CN103748227A - 芸苔gat事件dp-073496-4及其鉴定和/或检测组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了与转基因耐草甘膦芸苔属植物相关的组合物和方法。具体地，本发明提供了具有赋予对草甘膦抗药性的DP-073496-***的芸苔属植物。所述芸苔属植物在指定的染色***置具有DP-073496-***，包含SEQ ID NO:2内的基因组/转基因接合点或SEQ ID NO:12和/或13所示的基因组/转基因接合点。事件基因组***位点的表征提供了提高的繁殖效率，并且使得分子标志物的使用能够追踪繁殖群体及其后代的转基因***物。提供了多种用于鉴定、检测和使用所述事件的方法和组合物。

Description

芸苔GAT事件DP-073496-4及其鉴定和/或检测组合物和方法
对通过EFS-WEB作为文档文件所提交的序列表的查阅
通过EFS-Web将正式的序列表副本与说明书同时提交作为文档文件，该序列表副本遵守美国信息交换标准代码(ASCII)，文档名称为399080seqlist.txt，创建日为2010年11月24日，大小为40Kb。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，且在此通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明属于分子生物学领域。更明确地说，本发明涉及赋予对草甘膦的抗性的序列的表达。
发明背景
已知外源基因在植物中的表达受它们在植物基因组内的位置所影响，这或许是由于染色质结构(例如，异染色质)或是转录调节元件(例如，增强子)邻近整合位点所致(Weising et al.,(1988)Ann.Rev.Genet22：421-477)。同时，存在于基因组内不同位置处的转基因会以不同方式影响植物的整体表型。为此，为了鉴定由所导入的目的基因的最佳表达所表征的事件，通常必须筛查大量的事件。例如，已经在植物和其它生物中观察到，不同事件中导入基因的表达水平差异极大。在表达的空间或时间模式上也有所差异，例如，转基因在不同植物组织中相对表达的差异，可能与从导入基因构建体中所存在的转录调节元件的模型不对应。还观察到，转基因***能影响内源基因的表达。因为这些原因，经常产生数百乃至数千个不同的事件，需筛选这些事件中具有商业用途的期望的转基因表达水平与模式的单一事件。具有期望的转基因表达水平或模式的事件，对于通过利用传统培育方法的有性异型杂交(sexual outcrossing)，将转基因基因渗入(introgressing)其它遗传背景中是有用的。此类杂交的子代可保持最初转化体的转基因表达特征。此策略被用来确保许多相当适应地方性生长条件的变种(variety)中基因表达的可靠性。
为了确定有性杂交的子代是否含感兴趣的转基因，能够检测特定事件的存在将是有帮助的。此外，检测特定事件的方法也有助于合乎法律规章，这些规章要求上市前许可(pre-market approval)与来自基因重组农作物(recombinant crop plants)食品的标记；或用于环境监测，监测田地中作物的性状或监测来自作物收割的产物；以及用来确保接受管理或契约条款的当事人的承诺。
在作物的商业性生产中，轻易且迅速地从农作物的田地中排除无用的植物(即，杂草)是可取的。理想的处理将是这样的一种处理，其可应用在整个田地上而仅会排除无用植物同时使得农作物不受伤害。上述处理***之一涉及应用耐除草剂的农作物，以便在耐除草剂的农作物的田地上喷洒除草剂时，农作物能持续生长而不耐除草剂的杂草则被杀死或严重受损。
由于杂草优势种与偏好的作物种类的地方性与地区性差异，亟需一种可保护作物与管理杂草的定制***，该***可适应特定地带、地形和/或地区的需求。需要允许快速鉴定能够产生上述特征的植物事件的方法与组合物。例如，亟需作物保护与杂草管理的方法：所述方法能够降低控制田地中杂草所必需的除草剂应用的数目；降低控制田地中杂草所需的除草剂的量；降低生产作物所需的耕重量；和/或推迟或避免耐除草剂杂草的发展和/或出现。亟需作物保护与杂草管理的方法与组合物，其允许有针对性地应用特定除草剂并有效地检测这类事件。
发明概述
本发明提供了与耐草甘膦的转基因芸苔属植物相关的组合物与方法。明确地说，本发明提供了含有赋予对草甘膦耐药性的转基因的芸苔属植物。所述事件例如可以是DP-073496-4。含有转基因的芸苔属植物在所列举的染色***置包含独特的基因组/转基因接合点，该接合点具有至少SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:12和/或13的多核苷酸序列。还提供了以专利保藏号PTA-11504保藏的种子以及由此而来的植物、植物细胞、植物部位、种子与植物产品。DP-073496-4或任何其它包含耐草甘膦的转基因的事件的基因组***位点的表征提供增强的培育效率且使得能够使用分子标志物来追踪培育种群与其子代中的转基因***物。提供鉴定、检测与应用芸苔中草甘膦-N-乙酰转移酶(“GAT”或“glyat”)转化事件的多种方法与组合物。
附图说明
图1显示了质粒PHP28181的合成。质粒PHP28181被用于产生GAT芸苔品系。
图2提供了质粒PHP28181的示意图谱。
图3提供了***DNA，即片段PHP28181A的示意图谱。
图4提供了来自PHP28181的片段A(PHP28181A)的示意图，具体是含有gat4621基因盒的Hind III/Not I片段(PHP28181A)的示意图谱，所述Hind III/Not I片段(PHP28181A)用于植物转化以生成DP-073496-4芸苔。片段大小为2112bp。在图谱上指出09-0-3290/09-0-3288的构建体特异性引物位置。
图5为来自DP-073496-4芸苔和非基因修饰的对照芸苔的叶DNA的构建体特异性PCR的Southern分析。用靶向DP-073496-4加拿大油菜中存在的唯一的泛素启动子和gat4621接合点的引物组09-0-3290/09-0-3288进行PCR扩增。预期的PCR扩增子大小为675bp。
图6为来自DP-073496-4芸苔和非基因修饰的对照芸苔的叶DNA的芸苔FatA基因PCR的Southern分析。用引物组09-0-2812/09-02813作为PCR扩增的阳性对照对内源性芸苔FatA基因进行PCR扩增。预期的PCR扩增子大小为506bp。
发明的详细描述
现将于下文参照附图更完整地描述本发明，附图中显示本发明的某些而不是全部实施方案。当然，这些发明可以多种不同的形式体现，并且不应被解释为受限于本文所示的实施方案；反而，提供这些实施方案以便本公开能满足适当的法律需求。在整个附图中相同的编号代表相同的元件。
本文所示的本发明的许多改良与其它实施方案使这些发明所述即使领域的技术人员留意与这些发明相关的学说优点(前面描述与相关的图式所呈现)。因此，应当理解本发明并不限于所公开的具体实施方案，并且其它实施方案意图包括在所附权利要求的范围内。虽然此处应用特定术语，但仅以通称与描述方式应用这些术语并不意图限制。
在此提供与草甘膦耐药性的转基因芸苔属植物有关的组合物与方法。明确地说，本发明提供了具有事件DP-073496-4或包含PHP28181A或其可操作的片段或变体的另一事件的芸苔属植物。具有事件DP-073496-4的芸苔属植物例如已通过***来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的草甘膦乙酰转移酶(glyat4621)基因而被修饰。通过基因改组(gene shuffling)处理在功能上改善glyat4621基因，以优化草甘膦乙酰转移酶(GLYAT)活性(用于乙酰化除草剂草甘膦)的动力学。在植物中***glyat4621基因，通过将草甘膦转换成无毒的乙酰化形式而赋予对除草剂活性成分草甘膦的耐药性。因此，具有事件DP-073496-4的芸苔属植物是耐草甘膦的。
将赋予草甘膦耐药性的多核苷酸***芸苔基因组的特定位置，并由此产生例如DP-073496-***。含有DP-073496-***的芸苔属植物在特定的染色***置包含基因组/转基因接合点，该接合点具有特有的SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列或至少SEQ ID NO:12和/或13、SEQ ID NO:14和/或15或SEQ ID NO:16和/或17的多核苷酸序列。任一事件的基因组***位点的特征提供增强的培育效率且使得能够使用分子标志物来追踪培育种群与其子代中的转基因***物。本文提供鉴定、检测与应用芸苔DP-073496-***的多种方法与组合物。在一实施方案中，提供芸苔属植物，在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸，编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸。术语“事件DP-073496-4特异的”指适合用来可区别性地鉴定植物、植物材料或产物(例如但不限于，由种子产生的油，或包含植物材料或由植物材料产生的食物或饲料产品(新鲜的或加工的))中的事件DP-073496-4的多核苷酸序列。
组合物还包括以专利保藏号PTA-11504的保藏的种子以及由此而来的植物、植物细胞与种子。申请人(们)已经在2010年11月24日将至少2500颗具有芸苔事件DP-073496-4的种子保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA20110-2209USA)，而保藏物根据国际认可的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款下保持。保藏仅是为了方便本领域技术人员而非承认保藏是35U.S.C.§112所要求的。保藏于ATCC的种子取自Pioneer Hi-Bred International,Inc.(7250NW62nd Avenue,Johnston,Iowa50131-1000)所保持的保藏物。在专利与商标局工作人员审查申请的过程中与工作人员同意的有资格的人士在请求时，可获取此保藏物。在申请中的任何权利要求被批准后，申请人(们)依照37C.F.R.§1.808将保藏样品开放给公众。可将包含芸苔事件DP-073496-4的寄存种子保持于ATCC寄存处，长达30年的时间或最近请求后5年或该专利可实施的有效期间(不论哪个较长)，且其若在这段期间丧失活性可被替换。此外，申请人(们)需履行37C.F.R.§§1.801-1.809所有的需求，包括提供保藏时样品的活力证明。申请人(们)并无权力撤回法律施加在生物材料运送或其商业上输送的任何限制。在依据植物物种权利保护法(7USC第2321条以及下列)下，申请人(们)不能撤回任何本专利赋予的权力或适用于事件DP-073496-4的权力。禁止未授权的种子增殖。即该种子须受到控制。
本文所用的术语“芸苔(Brassica)”意指任何芸苔属植物且包括所有可用芸苔育种的植物品种。本文所用的术语植物包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物细胞组织培养物(由此可再生植物)、植物愈伤组织、植物丛与在植物或植物的一部分内的是完整的植物细胞，所述植物的一部分诸如胚、花粉、胚株、种子、叶、花、枝条、果实、茎部、根部、根尖、花药等。所产生的成熟的种子可用于食物、饲料、燃料或其它商业或工业目的，或用于增加或繁殖该物种的目的。再生植物的子代、变种与突变体也包含于本发明的范围内，先决条件为这些部分包含DP-073496-***。
转基因“事件”由下列步骤产生：用异源DNA构建体转化植物细胞，所述构建体包括含有感兴趣的转基因的核酸表达盒；从每一个均包含***的转基因的细胞再生植物群；以及挑选特征为***特定基因组位置的特定植物。事件的特征为表型上表达转基因。在基因水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”还指转化体与包含异源DNA的另一物种之间有性杂交所产生的子代。即便在与轮回亲本回交之后，来自转化亲本的***的DNA和侧翼DNA都存在于杂交子代中相同的染色***置上。术语“事件”还指来自最初转化体的DNA，该DNA包含***的DNA与紧邻***DNA的侧翼序列，所述侧翼序列预期由于含***DNA的一亲本品系(例如，最初的转化体和由自身产生的子代)与不含***DNA的亲本品系的有性杂交而被转移给子代。
如本文所用的，“DNA***物”指用来转化植物材料的表达盒内的异源DNA，而“侧翼DNA”可以包括有机体(例如，植物)中天然存在的基因组DNA，或通过转化方法而导入的外源(异源)DNA，该外源DNA与原始DNA***物分子无关，例如与转化事件相关的片段。本文所用的“侧翼区域”或“侧翼序列”指至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更长的序列，且该序列或者位于紧邻原始外源DNA***物分子的上游且与其连续，或者紧邻原始外源DNA***物分子的下游且与其连续。DP-073496-***的侧翼区域的非限制性实例包括SEQ ID NO:2、8和/或9所示的多核苷酸序列与其变体及片段。
导致随机***外源DNA的转化步骤将造成转化体含有每一转化体特有且唯一的不同的侧翼区域。经由传统杂交方法将重组DNA导入植物中时，通常不会改变其侧翼区域。转化体还在一段异源DNA***物与基因组DNA之间、或两段基因组DNA之间、或两段异源DNA之间包含独特的接合点。“接合点”为两段特定的DNA片段接合的点。例如，接合点存在于DNA***物与侧翼DNA的接合处。接合点还存在于转化有机体中两段DNA片段以这样的方式接合在一起的地方，该方式从天然有机体中所见的方式修饰而来。本文所用的“接合DNA(junction DNA)”指包含接合点的DNA。来自DP-073496-***的接合DNA的非限制性实例示于SEQ ID NO:2,11,12,13,14,15,16,17,18和/或19或其变体及片段。
DP-073496-4植物可由下列步骤培育：使由转基因DP-073496-4芸苔属植物长成的第一亲本芸苔属植物(或用赋予对除草剂耐药性的本发明实施方案的表达盒转化而得到的其子代)与缺少除草剂耐药性表型的第二亲本芸苔属植物进行有性杂交，由此产生多个第一子代植物；接着挑选出能表现出期望的除草剂耐药性的第一子代植物；然后使该第一子代植物自交，由此产生多个第二子代植物；接着从中挑选出能表现出期望的除草剂耐药性的第二子代植物。这些步骤还可以包括将第一子代的耐除草剂植物或第二子代的耐除草剂植物与第二亲本芸苔属植物或第三亲本芸苔属植物进行回交，由此产生能展现期望的除草剂耐药性的芸苔属植物。还认识到，无需检验子代的表型。可用此文其它地方所描述的多种方法与组合物来检测和/或鉴定DP-073496-4或其它事件。
还可以将两种不同的转基因植物进行有性杂交以产生含有两个独立分离的外源基因的后代。适当子代的自交可产生对两个外源基因为纯合的植物。还考虑与亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交，如营养繁殖(vegetative propagation)。一般用于不同性状与作物的其它培育方法的描述可参见数篇参考文献中的一篇，例如Fehr,inBreeding Methods for Cultivar Development,Wilcos ed.,AmericanSociety of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
术语“种质”指代表一种基因型、品种、物种或培养物或其遗传材料的个体、个体群或克隆。
“系”或“品系”为相同来源的个体群，其通常近亲繁殖至某种程度且通常为同基因的或接近同基因的。
自交系趋向于为高度相似的、纯合的和可繁殖的。可用许多分析方法来测定自交系的纯合性与表型稳定性。
术语“杂交植物”指由基因上不同的个体之间的杂交而得到的植物。
本发明背景下的术语“杂交的(crossed)”或“杂交(cross)”意指配子融合，例如，就植物而言，经由授粉以产生子代(即，细胞、种子或植物)。就植物而言，该术语包括有性杂交(通过一种植物被另一种植物授粉)与自交(自花授粉，即花粉与胚珠来自同一植物)。
术语“基因渗入”指将基因座的期望的等位基因由一遗传背景传送至另一遗传背景。在一种方法中，可通过两个亲本之间的有性杂交使期望的等位基因基因渗入，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。
在某些实施方案中，将赋予本发明的芸苔DP-073496-***的多核苷酸基因改造成分子堆栈(molecular stack)。在其它实施方案中，分子堆栈还包含至少一额外的多核苷酸(赋予对第二种除草剂的耐药性)。一实施方案中，该序列赋予对草铵膦(glufosinate)的耐药性，而在一特定的实施方案中，该序列包含pat基因。在另一实施方案中，所述额外的多核苷酸提供对ALS抑制剂类除草剂的耐药性。
在其它实施方案中，本发明的事件包含一个或多个感兴趣的性状，而在更具体的实施方案中，将该植物用感兴趣的多核苷酸序列的任何组合堆栈以产生具有期望的性状组合的植物。本文所用的“性状(trait)”指由特定的序列或序列组产生的表型。例如，耐除草剂的多核苷酸可与任何其它多核苷酸(编码具有除虫和/或杀虫活性的多肽)堆栈，例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；Geiser et al.(1986)Gene48：109；Lee et al.(2003)Appl.Environ.Microbiol.69：4648-4657(Vip3A)；Galitzky et al.(2001)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57：1101-1109(Cry3Bb1)；以及Herman et al.(2004)J.Agric.Food Chem.52：2726-2734(CrylF))、凝集素(lectin)(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825)、果胶(pentin)(描述于美国专利号5,981,722)等。产生的组合还可包括任何一种感兴趣的多核苷酸的多个拷贝。
在某些实施方案中，本发明的事件可与其它耐除草剂的性状堆栈以产生具有进一步改良特性的本发明转基因植物。可用于上述实施方案中的其它除草剂耐药性的多核苷酸包括那些通过其它作用模式赋予对草甘膦耐药性的多核苷酸，举例来说，例如编码草甘膦氧化还原酶的基因，其更完整地描述于美国专利号5,776,760与5,463,175。可与本发明的事件结合的其它性状包括由赋予植物产生更高水平的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)能力的多核苷酸衍生的那些多核苷酸，例如，其更完整地描述于美国专利号6,248,876B1；5,627,061；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE37,287E；以及5,491,288；和国际公开号WO97/04103；WO00/66746；WO01/66704；与WO00/66747。可与本发明的事件结合的其它性状包括赋予对磺脲(sulfonylurea)和/或咪唑啉酮(imidazolinone)的耐药性，例如，其更完整地描述于美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937；与5,378,824；以及国际公开号WO96/33270。
在某些实施方案中，本发明的事件可与例如羟基苯基丙酮酸双氧化酶(hydroxyphenylpyruvatedioxygenases)堆栈，该氧化酶为催化对-羟基苯基丙酮酸(para-hydroxyphenylpyruvate,HPP)转换成尿黑酸(homogentisate)的反应的酶。可利用抑制该酶并结合该酶以抑制HPP转换成尿黑酸的分子作为除草剂。植物中赋予对上述除草剂耐药性的性状描述于美国专利号6,245,968B1；6,268,549；与6,069,115；以及国际公开号WO99/23886。可与本发明事件堆栈的适当的耐除草剂性状的它实例包括芳氧基烷酸酯双氧化酶(aryloxyalkanoate dioxygenase)的多核苷酸(据报导其赋予对2,4-D与其它苯氧基生长素(auxin)型除草剂以及例如国际公开WO2005/107437中所述的芳氧基苯氧基丙酸(aryloxyphenoxypropionate)除草剂的耐药性)与例如Herman et al.(2005)J.Biol.Chem.280：24759-24767中所述的麦草畏(dicamba)耐药性的多核苷酸。
可与本文公开的事件结合的耐除草剂的性状的其它实例包括编码外源性膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)的多核苷酸所赋予的那些性状，其描述于美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616；与5,879,903。含有外源性膦丝菌素乙酰转移酶的植物可表现出对草铵膦(其抑制酶即谷氨酰胺合成酶)除草剂增强的的耐药性。可与本文公开的事件结合的耐除草剂的性状的其它实例包括赋予改变的原卟啉原氧化酶(原卟啉原氧化酶,protox)活性的多核苷酸所赋予的那些性状，其描述于美国专利号6,288,306B1；6,282,837B1；与5,767,373；以及国际公开号WO01/12825。含有此类多核苷酸的植物能够表现出对靶向原卟啉原氧化酶的多种除草剂(又称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)中任何一种增强的耐药性。
在其它实施方案中，将耐ALS抑制剂的性状与本文公开的事件结合。如本文所用的，“耐ALS抑制剂的多肽”包括当在植物中表达时赋予对至少一种ALS抑制剂的耐药性的任何多肽。多种ALS抑制剂时已知的，且包括例如，磺脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、嘧啶氧基(硫)苯甲酸(pyrimidinyl(thio)benzoate)和/或磺酰胺基羰基***啉酮(sulfonylaminocarbonyltriazolinone)类除草剂。其它ALS抑制剂是已知的，并在本文其它地方公开。本领域内公知的是，ALS突变就磺脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、和嘧啶氧基(硫)苯甲酸的耐药性而言，落入不同的类别，包括具有以下特性的突变：(1)对这些类别中的全部四类具有广泛的耐药性；(2)对咪唑啉酮和嘧啶氧基(硫)苯甲酸的耐药性；(3)对磺脲和***并嘧啶的耐药性；以及(4)对磺脲和咪唑啉酮的耐药性。
可以利用多种耐ALS抑制剂的多肽。在一些实施方案中，耐ALS抑制剂的多核苷酸含有至少一个导致ALS多肽中的一个氨基酸发生改变的突变。在具体的实施方案中，改变发生在乙酰乳酸合酶的数个基本保守区域的一个当中。参见例如，Hattori et al.(1995)MolecularGenetics and基因组s246:419-425；Lee et al.(1998)EMBO Journal7:1241-1248；Mazur et al.(1989)Ann.Rev.Plant Phys.40:441-470；以及美国专利号5,605,011，每一篇通过引用全文并入本文。耐ALS抑制剂的多肽可以由例如ALS的SuRA或SuRB基因座编码。在具体的实施方案中，耐ALS抑制剂的多肽包含C3ALS突变体，HRA ALS突变体，S4突变体或S4/HRA突变体或以上的任何组合。已知ALS中的不同突变能够赋予对不同除草剂和除草剂组(和/或亚组)的耐药性。参见例如，Tranel and Wright(2002)Weed Science50:700-712。还参见，美国专利号5,605,011,5,378,824,5,141,870和5,013,659，每一篇通过引用全文并入本文。还参见，包含大豆HRA序列的SEQ ID NO:65；包含芸苔HRA序列的SEQ ID NO:66；包含拟南芥HRA序列的SEQ ID NO:67；以及包含棉花中所用的HRA序列的SEQ ID NO:86。在本发明的一实施方案中，发现ALS中的HRA突变具有特定的用途。突变导致产生的乙酰乳酸合酶多肽相对于野生型蛋白对至少一种ALS抑制剂化学成分具有抗药性。例如，表达耐ALS抑制剂的多肽的植物可以耐受的磺脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、嘧啶氧基(硫)苯甲酸、和/或磺酰胺基羰基***啉酮类除草剂的剂量比这些除草剂对合适的对照植物造成损伤的剂量高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、70、80、100、125、150、200、500或1000倍。在一些实施方案中，耐ALS抑制剂的多肽包含多个突变。此外，具有ALS抑制剂多肽的植物可以通过选择对草甘膦赋予耐药性的天然存在的突变来产生。
在一些实施方案中，耐ALS抑制剂的多肽赋予对磺脲和咪唑啉酮类除草剂的抗药性。磺脲和咪唑啉酮类除草剂通过阻断乙酰乳酸合酶(ALS)抑制高等植物的生长，所述乙酰乳酸合酶还被称为乙酰羟酸合酶(AHAS)。例如，含有特定ALS突变(例如，S4和/或HRA突变)的植物是耐磺脲类除草剂的。耐磺脲类植物和耐咪唑啉酮类植物的产生更全面地描述于美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937；和5,378,824；以及国际公开WO96/33270中，通过引用将每一篇全文并入本文用于所有目的。在具体的实施方案中，耐ALS抑制剂的多肽包含耐磺酰胺药物的乙酰乳酸合酶(也被称为耐磺酰胺药物的乙酰羟酸合酶)或耐咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(也被称为耐咪唑啉酮的乙酰羟酸合酶)。
可与本文公开的事件结合的耐除草剂的性状的其它实例包括赋予植物(例如，芸苔属植物或加拿大莴苣)对至少一种除草剂的耐药性的那些性状。耐除草剂的杂草是本领域内已知的，就如同它们对特定除草剂有着不同的耐药性的植物。参见，例如Green and Williams(2004)“Correlation of Corn(Zea mays)Inbred Response to Nicosulfuronand Mesotrione”，以海报呈现于WSSA Annual Meeting in Kansas City,Missouri,February9-12,2004；Green(1998)Weed Technology12：474-477；Green and Ulrich(1993)Weed Science41：508-516。负责这些耐药性的性状可通过培育或经由其它方法与本文公开的事件结合以提供本发明的植物及其应用方法。
本文公开的事件还可与至少一种其它性状结合以产生还包含多种期望的性状组合的本发明植物，所述性状包括但不限于：动物饲料所需的性状，例如高含油量(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸含量(例如，高苏氨酸(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；与5,703,409；美国专利号5,850,016)；大麦的高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；与WO98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene71：359；与Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：
123))；高消化性(例如，修饰的储存蛋白(2001年11月7日提交的美国专利申请系列号10/053,410)；与硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国专利申请系列号10/005,429))；上述公开的内容在此通过引用并入本文。期望的性状组合还包括低亚麻酸含量(low linolenic acidcontent,LLNC；参见，例如，Dyer et al.(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.59：224-230)与高油酸含量(high oleic acid content,OLCH；参见，例如，Fernandez-Moya et al.(2005)J.Agric.Food Chem.53：5326-5330)。
本文公开的事件还可与下列其它期望的性状结合：诸如伏马菌素(fumonisim)解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性且抗疾病的基因(Jones,et al.(1994)Science266：789；Martin,et al.(1993)Science262：1432；Mindrinos,et al.(1994)Cell78：1089)；加工或加工产物期望的性状，诸如改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如，二磷酸腺苷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG pyrophosphorylases,AGPase)、淀粉合成酶(starch synthases,SS)、淀粉分支酶(starch branching enzymes,SBE)以及淀粉去分支酶(starchdebranching enzymes,SDBE))；与聚合物或原生质体(例如，美国专利号5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基烷酸合成酶与乙酰乙酰辅酶A(acetoacetyl-CoA)还原酶(Schubert,et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基烷酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)的表达)。上述的公开在此通过引用并入本文中。还可将耐除草剂的多核苷酸与提供下列农艺性状的多核苷酸结合，诸如雄性不育(例如，参见美国专利号5,583,210)、茎部强化、开花时间或例如细胞周期调控或基因打靶(genetargeting)的转化技术性状(例如，WO99/61619、WO00/17364与WO99/25821)，上述的公开在此通过引用并入本文中。
在另一实施方案中，本文公开的事件还可与Rcg1序列或其生物活性变体或片段结合。Rcg1序列为芸苔中的抗炭疽茎腐基因(anthracnosestalk rot resistance gene)。参见，例如，美国专利申请系列号11/397,153、11/397,275与11/397,247，每一篇在此通过引用并入本文中。
可用任何方法产生这些堆栈式组合，所述方法包括(但不限于)通过任何常规方法学或基因转化培育植物。如果通过基因转化植物而堆栈序列，则可于任何时间以任何顺序结合目的多核苷酸序列。可以以共转化方案，用转化盒的任意组合所提供的目的多核苷酸同时导入所述性状。例如，假若将导入两段序列，那么两段序列可包含于单独的转化盒中(反式)或包含于相同的转化盒中(顺式)。可由相同或不同的启动子驱动序列的表达。某些实例中，导入能抑制目的多核苷酸表达的转化盒可能是可取的。这可与其它抑制盒或过表达盒的任何组合结合，以便在植物中产生期望的性状组合。还认识到，可利用特定位点特异性重组***(site-specific recombination system)将多核苷酸序列堆栈于期望的基因组位置上。参见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855与WO99/25853，其所有在此通过引用并入本文中。
如本文所用的，术语“多核苷酸”的使用并非意图将本发明限制为包含DNA的多核苷酸。本领域技术人员应当认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。上述脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸包括天然存在的分子与合成类似物(syntheticanalogue)两种。本发明的多核苷酸还包括所有形式的序列，其包括(但不限于)单链形式、双链形式、发夹型(hairpins)、茎环结构(stem-and-loopstructures)等。
DP-073496-4芸苔属植物包含具有优化的草甘膦乙酰转移酶的多核苷酸的表达盒。所述盒包括可操作地连接于glyat的多核苷酸5'和3'调控序列。“可操作地连接”意图表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸与调控序列(即，启动子)之间的可操作连接为允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作连接的元件可以为连续性的或非连续性的。当结合两个蛋白质编码区的连接使用时，可操作地连接意为这些编码区处于相同的阅读框内。所述盒还可包含至少一种可被共转化入有机体内的附加基因。或者，可用多个表达盒提供附加基因。为此类表达盒提供多个限制位点和/或重组位点，以便***的多核苷酸受到调控区的转录调控。表达盒还可包含选择性标记基因。
表达盒以5'-3'的转录方向可包含：在植物中有功能的转录与翻译起始区(即，启动子)、编码区以及转录与翻译终止区。“启动子”指能控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位在启动子序列的3'端。启动子序列可包含近端与较远程的上游元件，而后者经常称为增强子。因此，“增强子”为一可刺激启动子活性的核苷酸序列，并可为启动子的固有元件或经***以增强启动子水平或组织特异性的异源性元件。启动子可整体来自一天然基因；或由来自自然中发现的不同启动子的不同元件组成；或甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同启动子可于不同组织或细胞类型；或发育的不同时期；或响应不同的环境条件指导基因的表达。造成一核酸片段在大部分时间表达于大多数细胞类型的启动子，通常称为“组成型启动子”。持续发现可用于植物细胞中的不同类型的新型启动子；可于Okamuro and Goldberg(1989)Biochemistry of Plants15：1-82的刊物中发现许多实例。还认识到，既然大部分实例中尚未完全界定调控序列的精确范围，那么不同长度的核酸片段可能具有相同的启动子活性。
表达盒还可含有5'前导序列。此类前导序列可起到增强翻译的作用。调控区(即，启动子、转录调控区、RNA处理或稳定区、内含子、多聚腺苷酸信号、转录终止区与翻译终止区)和/或编码区对宿主细胞或彼此之间可以为天然的/同功(analogous)或异源性(heterologous)的。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列与编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列位于完全加工过的mRNA中的翻译起始序列的上游。翻译前导序列可影响许多参数，包括初级转录物至mRNA的加工、mRNA的稳定性和/或翻译效率。已经描述翻译前导序列的实例(Turnerand and Foster(1995)Mol.Biotechnol.3：225-236)。“3'非编码序列”指位于编码序列下游的核苷酸序列，且包括多聚腺苷酸识别序列与其他序列(编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号)。多聚腺苷酸信号通常通过影响向mRNA前体的3'端添加多聚腺苷酸串来表征。Ingelbrecht et al.(1989)Plant Cell1：671-680中示例了不同3'非编码序列的使用。
本文所用的“异源性”涉及一段序列时，是指一段来自外来物种的序列，或(若来自同一物种)实质上由有意的人为干预从其组合物和/或基因组基因座的天然形式修饰得到的。例如，可操作地连接至一异源性多核苷酸的启动子是来自与多核苷酸不同的物种，或(若来至同一/相似物种)其中之一或两者均实质上由其原始形式和/或基因组基因座修饰而成，或启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
在制备表达盒时，可操作不同的DNA片段以便提供适当方向和适当阅读框(视情况而定)的DNA序列。针对此目标，可使用适配子或连接子以连接DNA片段或可涉及其他操作以提供方便的限制位点、多余DNA的移除、限制位点的移除等。为此目的，可包括体外突变、引物修复、限制(restriction)、退火(annealing)、再替代(resubstitutions)(例如，转换(transitions)与颠换(transversions))。表达盒还可包含选择性标记基因以便挑选转化后的细胞。利用选择性标记基因挑选转化后的细胞或组织。
提供分离的多核苷酸，其可用于检测和/或鉴定芸苔DP-073496-***的不同方法中。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分，是大体上或实质上不具有该多核苷酸天然存在的环境中所见的通常与之相伴或与之相互作用的成分。因此，当以重组技术产生时，分离或纯化的多核苷酸实质上不具有其他细胞材料或培养基，或当以化学合成时，其实质上不具有化学前体或其他化学物质。最理想地，“分离”的多核苷酸不具有多核苷酸所来源的有机体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸侧翼的序列(最佳为蛋白质编码序列)(即，位于多核苷酸5'端与3'端的序列)。例如，在多种实施方案中，分离的多核苷酸可包含低于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸侧翼的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的接合点DNA序列或其变体和/或片段，或SEQ ID NO:12和/或13所示的接合点DNA序列。在在其他实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:14、15、16、17、18和/或19所示的接合点DNA序列或其变体与片段。在具体的实施方案中，本文所述的检测方法扩增包含具体DP-073496-***的接合点的多核苷酸。接合点DNA序列的片段与变体适合用来有区别地鉴定任一事件DP-073496-4。如本文其他地方所讨论，此类序列可作为引物和/或探针。
在其他实施方案中，本发明的多核苷酸包括可检测DP-073496-***或DP-073496-4特异区域的多核苷酸。这类序列包括SEQ ID NO:2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27所示的任一多核苷酸或其的变体与片段。检测DP-073496-***或DP-073496-4特异区域的多核苷酸的片段与变体适于有区别地鉴定事件DP-073496-4。如本文其他地方所讨论，此类序列可作为引物和/或探针。
“变体”意图表示实质上相似的序列。针对多核苷酸，变体包括具有下列情况的多核苷酸：在其5'端和/或3'端具有缺失(deletion)(即，截断)；在天然多核苷酸中的一或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸中的一或多个位点取代一个或多个核苷酸。
本文所用的“探针”为一分离的多核苷酸，其连接常规的可检测的标记物或报导分子，诸如放射性同位素、配体、化学发光剂、酶等。这样的探针与靶多核苷酸的一条链互补，就本发明而言，探针与来自芸苔事件DP-073496-4的分离DNA的一条链互补，不论该DNA来自芸苔属植物或来自包含来自该事件的DNA的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，且包括聚酰胺与其他探针材料(可特异性地检测靶DNA序列的存在)。
本文所用的“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA退火，从而在引物与靶DNA链间形成杂合体，接着通过聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。本发明的引物对是指用以扩增靶多核苷酸的引物，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。“PCR”或“聚合酶链式反应”为一种用来扩增特定DNA区段的技术(参见，美国专利号4,683,195与4,800,159；在此通过引用并入本文)。可以使用引物的任何组合以便引物对允许检测DP-073496-***或DP-073496-4特异的区域。
探针与引物具有足够的核苷酸长度，从而可结合于目标DNA序列并特异性地检测和/或鉴定具有DP-073496-***的多核苷酸。应当认识到，操作者可确定杂交条件或反应条件以达成此结果。此长度可以为任何足以用于所选的检测方法的长度。一般来说，可使用长度为8、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700个核苷酸或更多，或约11-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800或更多个核苷酸。上述的探针与引物能够在高严紧的杂交条件下与目标序列特异性地杂交。根据本发明实施方案的探针与引物的连续核苷酸可具有与目标序列完全的DNA序列同一性，然而可通过常规方法设计不同于目标DNA序列且仍保持特异性地检测和/或鉴定目标DNA序列能力的探针。因此，探针与引物可与目标多核苷酸共有约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性或互补性，或者与目标序列有1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸的不同。探针可被当作引物，但通常将其设计成能结合目标DNA或RNA但不用于扩增过程。在一非限制性实施方案中，探针可包含编码glyat4621序列的多核苷酸或其任何变体及片段。
可利用特异性引物扩增整合片段以产生扩增子，所述扩增子可当作“特异性探针”或其本身可被检测以在生物样品中鉴定事件DP-073496-4。或者，可在聚合酶链式反应过程中应用本发明的探针(即，TaqmanTM探针或MGB探针，所谓的实时PCR反应)去检测事件。当在允许探针与样品结合的情况下探针与生物样品的多核苷酸杂交时，可检测此结合并因此指示事件DP-073496-4存在于生物样品中。本领域内已经描述了这类结合探针的辨识方法。在本发明的一实施方案中，特异性探针为这样的一段序列，该序列在优化的条件下可与事件5'或3'侧翼区域中的一区域特异性杂交，且还包含一部分与其连续的外源DNA。特异性探针可包含一段这样的序列，该序列与DP-073496-***的特异性区域至少80%、80至85%、85至90%、90至95%以及95至100%一致(或互补)。
本文所用的“扩增的DNA”或“扩增子”是指核酸模板中一部分的目标多核苷酸的多核苷酸扩增产物。例如，为了确定有性杂交产生的芸苔属植物是否含有DP-073496-***，利用DNA引物对以多核苷酸扩增方法处理芸苔属植物组织样品提取的DNA以产生一扩增子，该引物对包括第一引物与第二引物，所述第一引物来自***异源性DNA的***位点邻近的侧翼序列，所述第二引物来自***的异源性DNA，而该扩增子用于鉴定DP-073496-***DNA的存在与否。在具体的实施方案中，扩增子包含DP-073496-4接合点多核苷酸(即，SEQ ID NO:2跨越接合位点的一部分，例如SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或19或其变体或片段)。“鉴定”DP-073496-***是使用任何可在生物样品中区别DP-073496-***存在与否的方法或试验。或者，第二引物可来自侧翼序列。在其他实施方案中，引物对可来自DNA***物两侧的侧翼区域以便产生包括表达构建体完整的***多核苷酸以及转基因***物侧翼的序列的扩增子。参见，图3。扩增子为一段长度且具有也可鉴定所述事件的序列(即，具有来自DP-073496-***的接合点DNA)。扩增子的长度范围可以从引物对加一核苷酸碱基对的相加的长度至DNA扩增步骤可产生的任何长度的扩增子。来自侧翼序列的引物对成员可与***的DNA序列有段距离，这段距离的范围可以从一个核苷酸碱基对长至扩增反应的极限，或约两万个核苷酸碱基对。使用的术语“扩增子”明确地排除可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体(primer dimmers)。
制备与应用探针与引物的方法描述于，诸如Molecular Cloning：ALaboratory Manual,2.sup.nd ed,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1989(以下称为“Sambrook et al.,1989”)；Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausube et al.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NewYork,1992(定期更新)(以下称为“Ausubel et al.,1992”)；以及Innis et al.,PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press：San Diego,1990。聚合酶链式反应引物对可来自一已知序列，例如，利用为此目的的计算机程序，该程序诸如第6版Vector NTI(InformaxInc.,Bethesda Md.)；PrimerSelect(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.)；以及Primer(Version0.5.COPYRGT.,1991,Whitehead Institute for BiomedicalResearch,Cambridge,Mass)中的聚合酶链式反应引物分析工具。此外，可利用本领域技术人员已知的指导方针视觉性地扫描序列且手动地识别引物。
可以理解本文所用的术语“转基因”包括任何细胞、细胞株、愈伤组织、组织、植物部位或植物，其基因型因为异源性核酸的存在而改变，其包括那些最初即改变的转基因体以及最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖而产生那些个体。本文所用的术语“转基因”并不包括下列方式所造成的基因组(染色体或染色体外)改变：传统的植物培育方法或自然发生的事件，诸如随机异花受精(random cross-fertilization)、非重组性病毒感染(non-recombinant viral infection)、非重组性细菌转化(non-recombinant bacterial转化)、非重组性转位(non-recombinanttransposition)或自然突变。
“转化”指将核酸片段转移进入宿主有机体的基因组中，造成基因稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主有机体被称为“转基因”有机体。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(Agrobacterium-mediated转化)(De Blaere et al.(1987)Meth.Enzymol.143：277)与加速粒子或“基因枪”转化技术(Klein et al.(1987)Nature(London)327：70-73；美国专利号4,945,050，在此通过引用并入本文)。以下将揭示其它转化方法。
因此，可将本发明的分离多核苷酸并入重组构建体(一般为DNA构建体)，该构建体能够被导入宿主细胞并在细胞中复制。这样的构建体可以为一载体，其包括复制***与能在已知宿主细胞中转录与翻译多肽编码序列的序列。适合稳定转染(transfection)植物细胞或建立转基因植物的许多载体描述于，例如，Pouwels et al.(1985；1987补充)Cloning Vectors：A Laboratory Manual；Weissbach与Weissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology(Academic Press,New York)；以及Flevin et al.(1990)Plant Molecular Biology Manual(Kluwer AcademicPublishers)。一般来说，植物表达载体包括，诸如，受到5'与3'调控序列转录调控的一或多个克隆的植物基因，与显性选择标记。这类植物表达载体还可包含启动子调控区(例如，调控诱导型或组成型表达、环境或发育调节的表达、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸信号。
提供鉴定事件DP-073496-4的多种方法与组合物。此类方法可用于在任何生物材料中鉴定和/或检测DP-073496-***。此类方法包括，例如确定种子纯度的方法与在一批种子中筛选DP-073496-***的方法。在一实施方案中，提供在生物样品中鉴定事件DP-073496-4的方法，而该方法包括将样品与第一与第二引物接触；然后扩增含有DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。
生物样品可包括人们想测定是否含有事件DP-073496-4DNA的任何样品。例如，生物样品可包括任何植物材料，或是包含或来自植物材料(例如，但不限于食物或饲料产品)的任何材料。本文所用的“植物材料”指由植物或植物部位得到或衍生的材料。在具体的实施方案中，该生物样品包括芸苔组织。
基于本文所揭示的侧翼DNA与***序列的引物与探针，可通过传统方法(例如，通过再克隆与测序此类序列)来确认(且若有需要，修正)所公开的序列。本发明的多核苷酸探针与引物可特异性地检测目标DNA序列。任何传统的核酸杂交或扩增方法可用来在样品中鉴定来自转基因事件的DNA的存在与否。而“特异性地检测”，表示多核苷酸可当作引物以扩增DP-073496-4特异性区域，或多核苷酸可当作探针在严紧条件下与来自DP-073496-***的多核苷酸杂交。允许特异性检测DP-073496-***或DP-073496-***特异性区域的杂交水平或程度足以分辨具有DP-073496-4特异性区域的多核苷酸与缺少此区域的多核苷酸，因而可区别性地鉴定DP-073496-***。而“共有足够的序列同一性或互补性从而允许扩增DP-073496-4特定事件”，表示该序列与具有DP-073496-4特异性区域的多核苷酸的片段或全长共有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性或互补性。
关于利用特定扩增引物对目标多核苷酸的扩增(例如，通过聚合酶链式反应)，“严紧条件”是允许引物对与目标多核苷酸杂交且优选在DNA热扩增反应中产生可辨识的具有DP-073496-4特异性区域的扩增产物(扩增子)的条件，其中具有相应的野生型序列(或其互补序列)的一条引物和具有相应的DP-073496-4***DNA序列的另一条引物将与所述目标多核苷酸结合。在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物(用于聚合酶链式反应)以扩增DP-073496-4特异性区域。设计PCR引物与PCR克隆的方法通常是本领域内已知的，且揭示于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,New York)。还可见于Innis et al.,eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(AcademicPress,New York)；以及Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR MethodsManual(Academic Press,New York)。扩增方法进一步描述于美国专利号4,683,195、4,683,202与Chen et al.(1994)PNAS91：5695-5699。这些方法以及本领域内已知的DNA扩增的其他方法可用来实施本发明的实施方案。可以理解特定PCR方案中的许多参数需作调整以符合特定实验室条件，且可稍作修饰以收集相似结果。这些调整对本领域技术人员是显而易见的。
扩增的多核苷酸(扩增子)可以是允许检测DP-073496-***或DP-073496-4特异性区域的任何长度。例如，扩增子长度约10、50、100、200、300、500、700、1000、2000、3000、4000、5000个核苷酸或更长。
在具体的实施方案中，可检测DP-073496-***的特异性区域。
扩增和/或检测DP-073496-4特异性区域的任何引物可用于本发明的方法中。例如，在具体的实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:2或3的多核苷酸的片段，其中该第一或第二引物与多核苷酸共有足够的序列同一性或互补性以扩增DP-073496-4特异性区域。引物对可包含SEQ ID NO:2或3的片段，在另一实施方案中，引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:8的片段，所述第二引物包含SEQ ID NO:9或10的片段；或者，可选择地，引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:9的片段，所述第二引物包含SEQ ID NO:8或10的片段。引物可为足以扩增DP-073496-4特异性区域的任何长度，包括例如，至少6、7、8、9、10、15、20、25或30，或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。其它引物也列在表11中。
如本文其他地方所讨论，可使用任何方法以PCR扩增DP-073496-***或特异性区域，包括例如，实时PCR。参见，例如Livak et al.,(1995a)。在相对的两端具有荧光染料寡核苷酸提供了检测PCR产物和核酸杂交的淬灭探针***。PCR methods andApplications.4：357-362；美国专利号5,538,848；美国专利号5,723,591；Applied Biosystems User Bulletin No.2,“Relative Quantitation of GeneExpression,”P/N4303859；以及Applied Biosystems User BulletinNo.5,“Multiplex PCR with Taqman VIC probes,”P/N4306236；上述每一篇在此通过引用并入本文。
因此，在具体的实施方案中，提供在生物样品中检测芸苔事件DP-073496-4或其后代存在的方法。该方法包括(a)由该生物样品提取DNA样品；(b)提供靶向***物和/或接合点的一对DNA引物分子；(c)提供DNA扩增反应条件；(d)执行DNA扩增反应，因此产生DNA扩增子分子；以及(e)检测DNA扩增子分子，其中在DNA扩增反应中测得所述DNA扩增子分子指示芸苔事件DP-073496-4的存在。为了让核酸分子作为引物或探针，其仅需要序列上足够的互补性以能在应用特定溶剂与盐浓度的情况下形成稳定的双链结构。
杂交技术中，应用可与具有DP-073496-4特定事件的目标多核苷酸选择性杂交的多核苷酸的全部或部分。而当“严紧条件(stringentconditions)”或“严紧杂交条件(stringent hybridization conditions)”指多核苷酸探针条件时，表示在该条件下探针将以可检测地高于其他序列的程度与其目标序列杂交(例如，至少高于背景值2倍)。对利用特定扩增引物对扩增目标多核苷酸(例如，通过PCR)而言，“严紧条件”是允许引物对杂交至目标多核苷酸的条件，其中一条引物具有相应的野生型序列而另一引物具有相应的DP-073496-4***DNA序列。严紧条件取决于序列且在不同环境下有所不同。通过控制杂交和/或清洗条件的严紧性，可鉴定与探针100%互补的目标序列(同源性探取(homologousprobing))。或者，可调整严紧性条件以容许序列中的某些错配(mismatching)，从而检测较低程度的同一性(异源性探取(heterologousprobing))。一般来说，探针长度低于约1000个核苷酸或低于约500个核苷酸。
本文所用的“基本上相同或互补的序列”是指在高严紧条件下比较时，与核酸分子的互补序列特异性杂交的多核苷酸。促进DNA杂交的适当严紧条件为，例如，在约45℃下以6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)清洗接着在50℃下以2×SSC清洗，这些是本领域技术人员已知的或可见于Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。一般来说，杂交与检测的严紧条件中盐类浓度低于约1.5 M钠离子，一般约为0.01至1.0 M的钠离子(或其他盐类)浓度且pH值在7.0至8.3，而温度至少约30℃(短探针，例如，10至50个核苷酸)与至少约60℃(长探针，例如，长于50个核苷酸)。还可添加去稳定剂(例如，甲酰胺)以达成严紧条件。示范性的低严紧条件包括在37℃下，于30至35%甲酰胺、1M氯化钠、1%十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中杂交，然后在50℃到55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M氯化钠/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示范性的中等严紧条件包括在37℃下于40至45%甲酰胺、1M氯化钠、1%SDS中杂交，然后在55℃至60℃下于0.5×至1×SSC中清洗。示范性的高严紧条件包括在37℃下于50%甲酰胺、1M氯化钠、1%SDS中杂交，然后在60℃至65℃下在0.1×SSC中清洗。任选地，清洗缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交持续的时间通常少于约24小时，一般约为4至约12小时。清洗时间的持续将至少是足以达到平衡的时间长度。
杂交反应中，特异性一般为杂交后清洗的函数，而关键因素为最终清洗溶液的离子强度与温度。对DNA-DNA杂合体而言，Tm大约接近从Meinkoth and Wahl,(1984)Anal.Biochem.138：267-284公式的所得值，：Tm＝81.5℃＋16.6(log M)＋0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L，其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟嘌呤与胞嘧啶核苷酸的百分比，%form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L为杂合体的长度(碱基对)。Tm为50%互补性目标序列杂交至完美配对探针时的温度(确定的离子强度与pH值下)。每错配1%，Tm减少约1℃。因此，可以调整Tm、杂交和/或清洗条件以杂交期望同一性的序列。例如，若欲寻找>90%同一性的序列，那么Tm可以减少10℃。一般来说，在确定的离子强度与pH值下，针对特定序列与其互补序列挑选低于热熔点(T m)约5℃的严紧条件。然而，极度严紧条件在杂交和/或清洗时利用低于热熔点1、2、3或4℃的温度；中度严紧条件在杂交和/或清洗时利用低于热熔点6、7、8、9或10℃的温度；低严紧条件在杂交和/或清洗时利用低于热熔点11、12、13、14、15或20℃的温度。利用此公式、杂交与清洗溶液成分与期望的Tm，本领域技术人员可以理解杂交和/或清洗溶液的严紧性变化如同上述。若期望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最理想的是提高SSC浓度以便可使用更高温度。核酸杂交的广泛简介可见于Tijssen,(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter2(Elsevier,New York)；以及Ausube et al.,eds.(1995)Current Protocols inMolecular Biology,Chapter2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)以及Haymes et al.(1985)In：Nucleic Acid Hybridization,a PracticalApproach,IRL Press,Washington,D.C.。
如果多核苷酸表现出互补性，则其被认为是另一多核苷酸的“互补片段”。如文中所用，当多核苷酸分子之一的每个核苷酸互补于另一多核苷酸的核苷酸时，所述分子被认为表现出“完全互补性”。如果两种分子可以以足以允许他们彼此保持退火的稳定性杂交(至少在传统的“低严紧性”条件下)，则认为它们为“最低互补的”。相同地，如果两种分子可以以足以允许他们彼此保持退火的稳定性杂交(至少在传统的“高严紧性”条件下)，则认为它们是互补的。
还提供了检测样品中与DP-073496-***相对应的DNA存在与否的方法。在一实施方案中，该方法包括(a)使生物样品接触多核苷酸探针，该探针在严紧杂交条件下与来自芸苔事件DP-073496-4的DNA杂交且特异性地检测DP-073496-***；(b)将样品与探针置于严紧杂交条件下；以及(c)检测探针与DNA的杂交，其中测得杂交指示DP-073496-***的存在。
可用多种方法来检测DP-073496-4特异性区域或其扩增子，包括(但不限于)遗传单位分析法(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov et al.(1994)Nucleic Acid Res.22：4167-4175)，此方法中，设计DNA寡核苷酸使其与邻近的侧翼DNA序列和***的DNA片段两者部分重叠。将寡核苷酸固定于微孔板的孔中。使关注区域进行PCR(利用一位于***序列的引物与一位于邻近侧翼序列的引物)后，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸退火，且作为单碱基延伸反应的模板，而该单碱基延长反应利用DNA聚合酶与标记的ddNTP(对预期的下一碱基是特异的)。读取可以基于荧光或ELISA。由于成功的扩增、杂交与单一碱基延伸，信号指示***/侧翼序列的存在。
另一种检测方法为焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术，于Winge((2000)Innov.Pharma.Tech.00：18-24)中描述。此方法中，设计寡核苷酸使其与邻近DNA与DNA***物的接合点重叠。寡核苷酸与来自关注区域的单链PCR产物(其中一条引物位于***序列而另一引物位于侧翼序列)退火，且在存在以下的情况下孵育：DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷硫酸与荧光素。分别加入dNTPs，并且并入导致可测量光信号。而由于成功的扩增、杂交与单一或多个碱基延伸，光信号指示转基因***/侧翼序列的存在。
Chen et al.((1999)Genome Res.9：492-498,1999)描述的荧光偏振(Fluorescence Polarization)也是可用来检测本发明扩增子的方法。利用此方法，设计寡核苷酸使其与侧翼和***DNA***的接合点重叠。寡核苷酸与来自关注区域的单链PCR产物(其中一条引物位于***序列而另一引物位于侧翼序列)杂交，且在存在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的情况下孵育。单碱基延伸造成ddNTP的并入。而可利用荧光计观察偏振的变化来测量并入。而由于成功的扩增、杂交与单一碱基延伸，偏振变化指示转基因***/侧翼序列的存在。
Figure GDA0000466023700000261
(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)被描述成一种检测与定量DNA序列存在的方法且可由制造商的说明书完全了解其应用。简单的说，设计FRET寡核苷酸探针使其与侧翼和DNA***物的接合点部分重叠。FRET探针与PCR引物(其中一条引物位于***的DNA序列而另一引物位于侧翼基因组序列)在热稳定性聚合酶与dNTP存在下进行循环。FRET探针的杂交造成荧光基团由FRET探针上的淬灭基团(quenching moiety)分离与释出。由于成功的扩增与杂交，荧光信号指示侧翼/转基因***序列的存在。
如Tyangi et al.((1996)Nature Biotech.14：303-308)中所描述的，已经描述分子信标(Molecular Beacons)用于序列检测。简单的说，设计FRET寡核苷酸探针使其与侧翼和DNA***物的接合点部分重叠。FRET探针的独特结构造成其含有保持荧光与淬灭基团相当靠近的二级结构。FRET探针与PCR引物(其中一条引物位于DNA***序列而另一引物位于侧翼序列)在热稳定性聚合酶与dNTP存在下进行循环。PCR成功的扩增后，FRET探针与目标序列的杂交造成探针二级结构的移除以及荧光与淬灭基团空间上的分离。进而得到荧光信号结果。由于成功的扩增与杂交，荧光信号指示侧翼/转基因***序列的存在。
利用与扩增子中所见的某序列特异的探针的杂交反应为检测PCR反应产生的扩增子的又一种方法。
本文所用的“试剂盒”指用以执行本方法实施方案的一组试剂，更明确地，指用于鉴定和/或检测生物样品中的DP-073496-***的一组试剂。可使用本发明的试剂盒，且可明确地调整其成分，用于质量控制(例如，种子批次的纯度)，检测植物材料或包含或来自植物材料的材料(例如但不限于，食物或饲料产品)中的事件DP-073496-4的目的。
在具体的实施方案中，提供在生物样品中鉴定事件DP-073496-4的试剂盒。该试剂盒包含第一与第二引物，其中第一与第二引物扩增含有DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。在其它实施方案中，该试剂盒还包含用于检测DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。该试剂盒可包含例如第一引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:2、3、8、9或10多核苷酸的片段，其中所述第一或第二引物与多核苷酸共有足以扩增所述DP-073496-4特异性区域的序列同源性或互补性以及特异性。在其它实施方案中，所述第一引物包含SEQ ID NO:8多核苷酸的片段，而所述第二引物包含SEQ ID NO:9或10的片段，其中所述第一或第二引物与多核苷酸共有足以扩增DP061061-7特异性区域的序列同源性或互补性。可选择地，第一引物对包含SEQ ID NO:9或其变体或片段，且第二引物对包含SEQ ID NO:8或10或其变体或片段。在其它实施方案中，引物对可以包含SEQ ID NO:2的片段和SEQ ID NO:3的片段。引物可为足以扩增DP-073496-4区域的任何长度，包括诸如，至少6、7、8、9、10、15、20、25或30，或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。进一步提供DNA检测试剂盒，其包含至少一可特异性地检测DP-073496-4特异性区域或DNA***物的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一DNA分子，该分子具有与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27同源或互补的足够长度的连续核苷酸。
在一实施方案中，提供在生物样品中鉴定事件DP-073496-4的试剂盒。该试剂盒包含第一与第二引物，其中所述第一与所述第二引物扩增含有DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。在其它实施方案中，该试剂盒还包含用于检测DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。因此，在一非限制性实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:11的第一片段，而第二引物包含SEQ ID NO:11的第二片段，其中所述第一和第二引物在DP-073496-4特异性区域侧翼，且与多核苷酸共有足以扩增所述DP-073496-4特异性区域的序列同源性或互补性。由此，试剂盒因此可包含含有SEQ ID NO:8的片段的第一引物和含有SEQ ID NO:9的片段的第二引物；含有SEQ ID NO:11的至少8个连续多核苷酸的第一或第二引物；或含有SEQ ID NO:8或9的至少8个连续多核苷酸的第一或第二引物。
在其它实施方案中，提供了用于检测草甘膦-N-乙酰转移酶多肽的方法，其包括利用包含草甘膦-N-乙酰转移酶多肽特异性抗体的免疫测定分析芸苔属植物组织。在其它实施方案中，提供了用于检测编码草甘膦-N-乙酰转移酶多肽的多核苷酸存在的方法，其包括利用PCR扩增测定芸苔属植物组织。还提供了利用此类方法的试剂盒。
本发明方法与组合物中所用的任何多核苷酸与其片段与变体可与以下共有序列同一性：DP-073496-***转基因***物的区域、DP-073496-***的接合点序列、或***物区域结合DP-073496-***的侧翼序列的区域。已知用以测定多种序列关系的方法。本文所用的“参考序列”为用作序列比较基础的确定的序列。参考序列可为指定序列的部分或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或是完整的cDNA或基因序列。本文所用的“比较窗口(comparison window)”参考多核苷酸序列的连续的指定的区段，其中比较窗口中的多核苷酸序列与参考序列(其不含有添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，缺口)，以便最佳地比对这两个多核苷酸。一般来说，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，以及任选地可为30、40、50、100或更长。本领域技术人员可以理解为了避免因为多核苷酸序列包含缺口造成与参考序列的高相似度，一般会引进缺口罚分(gap penalty)并从匹配数目中减去。
用于比较的序列比对方法是本领域内已知的。因此，可利用数学算法来测定任何两条序列之间的序列同一性百分比。此类数学算法的非限制性实例为：Myers and Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needlemanand Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的整体比对算法；Pearsonand Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜寻比对方法(search-for-local alignment method)；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877的改良版。
这些数学算法的计算机操作可用来比较序列以测定序列同一性。此类操作包括(但不限于)：PC/Gene程序(得自Intelligenetics,MountainView,California)中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Version10(得自Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,California,USA)中的ALIGN程序(2.0版)与GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA。可用默认参数(default parameter)执行利用这些程序的比对分析。CLUSTAL程序详述于Higgins et al.(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins et al.(1989)CABIOS5：151-153；Corpet etal.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang et al.(1992)CABIOS8：155-65；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers and Miller(1988)(同上)的算法。当比较氨基酸序列时，可应用PAM120权重残基表(weight residue table)与ALIGN程序、所述PAM120权重残基表为12的缺口长度罚分与4的缺口罚分值。Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin andAltschul(1990)(同上)的算法。可用BLASTN程序、100的分数(score)、12的字数长度执行BLAST核苷酸搜寻，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可用BLASTX程序、50的分数、3的字数长度执行BLAST蛋白质搜寻，以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的具有缺口的比对，可应用Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389描述的GappedBLAST(BLAST2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(BLAST2.0中)执行反复搜寻以检测分子间的远源关系。参见Altschul et al.(1997)(同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如，BLASTN针对核苷酸序列，而BLASTX针对蛋白质)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以手动检验执行比对分析。
除非另有说明，文中提供的序列同一性/相似性数值指利用GAPVersion10利用下列参数所获得的数值：利用50的GAP Weight与3的Length Weight以及nwsgapdna.cmp得分矩阵(scoring matrix)的核苷酸序列的同一性%与相似性%；利用8的GAP Weight与2的LengthWeight以及BLOSUM62得分矩阵或其任何等同程序的氨基酸序列的同一性%与相似性%。预期当任何序列比较程序(针对待分析的任两段序列)与GAP Version10产生的对应比对分析相比，可产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配与相同序列同一性百分比的比对。
GAP利用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找出将配对数量最大化与缺口数最小化的两段完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对与缺口位置，然后产生具有最大配对碱基数目与最少缺口的比对。其以配对碱基单位提供缺口产生罚分(gap creation penalty)与缺口延伸罚分(gap extension penalty)。GAP必须对每个嵌入的缺口给以配对的缺口产生罚分数目。此外，若选择高于零的缺口延伸罚分，GAP必须将各个嵌入缺口的缺口长度乘以缺口延伸罚分。针对蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software PackageVersion10默认的缺口产生罚分与缺口延伸罚分值分别为8与2。针对核苷酸序列，默认的缺口产生罚分为50而默认的缺口延伸罚分为3。缺口产生与缺口延伸罚分可用选自0至200的整数表示。因此，举例来说，缺口产生与缺口延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。
GAP是最佳比对家族的一员。此家族有许多成员，但没有其他成员有更好的质量。GAP显示比对的四种优点特征：最佳分值(Quality)、比率(Ratio)、同一性(Identity)与相似性(Similarity)。为了比对序列将最佳分值进行度量最大化。比率是最佳分值除以较短片段的碱基数。同一性百分比为实际配对标记的百分比。相似性百分比为相似标记的百分比。可以忽略横跨缺口的标记。当一对标记的得分矩阵值高于或等于0.50(相似性阈值)时计算相似性得分。用于GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package Version10的得分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoffand Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。
如本文所用的，在两段多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”，是指当在指定的比较窗口中用于最大相似性比对时，两段序列中相同的残基。当序列同一性的百分比结合蛋白质使用时，可以理解不同的残基位置通常由保守型氨基酸取代所造成，其中氨基酸残基替代成具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因而不会改变分子的功能特性。当序列因保守型取代而不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。由此类保守型取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的方法是本领域技术部人员公知的。一般来说，这包括将保守型取代计算成部分而不是完全的错配，因而提高序列同一性的百分比。因此，举例来说，如果相同氨基酸给予1的分数而非保守型取代给予0的分数，则给予保守型取代0与1的分数。计算保守型取代的分数，例如，PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)程序中所执行的。
本文所用的“序列同一性的百分比”意指在一比较窗口上比较两个最佳比对的序列所测得的数值，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(其不含有添加或缺失)相比会包含添加或缺失(即，缺口)，以便最佳比对两序列。通过下列方式计算百分比：测定两段序列中相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生配对位置数，将配对数除以比较窗口内的总位置数目，然后将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
本发明提供控制耕种区域内杂草、避免耕种区域中耐除草剂杂草的生长或出现、生产作物与提高作物安全性的方法。术语“控制”与由此而来的衍生词(例如，“控制杂草”)指一或多种下述现象：抑制杂草生长、发芽、繁殖和/或增殖；和/或杀死、移除、破坏或以其它方式逐渐减小杂草的出现和/或活性。
本文所用的“耕种区域(area of cultivation)”包括人们想要种植植物的任何区域。此类耕种区域包括(但不限于)耕种植物的田地(诸如，农作地、草地、林地(tree field)、生产林(managed forest)、种植水果与蔬菜的田地等)、温室、生长室等。
本发明的方法包括将耕种区域栽种芸苔DP-073496-4种子或植物，且在在具体的实施方案中，对作物、种子、杂草或其耕种区域施加有效量的感兴趣的除草剂。可以理解可在耕种区域栽种作物之前或之后施加除草剂。此类除草剂施加可以包括施加草甘膦。
在一实施方案中，控制杂草的方法包括将耕种区域栽种芸苔DP-073496-4种子或植物，且对作物、作物部位、上述作物的种子或耕种区域施加有效量的除草剂，其中所述有效量包括当施加于第二对照作物、作物部位、种子或耕种区域时，第二对照作物无法耐受的量，其中此类第二对照作物不表达GLYAT多核苷酸。
在另一实施方案中，控制杂草的方法包括将区域栽种DP-073496-4芸苔作物种子或植物，然后对作物、作物部位、上述作物的种子或耕作区域施加有效量的草甘膦除草剂，其中所述有效量包括高于作物建议标签使用比例的水平，其中所述有效量是施加于DP-073496-4芸苔作物、作物部位、种子或其耕种区域时所耐受的。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞表型变化的参考点，且可为任合适当的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可包括，诸如：(a)野生型植物或细胞，即，与起始材料具有相同基因型，该起始材料用于基因改变以成为受试植物或细胞；(b)与起始材料具有相同基因型的植物或植物细胞，但已用无效构建体(null construct)(即，对目的性状没有已知影响的构建体，例如含有标记基因的构建体)转化；(c)受试植物或植物细胞后代中分离出的未转化的植物或植物细胞；(d)与受试植物或植物细胞在基因上相同的植物或植物细胞，但未暴露于如同受试植物或植物细胞一样的处理(例如，除草剂处理)；(e)受试植物或植物细胞其本身，处于不表达目的基因的条件下；或者(f)受试植物或植物细胞其本身，处于尚未暴露于特定处理(例如，除草剂或除草剂和/或其他化学物质的组合)的条件下。某些实例中，合适的对照植物或对照植物细胞可具有不同于受试植物或植物细胞的基因型，但与起始材料(用于基因改变以成为受试植物或细胞)共有相同的对除草剂敏感的特性。参见，例如，Green(1998)Weed Technology12：474-477；Green and Ulrich(1993)Weed Science41：508-516。在其它实施方案中，无效分离体(null segregant)可用来作为对照组，因为它们与DP-073496-4在基因上相同，除了转基因DNA***物以外。
除草剂的分类(即，将除草剂分为类与亚类)为本领域内公知的且包括除草剂抗性执行委员会(Herbicide Resistance Action Committee,HRAC)与美国杂草协会(Weed Science Society of A merica,WSSA)的分类(还参见Retzinger and Mallory-Smith,(1997)Weed Technology11：384-393)。下表1中示出HRAC分类的缩减版本(具有与对应的WSSA组相关的标示)。
可依照下列方式区分除草剂：作用模式和/或作用位置；施加的时间点(例如，萌发前或萌发后)；施加方法(例如，叶面施药或土壤施药)；其如何被吸收或其如何影响植物。例如，将噻吩磺隆(thifensulfuron-methyl)与苯磺隆(tribenuron-methyl)施加于作物叶片上然后通常在那里被代谢，然而玉嘧磺隆(rimsulfuron)与氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)通常可通过植物的根与叶两者吸收。“作用模式”通常指植物内除草剂抑制或损害的代谢或生理过程，然而“作用位置”通常指植物内除草剂作用或直接互动的物理位置或生化位置。可以不同方式分类除草剂，包括作用模式和/或作用位置(参见，例如，表1)。
通常，在植物上所表达的赋予对特定除草剂或其他化学物质耐药性的耐除草剂基因，也赋予对相同类别或亚类中其他除草剂或化学物质的耐药性，例如，表1所示的类别或亚类。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的转基因植物可耐受同一类别或亚类内超过一种以上的除草剂或化学物质，例如，PPO的抑制剂、磺脲(sulfonylurea)或合成生长素。
一般而言，本发明的植物比先前已知的植物更可耐受不同类型除草剂(即，具有不同作用模式和/或不同作用位置的除草剂)的处理以及更高量的除草剂，因而允许改良建议的杂草处理策略以便减少耐除草剂杂草的发生率与流行性。可应用特定的除草剂组合以有效地控制杂草。
因此，本发明基于即将种植转基因作物的区域中耐除草剂杂草物种的流行性，提供了可供挑选用于作物生产的转基因芸苔属植物。本领域内已知用以评估不同杂草物种的除草剂耐药性的方法。杂草管理技术也是本领域内已知的，举例来说，可应用耐除草剂的作物的轮作法(crop rotation)，当地杂草物种对所述除草剂是不耐受的。许多团体监测并公开地报导耐除草剂杂草的发生率与特性，这些团体包括除草剂抗性执行委员会、美国杂草协会与许多州政府机构，(参见，诸如多种阔叶杂草的除草剂耐药性计分(出自2004Illinois Agricultural PestManagement Handbook)),且本领域技术人员可利用此信息以决定在特定地点中应当应用何种作物与除草剂组合。
这些团体还刊载报道与指导方针以避免耐除草剂杂草的发展和/或出现并控制其散布。(参见，例如，Owen and Hartzler,(2004),2005Herbicide Manual for Agricultural Professionals,Pub.WC92Revised(Iowa State University Extension,Iowa State University of Science andTechnology,Ames,Iowa);Weed Control for Corn,Brassicas,and Sorghum,Chapter2of“2004Illinois Agricultural Pest Management Handbook”(University of Illinois Extension,University of Illinois atUrbana-Champaign,Illinois);Weed Control Guide for Field Crops,MSUExtension Bulletin E434(Michigan State University,East Lansing,Michigan))。
表1：缩减版本的HRAC除草剂分类
I.ALS抑制剂类(2组WSSA)
A.磺脲类
1.四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)
2.氯嘧磺隆
3.甲磺隆(Metsulfuron-methyl)
4.烟嘧磺隆
5.玉嘧磺隆
6.甲嘧磺隆
7.噻吩磺隆
8.苯磺隆
9.酰嘧磺隆
10.苄嘧磺隆
11.氯磺隆
12.醚磺隆
13.环磺隆
14.胺苯磺隆
15.乙氧磺隆
16.啶嘧磺隆
17.氟啶嘧磺隆
18.甲酰胺磺隆
19.咪唑磺隆
20.碘甲磺隆
21.甲磺胺磺隆
22.环氧嘧磺隆
23.氟嘧磺隆
24.氟磺隆
25.吡嘧磺隆
26.磺酰磺隆
27.醚苯磺隆
28.三氟啶磺隆
29.氟胺磺隆
30.三氟甲磺隆
31.氯吡嘧磺隆
32.氟吡磺隆
B.磺酰胺基羰基***啉酮类
1.氟酮磺隆
2.丙苯磺隆
C.***并嘧啶类
1.氯酯磺草胺
2.唑嘧磺草胺
3.双氯磺草胺
4.双氟磺草胺
5.磺草唑胺
6.平速烂(Penoxsulam)
7.甲氧磺草胺
D.嘧啶氧基(硫)苯甲酸类
1.双草醚
2.环酯草醚
3.嘧啶肟草醚
4.嘧硫草醚
5.嘧草醚
E.咪唑啉酮类
1.依灭草
2.咪草烟
3.咪唑喹啉酸
4.甲咪唑烟酸
5.咪草酸
6.甲氧咪草烟
II.其他除草剂--活性成分/其他作用模式
A.乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的抑制剂(1组WSSA)
1.芳氧基苯氧基丙酸(‘FOPs’)
a.精喹禾灵
b.禾草灵
c.炔草酯
d.恶唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)
e.高效伏寄普
f.普拔草
g.氟吡甲禾灵
h.氰氟草酯
i.精喹禾灵
2.烯巳二酮类(‘DIMs’)
a.亚汰草
b.丁苯草酮
c.克草同
d.环杀草
e.西杀草
f.得杀草
g.肟草酮
B.光合体系II的抑制剂—C1组HRAC/5组WSSA
1.三嗪
a.莠灭净
b.草脱净
c.氰乃净
d.敌草净
e.排草净
f.扑灭通
g.扑草净
h.扑灭津
i.西码净
j.西草净
k.特丁通
l.特丁津
m.特丁净
n.草达津
2.三嗪酮类
a.环嗪酮
b.嗪草酮
c.苯草酮
3.***啉酮类
a.氨唑草酮
4.尿嘧啶类
a.除草定
b.环草定
c.特草定
5.哒嗪酮类
a.杀草敏
6.氨基甲酸苯酯
a.甜菜安
b.甜菜宁
C.光合体系II的抑制剂--C2组HRAC/7组WSSA
1.脲
a.伏草隆
b.利谷隆
c.氯溴隆
d.绿麦隆
e.氯醚隆
f.恶唑隆
g.敌草隆
h.磺噻隆
i.非草隆
j.异丙隆
k.爱速隆
l.甲基苯噻隆
m.秀谷隆
n.甲氧隆
o.绿谷隆
p.草不隆
q.环草隆
r.丁噻隆
2.酰胺类
a.除草灵
b.甲氯草胺
D.光合体系II的抑制剂--C3组HRAC/6组WSSA
1.腈
a.溴酚肟
b.溴苯腈
c.碘苯腈
2.苯并噻唑(苯达松)
a.苯达松
3.苯基哒嗪
a.必汰草
b.Pyridafol
E.光***-I-电子转移(联吡啶)(22组WSSA)
1.敌草快
2.百草枯
F.PPO(原卟啉原氧化酶)的抑制剂(14组WSSA)
1.二苯醚
a.三氟羧草醚-Na
b.治草醚
c.甲氧除草醚
d.乙羧氟草醚
e.氟磺胺草醚
f.Halosafen
g.乳氟禾草灵
h.氟硝草醚
2.苯基吡啶类
a.异丙草酯
b.吡草醚
3.N-苯基酰亚胺
a.吲哚酮草酯
b.丙炔氟草胺
c.氟烯草酸
4.噻二唑类
a.嗪草酸甲酯
b.噻二唑草胺
5.恶二唑类
a.乐灭草
b.丙炔恶草酮
6.***啉酮类
a.乙基克繁草
b.甲磺草胺
7.恶唑烷二酮类
a.环戊恶草酮
8.嘧啶二酮类
a.双苯嘧草酮
b.氟丙嘧草酯
9.其他种类
a.吡唑基
b.氟唑草胺
G.漂白：抑制八氢番茄红素脱氢酶步骤(PDS)时的类胡萝卜素生物合成(12组WSSA)
1.哒嗪酮类
a.氟草敏
2.嘧啶甲酰氨
a.吡氟草胺
b.氟吡草胺
3.其他种类
a.氟丁酰草胺
b.氟啶草酮
c.氟咯草酮
d.呋草酮
H.漂白：抑制4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶(4-HPPD)(28组WSSA)
1.三酮
a.硝磺酮
b.磺草酮
c.苯唑草酮
d.环磺酮
2.异恶唑类
a.异恶氯草酮
b.异恶唑草酮
3.吡唑类
a.吡草酮
b.匹唑芬
c.芐草唑
4.其他种类
a.双环磺草酮
I.漂白：抑制胡萝卜素生物合成(未知靶标)(11和13组WSSA)
1.***类(11组WSSA)
a.氨基***
2.异噁草酮类(13组WSSA)
a.可灭踪
3.脲类
a.伏草隆
3.二苯醚类
a.苯草醚
J.抑制EPSP合酶
1.甘氨酸(9组WSSA)
a.草甘膦
b.草硫膦(Sulfosate)
K.抑制谷氨酰胺合成酶
1.次膦酸
a.草铵膦-铵
b.双丙氨膦
L.抑制DHP(二氢叶酸)合酶(18组WSSA)
1氨基甲酸盐
a.黄草灵
M.微管组装抑制(3组WSSA)
1.二硝基苯胺
a.氟草胺
b.双丁乐灵
c.挞乃安
d.乙丁烯氟灵
e.欧拉灵
f.喷达曼萨林
g.三福林
2.磷酰胺类
a.甲基胺草磷
b.抑草磷(Butamiphos)
3.吡啶类
a.汰硫草
b.噻草啶
4.苯甲酰胺类
a.拿草特
b.牧草胺
5.苯二羧酸类
a.二甲基敌草索
N.抑制有丝***/微管组建(23组WSSA)
1.氨基甲酸盐
a.克普芬
b.苯胺灵
c.双草胺
O.抑制细胞***(以所提出的机制抑制很长链的脂肪酸；15组WSSA)
1.氯乙酰胺
a.乙草胺
b.草不绿
c.去草胺
d.二甲草胺
e.二甲吩草胺(Dimethanamid)
f.吡草胺
g.莫多草
h.烯草胺
i.普草不绿
j.毒草胺
k.异丙草胺
l.欣克草
2.乙酰胺类
a.大芬灭
b.敌草胺
c.萘普草
3.氧乙酰胺类
a.氟噻草胺
b.苯噻草胺
4.四唑啉酮类
a.四唑草胺
5.其他种类
a.莎稗磷
b.唑草胺
c.茚草酮
d.Piperophos
P.抑制细胞壁(纤维素)合成
1.腈类(20组WSSA)
a.二氯苯腈
b.草克乐
2.苯甲酰胺类(异恶草胺(21组WSSA))
a.异恶草胺
3.三氮唑甲酰胺类(氟胺草唑)
a.氟胺草唑(Flupoxam)
Q.解偶联(膜破坏)：(24组WSSA)
1.二硝基酚
a.DNOC
b.地乐酚(Dinoseb)
c.特乐酚
R.抑制脂质合成，不同于ACC抑制
1.硫代氨甲酸盐(8组WSSA)
a.拉敌草
b.环草敌
c.呱草丹
d.EPTC
e.禾草畏
f.禾草敌
g.坪草丹
h.克草蜢
i.芐草丹
j.稻草完
k.仲草丹
l.三氯烯丹(Triallate)
m.灭草猛
2.二硫代磷酸酯类
a.地散磷
3.苯并呋喃类
a.呋草磺
b.乙呋草磺
4.卤代烷酸(26组WSSA)
a.TCA
b.得拉本
c.四氟丙酸
S.合成的植物生长素(IAA样)(4组WSSA)
1.苯氧羧酸
a.稗草胺(Clomeprop)
b.2,4-D
c.二甲四氯丙酸
2.吡啶羟酸苯甲酸类
a.麦草畏
b.草灭平
c.TBA
3.吡啶羟酸类
a.毕克草
b.氟草定
c.毒莠定
d.Tricyclopyr
4.喹啉羧酸类
a.快克草
b.喹草酸
5.其他种类(草除灵乙酯)
a.草除灵乙酯
T.抑制植物生长素运输
1.邻苯二甲酸类；缩氨基脲(19组
WSSA)
a.抑草生
b.氟吡草腙-Na
U.其他作用机制
1.芳香氨基丙酸类
a.高效麦草伏甲酯/高效麦草伏丙酯
2.草吡唑类(Pyrazolium)
a.野燕枯(Difenzoquat)
3.有机胂类
a.DSMA
b.MSMA
4.其他种类
a.溴芬诺
b.环庚草醚
c.芐草隆
d.棉隆
e.甲基杀草隆
f.杀草隆
g.乙氧苯草胺
h.蔓草磷
i.威百亩
j.恶嗪草酮
k.油酸
l.壬酸
m.稗草畏
在某些方法中，草甘膦，可单独施加或与另一种感兴趣的除草剂共同施加于DP-073496-4芸苔属植物或其耕种区域。表2呈现草甘膦配方的非限制性实例。在具体的实施方案中，草甘膦以盐类形式存在，诸如铵盐、异丙铵盐(isopropylammonium)、钾盐、钠盐(包括，倍半钠盐(sesquisodium）)或三甲基硫盐(trimesium)(或者称为草硫膦)。
表2：草甘膦配方比较
Figure GDA0000466023700000461
因此，某些实施方案中，本发明的转基因植物可用于通过应用该植物可耐受的除草剂而种植DP-073496-4芸苔作物的方法中。此种方式中，以一或多种除草剂的组合处理，所述除草剂包括(但不限于)：所揭示的乙草胺、三氟羧草醚与其钠盐、苯草醚、丙烯醛(acrolein)(2-丙烯醛)、草不绿、亚汰草、草杀净(ametryn)、氨唑草酮、酰嘧磺隆、氯氨吡啶酸(aminopyralid)、氨基***、氨基磺酸铵(ammonium sulfamate)、莎稗磷、亚速烂、草脱净、四唑嘧磺隆、氟丁酰草胺、草除灵(benazolin)、草除灵乙酯、倍卡贝唑(bencarbazone)、氟草胺、呋草磺、苄嘧磺隆、地散磷、本达隆、双环磺草酮、吡草酮、治草醚、毕草不绿(bilanafos)、双草醚与其钠盐、除草定、溴芬诺、溴酚肟、溴苯腈、溴苯腈辛酸酯(bromoxynil octanoate)、去草胺、氟丙嘧草酯(butafenacil)、丁胺磷(butamifos)、双丁乐灵、丁苯草酮、拉敌草、唑草胺、双草胺、乙基克繁草、儿茶素(儿茶素)、甲氧除草醚、草灭平、氯溴隆(chlorbromuron)、氯甲丹(chlorflurenol-methyl)、氯草敏(chloridazon)、氯嘧磺隆、绿麦隆、克普芬、氯磺隆、二甲基敌草索、草克乐、吲哚酮草酯、环庚草醚、醚磺隆、克草同、炔草酯、可灭踪、克普草、毕克草、毕克草-乙醇胺(clopyralid-olamine)、氯酯磺草胺、CUH-35(2-甲氧乙基2-[[[4-氯-2-氟-5-[(1-甲基-2-丙炔基)氧基]苯基](3-氟苯甲酰)胺基]羰基]-1-环己烷-1-羧酸盐)(2-methoxyethyl2-[[[4-chloro-2-fluoro-5-[(1-methyl-2-propynyl)oxy]-phenyl](3-fluorobenzoyl)-amino]carbonyl]-1-cyclohexene-1-carboxylate)、芐草隆、氰乃净、环草敌、环磺隆、环杀草、丁基赛伏草、2,4-D与其丁氧基乙基(butotyl)、丁基、辛基与异丙基酯类与其二甲基铵盐、二乙醇胺(diolamine)盐与三乙醇胺(trolamine)盐、杀草隆、得拉本、得拉本钠盐、棉隆、2,4-DB与其二甲基铵盐、钾盐与钠盐、甜菜安、敌草净(desmetryn)、麦草畏与其二乙二醇铵盐(diglycolammonium)、二甲基铵盐、钾盐与钠盐、二氯苯腈、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、禾草灵、双氯磺草胺、野燕枯甲硫酸盐(difenzoquat metilsulfate)、吡氟草胺、氟吡草腙、恶唑隆、呱草丹、二甲草胺、爱落杀(dimethametryn)、汰草灭(dimethenamid)、高效二甲吩草胺、获萎得(dimethipin)、双甲基砷酸(dimethylarsinic acid)与其钠盐、挞乃安、特乐酚、大芬灭、敌草快(diquat dibromide)、汰硫草、敌草隆、DNOC、茵多酸(endothal)、EPTC、禾草畏、乙丁烯氟灵、胺苯磺隆-甲基、乙呋草磺、氯氟草醚(ethoxyfen)、乙氧磺隆、乙氧苯草胺、恶唑禾草灵(fenoxaprop-ethyl)、精恶唑禾草灵、四唑草胺、非草隆、去草隆(fenuron-TCA)、麦草伏甲酯(flamprop-methyl)、高效麦草伏丙酯(flamprop-M-isopropyl)、高效麦草伏甲酯、啶嘧磺隆、双氟磺草胺、伏寄普(fluazifop-butyl)、高效伏寄普、氟酮磺隆、氟吡磺隆、贝杀灵(fluchloralin)、氟噻草胺、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草乙酯(flufenpyr-ethyl)、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、伏草隆、乙羧氟草醚、氟啶嘧磺隆与其钠盐、抑草丁(flurenol)、抑草丁丁酯(flurenol-butyl)、氟啶草酮、氟咯草酮、氟草定、呋草酮、嗪草酸甲酯、氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、蔓草磷铵盐(fosaime-ammonium)、草铵膦(glufosinate)、草铵膦铵盐、草甘膦与其盐类(诸如，铵盐、异丙铵盐、钾盐、纳盐(包括，倍半钠盐)与三甲基硫盐(或者称为草硫膦))、氯吡嘧磺隆、吡氟甲禾灵乙氧基乙酯(haloxyfop-etotyl)、精吡氟氯禾灵(haloxyfop-methyl)、环嗪酮、HOK-201(N-(2,4-二氟苯基)-1,5-二氢-N-(1-甲基乙基)-5-酮-1-[(四氢-2H-呱喃-2-基)甲基]-4H-1,2,4-***-4-酰胺)(N-(2,4-difluorophenyl)-1,5-dihydro-N-(1-methylethyl)-5-oxo-1-[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)-methyl]-4H-1,2,4-triazole-4-carboxamide)、咪草酸、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、依灭草、咪唑喹啉酸、咪唑喹啉酸铵盐(甲氧咪草烟-ammonium)、咪草烟、咪草烟铵盐(imazethapyr-ammonium)、咪唑磺隆、茚草酮、碘甲磺隆、碘苯腈、碘苯腈辛酸酯(ioxynil octanoate)、碘苯腈钠盐(ioxynil-sodium)、异丙隆、爱速隆、异恶草胺、异恶唑草酮、异恶氯草酮、乳氟禾草灵、环草定、利谷隆、抑芽素(maleic hydrazide)、MCPA与其盐类(例如，MCPA二甲基铵盐、MCPA钾盐与MCPA钠盐)、酯类(例如，MCPA-2-乙基己酯、MCPA-丁氧基乙酯)与硫酯类(例如，MCPA-硫乙酯)、MCPB与其盐类(例如，MCPB钠盐)与酯类(例如，MCPB乙酯)、二甲四氯丙酸、精二甲四氯丙酸、苯噻草胺、氟磺草胺(mefluidide)、甲磺胺磺隆、硝磺酮、威百亩钠盐(metam-sodium)、恶唑酰草胺(metamifop)、苯草酮、吡草胺、甲基苯噻隆、甲基砷酸(methylarsonic acid)与其钙盐、单铵盐、单钠盐与二钠盐、甲基杀草隆(methyldymron)、吡喃隆(metobenzuron)、秀谷隆、莫多草、异丙甲草胺(S-metholachlor)、磺草唑胺、甲氧隆、嗪草酮、甲磺隆、禾草敌、绿谷隆、萘普草、敌草胺、抑草生、草不隆、烟嘧磺隆、氟草敏、坪草丹、欧拉灵、丙炔恶草酮、乐灭草、环氧嘧磺隆、恶嗪草酮、氟硝草醚、巴拉刈二氯盐(paraquat dichloride)、克草蜢、壬酸、喷达曼萨林、平速烂、甲氯草胺、环戊恶草酮、黄草伏(perfluidone)、佩索密(pethoxyamid)、甜菜宁、毒莠定、毒莠定钾盐、氟吡草胺、拼沙登(pinoxaden)、派若斯(piperofos)、普草不绿、氟嘧磺隆、氨氟乐灵(prodiamine)、环苯草酮(profoxydim)、扑灭通、布灭净(prometryn)、毒草胺、除草灵、普拔草、扑灭津、苯胺灵、异丙草胺、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、戊炔草胺(propyzamide)、芐草丹、氟磺隆、双唑草腈(pyraclonil)、吡草醚、派索托(pyrasulfotole)、吡唑基(pyrazogyl)、芐草唑、匹唑芬、吡嘧磺隆、嘧啶肟草醚、稗草畏、必汰草、环酯草醚、嘧草醚、派嘧芬(pyrimisulfan)、嘧硫草醚、嘧硫草醚钠盐(嘧硫草醚-sodium)、甲氧磺草胺、快克草、喹草酸、莫克草(quinoclamine)、快伏草(quizalofop-ethyl)、精喹禾灵、糖草酯(quizalofop-P-tefuryl)、玉嘧磺隆、西杀草、环草隆、西码净、西草净(simetryn)、磺草酮、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、2,3,6-TBA、TCA、TCA钠、牧草胺、丁噻隆、持律三酮(tefuryltrione)、特普三酮(tembotrione)、得杀草、特草定、特丁通、特丁津、特丁净(terbutryn)、欣克草、噻草啶、噻卡巴腙(thiencarbazone)、噻吩磺隆、杀丹(thiobencarb)、仲草丹、拓普梅腙(topramezone)、肟草酮、野燕畏(tri-allate)、醚苯磺隆、三嗪氟草胺(triaziflam)、苯磺隆、绿草定(triclopyr)、绿草定-丁氧基乙酯、绿草定-三乙基铵盐、灭草环(tridiphane)、草达津、三氟啶磺隆、三福林、氟胺磺隆、三氟甲磺隆与灭草猛。
本领域内已知其他适当的除草剂与农业化学物质，例如描述于WO2005/041654中的那些物质。其他的除草剂还包括生物除草剂，诸如白鳞链格孢(Alternaria destruens)Simmons、炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporiodes)(Penz.)Penz.&Sacc.、稗内脐蠕孢菌(Drechsieramonoceras)(MTB-951)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(Albertini&Schweinitz)Ditmar：Fries、紫斑疫病菌(Phytophthorapalmivora)(Butl.)Butl.以及薪蓂柄锈菌(Puccinia thlaspeos)Schub.等菌。不同除草剂的组合可导致对杂草高于加成的效应(即，协同)和/或对作物或其他需要的植物低于加成的效应(即，安全)。某些实例中，草甘膦与其他除草剂(具有相似的控制谱但不同的作用模式)的组合将特别有利于预防耐药性杂草的生长。本领域技术人员可通过简单试验轻易地确定任何特定除草剂的除草有效量。
可参照其作用模式将除草剂分为类别和/或亚类，或可依照其化学结构将其分为类别和/或亚类。
磺酰胺(sulfonamide)类除草剂具有一基本的分子结构，其特征为磺酰胺基团(-S(O)2NH-)。而关于此文，磺酰胺类除草剂特别包括磺脲类除草剂、磺酰胺基羰基***啉酮类除草剂与***并嘧啶类除草剂。磺脲类除草剂中，磺酰胺基团为磺脲桥(-S(O)2NHC(O)NH(R)-)的一部份。磺脲类除草剂中，磺脲桥的磺酰端直接或通过氧原子或视情况取代的胺基或亚甲基接团连接于一般经取代的环或非环基团。磺脲桥的另外一端，氨基基团(其具有不是氢的取代基，例如甲基(R为CH3))连接于杂环基团，该杂环基团一般为对称的嘧啶或三嗪环，且该杂环基团具有一或两个取代基(诸如，甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基与卤素)。磺酰胺基羰基***啉酮类除草剂中，磺酰胺基团为磺酰胺基羰基桥(-S(O)2NHC(O)-)的一部分。磺酰胺基羰基***啉酮类除草剂中，磺酰胺基羰基桥的磺酰端一般连接于经取代的苯环。磺酰胺基羰基桥的另一端，羰基连结于***啉酮环的1号位置，而***啉酮环一般经诸如烷基与烷氧基的基团取代。***并嘧啶类除草剂中，磺酰胺基团的磺酰端连接于经取代的[1,2,4]***并嘧啶环***的2号位置，而磺酰胺基团的氨基端连接于经取代的芳基(一般为苯基)基团；或者磺酰胺基团的氨基端连接于经取代之[1,2,4]***并嘧啶环***的2号位置，而磺酰胺基团的磺酰端连接于经取代的芳基(一般为吡啶基)基团。
所述方法还包括对田地中的作物与杂草施加足量的至少一种除草剂(作物种子或植物可耐受)，该除草剂，诸如草甘膦、羟基苯基丙酮酸双氧化酶的抑制剂(例如，硝磺酮或磺草酮)、八氢西红柿红素去饱和酶的抑制剂(例如，吡氟草胺)、色素合成的抑制剂、磺酰胺、咪唑啉酮、毕草不绿、磷丝菌素(phosphinothricin)、草芬定(azafenidin)、氟丙嘧草酯、草硫膦、草铵膦、***并嘧啶、嘧啶氧基(硫)苯甲酸、或磺酰胺基羰基***啉酮、乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂(例如，精喹禾灵)、合成生长素(例如，快克草)、KIH-485或原卟啉原氧化酶(protox)的抑制剂，以控制杂草而不明显伤害农作物。
一般而言，施加于田地的除草剂的有效量足以选择性地控制杂草且不会明显地影响作物。本文所用的“杂草”指在特定区域中不需要的植物。相反地，本文所用的“农作物”指在特定区域中所需要的植物，例如芸苔属植物。因此，某些实施方案中，杂草为非农作物或非作物物种，然而在某些实施方案中，杂草为试图从一特定区域移除的作物物种，诸如田地(种植芸苔事件DP-073496-4)中较差和/或非转基因的芸苔属植物，或者为田地(种植DP-073496-4)中的非芸苔属农作物。杂草可分为两个主要类别：单子叶植物与双子叶植物。
可通过本文所述的除草剂控制(即，杀死或损害)许多植物物种。因此，本发明的方法有用于控制这些不需要的植物物种(即，如果它们是杂草)。这些植物物种包括农作物以及普遍认为是杂草的物种，其包括(但不限于)：诸如黑穗草(blackgrass)(大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides))、巨大狐尾草(giant foxtail)(法式狗尾草(Setaria faberi))、大型螃蟹草(large crabgrass)(马唐(Digitaria sanguinalis))、苏里南草(Surinam grass)(俯仰臂形草(Brachiaria decumbens))、野燕麦(wildoat)(野燕麦(Avena fatua))、普通苍耳(common cocklebur)(菊科苍耳(Xanthium pensylvanicum))、普通羊方草(common lambsquarters)(小叶灰雚(Chenopodium album))、牵牛花(morning glory)(圆叶茑萝(Ipomoeacoccinea))、猪草(pigweed)(籽粒苋(Amaranthus spp.))、绒叶草(velvetleaf)(苘麻子(Abutilion theophrasti))、普通稗草(commonbarnyardgrass)(稗草(Echinochloa crus-galli))、百慕大草(bermudagrass)(狗牙根(Cynodon dactylon))、绒毛雀麦(downy brome)(旱雀麦(Bromus tectorum))、鹅脚草(goosegrass)(牛筋草(Eleusine indica))、谷莠子(green foxtail)(狗尾草(Setaria viridis))、意大利黑麦草(Italianryegrass)(多花黑麦草(Lolium multiflorum))、强森草(Johnsongrass)(假高梁(Sorghum halepense))、小金丝雀草(lesser canarygrass)(小鹬草(Phalaris minor))、风剪草(windgrass)(风剪股颖(Apera spica-venti))、绒毛杯草(wooly cupgrass)(绒毛金茅(Erichloa villosa)、黄土香(yellownutsedge)(油莎草(Cyperus esculentus))、普通鱼肠草(commonchickweed)(繁缕(Stellaria media))、普通豚草(common ragweed)(豚草(Ambrosia artemisiifolia))、毛地肤(Kochia scoparia)、加拿大莴苣(horseweed)(加拿大莴苣(Conyza canadensis))、刚硬黑麦草(rigidryegrass)(瑞士黑麦草(Lolium rigidum))、野塘蒿(hairy fleabane)(美州假蓬(Conyza bonariensis))、鹿角车前草(buckhorn plantain)(长叶车前草(Plantago lanceolata))、热带紫鸭拓草(tropical spiderwort)(圆叶鸭拓草(Commelina benghalensis))、田旋花(field bindweed)(田旋花(Convolvulusarvensis))、紫土香(purple nutsedge)(香附子(Cyperus rotundus))、红藤草(redvine)(卵叶沙拐枣(Brunnichia ovata))、田菁麻(hemp sesbania)(田菁(Sesbania exaltata))、镰刀豆(sicklepod)(草决明(Senna obtusifolia))、德州蓝蓟(Texas blueweed)(蓝茎向日葵(Helianthus ciliaris))以及魔爪草(Devil’s claws)(长角胡麻(Proboscidea louisianica))。在其他实施方案中，杂草包括耐除草剂的黑麦草，例如，耐草甘膦的黑麦草、耐巴拉刈的黑麦草、耐乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的黑麦草以及耐非选择性除草剂的黑麦草。某些实施方案中，不想要的植物近似农作物。
本文所用的“选择性控制”意指耕种区域中的大部分杂草明显地受到伤害或被杀死，同时若农作物也存在于田地中时，大部分的农作物不会明显地受到伤害。因此，当至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的杂草明显地受到伤害或被杀死，同时若农作物也存在于田地中时，低于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%的农作物明显地受到伤害或被杀死时，将此方法视为能够选择性控制杂草。
某些实施方案中，通过以等同于以下比例的剂量施加在植物上的特定除草剂的处理：每英亩或每公顷至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、170、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分或商业产品或除草剂配方，不会明显伤害本发明的芸苔DP-073496-4植物，然而受到相同处理的合适的对照植物明显地受到伤害。
在具体的实施方案中，ALS抑制剂型除草剂的有效量包括每公顷至少约0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分。在其他实施方案中，ALS抑制剂的有效量包括每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-200、约200-500、约500-600、约600-800、约800-1000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分。任何ALS抑制剂，例如表1所列的那些可以以这些水平施加。
在其它实施方案中，磺脲的有效量包括每公顷至少约0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分。在其他实施方案中，磺脲的有效量包括每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约160-170、约170-180、约190-200、约200-250、约250-300、约300-350、约350-400、约400-450、约450-500、约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1000-2000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分。于表1中列出可应用该水平的典型磺脲。
在其它实施方案中，磺酰胺基羰基***啉酮类、***并嘧啶类、嘧啶氧基(硫)苯甲酸类与咪唑啉酮类的有效量包括每公顷至少约0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1550、1600、1650、1700、1800、1850、1900、1950、2000、2500、3500、4000、4500、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分。在其他实施方案中，磺酰胺基羰基***啉酮类、***并嘧啶类、嘧啶氧基(硫)苯甲酸类或咪唑啉酮类的有效量包括每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约160-170、约170-180、约190-200、约200-250、约250-300、约300-350、约350-400、约400-450、约450-500、约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1000-2000或更多克或盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成份。
除草剂有效量的其它范围可见，例如来自大学推广服务(UniversityExtension services)的多种刊物中。例如，参见Bernards,et al.,(2006)Guide for Weed Management in Nebraska(www.ianrpubs.url.edu/sendlt/ec130);Regher,et al.,(2005)ChemicalWeed Control for Fields Crops,Pastures,Rangeland,and Noncropland,Kansas State University Agricultural Extension Station and CorporateExtension Service;Zollinger,et al.,(2006)North Dakota Weed ControlGuide,North Dakota Extension Service and the Iowa State UniversityExtension at www.weeds.iastate.edu，上述各个通过引用在此并入本文中。
本发明某些实施方案中，将草甘膦以以下比例施加于耕种区域和/或耕种区域中至少一植物上：每英亩8至32盎司酸当量(acidequivalent)，或介于每英亩10、12、14、16、18、20、22、24、26、28与30盎司(1盎司＝29.57毫升)的酸当量与应用范围的下限之间，介于每英亩12、14、16、18、20、22、24、26、28、30与32盎司的酸当量与应用范围的上限之间。在其他实施方案中，以每公顷至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或更高盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分施加草甘膦。本发明某些实施方案中，将磺脲类除草剂以以下比例施加于田地和/或田地中至少一植物上：每英亩0.04至1.0盎司的活性成分，或介于每英亩0.1、0.2、0.4、0.6与0.8盎司(1盎司＝29.57毫升)的活性成分与应用范围的下限之间，以及介于每英亩0.2、0.4、0.6、0.8与1.0盎司的活性成分与应用范围的上限之间。
如本领域内已知的，草甘膦除草剂为含有相同活性成分的一类除草剂，但活性成分以许多不同盐类和/或组成之一存在。然而，已知能抑制ALS的除草剂的活性成分以及化学组成均不一样。本领域技术人员了解如何决定特定体积和/或重量的除草剂配方中存在的活性成分的量和/或酸当量。
某些实施方案中，应用一种ALS抑制剂型除草剂。施加在作物、作物部位、种子或耕种区域的ALS抑制剂型除草剂的比例可为本文所揭示的任何比例。在具体的实施方案中，ALS抑制剂类除草剂的比例为每公顷约0.1至约5000克、约0.5至约300克、或约1至约150克的活性成分。
一般而言，施加在特定田地(与任何生长于其中的植物)上的特定除草剂不会超过每年1、2、3、4、5、6、7或8次，或者不会超过每生长季1、2、3、4或5次。
而“以除草剂组合处理”或“施加除草剂组合于”作物、耕种区域或田地，意指特定田地、作物或杂草受到每种除草剂和/或化学物质(为组合的一部分以便达到期望的效应)的处理，即，以便选择性地控制杂草同时不会明显地伤害作物。某些实施方案中，对每种除草剂敏感的杂草显示出对每种除草剂(添加或协同作用)处理的伤害。可同时施加各除草剂和/或化学物质或者在不同时间施加各除草剂和/或化学物质，主要能实现期望的效应。此外，可在种植作物之前便进行施加。
本发明方法使用的除草剂与除草剂组合物中的其他除草剂活性成分的比例通常为重量比5000：1至1：5000、1000：1至1：1000、100：1至1：100、10：1至1：10或5：1至1：5。本领域技术人员可基于期望的杂草控制范围轻易地确定最佳比值。而且，表1所揭示的不同除草剂范围的任意组合也可用于本发明的方法中。
因此，某些实施方案中，本发明提供选择性控制田地中杂草的改良方法，其中所用的除草剂总量可低于其他方法的90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、2o%、15%、10%、5%或1%。同样地，某些实施方案中，选择性控制田地中杂草所应用的特定除草剂的量可低于其他方法(即，非利用本发明植物的方法)中所应用的特定除草剂的量的90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%。
某些实施方案中，本发明的DP-073496-4芸苔属植物受惠于协同效应，其中GLYAT多肽所赋予的除草剂耐药性以及提供对另一种除草剂耐药性的多肽所赋予的除草剂耐药性高于将各个基因分别赋予的除草剂耐药性单纯相加所预期的数值。参见，例如McCutchen et al.(1997)J.Econ.Entomol.90：1170-1180；Priesler et al.(1999)J.Econ.Entomol.92：598-603。本文所用的术语“协同”、“协同的”“协同地”及其衍生词(诸如，“协同效应”或“协同的除草剂组合”或“协同的除草剂组合物”)，指除草剂组合(例如，至少第一除草剂与第二除草剂)的生物活性高于单独除草剂生物活性总和的情况。协同，以“协同指数(Synergy Index,SI)”表示，通常可用Kull et al.,(1961)Applied Microbiology9,538所述的方法测定。还参见Colby,(1967)Weeds15,20-22。
其他实例中，本发明的DP-073496-4植物上所赋予的除草剂耐药性为累加的；这就是，除草剂耐药性基因所赋予的除草剂耐药谱为各个基因分别赋予转基因植物(分别含有这些基因)的除草剂耐药性单纯相加所预期的数值。对抗重要杂草物种的两种或更多种除草剂的累加和/或协同活性，将提高整体效应和/或降低控制上述杂草所需的活性成分(们)的实际量。如果观察到此类协同作用，本发明的植物可以显示出对更高剂量或比例的除草剂的耐药性和/或该植物可显示出对额外除草剂或其他化学物质(预期可显示耐药性之外的物质)的耐药性。例如，DP-073496-4芸苔属植物可显示对有机磷化合物(例如，杀虫剂)和/或4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶抑制剂的耐药性。
因此，举例来说，本发明的DP-073496-4芸苔属植物，当还包含赋予对其它除草剂的耐药性的基因时，可表现出高于对不同除草剂所预期的耐药性，这些除草剂包括(但不限于)草甘膦、ALS化学作用抑制剂与磺脲类除草剂。本发明的DP-073496-4芸苔属植物可显示对特定除草剂或除草剂组合的耐药性，该耐药性高于合适的对照植物的耐药性的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、17%、20%、22%、25%、27%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、300%、400%或500%或更高，所述对照植物仅含有单一除草剂耐药性基因(赋予对相同除草剂或除草剂组合的耐药性)。因此，DP-073496-4芸苔属植物相较于合适的对照植物可显示其受到较低来自相同除草剂剂量的伤害，或者它们相较对照植物在较高剂量的除草剂下显示相同程度的伤害。因此，在具体的实施方案中，选择性控制田地中杂草所用的特定除草剂高于其他方法(即，非利用本发明植物的方法)中所用的该特定除草剂量的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高。
以同样的方式，在某些实施方案中，本发明的DP-073496-4芸苔属植物相对于合适的对照植物显示对除草剂活性成分特定配方改良的耐药性。商业上以配方方式贩卖除草剂，而该配方一般包括除了除草剂活性成分以外的其他成分；通常预期这些成分系用来增加活性成分的效力。此类其他成分可包括，例如安全剂(safener)与佐剂(参见，例如Green and Foy,(2003)“Adjuvants：Tools for Enhancing HerbicidePerformance”in Weed Biology and Management,ed.Inderjit(KluwerAcademic Publishers,The Netherlands))。因此，本发明的DP-073496-4芸苔属植物可显示针对特定除草剂配方(例如，商业上可获得的特定除草剂产物)的耐药性，该耐药性高于合适的对照植物的耐药性的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、17%、20%、22%、25%、27%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、1100%、1200%、1300%、1400%、1500%、1600%、1700%、1800%、1900%或2000%或更高，而所述对照植物仅含有单一除草剂耐药性基因(赋予对相同除草剂成分的耐药性)。
某些实施方案中，本发明的DP-073496-4芸苔属植物显示对一种除草剂或除草剂类别(至少另外一种除草剂耐药性基因所赋予的耐药性)提高的耐药性以及对至少另外一种除草剂或化学物质(其作用机制或基础既不同于草甘膦也不同于对应于所述至少另外一种耐药性基因的除草剂)提高的耐药性。本发明这令人惊异的优点可用于种植作物的方法中，该方法包括以多种组合的化学物质处理，而该化学物质包括，例如用以种植作物的其他化学物质。因此，举例来说，DP-073496-4芸苔属植物还可显示对毒死蜱(chlorpyrifos)(一种***性有机磷酸酯类杀虫剂)提高的耐药性。因此，本发明还提供赋予对草甘膦耐药性(即，GLYAT基因)的DP-073496-4芸苔属植物(其显示针对影响细胞色素P450基因的化学物质提高的耐药性)及其使用方法。某些实施方案中，DP-073496-4芸苔属植物还显示对麦草畏(dicamba)提高的耐药性。某些实施方案中，在草甘膦与磺脲类除草剂存在下可明显发现对麦草畏提高的耐药性。
其他方法中，将除草剂组合施加于DP-073496-4芸苔属植物上，其中该除草剂组合产生累加或协同效应以控制杂草。此类除草剂组合可允许降低施加比例；控制更广谱的无用植物；以较少的施加提高对无用植物的控制；更快速地发挥除草剂活性；或更长效的除草剂活性。
“累加性除草剂组合物”的除草剂活性约等于所观察到的各个成分的活性。“协同性除草剂组合”的除草剂活性高于根据单独使用各个成分时观察到的活性所预测的数值。因此，本公开的主题提供一种协同性除草剂组合，其中混合物控制杂草的程度高于各个除草剂控制的总和。某些实施方案中，混合物控制杂草的程度高于各个除草剂控制总和任何统计学显著量，包括例如约1%至5%、约5%至约10%、约10%至约20%、约20%至约30%、约30%至约40%、约40%至约50%、约50%至约60%、约60%至约70%、约70%至约80%、约80%至约90%、约90%至约100%、约100%至约120%或更高。进一步地说，除草剂的“协同有效量”指引出除草剂组合物内存在的另一除草剂的协同效应所需的一种除草剂的量。因此，术语“协同剂”与其衍生词，指增强活性成分(ai)活性的物质，而活性成分即，一配方中可因此获得生物效应的物质(例如，除草剂)。
因此，某些实施方案中，本公开的主题提供一种控制耕种区域中杂草的方法。某些实施方案中，该方法包括：(a)将区域种植DP-073496-4作物种子或农作物，其还包含赋予ALS抑制剂抗药性的多核苷酸；以及(b)对杂草、农作物、作物部位、耕种区域或其组合施加有效量的除草剂组合物，该组合物包含协同有效量的草甘膦与协同有效量的ALS抑制剂(例如，但不限于磺脲类除草剂)或其农业上适当的盐类当中的至少一种，其中以下的至少一种：(i)协同有效量的草甘膦低于在磺脲类除草剂不存在的情况下用以控制杂草所需的草甘膦的量；(ii)协同有效量的ALS抑制剂类除草剂低于在草甘膦不存在的情况下用以控制杂草所需的ALS抑制剂的量；以及(iii)以上的组合，并且其中除草剂组合物的有效量为作物种子或农作物可耐受并控制耕种区域中的杂草。
某些实施方案中，用于控制杂草的本公开方法的除草剂组合物包含协同有效量的草甘膦与磺脲类除草剂。在进一步的实施方案中，本公开的协同性除草剂组合物包含草甘膦与磺脲类除草剂(选自甲磺隆、氯磺隆与醚苯磺隆)。
在具体的实施方案中，协同性除草剂组合还包含佐剂，例如基于的硫酸铵的佐剂，例如
Figure GDA0000466023700000591
(Wenkem S.A.,Halfway HouseMidrand,South Africa)。在其它的实施方案中，本公开的协同性除草剂组合物包含额外的除草剂，例如有效量的嘧啶氧基(硫)苯甲酸类除草剂。某些实施方案中，嘧啶氧基(硫)苯甲酸类除草剂包括双草醚，例如(
Figure GDA0000466023700000592
Valent U.S.A.Corp.,Walnut Creek,California,UnitedStates of America)，或其农业上适当的盐类。
本公开的用以控制无用植物的某些实施方案中，将草甘膦在萌发前(pre-emergence)、萌发后(post-emergence)或萌发前与萌发后施加于无用的植物或农作物上；和/或将ALS抑制剂型除草剂(即，磺脲类除草剂)在萌发前、萌发后或萌发前与萌发后施加于无用的植物或农作物上。在其他实施方案中，将草甘膦和/或ALS抑制剂型除草剂(即，磺脲类除草剂)一起施加或分开施加。又在其他实施方案中，施加协同性除草剂组合物，例如以上的步骤(b)，在种植感兴趣的作物前(例如，以上的步骤(a))至少施加一次。
在种植作物(例如，芸苔作物)的田地中单以草甘膦难以控制的杂草包括(但不限于下列)：加拿大莴苣(例如，Conyza canadensis)；刚硬黑麦草(例如，Lolium rigidum)；鹅脚草(例如，Eleusine indica)；意大利黑麦草(例如，Lolium multiflorum)；野塘蒿(例如，Conyzabonariensis)；鹿角车前草(例如，Plantago lanceolata)；普通豚草(例如，Ambrosiaartemisifolia)；牵牛花(例如，Ipomoea spp.)；水麻草(waterhemp)(例如，Amaranthus spp.)；田旋花(例如，Convolvulus arvensis)；黄土香(例如，Cyperus esculentus)；普通羊芳草(例如，Chenopodium album)；金荞麦(wild buckwheat)(例如，Polygonium convolvulus)；绒叶草(例如，Abutilontheophrasti)；毛地肤(例如，Kochia scoparia)；以及鸭跖草(Asiaticdayflower)(例如，Commelina spp.)。在发现上述杂草的区域中，包含DP-073496-***和对另一种除草剂的抗药性的芸苔属植物特别有用于以除草剂组合处理田地(以及因此生长于田地中的任何作物)，且该除草剂会对不含有这两种多核苷酸的农作物造成无法接受的伤害。可耐受草甘膦与其他除草剂(例如，磺脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、嘧啶基(硫)苯甲酸和/或磺酰胺基羰基***啉酮类除草剂)的本发明的植物除了耐受至少另外一种具有不同作用模式或作用位点的除草剂之外，还特别有用于这种情况，即当杂草可耐受至少两种与植物可耐受的相同的除草剂的情况。此种方式中，本发明的植物可能会提高对可耐受超过一种除草剂的杂草的控制。
例如，种植现今商业作物(包括，例如芸苔)的田地中，用于杂草控制的一些常用的处理包括草甘膦以及任选地2,4-D。然而此种组合有某些缺点。尤其，有着其无法控制的杂草物种且其还无法在寒冷气候中适当地控制杂草。另一经常用来控制芸苔田地中杂草的处理为磺脲类除草剂，氯嘧磺隆，其具有明显残留于土壤中的活性因此对所有晚萌发(later-emerging)的杂草物种维持选择性压力，造成耐磺脲类杂草较适合的生长与散布环境。例如，田地可用磺脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、嘧啶基(硫)苯甲酸和/或磺酰胺基羰基***啉酮类(例如，磺脲的氯嘧磺隆)处理，可单独或与其他除草剂共同应用，例如，草甘膦与苯磺隆(商业上可作为
Figure GDA0000466023700000601
获得)的组合。这种组合在某些情况下对杂草控制具有几个优点，这些情况包括使用不同作用模式的除草剂与使用土壤残留活性期相对较短的除草剂。举例来说，在降低选择性压力(该压力有利于耐除草剂杂草的生长)是至关重要的情况下，乐见具有相对较短期的残留活性的除草剂。当然，在需要控制杂草的任何特定情况下，其他考虑可能更为重要，例如，在种植作物前需要利用残留活性期相对较长的除草剂来预防田地中生长和/或出现杂草。而包括苯磺隆与噻吩磺隆两者的处理特别有用。
现今商业的作物品种(包括，例如芸苔)生长的田地中，其他经常用来控制杂草的处理包括磺脲类除草剂，噻吩磺隆(商业上可作为Harmony
Figure GDA0000466023700000611
获得)。然而，噻吩磺隆的一个缺点为持续性控制杂草所需的较高施加比例经常对生长于同一田地中的作物造成伤害。可以草甘膦与噻吩磺隆的组合处理包含额外抗药性的DP-073496-4芸苔属植物，其优点为利用不同作用模式的除草剂。因此，可耐受任一种单独的除草剂的杂草受到两种除草剂组合的控制，且该处理未明显地伤害改良的DP-073496-4芸苔属植物。
现今商业的作物品种(包括，例如芸苔)生长的田地中，其他用来控制杂草的除草剂为***并嘧啶类除草剂，氯酯磺草胺(商业上作为
Figure GDA0000466023700000612
获得)；与咪唑啉酮类除草剂，咪唑喹啉酸(商业上作为
Figure GDA0000466023700000613
获得)。当单独地应用这些除草剂时，它们仅提供微小的杂草控制力。可用下列物质的组合处理：诸如草甘膦(例如，
Figure GDA0000466023700000614
(草甘膦异丙铵盐))、依灭草(目前商业上可作为
Figure GDA0000466023700000615
获得)、氯嘧磺隆(目前商业上可作为
Figure GDA0000466023700000616
获得)、精喹禾灵(目前商业上可作为
Figure GDA00004660237000006114
Figure GDA0000466023700000617
获得)以及氟磺胺草醚(目前商业上可作为
Figure GDA0000466023700000618
获得)。这种组合的优点为利用不同作用模式的除草剂。因此，仅可耐受这些除草剂其中之一或数种的杂草受到该五种除草剂组合的控制。此组合提供相当广谱的针对耐除草剂的杂草类型(可能预期在现行的杂草控制实践中产生并散布)的保护。
还可用下列除草剂组合处理含有DP-073496-4芸苔属植物(具有额外的除草剂抗药性)的田地，而所述除草剂包括诸如草甘膦、玉嘧磺隆与麦草畏或硝磺酮。此种组合可以特别有用于控制已经发展出对某些抑制ALS除草剂的耐药性的杂草。另一种特别有用于控制杂草的除草剂组合包括草甘膦与至少一种下列物质：甲磺隆(商业上作为
Figure GDA0000466023700000619
获得)、依灭草(商业上作为
Figure GDA00004660237000006110
获得)、咪草烟、咪唑唑啉酸与甲磺草胺。可以理解任何上述或文中其他部分所揭示的组合也可与任何其他除草剂与农业化学物质一起用来处理区域。
现今商业作物(包括，例如芸苔)生长的田地中，某些时常用来控制杂草的处理包括草甘膦(目前商业上可作为
Figure GDA00004660237000006111
获得)、玉嘧磺隆(目前商业上可作为
Figure GDA00004660237000006112
或获得)、麦草畏(商业上作为
Figure GDA0000466023700000621
获得)、草脱净与硝磺酮(商业上作为获得)。有时因为作物无法耐受多种除草剂可单独应用这些除草剂。不幸的是，单独使用时，这些除草剂各自均有着明显的缺点。尤其，可耐受单个除草剂的杂草的发生率持续上升，使草甘膦在某些情况下低于预期中的效应。玉嘧磺隆在会对作物造成伤害的高剂量下才可提供较佳的杂草控制性，而替代品(例如，麦草畏)通常比其他普遍使用的除草剂来得贵。
现今商业作物生长的田地中，某些时常用来控制杂草的处理包括草甘膦(目前商业上可作为
Figure GDA0000466023700000623
获得)、氯嘧磺隆、苯磺隆、玉嘧磺隆(目前商业上可作为
Figure GDA0000466023700000624
或获得)、咪草烟、依灭草与咪唑喹啉酸。不幸的是，单独使用时，这些除草剂各者均有着明显的缺点。尤其，可耐受单个除草剂的杂草的发生率持续上升，使每种单独的除草剂在某些情况下低于预期中的效应。然而，可用会对标准植物品种造成无法接受的伤害的除草剂组合处理DP-073496-4芸苔(其具有额外的除草剂抗药性)，包括含有至少一种上述提到的除草剂的除草剂组合。
本发明的这些方法中，可用任何适当的方式配制除草剂并将其施加于感兴趣的区域(例如，田地或耕种区域)。可用任何形式(例如，液态喷洒或固态粉末或颗粒)将除草剂施加于田地上。在具体的实施方案中，应用于所述方法中的除草剂或除草剂组合包含桶混剂(tankmix)或预混剂(premix)。还可以将除草剂配制成例如利用混合技术(参见，例如美国专利号6,022,552，其标题为“Uniform Mixtures of PesticideGranules”)所产生的“同质混合颗粒”。美国专利号6,022,552的混合技术将保护作物的化学物质无分离的混合(即，“同质混合颗粒”)于干燥颗粒形式，以便运送定制(设计用来解决特定问题)的混合物。可用与传统预混产物(将许多活性成分配制于同一颗粒中)相同的方式运送、处理、分样(subsample)与应用同质混合颗粒。
简单地说，通过混合至少两种挤压制成(extruded formulated)的颗粒产物制备“同质混合颗粒”。某些实施方案中，每种颗粒产物包含含有单一活性成分的注明成分，所述活性成分诸如除草剂、杀真菌剂和/或杀虫剂。可通过控制混合物中所用的颗粒的相对大小与大小分布来优化“同质混合颗粒”的一致性(同质性)。挤压颗粒的直径受到押出模(extruder die)的孔洞大小的控制，且可以应用离心筛选处理以获得具有期望的长度分布的挤压颗粒群(参见，例如美国专利号6,270,025)。
当可将同质混合颗粒分样成适当大小的等分试样(aliquot)且各个等量样品的成分达到所须的试验规格时，才将其视为“同质的”。为了验证同质性，制备同质混合颗粒的大型样品，接着将其分样成大于最小统计样品大小的等分试样。混合还提供以标准的标记的使用率添加其他农用化学品的能力，诸如额外的除草剂(第3/第4种作用机制)、杀真菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂等，因而节省额外应用相关的费用。
任何施加于DP-073496-4芸苔属植物上的除草剂配方可制备成“桶混剂”组合物。此类实施方案中，各成分或成分组合可彼此分离地储存。接着在应用前将成分彼此混合。一般来说，此类混合发生于应用之前不久。桶混剂处理过程中，每个成分在混合前一般存在于水或适当的有机溶剂中。关于制剂领域的其它指导，参见T.S.Woods“TheFormulator's Toolbox--Product Forms for Modern Agriculture”PesticideChemistry and Bioscience,The Food-Environment Challenge,T.Brooksand T.R.Roberts,Eds.,Proceedings of the9th International Congress onPesticide Chemistry,The Royal Society of Chemistry,Cambridge,1999,pp.120-133。还可参见美国专利号3,235,361第6栏第16行至第7栏第19行与实施例10-41；美国专利号3,309,192第5栏第43行至第7栏第62行与实施例8、12、15、39、41、52、53、58、132、138-140、162-164、166、167与169-182；美国专利号2,891,855第3栏第66行至第5栏第17行与实施例1-4；Klingman,Weed Control as aScience,John Wiley and Sons,Inc.,New York,1961,pp81-96；以及Hanceet al.,Weed Control Handbook,8th Ed.,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1989，在此将上述各篇通过引用全文并入本文中。
本发明的方法进一步允许除草剂组合发展成可用于DP-073496-4芸苔属植物。在此类方法中，评估耕种区域的环境条件。可以评估的环境条件包括(但不限于)：土壤与地表水污染的议题、作物的预期用途、作物耐药性、土壤残留度、耕种区域内存在的杂草、土壤质地、土壤pH、土壤中有机物含量、应用的设备与耕种施行。对环境条件评估后，可施加有效量的除草剂组合于作物、作物部位、作物种子或耕种区域。
某些实施方案中，施加于本发明DP-073496-4芸苔属植物的除草剂用来避免敏感性杂草生长的开始和/或用来对生长于感兴趣的区域内的杂草造成伤害。某些实施方案中，除草剂或除草剂混合物施加于杂草上的这些效应影响接着种植于感兴趣的区域(即，田地或耕种区域)的作物。在本发明的这些方法中，除草剂组合的施加不需于同一时间发生。只要种植作物的田地含有可检测量的第一除草剂，且在作物存在于耕种区域的时期内的某一时间施加第二除草剂，那么将视为该作物受到根据本发明除草剂混合物的处理。因此，本发明的方法包括在“萌发前”、“萌发后”、“种植前并入”和/或包括种植前处理种子的除草剂应用。
在一实施方案中，提供涂覆种子的方法。这些方法包括以有效量的除草剂或除草剂组合(如本文其他地方所揭示)涂覆种子。接着将该种子种植于耕种区域。进一步提供具有涂层的种子，而该涂层包含有效量的除草剂或除草剂组合(如本文其他地方所揭示)。
“萌发前的”指在植物从土壤明显地冒出前施加于感兴趣的区域(例如，田地或耕种区域)的除草剂。“萌发后的”指在植物从土壤明显地冒出后施加于区域的除草剂。某些实例中，术语“萌发前的”与“萌发后的”结合感兴趣的区域中的杂草使用，然而某些实例中这些术语结合感兴趣的区域中的农作物使用。当结合杂草而应用时，这些术语可仅适用于特定类型的杂草或杂草物种(其存在或被认为存在于感兴趣的区域)。虽然可用萌发前和/或萌发后处理施加任何的除草剂，但已知某些除草剂在萌发前或萌发后施加于时，更有效于控制杂草或杂草们。举例来说，玉嘧磺隆同时具有萌发前与萌发后活性，但其他除草剂则具有优势的萌发前活性(莫多草)或萌发后活性(草甘膦)。特定除草剂的这些特性是本领域内已知的且容易为本领域技术人员所确定。再者，本领域技术人员可轻易地选出适当的除草剂与施加时间，以用于本发明的转基因植物和/或即将种植本发明转基因植物的区域上。“种植前并入”包括在种植前将化合物并入土壤中。
因此，本发明提供种植作物和/或控制杂草的改良方法，例如“种植前燃尽(pre-planting burn down)”，其中在种植感兴趣的作物前以除草剂处理区域以便更好地控制杂草。本发明还提供种植作物和/或控制杂草的方法，“免耕法(no-till)”或“少耕法(low-till)”(又称为“减少耕种法(reduced tillage)”)。上述方法(相对于传统方法)中，在生长周期中并不耕种或较少耕种土壤；这些方法可节省额外耕种所带来的其他花费(包括劳力与燃料费用)。
本发明这些方法包括同时和/或相继应用多种类型的除草剂。某些实施方案中，本发明的这些方法包括将本发明的植物和/或感兴趣的区域(例如，田地或耕种区域)和/或杂草处以仅仅一种除草剂或其他化学物质(例如，磺脲类除草剂)。
将除草剂施加于感兴趣的区域(与其中的任何植物)的时间点将是使杂草控制优化的重要因素。施加除草剂的时间点可参照下列因素确定：感兴趣的区域中的植物大小和/或生长阶段和/或植物的发育，例如，区域中生长的农作物或杂草。生长阶段和/或植物的发育是本领域内已知的。因此，举例来说，将除草剂或其他化学物质施加于感兴趣的区域(植物生长于其中)的时间点，可能为特定区域中某些或全部植物达到至少一特定大小和/或生长阶段和/或发育阶段的时间点，或特定区域中某些或全部植物尚未达到一特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间点。
某些实施方案中，本发明的DP-073496-4芸苔属植物显示出对萌发后除草剂处理改善的耐药性。例如，本发明的植物可耐受更高剂量的除草剂，耐受更广范围的除草剂，和/或可耐受较早或较晚发育时期(相对于适当的对照植物)所施加的除草剂剂量。例如，某些实施方案中，本发明的DP-073496-4芸苔属植物显示出对型态缺陷(已知特定发育阶段处理所导致)增高的抗性。因此，本发明耐草甘膦的植物可用于在发育较晚阶段(相对于先前可实施的方法)以除草剂处理的方法中。因此，本发明的植物可处以特定除草剂，该除草剂会造成在发育同一阶段以该除草剂处理的对照植物形态上的缺陷，但本发明耐草甘膦/的植物并未受到相同处理明显的伤害。
不同的化学物质(例如，除草剂)具有不同的“残留”效应，即，化学物质或除草剂处理对生长于处理区域的植物的效应持续时间的不同。此类效应可能为可取的或不可取的，取决于处理区域(例如，田地或耕种区域)将来的预期目的。因此，可基于处理(用于各个作物上)的残留效应与它们在作物(接下来生长于同一区域)上的效应挑选作物轮种方案(crop rotation scheme)。本领域技术人员了解可用哪些技术评估除草剂的残留效应；例如，草甘膦一般具有非常少或不具土壤残留活性，然而作用为抑制ALS的除草剂在残留活性程度上有所差异。本领域内已知不同除草剂的残留活性，且还已知残留活性会随着不同环境因子(例如，土壤水气量、温度、pH值与土壤组成(质地和有机物质)而变化。
此外，本发明的转基因植物提供对额外化学物质(经常联合除草剂处理用于作物上)处理改善的耐药性，而额外化学物质诸如安全剂、佐剂(例如，磺酸铵)与作物油浓缩物等。术语“安全剂”指当加入除草剂配方时，可排除或减轻除草剂对某些作物的植物毒素效应(phytotoxiceffects)的物质。本领域技术人员可理解，安全剂的选择一部份取决于感兴趣的农作物与特定除草剂或协同性除草剂组合物含有的除草剂组合。适合用于本公开除草剂组合物的示例性安全剂包括(但不限于)下述所揭示的物质：美国专利号4,808,208；5,502,025；6,124,240与美国专利公开号2006/0148647；2006/0030485；2005/0233904；2005/0049145；2004/0224849；2004/0224848；2004/0224844；2004/0157737；2004/0018940；2003/0171220；2003/0130120；2003/0078167，上述全文在此通过引用并入本文。本发明的方法包括除草剂联合除草剂安全剂的应用，而用以提高作物安全性的安全剂诸如：解草酮(benoxacor)、BCS(1-溴-4-[(氯甲基)磺酰基]苯)、解毒喹(cloquintocet-mexyl)、解草胺腈(cyometrinil)、二氯丙烯胺(dichlormid)、2-(二氯甲基)-2-甲基-1,3-二氧戊环(MG191)、解草唑-乙基(fenchlorazole-ethyl)、解草啶(fenclorim)、解草胺(flurazole)、氟草肟(fluxofenim)、解草恶唑(furilazole)、双苯恶唑酸(isoxadifen-ethyl)、吡唑解草酯(mefenpyr-diethyl)、甲氧苯酮(methoxyphenone)((4-甲氧基-3-甲苯基)(3-甲苯基)-甲酮)、萘二甲酸酐(naphthalic anhydride)(1,8-萘二甲酸酐)与解草腈(oxabetrinil)。可将解毒有效量的除草剂安全剂与本发明的化合物同一时间施加，或在种子处理时施加。因此，本发明的一方面涉及包含草甘膦、至少一种其他除草剂与一解毒有效量的除草剂安全剂的混合物的用途。
种子处理对于选择性杂草控制是特别有用的，因为其物理上限制农作物的解毒。因此，本发明特别有用的实施方案为选择性控制田地中杂草生长的方法，其包括以解毒有效量的安全剂处理种子(作物由此成长)与以有效量的除草剂处理田地以控制杂草。本领域技术人员可容易地经由简单试验确定安全剂的解毒有效量。解毒有效量的安全剂存在于欲以安全剂处理的植物上，以便除草剂在植物上的效应减少(相对于除草剂在未处以安全剂的植物上的效应)。一般而言，解毒有效量的安全剂避免对处以安全剂的植物造成伤害或严重伤害。本领域技术人员能够确定安全剂的使用是否洽当以及确定应当施加于作物上的安全剂剂量。
在具体的实施方案中，施加于本发明植物的除草剂或除草剂组合作为安全剂。在此实施方案中，施加解毒有效量的第一除草剂或除草剂混合物给植物。因此，提供控制耕种区域中杂草的方法。该方法包括以作物种子或植物种植该区域，而该作物种子或植物包含与植物中有活性的启动子可操作连接的第一多核苷酸(其编码一多肽，该多肽赋予对草甘膦的耐药性)；以及与植物中有活性的启动子可操作连接的第二多核苷酸(其编码耐ALS抑制剂的多肽)。将包含至少一有效量的第一与第二除草剂的除草剂组合施加于作物、作物部位、杂草或其耕种区域。有效量的除草剂组合可控制杂草；且当与对照作物(未曾暴露给第一除草剂)相比时，作物无法耐受单独施加的有效量的第一除草剂；而有效量的第二除草剂足以产生安全性效应，其中当与单独施加第一除草剂的作物耐药性相比，在应用第一与第二除草剂后安全性效应提供增强的作物耐药性。
在具体的实施方案中，安全性除草剂的组合包含第一ALS抑制剂与第二ALS抑制剂。在其他实施方案中，通过施加有效量的草甘膦与至少一ALS化学作用抑制剂的组合达成安全性效应。这类混合物提供增强的作物耐药性(即，降低除草剂伤害)。该方法允许在处理后或处理前增加化学物质的施加率。此类方法可用于增强控制无用的或不想要的植物。再在其他实施方案中，当DP-073496-4芸苔属作物、作物部位、作物种子、杂草或耕种区域处以至少一来自磺脲类化学物质家族的除草剂与至少一来自咪唑啉酮家族的除草剂时，可达成安全性效应。此方法提供增强的作物耐药性(即，降低除草剂伤害)。在具体的实施方案中，磺脲包括玉嘧磺隆而咪唑啉酮包括咪草烟。在其他实施方案中，还将草甘膦施加于作物、作物部位或耕种区域。
本文所用的“佐剂”为添加至喷雾溶液或配方以改良喷雾溶液的农业化学或物理特性的作用的任何物质。参见，例如Green andFoy(20o3)“Adjuvants：Tools for Enhancing Herbicide Performance”inWeed Biology and Management,ed.Inderjit(Kluwer Academic Publishers,The Netherlands)。可将佐剂归为或细分为：催化剂、酸化剂、缓冲剂、添加剂、附着剂、抗凝剂(antiflocculants)、抑泡剂(antifoamers)、消泡剂(defoamers)、防冻剂、引诱剂、基本混合剂(basic blends)、螯合剂(chelating agents)、除垢剂、着色剂或染色剂、兼容剂(compatibilityagents)、共溶剂(cosolvents)、耦合剂(couplers)、作物油浓缩物、沉淀剂、洗涤剂、分散剂、飘散控制剂(drift control agents)、乳化剂、减少蒸发剂(evaporation reducers)、增量剂(extenders)、肥料剂(fertilizers)、起泡剂(foam markers)、组成剂(formulants)、惰化剂(inerts)、保湿剂(humectants)、甲酯化种子油(methylated seed oils)、高负载作物油浓缩物(high load COCs)、聚合剂(polymers)、变性植物油(modified vege表oils)、渗透剂、防水剂(repellants)、石油浓缩物(petroleum oilconcentrates)、防腐剂、耐雨剂(rainfast agents)、助留剂(retention aids)、溶解剂(solubilizers)、界面活性剂、散布剂(spreaders)、粘着剂(stickers)、粘展剂(spreader stickers)、协同剂(synergists)、增稠剂(thickeners)、移位帮助剂(translocation aids)、紫外光保护剂(uv protectants)、植物油(vege表oils)、水质稳定剂(water conditioners)与湿润剂(wetting agents)。
此外，本发明的方法可包括应用除草剂或除草剂混合物以及一或更多种其他下列之物：杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀蜱剂(acaricides)、生长调控剂、化学不育剂(chemosterilants)、化学信息素(semiochemicals)、驱虫剂(repellents)、引诱剂、费洛蒙、激食剂(feedingstimulants)或其他生物活性化合物或虫生(entomopathogenic)细菌、病毒或真菌，以形成多成分混合物好赋予更宽广的农业保护幅度。可用于本发明之方法中的农药保护剂之实例包括：杀虫剂，诸如阿巴汀(abamectin)、殴杀松(acephate)、亚灭培(acetamiprid)、米弗灭(amidoflumet)(S-1955)、亚弗麦丁素(avermectin)、印楝素(azadirachtin)、谷速松(azinphos-methyl)、毕芬宁(bifenthrin)、联苯肼酯(bifenazate)、布芬净(buprofezin)、加保扶(carbofuran)、培丹(cartap)、克凡派(chlorfenapyr)、克福隆(chlorfluazuron)、毒死蜱、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、环虫酰肼(chromafenozide)、可尼丁(clothianidin)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、赛扶宁(cyfluthrin)、贝他赛扶宁(beta-cyfluthrin)、赛洛宁(cyhalothrin)、浪打赛洛宁(lambda-cyhalothrin)、赛灭宁(cypermethrin)、赛灭净(cyromazine)、第灭宁(deltamethrin)、汰芬隆(diafenthiuron)、大利松(diazinon)、地特灵(dieldrin)、二福隆(diflubenzuron)、四氟甲醚菊酯(dimefluthrin)、乐果(dimethoate)、达特南(dinotefuran)、达芬南(diofenolan)、因灭汀(emamectin)、安杀番(endosulfan)、益化利(esfenvalerate)、乙虫清(ethiprole)、芬硫克(fenothiocarb)、芬诺克(fenoxycarb)、芬普宁(fenpropathrin)、芬化利(fenvalerate)、芬普尼(fipronil)、氟尼胺(flonicamid)、氟虫酰胺(flubendiamide)、护赛宁(flucythrinate)、福化利(tau-fluvalinate)、氟芬宁(flufenerim)(UR-50701)、氟芬隆(flufenoxuron)、福诺松(fonophos)、氯虫酰肼(halofenozide)、六伏隆(hexaflumuron)、爱美松(hydramethylnon)、益达胺(imidacloprid)、因得克(indoxacarb)、亚芬松(isofenphos)、禄芬隆(lufenuron)、马拉松(malathion)、美弗腙(metaflumizone)、聚乙醛(metaldehyde)、达马松(methamidophos)、灭大松(methidathion)、纳乃得(methomyl)、美赐平(methoprene)、氯化甲醇(methoxychlor)、美特宁(metofluthrin)、亚素灵(monocrotophos)、灭芬诺(methoxyfenozide)、烯啶虫胺(nitenpyram)、尼丝浸(nithiazine)、诺伐隆(novaluron)、诺弗隆(noviflumuron)(XDE-007)、殴杀灭(oxamyl)、巴拉松(parathion)、甲基巴拉松(parathion-methyl)、百灭宁(permethrin)、福瑞松(phorate)、裕必松(phosalone)、益灭松(phosmet)、福赐米松(phosphamidon)、比加普(pirimicarb)、布飞松(profenofos)、布弗宁(profluthrin)、派灭净(pymetrozine)、派弗浦(pyrafluprole)、除虫菊精(pyrethrin)、百利达立(pyridalyl)、百利普立(pyriprole)、百利普芬(pyriproxyfen)、鱼藤精(rotenone)、里阿诺碱(ryanodine)、赐诺杀(spinosad)、赐派芬(spirodiclofen)、季酮甲螨酯(spiromesifen)(BSN2060)、螺虫乙酯(spirotetramat)、苏浦松(sulprofos)、得芬诺(tebufenozide)、得福隆(teflubenzuron)、汰福宁(tefluthrin)、托福松(terbufos)、乐本松(tetrachlorvinphos)、赛果培(thiacloprid)、赛速安(thiamethoxam)、硫敌克(thiodicarb)、硫苏特-钠盐(thiosultap-sodium)、特多宁(tralomethrin)、唑蚜威(triazamate)、三氯松(trichlorfon)与三福隆(triflumuron)；杀真菌剂，诸如艾西邦唑(acibenzolar)、阿迪墨弗(aldimorph)、吲唑磺菌胺(amisulbrom)、阿扎康唑(azaconazole)、亚托敏(azoxystrobin)、本达乐(benalaxyl)、免赖得(benomyl)、苯噻菌胺(benthiavalicarb)、苯噻菌胺异丙酯(benthiavalicarb-isopropyl)、比诺谬(binomial)、联苯(biphenyl)、比多农(bitertanol)、保米霉素(blasticidin-S)、波尔多液(Bordeaux mixture)(三元硫酸铜)、白克列(boscalid/nicobifen)、溴克座(bromuconazole)、布瑞莫(bupirimate)、得灭多(buthiobate)、萎锈灵(carboxin)、加普胺(carpropamid)、四氯丹(captafol)、盖普丹(captan)、贝芬替(carbendazim)、二氯甲氧苯(chloroneb)、四氯异苯腈(chlorothalonil)、克氯得(chlozolinate)、克三美唑(clotrimazole)、氯氧化铜(copper oxychloride)、铜盐(诸如，硫酸铜与氢氧化铜)、赛座灭(cyazofamid)、西弗嘧(cyflunamid)、克绝(cymoxanil)、环克座(cyproconazole)、赛普洛(cyprodinil)、益发灵(dichlofluanid)、双氯氰菌胺(diclocymet)、达灭净(diclomezine)、大克烂(dicloran)、乙霉威(diethofencarb)、待克利(difenoconazole)、达灭芬(dimethomorph)、醚菌胺(dimoxystrobin)、达克利(diniconazole、diniconazole-M)、白粉克(dinocap)、达克宾(discostrobin)、腈硫醌(dithianon)、吗菌灵(dodemorph)、多宁(dodine)、亦可那唑(econazole)、塔可那唑(etaconazole)、护粒松(edifenphos)、依普座(epoxiconazole)、萨布险(ethaboxam)、依瑞莫(ethirimol)、依瑞代唑(ethridiazole)、凡杀同(famoxadone)、芬嘧同(fenamidone)、芬瑞莫(fenarimol)、芬克座(fenbuconazole)、芬卡嘧(fencaramid)、芬弗烂(fenfuram)、芬六嘧(fenhexamide)、芬诺宁(fenoxanil)、芬皮宁(fenpiclonil)、芬普啶(fenpropidin)、芬普福(fenpropimorph)、三苯醋锡(fentin acetate)、三苯羟锡(fentin hydroxide)、福美铁(ferbam)、福瑞叶(ferfurazoate)、富米综(ferimzone)、扶吉胺(fluazinam)、护汰宁(fludioxonil)、护美佛(flumetover)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、护康唑(fluquinconazole)、护硅得(flusilazole)、氟硫灭(flusulfamide)、福多宁(flutolanil)、护汰芬(flutriafol)、福尔培(folpet)、福赛得(fosetyl-aluminum)、福贝唑(fuberidazole)、福拉夕(furalaxyl)、福灭派(furametapyr)、菲克利(hexaconazole)、恶霉灵(hymexazole)、克热净(guazatine)、依灭列(imazalil)、易胺座(imibenconazole)、克热净(iminoctadine)、欧滴克(iodicarb)、易康唑(ipconazole)、丙基喜乐松(iprobenfos)、依普同(iprodione)、依非克(iprovalicarb)、异康唑(isoconazole)、亚赐圃(isoprothiolane)、嘉赐霉素(kasugamycin)、克收欣(kresoxim-methyl)、锌锰乃浦(mancozeb)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、锰乃浦(maneb)、灭片淋(mapanipyrin)、右灭达乐(mefenoxam)、灭普宁(mepronil)、灭达乐(metalaxyl)、灭特座(metconazole)、减苏克(methasulfocarb)、免得烂(metiram)、免咪史宾/芬咪史宾(metominostrobin/fenominostrobin)、灭派林(mepanipyrim)、灭芬隆(metrafenone)、咪康唑(miconazole)、迈克尼(myclobutanil)、新阿苏仁(neo-asozin)(甲基砷酸铁)、尼瑞莫(nuarimol)、辛噻酮(octhilinone)、弗拉斯(ofurace)、欧撒史宾(orysastrobin)、殴杀斯(oxadixyl)、欧索林酸(oxolinic acid)、欧波康唑(oxpoconazole)、嘉保信(oxycarboxin)、巴克素(paclobutrazol)、平克座(penconazole)、宾克隆(pencycuron)、宾硫瑞(penthiopyrad)、派弗拉诶(perfurazoate)、膦酸(phosphonic acid)、热必斯(phthalide)、匹宾嘧(picobenzamid)、匹可史宾(picoxystrobin)、保粒霉素(polyoxin)、扑杀热(probenazole)、扑克拉(prochloraz)、扑灭宁(procymidone)、普拔克(propamocarb、propamocarb-hydrochloride)、普克利(propiconazole)、甲基锌乃浦(propineb)、普困悸(proquinazid)、普硫康唑(prothioconazole)、百克敏(pyraclostrobin)、百座弗(pryazophos)、比芬诺(pyrifenox)、派美宁(pyrimethanil)、百林浚(pyrolnitrine)、百快隆(pyroquilon)、快康唑(quinconazole)、快诺芬(quinoxyfen)、五氯硝苯(quintozene)、夕硫梵(silthiofam)、欣康唑(simeconazole)、葚孢菌素(spiroxamine)、链霉素(streptomycin)、硫磺(sulfur)、得克利(tebuconazole)、泰拉劲(techrazene)、克枯烂(tecloftalam)、克纳劲(tecnazene)、四克利(tetraconazole)、腐绝(thiabendazole)、赛氟灭(thifluzamide)、多保净(thiophanate)、甲基多保净(thiophanate-methyl)、得恩地(thiram)、泰地宁(tiadinil)、脱克松(tolclofos-methyl)、甲基益发灵(tolyfluanid)、三泰芬(triadimefon)、三泰隆(triadimenol)、三理莫(triarimol)、***赛(triazoxide)、三得芬(tridemorph)、三莫嘧三环唑(trimoprhamide tricyclazole)、三氟敏(trifloxystrobin)、赛福宁(triforine)、三康唑(triticonazole)、单康唑(uniconazole)、维利霉素(validamycin)、免克宁(vinclozolin)、锌乃浦(zineb)、福美锌(ziram)以及唑撒嘧(zoxamide)；杀线虫剂，诸如得灭克(aldicarb)、殴杀灭与芬灭松(fenamiphos)；杀菌剂，例如链霉素；杀蜱剂，诸如三亚满(amitraz)、离丹(chinomethionat)、克氯苯(chlorobenzilate)、锡螨丹(cyhexatin)、大克螨(dicofol)、得氯璊(dienochlor)、依杀螨(etoxazole)、芬杀螨(fenazaquin)、芬布赐(fenbutatinoxide)、芬普宁、芬普螨(fenpyroximate)、合赛多(hexythiazox)、殴螨多(propargite)、毕达本(pyridaben)与得芬瑞(tebufenpyrad)；以及生物药剂，包括虫生细菌，诸如苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensissubsp.Aizawai)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensissubsp.Kurstaki)与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的荚膜δ-内毒素(encapsulated delta-endotoxin)(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；虫生真菌，例如绿僵菌(green muscardine fungus)；以及虫生病毒，包括诸如杆状病毒(baculovirus)、核型多角体病毒(nucleopolyhedro virus,NPV)(诸如，HzNPV、AfNPV)以及颗粒体病毒(granulosis virus,GV)(例如，CpGV)。这些不同的混合伙伴与本发明方法中所用的其他组分(例如，除草剂)的重量比一般为100：1与1：100、30：1与1：30、10：1与1：10或4：1与1：4。
本发明还涉及一种组合物，其包含生物有效量的感兴趣的除草剂或除草剂混合物以及有效量的至少一额外生物活性化合物或药剂，且该组合物可进一步包含表面活性剂、固状稀释液或液态稀释液的至少一种。上述生物活性化合物或药剂的实例为：杀虫剂，诸如阿巴汀、殴杀松、亚灭培、米弗灭(S-1955)、亚弗麦丁素、印楝素、谷速松、毕芬宁、毕芬载(binfenazate)、布芬净、加保扶、克凡派、克福隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、赛扶宁、贝他赛扶宁、赛洛宁、浪打赛洛宁、赛灭宁、赛灭净、第灭宁、汰芬隆、大利松、二福隆、乐果、达芬南、因灭汀、安杀番、益化利、乙虫清、芬硫克、芬诺克、芬普宁、芬化利、芬普尼、氟尼胺、护赛宁、福化利、氟芬宁(UR-50701)、氟芬隆、福诺松、氯虫酰肼、六伏隆、益达胺、因得克、亚芬松、禄芬隆、马拉松、聚乙醛、达马松、灭大松、纳乃得、美赐平、氯化甲醇、亚素灵、灭芬诺、尼丝浸(nithiazin)、诺伐隆、诺弗隆(XDE-007)、殴杀灭、巴拉松、甲基巴拉松、百灭宁、福瑞松、裕必松、益灭松、福赐米松、比加普、布飞松、派灭净、百利达立、百利普芬、鱼藤精、赐诺杀、季酮甲螨酯(BSN2060)、苏浦松、得芬诺、得福隆、汰福宁、托福松、乐本松、赛果培、赛速安、硫敌克、硫苏特-钠盐、特多宁、三氯松与三福隆；杀真菌剂，诸如艾西邦唑、亚托敏、免赖得、保米霉素、波尔多液(三元硫酸铜)、溴克座、加普胺、四氯丹、盖普丹、贝芬替、二氯甲氧苯、四氯异苯腈、氯氧化铜、铜盐、西弗嘧、克绝、环克座、赛普洛、(S)-3,5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、达灭净、大克烂、待克利、(S)-3,5-二氢-5-甲基-2-(甲硫基)-5-苯基-3-(苯基-胺基)-4H-咪唑-4-酮(RP407213)、达灭芬、醚菌胺、达克利、达克利-M、多宁、护粒松、依普座、凡杀同、芬嘧同、芬瑞莫、芬克座、芬卡嘧(SZX0722)、芬皮宁、芬普啶、芬普福、三苯醋锡、三苯羟锡、扶吉胺、护汰宁、护美佛(RPA403397)、护膜弗/护膜林(flumorf/flumorlin)(SYP-L190)、氟嘧菌酯(HEC5725)、护康唑、护硅得、福多宁、护汰芬、福尔培、福赛得、福拉夕、福灭派(S-82658)、菲克利、易康唑、丙基喜乐松、依普同、亚赐圃、嘉赐霉素、克收欣、锌锰乃浦、锰乃浦、右灭达乐、灭普宁、灭达乐、灭特座、免咪史宾/芬咪史宾(SSF-126)、灭芬隆(AC375839)、迈克尼、新阿苏仁(甲基砷酸铁)、白克列(BAS510)、欧撒史宾、殴杀斯、平克座、宾克隆、扑杀热、扑克拉、普拔克、普克利、普困悸(DPX-KQ926)、普硫康唑(JAU6476)、比芬诺、百克敏、派美宁、百快隆、快诺芬、葚孢菌素、硫磺、得克利、四克利、腐绝、赛氟灭、甲基多保净、得恩地、泰地宁、三泰芬、三泰隆、三环唑(tricyclazole)、三氟敏、三康唑、维利霉素与免克宁；杀线虫剂，诸如得灭克、殴杀灭与芬灭松；杀菌剂，例如链霉素；杀蜱剂，诸如三亚满、离丹、克氯苯、锡螨丹、大克螨、得氯璊、依杀螨、芬杀螨、芬布赐、芬普宁、芬普螨、合赛多、殴螨多、毕达本与得芬瑞；以及生物药剂，包括虫生细菌，诸如苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌的荚膜δ-内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；虫生真菌，例如绿僵菌；以及虫生病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(诸如，HzNPV、AfNPV)以及颗粒体病毒(GV)(例如，CpGV)本发明的方法还包括使用基因转化的植物使其表达对无脊椎害虫有毒的蛋白质(例如，云金芽孢杆菌的荚膜δ-内毒素)。此类实施方案中，外源施加无脊椎害虫控制化合物的效应可与表达的毒素蛋白质协同作用。
这些农业保护剂的通用参考文献包括The Pesticide Manual,13thEdition,Tomlin,Ed.,British Crop Protection Council,Farnham,Surrey,U.K.,2003以及The BioPesticide Manual,2nd Edition,Copping,Ed.,British Crop Protection Council,arnham,urrey,.K.,2001。
某些实例中，与其它无脊椎害虫控制化合物或药剂(具有相似的控制谱但不同的作用模式)的组合对于抗性管理特别有利。因此，本发明的组合物可进一步包含生物有效量的至少一额外无脊椎害虫控制化合物或药剂(具有相似的控制谱但不同的作用模式)。将基因修饰以表达植物保护性化合物(例如，蛋白质)的植物或植物所在地接触生物有效量的本发明的化合物，还可提供较广谱的植物保护且对抗性管理有利。
因此，本发明的方法应用除草剂或除草剂组合且进一步包括应用杀虫剂和/或杀真菌剂和/或其他农业化学物质(例如，肥料剂)。使用本发明的此类组合处理可扩大针对其它杂草物种的活性谱与抑制任何抗性生物型(resistant biotype)的增殖。
本发明的方法可进一步包括应用植物生长调节剂，诸如艾维激素(aviglycine)、N-(苯甲基)-1H-嘌呤-6-胺(N-(phenylmethyl)-1H-purin-6amine)、益收生长素(ethephon)、波雀隆(epocholeone)、勃激素(gibberellic acid)、激勃素(gibberellin)A4与A7、诱敏蛋白质(harpinprotein)、甲派啶(mepiquat chloride)、普六酮钙(prohexadione calcium)、普海松(prohydrojasmon)、硝基苯酚钠(sodium nitrophenolate)与甲基三耐配(trinexapac-methyl)，与植物生长改造有机体，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BP01品系。
在接下来的实施例中进一步界定本发明的实施方案。应当理解这些实施例仅作为描述用途。由上述与这些实施例，本领域技术人员可确定本发明必要的特性，且可在不悖离其精神与范围下对本发明实施方案进行多种改变与改良以使其适应多种用途与条件。因此，本领域技术人员可由前文的叙述理解除了本文所显示与描述之外，还可理解本发明实施方案的多种改良。此类改良也意图位于所附的权利要求的范围中。
实验
使用下方的缩写描述本发明。
ALS         乙酰乳酸合酶蛋白
bp          碱基对
glyat4621   草甘膦乙酰转移酶基因
GLYAT4621   草甘膦乙酰转移酶蛋白
zm-als      来自芸苔的野生型乙酰乳酸合酶基因
zm-hra      来自芸苔的修饰版本的乙酰乳酸合酶基因
kb          千碱基对
PCR         聚合酶链式反应
UTR         非翻译区
实施例1.芸苔事件DP0-73496-4的***和侧翼边缘序列的表征
芸苔(Brassica napus L.)已通过***来自地衣芽孢杆菌的草甘膦乙酰转移酶基因(glyat4621)进行修饰，并通过基因改组优化。质粒PHP28181含有下文进一步描述的表达盒。
DNA构建体PHP28181通过以下来制备：利用T4DNA连接酶(New England Lab)将用BamHI和MfeI双消化从DNA构建体pZSL149切下的GAT4621:PINII TERM片段克隆至DNA构建体QC272相同BamHI和MfeI位点的AT-UBQ10启动子的下游。得到的PHP28181DNA含有表达盒：AT-UBQ10(DUPONT)PRO:GAT4621:PINII TERM。参见图1和图2。
利用HindIII和NotI限制性酶双消化从质粒PHP28181制备2112bp的PHP28181A DNA片段。通过电泳在1%琼脂糖凝胶中分析消化的质粒DNA。切下正确大小的DNA条带，并利用Qiagen DNA片段回收试剂盒(Qiagen)回收DNA片段。通过利用amp+阳性对照DNA的一系列稀释物进行PCR来检验DNA片段纯度，因为PHP28181质粒在其主链中含有amp+基因。通过分光光度法测量DNA片段浓度，并通过与琼脂糖凝胶中的低质量标志物(InVitrogen)比较来确认。
基本上如Chen和Tulsieram的美国专利申请公开号2007/0107077中所描述的进行转化。从供体系NS1822BC收集花蕾并将其灭菌。然后将花蕾匀浆、过滤并洗涤，以收集小孢子。将得到的小孢子悬液调整至指定密度，并培养2天。然后通过梯度离心分离胚性小孢子并进行培养。
将用PHP28181A DNA片段包被的金颗粒用于转化。利用PDS-1000/He粒递送***(Bio-Rad,Hercules,CA)如Klein,et al.,(1987)Nature327:70-73所述进行基因枪转化。将转化的胚性小孢子在新鲜的培养基中在黑暗条件下培养10-12天，然后在暗光条件下培养1-3周。将绿色的胚转移至新鲜的培养基并培养两周以选择草甘膦抗药性。将发出的芽和/或植物转移至补充草甘膦的生长培养基中。
从土壤细菌地衣芽孢杆菌获得glyat4621基因并通过DNA改组过程合成以优化GLYAT4621酶的乙酰转移酶活性(Castle et al.(2004)Science304：1151-1154)。
来自该质粒的***片段(图3)含有glyat4621基因盒。glyat4621基因的表达受到拟南芥的UBQ10调控区和pinII终止子的控制(参见，表4)。质粒PHP28181的转化片段的概述如表4所示。用于产生DP-073496-4的质粒PHP28181的基因元件如表3所示。
表3：质粒PHP28181中基因元件的描述
Figure GDA0000466023700000771
表4：转化片段PHP28181A中基因元件的描述
Figure GDA0000466023700000781
已经确定DP-073496-***中***的DNA的核苷酸序列。横跨导入的基因片段的独特接合点的PCR扩增可区分DP-073496-4植物及其未经基因修改的对应株，并可用来筛选***DNA的存在与否(即便浓度非常低)。以下描述了在DP-073496-4芸苔的基因组DNA上进行构建体特异的聚合酶链式反应(PCR)试验。
明确地说，分离试验物质(事件DP-073496-4的植物材料)与对照物质(非基因修饰芸苔的植物材料(具有代表事件背景的基因背景))的基因组DNA，并利用构建体特异的引物对进行定性PCR(qualitative PCR)扩增。在1.5%或2%的琼脂糖凝胶上分离PCR产物以确认从试验物质产生的基因组DNA中存在***的构建体，以及从对照物质产生的基因组DNA中不存在***的构建体。利用参考标准(100碱基对DNA阶梯；
Invitrogen Corporation产品编号#10380-012)来测定PCR产物的大小。
自植物上收取试验样品与对照样品。如果是叶片组织，利用标准的尿素提取步骤执行试验组织与对照组织的基因组DNA提取。如果是种子组织，利用
Figure GDA0000466023700000782
Magnetic96DNA Plant System(PromegaCorporation Catalog#FF3760)分离试验样品与对照样品的基因组DNA。利用试剂(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)在分光光度计上定量基因组DNA，和/或在琼脂糖凝胶上观察基因组DNA以确认定量数值并测定DNA的品质。
利用构建体特异的引物对(其跨越glyat4621编码区的至少一部分)对从事件DP-073496-4和对照样品的植物材料分离的基因组DNA进行PCR扩增(PCR Master Mix Catalog#7505，来自Promega Corporation)，并允许仅鉴定玉米事件DP-073496-4。第二引物对用于扩增内源基因，作为PCR扩增的阳性对照。将每个引物组的PCR靶位点和预期的PCR产物与观察到的结果进行比较。
实施例2.通过Southern印迹对事件DP-073496-4的表征
进行Southern印迹分析(Southern,1975)以便研究转化DNA***位点的数量、基因元件的拷贝数和功能完整性以及质粒主链序列的缺失。
使用的方法一般如下述。对取样于DP-073496-4芸苔以及未经基因修饰的对照植物的冻干组织提取基因组DNA。以限制性核酸内切酶消化基因组DNA，并在琼脂糖凝胶上对大小进行分离。使分子量标志物沿着样品运行以便预测大小。将在琼脂糖凝胶上分离的DNA片段在原位去嘌呤(depurinated)、变性与中和，并转移至尼龙膜上。转移至膜上后，通过紫外光交联反应(UV crosslinking)将DNA固定于膜上。通过质粒PHP28181的PCR产生与glyat4621基因同源的片段，将其凭借大小在琼脂糖凝胶上分离，切下凝胶并利用凝胶提取试剂盒纯化。将标记的探针杂交于尼龙膜上的目标DNA以便检测特异的片段。以高严紧性进行杂交后的洗涤。将印迹在一个或更多时间点上暴露于X光底片以检测杂交片段以及观察分子量标志物。
实施例3.***物的表达
利用从转基因植物收集的叶片组织评估GLYAT4621蛋白的表达。例如，可以收集四份新鲜的叶片，并利用GenoGrinder(Spex Certiprep)在样品提取缓冲液中研磨。总的可溶性蛋白(TEP)可以利用Bio-Rad蛋白试验进行测定，所述蛋白试验基于Bradford染料结合方案。可以将样品提取物在样品提取缓冲液中稀释，用于ELISA分析。
可以通过对获自多块田地试验位置的样品进行定量酶联免疫吸附试验(ELISA)，来测定DP-073496-4芸苔中GAT4621蛋白的表达水平。重复的种子样品(三份重复)可以获自这样的DP-073496-4植物，该植物用最大推荐标记率的
Figure GDA0000466023700000801
Total草甘膦除草剂(500g/l草甘膦钾盐；0.60–1.35l/ha)处理，该除草剂在子叶至6叶阶段时施加，因为这代表了可能的商业栽培情况。
证实DP-073496-4芸苔属植物中***物表达的另一种方式是评价转化植物对草甘膦的抗药性。由GAT4621酶的表达所赋予的耐除草剂性状的多代稳定性(Multigenerational stability)和代内分离(within-generation segregation)将利用对除草剂耐药性的功能测定进行证实。测试在至少三代植物材料上进行。除草剂伤害可以如表5中所描述的进行储存。
表5：除草剂伤害的0至100的作物响应等级***
Figure GDA0000466023700000802
实施例4.芸苔事件DP-073496-4的构建体特异的PCR分析
将从DP-073496-4加拿大油菜(T2F2代)和对照加拿大油菜(非基因修饰的)的叶片分离的基因组DNA利用构建体特异的引物对(09-0-3290/09-0-3288)进行PCR扩增(Roche High Fidelity PCR MasterKit,Roche Catalog#12140314001)，所述引物对跨越泛素启动子和gat4621基因盒(图4)。第二引物组(09-0-2812/09-0-2813)被用于扩增加拿大油菜内源的FatA基因，作为PCR扩增的阳性对照。每个引物组的PCR靶位点和预期PCR产物的大小如表8所示。PCR试剂和反应条件如表9所示。本项研究中所用的引物序列在表10中列出。在本项研究中，100ng叶片基因组DNA用于所有PCR反应中。
在利用质粒PHP28181(10ng)作为模版和三种DP-073496-4加拿大油菜植物的PCR反应中，观察到由构建体特异的引物组09-0-3290/09-0-3288扩增的大小为大约600bp的PCR产物，而在三种对照加拿大油菜植物和无模版对照中则没有观察到(图5)。加载的样品如表6所示。
表6
泳道 样品
1 低质量分子量标志物
2 空白
3 非基因修饰的加拿大油菜C1
4 非基因修饰的加拿大油菜C2
5 非基因修饰的加拿大油菜C3
6 DP-073496-4加拿大油菜T1
7 DP-073496-4加拿大油菜T2
8 DP-073496-4加拿大油菜T3
9 NT对照
10 质粒PHP28181
11 空白
12 低质量分子量标志物
这些结果与含有DP-073496-4加拿大油菜基因组DNA的样品的预期PCR产物大小(675bp)一致。在用于检测内源性FatA基因的引物组09-0-2812/09-0-2813的PCR反应之后，观察到DP-073496-4加拿大油菜和对照加拿大油菜植物的大小大约为450bp的PCR产物(图6)。加载的样品如表7所示。
表7
泳道 样品
1 低质量分子量标志物
2 空白
3 非基因修饰的加拿大油菜C1
4 非基因修饰的加拿大油菜C2
5 非基因修饰的加拿大油菜C3
6 DP-073496-4加拿大油菜T1
7 DP-073496-4加拿大油菜T2
8 DP-073496-4加拿大油菜T3
9 NT对照
10 质粒PHP28181
11 空白
12 低质量分子量标志物
这些结果与含有加拿大油菜内源性FatA基因的基因组DNA样品的预期PCR产物大小(506bp)一致。在无模板对照中没有观察到内源性目标条带。
表8：PCR基因组DNA靶位点和PCR产物的预期大小
Figure GDA0000466023700000821
PCR：聚合酶链式反应
bp：碱基对
1. FatA基因的Genbank登录号是X87842.1。该序列用于设计PCR引物。
表9：PCR试剂和反应条件
Figure GDA0000466023700000822
PCR：聚合酶链式反应
ddH2O：双蒸水
*Roche High Fidelity Master Mix
表10：PCR反应中所用的引物序列的列表
Figure GDA0000466023700000831
实施例5.芸苔事件DP-073496-4的其它***物和侧翼边缘序列的 表征
为了表征***DNA和基因组掺入位点的完整性，测定DP-073496-***的侧翼基因组DNA边缘区。DP-073496-4的侧翼基因组序列包括在SEQ ID NO:2中。***物和边缘序列的PCR扩增能够证实边缘区是芸苔来源，以及接合区可用于鉴定DP-073496-4芸苔。总的来说，***物和基因组边缘序列的表征，以及Southern印迹数据能够指示芸苔基因组中存在单个***的DNA片段。然后，多种分子技术用于特异性地表征整合位点。
在最初的表征中，利用GenomeWalker和反向PCR方法对侧翼基因组边缘区进行克隆和测序。利用来自侧翼边缘序列的信息，在DP-073496-4基因组DNA和未修饰的对照基因组DNA上进行PCR。本领域技术人员将还包括利用内源性基因的对照PCR，以验证分离的基因组DNA适于PCR扩增。
表11.
Figure GDA0000466023700000841
表12.SEQ ID NOS一览表
Figure GDA0000466023700000851
本文所用的冠词“一(“a”与“an”)”是指一或多于一(即，至少一)个冠词语法上的目标。举例来说，“一元件(an element)”意指一或多个元件。
本说明书所提的所有出版物与专利申请均指示本发明所属的本领域技术人员的水平。在此将所有出版物与专利申请通过引用并入本文中，与明确且单独地指出通过引用将每篇单独的出版物或专利申请并入本文中的程度相同。
虽然已经通过叙述与实施例在某种程度上详细地描述前述发明以便清楚了解，明显的是，可在附加的权利要求范围内实施某种程度的变化与改良。
申请人或代理的卷号35718/39908 国际申请号PCT/US2010/
关于保藏的微生物或其他生物材料的指示
(PCT细则13bis)
Figure GDA0000466023700000871
表PCT/RO/134(1998年7月)
Figure IDA00003547295500021
Figure IDA00003547295500041
Figure IDA00003547295500051
Figure IDA00003547295500061
Figure IDA00003547295500071
Figure IDA00003547295500081
Figure IDA00003547295500101
Figure IDA00003547295500111
Figure IDA00003547295500121
Figure IDA00003547295500131
Figure IDA00003547295500141

Claims (31)

1.芸苔属植物，在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸、编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的芸苔属植物，其中所述植物是从ATCC种子保藏号PTA-______的种子生长的植物的后代。
3.植物材料，其来源于权利要求2所述的芸苔属植物。
4.如权利要求3所述的植物材料，其中所述植物材料包括食品。
5.转基因种子，在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸、编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸。
6.ATCC种子保藏号PTA-_____的转基因种子。
7.植物材料，其来源于权利要求6所述的转基因种子。
8.如权利要求7所述的植物材料，其中所述植物材料包括食品或油。
9.分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12和13。
10.如权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:2、11、14、15、16、17、18或19所示的核苷酸序列。
11.DNA检测试剂盒，其包含至少一种可特异性地检测DP-073496-4特异性区域的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一DNA分子，所述分子具有与SEQ ID NO:11相同或互补的足够长度的连续核苷酸。
12.如权利要求11所述的DNA检测试剂盒，其中所述可特异性地检测DP-073496-4特异性区域的多核苷酸包含具有SEQ ID NO:12或13的多核苷酸。
13.如权利要求11所述的DNA检测试剂盒，其中所述多核苷酸包括在严紧条件下与包含以下的序列杂交的序列：
(a)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的序列；以及
(b)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列。
14.鉴定生物样品中事件DP-073496-4的方法，其包括
(a)将所述样品与第一引物和第二引物接触；以及
(b)扩增包含DP-073496-4特异性区域的多核苷酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述包含DP-073496-4特异性区域的多核苷酸包含SEQ ID NO:12、14或16。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述包含DP-073496-4特异性区域的多核苷酸包含SEQ ID NO:13、15或17。
17.如权利要求14、15或16所述的方法，其还包括检测所述DP-073496-4特异性区域。
18.如权利要求14、15、16或17所述的方法，所述第一引物包含SEQ ID NO:11的第一片段，且所述第二引物包含SEQ ID NO:11的第二片段，其中所述第一引物和第二引物在所述DP-073496-4特异性区域侧翼，并且与所述多核苷酸共有足够的序列同源性或互补性，以便扩增所述DP-073496-4特异性区域。
19.如权利要求18所述的方法，其中
a)所述第一引物包含SEQ ID NO:10的片段，且所述第二引物包含SEQ ID NO:8的片段；
b)所述第一引物包含SEQ ID NO:10的片段，且所述第二引物包含SEQ ID NO:9的片段；或
c)所述第一引物包含SEQ ID NO:8的片段，且所述第二引物包含SEQ ID NO:9的片段。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述第一引物和/或所述第二引物包含SEQ ID NO:11的至少8个连续的多核苷酸。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述第一引物和所述第二引物包含SEQ ID NO:8、10或9的至少8个连续的多核苷酸。
22.如权利要求14所述的方法，其中包含DP-073496-4特异性区域的多核苷酸的扩增指示种子纯度或一批种子的纯度。
23.如权利要求17所述的方法，其中在所述DNA扩增反应中所述DNA扩增子分子的检测指示种子纯度或一批种子的纯度。
24.检测样品中对应于DP-073496-***的DNA存在的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严紧杂交条件下与来自芸苔事件DP-073496-4的DNA杂交，并特异性地检测所述DP-073496-***；
(b)使所述样品和探针处于严紧杂交条件下；以及
(c)检测所述探针与DNA的杂交，其中杂交的检测指示DP-073496-***的存在。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述样品包含芸苔组织。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中杂交的检测指示种子纯度或一批种子的纯度。
27.产生耐草甘膦的植物的方法，其包括
培育芸苔属植物，在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸、编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸，或是从ATCC种子保藏号PTA-______的种子生长的植物的后代的植物，以及
通过分析包含DP-073496-4特异性区域的至少一种多核苷酸来选择后代。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述包含DP-073496-4特异性区域的多核苷酸包含SEQ ID NO:12或13。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸选自：
(a)SEQ ID NO:11、14、15、16或17所示的核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO:11、14、15、16或17片段的核苷酸序列。
30.控制耕种区域内的杂草的方法，包括向所述耕种区域施加有效量的草甘膦，所述耕种区域具有植物，所述植物在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸、编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸，或具有是从ATCC种子保藏号PTA-______的种子生长的植物的后代的植物。
31.长出耐草甘膦的芸苔属植物的方法，包括
(a)在耕种区域内种植芸苔属植物或种子，在其基因组中按以下顺序具有：包含SEQ ID NO:12的多核苷酸、编码草甘膦-N-乙酰转移酶的多核苷酸和包含SEQ ID NO:13的多核苷酸，或是从ATCC种子保藏号PTA-______的种子生长的植物的后代的植物，以及
(b)向所述耕种区域施加草甘膦。
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