DE69833457T2 - Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom - Google Patents
Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom Download PDFInfo
- Publication number
- DE69833457T2 DE69833457T2 DE69833457T DE69833457T DE69833457T2 DE 69833457 T2 DE69833457 T2 DE 69833457T2 DE 69833457 T DE69833457 T DE 69833457T DE 69833457 T DE69833457 T DE 69833457T DE 69833457 T2 DE69833457 T2 DE 69833457T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- site
- recombinase
- plant
- specific
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die genetische Modifikation von Chromosomen. Es werden insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen für die Integration von DNA in ein eukaryotisches Genom bereitgestellt.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um eine DNA von Interesse in das Genom einer Pflanze zu integrieren. Im einfachsten Verfahren wird DNA in eine Zelle eingeführt und integriert durch illegitime Rekombination statistisch in das Genom. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass positionale Effekte durch statistische Integration es schwierig machen, eine Genexpression zu analysieren.
- Als Alternative zur illegitimen Rekombination kann eine Integration auf eine besondere Stelle im Genom durch die Verwendung einer homologen Rekombination oder ortsspezifischen Rekombination targetiert werden. Bei Pflanzen, bei denen keine homologe Rekombinationstechnologie entwickelt wurde, wird eine ortsspezifische Rekombination verwendet, um eine Sequenz von Interesse in eine Integrationsstelle zu integrieren, die vorher in das Wirtspflanzengenom insertiert wurde. Wenn eine ortsspezifische Integration durch ein einfaches Kreuzungsereignis zwischen einem Chromosom und einem ringförmigen extrachromosomalen Replikon erfolgt, wird das gesamte Replikon in das Chromosom insertiert werden. Wenn eine Insertion des gesamten Replikons unerwünscht ist, kann ein Fragment des Replikons, das die DNA von Interesse umfasst, flankiert von Targetstellen für eine ortsspezifische Rekombinase, durch ein doppeltes reziprokes Kreuzungsereignis in ein Chromosom eingeführt werden, das eine Integrationsstelle hat, welche den Targetstellen entspricht, die die DNA von Interesse flankieren. In jedem Fall ist eine Integration ineffizient, da sie reversibel ist, d.h., die integrierte DNA kann durch anschließende ortsspezifische Rekombination zwischen den Targetstellen, die die integrierte DNA flankieren, ausgeschnitten werden.
- Es wurden mehrere Ansätze unternommen, um eine Exzision bzw. ein Ausschneiden einer integrierten DNA zu vermeiden. In einem Ansatz wird die Expression einer ortsspezifischen Rekombinase, z.B. Cre oder FLP, zeitweise reguliert. Siehe O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355; Logie und Stewart (1995) Proc Natl Acad Sci 92:5940-5944; Zhang et al. (1996) Nuc Acid Res 24:543-548; Nichols et al. (1997) Mol Endocinol 11:950-961; und Feil et al. (1997) Biochem Biophy Res Comm 237:752-757. In diesen Verfahren wird die Rekombinase entweder transient oder induzierbar kurz exprimiert, um eine Integration zuzulassen. Allerdings kann eine Exzision der integrierten DNA auftreten, bevor aktive Rekombinase aus der Zelle verschwindet. Darüber hinaus ist eine intramolekulare Exzision kinetisch gegenüber einer bimolekularen Integration begünstigt. Daher ist integrierte DNA in Gegenwart von Rekombinase von Natur aus instabil.
- Ein zweiter Ansatz reduziert eine Exzision von integrierter DNA durch Verwendung von Paaren einzeln mutierten Zielstellen, sowohl auf dem Chromosom als auch der flankierenden DNA von Interesse. Siehe Albert et al. (1995) Plant J7:649-659; Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; O'Gorman et al. (1997) Proc Natl Acad Sci 94:14602-14607; und Araki et al. (1997) Nuc Acid Res 25:868-872. Eine Rekombination zwischen einzeln mutierten Zielstellen resultiert in doppelt mutierten Zielstellen, die die DNA flankieren, die in das Chromosom insertiert ist. Die doppelt mutierten Zielstellen werden durch die Rekombinase gut erkannt. So wird die insertierte DNA durch eine Umkehrreaktion nur bei niedrigen Leveln aus dem Chromosom ausgeschnitten. Dieses System hat allerdings den Nachteil, dass einzeln mutierte Zielstellen oft nicht als effiziente Rekombinationssubstrate wirken und somit die Integrationshäufigkeit reduziert ist. Außerdem sind Transformanten instabil, da eine Exzision noch erfolgen kann, wenn auch bei reduzierter Häufigkeit.
- Ow et al. (1995), Critical Reviews in Plant Sciences 14(3), 239-261, offenbart mehrere ortsspezifische Rekombinationssysteme, von denen gezeigt wurde, dass sie in höheren eukaryotischen Zellen arbeiten. Diese Zwei-Komponentensysteme bestehen aus einer Einzel-Polypeptid-Rekombinase und einer kurzen Erkennungssequenz mit weniger als 35 bp.
- Dementsprechend besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung von effizienten Methoden für eine ortsspezifische Integration von DNA in eukaryotische Genome, die anschließende Exzisionsreaktionen und andere nicht-produktive Rekombinationsreaktionen vermeiden.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Einführen einer DNA von Interesse in eine genomische Integrationsstelle bereitgestellt. Die Verfahren und Zusammensetzungen involvieren insbesondere die Verwendung einer Kombination von Targetstellen bzw. Zielstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen, z.B. Cre und FLP, und Expression einer chimären Rekombinase mit dualer Targetstellenspezifität. Somit umfassen die Kombinationen neue ortsspezifische Rekombinasen mit Spezifitäten für multiple Targetstellen und Nucleotidsequenzen und Expressionskassetten, die für diese Rekombinasen oder Targetstellen codieren. Die Verfahren involvieren Transformieren einer eukaryotischen Zelle mit Targetstellen für die neue Rekombinase mit einer DNA von Interesse, die durch entsprechende Targetstellen flankiert ist. Die Expression entweder der neuen chimären Rekombinase oder von zwei ortsspezifischen Rekombinasen in der eukaryotischen Zelle resultiert in der Integration der DNA von Interesse in das Genom. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung haben eine Verwendung bei der Konstruktion von stabil transformierten eukaryotischen Zellen, und insbesondere Pflanzenzellen. Die Verfahren resultieren in einer effizienten targetierten genomischen Integration von DNA durch ortsspezifische Rekombination.
- Erfindungsgemäß wird demnach ein rekombinantes Protein bereitgestellt, umfassend eine erste ortsspezifische Rekombinase, im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase.
- Die Erfindung stellt auch bereit:
- – ein rekombinantes Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 3, 6, 9 und 11;
- – ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase, im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase, codiert, umfasst;
- – ein Nucleinsäuremolekül, das SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7 oder 8 umfasst;
- – eine eukaryotische Zelle, die ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung stabil in ihr Genom eingebaut hat;
- – eine Pflanze, die in ein Chromosom wenigstens eine Integrationsstelle, die eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase umfasst, stabil integriert hat, wobei die Targetstellen aneinander angrenzend sind;
- – eine Pflanze, die stabil in ihr Genom ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung integriert hat;
- – ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryoti schen Zelle, umfassend:
- (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse von einer Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und einer Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die Targetstellen umfasst, welche den Targetstellen entsprechen, die die DNA von Interesse flankieren; und
- (b) Bereitstellen in der genannten eukaryotischen Zelle eines rekombinanten Proteins, das die erste Rekombinase, ein aktives Derivat der ersten Rekombinase oder ein aktives Fragment der ersten Rekombinase, im Raster fusioniert mit der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, einem aktiven Derivat der zweiten unterschiedlichen Rekombinase oder einem aktiven Fragment der zweiten unterschiedlichen Rekombinase umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysieren, wobei die DNA von Interesse an der Integrationsstelle in das Genom integriert wird;
- – ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryoti schen Zelle, umfassend:
- (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA von Interesse flankieren; und
- (b) Bereitstellen in der Zelle der ersten Rekombinase eines aktiven Derivats der ersten Rekombinase oder eines aktiven Fragments der ersten Rekombinase; und der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, eines aktiven Derivats der zweiten Rekombinase oder eines aktiven Derivats der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, wobei die erste und zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysieren; und – transformierten Samen aus einer Pflanze der Erfindung.
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 stellt schematisch Pflanzentransformationsvektoren, PHP 13164 und PHP 13147, zur Expression von moCRE-Rekombinase bzw. Cre:FLPm-Rekombinase dar. -
2 stellt die Aktivierung der GUS-Expression durch FLPm- oder CRE:FLPm-vermittelte Exzision einer Sequenz, die durch FRT-Stellen flankiert wird, die einen Ubiquitin-Promotor und das GUS-offene Leseraster trennt, dar. -
3 stellt graphisch die Aktivierung der GUS-Expression durch CRE:FLPm-vermittelte Exzision einer Sequenz, die durch loxP-Stellen flankiert wird, die den Übiquitin-Promotor und das GUS-offene Leseraster trennt, dar. - DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Zusammensetzungen und Verfahren zur ortsspezifischen Integration von DNA in vorher festgelegte genomische Integrationsstellen in einem Wirtsgenom werden bereitgestellt. Die Erfindung sorgt für die Verwendung von chimären Rekombinasen, die eine ortsspezifische Rekombination zwischen Zielstellen katalysieren, welche aus unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinationssystemen stammen. Eine derartige chimäre Rekombinase mit dualer Funktion stellt sicher, dass die zwei Enden von Fremd-DNA nicht miteinander ligieren, sondern mit ihren verwandten Partner-Targetstellen, die in der genomischen DNA liegen, rekombinieren. Die Verfahren erleichtern das Richtungstargeting von gewünschten Genen und Nucleotidsequenzen in entsprechende Integrationsstellen, die vorher in das Genom eingeführt wurden.
- In den Verfahren der Erfindung wird eine Kombination von Targetstellen für zwei ortsspezifische Rekombinasen in das Genom eines Organismus von Interesse eingeführt, was eine Integrationsstelle zu Insertion einer Nucleotidsequenz von Interesse einrichtet. Zu Zwecken der Erfindung wird eine Integrationsstelle flankierende Targetstellen umfassen, wobei die Targetstellen den Rekombinationsstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen entsprechen. Diese Rekombinations- oder Targetstellen können andere Nucleotidsequenzen flankieren oder können fortlaufend sein. Verfahren für die Erzeugung von transgenen Pflanzen, die spezifische Rekombinationsstellen in das Pflanzengenom integriert enthalten, sind in der gleichzeitig anhängigen vorläufigen Anmeldung, Serial No. 60/065 627 mit dem Titel "Compositions and Methods for Genetic Modification of Plants", eingereicht am 18. November 1997, beschrieben, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Sobald eine stabile Pflanze oder ein stabiles Kulturgewebe entwickelt ist, wird eine Transferkassette, die eine DNA von Interesse flankiert von Targetstellen, die denen der genomischen Integrationsstelle entsprechen, umfasst, in die stabil transformierte Pflanze oder die stabil transformierten Gewebe in Gegenwart einer chimären Rekombinase mit Spezifitäten für jede der Targetstellen eingeführt. Alternativ können zwei unterschiedliche Rekombinasen, die den Targetstellen entsprechen, anstelle einer chimären Rekombinase in der Zelle vorliegen. Dieses Verfahren resultiert im Austausch der Nucleotidsequenzen zwischen den zwei identischen Targetstellen der genomischen Integrationsstelle und der Transferkassette.
- Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle bereit, umfassend:
- a) Transformieren der Zelle mit einer Transferkassette, die die DNA umfasst, wobei die DNA durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom eine Integrationsstelle enthält, welche Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA flankieren; und
- b) Bereitstellen in der Zelle eines rekombinaten Proteins, das die erste Rekombinase im Raster fusioniert mit der zweiten Rekombinase umfasst.
- Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle bereit, umfassend:
- a) Transformieren der Zelle mit einer Transferkassette, die die DNA umfasst, wobei die DNA durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom eine Integrationsstelle enthält, die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, die die DNA flankieren; und
- b) Bereitstellen in der Zelle die erste Rekombinase und die zweite Rekombinase.
- Mit "ortsspezifische Rekombinase" ist ein beliebiges Enzym gemeint, das eine konservative ortsspezifische Rekombination zwischen seinen entsprechenden Rekombinationsstellen katalysiert. Bezüglich einer Übersicht über ortsspezifische Rekombinasen siehe Sauer (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527; und Sadowski (1993) FASEB 7:760-767.
- Die erste und zweite ortsspezifische Rekombinase können Volllängen-Rekombinasen und/oder aktive Fragmente oder Derivate davon sein. Ortsspezifische Rekombinasen, die zur Erzeugung der chimären Rekombinasen der Erfindung einsetzbar sind, umfassen Rekombinasen aus der Integrase-Familie, Derivate davon oder ein beliebiges anderes natürlich vorkom mendes oder rekombinant produziertes Enzym oder Derivat davon, das eine konservative ortsspezifische Rekombination zwischen spezifizierten DNA-Stellen katalysiert. Die Integrase-Familie von Rekombinasen hat über dreißig Mitglieder und umfasst FLP, Cre, Int und R. Vorzugsweise benötigen die Rekombinasen keine Cofaktoren oder kein "supercoiled" Substrat. Am meisten bevorzugt sind die Rekombinasen Cre und FLP. Die Bakteriophage P1 loxP-Cre- und die Saccharomyces 2 μ-Plasmid FRT/FLP-ortsspezifischen Rekombinationssysteme wurden umfangreich untersucht, und ihre Verwendungen sind dem Fachmann gut bekannt. Von Cre und FLP ist bekannt, dass sie in einer Vielzahl von Organismen einschließlich Bakterien, Hefe, Drosophila, Säugern und monokotylen und dikotylen Pflanzen funktionieren. Außerdem erfordern diese Rekombinasen keine Hilfsfaktoren, um zu funktionieren.
- Die ortsspezifischen Rekombinasen und Sequenzen, die diese codieren, die in den Verfahren und den Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden können, können Varianten natürlich auftretender Rekombinasen und die Gene, die diese codieren, sein. Der Ausdruck "konservativ modifizierte Varianten" findet sowohl auf Aminosäure- wie auch auf Nucleinsäuresequenzen Anwendung. Bezüglich bestimmter Nucleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf solche Nucleinsäuren, die identische oder konservativ modifizierte Varianten der Aminosäuresequenzen codieren. Infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes codiert eine ganze Reihe von funktionell identischen Nucleinsäuren für ein gegebenes Protein. Beispielsweise codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle für die Aminosäure Alanin. So kann das Codon an jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert ist, in ein beliebiges der entsprechenden Codons, die beschrieben wurden, geändert werden, ohne dass das codierte Polypeptid verändert wird. Solche Nucleinsäurevariationen sind "stille Variationen" und stellen eine Spezies konservativ modifizierter Variation dar. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist) modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu liefern.
- Was die Aminosäuresequenzen angeht, so wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen an eine Nucleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren in der codierten Sequenz ändern, addieren oder deletieren, eine "konservativ modifizierte Variante" ist, in der die Veränderung in der Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure resultiert. Somit kann eine beliebige Zahl an Aminosäureresten, ausgewählt aus der Gruppe von ganzen Zahlen, bestehend aus 1 bis 15, verändert werden. Beispielsweise können so 1, 2, 3, 4, 5, 7 oder 10 Veränderungen durchgeführt werden. Konservativ modifizierte Varianten stellen typischerweise ähnliche biologische Aktivität, wie die nicht-modifizierte Polypeptidsequenz, aus der sie abgeleitet sind, bereit. Z.B. ist die Substratspezifität, Enzymaktivität oder Ligand/Rezeptor-Bindung im Allgemeinen wenigstens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% derjenigen des nativen Proteins für sein natives Substrat. Kon servative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
- Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:
- 1) Alanin (A), Serin (S), Theronin (T);
- 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
- 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
- 4) Arginin (R), Lysin (K);
- 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
- 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
- Anstelle einer Verwendung von Volllängen-Rekombinasen können funktionelle Fragmente von ortsspezifischen Rekombinasen in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Funktionelle Fragmente von ortsspezifischen Rekombinasen können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken identifiziert werden. Beispielsweise können funktionelle Fragmente des FLP-Proteins durch ihre Fähigkeit, bei Einführung in Zellen, die geeignete FRT-Substrate enthalten, eine ortsspezifische Rekombination zu katalysieren und in der Exzision eines analysierbaren Markergens zu resultieren, identifiziert werden.
- Ein allgemeiner Ansatz für eine derartige funktionelle Analyse involviert eine Subklonierung von DNA-Fragmenten eines genomischen Klons, cDNA-Klons oder einer synthetisierten Gensequenz in einen Expressionsvektor, Einführen des Expressionsvektors in einen heterologen Wirt und Screening, um das Rekombinationsprodukt zu detektieren (d.h., unter Verwendung einer Restriktionsanalyse, um das Rekombinationsprodukt auf dem Nucleinsäurelevel zu bestätigen, oder auf der Basis eines Assaysystems für eine Rekombination, wie es oben beschrieben wurde). Methoden zur Erzeugung von Fragmenten einer cDNA oder eines genomischen Klons sind gut bekannt. Varianten einer isolierten DNA, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, können durch Deletieren, Addieren und/oder Substituieren von Nucleotiden produziert werden. Solche Varianten können z.B. durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und dergleichen erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel, Current Protocols In Molecular Biology, Wiley Interscience (1990), Seiten 8.0.3 – 8.5.9, und McPherson (Herausg.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach, (IRL Press, 1991).
- Die rekombinanten Proteine der Erfindung mit dualer Funktion umfassen eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster, fusioniert mit einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase. Es wird erkannt werden, dass die Rekombinasen in den Verfahren der Erfindung, die der chimären Rekombinase entsprechen, den Targetstellen des transformierten Organismus und der Targetingkassette entsprechen müssen. D.h., wenn FRT- und loxP-Stellen verwendet werden, wird eine chimäre FLP:Cre-Rekombinase benötigt werden.
- Die offenen Leseraster, die für die ersten und zweiten Rekombinasen codieren, können direkt miteinander fusioniert sein oder können durch einen Linker verknüpft sein, der das korrekte Leseraster der chimären Rekombinase aufrechterhält. Es ist klar, dass die Rekombinasen Amino-an-Carboxy-Terminus, Amino-an-Amino-Terminus oder Carboxy-an-Amino-Terminus fusioniert sein können.
- Gene, die für chimäre ortsspezifische Rekmobinasen und Rekombinationsstellen codieren, können unter Verwendung von Standard-Rekombinationsverfahren, Synthesetechniken oder Kombinationen davon hergestellt werden. Die Verwendung von Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren, Adaptern und Linkern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und kann in Literaturstellen, wie z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (Cold Spring Habor, New York, 1989) gefunden werden. Es ist eine Vielzahl von Strategien zum Ligieren von DNA-Fragmenten verfügbar, deren Wahl von der Natur der Termini der DNA-Fragmente abhängt, wobei diese Wahl in einfacher Weise von einem Fachmann vorgenommen werden kann. Das FLP-Rekombinase-Gen aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) ist im Handel im Plasmid pOG44 von Stratagene Cloning Systems (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) verfügbar. Bezüglich einer Beschreibung des FLP-Gens und verschiedener Nucleinsäuren siehe z.B. Stratagene Cloning Systems, Kataloge 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); und Amersham Life Sciences, Inc., Katalog '97 (Arlington Heights, IL). In ähnlicher Weise sind die Sequenzen von vielen anderen ortsspezifischen Rekombinasen und ihren verwandten Erkennungsstellen allgemein oder kommerziell verfügbar. Gene, die für FLP und Cre codieren, können auch z.B. durch Synthetisieren der Gene mit wechselseitigem Priming langer Oligonucleatide erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 8.2.8 bis 8.2.13, Wiley Interscience (1990). Siehe auch Wosniak et al. (1987) Gene 60:115. Darüber hinaus bieten derzeitige Techniken unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion die Fähigkeit, Gene zu synthetisieren, die in der Länge so groß wie 1,8 Kilobasen sind (Adang et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:1131; Bombat et al. (1993) PCR Methods and Applications 2:266).
- Wenn die Nucleinsäure synthetisch hergestellt oder verändert wird, können bekannte Codonpräferenzen des vorgesehenen Wirts, in dem die Nucleinsäure exprimiert werden soll, genutzt werden. Obgleich z.B. Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sowohl in monokotylen wie auch in dikotylen Pflanzenspezies exprimiert werden können, können Sequenzen modifiziert werden, um für spezifische Codonpräferenzen und GC-Gehaltspräferenzen von Monokotylen oder Dikotylen verantwortlich zu sein, da gezeigt wurde, dass diese Differenzen differieren (Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-498; und Campbell et al. (1990) Plant Physiol. 92:1). So kann das in Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure aus bekannten Gensequenzen aus Mais abgeleitet werden. Eine Maiscodonverwendung für 28 Gene aus Maispflanzen ist in Tabelle 4 von Murray et al., supra, aufgelistet.
- Beispiele für Gene, die für Rekombinasen codieren, die in Mais bevorzugte Codons verwenden, umfassen FLPm, das in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung 08/972 258 beschrieben wird, deren Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, und moCre, das in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt wird. FLPm stammt aus der Saccharomyces-2μ-Plasmid-FLP-Rekombinase, wird aber durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die in Mais bevorzugte Codons verwendet. Obgleich die FLPm-Nucleinsäuresequenz bevorzugte Codons für eine Expression von Aminosäuren in Mais enthält, ist einzusehen, dass eine nützliche Sequenz Codons enthalten kann, die in Mais mit weniger als den höchsten beschriebenen Mais-Codon-Häufigkeiten auftreten. Beispiele für Nucleinsäuren, die für chimäre Rekombinasen codieren, umfassen Cre:FLPm (SEQ. ID NO: 4), moCre:FLPm (SEQ. ID NO: 5), Cre:FLP (SEQ. ID NO: 7) und FLPm:Cre (SEQ. ID NO: 8).
- Die Erfindung stellt auch Expressionskassetten bereit, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, welche für eine chimäre ortsspezifische Rekombinase codiert, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert. Vorzugsweise ist der Promotor ein Pflanzenpromotor. Beispielsweise enthält der Pflanzenexpressionsvektor PHP13147, der in
1 gezeigt ist, eine Expressionskassette für Cre:FLPm, worin das Gen, das für die chimäre Rekombinase codiert, funktionell mit einem Ubiquitin-Promotor verknüpft ist. Der Ausdruck "funktionell verknüpft", wie er hier verwendet wird, umfasst die Bezugnahme auf eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz, wobei die Promotorsequenz eine Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nucleinsäuresequenzen, die verknüpft sind, fortlaufend sind und, wo es notwendig ist, zwei für Protein codierende Regionen verknüpfen, die kontinuierlich und im selben Leseraster sind. - Der Ausdruck "Promotor", wie er hier verwendet wird, beinhaltet die Bezugnahme auf eine DNA-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart und involviert bei der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen unter Initiierung einer Transkription. Ein "Pflanzen-Promotor" ist ein Promotor, der fähig ist, eine Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren. Beispiele für Pflanzen-Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die aus Pflanzen, Pflanzenviren und Bakterien-Genen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden, z.B. die von Agrobacterium oder Rhizobium, erhalten werden. Sowohl heterologe als auch nicht-heterologe (d.h. endogene) Promotoren können verwendet werden, um die Expression einer Sequenz, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, zu steuern. Der Promotor kann konstitutiv, induzierbar oder gewebespezifisch sein.
- In der vorliegenden Erfindung können viele verschiedene konstitutive Promotoren eingesetzt werden. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen die Promotoren aus Pflanzenviren, z.B. der 35S-Promotor aus CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) und die Promotoren aus solchen Genen, wie Reisaktin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); Mais-H3-Histon (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 und Atanassova et al. (1992) Plant Journal 2(3):291-300); der 1'- oder 2'-Promotor, der aus der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens stammt, der Smas-Promotor, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US-Patent Nr. 5 683 439), der Nos-Promotor, der Pemu-Promotor, der Rubisco-Promotor, der GRP1-8-Promotor, und andere Transkriptions-Initiationsregionen aus verschiedenen Pflanzengenen, die dem Fachmann bekannt sind. Der ALS-Promotor, ein XbaI/NcoI-Fragment 5-Primer zu dem Brassica napus-ALS3-Strukturgen (oder einer Nucleotidsequenz, die wesentliche Sequenzsimilarität zu dem XbaI/NcoI-Fragment hat) stellt einen besonders nützlichen konstitutiven Promotor dar (siehe die anhängige Pioneer Hi-Bred International-US-Patentanmeldung 08/409 297 und das entsprechende US-Patent Nr. 5 659 026, veröffentlicht am 19. August 1997).
- Eine Vielzahl von induzierbaren Promotoren kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Siehe Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Beispiele für induzierbare Promotoren umfassen den aus dem ACE1-System, der auf Kupfer anspricht (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); In2-Gen aus Mais, das auf Benzolsulfonamid-Herbizid-Gegenmittel anspricht (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 und Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); der Adh1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist, der Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und der PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist, oder Tet-Repressor aus Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227-237). Ein besonders bevorzugter induzierbarer Promotor ist ein Promotor, der auf ein induzierendes Mittel anspricht, auf das Pflanzen normalerweise nicht ansprechen. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor ist ein induzierbarer Promotor aus einem Steroidhormon-Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch ein Glucocorticosteroidhormon induziert wird (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10421).
- Beispiele für Promotoren unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die eine Transkription nur oder vorzugsweise in bestimmten Geweben, z.B. Blättern, Wurzeln, Früchten, Samen oder Blumen, initiieren. Die Funktion eines Promotors kann auch in Abhängigkeit von seiner Lage im Genom variieren. So kann ein induzierbarer Promotor an bestimmten Stellen vollständig oder partiell konstitutiv werden.
- Die chimäre Rekombinase muss für eine Integration der DNA von Interesse in das Wirtsgenom in der Pflanze exprimiert werden. Dementsprechend kann die Expressionskassette, die für die ortsspezifische Rekombinase codiert, in cis der DNA von Interesse; in trans an einem Wirtschromosom oder extrachromosomalen Replikon zugeführt werden oder kann in den Wirt transferiert werden und transient in der Nähe des Zeitpunkts, an dem eine Rekombination gewünscht wird, exprimiert werden.
- Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Transferkassetten, die Nucleotidsequenzen umfassen, welche für die chimären Rekombinasen der Erfindung codieren. Mit Trans ferkassette ist jede Nucleotidsequenz gemeint, die verwendet werden kann, um eine Zelle von Interesse zu transformieren. Beispielsweise kann die Transferkassette ein unabhängiges Replikon, z.B. ein Plasmid, Shuttlevektor, Ti-Plasmid, viraler Vektor oder dergleichen, sein. Alternativ könnte die Transferkassette eine Nucleinsäure sein, die nicht zur unabhängigen Replikation fähig ist, jedoch in einen Organismus von Interesse durch eine Vielzahl von Transformationsprotokollen, z.B. Partikelbeschuss, Elektroporation und dergleichen, transferiert werden könnte. So stellt die Erfindung eine Transferkassette bereit, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein rekombinantes Protein codiert, das eine erste ortsspezifische Rekombinase, fusioniert im Raster mit einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase, umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert.
- In den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung ist die DNA von Interesse von Targetstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen flankiert. Mit "flankiert von bzw. durch" ist gemeint, dass die Rekombinations- oder Targetstellen direkt fortlaufend mit der DNA von Interesse sein können, oder es kann eine oder es können mehrere intervenierende Sequenzen zwischen einem oder beiden Enden der DNA von Interesse und den ortsspezifischen Rekombinationsstellen vorliegen. Intervenierende Sequenzen von besonderem Interesse würden Linker, Adapter, selektierbare Marker und/oder andere Stellen, die eine Vektorkonstruktion oder Analyse und Expressionskassette für ein Gen von Interesse unterstützen, umfassen. Targetstellen für ortsspezifische Rekombinasen sind dem Fachmann bekannt und werden in der gleichzeitig anhängigen vorläufigen Anmeldung 60/065 613 diskutiert. Beispiele für Targetstellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, FRT, FRT1, FRTS, FRT6, FRT7, andere FRT-Mutanten, loxP, loxP-Mutanten und dergleichen. Siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Bd. 51, S. 53-91; Cox (1989) in Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American Society of Microbiology, Washington D.C., S. 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant und Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale und Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; und Dale et al. (1990) Gene 91:79-85.
- Mit "Targetstelle für eine ortsspezifische Rekombinase" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die durch eine bestimmte ortsspezifische Rekombinase erkannt wird. Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist eine Vielzahl von Rekombinationsstellen bekannt, und diese können in Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden. Die Stelle kann die Sequenz der verwandten Stelle für eine gegebene Rekombinase haben oder kann modifiziert sein, solange sie fähig ist, als Rekombinationsstelle zu wirken. Die Stelle kann die Minimalsequenzen enthalten, die für eine Rekombination erforderlich sind, oder sie kann zusätzliche Sequenzen enthalten, die eine Rekombination verstärken. Beispiele für Rekombinationsstellen zur Verwendung in der Erfindung sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen FRT- und loxP-Stellen. (Siehe zum Beispiel Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Bd. 51, S. 53-91; Michael M. Cox (1989) in Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American Society of Microbiology, Washington D.C., S. 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journa17:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant und Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale und Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; Hartley et al. (1980) Nature 286:860-864; Sauer (1994) Current Opinion in Baotechnology 5:521-527; und Dale et al. (1990) Gene 91:79-85).
- Jede loxP- und die FRT-Stelle enthält jeweils zwei invertierte Wiederholungen mit 13 Basenpaaren, die einen 8 Basenpaar-Spacer flankieren. Die FRT-Stelle enthält eine zusätzliche nicht-essentielle 13 Basenpaar-Wiederholung. Die Sequenzen der loxP- und FRT-Stellen sind in SEQ. ID NO: 1 und SEQ. ID NO: 2 gezeigt. Eine minimale FRT-Stelle (SEQ. ID NO: 10), die zwei 13 Basenpaar-Wiederholungen, getrennt durch einen 8 Basen-Spacer, umfasst, ist:
5'-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
worin die Nucleotide in den Klammern die Spacerregion anzeigen. Die Nucleotide in der Spacerregion können durch eine Kombination von Nucleotiden ersetzt werden, solange die zwei 13 Basen-Wiederholungen durch 8 Nucleotide getrennt werden. FLP ist eine konservative, ortsspezifische Rekombinase, die fähig ist, eine Inversion einer Nucleinsäuresequenz, die zwischen zwei umgekehrt orientierten FRTs positioniert ist; eine Rekombination zwischen zwei Molekülen, die jeweils eine FRT-Stelle enthalten; und eine Exzision zwischen FRT-Stellen zu katalysieren. Die Kernregion ist nicht symmetrisch, und ihre Asymmetrie diktiert die Steuerbarkeit der Reaktion. Eine Rekombination zwischen umgekehrten FRT-Stellen verursacht eine Umkehr einer DNA-Sequenz zwischen diesen, wohingegen eine Rekombination zwischen direkt orientierten Stellen zu einer Exzision der DNA zwischen ihnen führt. - Nucleotidsequenzen, enthaltend eine DNA von Interesse, flankiert durch Targetstellen, Transferkassetten für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen und Vektoren, die diese Sequenzen tragen, können unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken konstruiert werden. Siehe z.B. Sambrook et al. (Herausg.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989).
- Techniken zur Transformierung einer weiten Vielzahl von eukaryotischen Zellen, einschließlich höherer Pflanzenspezies, sind gut bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Siehe z.B. Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Diese Methoden sind zum Transformieren einer Pflanzzelle mit den chimären Rekombinase-Expressionskassetten der Erfindung und mit DNAs von Interesse, flankiert durch Targetstellen für die chimäre Rekombinase, einsetzbar. Die Expressionskassette, die für die ortsspezifische Rekombinase codiert, kann im Pflanzengenom vor der Transformation der DNA von Interesse vorliegen oder kann um den Zeitpunkt der Transformation mit der T-DNA in die Pflanzenzelle transformiert werden, so dass sie transient exprimiert werden wird. Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden, wobei Techniken, wie Elektroporation, PEG-Poration, Partikelbeschuss, Siliciumfaserabgabe oder Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten oder embryogenem Callus, verwendet werden.
- Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe z.B. Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984), Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803 (1983), Kado (1991), Crit. Rev. Plant Sci. 10:1, und Moloney et al. (1989), Plant Cell Reports 8:238. Obgleich Agrobacterium in erster Linie in Dikotylen verwendbar ist, können durch Agrobacterium auch bestimmte Monokotylen transformiert werden. Beispielsweise wird die Agrobacterium-Transformation von Mais in US-Patent Nr. 5 550 318 beschrieben. Andere Verfahren der Agroinfektion umfassen Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und Fuller in: Genetic Engineering, Bd. 6, PWJ Rigby, Herausg., London, Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C.P., und Draper, J., in: DNA Cloning, Bd. II, D.M. Glover, Herausg., Oxford, IRI Press, 1985), Anmeldung PCT/US87/02512 (WO 88/02405, veröffentlicht am 7. Apr. 1988) beschreibt die Verwendung von A. rhizogenes-Stamm A4 und seines Ri-Plasmids mit A. tumifaciens-Vektoren pARC8 oder pARC16.
- Optimierte Verfahren und Vektoren zur Agrobacterium-vermittelten Transformation von Pflanzen in der Graminae-Familie, z.B. Reis und Mais, wurden von Heath et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10:221-227; Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282 und Ishida et al. (1996) Nat. Biotech. 14:745-750, beschrieben. Die Effizienz der Maistransformation wird durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Typen und Stufen von Gewebe, das infiziert ist, der Konzentration von Agrobacterium, dem Gewebekulturmedium, den Ti-Vektoren und dem Mais-Genotyp beeinflusst. Superbinäre Vektoren, die die vir-Gene der Agrobacterium-Stämme A281 und A348 tragen, sind für eine hocheffiziente Transformation von Monokotylen einsetzbar.
- Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung der Polyethylenglykol-Präzipitation wird in Paszkowski et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984), beschrieben. Elektroporationstechniken werden in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5824 (1985), beschrieben.
- Ballistische Transformationstechniken werden in Klein et al., Nature 327:70-73 (1987), beschrieben.
- Virale Mittel zur Einführung von DNA in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Insbesondere ist eine Reihe von Vektorsystemen zur Einführung von fremden oder nativen Genen in Säugerzellen bekannt. Diese umfassen SV40-Virus (siehe z.B. Okayama et al. (1985) Molec. Cell Biol. 5:1136-1142); Rinder-Papillom-Virus (siehe z.B. DiMaio et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4030-4034); Adenovirus (siehe z.B. Morin et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626; Yifan et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405; Yang et al. (1996) Gene Ther. 3:137-144; Tripathy et al. (1996) Nat. Med. 2:545-550; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; Wagner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6099-6103; Curiel et al. (1992) Human Gene Therapy 3:147-154; Curiel (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-8854; LeGal LaSalle et al. (1993) Science 259:590-599; Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502); Adeno-assoziiertes Virus (siehe z.B. Muzyczka et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:1351; Xiao et al. (1996) J. Yirol. 70:8098-8108); Herpes simplex-Virus (siehe z.B. Geller et al. (1988) Science 241:1667; Huard et al. (1995) Gene Therapy 2:385-392; US-Patent Nr. 5 501 979); Vektoren auf Retrovirus-Basis (siehe z.B. Curran et al. (1982) J. Virol. 44: 674-682; Gazit et al. (1986) J. Virol. 60: 19-28; Miller, A. D. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24; Cavanaugh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7071-7075; Smith et al. (1990) Molecular and Cellular Biology 10:3268-3271). Siehe auch Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14338-14342; Wu und Wu, J. Biol Chem. (1988) 263:14621-14624; Wu et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987; Zenke et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3655-3659; Wagner et al. (1990) 87:3410-3414.
- DNA kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen in Pflanzen eingeführt werden, wie es von Zhou et al., Methods in Enrymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988), beschrieben ist. Eine Expression von Polypeptid-codierenden Genen kann durch Injektion der DNA in reproduktive Organe einer Pflanze erreicht werden, wie es von Pena et al., Nature, 325:274 (1987), beschrieben wird. DNA kann auch direkt in die Zellen unreifer Embryos injiziert werden und die Rehydration von getrockneten Embryos durchgeführt werden, wie bei Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); und Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham. Mass., S. 27-54 (1986) beschrieben. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Pflanzenviren bekannt, die als Vektoren verwendet werden können; diese umfassen Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), Geminivirus, Trespenmosaikvirus und Tabak-Mosaikvirus.
- Pflanzenzellen, die mit einer chimären Rekombinase-Expressionskassette stabil transformiert sind, können z.B. aus einzelnen Zellen, Callusgewebe oder Blattscheiben nach Standard-Pflanzengewebe-Kulturtechniken regeneriert werden. Auf dem Fachgebiet ist gut bekannt, dass verschiedene Zellen, Gewebe und Organe aus fast jeder Pflanze erfolgreich kultiviert wer den können, um eine ganze Pflanze zu regenerieren. Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten ist bei Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, S. 124-176 (1983); und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, S. 21-73 (1985), beschrieben.
- Die Regeneration von Pflanzen, die die rekombinanten Gene enthalten, kann erreicht werden, wie es von Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985), beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Schösslingen in der Pflanzenspezies, die transformiert wird, induziert, wachsen gelassen, wie es von Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983), beschrieben wird. Dieses Verfahren produziert typischerweise Schösslinge innerhalb von zwei bis vier Wochen, und diese Transformantenschösslinge werden dann auf ein geeignetes Wurzel-induzierendes Medium, das das selektive Mittel und ein Antibiotikum, um bakterielles Wachstum zu verhindern, enthält, transferiert. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung können fertil oder steril sein.
- Eine Regeneration kann auch aus Pflanzencallus, -explantaten, -Organen oder Teilen davon erhalten werden. Solche Regenerationstechniken sind allgemein bei Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987), beschrieben. Die Regeneration von Pflanzen entweder aus Einzelpflanzenprotoplasten oder verschiedenen Explantaten ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach und H. Weissbach, Herausg., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Dieser Regenerations- und Wachstumsprozess beinhaltet die Schritte der Selektion von Transformantenzellen und -Schösslingen, Bewurzeln der Transformantenschösslinge und Wachsenlassen der Pflänzchen in Erde. Für eine Maiszellkultur und eine Regeneration siehe allgemein The Maize Handbook Freeling und Walbot, Herausg., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3. Ausgabe, Sprague und Dudley, Herausg., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
- Ein Fachmann wird erkennen, dass, nachdem eine DNA, z.B. eine chimäre Rekombinase-Expressionskassette oder eine Targetstelle für eine chimäre Rekombinase, stabil in transgene Pflanzen eingebaut wurde und als funktionsfähig bestätigt wurde, sie durch sexuelle Kreuzung in andere Pflanzen eingeführt werden kann. Es kann eine beliebige einer Reihe von Standardzüchtungstechniken verwendet werden, die von der zu kreuzenden Spezies abhängen.
- Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind einsetzbar, um eine DNA von Interesse in das Genom einer beliebigen Wirtszelle, einschließlich eines Pflanzenwirts, zu integrieren. Der Ausdruck "Pflanze", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z.B. Blätter, Stängel, Wurzeln, usw.), Samen und Pflanzenzellen und die Nachkommenschaft derselben. Der Ausdruck Pflanzenzelle, wie er hierin verwendet wird, umfasst, ohne Beschränkung, Samen, Suspensionskulturen, Embryos, Meristemregionen, Callusgewebe, Blätter, Wurzeln, Schösslinge, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Die Pflanzenklasse, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, ist im All gemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich ist, einschließlich monokotylen und dikotylen Pflanzen. Eine besonders bevorzugte Monokotyle ist Mais. Andere Monokotyle von besonderem Interesse umfassen Weizen, Reis, Gerste, Sorghum und Roggen. Dikotyle von besonderem Interesse umfassen Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa und Saflor.
- Aufgrund der Verwendung der chimären ortsspezifischen Rekombinasen und Targetstellen, die hier bereitgestellt werden, können die Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren transformiert wurden, von anderen Transformationsverfahren unterscheidbar sein, da die modifizierten Zellen der Erfindung Nucleotidsequenzen von Interesse insertiert in das Genom, flankiert durch Targetstellen für verschiedene Rekombinasen, enthalten werden.
- Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, nicht zur Beschränkung angeführt.
- EXPERIMENTELLER TEIL
- Beispiel 1
- Konstruktion von Vektoren, die eine DNA von Interesse, flankiert durch Targetstellen für eine chimäre ortsspezifische Rekombinase, enthalten
- DNA-Fragmente, die eine DNA von Interesse flankiert durch loxP- und FRT-Targetstellen enthalten, werden entweder durch Synthetisieren, Anlagern und Ligieren komplementärer Oligonucleotide oder durch Erzeugung von Primern zur PCR-Amplifikation einer DNA von Interesse, die loxP- und FRT-Stellen zusätzlich zu Restriktionsstellen, die zur Klonierung in einen Vektor der Wahl einsetzbar sind, enthält, konstruiert.
- Beispielsweise können lange PCR-Primer entwickelt werden, in denen das 3'-Ende des Primers an das 5'-Ende der DNA von Interesse hybridisiert und das 5'-Ende des Primers außerdem loxP- oder FRT-Stellen und nützliche Klonierungsstellen enthält. Das resultierende PCR-Produkt wird mit dem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und in einen geeigneten Vektor insertiert.
- Beispiel 2
- Exzision einer FRT-Stelle durch FLPm und die Cre:FLPm-chimäre Rekombinase Eine Transferkassette, die für eine Cre-FLPm-chimäre Rekombinase codiert, wurde in Pflanzenzellen transformiert, die eine Expressionskassette haben, welche für GUS, angetrieben durch den Ubiquitin-Promotor, codiert, wobei eine Sequenz durch identische FRT- oder loxP-Stellen flankiert wird, die das offene GUS-Leseraster unterbrechen.
2 und3 zeigen, dass die Cre-FLPm-chimäre Rekombinase entweder an der FRT-Stelle oder der loxP-Stelle unabhängig funktionell ist, was durch die Fähigkeit, GUS-Aktivität nach Exzision von Sequenzen zwischen zwei identischen Targetstellen zu aktivieren, wodurch die GUS-Aktivität unter die Kontrolle des Ubiquitin-Promotors gestellt wird, gemessen wird. - Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt werden, sind ein Hinweis für den Level des Fachmanns auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört.
- Obgleich die vorstehend beschriebene Erfindung durch Erläuterung und Beispiel zu Zwecken eines klaren Verständnisses detailliert beschrieben wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.
Claims (46)
- Rekombinantes Protein, umfassend eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase.
- Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase Glieder der Integrasefamilie von Rekombinasen, ein aktives Derivat eines Glieds der Integrasefamilie von Rekombinasen oder ein aktives Fragment eines Glieds der Integrasefamilie von Rekombinasen sind, wobei die Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment eine konservative ortsspezifische Rekombination katalysiert.
- Rekombinantes Protein nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite unterschiedliche Rekombinase ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cre, FLP, einem aktiven Derivat von Cre und einem aktiven Fragment von Cre, einem aktiven Fragment von FLP und einem aktiven Derivat von FLP, wobei die Rekombinase, das aktive Fragment oder das aktive Derivat eine konservative ortsspezifische Rekombination katalysiert.
- Rekombinantes Protein, das die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS : 3, 6, 9 und 11, umfasst.
- Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase codiert, umfasst.
- Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz für die erste und die unterschiedliche zweite ortsspezifische Rekombinase nach Anspruch 2, 3 oder 4 codiert.
- Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die erste oder zweite unterschiedliche Rekombinase Cre oder FLP umfasst, wobei die Cre-Rekombinase durch SEQ ID NO: 2, ein aktives Fragment von SEQ ID NO: 2 oder ein aktives Derivat von SEQ ID NO: 2 codiert wird und die FLP-Rekombinase durch FLPm, ein aktives Fragment von FLPm oder ein aktives Derivat von FLPm codiert wird, wobei das aktive Fragment oder Derivat für eine Rekombinase codiert, die fähig ist, ein konservatives, ortsspezifisches Rekombinationsereignis zu katalysierten.
- Nukleinsäuremolekül, das SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7 oder 8 umfasst.
- Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Molekül funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert.
- Eukaryotische Zelle, die das Nukleinsäuremolekül, wie es in einem der Ansprüche 5 bis 9 definiert ist, stabil in ihr Genom eingebaut hat.
- Eukaryotische Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
- Eukaryotische Zelle nach Anspruch 11, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
- Eukaryotische Zelle nach Anspruch 12, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
- Eukaryotische Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle aus einer Dikotyle stammt.
- Eukaryotische Zelle nach Anspruch 14, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume oder Saflor ist.
- Pflanze, die in ein Chromosom wenigstens eine Integrationsstelle, die eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase umfasst, stabil integriert hat, wobei die Targetstellen aneinander angrenzend sind.
- Pflanze nach Anspruch 16, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
- Pflanze nach Anspruch 17, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
- Pflanze nach Anspruch 16, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
- Pflanze nach Anspruch 19, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor ist.
- Transformierter Samen aus der Pflanze nach einem der Ansprüche 16 bis 20.
- Pflanze nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die Pflanze eine Pflanzenzelle ist.
- Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse von einer Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und einer Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die Targetstellen umfasst, welche den Targetstellen entsprechen, die die DNA von Interesse flankieren; und (b) Bereitstellen in der genannten eukaryotischen Zelle ein rekombinantes Protein, das die erste Rekombinase, ein aktives Derivat der ersten Rekombinase oder ein aktives Fragment der ersten Rekombinase im Raster fusioniert mit der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, einem aktiven Derivat der zweiten unterschiedlichen Rekombinase oder einem aktiven Fragment der zweiten unterschiedlichen Rekombinase umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert, wobei die DNA von Interesse an der Integrationsstelle in das Genom integriert wird.
- Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA von Interesse flankieren; und (b) Bereitstellen in der Zelle der ersten Rekombinase, eines aktiven Derivats der ersten Rekombinase oder eines aktiven Fragments der ersten Rekombinase und der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, eines aktiven Derivats der zweiten Rekom binase oder eines aktiven Fragments der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, wobei die erste und zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert.
- Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
- Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Pflanzenzelle monokotyl oder dikotyl ist.
- Verfahren nach Anspruch 26, wobei die monokotyle Pflanzenzelle aus Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen stammt und die dikotyle Pflanzenzelle aus Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor stammt.
- Verfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25, wobei die erste Rekombinase Cre, ein aktives Derivat von Cre oder ein aktives Fragment von Cre ist und die zweite Rekombinase FLP, ein aktives Derivat von FLP oder ein aktives Fragment von FLP-Rekombinase ist, wobei die Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert.
- Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase ein aktives Derivat von Cre umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase ein aktives Fragment von Cre umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase Cre umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase ein aktives Derivat von FLP umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase ein aktives Fragment von FLP umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase FLP umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase Cre umfasst und die zweite ortsspezifische Rekombinase FLP umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die FLP-Rekombinase durch FLPm codiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die Cre-Rekombinase durch SEQ ID NO: 2 codiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 23, wobei das rekombinante Protein durch SEQ ID NO: 4, 5, 7 oder 8 codiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 23, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase an den Amino-Terminus der zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase fusioniert ist.
- Verfahren nach Anspruch 23, wobei die zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase an den Amino-Terminus der ersten ortsspezifischen Rekombinase fusioniert ist.
- Pflanze, die in ihr Genom das Nukleinsäuremolekül, wie es in einem der Ansprüche 5 bis 9 definiert ist, stabil eingebaut hat.
- Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
- Pflanze nach Anspruch 42, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
- Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Pflanze aus einer Dikotyle ist.
- Pflanze nach Anspruch 49, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor ist.
- Transformierter Samen aus der Pflanze nach einem der Ansprüche 41 bis 45.
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US6561397P | 1997-11-18 | 1997-11-18 | |
US6562797P | 1997-11-18 | 1997-11-18 | |
US65627P | 1997-11-18 | ||
US65613P | 1997-11-18 | ||
US9943598P | 1998-09-08 | 1998-09-08 | |
US99435P | 1998-09-08 | ||
PCT/US1998/024608 WO1999025840A1 (en) | 1997-11-18 | 1998-11-17 | A novel method for the integration of foreign dna into eukaryoticgenomes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69833457D1 DE69833457D1 (de) | 2006-04-20 |
DE69833457T2 true DE69833457T2 (de) | 2006-09-14 |
Family
ID=27370819
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69833457T Expired - Lifetime DE69833457T2 (de) | 1997-11-18 | 1998-11-17 | Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6262341B1 (de) |
EP (1) | EP1032680B1 (de) |
AT (1) | ATE317440T1 (de) |
AU (1) | AU745960C (de) |
BR (1) | BR9814669A (de) |
CA (1) | CA2306188C (de) |
DE (1) | DE69833457T2 (de) |
DK (1) | DK1032680T3 (de) |
ES (1) | ES2256972T3 (de) |
NZ (1) | NZ504511A (de) |
PT (1) | PT1032680E (de) |
WO (1) | WO1999025840A1 (de) |
Families Citing this family (235)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6964861B1 (en) | 1998-11-13 | 2005-11-15 | Invitrogen Corporation | Enhanced in vitro recombinational cloning of using ribosomal proteins |
US6143557A (en) * | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Life Technologies, Inc. | Recombination cloning using engineered recombination sites |
US6720140B1 (en) | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
US5851808A (en) | 1997-02-28 | 1998-12-22 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
US7119250B2 (en) * | 1997-06-03 | 2006-10-10 | The University Of Chicago | Plant centromere compositions |
IL135776A0 (en) * | 1997-10-24 | 2001-05-20 | Life Technologies Inc | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
US7351578B2 (en) * | 1999-12-10 | 2008-04-01 | Invitrogen Corp. | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
US6632980B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
CN101125873A (zh) * | 1997-10-24 | 2008-02-20 | 茵维特罗根公司 | 利用具重组位点的核酸进行重组克隆 |
DE69841438D1 (de) | 1997-11-18 | 2010-02-25 | Pioneer Hi Bred Int | Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme |
CA2306184C (en) * | 1997-11-18 | 2007-05-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for genetic modification of plants |
US7102055B1 (en) * | 1997-11-18 | 2006-09-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for the targeted insertion of a nucleotide sequence of interest into the genome of a plant |
AU3928899A (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-16 | Novartis Ag | Site-directed transformation of plants |
AU774643B2 (en) | 1999-03-02 | 2004-07-01 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids |
US6746870B1 (en) | 1999-07-23 | 2004-06-08 | The Regents Of The University Of California | DNA recombination in eukaryotic cells by the bacteriophage PHIC31 recombination system |
NZ539430A (en) * | 1999-12-10 | 2006-09-29 | Invitrogen Corp | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
ATE361986T1 (de) | 1999-12-16 | 2007-06-15 | Cropdesign Nv | Optimierter t-dna transfer und entsprechende vektoren |
US20020023278A1 (en) * | 2000-05-08 | 2002-02-21 | Lyznik Leszek Alexander | Genetic transformation in plants using site-specific recombination and wide hybridization |
US7244560B2 (en) | 2000-05-21 | 2007-07-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
US6936747B2 (en) * | 2000-07-21 | 2005-08-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Methods for the replacement, translocation and stacking of DNA in eukaryotic genomes |
EP1307570A2 (de) * | 2000-07-28 | 2003-05-07 | The University of Connecticut | Methoden zum kontrollierten, automatischen ausschneiden einer heterologen dns in einer transgenen pflanze und verwendung einer dns-ausschneinenden genkassette |
US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
US7560622B2 (en) * | 2000-10-06 | 2009-07-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions relating to the generation of partially transgenic organisms |
DE10114209A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-12-05 | Icon Genetics Ag | Ortsgerichtete Transformation durch Verwendung von Amplifikationsvektoren |
EP1390394A4 (de) * | 2001-04-19 | 2004-05-26 | Invitrogen Corp | Zusammensetzungen und verfahren zur rekombinationsklonierung von nukleinsäuremolekülen |
JP2004532636A (ja) * | 2001-05-21 | 2004-10-28 | インヴィトロジェン コーポレーション | 核酸分子の単離に用いるための組成物および方法 |
EP1390384A4 (de) * | 2001-05-30 | 2005-08-17 | Chromos Molecular Systems Inc | Plattformen auf chromosomgrundlage |
SG182847A1 (en) * | 2001-05-30 | 2012-08-30 | Agrisoma Inc | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
US20030082591A1 (en) * | 2001-07-24 | 2003-05-01 | Donald Awrey | Methods for gene disruption and uses thereof |
WO2003083045A2 (en) | 2002-03-29 | 2003-10-09 | Syngenta Participations Ag | Lambda integrase mediated recombination in plants |
US7164056B2 (en) * | 2002-05-03 | 2007-01-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene targeting using replicating DNA molecules |
US8304233B2 (en) | 2002-06-04 | 2012-11-06 | Poetic Genetics, Llc | Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same |
US7476777B2 (en) * | 2002-09-17 | 2009-01-13 | Ceres, Inc. | Biological containment system |
EP1405908A1 (de) * | 2002-10-04 | 2004-04-07 | ProBioGen AG | Herstellung von Zelllinien zur heterologen Expression |
US20040137624A1 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Lowe Brenda A. | Methods of site-directed transformation |
CA2662092C (en) | 2003-04-29 | 2012-07-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes |
EP1644538A4 (de) * | 2003-06-26 | 2006-11-08 | Invitrogen Corp | Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von promotoraktivität und zur expression von fusionsproteinen |
DE602004027538D1 (de) | 2003-12-01 | 2010-07-15 | Life Technologies Corp | Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon |
US7935862B2 (en) * | 2003-12-02 | 2011-05-03 | Syngenta Participations Ag | Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination |
WO2005059148A1 (en) * | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Recombinase mediated gene traps |
BRPI0512904A (pt) | 2004-06-30 | 2008-04-15 | Pioneer Hi Bred Int | método para o aumento da resistência de plantas a patógenos de fungo |
US7306946B2 (en) | 2004-07-02 | 2007-12-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antifungal polypeptides |
ES2653843T3 (es) * | 2004-09-02 | 2018-02-09 | Wyeth Llc | Sistemas y procedimientos de producción de proteínas |
BRPI0612862A2 (pt) | 2005-07-18 | 2010-11-30 | Pioneer Hi Bred Int | polinucleotìdeo isolado, método para obtenção de uma célula transformada, método para obtenção de uma planta transformada, método de produção de recombinação de dna de sìtio especìfico, biblioteca isolada, método de geração de biblioteca de moléculas e método para selecionar sìtio de recombinação frt modificado |
US20070107084A1 (en) | 2005-11-10 | 2007-05-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Dof (DNA binding with one finger) sequences and methods of use |
US20070143881A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and Compositions for Improving the Efficiency of Site-Specific Polynucleotide Exchange |
US8058509B2 (en) * | 2005-12-21 | 2011-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for in planta production of inverted repeats |
CA2638739A1 (en) | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions related to the quantitative trait locus 6 (qtl6) in maize and methods of use |
EP2251349A1 (de) | 2006-04-19 | 2010-11-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Isolierte Polynukleotidmoleküle, welche Mutanten- und Wildtypallelen des D9-Gens aus Mais entsprechen, und Verwendungsmethoden |
MX2008014405A (es) | 2006-05-09 | 2009-01-27 | Univ Missouri | Plataformas de cromosomas artificiales de plantas por medio de truncamiento de telomeros. |
EP2027276B1 (de) | 2006-05-16 | 2011-02-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antimykotische polypeptide |
CN101490267B (zh) | 2006-05-17 | 2013-04-17 | 先锋高级育种国际公司 | 人工植物微染色体 |
US7951995B2 (en) | 2006-06-28 | 2011-05-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof |
US9206397B2 (en) * | 2006-07-07 | 2015-12-08 | The Fred Hutchinson Cancer Research Center | High efficiency FLP site-specific recombination in mammalian cells using an optimized FLP gene |
EP1942192A1 (de) * | 2007-01-08 | 2008-07-09 | Heinrich-Pette-Institut für experimentelle Virologie und Immunologie | Verwendung einer massgeschneiderten Recombinase für die Behandlung einer retroviralen Erkrankung |
EP2124522B1 (de) | 2007-02-05 | 2011-11-16 | National University of Singapore | Mutmasslicher cytokininrezeptor und verfahren für seine verwendung |
US20100154076A1 (en) | 2007-05-25 | 2010-06-17 | Cropdesign N.V. | Yield Enhancement In Plants By Modulation of Maize Alfins |
EP2568048A1 (de) | 2007-06-29 | 2013-03-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Verfahren zur Veränderung des Genoms einer Zelle von Einkeimblättrigen |
EP2031067A1 (de) * | 2007-08-30 | 2009-03-04 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Herstellung von genetisch modifizierten Aktinomyceten durch Rekombination |
US8367895B2 (en) | 2008-01-17 | 2013-02-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for the suppression of target polynucleotides from the family aphididae |
US8847013B2 (en) | 2008-01-17 | 2014-09-30 | Pioneer Hi Bred International Inc | Compositions and methods for the suppression of target polynucleotides from lepidoptera |
BR122018010813B1 (pt) | 2008-02-29 | 2023-12-19 | Monsanto Technology Llc | Cromossomo, alimento processado ou produto alimentício de milho processado, métodos de detecção da presença de sequências em uma amostra de tecido de milho e para obtenção de uma planta de milho tolerante a déficit de água que carece de um gene marcador selecionável e polinucleotídeo |
CA2718517A1 (en) * | 2008-03-26 | 2009-10-01 | Iti Scotland Limited | Efficient insertion of dna into embryonic stem cells |
CN102216453B (zh) | 2008-09-26 | 2014-02-05 | 巴斯夫农化产品有限公司 | 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法 |
CA2743707A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1 |
US8293533B2 (en) | 2008-12-19 | 2012-10-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific integration and stacking of transgenes in soybean via DNA recombinase mediated cassette exchange |
EP3156489B1 (de) | 2009-01-22 | 2019-03-06 | Syngenta Participations Ag | Mutierte hydroxylphenylpyruvat-dioxygenase-polypeptide und verfahren zur verwendung |
WO2011068567A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-06-09 | Syngenta Participations Ag | Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use |
GB2467167B (en) * | 2009-01-26 | 2013-09-11 | Algentech Sas | Gene targeting in plants |
WO2010096613A1 (en) | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production |
EP2427481A1 (de) | 2009-05-04 | 2012-03-14 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Ertragssteigerung in pflanzen durch modulation des ap2-transkriptionsfaktors |
WO2010147825A1 (en) | 2009-06-09 | 2010-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Early endosperm promoter and methods of use |
BR112012008078A2 (pt) | 2009-08-21 | 2017-07-04 | Beeologics Inc | prevenção e cura de doenças de inseto benéfico por meio de moléculas transcritas de planta. |
EP3098317B1 (de) | 2009-08-28 | 2018-08-22 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Zusammensetzungen und verfahren zur insektenschädlingsbekämpfung |
WO2011056544A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Somatic ovule specific promoter and methods of use |
AU2010339404B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-01-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants |
AU2010339481B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-02-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for targeted polynucleotide modification |
WO2011094199A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polynucleotide and polypeptide sequences associated with herbicide tolerance |
WO2011133387A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene switch compositions and methods of use |
MX2012012672A (es) | 2010-05-06 | 2012-12-17 | Du Pont | Gen y proteina acc sintasa 3 de maiz y sus usos. |
EP2576798B1 (de) * | 2010-05-27 | 2016-04-27 | Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - | Massgeschneiderte rekombinase zur rekombination asymmetrischer zielorte in mehreren retrovirenstämmen |
EP2584887B1 (de) | 2010-06-25 | 2018-05-30 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der resistenz gegenüber turcicum-blattdürre bei mais |
AU2011289283B2 (en) | 2010-08-13 | 2015-04-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Chimeric promoters and methods of use |
US8865967B2 (en) | 2010-08-23 | 2014-10-21 | Pioneer Hi Bred International Inc | Defensin variants and methods of use |
WO2012071039A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Pioner Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
UA122558C2 (uk) | 2010-11-24 | 2020-12-10 | Піонер Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Рослина brassica, яка є стійкою до гліфосату, та спосіб її одержання |
AR083029A1 (es) | 2010-12-09 | 2013-01-23 | Syngenta Participations Ag | Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas |
TWI667347B (zh) | 2010-12-15 | 2019-08-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 大豆品種syht0h2及偵測其之組合物及方法 |
WO2012092106A1 (en) | 2010-12-28 | 2012-07-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
US9109231B2 (en) | 2011-02-11 | 2015-08-18 | Pioneer Hi Bred International Inc | Synthetic insecticidal proteins active against corn rootworm |
MX344356B (es) | 2011-02-15 | 2016-12-14 | Pioneer Hi Bred Int | Promotores preferidos para raices y metodos de uso. |
US8878007B2 (en) | 2011-03-10 | 2014-11-04 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
EA201391373A1 (ru) * | 2011-03-23 | 2014-07-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Способы получения сложного локуса трансгенных признаков |
US9090906B2 (en) | 2011-03-30 | 2015-07-28 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use |
WO2012142311A1 (en) | 2011-04-15 | 2012-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Self-reproducing hybrid plants |
BR112013025567B1 (pt) | 2011-04-27 | 2021-09-21 | Amyris, Inc | Métodos para modificação genômica |
US9062317B2 (en) | 2011-05-09 | 2015-06-23 | E I Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions for silencing gene families using artificial microRNAs |
US9150625B2 (en) | 2011-05-23 | 2015-10-06 | E I Du Pont De Nemours And Company | Chloroplast transit peptides and methods of their use |
MX2013015174A (es) | 2011-06-21 | 2014-09-22 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos y composiciones para producir plantas esteriles masculinas. |
WO2013019411A1 (en) | 2011-08-03 | 2013-02-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions for targeted integration in a plant |
AU2012301912A1 (en) | 2011-08-31 | 2014-03-06 | E. I. Dupont De Nemours & Company | Methods for tissue culture and transformation of sugarcane |
WO2013063344A1 (en) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Engineered pep carboxylase variants for improved plant productivity |
MX2014004958A (es) | 2011-10-28 | 2014-10-17 | Du Pont | Metodos y composiciones para silenciar genes mediante el uso de microarn artificiales. |
US9006515B2 (en) | 2012-01-06 | 2015-04-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Pollen preferred promoters and methods of use |
CN104039967A (zh) | 2012-01-06 | 2014-09-10 | 先锋高级育种国际公司 | 筛选植物的在植物中诱导孤雌生殖的遗传元件的方法 |
WO2013103371A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
BR112014017196A2 (pt) | 2012-01-11 | 2017-06-13 | The Australian National University | métodos para a modulação ou inibição da modulação da arquitetura da raiz de uma planta, planta, planta transgênica, peptídeo regulador de arquitetura de raiz isolado (rar), polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, célula hospedeira transgênica e promotor de planta isolado |
AR089793A1 (es) | 2012-01-27 | 2014-09-17 | Du Pont | Metodos y composiciones para generar locus de rasgos transgenicos complejos |
EA031448B1 (ru) | 2012-02-16 | 2019-01-31 | Зингента Партисипейшнс Аг | Сконструированные пестицидные белки |
WO2013134499A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | The Johns Hopkins University | Anastasis biosensor |
DK2839013T3 (da) | 2012-04-18 | 2020-09-14 | Univ Leland Stanford Junior | Ikke-disruptiv-gen-targetering |
WO2013166113A1 (en) | 2012-05-04 | 2013-11-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods comprising sequences having meganuclease activity |
US20130337442A1 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic loci associated with soybean cyst nematode resistance and methods of use |
WO2013188291A2 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods and compositions involving als variants with native substrate preference |
CA2890235A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-27 | Syngenta Participations Ag | Biological control of coleopteran pests |
WO2014042923A1 (en) | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Indiana University Research & Technology Corporation | Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof |
US20140109259A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi Bred International Inc | Guard Cell Promoters and Uses Thereof |
CN104884625A (zh) | 2012-10-15 | 2015-09-02 | 先锋国际良种公司 | 增强cry内毒素的活性的方法和组合物 |
US20140173775A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants |
WO2014100525A2 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for auxin-analog conjugation |
WO2014116989A1 (en) | 2013-01-25 | 2014-07-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-032218-9 and methods for detection thereof |
CA2905399A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions employing a sulfonylurea-dependent stabilization domain |
WO2014164775A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions to improve the spread of chemical signals in plants |
US9273322B2 (en) | 2013-03-12 | 2016-03-01 | Pioneer Hi Bred International Inc | Root-preferred promoter and methods of use |
US9803214B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility |
CA2905289C (en) | 2013-03-12 | 2023-03-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for the identification of variant recognition sites for rare-cutting engineered double-strand-break-inducing agents and compositions and uses thereof |
US9243258B2 (en) | 2013-03-12 | 2016-01-26 | Pioneer Hi Bred International Inc | Root-preferred promoter and methods of use |
EA028528B1 (ru) | 2013-03-13 | 2017-11-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Внесение глифосата для борьбы с сорняками у brassica |
BR112015023268A2 (pt) | 2013-03-13 | 2018-05-02 | Du Pont | método para reduzir a expressão, construto de dna, método de obtenção de célula vegetal, método de obtenção de planta transgênica ou uma parte de planta |
US20140289906A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use |
AU2014236162A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-17 | Arzeda Corp. | Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use |
CN115960896A (zh) | 2013-03-14 | 2023-04-14 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫害虫的组合物和方法 |
WO2014150914A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
EP3010582B1 (de) | 2013-06-21 | 2021-04-28 | Newsouth Innovations Pty Limited | Verfahren und vorrichtung zur nahfeldelektroporation |
US11459579B2 (en) | 2013-07-09 | 2022-10-04 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Transgenic plants produced with a K-domain, and methods and expression cassettes related thereto |
US10570409B2 (en) | 2013-07-09 | 2020-02-25 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Transgenic plants produced with a K-domain, and methods and expression cassettes related thereto |
EP3027756A1 (de) | 2013-07-31 | 2016-06-08 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Modifizierung der sojabohnensamenzusammensetzung zur optimierung von futter-, nahrungsmitteln und anderen industrielle anwendungen von sojabohnenprodukten |
BR112016002596B1 (pt) | 2013-08-08 | 2023-03-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira bacteriana, polipeptídeo isolado, composição, método para controlar uma população, método para matar uma praga, método para produzir um polipeptídeo, método para produzir uma planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta, método para exterminar ou controlar uma população |
EA030896B1 (ru) | 2013-08-16 | 2018-10-31 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
WO2015038622A1 (en) | 2013-09-11 | 2015-03-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
AU2014336957B2 (en) | 2013-10-16 | 2018-07-12 | The Australian National University | Method for modulating plant growth |
US10329578B2 (en) | 2013-10-18 | 2019-06-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate-N-acetyltransferase (GLYAT) sequences and methods of use |
CA2928830A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | Shai J. Lawit | Self-reproducing hybrid plants |
US9476065B2 (en) | 2013-12-19 | 2016-10-25 | Amyris, Inc. | Methods for genomic integration |
US10227608B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-03-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
WO2015143177A1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genome editing without nucleases |
AR100159A1 (es) | 2014-04-22 | 2016-09-14 | Du Pont | Genes de anhidrasa carbónica plastídica para el incremento de aceite en semillas con expresión incrementada de dgat |
WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
US20170218384A1 (en) | 2014-08-08 | 2017-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
EP2993229A1 (de) | 2014-09-02 | 2016-03-09 | Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - | Verträgliche und hochspezifische massgeschneiderte Rekombinase zur Rekombination asymmetrischer Zielorte in mehreren Retrovirenstämmen |
CA2956487A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use |
CA2961733A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
CN106852153B (zh) | 2014-10-16 | 2023-06-06 | 先锋国际良种公司 | 具有广谱活性的杀昆虫多肽和其用途 |
EP3207050A4 (de) | 2014-10-16 | 2018-09-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insektizide polypeptide mit verbessertem wirkungsspektrum und verwendungen davon |
US10435706B2 (en) | 2014-10-16 | 2019-10-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
RU2741833C2 (ru) | 2014-12-12 | 2021-01-29 | Зингента Партисипейшнс Аг | Композиции и способы контроля вредителей растений |
WO2016100333A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal microrna carriers and use thereof |
WO2016100309A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Restoration of male fertility in wheat |
WO2016099916A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
CN107109414A (zh) | 2014-12-23 | 2017-08-29 | 先正达参股股份有限公司 | 鞘翅目有害生物的生物控制 |
CN107529763B (zh) | 2015-03-11 | 2021-08-20 | 先锋国际良种公司 | Pip-72的杀昆虫组合及使用方法 |
WO2016149352A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Pioneer Hi-Bred International Inc | Methods and compositions for accelerated trait introgression |
EP3091076A1 (de) | 2015-05-07 | 2016-11-09 | Limagrain Europe | Für die haploide induktion in maispflanzen verantwortliches polynukleotid und zugehörige verfahren |
CN108064233B (zh) | 2015-05-19 | 2022-07-15 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
CA2994676A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
ES2773072T3 (es) | 2015-08-28 | 2020-07-09 | Pioneer Hi Bred Int | Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum |
WO2021257206A1 (en) | 2020-06-17 | 2021-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Generating maize plants with enhanced resistance to northern leaf blight |
WO2017066597A1 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Generating maize plants with enhanced resistance to northern leaf blight |
BR112018007796A2 (pt) | 2015-11-06 | 2018-10-30 | Du Pont | plantas de soja, partes de plantas de soja ou sementes de soja, método para selecionar uma célula de soja, métodos de seleção de uma célula de soja e de produção de um locus e molécula de ácido nucleico |
US11104911B2 (en) | 2015-12-22 | 2021-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Embryo-preferred Zea mays promoters and methods of use |
MX2018011298A (es) | 2016-03-18 | 2019-03-07 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos y composiciones para producir gametos clonados, sin reducir, sin recombinar. |
CN117003840A (zh) | 2016-04-14 | 2023-11-07 | 先锋国际良种公司 | 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途 |
WO2017184673A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
EA201892293A1 (ru) | 2016-05-04 | 2019-04-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
JP7093310B2 (ja) | 2016-05-18 | 2022-06-29 | アミリス, インコーポレイテッド | 外因性ランディングパッドへの核酸のゲノム組込みのための組成物および方法 |
CN109312359A (zh) | 2016-06-16 | 2019-02-05 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
MX2018015900A (es) | 2016-06-24 | 2019-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de planta y metodos para usarlos. |
EP3954202A1 (de) | 2016-07-01 | 2022-02-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insektizide proteine aus pflanzen und verfahren zu deren verwendung |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
AR109205A1 (es) | 2016-08-05 | 2018-11-07 | Syngenta Participations Ag | Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn |
AR109206A1 (es) | 2016-08-05 | 2018-11-07 | Syngenta Participations Ag | Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn |
WO2018076335A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance |
CN109863167B (zh) | 2016-11-01 | 2022-12-23 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
US11650201B2 (en) | 2016-11-16 | 2023-05-16 | The Johns Hopkins University | Anastasis biosensor |
US11174295B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-11-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
US11213028B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
MX2019009371A (es) | 2017-02-08 | 2019-09-23 | Pionner Hi Bred Int Inc | Combinaciones insecticidas de proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso. |
RU2019140646A (ru) | 2017-05-11 | 2021-06-11 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
UA126971C2 (uk) | 2017-05-26 | 2023-03-01 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Інсектицидний поліпептид з поліпшеним спектром активності і його застосування |
CN110914414A (zh) | 2017-06-14 | 2020-03-24 | 德累斯顿工业大学 | 利用设计dna重组酶遗传改变基因组的方法与手段 |
WO2019049111A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | R. J. Reynolds Tobacco Company | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EXPRESSION OF GENES OF INTEREST IN A PLANT BY CO-EXPRESSION WITH P21 |
CA3076831A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
WO2019074598A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE |
AR113761A1 (es) | 2017-10-18 | 2020-06-10 | Syngenta Participations Ag | Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn |
WO2019099769A1 (en) | 2017-11-16 | 2019-05-23 | The Johns Hopkins University | Anastasis biosensor caspase tracker |
BR112020012477A2 (pt) | 2017-12-19 | 2020-11-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | polipeptídeo recombinante; polipeptídeo inseticida recombinante; composição agrícola; construto de dna; célula hospedeira; planta transgênica; método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto ou população de praga; método para controlar a infestação de praga; e método para melhorar o rendimento de uma cultura |
BR112020016306A2 (pt) | 2018-02-12 | 2020-12-15 | Curators Of The University Of Missouri | Gene (saur) suprarregulado pequeno de auxina para o melhoramento da arquitetura do sistema radicular da planta, tolerância ao encharcamento, resistência à seca, e rendimento |
CA3091431A1 (en) | 2018-02-26 | 2019-08-29 | Devgen Nv | Control of insect pests using rna molecules |
WO2019169150A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
WO2019178042A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CA3092075A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
EP3784784A1 (de) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Devgen NV | Bekämpfung von insektenschädlingen mithilfe von rna-molekülen |
US11702668B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
EP3833747A1 (de) | 2018-06-28 | 2021-06-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Verfahren zur erzeugung transformierter pflanzen |
MX2021002290A (es) | 2018-08-29 | 2021-04-28 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
AU2019369415A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for Ochrobactrum-mediated plant transformation |
AU2020234553A1 (en) | 2019-03-11 | 2021-07-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for clonal plant production |
WO2020187798A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Devgen Nv | Control of insect pests using rna molecules |
US20220170033A1 (en) | 2019-03-27 | 2022-06-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant explant transformation |
CA3127173A1 (en) | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Modified agrobacterium strains and use thereof for plant transformation |
US20220240467A1 (en) | 2019-04-18 | 2022-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Embryogenesis factors for cellular reprogramming of a plant cell |
EP3831939A1 (de) * | 2019-12-06 | 2021-06-09 | Technische Universität Dresden | Fusion von stellenspezifischen rekombinasen zur effizienten und spezifischen genom-editierung |
TW202142114A (zh) | 2020-02-04 | 2021-11-16 | 美商陶氏農業科學公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法 |
BR112022018442A2 (pt) | 2020-03-15 | 2022-11-22 | Proteinea Inc | Produção de proteína recombinante em insetos |
US20230220409A1 (en) | 2020-06-12 | 2023-07-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Alteration of seed composition in plants |
US20230235352A1 (en) | 2020-07-14 | 2023-07-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
WO2022035653A2 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for enhancing resistance to northern leaf blight in maize |
BR112023002603A2 (pt) | 2020-08-10 | 2023-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de plantas e métodos de uso dos mesmos |
JP2023544016A (ja) | 2020-09-30 | 2023-10-19 | パイオニア ハイ-ブレッド インターナショナル, インコーポレイテッド | 単子葉外植片の迅速な形質転換 |
CN116635529A (zh) | 2020-10-21 | 2023-08-22 | 先锋国际良种公司 | 双单倍体诱导物 |
EP4231816A1 (de) | 2020-10-21 | 2023-08-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Parthenogenesefaktoren und verfahren zur verwendung davon |
EP4251755A2 (de) | 2020-11-24 | 2023-10-04 | AgBiome, Inc. | Pestizidgene und verfahren zur verwendung |
WO2022226316A1 (en) | 2021-04-22 | 2022-10-27 | Precision Biosciences, Inc. | Compositions and methods for generating male sterile plants |
BR112023023044A2 (pt) | 2021-05-06 | 2024-01-23 | Agbiome Inc | Genes pesticidas e métodos de uso |
US20220386574A1 (en) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | P21-cre animal models |
WO2023076898A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase |
CA3239251A1 (en) | 2021-12-07 | 2023-06-15 | Rebekah Deter Kelly | Pesticidal genes and methods of use |
TW202345696A (zh) | 2022-05-18 | 2023-12-01 | 美商科迪華農業科技有限責任公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法 |
WO2024023578A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Institut Pasteur | Hsc70-4 in host-induced and spray-induced gene silencing |
WO2024044596A1 (en) | 2022-08-23 | 2024-02-29 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
EP4360451A1 (de) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Limagrain Europe | Mutanten zur haploiden induktion |
WO2024129674A1 (en) | 2022-12-13 | 2024-06-20 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992015694A1 (en) | 1991-03-08 | 1992-09-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor |
WO1993001283A1 (en) | 1991-07-08 | 1993-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Selection-gene-free transgenic plants |
EP0672142B1 (de) | 1992-12-04 | 2001-02-28 | Medical Research Council | Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung |
US5527695A (en) * | 1993-01-29 | 1996-06-18 | Purdue Research Foundation | Controlled modification of eukaryotic genomes |
EP0632054A1 (de) | 1993-06-28 | 1995-01-04 | European Molecular Biology Laboratory | Regulation stellenspezifischer Rekombination mittels stellungsspezifischer Rekombinase/Kernrezeptor-Fusionsproteine |
CA2177367A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Andrew David Griffiths | Recombinant binding proteins and peptides |
EG23907A (en) | 1994-08-01 | 2007-12-30 | Delta & Pine Land Co | Control of plant gene expression |
US5888732A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | Life Technologies, Inc. | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
US5801030A (en) | 1995-09-01 | 1998-09-01 | Genvec, Inc. | Methods and vectors for site-specific recombination |
AUPN523995A0 (en) | 1995-09-05 | 1995-09-28 | Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd | Method for producing phage display vectors |
AU716781B2 (en) | 1995-10-13 | 2000-03-09 | Purdue Research Foundation | Method for the production of hybrid plants |
AUPN903196A0 (en) | 1996-03-29 | 1996-04-26 | Australian National University, The | Single-step excision means |
US5928914A (en) | 1996-06-14 | 1999-07-27 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | Methods and compositions for transforming cells |
US6774279B2 (en) * | 1997-05-30 | 2004-08-10 | Carnegie Institution Of Washington | Use of FLP recombinase in mice |
US6114600A (en) | 1997-10-31 | 2000-09-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Resolution of complex integration patterns to obtain single copy transgenes |
CA2306184C (en) | 1997-11-18 | 2007-05-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for genetic modification of plants |
DE69841438D1 (de) | 1997-11-18 | 2010-02-25 | Pioneer Hi Bred Int | Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme |
AU3928899A (en) | 1998-04-28 | 1999-11-16 | Novartis Ag | Site-directed transformation of plants |
-
1998
- 1998-11-17 AT AT98960261T patent/ATE317440T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 PT PT98960261T patent/PT1032680E/pt unknown
- 1998-11-17 ES ES98960261T patent/ES2256972T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 DE DE69833457T patent/DE69833457T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 BR BR9814669-6A patent/BR9814669A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 EP EP98960261A patent/EP1032680B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 NZ NZ504511A patent/NZ504511A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 DK DK98960261T patent/DK1032680T3/da active
- 1998-11-17 AU AU15904/99A patent/AU745960C/en not_active Ceased
- 1998-11-17 CA CA002306188A patent/CA2306188C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 WO PCT/US1998/024608 patent/WO1999025840A1/en active IP Right Grant
- 1998-11-17 US US09/193,503 patent/US6262341B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-12 US US09/415,839 patent/US6541231B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-01-29 US US10/353,445 patent/US7223601B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6262341B1 (en) | 2001-07-17 |
ATE317440T1 (de) | 2006-02-15 |
US6541231B1 (en) | 2003-04-01 |
EP1032680B1 (de) | 2006-02-08 |
DE69833457D1 (de) | 2006-04-20 |
DK1032680T3 (da) | 2006-05-22 |
ES2256972T3 (es) | 2006-07-16 |
EP1032680A1 (de) | 2000-09-06 |
US7223601B2 (en) | 2007-05-29 |
CA2306188A1 (en) | 1999-05-27 |
BR9814669A (pt) | 2001-11-20 |
US20030119166A1 (en) | 2003-06-26 |
AU745960B2 (en) | 2002-04-11 |
PT1032680E (pt) | 2006-05-31 |
NZ504511A (en) | 2002-12-20 |
WO1999025840A1 (en) | 1999-05-27 |
AU1590499A (en) | 1999-06-07 |
AU745960C (en) | 2003-09-18 |
CA2306188C (en) | 2008-08-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69833457T2 (de) | Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom | |
US7179599B2 (en) | Mobilization of viral genomes from T-DNA using site-specific recombination systems | |
DE3686633T2 (de) | Pflanzenvektoren. | |
US6833449B1 (en) | Expression of the toxic portion of Cry1A in plants | |
EP1234022B1 (de) | Dna-rekombination in eukaryotischen zellen mittels des rekombinationszentrums vom bakteriophag phic31 | |
CN108130342B (zh) | 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法 | |
US8129598B2 (en) | DNA recombination in eukaryotic cells by the bacteriophage PHIC31 recombination system | |
DE69636225T2 (de) | Stimulierung der homologen rekombination in pflanzlichen organismen mittels rekombinations fördernder enzyme | |
US20050009182A1 (en) | Methods for the replacement, translocation and stacking of DNA in eukaryotic genomes | |
DE112010004582T5 (de) | Optimierte Endonukleasen und Anwendungen davon | |
EP2235187B1 (de) | Verbessertes mutageneseverfahren mit polyethylenglykol-vermittelter einführung mutagener nukleobasen in pflanzenprotoplasten | |
US7238854B2 (en) | Method of controlling site-specific recombination | |
US7754944B2 (en) | Polynucleotide constructs | |
DE60028548T2 (de) | Verfahren zur vewendung von viralen replicase-polynukleotiden und polypeptiden | |
US8841511B2 (en) | Removal of plastid sequences by transiently expressed site-specific recombinases | |
US6984774B1 (en) | Method and materials to induce recombination in plants | |
DE102015009482B4 (de) | Verfahren zur erzeugung von pflanzen oder pflanzenzellen mit arteigener katalaese in ihren chloroplasten und pflanzen oder pflanzenzellen hergestellt nach diesem verfahren | |
Hess | Direct and indirect gene transfer using pollen as carriers of exogenous DNA | |
MXPA00004745A (es) | Un metodo novedoso para la integracion de adn estraño en genomas eucarioticos |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |