопір 4. Бензаміди а. Пронамід р. Тебутам 5. Бензолдикарбонові кислоти а. Хлортал-Диметил
М. Інгібування мітозу/організації мікротрубочок (Група 23 УУ55А) 1. Карбамати а. Хлорпрофам р. Профам с. Карбетамід
О. Інгібування розподілу клітин (Інгібування синтезу жирних кислот з дуже довгим ланцюгом, як передбачуваний механізм; група 15 М/55А) 1. Хлорацетаміди а. Ацетохлор р. Алахлор с. Бутахлор а. Диметахлор е. Диметанамід
Ї. Метазахлор 9. Метолахлор п. Петоксамід і. Претилахлор )Ї. Пропахлор
К. Пропізохлор
І. Тенилхлор 2. Ацетаміди а. Дифенамід р. Напропамід с. Напроанілид 3. Оксіацетаміди а. Флуфенацет р. Мефенацет 4. Тетразолінони а. Фентразамід 5. Інші а. Анілофос р. Кафенистрол с. Інданофан а. Піперофос
Р. Інгібування синтезу клітинної стінки (целюлози) 1. Нітрили (Група 20 МУЗ5А) а. Диклобенил р. Хлортіамід 2. Бензаміди (ізоксабен (Група 21 М/55А)) а. Ізоксабен 3. Тріазолокарбоксаміди (флупоксам) а. Флупоксам
О. Росполучення (руйнування мембрани) (Група 24 МУЗ5А) 1. Динітрофеноли а. ОМОС р. Диносеб с. Динотерб
Е. Інгібування синтезу ліпідів, відмінне від інгібування АСС 1. Тіокарбамати (Група 8 МУУ55А) а. Бутилат р. Циклоат с. Димепіперат й. ЕРТО е. Еспрокарб
Ї. Молінат 9. Орбенкарб
Р. Пебулат і. Просульфокарб . Бентіокарб
К. Тіокарбазил
І. Тріаллат т. Вернолат 2. Фосфородитіоати а. Бенсулид 3. Бензофурани а. Бенфуресат р. Етофумесат 4. Галогеновані алканові кислоти (Група 26 М/55А) а ТСА р. Даларон с. Флурпропанат 5. Синтетичні ауксини ( Іаа-Подібні) (Група 4 МУ55А) 1. Феноксикарбонові кислоти а. Кломепроп р. 2,4-0 с. Мекопроп 2. Бензойні кислоти а. Дікамба р. Хлорамбен с. ТВА 3. Піридинкарбонові кислоти а. Клопіралід р. Флуроксипір с. Піклорам а. Трициклопір 4. Хінолінкарбонові кислоти а. Хінклорак р. Хінмерак 5. Інші ( беназолін-етил) а. Беназолін-етил
Т. Інгібування транспорту ауксину 1. Фталамати; семикарбазони (Група 19 МУЗА) а. Напталам р. Дифлуфензопір-Ма
ЦО. Інші механізми дії 1. Ариламінопропіонові кислоти а.Флампроп-М-метил І-ізопропіл 2. Піразоліум а. Дифензокват 3. Арсенорганічні сполучення а. ОБМА р. М5МА 4. Інші а. Бромбутид р. Цинметилн с. Кумилурон а. Дазомет е. Даїмурон-метил
І. Димурон 9д. Етобензанід п. Фосамін і. Позначкам . Оксазикломефон
К. Олеїнова кислота
І. Пеларгонова кислота т. Пірибутикарб
У деяких способах гліфосат, окремо або в поєднанням з іншим гербіцидом інтересуючого, може наноситися на рослини Вгаззіса ЮР-073496-4 або на оброблені землі, де вони культивуються. Необмежуючі приклади препаратів гліфосату наведено в таблиці 2. У конкретних варіантах здійснення гліфосат перебуває у формі солі, такий як, сіль амонію, ізопропіламонія, калію, натрію (включаючи полуторанатрієвую сіль) або у вигляді тримезіума (альтернативно називається сульфосат).
Таблиця 2
Порівняння препаратів гліфосату
Гербіцид по Активний) Кислотний Н | Кислотний й й й й анесення: й зареєстрованому Виробник Сіль інгредієнті| еквівалент ниїй/ак еквіваленті товарному знакові нагалон нагалон | УНЦ р на акр
Вошпашр Огідіпа! 0,750
Вошпаир Огідіпа Ш/Мопзапіо (Ізопропламн| 4 / 3 | 32 | 0,750
Вошпдир Ойгатах 0,748
УМеашетптах
Тоиспаомл 00 бЗупоєпіа 00 |Діамонй | 37 | 3 | 32 | 0750
Тоиспдомлп Ніїесп 0,781
Тоиспдомлп Тоїа! 0,782 бом й й
Адгозсівєпсев5
Адгозсівєпсев5 дгозсіепсевз
Сіу біагОгідіпа! ІАїІрацоі/Адиі бапізопропіламін! 401031 32 | 0,750 сіу-Ніо 0,750 0,750
Сгедії Ехіга 0,750
Ізопропіламін
Стєдії ОПО Митагт ня 4 З 32 0,750 моноаммоний
Ізопропіламін
СтедіїОцо Ехіга |Миїагтт ня 4 З 32 0,750 моноаммоний
Ехіга Стеай 5 0,748 0,750
Сотегвіопе Рів 0,750 0,750
Сіуюв Х-ТВА 0,750
Вашег 0,750
Вашег Рів 0,750 0,750 0,750
Гліфосат4196 |Неїт Адго ЮБА 0,750 0,750 0,750 0,750
Нопсно Рій 0,750
Продовження таблиці 2
Сваюшя вдо ОО (нопроілнін! 40932 ол
СіІвагоцші 41 Ізопропіламін 4 З 32 0,750
Ргодисів
Ргодисів
Огідіпа!
Таким чином, у деяких варіантах здійснення трансгенна рослина за винаходом використовують у способі вирощування культури Вгаззіса ОР-073496-4 шляхом нанесення гербіцидів, до яких ця рослина стійка. Таким чином, описана обробка поєднанням одного або декількох гербіцидів, які в якості необмежуючих прикладів включають: ацетохлор, адифлуорфен і його натрієву сіль, аклонифен, акролеїн ( 2-пропенал), алахлор, аллоксидим, аметрин, амікарбазон, амідосульфурон, амінопіралид, амітрол, сульфамат амонію, анілофос, асулам, атразин, азимсульфурон, бефлубутамід, беназолін, беназолін-етил, бенкарбазон, бенфлуралін, бенфуресат, бенсульфурон-метил, бенсулид, бентазон, бензобіциклон, бензофенап, біфенокс, біланафос, біспірибак і його натрієву сіль, бромацил, бромобутид, бромофеноксим, бромоксиніл, октаноат бромоксинілу, бутахлор, бутафенацил, бутаміфос, бутралин, бутроксидим, бутилат, кафенстрол, карбетамід, карфентразон-етил, катехин, хлометоксифен, хлорамбен, хлорбромурон, хлорфлуренол-метил, хлоридазон, хлоримурон-етил, хлортолурон, хлорпрофам, хлорсульфурон, хлортал-диметил, хлортіамід, цинидон-етил, цинметилин, циносульфурон, клетодим, клодинафоп-пропаргил, кломазон, кломепроп, клопіралид, клопіралид-оламін, клорансулам-метил, СОН-35 (2-метоксиетил-2-|(4-хлор-2г-фтор-5-(1-метил- 2-пропініл)уокси|феніл)|(3-фторбензоиїл)аміно|карбоніл|-1-циклогексен-1-карбоксилат), кумилурон, ціаназин, циклоат, циклосулфамурон, циклоксидим, цигалофоп-бутил, 2,4-О і його бутотиловий, бутиловий, ізоктиловий і ізопропіловий складні ефіри і його солі диметиламонія, діоламіну й троламіну, даймурон, далапон, далапон-натрій, дазомет, 2,4-ОВ і його солі диметиламонія, калію й натрію, десмедифам, деспетрин, дікамба і її солі дигликольаммония, диметиламмония, калію й натрію, диклобеніл, дихлорпроп, диклофоп-метил, диклосулам, дифензокват метилсульфат, дифлуфеникан, дифлуфензопір, димефурон, димепіперат, диметахлор, диметаметрин, диметенамід, диметанамід-Р, диметипін, диметиларсинову кислоту і її натрієву сіль, динітрамін, динотерб, дифенамід, дикват дибромід, дитіопір, діурон, ОМОС, ендотал, ЕРТС, еспрокарб, еталфлуралин, етаметсульфурон-метил, етофумезат, етоксифен, етоксисульфурон, етобензанід, феноксапроп-етил, феноксапроп-Р-етил, фентразамід, фенурон, фенурон-ТСА, флампроп-метил, флампроп-М-ізопропіл, флампроп-М-метил, флазасульфурон, флорасулам, флуазифоп-бутил, флуазифоп-Р-бутил, флукарбазон,
Зо флуцетосульфурон, флухлоралін, флуфенацет, флуфенпір, флуфенпір-етил, флуметсулам, флумиклорак-пентил, флуміоксазин, флуометурон, фторглікофен-етил, флупірсульфурон- метил і його натрієву сіль, флуренол, флуренол-бутил, флуридон, флурохлоридон, флуроксипір, флуртамон, флутіацет-метил, фомесафен, форамсульфурон, фосамін-амоній, глуфосинат, глуфосинат-амоній, гліфосат і його солі, такі як солі амонію, ізопропіламонія, калію, натрію (включаючи полуторанатрієву сіль) і тримезія (альтернативно названий сульфосат), галосульфурон-метил, галоксифоп-етотил, галоксифоп-метил, гексазинон, НОК-201 М-(2,4- дифторфеніл)-1,5-дигідро-М-(1-метилетил)-5-оксо-1-(тетрагідро-2Н-піран-2-іл)метил|)|-4Н-1,2,4- тріазол-4-карбоксамід), імазаметабенз-метил, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазаквін- амоній, імазетапір, імазетапір-амоній, імазосульфурон, інданофан, йодсульфурон-метил, іоксиніл, іоксиніл-октаноат, іоксинил-натрій, ізопротурон, ізоурон, ізоксабен, ізоксафлутол,ізоксахлортол, лактофен, ленацил, лінурон, малеїновий гідразид, МСРА і його солі (наприклад, МСРА-диметиламоній, МСРА-калій і МСРА-натрій, складні ефіри (наприклад,
МОРА-2-езтилгексил, МСРА-бутотил) і складні тіоефіри (наприклад, МСРА-тіоетил), МСРВ і його солі (наприклад, МСРВ-натрій) і складні ефіри (наприклад, МСРВ-етил), мекопроп, мекопроп-Р, мефенацет, мефлуїдид, мезосульфурон-метил, мезотріон, мета-натрій, метаміфоп, метамітрон, метазахлор, метабентіазурон, метиларсонову кислоту і її кальцієву, моноамонійну, мононатрієву й динатрієву солі, метилдимрон, метобензурон, метобромурон,
метолахлор, З-метолахлор, метозулам, метоксурон, метрибузин, метсульфурон-метил, молинат, монолинурон, напроанілид, напропамід, напталам, небурон, никосульфурон, нофлуразон, орбенкарб, оризалін, оксадіаргил, оксадіазон, оксасульфурон, оксацикломефон, оксифлуорфен, паракват дихлорид, пебулат, пеларгонову кислоту, пендиметалин, пенокссулам, пентанохлор, пентоксазон, перфлуїдон, петоксіамід, фенмедифам, піклорам, пікрорам-калій, піколнафен, піноксаден, піперофос, претилахлор, примисульфурон-метил, продіамін, профоксидим, прометон, прометрин, пропахлор, пропаніл, пропаквізафоп, пропазин, профам, пропізохлор, пропоксикарбазон, пропізамід, просульфокарб, просульфурон, піраклоніл, пірафлуфен-етил, пірасульфотол, піразогил, піразолінат, піразоксифен, піразосульфурон-етил, пірибензоксим, пірибутикарб, піридат, пірифталид, піриминобак-метил, піримисульфан, піритіобак, піритіобак-натрій, піроксулам, квінклорак, квінмерак, хінокламін, хінокламін, квизалофоп-етил, квизалофоп-Р-етил, квизалофоп-Р-тефурил, римсульфурон, сетоксидим, сидурон, симазин, симетрин, сулькотріон, сульфентразон, сульфометурон-метил, сульфосульфурон, 2,3,6-ТВА, ТСА, ТСА-натрій, тебутам, тебутіурон, тебурилтріон, темботріон, тепралоксидим, тербацил, тербуметон, тербутилазин, тербутрин, тенілхлор, тіазопір, тієнкарбазон, тифенсульфурон-метил, тіобенкарб, тіокарбазил, топрамезон, тралкоксидим, три- аллат, тріасульфурон, тріазифлам, трибенурон-метил, триклопір, триклопір-бутотил, триклопір- триетиламоній, тридифан, триетазин, трифлоксисульфурон, трифлуралин, трифлусульфурон- метил, тритосульфурон і вернолат.
У даній галузі відомі інші підходящі гербіциди й сільськогосподарські хімікати, такі як, наприклад, ті, що описані в УМО 2005/041654. Інші гербіциди також включають біогербіциди, такі як АМегпагіа дезігиеп5 Зіттоп5, СоїІефїгіснит діоеозрогіодез (Репг.) Реп. єї Засс., Огеспвієта топосегаз (МТВ-951), Мугоїпесійт метисаїпа (АїІрепіпі в Зспмвїіпії:) Ойтаг: Епез, РНуїорнійога ра!тімога (Ви) Вші. і Риссіпіа Іпіазрео5 ЗспиБб. Поєднанням різних гербіцидів можуть приводити до більшого, ніж просте додавання ( тобто, синергічної), дії на бур'яни, і/або меншому, ніж просте додавання, ( тобто, що зберігає) дії на культури або інші потрібні рослини. У деяких випадках поєднанням гліфосату з іншими гербіцидамі, що мають подібний спектр контролю, але відмінний спосіб дії будуть, зокрема, кращі для запобігання розвитку стійких бур'янів. Ефективні по гербіцидної дії кількості будь-якого конкретного гербіциду можуть легко визначатися
Зо фахівцем у даній галузі за допомогою простого експериментування.
Гербіциди можуть класифікуватися на групи й/або підгрупи, як описано вище в даному документі, з посиланням на спосіб їх дії, або вони можуть класифікуватися на групи й/або підгрупи відповідно до їхньої хімічної структури.
Сульфонамідні гербіциди мають істотну хімічну молекулярну структурну характеристику - складеною групою сульфонаміду (-5(0)2МН-). Як вказується в даному документі, сульфонамідні гербіциди, зокрема, включають сульфонілсечовині гербіциди, гербіциди на основі сульфоніламінокарбонілтріазолінону й гербіциди на основі тріазолопіримідину. У сульфонілсечовиних гербіцидах складена група сульфонаміду є компонентом у сульфонілсечовином містку (-5(0)2МНС(О)МН(К)-). У сульфонілсечовиних гербіцидах сульфонільний кінець сульфонілсечовиного містка зв'язаний безпосередньо або через атом кисню або необов'язково заміщену аміногрупу або метиленову групу, із циклічною або нециклічною групою, як правило, заміщеної. На протилежному кінці сульфонілсечовиного містка аміногрупа, яка може містити заступники, такі як метил (К являє собою СНз), замість водню, з'єднана о гетероциклічною групою, як правило, симетричним піримідиновим або тріазиновим кільцем, що містять один або два замісники, таких як метил, етил, трифторметил, метокси, етокси, метиламіно, диметиламіно, етиламіно й галогени. У гербіцидах на основі сульфоніламінокарбонілтріазолінону складова група сульфонаміду є компонентом сульфоніламінокарбонільного містка (-5(0)2МНО(О)-). У гербіцидах (на основі сульфоніламінокарбонілтріазолінону сульфонільний кінець сульфоніламінокарбонільного містка, як правило, з'єднаний із заміщеним фенільним кільцем. Із протилежного кінця сульфоніламінокарбонільного містка карбоніл з'єднаний з 1 положенням кільця тріазолінону, яке, як правило, заміщене групамі, такими як алкіл і алкокси. У гербіцидах на основі тріазолопіримідину сульфонільний кінець складеної групи сульфонаміду приєднаний до 2 положення заміщеної циклічної системи (|1,2,4Ітріазолопіримідину, а кінець із аміногрупою сульфонамідної складової групи приєднаний до заміщеної арильной, як правило, до фенільной групи, або, альтернативно, кінець із аміногрупою сульфонамідної складової групи приєднаний до 2 положення заміщеної циклічної системи (|1,2,4|тріазолопіримідину, а сульфонільний кінець сульфонамідної складової групи приєднаний до заміщеної арильної, як правило, піридинильної групи.
Способи додатково містять нанесення на культуру й бур'яни в поле достатньої кількості щонайменше одного гербіциду, до якого стійкі насіння або рослини культури, такого як, наприклад, гліфосат, інгібітор гідроксифенілпіруватдіоксигенази (наприклад, мезотріон або сулькотріон), інгібітор фітоіндесатурази (наприклад, дифлуфеникан), інгібітор синтезу пігменту, сульфонамід, імідазолінон, біалафос, фосфінотрицин, азафенидин, бутафенацил, сульфосат, глуфосинат, тріазолопіримідин, піримідинілокси(тіо)бензоат або сульфоніламінокарбонілтріазолінон, інгібітор ацетил-Со-А -карбоксилази, такий як квизалофоп-
Р-етил, синтетичний ауксин, такий як квінклорак, КІН-485 або інгібітор ргоїох, для контролю бур'янів без значного ушкодження сільськогосподарської культури.
В основному, ефективну кількість гербіциду, нанесеного на поле, досить для виборчого контролю бур'янів без значного впливу на культуру. «Бур'ян», як цей термін застосовують у даному документі, відноситься до рослини, яка небажана в конкретній місцевості. Навпаки, «сільськогосподарська культура», як цей термін застосовують у даному документі, відноситься до рослини, яка бажана в конкретній місцевості, такої як, наприклад, рослина Вгаззіса. Таким чином, у деяких варіантах здійснення рослина являє собою несільськогосподарську культуру або несільськогосподарський вид, тоді як у деяких варіантах здійснення бур'ян являє собою сільськогосподарський вид, який намагаються елімінувати з конкретної місцевості, такий як, наприклад, малоцінне й/або нетрансгенна рослина Вгаззіса на поле, засадженому Вгазвзіса з подією ОР-073496-4, або, що не є Вгаззіса сільськогосподарський вид у полі, засадженому ОР- 073496-4. Бур'яни можуть класифікуватися на дві більші групи: однодольні рослини й двочасткові рослини.
Багато видів рослин можуть контролюватися (тобто, знищуватися або ушкоджуватися) гербіцидамі, описуваними в даному документі. Таким чином, способи за винаходом придатні для контролю цих видів рослин там, де останні є небажаними ( тобто, де вони є бур'янамі). Ці види рослин включають сільськогосподарські культури, а також види, що звичайно вважаються бур'янамі, що включають у якості необмежуючих прикладів види, такі як: лисохвіст мишехвостий (Аіоресиги5 туозигоіде5), щетинник гігантський (Зеїагіа Тарегі), росичка кров'яна (Ріднагіа запдпиіпаїї5), брахіария (Вгаснпіата деситрепв), дикий овес (Амепа їаїшца), дурнишник звичайний (Хапіпйшт репзуїмапіснит), лобода біла (СпПепородішт аїірит), в'юнок пурпурний (Іротоєа
Зо соссіпєа), щириця (Атагапіпив5 5рр.), канатник Теофраста (Аршйіоп (пеорНгавії), куряче просо (Еспіпоспіоа сгив-даїйї), свинорий пальчастий (Суподоп адасіуіоп), багаття покрівельне (Вготив
Іїесіогит), подмаренник чіпкий (ЕІєивзіпе іпаіса), щетинник зелений (5еїагіа мігідів), райграс італійський (І оїїшт тийШогит), сорго алепске (5огдо Наіерепзе), канареечник малий (РНаїагі тіпог), метлиця звичайна (Арега 5ріса-мепії), шерстняк волохатий (Егіспіса міПоза), сить їстівна (Сурегив езсціепійв), зірочник середня (5ієЇПагпа теадіа), амброзія полинолистна (Атргозіа апетівійоїїа), Косніа зсораїа, мелколепестник канадський (Сопула сападепвів), райграс твердий (Гоїйшт тідідит), подмаренник чіпкий (ЕІеивіпе іпаїса), мелколепестник волохатий (Сопуга ропаїгіепвзів), подорожник ланцетолистний (Ріапіадо Іапсеоіаіа), традесканція бенгальська (Соттеїпа БреподНаїепвів), в'юнок польової (Сопмоїмціи5 агуепвів), сить пурпурна (Суреги5 гоїшпаив), бруннихія (Вгиппіснпіа омаїа), сесбанія росла (Зезрапіа ехайайа), сенна туполістная (беппа обБішзітЇйа), соняшник реснитчатий (Неїїапійиє сійанйв) і пробосцидея луизіанска (Ргобозсідеа Іоцпізіапіса). В інших варіантах здійснення бур'ян включає стійкий до гербіциду райграс, наприклад, стійкий до гліфосату райграс, стійкий до параквату райграс, стійкий до інгібітору Ассази райграс і неселективно стійкий до гербіцидів райграс. У деяких варіантах здійснення небажані рослини є сільськогосподарськими видамі, що сусідять.
Під застосовуваним у даному документі вираженням «вибірково контрольований» слід розуміти, що більша частина бур'янів на оброблюваних землях значно ушкоджуються або гинуть, у той час як якщо на поле також присутні сільськогосподарські культури, більша частина сільськогосподарських культур значно не ушкоджується. Таким чином, спосіб передбачає виборчий контроль бур'янів, коли щонайменше 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 85905, 9095, 9590 або більш бур'янів значно ушкоджуються або гинуть, у той час як якщо на поле також присутні сільськогосподарські культури, менш ніж 4595, 4095, 3595, 3095, 25905, 20905, 1595, 10905, 595 або 195 сільськогосподарських культур значно ушкоджуються або гинуть.
У деяких варіантах здійснення рослина Вгаззіса ЮОР-073496-4 за винаходом значно не ушкоджується при обробці конкретним гербіцидом, наношуваним на рослину в дозі, еквівалентної відношенню, рівному щонайменше 0,5, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 150, 170, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або більш грамів або унцій (1 унція - 29,57 мл) активного інгредієнта або комерційного продукту або препарату гербіциду на акр або на бо гектар, в той час як відповідний контрольна рослина значна ушкоджується такою ж обробкою.
Зо
У конкретних варіантах здійснення ефективна кількість гербіциду-інгібітору АЇ5 включає щонайменше приблизно 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або більш грамів або унцій (1 унція - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар. В інших варіантах здійснення ефективна кількість гербіциду-інгібітору АЇ 5 включає щонайменше приблизно 0,1-50, приблизно 25-75, приблизно 50-100, приблизно 100-110, приблизно 110-120, приблизно 120-130, приблизно 130-140, приблизно 140-150, приблизно 150-200, приблизно 200-500, приблизно 500-600, приблизно 600- 800, приблизно 800-1000 або більш грамів або унцій (1 унція - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар. Будь-який інгібітор АЇ5, наприклад, з тих, що перераховано в таблиці 1, може наноситися в цих кількостях.
В інших варіантах здійснення ефективна кількість сульфонілсечовини включає щонайменше 01,1, 5,10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000 або більш грамів або унцій (1 унція - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар. В інших варіантах здійснення ефективна кількість сульфонілсечовини включає щонайменше приблизно 0,1-50, приблизно 25-75, приблизно 50-100, приблизно 100-110, приблизно 110-120, приблизно 120-130, приблизно 130-140, приблизно 140-150, приблизно 150-160, приблизно 160-170, приблизно 170-180, приблизно 190-200, приблизно 200-250, приблизно 250-300, приблизно 300- 350, приблизно 350-400, приблизно 400-450, приблизно 450-500, приблизно 500-550, приблизно 550-600, приблизно 600-650, приблизно 650-700, приблизно 700-800, приблизно 800-900, приблизно 900-1000, приблизно 1000-2000 або більш грамів або унцій (1 унція - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар. Репрезентативні сульфонілсечовини, які можуть наноситися в цій кількості, наведено в таблиці 1.
В інших варіантах здійснення ефективна кількість сульфоніламінокарбонілтріазолінонів, тріазолопіримідинів, піримідинілокси(тіо)бензоатів і імідазолінонів може включати щонайменше приблизно 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2500, 3500, 4000, 4500, 5000 або більш грамів або унцій (1 унцій - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар. В інших варіантах здійснення ефективна кількість сульфоніламінокарбонілтріазолінонів, тріазолопіримідинів,
Зо піримідинілокси(тіо)бензоатів і імідазолінонів включає щонайменше приблизно 0,1-50, приблизно 25-75, приблизно 50-100, приблизно 100-110, приблизно 110-120, приблизно 120- 130, приблизно 130-140, приблизно 140-150, приблизно 150-160, приблизно 160-170, приблизно 170-180, приблизно 190-200, приблизно 200-250, приблизно 250-300, приблизно 300-350, приблизно 350-400, приблизно 400-450, приблизно 450-500, приблизно 500-550, приблизно 550- 600, приблизно 600-650, приблизно 650-700, приблизно 700-800, приблизно 800-900, приблизно 900-1000, приблизно 1000-2000 або більш грамів або унцій (1 унцій - 29,57 мл) активного інгредієнта на гектар.
Додаткові інтервали ефективних кількостей гербіцидів можна знайти, наприклад, у різних публікаціях від Опімегейу Ехіепзіоп 5егмісе5. Див., наприклад, Вегпага5, еї аї., (2006) сиціде ог
Месй Мападетепі іп МебгабзКа (м/млу.їапгтрирз.ші.еди/вепай/ес130); АНедпег, еї аї., (2005)
Спетіса! М/еей Сопіго! тог Рієїд5 Стор5, Равіцге5, Напдеїапа, апа Мопсторіапа, Капзав 5іаїє
Опіметейу Адгісийига! Ехієпвіоп еїайоп апа Согрогаїє Ехієпвіоп бегмісе; 2оПпдег, єї аї., (2006)
Мопійп РаКоїа М/еєд Сопігої Сціде, Мопи баКкоїа Ехіепзіоп бегмісе апа Ше Ісула біаіїє Опіметейу
Ехіепзіоп аї м/млу.мееавз.іазіаге.еди, кожний з яких включений у даний документ як посилання.
У деяких варіантах здійснення винаходу гліфосат наносять на оброблювані землі й/або щонайменше на одну рослину на оброблюваних землях у концентраціях від 8 до 32 унцій кислотного еквівалента на акр, або в концентраціях між значеннями 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28 і 30 унцій кислотного еквівалента на акр у нижній межі інтервалу нанесення й між значеннями 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 і 32 унцій кислотного еквівалента на акр у верхній межі інтервалу нанесення (1 унція - 29,57 мл). В інших варіантах здійснення гліфосат наносять, щонайменше, у кількості 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або більш унцій активного інгредієнта на гектар (1 унція - 29,57 мл). У деяких варіантах здійснення винаходу сульфонілсечовиний гербіцид наносять на поле й/або на щонайменше одну рослину в поле в концентраціях від 0,04 до 1,0 унцій активного інгредієнта на акр, або в концентраціях між значеннями 0,1, 0,2, 0,4, 0,6 ї 0,8 унцій кислотного еквівалента на акр у нижній межі інтервалу нанесення й між значеннями 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 і 1,0 унцій кислотного еквівалента на акр у верхній межі інтервалу нанесення (1 унція - 29,57 мл).
Як відомо в даній галузі, гербіциди на основі гліфосату, як клас, містять той самій активний інгредієнт, але активний інгредієнт присутній у вигляді однієї з декількох різних солей і/або у 60 вигляді одного із препаратів. Однак гербіциди, відомі як інгібітори АЇ5, мають різні активні інгредієнти, а також хімічні формули. Фахівцеві в даній галузі відоме визначення кількості активного інгредієнта й/або кислотного еквівалента, що присутнії в конкретному обсязі й/або в масі препарату гербіциду.
У деяких варіантах здійснення використовується гербіцид-інгібітор АГ 5. Концентрації, у яких гербіцид-інгібітор АЇ З наноситься на культуру, насіння або оброблювані землі, може бути кожний з концентрацій, описуваних у даному документі. У конкретних варіантах здійснення концентрація гербіциду-інгібітору АЇЗ становить від приблизно 0,1 до приблизно 5000 г на гектар, від приблизно 0,5 до приблизно 300 г на гектар або від приблизно 1 до приблизно 150 г на гектар.
В основному, конкретний гербіцид наносять на конкретне поле (і на будь-які рослини, що ростуть на ньому) не більш ніж 1, 2, 3, 4, 5,6, 7 або 8 раз у році, або не більш ніж 1, 2, 3, 4 або 5 раз за сезон вегетації.
Під «обробкою поєднанням» або «нанесенням поєднання гербіцидів на культуру, оброблювані землі або поле» слід розуміти, що конкретне поле, культуру або бур'ян обробляють гербіцидамі й/або хімікатамі, зазначеними як частина поєднання, так що досягнута бажана дія, тобто, так що бур'яни вибірково контрольовані, тоді як культура значно не ушкоджена. У деяких варіантах здійснення бур'яни, чутливі до кожного з гербіцидів, ушкоджуються від обробки кожним гербіцидом, яка є аддитивною або синергічною. Нанесення кожного гербіциду й/або хімікату може відбуватися одномоментно, або нанесення можуть здійснюватися в різний час, за умови досягнення бажаного дії. Крім того, нанесення може відбуватися до посадок культури.
Співвідношення гербіцидів, застосовуваних у способах по винаходу, з іншими гербіцидними активними інгредієнтамі в гербіцидних композиціях, в основному, становлять від 5000:1 до 1:5000, від 1000:1 до 1:1000, від 100:1 до 1:100, від 10:1 до 1:10 або від 5:1 до 1:5 по масі.
Оптимальні відносини можуть легко визначити фахівці в даній галузі, грунтуючись на необхідних спектрах контролю бур'янів. Крім того, будь-які поєднанням інтервалів різних гербіцидів, описаних у таблиці 1, також можуть використовуватися в способах по винаходу.
Таким чином, у деяких варіантах здійснення винахіда відноситься до поліпшених способів виборчого контролю бур'янів у полі, де загальне нанесення гербіциду може становити менш
Коо) 909, 8595, 8090, 7590, 7090, 6590, бОбю, 5595, 509, 4595, 4095, З59Ую, З0Ую, 2590, 2090, 1590, 1090, 5 або 195 від того, яке використовується в інших способах. Подібним образом, у деяких варіантах здійснення кількість конкретного гербіциду, використовуваного для виборчого контролю бур'янів у полі, може становити менш 9095, 8595, 8095, 7595, 7095, 6595, 6095, 5595, 5095, 4595, 4095, 3590,
З095, 2595, 2095, 1595, 1095, 595 або 195 від кількості конкретного гербіциду, які може використовуватися в інших способах, тобто, способах, у яких не застосовується рослина по винаходу.
У деяких варіантах здійснення рослина Вгаззіса ОР-073496-4 за винаходом має перевага від синергічної дії, де стійкість до гербіциду, забезпечувана поліпептидом СІ МАТ, і стійкість, забезпечувана поліпептидом стійкості до іншого гербіциду, перевищує очікувану стійкість від простого додавання стійкостей, забезпечуваних кожним геном окремо. Див., наприклад,
Месиїспеп, еї аї!., (1997) У. Есоп. Епіотої. 90:1170-1180; Ргієвіег, еї а!., (1999) 9. Есоп. Епіотої. 92:598-603. Застосовувані в даному документі терміни «синергія», «синергічний», «синергічне» і їх похідні, наприклад, у вираженнях «синергічна дія» або «синергічна поєднання гербіцидів» або «синергічна композиція гербіцидів» відносяться до обставин, при яких біологічна активність поєднанням гербіцидів, такого як щонайменше перший гербіцид і другий гербіцид, перевищує суму типів біологічної активності окремих гербіцидів. Синергія, виражена в контексті «Індексу синергії» (ЗІ), загалом, може визначатися способом, описаним Киї, еї аї., (1961) Арріїєй
Місторіоіоду 9:538. Див. також, Соїбу, (1967) М/еєаз 15:20-22.
В інших випадках, стійкість до гербіциду, забезпечувана рослині ОР-073496-4 по винаходу, є
БО аддитивною; тобто, профіль стійкості до гербіциду, забезпечуваний генамі стійкості до гербіциду, є таким, який очікується від простого поєднання стійкості гербіцидів, забезпечуваної кожним геном окремо трансгенної рослині, що містить їх окремо. Аддитивна й/або синергічна активність двох або більш гербіцидів проти ключових видів бур'янів збільшує загальну ефективність і/або знижує дійсну кількість активного(-их) інгредієнта(-ів), необхідну для контролю зазначених бур'янів. Коли спостерігають таку синергію, рослину за винаходом може характеризуватися стійкістю до більш високої дози або концентрації гербіциду, і/або рослина може характеризуватися стійкістю до додаткових гербіцидів або іншим хімікатів, крім тих, до яких воно, як очікується, проявляє таку стійкість. Наприклад, рослина Вгазвзіса ОР-073496-4 може характеризуватися стійкістю до фосфорорганічних сполук, таким як інсектициди й/або бо інгібітори 4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази.
Таким чином, наприклад, рослини Вгаззіса ОР-073496-4 по винаходу, якщо вони, крім того, містять гени, забезпечуючі стійкість до інших гербіцидів, можуть характеризуватися більшої, ніж очікувана, стійкістю до різних гербіцидів, включаючи в якості необмежуючих прикладів гліфосат, хімічні сполуки-інгібітори АЇ 5 і сульфонілсечовині гербіциди. Рослина Вгаззіса ОР-073496-4 за винаходом може характеризуватися стійкістю до конкретного гербіциду або до поєднанням гербіцидів, яка на щонайменше 195, 295, 395, 495, 5905, 695, 795, 895, 995, 1095, 1295, 15905, 17905, 2095, 22, 250, еиУю, 3090, З5Ую, 4090, 4590, 5090, Зою, 609ю, б5Ую, 7095, 8095, 909, 100905, 12595, 15095, 17595, 20095, 30095, 40095 або 50095 або більш перевищує стійкість відповідної контрольної рослини, яка містить лише єдиний ген стійкості до гербіциду, який забезпечує стійкість до того ж гербіциду або до поєднанням гербіцидів. Таким чином, рослини Вгазвзіса ОР- 073496-4 можуть характеризуватися зниженим рівнем ушкодження від однієї й тієї ж дози гербіциду в порівнянні з підходящою контрольною рослиною, або вони можуть характеризуватися тою же ступенем ушкодження у відповідь на набагато більшу дозу гербіциду, ніж в контрольній рослині. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення конкретний гербіцид, використовуваний для виборчого контролю бур'янів на поле, застосовується в кількості, більшому на 195, 595, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 6095, 7095, 8095, 9090, 10095 або більш, ніж кількість цього конкретного гербіциду, який використовується в інших способах, тобто, способах, у яких не використовується рослина по винаходу.
У такий же спосіб, у деяких варіантах здійснення рослина Вгаззіса ЮР-073496-4 за винаходом характеризується посиленою стійкістю до конкретного препарату активного інгредієнта гербіциду в порівнянні з підходящою контрольною рослиною. Гербіциди продаються комерційно в якості препаратів, які, як правило, включають інші інгредієнти на додаток до гербіцидному активному інгредієнту; ці інгредієнти часто призначають для посилення ефективності активного інгредієнта. Такі інші інгредієнти можуть включати, наприклад, антидоти й адьюванти (див., наприклад, Сгееп апа Есу, (2003) "Адіимапіє: ТооїІ5 Ттог Еппапсіпд Гербіцид
Репогтапсе", іп Ууеєй Віоюду і Мападетепі, ей. Іпаегйї (Кіпмег Асадетіс Рибіївпег5, Те
Меїпегіапа5)). Таким чином, рослина Вгазбвіса ЮР-073496-4 за винаходом може характеризуватися стійкістю до конкретного препарату гербіциду (наприклад, до конкретного комерційно доступного гербіцидному продукту), яка на щонайменше 195, 295, 390, 495, 5905, бо,
Коо) 79Уо, 8Ую, Зув, 1090, 1295, 1590, 1795, 2096, гео, 2590, 21Ую, З09о, ЗБУю, 4090, 4596, 5ОУю, 5595, 6090, бос, 7095, 8095, 9095, 10095, 12595, 150905, 17595, 20095, 30095, 40095, 50090, 60095, 70095, 8009, 90096, 100095, 110095, 120096, 130095, 140095, 150095, 160095, 170095, 180095, 190095 або 2000905 або більш перевищує стійкість підходящої контрольної рослини, яка містить тільки один ген стійкості до гербіциду, який забезпечує стійкість до того ж препарату гербіциду.
У деяких варіантах здійснення рослина Вгаззіса ОР-073496-4 ріапі за винаходом характеризується посиленою стійкістю до гербіциду або класу гербіцидів, до якого забезпечує стійкість щонайменше один інший ген стійкості до гербіциду, а також посиленою стійкістю до щонайменше одному гербіциду або хімікату, який характеризується іншим механізмом або основою дії, ніж гліфосат або гербіцид, що відповідає зазначеному щонайменше одному іншому гена стійкості до гербіциду. Це несподівана перевага винаходу знаходить застосування в способах вирощування культурних рослин, які включають їхню обробку різними поєднаннями хімікатів, включаючи, наприклад, інші хімікати, використовувані для вирашивания рослин. Таким чином, наприклад, рослина Вгазбзіса ОР-073496-4 може також характеризуватися посиленою стійкістю до хлорпірофосу, системному фосфорорганічному інсектициду. Таким чином, винахід також відноситься до рослини Вгаззіса ОР-073496-4, володіючим стійкістю до гліфосату ( тобто, за рахунок гена сі АТ), яке характеризується посиленою стійкістю до хімікатів, які впливають на ген цитохрому Р450, і до способів його застосування. У деяких варіантах здійснення рослини
Вгаззіса ОР-073496-4 також характеризуються посиленою стійкістю до дікамби. У цих варіантах здійснення посилена стійкість до дикамбе може бути доведена в присутності гліфосату й сульфонілсечовиного гербіциду.
В інших способах поєднання гербіцидів наносять на рослину Вгаззіса ЮОР-073496-4, де поєднання гербіцидів здійснює аддитивну або синергічнуе дію для контролю бур'янів. Такі поєднанням гербіцидів можуть забезпечувати зниження кількості нанесеної речовини, більш широкий спектр контрольованої небажаної рослинності, поліпшений контроль небажаної рослинності меншими нанесеними кількостями, більш ранній початок гербіцидної активності або більш тривалу гербіцидну активність. «Аддитивна гербіцидна композиція» характеризується гербіцидною активністю, яка приблизно рівна спостережуваним активностям окремих компонентів. «Синергічне поєднання гербіцидів» має гербіцидну активність, більш високу, тем та, яка може очікуватися на основі бо спостережуваних активностей індивідуальних компонентів при окремому використанні. Таким чином, представлений у даному описі об'єкт винаходу відноситься до синергічному поєднанню гербіцидів, де ступінь контролю бур'янів сумішшю перевершує суму контролю індивідуальними гербіцидамі. У деяких варіантах здійснення ступінь контролю бур'янів сумішшю перевершує суму контролю індивідуальними гербіцидамі на будь-яке статистично значиме значення, що включає, наприклад, від приблизно 195 до 595, від приблизно 595 до приблизно 1095, від приблизно 1095 до приблизно 2095, від приблизно 2095 до приблизно 3095, від приблизно 3095 до 4095, від приблизно 4095 до приблизно 5095, від приблизно 5095 до приблизно 6095, від приблизно 6095 до приблизно 7095, від приблизно 7095 до приблизно 8095, від приблизно 80905 до приблизно 9095, від приблизно 9095 до приблизно 10095, від приблизно 10095 до 12095 або вище. Крім того, «синергічне ефективна кількість» гербіциду відноситься до кількості одного гербіциду, необхідному для надання синергічної дії на інший гербіцид, що присутній у гербіцидної композиції. Таким чином, термін «синергіст» і його похідні відносяться до речовини, яка підсилює дію активного інгредієнта (аї), тобто, речовини в препараті, від якого відбувається біологічна дія, наприклад, гербіциду.
Таким чином, у деяких варіантах здійснення представлений у даному описі об'єкт винаходу надає спосіб контролю бур'янів на оброблюваних землях. У деяких варіантах здійснення спосіб включає: (а) засівання земель насіннями культури ЮОР-073496-4 або сільськогосподарських культур, які також включають полінуклеотиди, що забезпечують стійкість до інгібітору АЇ 5; і (Б) нанесення на бур'яни, сільськогосподарські культури, частини культур, оброблювані землі або на комбінацію цих об'єктів ефективної кількості гербіцидной композиції, що містить щонайменше одну із синергічне ефективної кількості гліфосату й синергічне ефективної кількості інгібітору
АЇ 5 (у якості необмежуючих прикладів, включаючого сульфонілсечовиний гербіцид) або їх прийнятні для сільського господарства солі, де дотримується щонайменше одна з умов: (Її) синергічна ефективна кількість гліфосату становить менше кількості гліфосату, необхідного для контролю бур'янів під час відсутності сульфонілсечовиного гербіциду; (ії) синергічне ефективна кількість гербіциду-інгібітору АЇ 5 становить менше кількості інгібітору АГ 5, необхідного для контролю бур'янів під час відсутності гліфосату й (ії) їх поєднання, і де ефективна кількість гербіцидної композиції переноситься насіннями культури або сільськогосподарськими культурамі й контролює бур'яни на оброблюваних землях.
Зо У деяких варіантах здійснення гербіцидна композиція, використовувана в представленому в даному документі способі контролю бур'янів, містить синергічну ефективну кількість гліфосату й сульфонілсечовиного гербіциду. У додаткових варіантах здійснення описана в даному документі синергічна гербіцидна композиція містить гліфосат і сульфонілсечовиний гербіцид, обраний із групи, що полягає з метсульфурон-метилу, хлорсульфурону й тріасульфурону.
У конкретних варіантах здійснення синергічне поєднання гербіцидів додатково містить добавку, таку як, наприклад, добавка, заснована на сульфаті амонію, наприклад, АОО-ОРФ (УуепКет., НаІйбуау Ношизе, Міагапа, Зоцій Аїгіса). У додаткових варіантах здійснення описані в даному документі синергічні гербіцидні композиції містять додатковий гербіцид, наприклад, ефективну кількість гербіциду на основі піримідинілокси(тіо)дбензоату. У деяких варіантах здійснення гербіцид на основі піримідинілокси(тіо)бензоату включає біспірибак, наприклад, (МЕГОСІТУФ, Маїепі О.5.А. Согр., УМаІпиї СтееК, Саїйогпіа, Опнйейд 5іаге5 ої Атегіса) або його прийнятну для сільського господарства сіль.
У деяких варіантах здійснення описаного в даному документі способу контролю небажаних рослин гліфосат наносять на небажані рослини або рослинні культури до сходів, після сходів або до й послу сходів, і/або гербіцид-інгібітор А З ( тобто, сульфонілсечовиний гербіцид) наносять на небажані рослини або рослинні культури до сходів, після сходів або до й послу сходів. В інших варіантах здійснення гліфосат і/або гербіцид-інгібітор А 5 ( тобто, сульфонілсечовиний гербіцид) наносять разом або наносять роздільно. В інших варіантах здійснення синергічну гербіцидну композицію наносять, наприклад, на зазначеній вище стадії (Б), щонайменше, у деякий момент перед посадкою інтересуючого(-їх) культури(-р), наприклад, на зазначеній вище стадії (а).
Бур'яни, які важко контролюватися одним гліфосатом у полях, де вирощують культуру (таку як, наприклад, культура Вгаз5зіса), у якості необмежуючих прикладів включають наступні: мелколепестник канадський (наприклад, Сопула сападепвів); райграс твердий (наприклад,
Їоїїшт гідідит); подмаренник чіпкий (наприклад, ЕЇеивзіпе іпаїса); райграс італійський (наприклад, І оїйшт тийШогит), мелколепестник волохатий (наприклад, Сопуга Бопаїпепвів), подорожник ланцетолистний (наприклад, Ріапіадо іапсеоіаїа), амброзію полінолистну (наприклад, Атрбговзіа апетівзіїоїйа;); в'юнок пурпурний (наприклад, Іротоєа 5рр.), щирицу (наприклад, Атагапіпив 5рр.); в'юнок польової (наприклад, Сопмоїмци5 агуепвів), сить їстівну 60 (наприклад, Сурегив езсціепійв), марь білу (наприклад, Спепородішт аїІрит); горець кучерявий
(наприклад, Роїудопішт сопмоїмши5); канатник Теофраста (наприклад, АбшШоп (пеорнНгазвії), кохію (наприклад, Коспіа зсорагіа) і коммелину (наприклад, Соттвеїйна 5рр.). На територіях, де перебувають такі бур'яни, особливо придатні рослини Вгаззіса, що містять подію ОР-073496-4 і стійкість до іншого гербіциду, оскільки вони дозволяють обробляти поле (і, таким чином, будь- якій культурі, що росте в поле) поєднаннями гербіцидів, які завдають неприйнятної шкоди сільськогосподарським культурам, які не містять обоє ці полінуклеотиди. Рослини по винаходу, стійкі до гліфосату й іншим гербіцидам, таким як, наприклад, гербіциди на основі сульфонілсечовини, імідазолінону, тріазолопіримідину, піримідиніл(тіо)бензоату й/або сульфоніламінокарбонілтріазолінону, на додаток до устойчіовсти до щонайменше одному іншому гербіциду з іншим способом дії або місцем дії, особливо придатні в ситуаціях, у яких бур'яни стійкі до щонайменше двом з тих же гербіцидів, до яких стійкі рослини. Таким чином, рослини за винаходом дають можливість для поліпшеного контролю бур'янів, які стійкі більш ніж до одному гербіциду.
Наприклад, деякі широко використовувані способи обробки для контролю бур'янів у полях, де вирощують сучасні комерційні культури (включаючи, наприклад, культури Вгавзвіса), включають гліфосат і, необов'язково, 2,4-Ю0; дане поєднання, однак, має деякі недоліки.
Зокрема, є види бур'янів, які воно добре не контролює, і також воно як випливає не працює для контролю бур'янів у холодну погоду. Інша широко використовувана обробка для контролю бур'янів у полях Вгаззіса включає сульфонілсечовиний гербіцид хлоримурон-етил, який має значну залишкову активність у грунті й, таким чином, підтримує тиск селекції на поздневсходні види бур'янів, створюючи сприятливе середовище для росту й поширення стійких до сульфонілсечовини бур'янів. Поля можуть бути оброблені сульфонілсечовиною, імідазоліноном, тріазолопіримідином, піримідиніл(тіо)бензоатамі й/або сульфоніламінокарбонілтріазоліноном, наприклад, сульфонілсечовіой хлоримурон-етилом, окремо або в поєднанням з іншими гербіцидамі, такому як поєднання гліфосату й трибенурон-метилу (комерційно доступного як
Ехрге55Ф). Дане поєднання має деякі переваги для контролю бур'янів у деяких обставинах гербіцидів, що включають застосування, з різними типамі дії й застосування гербіцидів, що мають відносно короткий період залишкової активності в грунті. Гербіцид з відносно коротким періодом залишкової активності в грунті є бажаним, наприклад, у ситуаціях, у яких важливо
Зо знизити тиск селекції, який буде сприяти росту стійких до гербіцидів бур'янів. Звичайно, у кожній конкретній ситуації, де потрібен контроль бур'янів, інші міркування можуть бути важливіше, наприклад, необхідність запобігати розвитку й/або появі бур'янів у полі перед посадкою культури шляхом використання гербіциду з відносно довгим періодом залишкової активності.
Можуть бути особливо придатні способи обробки, які включають використання трибенурон- метилу й тифенсульфурон-метилуа.
Іншими широко використовувані способи обробки для контролю бур'янів у полях, де вирощують сучасні комерційні сорти культур (включаючи, наприклад, види Вгазвіса), включають використання сульфонілсечовиного гербіциду тифенсульфурон-метилу (комерційно доступного як Наптопу СТ). Однак, одним з недоліків тифенсульфурон-метилу є те, що високі концентрації нанесення, необхідні для відповідного контролю бур'янів, часто завдають шкоди культурі, що росте на тому ж полі. Рослини Вгаззіса ОР-073496-4, що містять додатковий вид стійкості, можуть оброблятися поєднанням гліфосату й тифенсульфурон-метилу, яке має перевагу використання гербіцидів з різними способамі дії. Таким чином, бур'яни, стійкі до одного гербіциду, контролюються поєднанням двох гербіцидів, і поліпшені рослини Вгаззіса ОР-073496- 4 не будуть значно ушкоджуватися обробкою.
Інші гербіциди, використовувані для контролю бур'янів у полях, де вирощують сучасні комерційні сорти культур (включаючи, наприклад, види Вгазвзіса), являють собою гербіцид на основі тріазолопіримідину клорансулам-метил (комерційно доступний як Рігеігасетф)) і гербіцид на основі імідазолінона імазаквін (комерційно доступний як Бсеріог?). Коли ці гербіциди використовують індивідуально, вони можуть надавати тільки один обмежений вид контролю бур'янів. Однак, може відбуватися обробка, наприклад, поєднанням гліфосату (наприклад,
Коипапирфе (ізопропіламінова сіль гліфосату)), імазапіру ( у цей час комерційно доступний як
Агзепа!Фф), хлоримурон-етилом ( у цей час комерційно доступний як СіІаззіст), квизалофоп-Р- етилом ( у цей час комерційно доступний як Аззиге ПФ) і фомесафеном ( у цей час комерційно доступний як РіІехеїаг?). Дане поєднання має перевага використання гербіцидів з різними способамі дії. Таким чином, бур'яни, стійкі всього до одного або декільком із цих гербіцидів, контролюються поєднанням п'ятьох гербіцидів. Дане поєднання надає винятково широкий спектр захисту проти типу стійких до гербіцидів бур'янів, який, як очікується, виникає й поширюється при сучасній практиці контролю бур'янів.
Поля, що містять рослини Вгаззіса ОР-073496-4 з додатковим видом стійкості до гербіциду, можуть також оброблятися, наприклад, поєднанням гербіцидів, що включають гліфосат, римсульфурон і дикамбу або мезотріон. Це поєднання може бути особливо придатне при контролі бур'янів, що розбудовують деяку стійкість до гербіцидів, які інгібують АЇ 5. Інша поєднання гербіцидів, які може бути особливо придатним для контролю бур'янів, включає гліфосат і щонайменше один засіб з наступних: метсульфурон-метил (комерційно доступний як
АпПуФ)), імазапір (комерційно доступний як Агзепаї!Ф)), імазетапір, імазаквін і сульфентразон. Слід розуміти, що кожна з комбінацій, обговорюваних вище або в іншій частині даного документа, також можна використовувати для обробки земель у поєднанням з будь-якими іншими гербіцидамі або сільськогосподарськими хімікатамі.
Деякі загальноприйняті способи обробки для контролю бур'янів на полях, де вирощують сучасні комерційні культури (включаючи, наприклад, Вгавзвзіса), включають застосування гліфосату (у цей час комерційно доступний як Коипдир?т), римсульфурону ( у цей час комерційно доступний як КезоїЇме?ж або Маїгіх?), дікамби (комерційно доступна як СіІагуф), атразина й мезотріона (комерційно доступний як СаїйсіоФ). Ці гербіциди іноді використовують окремо внаслідок слабкої стійкості культур до множинних гербіцидів. На жаль, при окремому використанні кожний із цих гербіцидів має значні недоліки. Зокрема, поширення бур'янів, стійких до індивідуальних гербіцидів, продовжує рости, приводячи в деяких ситуаціях до зменшення ефективності гліфосату в порівнянні з необхідної. Римсульфурон забезпечує кращий контроль бур'янів у високих дозах, які можуть викликати ушкодження культури, а альтернативи, такі як дікамба, часто більш дороги, ніж загальноприйняті гербіциди.
Деякі загальноприйняті способи обробки для контролю бур'янів на полях, де вирощують сучасні комерційні культури (включаючи, наприклад, Вгавззіса), включають застосування гліфосату (у цей час комерційно доступний як КошипадирФ), хлоримурон-етилу, трибенурон- метилу, римсульфурону ( у цей час комерційно доступний як КезоїЇмеФ або МаїгіхФ)), імазетапіру, імазапіру й імазаквіну. На жаль, при індивідуальному застосуванні кожний із цих гербіцидів має значні недоліки. Зокрема, поширення бур'янів, стійких до індивідуальних гербіцидів, продовжує рости, приводячи в деяких ситуаціях до зменшення ефективності гліфосату в порівнянні з необхідної. Однак, Вгаззіса ОР-073496-4 з ознакою додаткової стійкості до гербіциду може
Ко) оброблятися поєднанням гербіцидів, яке завдає небажаної шкоди стандартним сортам рослин, у тому числі, поєднаннями гербіцидів, що включають щонайменше один із зазначених вище.
У способах за винаходом гербіцид можна становити в препарат і наносити на інтересуючу територію, таку як, наприклад, поле або оброблювані землі, будь-яким підходящим образом.
Гербіцид можна наносити на поле в будь-якому виді, наприклад, у вигляді рідкого спрея або твердого порошку або гранул. У конкретних варіантах здійснення гербіцид або поєднання гербіцидів, використовуваних у способах, включають бакову суміш або попередню суміш.
Гербіцид можна також становити в препарат, наприклад, з одержанням «гомогенної гранулярної суміші», продукуємої з використанням технології змішування (див., наприклад, патент США Мо 6022552, озаглавлений "Однорідні суміші гранул пестициду"). Технологія змішування з патенту
США Мо 6022552 продукується нерозшаровна суміш ( тобто, «гомогенну гранулярну суміш») препарату хімікатів для захисту культури в сухій гранулярній формі, яка забезпечує доставку спеціалізованих сумішей, розроблених для вирішення конкретних проблем. Гомогенну гранулярну суміш можна транспортувати, нею можна маніпулювати, розділяти її на зразки й наносити тим же образом, яким діють із традиційними попередньо змішаними продуктамі, у яких множинні активні інгредієнти становлять у препарат тієї ж самої гранули.
У короткому викладі, «гомогенну гранулярну суміш» одержують змішуванням щонайменше двох утворені шляхом екструзії гранулярних продуктів. У деяких варіантах здійснення кожний гранулярний продукт включає зареєструваний склад, що містить один активний інгредієнт, який являє собою, наприклад, гербіцид, фунгіцид і/або інсектицид. Однорідність (гомогенність) «гомогенної гранулярної суміші» може оптимізуватися шляхом контролю розмірів і розподілу розмірів гранул, застосовуваних у суміші. Діаметр екструдованих гранул контролюють розміром отворів екструзіонной матриці, і процес просівання за допомогою центрифуги можна використовувати для одержання популяції екструдованих гранул з необхідним розподілом довжин (див., наприклад, патент США Мо 6270025).
Суміш гомогенних гранул уважається «гомогенною», коли вона може підрозділятися на аліквоти відповідного розміру, ії композиція кожної аліквоти відповідає необхідній специфікації аналізу. Для демонстрації гомогенності одержують великий зразок гомогенної гранулярної суміші, і його потім підрозділяють на аліквоти, що перевищують мінімальний статистичний розмір зразка. До сумішей також можливо додавати інші агрохімікати в нормальних, дозволених 60 до застосування кількостях, наприклад, додаткові гербіциди (з З3-м/ 4-м механізмом дії),
фунгіциди, інсектициди, регулятори росту рослин і т.п., за рахунок чого скорочуються витрати, пов'язані з додатковими нанесеннями.
Будь-який препарат гербіциду для нанесення на рослину Вгаззіса ЮОР-073496-4 можна одержувати у вигляді композиції «бакової суміші». У таких варіантах здійснення кожний інгредієнт або поєднання інгредієнтів можна зберігати окремо друг від друга. Потім інгредієнти можна змішувати один з одним перед нанесенням. Як правило, таке змішування відбувається незадовго до нанесення. У процесі бакового змішування кожний інгредієнт перед змішуванням, як правило, є присутнім у воді або в підходящому органічному розчиннику. Для додаткових вказівок в ділянки одержання препаратів див., Ууосаз, "пе Еоптшаг5 ТооІрох-Ргодисі Богт5 їог Модегп Адгісийиге" Резіїсіде Спетівігу і Віозсіепсе, Тпе Боса-Епмігоптепі Спаеподе, Вгоокз і
Вобепв, Еав., Ргосеєдіпд5 ої Ше 9Іп Іпіегпайопа! Сопдге55 оп Резвіїсіде Спетівігу, Те Воуаї зЗосієїу ої Спетівігу, Сатбгідде, 1999, рр. 120-133. Див. також патент США Мо 3235361, зі сторінки б, рядок 16, до сторінки 7, рядок 19, і приклади 10-41; патент США Мо 3309192, зі сторінки 5, рядок 43, до сторінки 7, рядок 62, і приклади 8, 12, 15, 39, 41, 52, 53, 58, 132, 138- 140, 162-164, 166, 167 і 169-182; патент США Мо 2891855, зі сторінки 3, рядок 66, до сторінки 5, рядок 17, і приклади 1-4; Кііпдтап, Ууеєй Сопігої а5 а зсіепсе, хопп Уміеу і Зопв, Іпс., Мем ХОгК, 1961, рр 81-96 і Напсе, єї аїІ., Меєйа Сопігої Напароок, 8іп Еа., Віаскугеї! Зсіепіййс Рибіісабопв,
Охіога, 1989, причому кожний з даних джерел повністю включений у даний документ як посилання.
Способи за винаходом далі забезпечують розробку комбінацій гербіцидів для застосування на рослинах Вгаззіса ОР-073496-4. У таких способах оцінюють умови навколишнього середовища на оброблюваних землях. Умови навколишнього середовища, які можна оцінювати, у якості необмежуючих прикладів включають міркування забруднення грунту й поверхневих вод, призначення використання культури, стійкість культури, грунтові залишки, бур'яни, що присутні на оброблюваних землях, структуру грунту, рН грунту, кількість органічної речовини в грунті, устаткування для нанесення й способи оранки. Після оцінки умов навколишнього середовища ефективна кількість поєднання гербіцидів можна наносити на культуру, частину культури, насіння культури або на оброблювані землі.
У деяких варіантах здійснення гербіцид, нанесений на рослини Вгаззіса ОР-073496-4 по
Зо винаходу, служить для профілактики початку росту чутливих бур'янів і/або служить для ушкодження бур'янів, які ростуть на інтересуючої території. У деяких варіантах здійснення гербіцид або суміш гербіцидів проявляють ці ефекти на бур'яни, що впливають на культуру, причому культуру після цього саджають на інтересуючу територію ( тобто, на поле або оброблювані землі). У способах за винаходом нанесення поєднання гербіцидів не обов'язково відбувається в те саме час. За умови, що поле, на якому посаджена культура, містить кількості, що детектуються, першого гербіциду, а другий гербіцид наносять у деякий момент часу протягом періоду, коли культура росте на оброблюваних землях, культура, як уважається, оброблена сумішшю гербіцидів по винаходу. Таким чином, способи за винаходом охоплюють варіанти нанесення гербіцидів, які є «предвсходовими», «післевсходовими», «передпосівним уведенням» і/або в яких використовується обробка насінь перед посадкою.
В одному з варіантів здійснення надаються способи покриття насінь. Способи включають покриття насінь ефективною кількістю гербіциду або поєднанням гербіцидів (описаного в іншій частині даного документа). Насіння потім можуть висаджуватися на оброблювані землі. Далі надані насіння, що мають покриття, що включає ефективна кількість гербіциду або поєднання гербіцидів (описаного в іншій частині даного документа). «Предвсходовий» відноситься до гербіциду, який наносять на інтересуючу територію (наприклад, на поле або оброблювані землі) перед видимими сходамі рослини із грунту. «Післевсходовий» відноситься до гербіциду, який наносять на територію після того, як рослина видима зійде із грунту. У деяких випадках, терміни «предвсходовий» і «післевсходовий» використовують із посиланням на бур'ян на інтересуючий території, і в деяких випадках ці терміни використовують із посиланням на сільськогосподарську культуру на інтересуючий території. При використанні з посиланням на бур'ян, ці терміни можуть ставитися тільки до конкретного типу або виду бур'яну, який є присутнім або, як уважаються, є присутнім на інтересуючий території. Тоді як будь-який гербіцид може наноситися шляхом предвсходової іл або післевсходової обробки, деякі гербіциди, як відомо, більш ефективні при контролі бур'яну або бур'янів, які наносяться перед або після сходів. Наприклад, римсульфурон володіє й предвсходовой, і післевсходовой активністю, тоді як інші гербіциди мають переважно предвсходову (метолахлор) або післевсходову (гліфосат) активність. Ці властивості конкретних гербіцидів відомі в даній галузі й легко визначаються фахівцем у даній галузі. Далі, фахівець в бо даній галузі легко може вибрати підходящі гербіциди й час нанесення для застосування із трансгенними рослинамі за винаходом й/або на територіях, де слід висівати трансгенние рослини по винаходу. «Передпосівне введення» включає введення сполучень у грунт перед посадкою.
Таким чином, винахід відноситься до поліпшених способів вирощування культури й/або контролю бур'янів, таким як, наприклад, «передпосівне випалювання», при якому територію обробляють гербіцидамі перед посадкою інтересуючий культури, для кращого контролю бур'янів. Винахід також відноситься до способів вирощування культури й/або контролю бур'янів, які характеризуються «нульовою обробкою грунту» або « неглибокою оранкою» (також позначуваної як «зниження оранки»). У таких способах грунт не культивують або рідше культивують під час циклу вирощування в порівнянні із традиційними способамі; ці способи можуть скоротити витрати, які будуть в протележном випадку здійснені на додаткове культивування, включаючи вартість роботи й палива.
Способи за винаходом охоплюють застосування одночасних і/або послідовних нанесень множинних класів гербіцидів. У деяких варіантах здійснення способи за винаходом включають обробку рослини за винаходом й/або інтересуючий території (наприклад, поля або оброблюваних земель), і/або бур'яну всього одним гербіцидом або іншим хімікатом, таким як, наприклад, сульфонілсечовиний гербіцид.
Час, у який гербіцид наносять на інтересуючу територію (і будь-які рослини на ній), може бути значимим для оптимізації контролю бур'янів. Час, у який наносять гербіцид, можна визначати з урахуванням розміру рослин і/або стадії росту й/або розвитку рослин на інтересуючої території, наприклад, сільськогосподарської культури або бур'янів, що ростуть на території. Стадії росту й/або розвитку рослин відомі в даній галузі. Таким чином, наприклад, час, у який гербіцид або інший хімікат наносять на інтересуючу територію, на якій ростуть рослини, може бути часом, у який деякі або всі рослини на конкретній території досяглися, щонайменше, конкретного розміру й/або стадії росту й/або розвитку, або часом, у який деякі або всі рослини на конкретній території ще не досяглися конкретного розміру й/або стадії росту й/або розвитку.
У деяких варіантах здійснення рослини Вгаззіса ОЮР-073496-4 за винаходом характеризуються поліпшеною стійкістю до післепосівними обробкамі гербіцидом. Наприклад, рослини за винаходом можуть бути стійкими до більш високих доз гербіциду, стійкими до більш
Зо широкого інтервалу гербіцидів і/або можуть бути стійкими до доз гербіциду, нанесеним у ранні або пізні моменти розвитку, у порівнянні з підходящою контрольною рослиною. Наприклад, у деяких варіантах здійснення рослини Вгаззіса ОР-073496-4 за винаходом характеризуються підвищеною стійкістю до морфологічних дефектів, які відомі як результат обробки на конкретних стадіях розвитку. Таким чином, стійкі до гліфосату рослини за винаходом знаходять застосування в способах, що використовують, обробки гербіциду на більш пізніх стадіях розвитку, ніж це було припустимо раніше. Таким чином, рослини за винаходом можуть оброблятися конкретним гербіцидом, який викликає морфологічні дефекти в контрольних рослинах, оброблених на тих же стадіях розвитку, але стійкі до гліфосату рослини за винаходом не будуть значно ушкоджуватися тою же обробкою.
Різні хімікати, такі як гербіциди, характеризуються різними «залишковими» ефектамі, тобто, різними періодамі часу, протягом яких обробка хімікатом або гербіцидом продовжує виявляти дію на рослини, що ростуть на обробленій території. Такі ефекти можуть бути бажаними або небажаними, залежно від необхідної подальшої мети обробленої території (наприклад, поля або оброблюваних земель). Таким чином, схема обороту культур може бути обрана на основі залишкових ефектів від обробки, які будуть використовуватися для кожної культури і їх дії на культуру, яка буде потім вирощуватися на тій же території. Фахівцеві в даній галузі відомі способи, які можна використовувати для оцінки залишкового ефекту гербіциду; наприклад, загалом, гліфосат має дуже маленьку залишкову активність у грунті або не має її, тоді як гербіциди, які діють на АЇ5, варіюють по своєму рівню залишкової активності. Залишкові активності різних гербіцидів відомі в даній галузі, і вони також, як відомо, змінюються з різними факторамі навколишнього середовища, такими як, наприклад, рівні вологості грунту, температура, рН і композиція грунту (текстура й органічна речовина).
Крім того, трансгенні рослини за винаходом надають посилену стійкість до обробки додатковими хімікатамі, широко використовуваними на культурах у поєднанням з обробкою гербіцидом, такими як антидоти, добавки, такі як сульфонат амонію й маслянистий концентрат для збереження рослин при обробці, і т.п. Термін «антидот» відноситься до речовини, яка при додаванні до препарату гербіциду скасовує або знижує фітотоксичні ефекти гербіциду у відношенні деяких культур. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що вибір антидоту частково залежить від інтересуючий сільськогосподарської культури, і конкретного гербіциду або бо поєднання гербіцидів, включених у синергічну гербіцидну композицію. Типові антидоти, придатні для використання з описаними в даному документі гербіцидними композиціями, у якості необмежуючих прикладів включають ті, що описані в патентах США МоМо 4808208; 5502025; 6124240 і в публікаціях патентних заявок США МоМо 2006/0148647; 2006/0030485; 2005/0233904; 2005/0049145; 2004/0224849; 2004/0224848; 2004/0224844; 2004/0157737; 2004/0018940; 2003/0171220; 2003/0130120; 2003/0078167, описання яких включені в даний документ повністю в якості посилання. Способи за винаходом можуть використовувати гербіциди в поєднанням з гербіцидними антидотамі, такими як беноксакор, ВС5 (1-бром-4-Кхлорметил)сульфонілібензол), клоквінтосет-мексил, ціометриніл, дихлормід, 2-(дихлорметил)-2- метил-1,3-діоксолан (МО 191), фенхлоразол-етил, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, ізоксадифен-етил, мефенпір-діетил, метоксифенон ((4-метокси-3-метилфеніл)(3З-метилфеніл)метанон), нафтойний ангідрид (1, в-нафтойний ангідрид) і оксабетринил для підвищення схоронності культури.
Ефективні в якості антидоту кількості гербіцидних антидотів можуть наноситися в той самій час із сполученнями по даному винаходу або можуть наноситися при обробці насінь. Таким чином, аспект даного винаходу відноситься до застосування суміші, що містить гліфосат, щонайменше один інший гербіцид і ефективне в якості антидоту кількість гербіцидного антидоту.
Обробка насінь особливо придатна для селективного контролю бур'янів, оскільки вона фізично обмежує обробку антидотамі сільськогосподарської культури. Таким чином, особливо придатним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб селективного контролю росту бур'янів у полі, що включає обробку насінь, з яких вирощують культуру, ефективним у якості антидоту кількістю антидоту й обробку поля ефективною кількістю гербіциду для контролю бур'янів. Ефективні в якості антидотів кількості антидоти можуть легко встановлюватися фахівцем у даній галузі за допомогою простого експериментування. Ефективна в якості антидоту кількість антидоту присутня, коли необхідну рослину обробляють антидотом, так що дія гербіциду на рослину знижується в порівнянні з дією гербіциду на рослину, яку не обробляли антидотом; загалом, ефективне в якості антидоту кількість антидоту запобігає ушкодженню або важкому ушкодженню рослини, обробленого антидотом. Фахівець у даній галузі здатний установити, чи є застосування антидоту підходящим, і може встановити дозу, у якій антидот слід уводити рослинам
У конкретних варіантах здійснення гербіцид або поєднання гербіцидів, наносимі на рослину
Зо по винаходу, діють у якості антидоту. У цьому варіанті здійснення перший гербіцид або суміш гербіцидів наносять на рослину в ефективної в якості антидоту кількості. Таким чином, надається спосіб контролю бур'янів на оброблюваних землях. Спосіб включає засів території насіннями культури або засадження рослинамі, які містять перший полінуклеотид кодючий поліпептид, який може забезпечувати стійкість до гліфосату, функціонально пов'язаний із промотором, активним у рослині; і другий полінуклеотид кодючий поліпептид, стійкий до інгібітору АЇ5, функціонально пов'язаний із промотором, активним у рослині. Поєднання гербіцидів, що містить, щонайменше, ефективну кількість першого й другого гербіциду, наносять на культуру, частину культури, бур'ян або оброблювані землі з культурою. Ефективна кількість поєднанням гербіцидів контролює бур'яни; і ефективна кількість першого гербіциду не переноситься культурою, коли воно наноситься окремо, у порівнянні з контрольною культурою, яка не зазнала впливу першого гербіциду; і ефективної кількості другого гербіциду досить для надання дії антидоту, де дія антидоту надає підвищення стійкості культури після нанесення першого й другого гербіциду в порівнянні зі стійкістю культури при нанесенні тільки першого гербіциду.
У конкретних варіантах здійснення поєднання гербіцидів-антидотів включає перший інгібітор
АЇ 5 і другий інгібітор А 5. В інших варіантах здійснення ефект антидоту досягається нанесенням ефективної кількості поєднання гліфосату й щонайменше одного хімікату-інгібітору
АІЇ 5. Такі суміші надають підвищену стійкість культури ( тобто, зниження ушкодження гербіцидом). Даний спосіб забезпечує зниження кількості наношувних хімікатів до або після обробки. Такі способи знаходять застосування для підвищеного контролю небажаної або непотрібної рослинності. В інших варіантах здійснення вплив антидоту досягається, коли культуру Вгаззіса ЮР-073496-4, частини рослин культури, насіння культури, бур'яни або оброблювані землі обробляють щонайменше одним гербіцидом із сімейства хімікатів сульфонілсечовини в поєднанням із щонайменше одним гербіцидом із сімейства імідазолінонів.
Цей спосіб надає підвищену стійкість культури (тобто, зниження ушкодження гербіцидом). У конкретних варіантах здійснення сульфонілсечовина включає римсульфурон, а імідазолінон включає імазетапір. В інших варіантах здійснення на культуру, частини рослин культури або оброблювані землі також наносять гліфосат.
Застосовуваний у даному документі термін «добавка» відноситься до будь-якої речовини, 60 доданої до розчину для розпилення або до препарату для модулювання дії сільськогосподарського хімікату або фізичних властивостей розчину для розпилення. Див., наприклад, Сгееп апа Еоу, (2003) "Ад)имапів: Тооі5 Тог Еппапсіпд Негбісіде Регпогтапсе", іп М/еєй
Віоїосду і Мападетепі, еа. Іпаегйї (Кішуег Асадетіс Рибіїзпег5, Те Мефйепапавз). Адьюванти можуть розділятися на категорії й підкласи, такі як активатори, підкислювачи, буфери, добавки, клейкі речовини, дефлокулянти, противспінювачи, піногасники, антифризи, аттрактанти, основні суміші, хелатуючи засоби, очисники, барвники або пігменти, засоби сумісності, співрозчинники, зв'язуючи засоби, маслянисті концентрати для захисту культури від гербіцидів, засоби змиву, детергенти, дисперсанти, засобу контролю змиву, емульгатори, засобу зниження випару, наповнювачі, добрива, пінні маркери, наповнювачі препаратів, інертні добавки, зволожувачи, метильовані олії насінь, СОС з високим завантаженням, полімери, модифіковані рослинні олії, пенетратори, репеленти, концентрати мінерального олії, консерванти, засоби захисту від дощу, утримувальни добавки, солюбілізатори, поверхнево-активні речовини, розпилювачі, клеючи склади, адгезивниє агенти, синергісти, загусники, засоби, що забезпечують перенос, засоби захисту від ультрафіолету, рослинні олії, водополіпшуючи засоби й засоби для змочування.
Крім того, способи за винаходом можуть включати застосування гербіцидів або суміші гербіцидів, а також один або декілька інших інсектицидів, фунгіцидів, нематоцидів, бактерицидів, акарицидів, регуляторів росту, хімічних стерилізаторів, семохімикати, репелентів, аттрактантів, феромонів, стимуляторів підгодовування або інших біологічно активних сполучень або ентомопатогенних бактерій, вірусів або грибів для утвору мультикомпонентної суміші, що забезпечує більш широкий спектр сільськогосподарського захисту. Приклади таких сільськогосподарських засобів захисту, які можна використовувати в способах по винаходу, включають: інсектициди, такі як абамектин, ацефат, ацетаміприд, амідофлумет (5-1955), авермектин, азадирахтин, азинфос-метил, біфентрин, біфеназат, бупрофезин, карбофуран, картап, хлорфенапір, хлорфлуазурон, хлорпірифос, хлорпірифос-метил, хромафенозид, клотіанідин, цифлуметофен, цифлутрин, бета-цифлутрин, цигалотрин, лямбда-цигалотрин, циперметрин, циромазин, дельтаметрин, діафентіурон, діазинон, діелдрин, дифлубензурон, димефлутрин, диметоат, динотефуран, діофенолан, емамектин, ендосульфан, есфенвалерат, етипрол, фенотіокарб, феноксикарб, фенпропатрин, фенвалерат, фипроніл, флоникамід, флубендіамід, флуцитринат, тау-флувалинат, флуфенирим (ШК-50701), флуфеноксурон, фонофос, галофенозид, гексафлумурон, гидраметилнон, імідаклоприд, індоксакарб, ізофенфос, луфенурон, малатіон, метафлумізон, металдегид, метамідофос, метидатіон, метоміл, метопрен, метоксихлор, метофлутрин, монокротофос, метоксифенозид, нітенпірам, нітіазин, новалурон, новифлумурон (ХОЕ-007), оксаміл, паратіон, паратіон-метил, перметрин, форат, фосалон, фосмет, фосфамідон, піримикарб, профенофос, профлутрин, піметрозин, пірафлупрол, піретрин, піридалил, пірипрол, пірипроксифен, ротенон, ріанодин, спіносад, спіродиклофен, спіромезифен (В5М 2060), спіротетрамат, сульпрофос, тебуфенозид, тефлубензурон, тефлутрин, тербуфос, тетрахлорвинфос, тіаклоприд, тіаметоксам, тіодикарб, трисультап-натрій, тралометрин, тріазамат, трихлорфон і трифлумурон; фунгіциди, такі як ацибензолар, альдиморф, амісульбром, азаконазол, азоксистробін, беналаксил, беноміл, бентіавалікарб, бентіавалікаррб-ізопропіл, біноміал, біфеніл, бітертанол, бластицидин-5, суміш
Бордо (трьеохосновний сульфат міді), борсалид/нікобіфен, бромуконазол, бупіримат, бутіобат, карбоксин, карпропамід, каптафол, каптан, карбедазим, хлоронеб, хлорталоніл, хлозолинат, клотримазол, оксихлорид міді, солі міді, такі як сульфат міді й гідроксид міді, ціазофамід, цифлунамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродиніл, дихлорфлуанід, диклоцимет, дикломезин, диклоран, діетофенкарб, дифеноконазол, диметоморф, димоксистробін, диниконазол, диниконазол-М, динокап, дискостробін, дитіанон, додеморф, додин, еконазол, етаконазол, едифенфос, епоксиконазол, етабоксам, етиримол, етридіазол, фамоксадон, фенамідон, фенаримол, фенбуконазол, фенкарамід, фенфурам, фенгексамід, феноксаніл, фенпиклоніл, фенпропідин, фенпропіморф, ацетат фентина, гідроксид фентина, фербам, ферфуразоат, феримзон, флуазинам, флудіоксоніл, флуметовер, флуопіколід, флуоксастробін, флуквінконазол, флузилазол, флусульфамід, флутоланіл, флутріафол, фолпет, фосетил- алюміній, фуберидазол, фуралаксил, фураметапір, гексаконазол, гимексазол, гуазатин, ентомопатогенних бактерій, імибенконазол, іминоктадин, іодикарб, іпконазол, іпробенфос, іпродіон, іпровалікарб, ізоконазол, ізопротіолан, касугаміцин, крезоксим-метил, манкозеб, мандипропамід, манеб, мапанипірин, мефеноксам, мепроніл, металаксил, метконазол, метасульфокарб, метирам, метоміностробін/феноміностробін, мепаніпірим, метрафенон, миконазол, миклобутаніл, непро-азоцин (метанарсонат заліза-ІІ), нуаримол, октилинон, офурас, ооризастробін, оксадиксил, оксолінова кислота, окспоконазол, оксикарбоксин, паклобутразол, пенконазол, пенцикурон, пентіопірад, перфуразоат, фосфонова кислота, 60 фталид, пікобензамід, пікоксистробін, поліоксин, пробеназол, прохлораз, процімідон,
пропамокарб, пропамокарб-гідрохлорид, пропіконазол, пропінеб, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, пріазофос, пірифенокс, піриметаніл, пірифенокс, піролнітрин, піроквилон, квінконазол, квіноксифен, хінтозин, силтіофам, симеконазол, спіроксамін, стрептоміцин, сірка, тебуконазол, техразин, теклофталам, техназин, тетраконазол, тіабендазол, тифлузамід, тіофанат, тіофанат-метил, тирам, тіадиніл, толклофос-метил, толифлуанід, тріадимефон, тріадименол, тріаримол, тріазоксид, тридеморф, тримопрамід трициклазол, трифлоксистробін, трифорин, тритиконазол, униконазол, валідаміцин, вінклозолин, зинеб, зирам і зоксамід; нематоциди, такі як альдикарб, оксаміл ії фенаміфос; бактерициди, такі як стрептоміцин; акарициди, такі як амітраз, хінометіонат, хлорбензилат, цигексатин, дикофол, діенохлор, етоксазол, феназаквін, оксид фенбутатина, фенопропатрин, фенпіроксимат, гекситіазокс, пропаргит, піридабен і тебуфенпірад, і біологічні засоби, що включають ентомопатогенні бактерії, такі як Васійи5 ІНигіпдіепзів 5иБ5р. Аїігамаї, Васійшв «игіпдіепвів 5Иирер. Китгеїакі, і інкапсульованні дельта-ендотоксини Васійй5 Шигіпдіепзіз (наприклад, СеїЇсар, МРМ, МРМІЇ); ентомопатогенні гриби, такі як гриб зелена мускардина; і ентомопатогенниє віруси, що включають бакуловируси, нуклеополієдровируси (МРМУ), тому що НА2МРМ, АТМРМ; і віруси гранулеза (СУМ), такі як СраУ. Масові відносини цих різноманітних компонентів суміші з іншими композиціями (наприклад, гербіциди), використовуваними в способах по винаходу, як правило, становлять від 100:1 до 1:100 або від 30:1 до 1:30, від 1071 до 1:10 або від 4:1 до 1:4.
Даний винахід також відноситься до композиції, що містить біологічно ефективну кількість інтересуючого гербіциду, або суміші гербіцидів і ефективна кількість щонайменше одного додаткового біологічно активного сполучення або засобу, і вона може додатково містити щонайменше один засіб з поверхнево-активної речовини, твердого наповнювача або рідкого наповнювача. Прикладамі таких біологічне активних сполучень або агентів є: інсектициди, такі як абамектин, ацефат, ацетаміприд, амідофлумет (5-1955), авермектин, азадирахтин, азинфос- метил, біфентрин, біфеназат, бупрофезин, карбофуран, хлорфенапір, хлорфлуазурон, хлорпірифос, хлорпірифос-метил, хромафенозид, клотіанідин, цифлутрин, бета-цифлутрин, цигалотрин, лямбда-цигалотрин, циперметрин, циромазин, дельтаметрин, діафентіурон, діазинон, дифлубензурон, диметоат, діофенолан, емамектин, ендосульфан, есфенвалерат, етипрол, фенотіокарб, феноксикарб, фенпропатрин, фенвалерат, фіпроніл, флоникамід,
Зо флуцитринат, тау-флувалинат, флуфенирим (ШК-50701), флуфеноксурон, фонофос, галофенозид, гексафлумурон, імідаклоприд, індоксакарб, ізофенфос, луфенурон, малатіон, металдегид, метамідофос, метидатіон, метоміл, метопрен, метоксихлор, монокротофос, метоксифенозид, нитіазін, новалурон, новифлумурон (ХОЕ-007), оксаміл, паратіон, паратіон- метил, перметрін, форат, фосалон, фосмет, фосфамідон, піримікарб, профенофос, піметрозін, піридалил, пірипроксифен, ротенон, спіносад, спіромезифен (ВМ 2060), сульпрофос, тебуфенозид, тефлубензурон, тефлутрін, тербуфос, тетрахлорвінфос, тіаклоприд, тіаметоксам, тіодикарб, трисультап-натрій, тралометрін, трихлорфон і трифлумурон; фунгіциди, такі як ацибензолар, азоциклостробін, беномл, бластицидін-5, суміш Бордо (трьохосновний сульфат міді), бромуконазол, карпропамід, каптафол, каптан, карбедазим, хлоронеб, хлорталоніл, оксихлорид міді, солі міді, цифлуфенамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродініл, (5)-3,5- дихлор-М-(З-хлор-1-етил-1-метил-2-оксопропіл)-4-метилбензамід (КН 7281), диклоцимет (5- 2900), дикломезін, диклоран, дифеноконазол, 5)-3,5-дихлор-5-метил-2-(метилтіо)-о-феніл-3- (феніламіно)-4Н-імідазол-4-он (КР 407213), диметоморф, димоксистробін, діниконазол, діниконазол-М, додін, едифенфос, епоксиконазол, фамоксадон, фенамідон, фенаримол, фенбуконазол, фенкарамід (52Х0722), фенпиклоніл, фенпропідін, фенпропіморф, ацетат фентіну, гідроксид фентіну, флуазінам, флудіоксоніл, флуметовер (КРА 403397), флуморф/флуморлін (5УР-1190), флуоксастробін (НЕС 5725), флуквінконазол, флузилазол, флутоланіл, флутріафол, фолпет, фосетил-алюміній, фуралаксил, фураметапір (5-82658), гексаконазол, іпконазол, іпробенфос, іпродіон, ізопротіолан, касугаміцін, крезоксим-метил,
БО манкозеб, манеб, мефеноксам, мепроніл, металаксил, метконазол, метоміностробін/феноміностробін (З5Е-126), метрафенон (АС375839), миклобутаніл, нео-азоцін (метанарсонат заліза-ІП), нікобірен (ВАБ 510), оризастробін, оксадиксил, пенконазол, пенцикурон, пробеназол, прохлораз, пропамокарб, пропіконазол, проквіназид (ОРХ-КОЗ26), протіоконазол (ШАШ 6476), пірифенокс, піраклостробін, піриметаніл, піроквилон, квіноксифен, спіроксамін, сірка, тебуконазол, тетраконазол, тіабендазол, тифлузамід, тіофанат-метил, тирам, тіадініл, тріадимефон, тріадименол, трициклазол, трифлоксистробін, тритиконазол, валідаміцін і вінклозолін; нематоциди, такі як альдикарб, оксаміл і фенаміфос; бактерициди, такі як стрептоміцін; акарициди, такі як амітраз, хінометіонат, хлорбензилат, цигексатін, дикофол, діенохлор, етоксазол, феназаквін, оксид фенбутатіна, фенопропатрін, фенпіроксимат, 60 гекситіазокс, пропаргит, піридабен і тебуфенпірад, і біологічні засоби, що включають ентомопатогенние бактерії, такі як Васійи5 ІПигіпдіепвіє вирер. Аїігамаї, Васіййв5 Іпигіпдіепвів вир. Китгеїакі, і інкапсульованні дельта-ендотоксіни Васіїш5 ІПигіпдієпві5 (наприклад, СеїІсар,
МРУ, МРМІЇ); ентомопатогенні гриби, такі як гриб зелена мускардіна; і ентомопатогенні віруси, що включають бакуловируси, нуклеополієдровируси (МРМ), тому що Наопрм, Аїпру; і віруси гранулеза (БМ), такі як Сруду. Способи за вінаходом можуть також включати застосування рослін, генетично трансформованих для того, щоб експресувати білки, токсичні для безхребетних-шкідників (такі як дельта-ендотоксіни Васійй5 Іпигіпдіеп5іб). У таких варіантах здійснення ефект наношувних ззовні сполучень для контролю шкідників може бути сінергічним з експресованими білкамі-токсінамі.
Основні посилання на ці сільськогосподарські захисні засоби включають Те РевФіїсіде
Мапиаї, 131 Едйіоп, Тотіїп, Еа., Вгйі5п Стор Ргоїесіоп Соишпсії, Рагппат, З!игеу, Ш.К., 2003 і Те
Віоревіїсіде Мапиаї!, 279 Еайіоп, Сорріпо, Еа., Вийїви Стор Ргоїесіп Соипсії, Раптппат, Зитеу,
О.К., 2001.
У деяких випадках поєднанням з іншими сполученнями або засобамі для контролю безхребетних-шкідників, що мають подібний спектр контролю, але інший спосіб дії, будуть, зокрема, кращими для керування стійкістю. Таким чіном, композиції по даному вінаходу можуть додатково містити біологічно ефективну кількість щонайменше одного додаткового сполучення або засобу для контролю шкідників-безхребетних, що має, подібний спектр контролю, але інший спосіб дії. Контакт росліни, генетично модифікованого так, що воно експресує сполучення захисту росліни (наприклад, білок), або місця перебування росліни з біологічно ефективною кількістю сполучення по даному вінаходу може також надавати більш широкий спектр захисту росліни й бути кращою для керування стійкістю.
Таким чіном, у способах за вінаходом може використовуватися гербіцид або поєднання гербіцидів, вони можуть додатково включати застосування інсектицидів і/або фунгіцидів, і/або інших сільськогосподарських хімічних сполук, таких як добрива. Застосування таких комбінованих способів обробки за вінаходом може розширити спектр активності проти додаткових видів бур'янів і пригнічує розмноження будь-яких стійких біотипів.
Способи за вінаходом можуть додатково використовувати застосування регуляторів росту рослін, таких як авигліцін, М-(фенілметил)-1Н-пурін-6-амін, етефон, епохолеон, гібберелінова
Ко) кислота, гібберелін А і А;7, білок харпін, хлорид мепиквату, прогексадіон кальцію, прогідрожасмон, нітрофенолят натрію й трінексапак-метил, і організми, що модулюють ріст росліни, такі як Васіїи5 сегеи5 штаму ВРО1.
Варіанти здійснення даного вінаходу далі визначені в наступних прикладах. Слід розуміти, що ці приклади наведені тільки в якості ілюстрації. З наведеної вище дискусії й цих прикладів фахівець у даній галузі може встановити характеристики, властиві даному вінаходу, без відхилення від його сутності й обсягу, може осущестить різні зміни й модифікації варіантів здійснення вінаходу, для адаптації його до різних варіантів застосування й умов. Таким чіном, різні модифікації варіанти здійснення вінаходу на додаток до тем, які показані й описані в даному документі, зрозумілі фахівцям у даній ділянки з наведеного вище опису. Такі модифікації також, як мається на увазі, попадають в обсяг прикладеної формули вінаходу.
Експериментальна частіна
Наступні скорочення використовують при описі даного вінаходу.
А 5 білок ацетолактатсинтаза п.о. пари основ діуаїйб21 ген гліфосатуцетилтрансферази
СІ МАТА621 білок гліфосатуцетилтрансфераза 2т-аїв ген ацетолактатсинтази Вгаззіса дикого типу 2т-пга модифікована версія гена ацетолактатсинтази Вгавззіса т.п.о. тисяч пар основ
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція отв нетрансльована ділянка
Приклад 1. Характеристика послідовності вставки й прикордонної фланкуючої послідовності події Вгаззіса ОРО-73496-4
Рапс (Вгаззіса пари І.) модифікували шляхом вставки гена гліросатуцетилтрансферази (діуа!4621), що відбувається з Васіїи5 Іспепітгттів і оптимізованого шляхом генного тасування.
Плазмида РНР28181 містить експресуючу касету, описану тут і далі.
Конструкцію ДНК РНР28181 одержували клонуванням фрагмента САТ4621:РІМІ ТЕКМ, вирізаного з конструкції ДНК р251І 149 подвійним розщепленням Ватні і М'єї, нижче промотору
АТ-ОВО10 конструкції ДНК ОС272 у ті ж ділянки Ватні і М'ієїЇ з використанням ДНК -лигази Т4
(Мемж/ Епдіапа Габ). Отримана в результаті ДНК РНР28181 містить експресуючі касети: АТ-
ОВО10 (ОРОМТ) РКО:САТА4621:РІМІ!Ї ТЕКМ. Див. фігуру 1 і фігуру 2.
Фрагмент ДНК РНР28181А довжіною 2112 п.о. одержували із плазміди РНР28181 подвійним розщепленням рестрикціонними ферментамі Ніпайїї і Моїї. Розщеплену ДНК -плазміду розділяли в 196 агарозном гелі шляхом електрофореза. Смугу ДНК правильного розміру вирізали, і екстрагували фрагмент ДНК із використанням набору для екстракції фрагментів ДНК Оіадеп (Сіадеп). Чистоту фрагментів ДНК перевіряли шляхом ПЛР серією розведень із позитивним контролем ДНК атржю, оскільки плазмида РНР28181 містить у своєму каркасі ген атржк.
Концентрацію фрагментів ДНК вимірювали спектрофотометричне й підтверджували порівнянням з низькомолекулярними маркерамі ДНК (І ІпМітодеп) в агарозном гелі.
Трансформацію проводили, по суті, як описано Спеп апа Тиїбіегат у публікації патентної заявки США Мо 2007/0107077. Бруньки збирали від донорської лінії М51822ВС і стерилізували.
Потім бруньки гомогенизировали, фільтрували й промивали для збору мікроспор. Отриману в результаті суспензію мікроспор доводили до встановленої щільності й культивували протягом 2 доби. Потім виділяли ембріогенние мікроспори шляхом градієнтного центрифугвання й культивували.
Золоті частки, покриті фрагментом ДНК РНР28181А використовували для трансформації.
Біолістичну трансформацію проводили з використанням системи доставки часток РОБ-1000/Не (Віо-Кай, Негсшез, СА), як описано Кіеїп, еї аїІ., (1987) Маїшге 327:70-73. Трансформовані ембріогенні мікроспори культивували у свіжому середовищі в темряві протягом 10-12 доби, а потім у неяскравому світлі протягом 1-3 тижнів. Зелені ембріони переносили у свіже середовище й культивували протягом двох тижнів для селекції на стійкість до гліфосату.
Гермінативні пагони й/або росліни переносили в середовище для вирощування, доповнену гліфосатом.
Ген діуаї4б21 одержували із грунтової бактерії Васійив5 Ііспепітоптібз і сінтезували за допомогою процесу тасування генів для оптимізації активності ацетилтрансферази ферменту
СІ МАТА621 (Сазе, єї а!., (2004) бсіепсе 304:1151-1154).
Вбудований фрагмент (фігура 3) з даної плазміди містить генну касету аіуаї4621. Експресія гена діуаї4621 контролюється регуляторною ділянкою ОВОТ10 з Агабрідорзів і термінатором ріпії
Зо (див. таблицю 4). Зміст фрагмента трансформації плазміди РНР28181 показано в таблиці 4.
Генетичні елементи плазміди РНР28181, використані для одержання ОР-073496-4, показано в таблиці 3.
Таблиця З
Опис генетичних елементів плазміди РНР28181
Відомий й . плазмиде - |Розмір (пара
Ділянка генетичний Опис (положення пар основ) елемент основ)
Фрагмент Див. таблицю 4 для трансформації | від 1 до 2112 2112 інформації з елементів цієї
РНР28181А ділянки
Конструкція | Включає ДНК із різних джерел для плазміди від 2113 до 4770 наведені нижче 2658 конструкції плазміди й елементи реплікації плазміди
Ген ВД-лактамази, кодуєчий й стійкість до ампицилліну, з Е. від 2736 до 3596 іа (Арі) 861 | сої (вцісійе, 1978) (Уапівсп-
Ре!топ, вї аї., 1984
Фрагмент Нає ІЇ, що містить, . ! бактеріальну ділянку початку від 4170 до 4539 (|огі соЇєї 370 реплікації (, що відбувається з со!е1) (Тотігаула вї аї., 1977
Таблиця 4
Опис генетичних елементів фрагмента трансформації РНР28181А
Локалізація на Розмі . . озмір фрагменті Генетичний о основ) основ ділянку елементів
Версія промоторной ділянки з гена . Промотор поліубіквітіна Агабідорвзів Іпаійапа ОВО10 (Мотті5
Від 8 до 1312 Ово1о0 1305 еї а!, 1993), розроблена Е. І. диропі ае Метоиг5 апа Сотрап ділянка елементів . Сінтетичний ген гліфосат-п-ацетилтрансферази ділянка елементів
Термінаторная ділянку із гена інгібітору
Від 1797 до 2106 | Термінатор ріпії 310 протеінази ІЇ оїапит Шрегозит (Кеї! єї а!. 1986;
Ап еї а!., 1989
ЕЕСДЕСВ У ий Я -інннйнйнвнінинний ділянка елементів
Визначали нуклеотидну послідовність вбудованої ДНК події ОР-073496-4. За допомогою
ПЛР-ампліфікації унікальних ділянок сполучення, що перекриваються з уведеними генетичними елементамі, можна відрізнити росліни ЮР-073496-4 від них не модифікованих генетично варіантів, і її можна використовувати для скрінінга присутності вбудованої ДНК навіть при дуже низьких концентраціях. Нижче описаний аналіз геномної ДНК із Вгаззіса ОР-073496-4 шляхом специфічної відносно конструкцій полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Конкретно, геномну ДНК із тестуємого матеріалу (рослінний матеріал події ОР-073496-4) і контрольного матеріалу (рослінний матеріал не модифікованої генетично Вгазвіса з генетичним фоном, що представляють фон цієї події) виділяли й піддавали кількісної ПЛР-ампліфікації з використанням специфічної відносно конструкції пари праймерів. Продукти ПЛР розділяли в 1,595 або 295 агарозних гелях для підтвердження присутності вбудованої конструкції в геномної
ДНК , отриманої з тестуємого матеріалу, і її відсутності в геномної ДНК , отриманої з контрольного матеріалу. Контрольний стандарт (сходовий маркер ДНК із різницею в 100 пару основ; Іпмігодеп Согрогайоп, каталожний Мо 10380-012) використовують для визначення розміру продукту ПЛР.
Тестируемий і контрольний зразки одержували з рослін. Екстракцію геномной ДНК із тестируемих і контрольних тканін проводять із використанням стандартного протоколу екстрації за допомогою сечовіни у випадку тканіни листів. Геномну ДНК із тестуємих й контрольних зразків виділяють із використанням системи для рослінної ДНК Умігагаєю Маодпеїїіс 96 (Рготеда
Согрогайоп, каталожний Мо ЕЕ3760) у випадку тканіни насінь. Геномну ДНК кількісно визначають на спектрофлуориметре з використанням реагенту Рісодгееп?т? (МоїІесшаг Ргобев, Іпс., Еидепе,
ОК) і/або візуалізують на агарозном гелі для підтвердження концентрації, певним шляхом кількісного аналізу, і для визначення якості ДНК.
Геномну ДНК , виділену з рослінного матеріалу події ОР-073496-4 і контрольних зразків, піддають ампліфікація ПЛР (РСК Мабзієег Міх, каталожний Ме 7505 від Рготеда Согрогайоп), з використанням специфічної відносно конструкції пари праймерів, яка перекриває, щонайменше, частіну кодуючої ділянки аіуаї4621 і забезпечує унікальну ідентифікацію події в кукурудзі ОР-
Зо 073496-4. Другий набір праймерів використовують для ампліфікації ендогенного гена у якоиті позитивного контролю ампліфікації ПЛР. Ділянка-мішень ПЛР і розмір очікуваного продукту ПЛР для кожного набору праймерів порівнюють зі спостережуваними результатамі.
Приклад 2. Характеристика події ОР-073496-4 шляхом блота по Саузерну
Аналізи за допомогою блота по Саузерну (ЗошПепт, 1975) проводять для дослідження числа ділянок вставки трансформуючої ДНК , числа копій і функціональної цілісності генетичних елементів і відсутності послідовностей плазмідного кістяка.
Використовуваний спосіб, загалом, описаний у такий спосіб. Геномну ДНК екстрагують із ліофілізованної тканіни, отриманої з Вгаззіса ЮР-073496-4 і не модифікованих генетично контрольних рослін. Геномну ДНК розщеплюють ферментамі - рестрикційними ендонуклеазамиі й розділяють по розміру на агарозном гелі. Маркер молекулярної маси розділяють разом зі зразкамі для цілей оцінки розміру. Фрагменти ДНК, розділені на агарозном гелі, депуринизують, денатурирують і нейтралізують іп 5йи, і переносять на нейлону мембрану. Після переносу на мембрану ДНК зв'язують із мембраною шляхом перехресного зв'язування шляхом УФф.
Фрагменти, гомологичние гена діуаї4621, одержують шляхом ПЛР із плазміди РНР28181, розділяють на агарозном гелі по розміру, вирізують і очищають із використанням набору екстракції з гелю. Мічений зонд гібридизують з більшої цільовий ДНК на нейлонових мембранах для детекції специфічних фрагментів. Промивання після гібридизації проводять при високій твердості. Блоти експонують на рентгенівську плівку одного разу або в кілька моментів часу для детектування гібридизовавшихся фрагментів і візуалізації маркерів молекулярної маси.
Приклад 3. Експресія вставок
Експресію білка СІ МАТ4621 оцінюють із використанням тканіни листів, отриманої із трансгенних рослін. Наприклад, чотири свіжі пучки листів можуть бути зібрані й розмелені в буфері для екстракції зразка з використанням Сеподгіпдег (б5рех Сегпіргер). Загальний екстрагируемий білок (ТЕР) можна визначати з використанням аналізу білка Віо-Кай, який заснований на процедурі зв'язування барвника по Бредфорду. Екстракти зразка можуть розбавлятися в буфері для екстракції зразка для аналізу ЕГ ІА.
Рівні експресії білка САТ4621 в Вгаззіса ОР-073496-4 можна визначати кількісним твердофазним іммуноферментним аналізом (ЕГІ5А) зразків, отриманих з різних місць поля для випробувань. Репликати зразків насінь (три репликата) можна одержувати з рослін ОР-073496- 4, оброблених максимально рекомендованої на етикетці концентрацією гербіциду гліфосату
Тоиспдомупе» ТоїаІ (500 г/л гліфосату у вигляді калієвої солі; 0,60-1,35 л/га), нанесеної на сім'ядолю на стадії 6 листів, оскільки це відтворює найбільш імовірний сценарій комерційного
Зо культивування.
Іншим шляхом верифікації експресії вставки в росліни Вгаззіса ЮОР-073496-4 є оцінка стійкості трансформованих рослін до гліфосату. Стабільність у багатьох поколіннях і розщеплення в поколінні ознаки стійкості до гербіциду, забезпечуваного експресією ферменту
САТ4621, підтверджують функціональним аналізом стійкості до гербіцидів. Тести проводять на 35 щонайменше трьох поколіннях рослінного матеріалу. Ушкодження гербіцидом може оцінюватися, як описано в таблиці 5.
Таблиця 5
Система оцінки ушкодження культури гербіцидом від 0 до 100 0 | Немаєефекту, | Нігнобленняабоушкодженнякультури./-:/ /-: 10 Слабке знебарвлення або вповільнення росту культури 20 Слабкий ефект Деяке знебарвлення, уповільнення або гноблення росту
Більш виражене ушкодження культури, але нетривале
Помірне ушкодження, культура, як правило, видужує 50 Помірний ефект Більш тривале ушкодження культури, видужання сумнівне бо Тривале ушкодження культури, немає видужання 70 Важке ушкодження культури й стійкі втрати 80 Виражений ефект Культура майже зруйнована - рослін мало, що вижили 90 Залишилися живими тільки окремі росліни культури нижня 40 Приклад 4. Специфічний відносно конструкції аналіз ПЛР події Вгаззіса ОР-О73496-4
Геномну ДНК, виділену з листів каноли ОР-073496-4 (покоління Т2Е2) і контрольної каноли (не модифікованої генетично), піддавали ампліфікації шляхом ПЛР (Коспе Нідп Ріаєїйу РСВ
Махтіег Кі, Коспе, каталожний Мо 12140314001) з використанням специфічної відносно конструкції пари праймерів (09-0-3290/09-0-3288), яка перекриває промотор убіквітіну й касету гена даї4621 (фігура 4). Другий набір праймерів (09-0-2812/09-0-2813) використовували для ампліфікації ендогенного гена каноли РаїА у якості позитивного контролю ампліфікації ПЛР.
Ділянка-Мішень ПЛР і розмір очікуваного ПЛР-продукту для кожного набору праймерів показано в таблиці 8. Реагенти для ПЛР і умови реакції показано в таблиці 9. Послідовності праймерів, використані в даному дослідженні, перераховано в таблиці 10. У даному дослідженні 100 нг геномної ДНК із листів використовували у всіх реакціях ПЛР.
Продукт ПЛР розміром приблизно 600 п.о., ампліфікованний за допомогою специфічного відносно конструкції набору праймерів 09-0-3290/09-0-3288, спостерігали в реакціях ПЛР. із використанням плазміди РНР28181 /10 нг) у якості матриці й трьох рослін каноли ОР-073496-4, але він був відсутній у трьох контрольних рослінах каноли, і в контролі без матриці (фігура 5).
Зразки завантажували, як показано в таблиці 6.
Таблиця 6 11111116 |КаноларР-0734964711.Й..:К(СБ/...////СЄЄС:(/ и/С:Л ИС/С/С/С/С/С/С/С/:(КБ С «КЇ 71171118 |КаноларР-0734964713...-:/(-(: (ХГ Ї//ССССССССССССсСсС.у 1111119 |Контрольбезматриції/:/ /(/11111111сСсСсСсС
Ці результати відповідають очікуваному розміру продукту ПЛР (675 п.о.) для зразків, що містять геномну ДНК каноли ОР-073496-4. Продукт ПЛР розміром приблизно 450 п.о. спостерігали для каноли ОР-073496-4 і контрольних рослін каноли після реакції ПЛР із набором праймерів 09-0-2812/09-0-2813 для детекції ендогенного гена Баг (фігура 6). Зразки завантажували, як показано в таблиці 7.
Таблиця 7 71171116 |КаноларР-073496411.Й..:/(КК:(К( ССС: 7771 .у 77171718 |КаноларР-073496413. .-:/(иИ(::К:Йф:КУ0ИС:У/../С:44СС::и44сСсСсСс20 7111119 |Контрольбезматриції/./://:/(1111СсСсСсС
Ці результати відповідають очікуваному розміру продукту ПЛР (506 п.о.) для зразків геномної ДНК , що містять ендогенний ген каноли Баг. Смугу ендогенної мішені не спостерігали в контролі, що не містить матрицю.
Таблиця 8
Ділянка геномной ДНК - мішень для ПЛР і очікуваний розмір продуктів ПЛР . - . . ще Очікуваний розмір т т Специфічний для конструкції 09-0-3290/09-0-3288 промотор убіквітіну й даї4621 675 09-0-2812/09-0-2813 Ендогенний ген каноли Рад!
ПЛР: ПОЛІМЕРАЗНАЯ ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ п.о. ПАРА ОСНОВ 1 Номер доступу СепрапкК для гена Рад Х87842.1. Цю послідовність використовували для конструювання праймерів ПЛР. нижня
Таблиця 9
Реагенти для ПЛР і умови реакції
Реагенти для ПЛР Умови реакції ПЛР
Реагент Об'єм Елемент циклу Темп. Час (сек) Число (мкл) сс) циклів нг/мкл 1 Вихідна денатурація 94 120 1
Праймер 1 (10 мкм
Праймер 2 (10 мкм 35
РСВ Мавівг Міх" аанго 11111111 Циклвитримування | 4 | Доаналізу
ПЛР: ПОЛІМЕРАЗНАЯ ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ дан»: ПРО: бідистильованна вода " Носне Нідп Рідеїйу Мавієг Міх
Таблиця 10
Список праймерних послідовностей, використовуваних у реакціях ПЛР -0-32 п б 0903290 | достТАТТОСТТСАССОССТТАОС ромотор усіквітіну 09-0-3288 14621
ОСТСАССТТОСТОСААТОААОССАС За 09-0-2812 ЗЕО Ю МО: 6 Ендогенний ЕагА каноли
САСАСААСОСООСТТСАААСАСТТАСАСАТО
09-0-2813 ЗО о МО 7: Ендогенний РГагсА каноли
АСААТОТСАТСТТОСТООСАТТСТСТТСТО
Приклад 5. Подальша характеристика вставки й фланкуючої крайової послідовності події
Вгазвзіса ОР-073496-4
Для характеристики цілісності вбудованої ДНК і ділянки вставки в геном визначали фланкуючі прикордонні ділянки геномної ДНК події ОР-073496-4. Фланкуюча геномна послідовність ЮР-073496-4 включена в ЗЕО І МО: 2. Ампліфікація ПЛР вбудованої й прикордонних послідовностей підтверджує, що прикордонні ділянки походять із Вгаввіса, і що ділянки сполучення можна використовувати для ідентифікації Вгаззіса ОР-073496-4. Разом, характеристика вбудованих і геномних прикордонних послідовностей разом з даними блота по
Саузерну вказують на одіничну вставку фрагмента ДНК , присутній в геномі Вгазвзіса. Потім застосовують різні молекулярні способи для специфічної характеристики ділянки вставки.
Для початкової характеристики фланкуючі прикордонні ділянки в геномі клонують і секвенують з використанням способів СепотемУуаіКег і зворотної ПЛР. З використанням інформації про фланкуючу прикордонну послідовність проводять ПЛР на геномной ДНК ОрР- 073496-4 і немодифікованої контрольної геномної ДНК . Фахівці в даній галузі також включають в експеримент контрольну ПЛР із використанням ендогенного гена для верифікації того, що виділена геномна ДНК підходить для ампліфікації ПЛР.
Таблиця 11
Основаннье на ПЦР. специфичньсе совет способь! детектировання
Ї 10-0- ря: ЕЕ Ес ЗНИННИН ШИН ШЕ
ОР-бтзАеБ ель 5ЕДІЮ МО: | СТТССТАААСЯТ | 5ЕДІЮ | АТСАТСАСТТСАТА 4 | 20 сссо МО:23 САДАССТОС си ЖЕ ШЕ р дян
Ов-ф7з496. времени, ЗЕ0ІО | АТАБСТСАТТАЄС | ЗЕОЮ | АСТТСААСАТСТТА 09-араЗ АССАТАТТСТТ 4 ! МО:21 дет МО:24 А 5ЕО ЛО МО:26 в 1 вАМ Мов й ! в Ї 09-0-3249 АСАБАТОДАСТ ові. всткніннинй 1 реальном СОЮ товссасвАєт | БО САБСТТОАСАТСС 09-0ря? ААСААСААТСА чан | Мог22 Ас Мо:25 АСАТОСТТАААТАТ | БОЮ МО:27 ТСАТСТТС Ам мов
Таблиця 12
Зведена таблиця 5ЕО ІЮ МО промотор убіквітіну даї4621
ШСЯНЙ ЕК сій йно
Мішень - ендогенний РасА каноли
Ендогенний РагА каноли 8 | Праваприкордоннагеномнапослідовність./-/:////1111111с1ш 9 | Ліваприкордоннагеномнапослідовність.:/-:/|//НСССС1111с1с1 трансгена (10 п.о./10 п.о.) (10 п.о.Л10 п.о.) трансгена (20 п.о./20 п.о.) (20 п.о./20 п.о.) трансгена (30 п.о./30 п.о.) п.о./30 п.о.
Продовження таблиці 12
Одніну застосовують у даному документі для позначення одного або більшого числа (тобто, щонайменше одного) граматичних об'єктів, про яких мова йде. Наприклад, "елемент" означає одін або кілька елементів.
Усі публікації й патентні заявки, зазначені в специфікації, є показником рівня фахівців в галузі, до якої відноситься даний вінахід. Усі публікації й патентні заявки включені в даний документ як посилання тією самою мірою, як якби окрема публікація або патентна заявка була б специфічно й окремо зазначена як включена в якості посилання.
Хоча зазначене вище вінахід описаний у деяких подробицях у якості ілюстрації й прикладу для цілей ясності розуміння, мабуть, що деякі зміни й модифікації можуть бути застосовані на практиці в обсязі прикладеної формули вінаходу.
пити трі еф тиви кути ОК ЕД МКУ ТУ нечеа Кля. - тен гону гук «лм «Пар рвих, фе пох ом СЕ х, КЕ КОКО
Ст; , Удав
ЗААКЖВ 8 0ОЖЖЕДКХЬ фомтшщ Я уп ух Сидів пане
КЛЕМ АМу кю ОМС ХК АК стуки, стаха тк ху тод ду
МІК ож ДЕКО МН ЕХЬМВ, В. еВ, чи хг що осикою
ЛЕН піц ск роЕЕ ТОК ди
ТК 0 НЕД ЕВ СЕК
НЕ ЧИМ гя
ЦИ «і смт ве
МІУ НЕ, КН оо щих кгц КУ ККУ еІМавш. КОП Е
Ех БІДУ дах У. ЛИ м БІ КИи приді иа ду тиме Ту СО тах кдиМ кома Мом їхАЦ Міка му В МАМ МО АЮ НО Ка М ЗА А ЮТЬ МІЖ 0 ДТ КИМ А
УК зд Й Жілу студ лу тут Кі
ПО ИИК ТЕ І ІЕМ аг мювя о ов бр АОТЯ І К г
Ки ль о ЕК ВВ Но
ЄМО и "ж а ника
ТАЛМ ко от ЖЖ или о жи пер Кк от й у х Ух
СТ бі ати о ухузищоме Зб и В в во м ие но м КС м КК Й В ЕК а ЕЕ У ш шт т МОХ хлол ч дх оС но ее о
Лю вна ТІЙ :
Межа МОН ІК Ух : копчене і м : «Тих ти еххВідіщо пе у пу си : на во С о ак МО у Вк ва : и в ем «ХУ Мб тут УЖ УА ДОЛ жуки Мої жилку лю їх ох псих мем сек пек й КОМІ «МИ КелмаМ КАВИ Молекула вдів кю Кім сте СД
Молю ХМ деку лькм, МИЛІ НЯМ пошани СТОК КЕН ср хх
ПК НЯ чар о ол маш Во: 1 тал АгщЩЯ ср ик Жах Ви жк Вл бджу ЖИрухе тут ж до Єопут ше Але ее я М Буш БО ТАБ АН жа Аа БЕ КЕ БУХ ЩЕ мем х Е Б хх щ
Н у їй ху
Кх М А ПО
Шон МІ а Б ККУ Не жо нку М дж чн ШЕ ЗИ ен пи жа дих. уд жк ЖІ су бог Хух пз юю чех Жака Бл ку ДУМ сх т: Ки Ки Мих ра
Мов Бе Уа їде: м Кже дав су ги дае І Аля му дюни БКЦ
Ух то Я
Же «й БЖ
У ре о тах рез диму юю Ж м ЖОМУ у озм Хв фу З зл ЧЛ ср 0 ---м же ав Беж АХИ шшЖК дав маш МЛ Ме АТ дьшУ КМ Суб кю
Ки й Кк
Би я Б с А ЯК пл нг. КО шах сш ли З Од же тм Ж їх чи о Аж чек о Я хх тре тих хо Ст іх ау ІІ Кк ЩО піз БІ її 1їуї КОХ лю Ах КІЗ хіт;
БУМ меш їні Біє ши За б за ишж М АЮ дій яЯвля МЕ о щенж с п -ке «щ
У ХО си
СУ Я ме ик ку. У м ОНИ Ге - -- ше шк Я п ОЖИ. І: н жи МО Ин Томи т х- : тех С У Бах Усхаху Том Флобер о Тих окт Їх: їЖв! АТ При Боже СИ :
Мар сала іду ЖЕ муж кА СУМ УА МНЖА ТК ща МІ яМуЖк ЖЕе мам ож
ЖЕ хх хх пре ще хг зе шу
ГУ мя їх У
ЇМ хи сю лих (і и її хкшо А КТ хи ХМ оку Ї. «кі І Ж ож А мо КТ г «з
ХА КУ М МОХ СЛ ОК ЖК. МОЖ ЖЕК У МяНА МІ дер КК жа ЛА ск гі їз: я з З
Пів їла їду: дя бо дже Бе жі дат Мало їі бкр ів Зап Атла АХ
ММ АМКУ Ех ОН ТО З С СЕ и ОО Я АСК а с о а о ч ж жо косцокх
НИКНН їх 1
Аме Я МЕ юс, ча У са у КБ я, по Уж. Можихж Ж ок У Кк ен хижих сан ит. сх ж тмкиу МляжУ ою мкм Мік или мих дет Ти Га; Тл МЕ х ОО Хі бр І хх
ММК ВК в ХЕ ЗАМ Ж АЖ ФАК ЗК АНА Ю ЇХ БОБ ККАЯМ ОХ МА ак пу бух Ук яму
Я; СЯ п
БАСУ Я Ком ск хм ли че у Я сію. Схжи и у хв ел вся яаедя дан У поля а Ле Жрреу сфррух Жака Смт щої де ЯМуїх а т з: 5 ля шу би бок шАЛА ЖАВ КЛАМУ УВА тТЕКХ ОСШЕТЮЬ ДЖЕ ХУ МУК ЖЖ ХА З СВОИ МЖЖ УК ЦЕ ЗЛ лу ЕК зи 330 ЩА ХУ фронти ши ЩЦКдя
Же ЖЕ рух
ОО КХ
«ТУХ «ху Ух
ММ ох кою С ВИ хидх ко УК АХ каченя дих Н
Лю ТІ Н секх КОЖ УМ ДК
ЛК м Поки фо иє ут уки кю Ї Кт ве кв п НВ КО А МЕ Ск
Кен
ХУ щих
Я г : Кк тощо жу й хо. м шк я полю «Ху шви ЛІТЕ ІЕМ МИЇМ ОЛЕШКИ и: ШУ ТХ. З МАК ЖЖ КІМ МИШКУ МИ мих ДИТИ МЛМ ДИ, сд -ї
Іі гх З «ВІ скпунв вла у петв вині Жора вежу водо еіщ жщвЕ гемивммк КИ
Мои и м в и кн п М В В в В в а в ОНИ ТА ЖЮЮ ЕМ. МО КУКАКВАВАИКУтихи ХМ : с пос М с Н ан А Усе вот схелуу м вовну Код свковют фотку Ук оетЕю и житі МК фр ехо а пес Соски ето ВТК сдуг м Х КА мАОВНА МО кю щей хо пулі фра ковки віх оком иих ши уч кити Можу ех СК п клем І шЕлацвічаи кімнат плекає ке МИ ДАТУ НМ ЗК ММ КМ сосок их вс адЕвке асЕсЕкезаа ОБОВ ВОК баса йо вазссвталн: ПК зва ваша Квалає сова скаво зреросаве 0 ор ноне сага КЕКС Бокова совшопсеНе ска оо За стосовно и сещсооикоу сок оцє се оон вена вопстстехо риюжовосз зЗКЕвощККе сек овосвевака Біо Бешя ащО авичкішнею соска чі зч в воза свооасовоя бак Зк поеісасанє фдавстеавЕх ааацавеце козака Кол кає зскаскакКа З акцачаниви зЗКЕзЗсІсеє казала зозорасоше сазасатда сне вес с актова сдавуказася асан песо май У пово та вопесасео сосвскавої севсяасвааа бос касова о ЗИ васванповгв сазавзкамс савсоваєсасо завивка если фас А звичка сазан ще свазааакКо звое есе свапососвОоВ 2 сосвкесеє взазводооева вався еа васицвазесеа васала дю е НО щавель пава сами соассовиц босмнаиєтвех дбесазеЕЕке УФВ аисгосиссея свозсссеааа вВВсазаанв вовзаедетах зазевовова вся ввасна ЗОВ аск ааарс ссваєсцаско пасе сца своє зако зе ЗО позосаесва зодспсцеожа зов есе асо сеБакоюеаск ТВО каазцосюимех аощипекоос ссвавбосана захсазЗОса совоосааав вевасеском ТЯ поза сосок воптщеиаЕ ув вскаа соломи вето 13 секс змо кзавовЕ се Бек еКвоо секс Зсваа всавевовсВ ЗНО звисати сто Вов еВ О савтпікюв вежі иваа аск спав сіє пвесосссчаєс застає песен кра сенх зававкеснов ЗО
СЕК Е сескозвоос сазкЕвсСа Басов «Ессе сказ 1550 кидчабочанває везапиекоУє своє Фосвдвевос зЕсЕсааКЕс теза БО «МЕН ну АКА ет МЕ МО ОКХ ох ЦД о А ММК ЖАКА НАУ НМ шуксасасчве зкояипсочиЕ скЗековаах заоч кокоса са вЕкасмии ТБ чали ксоще сенс а асемниес ааптаненує оман фравЕкауке 17
Зсув неюе зЕККевско СочасаосЗЯ сс ое сассвсеаиса созекаєксв УВО) пустаєзчосс зсозасзсео зушеєаоссв сезостіаех свбоесвесоє сСозовосава БЕБО сотадискчоє завше ся КОС боса Береза соски ЗО "щщшясюлово зоасчекао Бе фест вкох сбосвалсю епосом УЗВО апкрсеоцнх заоззчсе восизцчоо зозсоечх зоссслова песаедеив ши щчовоаоссє фасони Сни сс ачая кое вок венмоє о сові поса сс пессссаци бенссвовняа зубі ЛЯ стацсмервав сао соцеасвасвсо есе собовеаеоє сова ши часа ссвся саасрасоа сФосвусоаво сквувовое соашосБот засос еав ОО така зе зе свовсвоов света зокеюькек лам чловговава чего вехеоеааОох аосваЕНю годаававаа вехалчммуУ хм пяшсасвквис Веб ксив зага вибере шен диф осве шо асзодітоєв сбозвосиаає созсаівинае зізчагаса зсвсзтата віха свесвВ й зешосоксюр сеавасевех Факс сао аасчсваєся висо васи ВМО
Купа гло ща цти щадна ар сша ща щен ква На щщ ЕМ
КЕ МОЛМОМІМИ ОХЕХУХЕ УВУ ХУ МЕКУКМ М ДК ДМЕ БУК М НАШ МЕ МК КА М ХУ М всвкайОоса всоваатокив авсезЕсоеви касвасвока сала оеиМо вена Я звоссеазваеа саваоссоска слядаааакво бесбсвавсеае счцавайасав света ТИ освалсва падав сс аваа сезсбсолеюсх вгсопове своввасон еВ сваєсвсквсх вавассоков ваЕОоБсска свесоатінно сс вааа сссаазавав ВМО хааваксіазво звасваава вассвааоє соваевазава засво завестовоцЧЕ я павесаасовх соррсвсессох авозсосов сосок зесезаовою восувиоває ЗО песассаває соєва асан ачсвосавес оо сосова зезассчко ОБО пекомааізоа овузсааее воаашенях зсеесвевКЕ вкКО БА: кам» З «ей жа ода ту
ЕК УУЦХ еф ЩШеечЧНИ Моно ше хх «ша» ВНУ поь вах ек ев аасишецаєєс «озеро пускає би оке асо деакоаасюр ви епі снмі вссоизвеває есесвКек свое Секс ваВо «аа и шиакусвссо казку асаско поставка вався крос сасе павобоавасяг З чазчепеккаа саоивоспас поссоваатва аоагння збакакоеє слову паза воссасиваа сосен се Со свавиоВ пас вов соезасссоаи Я присл ко мим узи щік т сдуг с дують я ЗК йти див ам
МАХОДЕІЖКВКІКИ МОЖ ОК КІ КИ ОКО СЕМА «вд ЕКО ХО НА шк ах З крісла суху ді ик кої потових и і В в сталу куки лу их паніки ВИ
МСБО Ку СПАМ ІТИ ОНИ ВО МІ пІщешчшпюріїих вмію ж домо мови тези сви й веж ми пі пвівіінічич МІ
МЖК АЛІ КА УМ ХА МО УМА СО е ШААЮ ІАЮК КМ ІКАТУЬ і ВКМ. КАСА ХА ММ КА ЗІ прохо д пульеуу ве из сл ЩО Ме жУтоІх сзи5 піст В Фут феод: суда рі Кетити и
МАМИ КУСУКУ ККУ ВХ ОДНИХ ЕТУке хи ММ АХА КОЛА Вк хх Ем. ПЛЕМЕН Етики их дІЖАХ чут вату. су Бо качзоетуми дуг в реа міфи Ки Вело смлудуйтт М о КЗ
СУА МОМ М МУ З м м о и о в м в о в Ідна ВХ КАМИ ЕХ фол у м щи яеду в хм ми еку Я, теж ги фолУуутю и гМхх Може аежещцо ех Мі и пох паска лильиа етапи шими ша имам крам бок о мч РсфетохощоМ фе кеиев тиюіих вудку Борова РК лив ке же узи етитиюи ТЕ
МИ КИМ АКЮ хм М те лю Мал. КОКО КА ЖЕ КИТ, З МУКА КИЕКАКЕ КЗ хх Не МКМ МИЯ ЗА АЖ КВК ему щує Уже в е т зх ух от суєті щих ВОК уки фе ву м уж постає що оКив ласо века Кая Фесианна ка прежетичщ вот фа мив МО и ЮК. хек ув е В в М прукта ж вро жен.
ТИМКО МУ еМУКІ БИК ЖИ КАЛ КНТ ОЙ У ЗЕ ЕТА АТАКА С МО МІРА МК нена о на
Фдуф і дуйуєти прі: жому і едююимекх слев водити і му ут пукїК туту ух діт В джу ЖИ
ЗУ а ем о у У ВХ ЗА Же УЄ ХУ МАУ ЖІ МАХ ВАД ЕНАУХУ КЕ В С хх а оз я В рк он в НВ ВН в НВ нн НВ
ПАН МЕН СВО НІНІ ЛК КК о ЕК ХО жуком М осв ов ммс Кум дуєти Кт олющевут аю вових г нини и Ми о у м М в м и в и м а КО и кв и ВЕ В ЕЕ и М ВВА ХК Мам
Фе мери Мощі ска ех моих доме Же ЖК МО феод ув М фежзижф о схем би их щу фару ву Мом РАЗУ
КМТ МАМ МАКИ СУТ МАКАТАТА СМ ку МК МД Мою иа МДЖ МКК АМЕ ОКОМ АКТА КОТА А В БА же Мом озимі Усю мм иежМ Мід В щити Хо тму що туУх шу ржуижак комети ми ОД шКПЕЕСХ СеМКАМИСКОЮ ОЕМ шен ККУ пло о ин а Ні а и НН в НН НН ЕН «ака песо кис с воза пев Шона МК ферм ет г то студ цю мой пт чужою фета М щу ми ту Мет М Ме тут нав а ма нн в са нм пк м и м хи и м о а ма и м и в и я а а КВ а В КЕ М а
Феї: суха Ву схо єму ство Моро тету Б секта фуд упо епоху їутичутиїм СОВИ шести щи БК БЕК М КАК Ма КМ с : 5 чо до : ще рос мких тех ф хр ех шедеі вує БІ меми щих вату юм бок жи Ж
МАНТИ ЕЛАСТИЧНЕ МЕНА ВИ КОМО
КМ Кліо ту фігури юс се ще сну сові Ковалі З
МЕМ ОНИ МОМ ума мишах М чаша ке сві декрети сумму ачсвщ кине і ів Кохати Безу тк итрти щТХ шикарна щесНІВлиин СсСсоуи КС еа иа пе Ми джу у хом ижих льки ем ан и ЖЕ І КЕ хек мм шУ лем жим ше моду ут ОК
МАМАМИ а ЕНН ККАЛ ОМАН ІС щі КВК КТК жара сві фе лей ЖКемквщг улюртит і і Е Я «чут уха ІМ «тов е не З И
ИН МАН ОХлІДНЯ В де иа ШНЕК шани НК в тпм ви фокуси х сів ее живих сус иу ен ух ут пісі ех их ежрем Кр юи КИ шанс ссання ЗМО чі се ЛУ А НЕ КИ теж щен пк г г. си о в ВІК Е Срна ам ох іа мех ЗАМІН и и мМ ПІ АНІ МЕН І КУ СМХУМ С ММ МВА Я КМ
УЖЕ Матер м ожив ежа умі т МУ шуєусу м Му по Мачуха МЕ шипом мимо сиве поси уяа Кави шипа Бе щук ит шк ит зі Мід таж ді ффльдьщ оповита уи ви ОК
КІШОК АКА ВОВК ЕК АМУ КК ВХ РАНА ЕНН ХА НИ СН АТМ о и и НН и Нв ОН КО КОРА КУА ве МДЕ ХЕ КТМЖЯИВХ АКІМОВА ЖАХ ЗЗАДУ ЗИ мож ІН ших «функ мкм киев евии фоумсв ето ето хів ВК и с ху ее фур пвх щонефріщих ДЕ
МОМ ККУ ХУ ІВАНА ОКА АЮ ща Кв ск МРС І М ВК шАЮ ЗБОКУ чук им кв ші що З уні Ку тиж подо чі свіже от жхехту мо ик пт ІВ ові КИЙ
ФЕМ ШОК ЗСУ МЕС ХМК ОМВХ САДИ МАХАХЯМО ЯМ ще мцітим оваю щоцюш их БОУ О пмем Ко еут окпр пусті Кухта Кам СТГ
ХАКІ КЕ МА МЕККА ФК ВЕК КТ КЕ ВЕ БАКА МИ МІ КК І КАМ
Кн НН зл
ММК «АХ злу й в Х щу т -х. ст ух «ЯКЕ хх люто піт деки МДЕ тю у м пики плн. попи о ес. ем Золоте му ме А боки и МКУ ЯМИ ІШОВ АГ УМ
СЛАЖАНеВ. я
Б АВОИЧНИ дм уми вм кам ми «ЖИ ди па дини
ХохухА ТВ ЗДАТНЕ ФІН СОЮ МА СЯ ЕГУ ко : ек у при шу кову Поу дити ких и опер лют
ЗК: я УВНаре ря З я ни те Ки З Я ж з К нене Я
У М си й : сечо сту І
ОМ Яна» НІК Н «их ЖАМНУ : я и ЗИгедожетой жати ж темою ик й МУЖА РОМ ХО ЕК ЦИХ : «ших текК
МЕ мя сюли жуть ме і жи КІМ щита їз Ж
Се х
ХАТКУ соби я Фон аа ВІ сту ум и и М СМ МИУІ ІЕМ ММА ие пох ск т и окт Км шк вирия три
ПМ Тх МЕ
ЕК ДІ
КІ де, Я шина ема де чонени ше я ХК орви ки НН НН Нв НН
СМТ ню Тіма пихи мату ин и ІК щи Мектк жи дю МЕНЯ Мат ЕД ую Бех БОМ х ДОКих сх ки В томат ививиуєх стр порі ПК с 3
МО ТЯ ЕК КА А чи «іі» ЗВ
Одк и о «а АНЕК. «Ж лис, ФІіферА готи м ин ужит. я кттикки
Зк МЕМ У С НВИКІА ІЛВІАКНЕК «Ем «Ки ж Прабвнеую спимо ЩО ващснтх «а вевасссвь єс ана Бош Ус хи» я ев ки «шах ДНК
Ек Цермена тиж ана юе ке ж БЦ КНОБНОжоая чено Пра ДЗ ВсКЕ «В паєавикосне аавопсоаае вевсвааКиї аоссваваа Зіна понад БО сакзовесЗо сбеавосвсв восвеаєсвває сбсавастяо зааасвсанс асаадновео МО читазоваии помах: зва скібвованиа асеоссмава сресошав АК зпезсвесов сестер ска цечаво засос завада лес ков ВО «ащцннназ созсаасви сасозачаме песо єтив зе асюае посох ЗО звансекаво влайсзие вопБуаавеаа даааааоссав васескавев ваваазоваш доставок зодпошнаюєа кое сооФщчіоах підкаив поси внх Б спассввк Феаасшесвес вавазссисава засво сеча ак осввеос аву спшааанея песо ема са зассесваса паасаоаве хетвеяса Я скесвевоса само вав свабасоваЕ ас евах о Зенона свовакцвя по возив зкассвєх Кослкзазсви пет свема паза водо ВО звибавсекис Мссесваакє веБоссскоа сс ско вВомх Серовевоеюи Тк пЕсеоватов зосеосоєва сеасвсесавс сесОветосов аоссвВЕвЕКов засво єсвов ТВО есе азссозвоза сова засос асВЕ соааавеї даси ВАЗ овасветоа чеваскстеав аазепавско звана сеча зале Зо весні васасеск зсозека вано коз сода еа срср сі ВУ спасе вос Босвозоє БЕК Кіш еания Клео юав (еп азие ил есе слот фассоовЕе зкспізаваи ЗЕ піст ІП сідав адааскеакк сова даси стєзаакатх закис 40 шви щк м жхоуй сце суюаисю Мито мМаєту пшлретМ що дух мощі сь и Юм Мові ЛОТ. а я и З В в м и и С В М и М М М В КЕ М и п в и я МИ В и В МНК месксвавоє Кебовсе: аск свскоскася оса Свзокіхннни 18 вача ск: раса ове вача сбаачаов пес сиесаисваве ло
Бтетекяцкхм Збепававее сзашевазє ввпсоскиа возекаювва завер ВХБИ кзвитасвасоза взочнисва зе зЗева саван васаеевЕ сааовеводе 15
МИ МО КЕ СТАТ У Х МОМ лю ЖЖ ДАМАМ ЛАТИ МІ хи ща ех МАЮ МИ вана КЕКВ ссзапдваса зва адов сесасавниє фреон ВИТ това неяа СОкезавВКОУ сесавааа саасвоєта поса сєВЕВ седептеес ЗО минає: засабоосеав вазспзеоаа песеааси заз виа кеша даєе кю дсехумниас сиза сказ всвов зосоееаєва забав ее КБ весь ах Каасковсоа сиосссоов асажасоосв ассеєиевия зом Я и ававовссане засос бооевосвок зесколааоє зазаксетеуую ско ненака ЗВ аааасватих асо бек сссеев ас стас вела а свааовновоє 15 дека Кк аснаАк еко имени сою ке ХМ каадтвсскс Сесваессази сшесавакуе са сева Пса а Ббавщеалає ЗК ступив с Козій а года еии стХ вс у соки Еа кю УЖ из де жи лЕ МУ ЯЯ
МЕМ ТА МУКОЮ ХАТИ жу СХЕМУ Е М ЗМ МУ ХУКИМОМ ск ЕХ МА МИ зсасоомося дадлневие мооме НК «ВІ З «Ех ИЙ «ших НЕ «ТЕ: Фіг нллна еУ пат уж укл Ес стиск, хи му ІА ВМТ ик «ик уж пронмежаонах сгефомий посмів пикиссюуюе асо УВо чеках Кецласезєю оксвсвюкаа база КВ щвощававака ссовосшщне скоса совеа савскеасияо сассвевоюя вихаававове м о зеасаосвкі зевссавВе Опт есса вав см свав века АБИ климинасства атоми сває зЗеалахосвой асп сазана зло о специ зе свооо коми спос зе азчзасікІва о чис овнниЕ комета сосну свое овох ваз сво сет АБО асист Оксана БОМ одиКися опара поса озна ЗО аваавскаавв ЕТ свЗзазо вано завис ка СОсКещді о БссваекиВи ЗИ дассчєеевиЕ еко ссвсве засос своцая взкобесиате сор дес каМ я зах псчаазз Заасаввавов ска савав сСезакавею сзаосцпаслако вес го ааврисвасс чесвавас все себасюсаа сесссенаса пес Яйо сосасвитсв сосавоссаа зесвапавиє Мова сВвоокавеек сао ЗщИ мс сае слакавовов Саки сн осаха печене певоесяое КО часова кзессвсоех сазана давависвою свобосиеее оекссеюує ВО пасок оаов влити созавчминє заскесаєса зоссеоса сома осас Зо соска сосок вова севлосовиеЕ зосчкаВеКи ще асюа Кос ошюах БО товссспссва зсовисесма семешесоми мес вошобссовя следка ЗИ У згшаякстма сеззсвовма весни се вє сопе ою рот МИ совно спюресаесв заява ск шазасЄх взшесєуюєюю кеша ХМ висно аа савані сещекКосле стае сосен седан о
МОХУ ї ЗО : я ще еВ 3: х ПХ поавссенех сфе овубЧасою пасе могут засос їиБУ зЕЄєЧеАсс шаскоКенЕЕ сов есте ссссвезсвю Косик ди мне ссва Фасад: савочасесаз сазан сезон ВосБквосво 38 щас стче База сопе сттадсми асдасскекав мишки Я; капессувцє вадетвазввов своє чекає сасззаааав Босвовеоля ЗО сегасасоща каса ни КЕспотасес статок епесутавав за акавА ОБО стабссасава бваспобета аусоавтюе боБкасопізна зва овок сова 155 каеасцаксоз зааагаасви аа вва свиве бозаакосвка зраз еексеси ТБ чченксовклв ваза лесоа состобсоєа ас ннеВиН ще є Кеш За зве аоЕ: спека аавсяв сЗзбасваиє сиБеесвсови довазеааах вові ВОЮ «секс сзабабвоса озерна зсваововеа сову сваЕ бсКаавсвив ХВО заст ескЕ сасксосчо соачесееє боссбасеєх свссквекетя сб ва 2555 спання сода сера бессвавово зе секс сеня Бе квоассоаееа сао це ІН дути та
КАМ ла «ее ІК «Вій: ДЕ ак штучна пошжідевВи юю»
ЗЛЕ Я КУ хви Мовиями дянутраешщеМи тоаБоеем «и В ссвсассвоє асан скеааасвкс завсоосаєе Фе ссцее соваесоакч БО зксосзееннє созкавиеев сесії звпоемсва сбсвовсвааї свое а яв ев Есн свасвклнеа скавсвааае аасвкНюо пеосвосаово пзаловоове БИ сеаптвавгає зивосвомес сова поса гасеаагтва воеаснаа яп твзагестис сассвааосв ссцопеех совасцацви КЕЗКосаеося сс еВо 0 завувевіка поспасааа асоззмааки агбасваавви авкосваеювнх впгсекомае я сававизошаци сві возасвіе возЄцеавнав пава іссввовав о кідчатииНЕи соасавено лебееекв двох вазах звана ЗО дуаазсовкає саодазоаває векасааавк зосбвазвеовеЗ себосхатоюа сову па писесбовао збошосввів Сесвасвссв сота задавав всовкевкос БО чзказзаачка садассдеаа свои ва зесссоввоеа сосок а совет БО свозаажкзЗ сао Уух зецссвокав сСвзазсовсве семи: зсвдссоде хо ссасцастоо соска вессанеассв сова вВоКЕе Косован сеавеаваквааа Т8о павептвацєсв ваадсваєви гекекоінанаМ савоссксосав сао кекс жене Ба пнжвекоаіо ттовссмоєи саОсКІвико сша песо сввю пишне БИ «Кі млжеак вавастисає ссвавовеасе список зозесвовов сЕосзаеи Ме поет заавасквив екол ссосасвову зісваовіка ВЕС ОО со вассюю стсвазавоє Сосебосков Кеобортеєю Себспезеесо совевасясвю АБИ кішоскево ЗЕВОСчскваа Моккасвоко зацявєцчакКе босу авишцетасв ЗВ авсасоскав Кора а ча росвнся чвеВкевкОоє Загскосося аасввтктов З
Чекводеєев зЕваксассо кеВ зас кссве сазасокемє Фіра бю аск ойює знову ссдвесвасс аа Биє совскавсва спосте Зали где модема гедччсвви соска ксахя сасдисщвии сивих ЛО
ЖИМ ШАНСИ ОНА Є СТАТИ КАМ НК АТАКИ, й змізозівсови соєссзавис вввосвниоє ассцаецеєє дону сша доска к БО зескосвосо свобсковний БОБсЗОаЕвоО асоєфасомть ваше «есе ло
Ес мнеу содацезоеко сода свв Зо осецчею свщдецеаке КБ шоасоксої азазассавао зососвовес сов осовВ зезвсуеова вовку МЕ саланісссв пвавозозоає сомів вобтоокоєв збзосвоеє зебечекис Лаво зовевнквний сосен кое ЗеКовериов свешсесаою КосеЕодатає Косшосаск ММ ччвосостонов бестовсота севовачасс вевсазорвоа стабссаав заосссаоааом ВИ екс вБиве сірі сао заго евав вовна чововевиво ЛК «дано ств апоастате севосУусаиє Вам ЗБОвіееева ВЕК це кан зісбзавиза засно сассовосве ЗЕ сскано ббзааеоає дівою МИ вексзинЕс секс заас садове Бовсвавсся васлосвіе сетасаввка яп сваєсвсав зквассвахз повастузоМ пюзсеавасв весссвавоє азс чєцееЕ ОВ ве киш ка еле мо У ея «а КІ «кій МНК «иа ее РИЗІ пон вь сах х «а» Повна оранки рвУюа Мир лсленаств ов БНУутрошахш транстен «ах 11 шрЕроскесюв ве кокомви пово сова Кіма юима кава БИ задавав псасвоузає Евро савани птаютьй фаскою саму анха ЗХ авазесаєи азабсвасие ск сосСа звассвасакЕ себвасзесназ азЕсасаваа ВМО дівасесува зако звазавісвов заоеСка бівовосаа век я
КежщсвісовВ чок овоюо сЕмаєеоцсиЄ вовк оа постав сезавеска ЗИ тки Сова ов поши свои кесаци Кк осо покази БО звичка зопезнаааа сосен за аанав пошани седана свав Зх ваавастлеава сс сбайа вежавевка есе ка БЕКТтОестове кЕпаоивЕт ВО жи сшеовиє косо вався зале тАКЕ скоро паса зовсгісаваиа спазсодааасе стабасвава свовзевеааса сесчасоцаа ек оая ЗОВ двохсот фтовеаяисє ес ко КосазекВоа свзокіоеню Базові БО посзевлнов посввеоева Фесавечаєс щшоеаводаов пасе сесевкеи пквлбвстеаца ковбаса ЄКеКеднсос сечова коспбасвеви вопвевсвокЕ ВО цагвасваср бястсовоскоо сопезагасто пзазассвея шассОсисЕ Фобоса ай пвоесаосвсв воссовісвки сосвннвнеє свесаикма воссосхаова оце З сте сов собассве ково асоусаавккх зо ссоєюю шосцізее БО порассшисаиа чисеаевик КОсецсцк скбвоце еще сркзщавио МО вссвоссвав поле ост слввесте сосну Ссесолессю плоско ЗОМ шахтар сосни свои сбоаащчас вспашососев сода ко 315 весни аз делекваосиє осока сесасскеуєє бсодасоови Кодак ЗО кавтовсвие ска ю сзоозаичеЗ ак еоспав косо безос МА поса свсооя даскегееке веесавосаа сао осно соседеоне Ах кЕВСССССОВа ЗппКисаан списа ож аве сеоКЕиессмЬ Вис аккає МЕ застави во Ксавкнцеств СеБвиса о СЕпвагаасню всласокатай КЕвВеековом 102
ЕК ш М щИ ОХУАШКМА АНУ СКОУЕАНА МУТХ КУ ККУ МАЛИМИ МОВА МО КК ХУ ККУ Ка какооскаЯє заерпавави свотізавсо чекових пса КегасВиева ЗО сщівсвисца баЕсгпяфсих КЕ асик ство зсссусаваа заававаяак Т550 паготцсваиа сзассопсваеЗ згас пеа ссвсвкжвза зесфасссоще сова їа за квовтавсс зазвтавсах зок сват вацво сова есса асваравеце Зо пусти чтавувь чесна нії Сус аква к Фета боса З васвисвосО СебЗзасеЯє сасасвах сзсосевови довевосеас свозоБКе МО шило: «ажевеаев ссасзеевав асеваснаа беосвеожее: сСссвввачеєн ІК аабоседискк вчексосахв сов бекон Е сао позваса БА
Указ шпсоз ссавсссозе ссосБсос соска дес ссоББесвео ЗБ вшоссасиЗз сві ове бачок оцвос звопакЗисВ сет аадав дебодасіяє я взасос сбеакочасх Взиобчисаса зоесчза ис к свшщмнинни: БО как єеавас аа ЕБє ча оакоє асо пев ааоав завававшва ІК шпкЕцслсЗеанеєт песо сяе сети свои чосва псоссваасов засос окв ияХ зазна паидахнасве Фсавеозайкою аиесвосавв сосків КЕБЕкеаІса ЗИ шими Івмь тозасекоавВк зеедлвецеса ково вкя свадсовета зрос асава З вакшиссчак весалшинава заспівав ева засщивиах сксвовасат зчЕклсовеоВи Я заазчачес сс ссвво аввсссаску асп асве: сосвовозосе каша ЯВИ шшсзазива вовка зизадннвеа зассводеас авссееаса загжсмавам и зодлкковак полова й сова сков ассактдева зве сова МОНО щокаевавави кавове оса вваав воасваАВисв сао се совиа МОЯ ппчссзиеие сСедалвооах соапооваечаак одини сеча све базовими я ОО сесзааацки фіксує деБсвквоце сви БОБ сова МІВ сЕшкенУК се осів ЗВоцоламов босвавазсва ЄЕК осаКОЄ сезовасююи НИМ сеасавожсою зосвоткеає Капеосиае босопсаєссо осо ецие стоссоавсс МВВО дшисчссико ше севи ЖЕ омсо Барлавасях сасосеваца поло йо сксасва мі взасеивави КВсКеЗзаВає сова вкЕ шКсокевовВак песо СО пЕчассвонв пававБккеа ато фессрповн «кто вве шко ЗОБО пичссссаєє кксокасаш МОСС вада кеВ Косвннуавсюе ЗО жк чн гЕсвксщі са Зара тов саке сссоа совок вгадав не ЗБК кслевасЕЕзи Сезавааиу мине саше сис аи пасок За вксювема сої осока кою зсоеею места зок ДО песхпоаова сабесцосеов заосвевоЮ вес сао Фаємми с ЗБЕ питні ем Ему СКЛО, віх дм жур тиу щучикиіще мах УК гріху ту А м СЕС м и У КОМ В а В М В и В СКМ В МО ХК ІОВА ож соте бювернома сепассвоюа зозоееисВ Косова кескаеюки НО кола. лжчю Коссак Засн са кла сови МО
Зксрофукт осв СОБІ песо посох сей засо ММ ссвимссе «засохне деваешаіс бос«оаавцао вена є вЕшаловас ЗВО пізна цисех шечсвинНех Бобові оже зок а ср освє аосевоюає В випосчеесе сяппоєізов зчишцаосра возоссссвяє зма ав ссанки МО сацебацксва згас весксеосває еекосснки їх зеаоссвасеса вЕсзаІви ВО падаакаала сасоєзвовсов асроцасвія сезассвое аа оес весаваинее а)
Зк аи сива сасив фешечштче гром вн есвис парднекОоКе ЗИ
НН а НН в НН НА мТл
ВЕС ен Оу мяУСеМ МІУ ВЕК ши ЕК КАК хау педа сстах всдсвтасва вес вассе ас вахи зсавсоввека заселена ЗИ возайсссаа посаєтезея ссооссвас додасвотоє пкзасекоза скзазсаави 5150 корт фМОКРрЛІОХУЄНах. ах влУВиНа. секр. ФУ ак пово смивв жо вклхи:свваасх азсозлясвивз вововацаосв Косбозасве вссобаввос чеозизакеа Зеви пржссвІмн самост а ВАС аКиМмЬ зашмма зечакзке снассасаов жо всваависвоз созаацавх сашоссВлех дае ове аасбсссваи абс ЧА спесосдваке спон оБосаєсоєа позаааасесв воза чаа песо 40 здазазайвсо вкаавоссіва сама вашоскаих сеасоцтоанс семан ЗМ авгссзлався пососвастевчо зло засасевосс вопавсдока созБеюхесе ТБ
Мом узи Вот даху ха ву кх дос В им Ж сх ази и В вот Про ях ни ю их педа М омана Зх
Зсув Марина лома а Ван Саму поем щем гезазсвЕза свозакакае свое зоКа косо песлеововя свовакаксо ЗНО зкамасеещ возраста засо сВЕ беавевекаєма сема Ерос 24 анккнвасоюЗ але заМакашсих Сила чок тева шекЕзееох ЗО кависскоає закосссочео пас овоочи фомкішннНнає кис: ззиавіака ЗБК пМабиссваес самок скан засос веденим Фаза Зх
Хвоесенивс зерзававо єкавчся вісзчавози» Федбсазвекке звазвавссаау КО посада Кам: КсВовекови абаскеоКіса сзайаосвНкее позик кави сх Мми стен стрес воссавовою Фесенко ЗМ щксосвах пасівастсх заовссави ВКА: Кос фесвосптовк ЗіБ сквгсстам везе тІр щем еио пліч слави сел паляа ВИЯЙ визасачае соісвваста сзавсвесва вес кзес аа КвлосевиВ За
Кллзавтассвз сезвавосва Кава скваа ввів аа ведення ви Мем За екКавсопосе сировини сккезссвак Вега Кс Сомка Вацо стшувЗцечЯ гвозассзава сепанесква Веста ссассрвзавзв ссозКов Зав кесвссосов всвсзавнов воза свсв сказав смена сш ляр а да видаавацеачЧ смена є бсосасіанає пезавеочас Феіпосзозеа зекосоасЗаа ЗЕВИ схмавомунав свое ссвачовеов Коко чес аевав пекан ЗЕ
Єтсавскнає вера росу СОНБеКаст совесваос вав ЧИ закашааасї. ссвадкаск зкевавовнає сао сгсоівесва седомаааиє ЖЕБИ зЗовиаасавак срезсваеле воза соч оаове Кваси бака оцешк Зо саван сесія свачавосяа заавешессв Єстававос: зссоцавовОо ЗО тіссоосаає сова: чес сооаохю солоне скнаксевзва емо ЗНО аващсосоеї заслано васалоаса виш хвоае мое весно я
Ім у и, них ОБУ че ная «их Ум УХОУХ ВОМУ УКОМЕ М ому я ИЖО УМ ЕК Ж ж юю и у ОА сиву ис пред МіІвівИ денце гви я пава Бека маства щреБІунЗкесоцщЕ ВБИВ
ЩЕНЯ КА ЕІ ПЕК ЗАМ КЕЛИХ ВЕУ ЕК КУ ЄкАК МИ Ю тжкемимемоююь ех сміш М Кім омехевіих М оду пе Киї тер іт свити фі жів ду ОСИ
М КАЗКІВНАТАЄ ТАЖК МІЖ КО КОХА її ММ МУКУ АМ ТКУ АК ПАТ ІА уми МИ Мод АНЯ Ху
К зро Он г фжоосву яву ие Ов он я с г х. ФСУ пеихучовогп ох жовтих дела Брови вик фу жК Ки що о у т и и еВ В а М о м В В ОК ЩА СЕК І КО КТК Баш «кал те блешеи А як ож жу я дк хх слу ПЕ лях ДИМ «М Зою Ніж утюрть дже ПОЕМ СИ,
Ач НУ ХМАХЛЕТИЖУТМ СУМІ УМО ДИМОМ УЖ ХХ АТ кое жани хіх
МАО Ктачсати тю дн пу ин Ум УВК Ма М стЗк Мі ци ух о і. КУ шив 0 Ум у тк Ми ву Ухил жк мк тих жу М ім м ПІІ ЕКС СК МЕТУ явних фл дн Ки У НІМ ТИ ШУли КІМ ОБІД ДИМ
Поки Зм о ВЕ МВ Є ВИНИ МИ а В ВИД о У зи хх о оон ШІ
ХОМ Ух ом тІох ех е стру УК, ПЕ
ПІ КАТК (АКАДЕМ ші
З СК я ІНН де ЧАН и о пуфи СИЛ
ЖАН ЖЕМКО, суч у - Коди логи
ШЛЕ вх Мі хтуіли трав при ФК жшош Й У ЕМ ШМАТ МАКИТКТ я
ХІД КАИ
«ЛЕМ ЗЕ ті де мадам чаги ІК і сні сп гл яд тіуХІВа СИНИ ФМ пелет ТИ зішуши я РОН Я МІЖНА КЕ КИМ Я ВАМИ Кия МАВ БІБ ВЧИВ ДІ ЕК т пали, век ЕК ОХ оздо ї сежтрес тив т ТУ том
КЕН еко ж МК ЗЛЗНА З З с СЕ оп ях
Мед АНЯ мое кичхе в ит Мох дих их п
МЛМ Км ПОЕТ АХ их
Кк: ох КиЛуХ з «гр Й ях пу осу м М
А юю да ва хе шк МІ
Седих ДУМИ су пе оди : шу літню ситий ТУ хм А МрВУучНи Та ДОМУ Є дра ви
Ум
Тут то. Мт я нн нн пон кН вн НН я «ДО ло филдниечвтех ХчаиМини посли шосвМмшвИ Еш умові млі в о НК г сухі КЕ оо ЖАТЬ тк
Дня ж ТВ и с Ям о З М з МВ Я ї Я
ОЙ В-ШЯ
У я й чо косзуликюмугі іо коксу Мем хм сухе М Ком ЯК
Мед КУ КОСИ МА М БУ ге ПЕК С КАК кЕ
Ока НК, а АМ жа А «лох ТЕ пед хи Я УТАТ коня те хм кжочечь ї ги хтікІ й МИХ жін ВЕЖУ ЕК МАМЛУМЕ М Ух
До леду
ХК ЛЬ си ВіУєміх мекв с ттл у КВІдВ рі труду пихи т Жде фрукта Же ПУ УК МТУ тт шк Ж и ХК щЕЮ ПММ шМЖУНУММУ КОСИМ КАСІМІВА СИ ЖИ МІМХНА ТЕБУСИМАТЮ Же КИ МАМУ ИМЕНИ ТК ХЕ
МУ Ех, мк з. і ожини вен и Іо І НЕ а
УГТ ІРАТА ТИЧ ММ ем М І у склу ж оре НИ же З сеї іх кдд о ікіхиюцм м і 2 дер Катльжую сфещерию рі ЯН сш воаня Плани же КОТУ ВК ШЕ Ж ст вн пк УЮ
УВО
«зон тугу ше ню ХІД
Мк АЖ КХ тк ско еєкитисить функ КИТИ МИ ку с кн в м и пе
Ки ня зро и я А НВ В АХ емо ва Усі КТ УК и «Ле Зі йпюмтдіннаиаи за яВ ТЛ лад КІ НА ТІМ БЛІН А ТУ кот г ї пива мм М тро. у ХО ТА «Ера ха» Мк па кам теми Бочки ферум сти чаем тив дом інте сування Щи нс нн оз у кв З ак ке нн КЕ М З М ох З В А КО Кк З Ми и В ВН С ТО В З В КМЗ
Кеди ок не кя ех МО А ут лоїох Е їж мМ орав ення дк ІК, тк тю» из ма тує о жо и р лики мой сети, тк ЗВ КУуЄЕИ ІМЛІ ПОВЕ
ОН
Мед АХ «СЯ Ма ВІТЬ м Кіа Бе КЕ іВ З ФМ, Я ЕЛ спека ет и Мед М ЕК Не деккуюит КАК ІМК УВО ОБОШЖНОЯКИУ СМОЛ ЕМ КК Я КЕ УСНЕ ІІ ШОК ЧИЯ ВАХ» стадом ВТ У лу ВЕ умо
ХУМЕЛІКОА МУКУ КЕ мом МЕ МОЇ сій СТІ мм
Ук жи ех М М путівок щи роде МД м руни Едді «РИ КН СКМ М ток Міша МіК сема меми Кеш о ек 5 чмащя х шлю КРД сих ХА, ом зуа ша пи лох ША ет у хи іеехурифі ть тки жк дити Тех зд ит ММ У еще ІМ ДИ Б МКК «АТ ет тегії пені во рідинних ВИ Я КН р й вче, жує МИ нМмМ гло РбеМмогиа цим инавМ ДОКИ МОУ ОСЛО СУХЕ чи Її
АВ АВ и НН Не АН НН ОО НЯ о я Ов о ВН КВН ОККО КУ МІК а МОХ КІ МКМ УИУКОМОМИ а ря о пуф ее се комою ви ін і их ххжечитвай і Фоми ФУ вежу аня м ЗИ а З В В я жов и За я В З он В в в В І В о п М ва ви и В КЗ ЗЕ В ЗО зожди ок к Бере тля Беата дама тих Ма Баха бачки М о но в о о з А В НК МідАЛуШК У о еху М МІ ТЕ ЖАХУ Ошуки. ММБАФИХ МУ МОМ жит пулу м Уже сміх ве суши Ум кох в Клум М я ук коди муки СЕ
ПАДКУ КМИНУ АСКОЕ ІКНІ ХІМ САМЕ ТОК ВИХ КЬНЦЕНА лем он НН НН чн он нн я в ВН о ОНЕУ
ТАК КМ м ше не ен КОЛІНО ЩА ЖУКИ МІМІКА МК ММ ен КН люмоУщУ и своим ам муч мощами де Ї ше л у ок ем омоМімом м вет
За СНУ ЕКО МИНА НО КВН ВЕ УВА МО НА М 1 зо Єфетлуї пуп в фоні спугхожом Гощі во ом Зге ХУ оо пло вва МО КМ ЖІ ВоВЗУ СУМ мс хНаХ са ук и МКК КВ ек Ес аВ же х кжЖжхкт яким Усю юок мому пак МІ м ож сх ом Ка ше мом мвх З мохом і Божа
ХХАПАИ ММК ХНИ УК КАНВИ лю КАМ АНУС ВИНЕН ІМК ХМ суч мом Мо ллусвих удо ту ит Жозе ще мими М півосі фот ОД апа савен саке с МУКА, щу ОК ЕН МТА Я ДЯ КНИНА СИЛ ХМК семи їз мом тк фс ос ю ММК ух о в АН НН в о НН
ТОМ КК ИНА ХТО ЗВ КОХ Аа С ХО М с дрофстльсьстюі и: флот тик ет трі сего дов иетит Кот Мід иМ МД ех с о ОВ СН У МВ І М В З АН В І о ВЕ І Ох ВВ а В КО Во ВУ лоту у жи Кия фсдтюжиити фе Кт Ме М хо А фАВУ отим ом и и а и щи АСУ и оо МИ
ТИМ А ІДД мя о о а о в и в а о жя ММ МАКИ ИН ТМ скит км их фе Мо водв ких пуф хоть кл В де ЕМ Може чад шовк свт СКД
ШУ КМ Ки г МТА МеВ МІЖУКА СК КЕ Аа и и ви МО М В п и п СВ М С У КО М КИ тд ту оди Жук кіт кЕ од додумався Кк щи ша й
МЕМ ММ КИ КІХОТ юю как ОН МО ЕМ Ж, МЕККА ОО Ю дви ДК тити іму хомути Жоашиких в м б дю Уж кж Кт сви Ма кими КОД ик и ооо
МИ ЄВХК МУКИ МІ Б рН КЕКВ КНУ СКК КУ Б и Нв НН НИ НИ
ЖБК МОБИКА БОМ СУМА СН САНУ ММ КН я ВЖЕ МЕМ юМ ОМ озимі х Ікс Мито дод ехщох іх ие м и Фр У Ева яр ето ОТ пилами ази тес сю тиОЯ чок КЕ ИгОАВК СМ пімуЖ У М оМ Кома демон бут фе юю. ЖипуЖУ УЮ Мам р р ехиюМ Мам іссхулувов т ух тах се те СТОР скін КжК Сопаавщакє Конан ПИСК наА МОСС ОКХ МАО тут е гово дет прим єюіаче полу Кук лек ут при тових М ОМ Бех еуитуниі вих щу М ще ол
КН МОМ М Ки КОХАЮ МК ПХ поко ВІ они пи и в у в м и М о Ви и о ве НО пред м Котов Кому роли в до сту Кок му і КК сах жу жи и пп ВІ БОБ ОТ
ФЕМ СО ОК З МОЛОКА КВ УКЛ КМ Кр КУКА НАКАЗУ КиМУ пут діжках Как зав Ма енень р кам ит
МКМ ЗК МКУ МУ Ми ЩУКИ МКМ КИ поташ паті ттиУих хамам М Мах ох вщ Кк удуюих меч Ко вих мот юмоса дивом стеж ихуутеМ САУ зиск ес асо аКлия оф еаиг попе соєва ХІМ ля туту ча жду чех вом ем шив ж Кмин тух «утоми Аж жюрі ЛК МІХ
МОВНА МЕ МА СНІ НН БМК СеКЕ НАМИ МАЛИЙ ДМАА и ТИ зІбритех м меми Я их Ем жом щоки прі схржтухулуєеУ пк ек У Кіш сво колетнУМі зада
ЗЕВС ХК КИу ВАТНІ ВЕСНА ВІКИ ОМ ДЕ ВОА КМОЕИЗКІКУХУХ. ОБЖ К сретк ода жд сходи. ож жЕаеиМ тях Бари им скуті кос ОТ, щі КІ КОЗА ММК М А с КВ З. У м еВ ОК МИ КН ВУ п в НН Но В НИ мн м и и В в в в о ОК еВ МИ З ДАХИ КЕ КК МКК. ЖИ о аа о ОО В зма дн екдеи дис аі ти а иа ВИДОМ ВШ
МТУ ММ ММ СИХІВ Яке ми и НЕ Кн ВХ о п В Ко В о ВН прлргти Моехтед тлу орли Ме УМ ім діеу свіже пгт емох вже ТУ
ПИЛУ МО сур МА КН КИ КА ОХ СКМ ТММ ОККО М
АТХ МУ АГАХЕТАВИИ ще ОО ХХ с ПМК З ок Мои Ім сут в кулі сухе МІВ Ух меми КЕ ти уми о Мем учи тм СЕ цип сиво фена он КІМ мно р КНТ А АСК студ чих ужитку у лу ом Ж ум луг В МУ Ко ней пух учи мк думи Зп
ОЧНІ ХМК МаОКА Ю ВИНА СЕМ Ж КІМ КВ ХО ІТ ВІН СЮ
Фферж же у уз иуум у влити фепУЦЬСИ М М пи суть ик пе нх Ж сі су п дуєхе і рум МеВ хе СР
ТЕКИ КІВІ КН И М МА КОХ ЛЯ ЕКО мнна Бади рисах пи ; Я Я : ше ще 4 рт тррл м іти ю о пуделя Кекс пильне етика докт Введи І
МЕБАСНАК Я ХОСЕ ПАРОЧКА Ди чим МТВ Ка ю спа кеклмл;рі ух дрозди свв студ счюМ зе ва м м нн дк вом жк стих ІІ ук из уст вмію СВК
Алина сав зЗеселанВ шахи БМК ки срср КИ ую и. жим ч гч їх пек дужки. с. чо пи ше Я КОЖ М уж ие ж. пк пон и «хх Ту мож оуую и факто ху ту вок свічу вм сви ЗИ
МКМ ККД КА М С КК ОО КК А ЯКИХ
ФМомлвІвІ ем оси фр о: щі вомІую ой Муз утри ізлшетучт п пух МІК ові щі у В. току повз озасє зи стввия иа КИ Ка НН МНН ЮНАК. ТАМ : ; : : ЩО : Й Я сухо фут мулютьй стеми пудчтвттк єнотів се ев пе ри м отв уж ае п КИ мА сх мем сю НВ ОН КО КЕ В В ХК У ВО М У ВВ ЕН мову ще влив Моди ки чех и Кожні щи мк оті ОСИКА
МЕТКИ ЮМ и ОКУ щ ТК ще савани сна Би МОХУ СХ КЕЛИХ МОЄМУ. щем я гори кит й г - сг. що с. Фе. вк ще їх смію и и ис, пом «хі и ітд мй г У Кит. же Мен мцтющу С ошфикамичаі а К
ПУХКУ З Лю МУХІНА А МО Ку ПИЖЖИ Хек КаЕеЯ а о и с М т м Кв п В о а ЕК ВУ с в в НН НН и Нр НН НН в АЕН сасонеааа снами во сия слі слєнахе осв нава па сосавитова аоосвовеас Ооубіаасвис ябаааннмо фев Козака ку сюсссассй звеосскада зак ахка песаластив мона ек Шона ає В видавсазаа состав оое сисвмижаа забор оато сода совеов бовсмуклве Бий свксєзесаво зопасснисш вена сов яачесствав зосаовакх дова БО ассссозсоов сдазовавоя поебассосае басовсаса: дмоасавеаа васасвасав ий звеічекемо коса змиває «ака ака сао сляю ВТК зіва свеказаснв суха ссквавовоє Саасоиваве доска те вВЕСКЕ А Бізе поем БосссккаЗ со сема яВАВ кісворооск ігвсвассва дегеовинас асасацавсе сосадовова себаксеєв НО вевкцчекве сосюваввоай сосОзасоВО Мевсвесвая вевовевВо овал све чо зипсавойаЕо сазсвсвовоу Сакс ВУСТ авт еаамккінє вес ЯН) зви поамата соди ссвиа мм поко сосва сеаЗЕЕКтх се ЕН тЕскоєксвЗ айспевцво: савеасеН Еш квисоК саме яс сваскеню 1 азсптавнс постання екс вссосЕКа сессаааа БОКС ЗО текаскосяє спевавососа вира баенивавсв асвааестЕ ссовавсетав Зло ем сваваї сЕкасссвав Вас све схе свае часте насоса ЗНО тастзававе «ЕВ Фени Єва безе оо ЗО
ЗосгаВаксЕ сзашщвивї БейудЕскеЗ саше савасве здасвававки Зо аск авакк сежкасево себозааеко Зк аЗЕУВ звоеескаса безе лев мес ата: аекетасваа жено Кокс ммн давача абедеаевкє У зашввасова зак: Між е соб сваасаа зависає БЕБеяааи жВБЦ щшикнскоае сваваавааи Зиаааавссг віза єс «Кто Сов ко КО зазишковсвей сота осв звшсоао зовавнвече есе ЗВ зацесласооз сосни чваозоаваня взаовосвоюа баозваетох ззезассвей НО заісзавсасоса позадеави звер єво зроссповав саласооєва воссссблм ЗНАЮ пеломаюаєсв васоловенса валок ссолновескоа ссповавсов весен КО
Кековсаеаа звоосвжевев Мещесавесо СФоссоов зона сову За засгваотасев сова сова сасс скссспас Ваза зисеосвше ЗИУО забез сцааи зар Вища соками паза Есе мени ЗМО засцсаасВос васала всезаонм зро чвюво се сеон зроцкнанаа 510
ЧК сема пса шов 7а «ве ха ІЙ «віх ДЦ «ВІЗ» ЦПоршчни гема НнО ль «Ма ки «вхЯМ Лія фазнююютчй пеомен пюослідовН єть теВнНим тку «Од, лі ха КВ ско Еоч; вес кове Усе санах Кисвацасов совасасва свакавіви ИЙ айожнинаакуа фай шчсвоав кеша сва сазЕкаса ово зававжасакааА їх чащевациесь зваповачУх сесзОоєсВ заз восВие сел вався ЗВО акгчсастаа пезгткеако ввазаведсв вевесоасемУ позоеєскав зссцонвв Май
Сом сов зоцсссаам посада: аавасроох зер есе кан о ще НЕ щ се УЕКІ ОН ККЗ ПВС виш сеазов ЕБОСОеКИНе зЗЗасацаЗз осами вод евВія зобов ЗАЙ
Ман свая зрос форнееека носа весзаВжКЕе савани ЯМИ шесвоеасмаав сЕстсааном злаки вас КЕКВ БІВ ЯВИ шесчещаик СЕКС зааесоаааа зе щЩеквии соус аВЕи зп ЗА аквиссаавя зечсваваасв сах асвавча саспакзеаа а засос воза БО зазикевманют «Іа шко мщвз ие брову ке сасесєве Зв нии я кнІканово сих плсжоюєь досто созсоетиме сабо свое ТО пессоцесвов сови се сракочае сосен еще аВосо схрБасакавеми АТ
Факавсснав пасссовВеске сспшдакасве давав осеою ВОСКОМ всім МНнМ Ва сщеливезЗсй вссовисчЕЕ ссзазайаво салі все цВоя саке ЗИ сце сдоєєове совесоЦцеє весен влення коса З соску пев сосен спос зе соснами ТИХО врсвуюетиЯх смижне ессечасеое особове сором сошки МИ стека шснх соззасаов сесеванеик сазассцак вовооссию сте даєкк ЛІ
Зоо Чис шБшиизвов сс лошЕ зов зонаєтсоасв ТМ
Мао счЧесасеве свое заоч е песо а соку ВО5О тео Вес сомкатзс сасчхакеє смс ВевозевНе ща сеамосесея екз авва ска ЕккА соска е соска ссессастви ЇМО
«вай Прайме»з ОЗ зацезспеайоє Вес ши

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рослина Вгаввіса, стійка до гліросату, що має у своєму геномі у наступному порядку: полінуклеотид, що містить 5ЕБЕО 10 МО: 12, полінуклеотид, що кодує гліфосат-М- ацетилтрансферазу, і полінуклеотид, що містить 5ЕО ІЮ МО: 13.
2. Рослина за п. 1, геном якої містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
3. Рослина за п. 2, геном якої містить ЗЕО ІЮО МО: 2.
4. Трансгенне насіння, що має у своєму геномі у наступному порядку: полінуклеотид, що містить 5ЕБЕО 0 МО: 12, полінуклеотид, що кодує гліфосат-М- ацетилтрансферазу, і полінуклеотид, що містить 5ЕО ІЮ МО: 13.
5. Насіння за п. 4, геном якого містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
6. Насіння за п. 5, геном якого містить ЗЕО ІЮ МО: 2.
7. Рослинний матеріал, одержаний із рослини Вгазвзіса за будь-яким із пп. 1-3 або одержаний із насіння за будь-яким із пп. 4-6.
8. Виділений полінуклеотид, що містить 5ЕО ІЮО МО: 12 та 13.
9. Виділений полінуклеотид за п. 8, де зазначений полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 2, 14, 15, 16, 17 або 19.
10. Набір для детектування ДНК, що містить щонайменше один полінуклеотид, який може специфічно детектувати специфічну для ОР-073496-4 ділянку, де специфічна для ОР-073496-4 ділянка містить 5ЕО ІЮО МО: 12, 10 і 13, де: а) зазначений полінуклеотид містить полінуклеотид, що містить ЗЕО ІО МО: 12 або 13; або р) зазначений полінуклеотид містить послідовність, що гібридизується в жорстких умовах з послідовностями, що містять: ї) послідовності БЕО ІЮ МО: 8 і ЗЕО ІЮО МО: 10; або і) послідовності зЕО ІЮ МО: 9 ї БЕО ІЮ МО: 10. Зо
11. Спосіб ідентифікації події ОР-073496-4 у біологічному зразку, де подія ОР-073496-4 містить ЗЕО ІЮО МО: 12, 10 їі 13, що включає: (а) приведення зазначеного зразка в контакт із першим і другим праймерами; і (Б) ампліфікацію полінуклеотиду, що містить специфічну для ОР-073496-4 ділянку, де специфічна для ОР-073496-4 ділянка містить ЗЕО ІЮО МО: 12 або 13; і (с) детектування зазначеної ділянки, специфічної для ОР-073496-4.
12. Спосіб за п. 11, де: ї) зазначений полінуклеотид містить 5ЕО ІЮ МО: 14 або 16; або ії) зазначений полінуклеотид містить 5ЕО ІЮ МО: 15 або 17.
13. Спосіб детектування присутності ДНК, що відповідає події ОР-073496-4, у зразку, де подія ОР-073496-4 містить 5ЕО ІЮ МО: 12, 10 ї 13, який включає: (а) приведення зразка в контакт із полінуклеотидним зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК із зазначеної події Вгазв/іса і специфічно детектує зазначену подію; (р) піддавання зразка і зонда впливу жорстких умов гібридизації; і (с) детектування гібридизації зонда із ДНК, де детектування гібридизації вказує на присутність зазначеної події.
14. Спосіб за п. 13, де зазначений зразок містить тканину Вгаввіса. бо ше «ЕІ ОКО ще Ше ; ПИЛЕТИМТЬ Її Я пе миша в ден ії г із - кет. ЗК : 7 «й суду ня ЗКУуяОВ ит х Я 1 х КУ І БЕИХ щі Н Й і х Я Я в е дике КИ и й фреон шежжяжжнятннкккт няття зм -- Ме шо че х пат дже дк шх і ; ан пе ж Н дент КТК Е вим : ще і їй ; їі осока : хе «в і ДН нега ТЯ ІТИ: її й 3 х У бе Е Шо пу, Е се ЗІ СН 5 і важ ЗАД я їй дом а ще: ; пи ях х щамж Ху «ще хх ї ще КУ ц Ку їх У І жхаМ Й ї вка ЕЕ. Її ства « ЮК х у нови ЧИН лжжххюттих : Її ї : дулих 1 свй їх. : З пед - я ШЕУ мин о КБ нн па М Б ї о Ко ро пеня поютьях 5 зонд осстнінчнння : і Й я дяк МИ прохо вх ВО Я : - з ЯК З; Мозок ШОМО ЛИ І:
ж. КЕ й : і ї и ї ям і я З ще «АК ЕК Х ТІ мих І дети КТ ОаМИ КН МЖК КУ Я зкхлнмх Б ж «я й У х Е Може й к. х пет ІЗ й й ТАЦІ ша яка йо ву з Мак В Бош ї во Я: Сентез ВНЗ вес їх хо В: о СЯ ЗМ а но диню ння, дж ни Кл зоні ГКУ г ЕНН ККЗ) са ЕХ щої щи МК хе ее ВЖИ зе ШИ з: сх й я КЕ ХК хх КК техки кох кох КЕ Кк Гунеов МІВ з Х Е ; і х ГУ і і Я : ЗМОЗІ: і. В Мін МЕ щ уні пе . її й З КЗ о ВЕ АВС я С Б» : з й -З жк «ролхутмтея се ЕЕ п. й оре ДЕНЕНЕ х не в Х х Б Му ЖК хх КІВІ дво жо хх сні ї у З атух куки тт -е : хх вах че ж Х вето піт сх їз х я же жематична підго ма ЕК Мк ак я Х з ЕЕ ЕМ.
ЛАН НОВ НВК Ве ОВО ПОВ рення» кві
Б ж В закрутки В зу фчрьтую ти
Я ев КАК НВ ДОКТ МВ
Промовою зн ВО о ОВАВ те» ВІ зон а ОО ОВО ТВ нення ФА Схематичне уявлення сраєменту А з плазміди ВНеоВіВ еНеоВіві А;
UAA201307747A 2010-11-24 2010-11-24 Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання UA122558C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2010/058011 WO2012071040A1 (en) 2010-11-24 2010-11-24 Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA122558C2 true UA122558C2 (uk) 2020-12-10

Family

ID=43896668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201307747A UA122558C2 (uk) 2010-11-24 2010-11-24 Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2643464B1 (uk)
CN (2) CN103748227A (uk)
AU (1) AU2010364322C1 (uk)
CA (1) CA2810180C (uk)
EA (1) EA031629B1 (uk)
HU (1) HUE043280T2 (uk)
PL (1) PL2643464T3 (uk)
UA (1) UA122558C2 (uk)
WO (1) WO2012071040A1 (uk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014DN09195A (uk) 2012-05-23 2015-07-10 Du Pont
CA2905743C (en) 2013-03-13 2021-09-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
CN105874062B (zh) 2013-10-18 2021-07-20 先锋国际良种公司 草甘膦-n-乙酰转移酶(glyat)序列以及使用方法
CN106815766A (zh) * 2016-11-23 2017-06-09 北海高创电子信息孵化器有限公司 一种草本植物抗药性信息收集和整治***
CN106780077A (zh) * 2016-11-23 2017-05-31 北海高创电子信息孵化器有限公司 一种草本植物抗药性信息收集和整治***的工作方法
CN106701999B (zh) * 2017-02-24 2019-01-04 四川省农业科学院分析测试中心 含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针及方法
CN108486008B (zh) * 2018-03-26 2021-08-24 延边大学 对鳞翅目害虫高毒力的苏云金杆菌yn108、培养方法及其应用
CN109825634A (zh) * 2019-04-03 2019-05-31 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 转基因油菜品系dp-073496-4检测方法和试剂
CN111543309A (zh) * 2020-05-19 2020-08-18 吉林省农业科学院 一种牧草的育种方法
CN114586797B (zh) * 2020-12-03 2023-09-01 青岛清原作物科学有限公司 包含灭草松和砜嘧磺隆的三元除草组合物及其应用
AU2021410073A1 (en) 2020-12-21 2023-07-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer
CN116024253B (zh) * 2022-12-16 2024-06-14 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US542901A (en) 1895-07-16 Cabinet
US2891855A (en) 1954-08-16 1959-06-23 Geigy Ag J R Compositions and methods for influencing the growth of plants
US3235361A (en) 1962-10-29 1966-02-15 Du Pont Method for the control of undesirable vegetation
US3309192A (en) 1964-12-02 1967-03-14 Du Pont Method of controlling seedling weed grasses
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
ATE93542T1 (de) 1984-12-28 1993-09-15 Plant Genetic Systems Nv Rekombinante dna, die in pflanzliche zellen eingebracht werden kann.
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
EP0218571B1 (en) 1985-08-07 1993-02-03 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4808208A (en) 1986-08-04 1989-02-28 Canadian Patents & Development Ltd. Phenolic safeners for glyphosate herbicides
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5145783A (en) 1987-05-26 1992-09-08 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5502025A (en) 1987-08-13 1996-03-26 Monsanto Company Safening herbicidal pyrazolylsulfonylureas
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
CA2079877C (en) 1990-04-26 2001-07-31 Marnix Peferoen Bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
AU655197B2 (en) 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
USRE36449E (en) 1991-03-05 1999-12-14 Rhone-Poulenc Agro Chimeric gene for the transformation of plants
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
ES2124738T3 (es) 1991-08-02 1999-02-16 Mycogen Corp Nuevo microorganismo e insecticida.
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
US5341001A (en) 1992-02-13 1994-08-23 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Sulfide-selenide manganese-zinc mixed crystal photo semiconductor and laser diode
WO1994011516A1 (en) 1992-11-17 1994-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
CA2127807A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 John Maliyakal Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
DE69428290T2 (de) 1993-01-13 2002-04-18 Pioneer Hi Bred Int Derivate von alpha-hordothionin mit höherem behalt an lysin
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
JPH07177130A (ja) 1993-12-21 1995-07-14 Fujitsu Ltd エラーカウント回路
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
DE4440354A1 (de) 1994-11-11 1996-05-15 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Kombinationen aus Phenylsulfonylharnstoff-Herbiziden und Safenern
BR9604993B1 (pt) 1995-04-20 2009-05-05 dna mutante codificando uma proteìna ahas mutante de sìntese de ácido acetohidróxi e proteìnas ahas mutantes.
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
AU705933B2 (en) 1995-06-02 1999-06-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High threonine derivatives of alpha-hordothionin
EP0832235A1 (en) 1995-06-02 1998-04-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH METHIONINE DERIVATIVES OF alfa-HORDOTHIONIN
ZA964248B (en) 1995-06-23 1997-11-27 Du Pont Uniform mixtures of pesticidal granules.
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
US5981722A (en) 1995-11-20 1999-11-09 Board Of Regents For The University Of Oklahoma Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from PENTACLETHRA MACROLOBA
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
DE19638233A1 (de) 1996-09-19 1998-03-26 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Kombinationen aus Sulfonylharnstoff-Herbiziden und Safenern
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1998-06-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung
US6270025B1 (en) 1997-03-14 2001-08-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Apparatus for breaking and separating particles
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
WO1999025855A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
DE69833457T2 (de) 1997-11-18 2006-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom
AU760113C (en) 1997-11-18 2004-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
WO1999061619A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cell cycle genes, proteins and uses thereof
DE19827855A1 (de) 1998-06-23 1999-12-30 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Kombinationen aus Herbiziden und Safenern
US6518487B1 (en) 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
DE19853827A1 (de) 1998-11-21 2000-05-25 Aventis Cropscience Gmbh Kombinationen aus Herbiziden und Safenern
JP2003523173A (ja) 1999-04-29 2003-08-05 シンジェンタ リミテッド 除草剤耐性植物
HUP0201013A2 (en) 1999-04-29 2002-07-29 Syngenta Ltd Herbicide resistant plants
CN1373811A (zh) 1999-08-13 2002-10-09 辛根塔参与股份公司 耐除草剂的原卟啉原氧化酶
CA2401093A1 (en) 2000-03-09 2001-09-13 Monsanto Technology Llc Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof
DE10119721A1 (de) 2001-04-21 2002-10-31 Bayer Cropscience Gmbh Herbizide Mittel enthaltend Benzoylcyclohexandione und Safener
DE10145019A1 (de) 2001-09-13 2003-04-03 Bayer Cropscience Gmbh Kombinationen aus Herbiziden und Safenern
EP1382247A1 (en) 2002-07-18 2004-01-21 Bayer CropScience GmbH Combinations of cyclohexanedione oxime herbicides and safeners
MXPA05010296A (es) 2003-03-26 2005-11-17 Bayer Cropscience Gmbh Utilizacion de compuestos hidroxilicos aromaticos como antidotos.
DE10335725A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Bayer Cropscience Gmbh Safener auf Basis aromatisch-aliphatischer Carbonsäuredarivate
EA012521B1 (ru) 2003-11-03 2009-10-30 Байер Кропсайенс Аг Жидкий препарат, его применение, способ его получения и способ борьбы с сорными растениями
ATE442044T1 (de) 2004-03-27 2009-09-15 Bayer Cropscience Ag Herbizid-safener-kombination
SI2319932T2 (sl) 2004-04-30 2017-02-28 Dow Agrosciences Llc Nov gen z rezistenco na herbicide
US8796508B2 (en) 2005-11-10 2014-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Microprojectile bombardment transformation of Brassica
US7928296B2 (en) * 2006-10-30 2011-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010364322A1 (en) 2013-02-28
EA201390765A1 (ru) 2013-11-29
CA2810180C (en) 2015-07-28
PL2643464T3 (pl) 2019-08-30
AU2010364322B2 (en) 2013-03-21
EA031629B1 (ru) 2019-01-31
WO2012071040A1 (en) 2012-05-31
CN107815462A (zh) 2018-03-20
EP2643464A1 (en) 2013-10-02
CN103748227A (zh) 2014-04-23
CA2810180A1 (en) 2012-05-31
AU2010364322C1 (en) 2013-09-19
EP2643464B1 (en) 2018-12-26
HUE043280T2 (hu) 2019-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA122558C2 (uk) Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання
US20210324482A1 (en) Brassica gat event and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US7951995B2 (en) Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
US7928296B2 (en) Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US7968770B2 (en) Methods for improving yield using soybean event 3560.4.3.5
CA2666754C (en) Soybean event dp-305423-1 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
WO2012071039A1 (en) Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US8575431B2 (en) Brassica GAT event DP-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
AU2015268681B2 (en) Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
AU2013206424B2 (en) Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
CA2891153C (en) Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof