DE69833457T2 - Neuartige methode zur integration von fremd-dna ins eukaryotische genom - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die genetische Modifikation von Chromosomen. Es werden insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen für die Integration von DNA in ein eukaryotisches Genom bereitgestellt.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um eine DNA von Interesse in das Genom einer Pflanze zu integrieren. Im einfachsten Verfahren wird DNA in eine Zelle eingeführt und integriert durch illegitime Rekombination statistisch in das Genom. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass positionale Effekte durch statistische Integration es schwierig machen, eine Genexpression zu analysieren.
• Als Alternative zur illegitimen Rekombination kann eine Integration auf eine besondere Stelle im Genom durch die Verwendung einer homologen Rekombination oder ortsspezifischen Rekombination targetiert werden. Bei Pflanzen, bei denen keine homologe Rekombinationstechnologie entwickelt wurde, wird eine ortsspezifische Rekombination verwendet, um eine Sequenz von Interesse in eine Integrationsstelle zu integrieren, die vorher in das Wirtspflanzengenom insertiert wurde. Wenn eine ortsspezifische Integration durch ein einfaches Kreuzungsereignis zwischen einem Chromosom und einem ringförmigen extrachromosomalen Replikon erfolgt, wird das gesamte Replikon in das Chromosom insertiert werden. Wenn eine Insertion des gesamten Replikons unerwünscht ist, kann ein Fragment des Replikons, das die DNA von Interesse umfasst, flankiert von Targetstellen für eine ortsspezifische Rekombinase, durch ein doppeltes reziprokes Kreuzungsereignis in ein Chromosom eingeführt werden, das eine Integrationsstelle hat, welche den Targetstellen entspricht, die die DNA von Interesse flankieren. In jedem Fall ist eine Integration ineffizient, da sie reversibel ist, d.h., die integrierte DNA kann durch anschließende ortsspezifische Rekombination zwischen den Targetstellen, die die integrierte DNA flankieren, ausgeschnitten werden.
• Es wurden mehrere Ansätze unternommen, um eine Exzision bzw. ein Ausschneiden einer integrierten DNA zu vermeiden. In einem Ansatz wird die Expression einer ortsspezifischen Rekombinase, z.B. Cre oder FLP, zeitweise reguliert. Siehe O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355; Logie und Stewart (1995) Proc Natl Acad Sci 92:5940-5944; Zhang et al. (1996) Nuc Acid Res 24:543-548; Nichols et al. (1997) Mol Endocinol 11:950-961; und Feil et al. (1997) Biochem Biophy Res Comm 237:752-757. In diesen Verfahren wird die Rekombinase entweder transient oder induzierbar kurz exprimiert, um eine Integration zuzulassen. Allerdings kann eine Exzision der integrierten DNA auftreten, bevor aktive Rekombinase aus der Zelle verschwindet. Darüber hinaus ist eine intramolekulare Exzision kinetisch gegenüber einer bimolekularen Integration begünstigt. Daher ist integrierte DNA in Gegenwart von Rekombinase von Natur aus instabil.
• Ein zweiter Ansatz reduziert eine Exzision von integrierter DNA durch Verwendung von Paaren einzeln mutierten Zielstellen, sowohl auf dem Chromosom als auch der flankierenden DNA von Interesse. Siehe Albert et al. (1995) Plant J7:649-659; Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; O'Gorman et al. (1997) Proc Natl Acad Sci 94:14602-14607; und Araki et al. (1997) Nuc Acid Res 25:868-872. Eine Rekombination zwischen einzeln mutierten Zielstellen resultiert in doppelt mutierten Zielstellen, die die DNA flankieren, die in das Chromosom insertiert ist. Die doppelt mutierten Zielstellen werden durch die Rekombinase gut erkannt. So wird die insertierte DNA durch eine Umkehrreaktion nur bei niedrigen Leveln aus dem Chromosom ausgeschnitten. Dieses System hat allerdings den Nachteil, dass einzeln mutierte Zielstellen oft nicht als effiziente Rekombinationssubstrate wirken und somit die Integrationshäufigkeit reduziert ist. Außerdem sind Transformanten instabil, da eine Exzision noch erfolgen kann, wenn auch bei reduzierter Häufigkeit.
• Ow et al. (1995), Critical Reviews in Plant Sciences 14(3), 239-261, offenbart mehrere ortsspezifische Rekombinationssysteme, von denen gezeigt wurde, dass sie in höheren eukaryotischen Zellen arbeiten. Diese Zwei-Komponentensysteme bestehen aus einer Einzel-Polypeptid-Rekombinase und einer kurzen Erkennungssequenz mit weniger als 35 bp.
• Dementsprechend besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung von effizienten Methoden für eine ortsspezifische Integration von DNA in eukaryotische Genome, die anschließende Exzisionsreaktionen und andere nicht-produktive Rekombinationsreaktionen vermeiden.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Einführen einer DNA von Interesse in eine genomische Integrationsstelle bereitgestellt. Die Verfahren und Zusammensetzungen involvieren insbesondere die Verwendung einer Kombination von Targetstellen bzw. Zielstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen, z.B. Cre und FLP, und Expression einer chimären Rekombinase mit dualer Targetstellenspezifität. Somit umfassen die Kombinationen neue ortsspezifische Rekombinasen mit Spezifitäten für multiple Targetstellen und Nucleotidsequenzen und Expressionskassetten, die für diese Rekombinasen oder Targetstellen codieren. Die Verfahren involvieren Transformieren einer eukaryotischen Zelle mit Targetstellen für die neue Rekombinase mit einer DNA von Interesse, die durch entsprechende Targetstellen flankiert ist. Die Expression entweder der neuen chimären Rekombinase oder von zwei ortsspezifischen Rekombinasen in der eukaryotischen Zelle resultiert in der Integration der DNA von Interesse in das Genom. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung haben eine Verwendung bei der Konstruktion von stabil transformierten eukaryotischen Zellen, und insbesondere Pflanzenzellen. Die Verfahren resultieren in einer effizienten targetierten genomischen Integration von DNA durch ortsspezifische Rekombination.
• Erfindungsgemäß wird demnach ein rekombinantes Protein bereitgestellt, umfassend eine erste ortsspezifische Rekombinase, im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase.
• Die Erfindung stellt auch bereit:
• – ein rekombinantes Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 3, 6, 9 und 11;
• – ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase, im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase, codiert, umfasst;
• – ein Nucleinsäuremolekül, das SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7 oder 8 umfasst;
• – eine eukaryotische Zelle, die ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung stabil in ihr Genom eingebaut hat;
• – eine Pflanze, die in ein Chromosom wenigstens eine Integrationsstelle, die eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase umfasst, stabil integriert hat, wobei die Targetstellen aneinander angrenzend sind;
• – eine Pflanze, die stabil in ihr Genom ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung integriert hat;
• – ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryoti schen Zelle, umfassend:
• (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse von einer Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und einer Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die Targetstellen umfasst, welche den Targetstellen entsprechen, die die DNA von Interesse flankieren; und
• (b) Bereitstellen in der genannten eukaryotischen Zelle eines rekombinanten Proteins, das die erste Rekombinase, ein aktives Derivat der ersten Rekombinase oder ein aktives Fragment der ersten Rekombinase, im Raster fusioniert mit der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, einem aktiven Derivat der zweiten unterschiedlichen Rekombinase oder einem aktiven Fragment der zweiten unterschiedlichen Rekombinase umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysieren, wobei die DNA von Interesse an der Integrationsstelle in das Genom integriert wird;
• – ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryoti schen Zelle, umfassend:
• (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA von Interesse flankieren; und
• (b) Bereitstellen in der Zelle der ersten Rekombinase eines aktiven Derivats der ersten Rekombinase oder eines aktiven Fragments der ersten Rekombinase; und der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, eines aktiven Derivats der zweiten Rekombinase oder eines aktiven Derivats der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, wobei die erste und zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysieren; und – transformierten Samen aus einer Pflanze der Erfindung.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 stellt schematisch Pflanzentransformationsvektoren, PHP 13164 und PHP 13147, zur Expression von moCRE-Rekombinase bzw. Cre:FLPm-Rekombinase dar.
• 2 stellt die Aktivierung der GUS-Expression durch FLPm- oder CRE:FLPm-vermittelte Exzision einer Sequenz, die durch FRT-Stellen flankiert wird, die einen Ubiquitin-Promotor und das GUS-offene Leseraster trennt, dar.
• 3 stellt graphisch die Aktivierung der GUS-Expression durch CRE:FLPm-vermittelte Exzision einer Sequenz, die durch loxP-Stellen flankiert wird, die den Übiquitin-Promotor und das GUS-offene Leseraster trennt, dar.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Zusammensetzungen und Verfahren zur ortsspezifischen Integration von DNA in vorher festgelegte genomische Integrationsstellen in einem Wirtsgenom werden bereitgestellt. Die Erfindung sorgt für die Verwendung von chimären Rekombinasen, die eine ortsspezifische Rekombination zwischen Zielstellen katalysieren, welche aus unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinationssystemen stammen. Eine derartige chimäre Rekombinase mit dualer Funktion stellt sicher, dass die zwei Enden von Fremd-DNA nicht miteinander ligieren, sondern mit ihren verwandten Partner-Targetstellen, die in der genomischen DNA liegen, rekombinieren. Die Verfahren erleichtern das Richtungstargeting von gewünschten Genen und Nucleotidsequenzen in entsprechende Integrationsstellen, die vorher in das Genom eingeführt wurden.
• In den Verfahren der Erfindung wird eine Kombination von Targetstellen für zwei ortsspezifische Rekombinasen in das Genom eines Organismus von Interesse eingeführt, was eine Integrationsstelle zu Insertion einer Nucleotidsequenz von Interesse einrichtet. Zu Zwecken der Erfindung wird eine Integrationsstelle flankierende Targetstellen umfassen, wobei die Targetstellen den Rekombinationsstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen entsprechen. Diese Rekombinations- oder Targetstellen können andere Nucleotidsequenzen flankieren oder können fortlaufend sein. Verfahren für die Erzeugung von transgenen Pflanzen, die spezifische Rekombinationsstellen in das Pflanzengenom integriert enthalten, sind in der gleichzeitig anhängigen vorläufigen Anmeldung, Serial No. 60/065 627 mit dem Titel "Compositions and Methods for Genetic Modification of Plants", eingereicht am 18. November 1997, beschrieben, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Sobald eine stabile Pflanze oder ein stabiles Kulturgewebe entwickelt ist, wird eine Transferkassette, die eine DNA von Interesse flankiert von Targetstellen, die denen der genomischen Integrationsstelle entsprechen, umfasst, in die stabil transformierte Pflanze oder die stabil transformierten Gewebe in Gegenwart einer chimären Rekombinase mit Spezifitäten für jede der Targetstellen eingeführt. Alternativ können zwei unterschiedliche Rekombinasen, die den Targetstellen entsprechen, anstelle einer chimären Rekombinase in der Zelle vorliegen. Dieses Verfahren resultiert im Austausch der Nucleotidsequenzen zwischen den zwei identischen Targetstellen der genomischen Integrationsstelle und der Transferkassette.
• Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle bereit, umfassend:
• a) Transformieren der Zelle mit einer Transferkassette, die die DNA umfasst, wobei die DNA durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom eine Integrationsstelle enthält, welche Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA flankieren; und
• b) Bereitstellen in der Zelle eines rekombinaten Proteins, das die erste Rekombinase im Raster fusioniert mit der zweiten Rekombinase umfasst.
• Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle bereit, umfassend:
• a) Transformieren der Zelle mit einer Transferkassette, die die DNA umfasst, wobei die DNA durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom eine Integrationsstelle enthält, die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, die die DNA flankieren; und
• b) Bereitstellen in der Zelle die erste Rekombinase und die zweite Rekombinase.
• Mit "ortsspezifische Rekombinase" ist ein beliebiges Enzym gemeint, das eine konservative ortsspezifische Rekombination zwischen seinen entsprechenden Rekombinationsstellen katalysiert. Bezüglich einer Übersicht über ortsspezifische Rekombinasen siehe Sauer (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527; und Sadowski (1993) FASEB 7:760-767.
• Die erste und zweite ortsspezifische Rekombinase können Volllängen-Rekombinasen und/oder aktive Fragmente oder Derivate davon sein. Ortsspezifische Rekombinasen, die zur Erzeugung der chimären Rekombinasen der Erfindung einsetzbar sind, umfassen Rekombinasen aus der Integrase-Familie, Derivate davon oder ein beliebiges anderes natürlich vorkom mendes oder rekombinant produziertes Enzym oder Derivat davon, das eine konservative ortsspezifische Rekombination zwischen spezifizierten DNA-Stellen katalysiert. Die Integrase-Familie von Rekombinasen hat über dreißig Mitglieder und umfasst FLP, Cre, Int und R. Vorzugsweise benötigen die Rekombinasen keine Cofaktoren oder kein "supercoiled" Substrat. Am meisten bevorzugt sind die Rekombinasen Cre und FLP. Die Bakteriophage P1 loxP-Cre- und die Saccharomyces 2 μ-Plasmid FRT/FLP-ortsspezifischen Rekombinationssysteme wurden umfangreich untersucht, und ihre Verwendungen sind dem Fachmann gut bekannt. Von Cre und FLP ist bekannt, dass sie in einer Vielzahl von Organismen einschließlich Bakterien, Hefe, Drosophila, Säugern und monokotylen und dikotylen Pflanzen funktionieren. Außerdem erfordern diese Rekombinasen keine Hilfsfaktoren, um zu funktionieren.
• Die ortsspezifischen Rekombinasen und Sequenzen, die diese codieren, die in den Verfahren und den Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden können, können Varianten natürlich auftretender Rekombinasen und die Gene, die diese codieren, sein. Der Ausdruck "konservativ modifizierte Varianten" findet sowohl auf Aminosäure- wie auch auf Nucleinsäuresequenzen Anwendung. Bezüglich bestimmter Nucleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf solche Nucleinsäuren, die identische oder konservativ modifizierte Varianten der Aminosäuresequenzen codieren. Infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes codiert eine ganze Reihe von funktionell identischen Nucleinsäuren für ein gegebenes Protein. Beispielsweise codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle für die Aminosäure Alanin. So kann das Codon an jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert ist, in ein beliebiges der entsprechenden Codons, die beschrieben wurden, geändert werden, ohne dass das codierte Polypeptid verändert wird. Solche Nucleinsäurevariationen sind "stille Variationen" und stellen eine Spezies konservativ modifizierter Variation dar. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist) modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu liefern.
• Was die Aminosäuresequenzen angeht, so wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen an eine Nucleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren in der codierten Sequenz ändern, addieren oder deletieren, eine "konservativ modifizierte Variante" ist, in der die Veränderung in der Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure resultiert. Somit kann eine beliebige Zahl an Aminosäureresten, ausgewählt aus der Gruppe von ganzen Zahlen, bestehend aus 1 bis 15, verändert werden. Beispielsweise können so 1, 2, 3, 4, 5, 7 oder 10 Veränderungen durchgeführt werden. Konservativ modifizierte Varianten stellen typischerweise ähnliche biologische Aktivität, wie die nicht-modifizierte Polypeptidsequenz, aus der sie abgeleitet sind, bereit. Z.B. ist die Substratspezifität, Enzymaktivität oder Ligand/Rezeptor-Bindung im Allgemeinen wenigstens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% derjenigen des nativen Proteins für sein natives Substrat. Kon servative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
• Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:
• 1) Alanin (A), Serin (S), Theronin (T);
• 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
• 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
• 4) Arginin (R), Lysin (K);
• 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
• 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
Siehe Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman und Company.
• Anstelle einer Verwendung von Volllängen-Rekombinasen können funktionelle Fragmente von ortsspezifischen Rekombinasen in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Funktionelle Fragmente von ortsspezifischen Rekombinasen können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken identifiziert werden. Beispielsweise können funktionelle Fragmente des FLP-Proteins durch ihre Fähigkeit, bei Einführung in Zellen, die geeignete FRT-Substrate enthalten, eine ortsspezifische Rekombination zu katalysieren und in der Exzision eines analysierbaren Markergens zu resultieren, identifiziert werden.
• Ein allgemeiner Ansatz für eine derartige funktionelle Analyse involviert eine Subklonierung von DNA-Fragmenten eines genomischen Klons, cDNA-Klons oder einer synthetisierten Gensequenz in einen Expressionsvektor, Einführen des Expressionsvektors in einen heterologen Wirt und Screening, um das Rekombinationsprodukt zu detektieren (d.h., unter Verwendung einer Restriktionsanalyse, um das Rekombinationsprodukt auf dem Nucleinsäurelevel zu bestätigen, oder auf der Basis eines Assaysystems für eine Rekombination, wie es oben beschrieben wurde). Methoden zur Erzeugung von Fragmenten einer cDNA oder eines genomischen Klons sind gut bekannt. Varianten einer isolierten DNA, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, können durch Deletieren, Addieren und/oder Substituieren von Nucleotiden produziert werden. Solche Varianten können z.B. durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und dergleichen erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel, Current Protocols In Molecular Biology, Wiley Interscience (1990), Seiten 8.0.3 – 8.5.9, und McPherson (Herausg.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach, (IRL Press, 1991).
• Die rekombinanten Proteine der Erfindung mit dualer Funktion umfassen eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster, fusioniert mit einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase. Es wird erkannt werden, dass die Rekombinasen in den Verfahren der Erfindung, die der chimären Rekombinase entsprechen, den Targetstellen des transformierten Organismus und der Targetingkassette entsprechen müssen. D.h., wenn FRT- und loxP-Stellen verwendet werden, wird eine chimäre FLP:Cre-Rekombinase benötigt werden.
• Die offenen Leseraster, die für die ersten und zweiten Rekombinasen codieren, können direkt miteinander fusioniert sein oder können durch einen Linker verknüpft sein, der das korrekte Leseraster der chimären Rekombinase aufrechterhält. Es ist klar, dass die Rekombinasen Amino-an-Carboxy-Terminus, Amino-an-Amino-Terminus oder Carboxy-an-Amino-Terminus fusioniert sein können.
• Gene, die für chimäre ortsspezifische Rekmobinasen und Rekombinationsstellen codieren, können unter Verwendung von Standard-Rekombinationsverfahren, Synthesetechniken oder Kombinationen davon hergestellt werden. Die Verwendung von Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren, Adaptern und Linkern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und kann in Literaturstellen, wie z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (Cold Spring Habor, New York, 1989) gefunden werden. Es ist eine Vielzahl von Strategien zum Ligieren von DNA-Fragmenten verfügbar, deren Wahl von der Natur der Termini der DNA-Fragmente abhängt, wobei diese Wahl in einfacher Weise von einem Fachmann vorgenommen werden kann. Das FLP-Rekombinase-Gen aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) ist im Handel im Plasmid pOG44 von Stratagene Cloning Systems (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) verfügbar. Bezüglich einer Beschreibung des FLP-Gens und verschiedener Nucleinsäuren siehe z.B. Stratagene Cloning Systems, Kataloge 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); und Amersham Life Sciences, Inc., Katalog '97 (Arlington Heights, IL). In ähnlicher Weise sind die Sequenzen von vielen anderen ortsspezifischen Rekombinasen und ihren verwandten Erkennungsstellen allgemein oder kommerziell verfügbar. Gene, die für FLP und Cre codieren, können auch z.B. durch Synthetisieren der Gene mit wechselseitigem Priming langer Oligonucleatide erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 8.2.8 bis 8.2.13, Wiley Interscience (1990). Siehe auch Wosniak et al. (1987) Gene 60:115. Darüber hinaus bieten derzeitige Techniken unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion die Fähigkeit, Gene zu synthetisieren, die in der Länge so groß wie 1,8 Kilobasen sind (Adang et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:1131; Bombat et al. (1993) PCR Methods and Applications 2:266).
• Wenn die Nucleinsäure synthetisch hergestellt oder verändert wird, können bekannte Codonpräferenzen des vorgesehenen Wirts, in dem die Nucleinsäure exprimiert werden soll, genutzt werden. Obgleich z.B. Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sowohl in monokotylen wie auch in dikotylen Pflanzenspezies exprimiert werden können, können Sequenzen modifiziert werden, um für spezifische Codonpräferenzen und GC-Gehaltspräferenzen von Monokotylen oder Dikotylen verantwortlich zu sein, da gezeigt wurde, dass diese Differenzen differieren (Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-498; und Campbell et al. (1990) Plant Physiol. 92:1). So kann das in Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure aus bekannten Gensequenzen aus Mais abgeleitet werden. Eine Maiscodonverwendung für 28 Gene aus Maispflanzen ist in Tabelle 4 von Murray et al., supra, aufgelistet.
• Beispiele für Gene, die für Rekombinasen codieren, die in Mais bevorzugte Codons verwenden, umfassen FLPm, das in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung 08/972 258 beschrieben wird, deren Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, und moCre, das in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt wird. FLPm stammt aus der Saccharomyces-2μ-Plasmid-FLP-Rekombinase, wird aber durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die in Mais bevorzugte Codons verwendet. Obgleich die FLPm-Nucleinsäuresequenz bevorzugte Codons für eine Expression von Aminosäuren in Mais enthält, ist einzusehen, dass eine nützliche Sequenz Codons enthalten kann, die in Mais mit weniger als den höchsten beschriebenen Mais-Codon-Häufigkeiten auftreten. Beispiele für Nucleinsäuren, die für chimäre Rekombinasen codieren, umfassen Cre:FLPm (SEQ. ID NO: 4), moCre:FLPm (SEQ. ID NO: 5), Cre:FLP (SEQ. ID NO: 7) und FLPm:Cre (SEQ. ID NO: 8).
• Die Erfindung stellt auch Expressionskassetten bereit, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, welche für eine chimäre ortsspezifische Rekombinase codiert, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert. Vorzugsweise ist der Promotor ein Pflanzenpromotor. Beispielsweise enthält der Pflanzenexpressionsvektor PHP13147, der in 1 gezeigt ist, eine Expressionskassette für Cre:FLPm, worin das Gen, das für die chimäre Rekombinase codiert, funktionell mit einem Ubiquitin-Promotor verknüpft ist. Der Ausdruck "funktionell verknüpft", wie er hier verwendet wird, umfasst die Bezugnahme auf eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz, wobei die Promotorsequenz eine Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nucleinsäuresequenzen, die verknüpft sind, fortlaufend sind und, wo es notwendig ist, zwei für Protein codierende Regionen verknüpfen, die kontinuierlich und im selben Leseraster sind.
• Der Ausdruck "Promotor", wie er hier verwendet wird, beinhaltet die Bezugnahme auf eine DNA-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart und involviert bei der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen unter Initiierung einer Transkription. Ein "Pflanzen-Promotor" ist ein Promotor, der fähig ist, eine Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren. Beispiele für Pflanzen-Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, jene, die aus Pflanzen, Pflanzenviren und Bakterien-Genen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden, z.B. die von Agrobacterium oder Rhizobium, erhalten werden. Sowohl heterologe als auch nicht-heterologe (d.h. endogene) Promotoren können verwendet werden, um die Expression einer Sequenz, die für eine ortsspezifische Rekombinase codiert, zu steuern. Der Promotor kann konstitutiv, induzierbar oder gewebespezifisch sein.
• In der vorliegenden Erfindung können viele verschiedene konstitutive Promotoren eingesetzt werden. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen die Promotoren aus Pflanzenviren, z.B. der 35S-Promotor aus CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812) und die Promotoren aus solchen Genen, wie Reisaktin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); Mais-H3-Histon (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 und Atanassova et al. (1992) Plant Journal 2(3):291-300); der 1'- oder 2'-Promotor, der aus der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens stammt, der Smas-Promotor, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US-Patent Nr. 5 683 439), der Nos-Promotor, der Pemu-Promotor, der Rubisco-Promotor, der GRP1-8-Promotor, und andere Transkriptions-Initiationsregionen aus verschiedenen Pflanzengenen, die dem Fachmann bekannt sind. Der ALS-Promotor, ein XbaI/NcoI-Fragment 5-Primer zu dem Brassica napus-ALS3-Strukturgen (oder einer Nucleotidsequenz, die wesentliche Sequenzsimilarität zu dem XbaI/NcoI-Fragment hat) stellt einen besonders nützlichen konstitutiven Promotor dar (siehe die anhängige Pioneer Hi-Bred International-US-Patentanmeldung 08/409 297 und das entsprechende US-Patent Nr. 5 659 026, veröffentlicht am 19. August 1997).
• Eine Vielzahl von induzierbaren Promotoren kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Siehe Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Beispiele für induzierbare Promotoren umfassen den aus dem ACE1-System, der auf Kupfer anspricht (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); In2-Gen aus Mais, das auf Benzolsulfonamid-Herbizid-Gegenmittel anspricht (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 und Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); der Adh1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist, der Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und der PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist, oder Tet-Repressor aus Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227-237). Ein besonders bevorzugter induzierbarer Promotor ist ein Promotor, der auf ein induzierendes Mittel anspricht, auf das Pflanzen normalerweise nicht ansprechen. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor ist ein induzierbarer Promotor aus einem Steroidhormon-Gen, dessen Transkriptionsaktivität durch ein Glucocorticosteroidhormon induziert wird (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10421).
• Beispiele für Promotoren unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die eine Transkription nur oder vorzugsweise in bestimmten Geweben, z.B. Blättern, Wurzeln, Früchten, Samen oder Blumen, initiieren. Die Funktion eines Promotors kann auch in Abhängigkeit von seiner Lage im Genom variieren. So kann ein induzierbarer Promotor an bestimmten Stellen vollständig oder partiell konstitutiv werden.
• Die chimäre Rekombinase muss für eine Integration der DNA von Interesse in das Wirtsgenom in der Pflanze exprimiert werden. Dementsprechend kann die Expressionskassette, die für die ortsspezifische Rekombinase codiert, in cis der DNA von Interesse; in trans an einem Wirtschromosom oder extrachromosomalen Replikon zugeführt werden oder kann in den Wirt transferiert werden und transient in der Nähe des Zeitpunkts, an dem eine Rekombination gewünscht wird, exprimiert werden.
• Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Transferkassetten, die Nucleotidsequenzen umfassen, welche für die chimären Rekombinasen der Erfindung codieren. Mit Trans ferkassette ist jede Nucleotidsequenz gemeint, die verwendet werden kann, um eine Zelle von Interesse zu transformieren. Beispielsweise kann die Transferkassette ein unabhängiges Replikon, z.B. ein Plasmid, Shuttlevektor, Ti-Plasmid, viraler Vektor oder dergleichen, sein. Alternativ könnte die Transferkassette eine Nucleinsäure sein, die nicht zur unabhängigen Replikation fähig ist, jedoch in einen Organismus von Interesse durch eine Vielzahl von Transformationsprotokollen, z.B. Partikelbeschuss, Elektroporation und dergleichen, transferiert werden könnte. So stellt die Erfindung eine Transferkassette bereit, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein rekombinantes Protein codiert, das eine erste ortsspezifische Rekombinase, fusioniert im Raster mit einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase, umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert.
• In den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung ist die DNA von Interesse von Targetstellen für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen flankiert. Mit "flankiert von bzw. durch" ist gemeint, dass die Rekombinations- oder Targetstellen direkt fortlaufend mit der DNA von Interesse sein können, oder es kann eine oder es können mehrere intervenierende Sequenzen zwischen einem oder beiden Enden der DNA von Interesse und den ortsspezifischen Rekombinationsstellen vorliegen. Intervenierende Sequenzen von besonderem Interesse würden Linker, Adapter, selektierbare Marker und/oder andere Stellen, die eine Vektorkonstruktion oder Analyse und Expressionskassette für ein Gen von Interesse unterstützen, umfassen. Targetstellen für ortsspezifische Rekombinasen sind dem Fachmann bekannt und werden in der gleichzeitig anhängigen vorläufigen Anmeldung 60/065 613 diskutiert. Beispiele für Targetstellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, FRT, FRT1, FRTS, FRT6, FRT7, andere FRT-Mutanten, loxP, loxP-Mutanten und dergleichen. Siehe z.B. Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Bd. 51, S. 53-91; Cox (1989) in Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American Society of Microbiology, Washington D.C., S. 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journal 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant und Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale und Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; und Dale et al. (1990) Gene 91:79-85.
• Mit "Targetstelle für eine ortsspezifische Rekombinase" ist eine DNA-Sequenz gemeint, die durch eine bestimmte ortsspezifische Rekombinase erkannt wird. Dem Fachmann auf diesem Gebiet ist eine Vielzahl von Rekombinationsstellen bekannt, und diese können in Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden. Die Stelle kann die Sequenz der verwandten Stelle für eine gegebene Rekombinase haben oder kann modifiziert sein, solange sie fähig ist, als Rekombinationsstelle zu wirken. Die Stelle kann die Minimalsequenzen enthalten, die für eine Rekombination erforderlich sind, oder sie kann zusätzliche Sequenzen enthalten, die eine Rekombination verstärken. Beispiele für Rekombinationsstellen zur Verwendung in der Erfindung sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen FRT- und loxP-Stellen. (Siehe zum Beispiel Schlake und Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Bd. 51, S. 53-91; Michael M. Cox (1989) in Mobile DNA, Berg und Howe (Herausg.) American Society of Microbiology, Washington D.C., S. 116-670; Dixon et al. (1995) 18:449-458; Umlauf und Cox (1988) The EMBO Journa17:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant und Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7:649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:369-378; Dale und Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10558-105620; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; Hartley et al. (1980) Nature 286:860-864; Sauer (1994) Current Opinion in Baotechnology 5:521-527; und Dale et al. (1990) Gene 91:79-85).
• Jede loxP- und die FRT-Stelle enthält jeweils zwei invertierte Wiederholungen mit 13 Basenpaaren, die einen 8 Basenpaar-Spacer flankieren. Die FRT-Stelle enthält eine zusätzliche nicht-essentielle 13 Basenpaar-Wiederholung. Die Sequenzen der loxP- und FRT-Stellen sind in SEQ. ID NO: 1 und SEQ. ID NO: 2 gezeigt. Eine minimale FRT-Stelle (SEQ. ID NO: 10), die zwei 13 Basenpaar-Wiederholungen, getrennt durch einen 8 Basen-Spacer, umfasst, ist:
  5'-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
  worin die Nucleotide in den Klammern die Spacerregion anzeigen. Die Nucleotide in der Spacerregion können durch eine Kombination von Nucleotiden ersetzt werden, solange die zwei 13 Basen-Wiederholungen durch 8 Nucleotide getrennt werden. FLP ist eine konservative, ortsspezifische Rekombinase, die fähig ist, eine Inversion einer Nucleinsäuresequenz, die zwischen zwei umgekehrt orientierten FRTs positioniert ist; eine Rekombination zwischen zwei Molekülen, die jeweils eine FRT-Stelle enthalten; und eine Exzision zwischen FRT-Stellen zu katalysieren. Die Kernregion ist nicht symmetrisch, und ihre Asymmetrie diktiert die Steuerbarkeit der Reaktion. Eine Rekombination zwischen umgekehrten FRT-Stellen verursacht eine Umkehr einer DNA-Sequenz zwischen diesen, wohingegen eine Rekombination zwischen direkt orientierten Stellen zu einer Exzision der DNA zwischen ihnen führt.
• Nucleotidsequenzen, enthaltend eine DNA von Interesse, flankiert durch Targetstellen, Transferkassetten für zwei unterschiedliche ortsspezifische Rekombinasen und Vektoren, die diese Sequenzen tragen, können unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken konstruiert werden. Siehe z.B. Sambrook et al. (Herausg.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989).
• Techniken zur Transformierung einer weiten Vielzahl von eukaryotischen Zellen, einschließlich höherer Pflanzenspezies, sind gut bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Siehe z.B. Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Diese Methoden sind zum Transformieren einer Pflanzzelle mit den chimären Rekombinase-Expressionskassetten der Erfindung und mit DNAs von Interesse, flankiert durch Targetstellen für die chimäre Rekombinase, einsetzbar. Die Expressionskassette, die für die ortsspezifische Rekombinase codiert, kann im Pflanzengenom vor der Transformation der DNA von Interesse vorliegen oder kann um den Zeitpunkt der Transformation mit der T-DNA in die Pflanzenzelle transformiert werden, so dass sie transient exprimiert werden wird. Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden, wobei Techniken, wie Elektroporation, PEG-Poration, Partikelbeschuss, Siliciumfaserabgabe oder Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten oder embryogenem Callus, verwendet werden.
• Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe z.B. Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984), Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803 (1983), Kado (1991), Crit. Rev. Plant Sci. 10:1, und Moloney et al. (1989), Plant Cell Reports 8:238. Obgleich Agrobacterium in erster Linie in Dikotylen verwendbar ist, können durch Agrobacterium auch bestimmte Monokotylen transformiert werden. Beispielsweise wird die Agrobacterium-Transformation von Mais in US-Patent Nr. 5 550 318 beschrieben. Andere Verfahren der Agroinfektion umfassen Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und Fuller in: Genetic Engineering, Bd. 6, PWJ Rigby, Herausg., London, Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C.P., und Draper, J., in: DNA Cloning, Bd. II, D.M. Glover, Herausg., Oxford, IRI Press, 1985), Anmeldung PCT/US87/02512 (WO 88/02405, veröffentlicht am 7. Apr. 1988) beschreibt die Verwendung von A. rhizogenes-Stamm A4 und seines Ri-Plasmids mit A. tumifaciens-Vektoren pARC8 oder pARC16.
• Optimierte Verfahren und Vektoren zur Agrobacterium-vermittelten Transformation von Pflanzen in der Graminae-Familie, z.B. Reis und Mais, wurden von Heath et al. (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10:221-227; Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282 und Ishida et al. (1996) Nat. Biotech. 14:745-750, beschrieben. Die Effizienz der Maistransformation wird durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Typen und Stufen von Gewebe, das infiziert ist, der Konzentration von Agrobacterium, dem Gewebekulturmedium, den Ti-Vektoren und dem Mais-Genotyp beeinflusst. Superbinäre Vektoren, die die vir-Gene der Agrobacterium-Stämme A281 und A348 tragen, sind für eine hocheffiziente Transformation von Monokotylen einsetzbar.
• Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung der Polyethylenglykol-Präzipitation wird in Paszkowski et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984), beschrieben. Elektroporationstechniken werden in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:5824 (1985), beschrieben.
• Ballistische Transformationstechniken werden in Klein et al., Nature 327:70-73 (1987), beschrieben.
• Virale Mittel zur Einführung von DNA in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Insbesondere ist eine Reihe von Vektorsystemen zur Einführung von fremden oder nativen Genen in Säugerzellen bekannt. Diese umfassen SV40-Virus (siehe z.B. Okayama et al. (1985) Molec. Cell Biol. 5:1136-1142); Rinder-Papillom-Virus (siehe z.B. DiMaio et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4030-4034); Adenovirus (siehe z.B. Morin et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626; Yifan et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405; Yang et al. (1996) Gene Ther. 3:137-144; Tripathy et al. (1996) Nat. Med. 2:545-550; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; Wagner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6099-6103; Curiel et al. (1992) Human Gene Therapy 3:147-154; Curiel (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-8854; LeGal LaSalle et al. (1993) Science 259:590-599; Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502); Adeno-assoziiertes Virus (siehe z.B. Muzyczka et al. (1994) J. Clin. Invest. 94:1351; Xiao et al. (1996) J. Yirol. 70:8098-8108); Herpes simplex-Virus (siehe z.B. Geller et al. (1988) Science 241:1667; Huard et al. (1995) Gene Therapy 2:385-392; US-Patent Nr. 5 501 979); Vektoren auf Retrovirus-Basis (siehe z.B. Curran et al. (1982) J. Virol. 44: 674-682; Gazit et al. (1986) J. Virol. 60: 19-28; Miller, A. D. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24; Cavanaugh et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7071-7075; Smith et al. (1990) Molecular and Cellular Biology 10:3268-3271). Siehe auch Wu et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14338-14342; Wu und Wu, J. Biol Chem. (1988) 263:14621-14624; Wu et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987; Zenke et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3655-3659; Wagner et al. (1990) 87:3410-3414.
• DNA kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen in Pflanzen eingeführt werden, wie es von Zhou et al., Methods in Enrymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1988), beschrieben ist. Eine Expression von Polypeptid-codierenden Genen kann durch Injektion der DNA in reproduktive Organe einer Pflanze erreicht werden, wie es von Pena et al., Nature, 325:274 (1987), beschrieben wird. DNA kann auch direkt in die Zellen unreifer Embryos injiziert werden und die Rehydration von getrockneten Embryos durchgeführt werden, wie bei Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); und Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham. Mass., S. 27-54 (1986) beschrieben. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Pflanzenviren bekannt, die als Vektoren verwendet werden können; diese umfassen Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), Geminivirus, Trespenmosaikvirus und Tabak-Mosaikvirus.
• Pflanzenzellen, die mit einer chimären Rekombinase-Expressionskassette stabil transformiert sind, können z.B. aus einzelnen Zellen, Callusgewebe oder Blattscheiben nach Standard-Pflanzengewebe-Kulturtechniken regeneriert werden. Auf dem Fachgebiet ist gut bekannt, dass verschiedene Zellen, Gewebe und Organe aus fast jeder Pflanze erfolgreich kultiviert wer den können, um eine ganze Pflanze zu regenerieren. Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten ist bei Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, S. 124-176 (1983); und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, S. 21-73 (1985), beschrieben.
• Die Regeneration von Pflanzen, die die rekombinanten Gene enthalten, kann erreicht werden, wie es von Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985), beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Schösslingen in der Pflanzenspezies, die transformiert wird, induziert, wachsen gelassen, wie es von Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983), beschrieben wird. Dieses Verfahren produziert typischerweise Schösslinge innerhalb von zwei bis vier Wochen, und diese Transformantenschösslinge werden dann auf ein geeignetes Wurzel-induzierendes Medium, das das selektive Mittel und ein Antibiotikum, um bakterielles Wachstum zu verhindern, enthält, transferiert. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung können fertil oder steril sein.
• Eine Regeneration kann auch aus Pflanzencallus, -explantaten, -Organen oder Teilen davon erhalten werden. Solche Regenerationstechniken sind allgemein bei Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987), beschrieben. Die Regeneration von Pflanzen entweder aus Einzelpflanzenprotoplasten oder verschiedenen Explantaten ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach und H. Weissbach, Herausg., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Dieser Regenerations- und Wachstumsprozess beinhaltet die Schritte der Selektion von Transformantenzellen und -Schösslingen, Bewurzeln der Transformantenschösslinge und Wachsenlassen der Pflänzchen in Erde. Für eine Maiszellkultur und eine Regeneration siehe allgemein The Maize Handbook Freeling und Walbot, Herausg., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3. Ausgabe, Sprague und Dudley, Herausg., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
• Ein Fachmann wird erkennen, dass, nachdem eine DNA, z.B. eine chimäre Rekombinase-Expressionskassette oder eine Targetstelle für eine chimäre Rekombinase, stabil in transgene Pflanzen eingebaut wurde und als funktionsfähig bestätigt wurde, sie durch sexuelle Kreuzung in andere Pflanzen eingeführt werden kann. Es kann eine beliebige einer Reihe von Standardzüchtungstechniken verwendet werden, die von der zu kreuzenden Spezies abhängen.
• Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind einsetzbar, um eine DNA von Interesse in das Genom einer beliebigen Wirtszelle, einschließlich eines Pflanzenwirts, zu integrieren. Der Ausdruck "Pflanze", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z.B. Blätter, Stängel, Wurzeln, usw.), Samen und Pflanzenzellen und die Nachkommenschaft derselben. Der Ausdruck Pflanzenzelle, wie er hierin verwendet wird, umfasst, ohne Beschränkung, Samen, Suspensionskulturen, Embryos, Meristemregionen, Callusgewebe, Blätter, Wurzeln, Schösslinge, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Die Pflanzenklasse, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, ist im All gemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich ist, einschließlich monokotylen und dikotylen Pflanzen. Eine besonders bevorzugte Monokotyle ist Mais. Andere Monokotyle von besonderem Interesse umfassen Weizen, Reis, Gerste, Sorghum und Roggen. Dikotyle von besonderem Interesse umfassen Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa und Saflor.
• Aufgrund der Verwendung der chimären ortsspezifischen Rekombinasen und Targetstellen, die hier bereitgestellt werden, können die Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren transformiert wurden, von anderen Transformationsverfahren unterscheidbar sein, da die modifizierten Zellen der Erfindung Nucleotidsequenzen von Interesse insertiert in das Genom, flankiert durch Targetstellen für verschiedene Rekombinasen, enthalten werden.
• Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, nicht zur Beschränkung angeführt.
• EXPERIMENTELLER TEIL
• Beispiel 1
• Konstruktion von Vektoren, die eine DNA von Interesse, flankiert durch Targetstellen für eine chimäre ortsspezifische Rekombinase, enthalten
• DNA-Fragmente, die eine DNA von Interesse flankiert durch loxP- und FRT-Targetstellen enthalten, werden entweder durch Synthetisieren, Anlagern und Ligieren komplementärer Oligonucleotide oder durch Erzeugung von Primern zur PCR-Amplifikation einer DNA von Interesse, die loxP- und FRT-Stellen zusätzlich zu Restriktionsstellen, die zur Klonierung in einen Vektor der Wahl einsetzbar sind, enthält, konstruiert.
• Beispielsweise können lange PCR-Primer entwickelt werden, in denen das 3'-Ende des Primers an das 5'-Ende der DNA von Interesse hybridisiert und das 5'-Ende des Primers außerdem loxP- oder FRT-Stellen und nützliche Klonierungsstellen enthält. Das resultierende PCR-Produkt wird mit dem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und in einen geeigneten Vektor insertiert.
• Beispiel 2
• Exzision einer FRT-Stelle durch FLPm und die Cre:FLPm-chimäre Rekombinase Eine Transferkassette, die für eine Cre-FLPm-chimäre Rekombinase codiert, wurde in Pflanzenzellen transformiert, die eine Expressionskassette haben, welche für GUS, angetrieben durch den Ubiquitin-Promotor, codiert, wobei eine Sequenz durch identische FRT- oder loxP-Stellen flankiert wird, die das offene GUS-Leseraster unterbrechen. 2 und 3 zeigen, dass die Cre-FLPm-chimäre Rekombinase entweder an der FRT-Stelle oder der loxP-Stelle unabhängig funktionell ist, was durch die Fähigkeit, GUS-Aktivität nach Exzision von Sequenzen zwischen zwei identischen Targetstellen zu aktivieren, wodurch die GUS-Aktivität unter die Kontrolle des Ubiquitin-Promotors gestellt wird, gemessen wird.
• Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt werden, sind ein Hinweis für den Level des Fachmanns auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört.
• Obgleich die vorstehend beschriebene Erfindung durch Erläuterung und Beispiel zu Zwecken eines klaren Verständnisses detailliert beschrieben wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.
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Claims (46)

1. Rekombinantes Protein, umfassend eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase.
2. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase Glieder der Integrasefamilie von Rekombinasen, ein aktives Derivat eines Glieds der Integrasefamilie von Rekombinasen oder ein aktives Fragment eines Glieds der Integrasefamilie von Rekombinasen sind, wobei die Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment eine konservative ortsspezifische Rekombination katalysiert.
3. Rekombinantes Protein nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite unterschiedliche Rekombinase ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cre, FLP, einem aktiven Derivat von Cre und einem aktiven Fragment von Cre, einem aktiven Fragment von FLP und einem aktiven Derivat von FLP, wobei die Rekombinase, das aktive Fragment oder das aktive Derivat eine konservative ortsspezifische Rekombination katalysiert.
4. Rekombinantes Protein, das die Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS : 3, 6, 9 und 11, umfasst.
5. Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase im Raster fusioniert mit einer zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase codiert, umfasst.
6. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz für die erste und die unterschiedliche zweite ortsspezifische Rekombinase nach Anspruch 2, 3 oder 4 codiert.
7. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die erste oder zweite unterschiedliche Rekombinase Cre oder FLP umfasst, wobei die Cre-Rekombinase durch SEQ ID NO: 2, ein aktives Fragment von SEQ ID NO: 2 oder ein aktives Derivat von SEQ ID NO: 2 codiert wird und die FLP-Rekombinase durch FLPm, ein aktives Fragment von FLPm oder ein aktives Derivat von FLPm codiert wird, wobei das aktive Fragment oder Derivat für eine Rekombinase codiert, die fähig ist, ein konservatives, ortsspezifisches Rekombinationsereignis zu katalysierten.
8. Nukleinsäuremolekül, das SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7 oder 8 umfasst.
9. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Molekül funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einer eukaryotischen Zelle steuert.
10. Eukaryotische Zelle, die das Nukleinsäuremolekül, wie es in einem der Ansprüche 5 bis 9 definiert ist, stabil in ihr Genom eingebaut hat.
11. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
12. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 11, wobei die Pflanzenzelle aus einer Monokotyle stammt.
13. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 12, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
14. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle aus einer Dikotyle stammt.
15. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 14, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume oder Saflor ist.
16. Pflanze, die in ein Chromosom wenigstens eine Integrationsstelle, die eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase umfasst, stabil integriert hat, wobei die Targetstellen aneinander angrenzend sind.
17. Pflanze nach Anspruch 16, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
18. Pflanze nach Anspruch 17, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
19. Pflanze nach Anspruch 16, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
20. Pflanze nach Anspruch 19, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor ist.
21. Transformierter Samen aus der Pflanze nach einem der Ansprüche 16 bis 20.
22. Pflanze nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die Pflanze eine Pflanzenzelle ist.
23. Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse von einer Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und einer Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die Targetstellen umfasst, welche den Targetstellen entsprechen, die die DNA von Interesse flankieren; und (b) Bereitstellen in der genannten eukaryotischen Zelle ein rekombinantes Protein, das die erste Rekombinase, ein aktives Derivat der ersten Rekombinase oder ein aktives Fragment der ersten Rekombinase im Raster fusioniert mit der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, einem aktiven Derivat der zweiten unterschiedlichen Rekombinase oder einem aktiven Fragment der zweiten unterschiedlichen Rekombinase umfasst, wobei die erste und die zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert, wobei die DNA von Interesse an der Integrationsstelle in das Genom integriert wird.
24. Verfahren zum Integrieren einer DNA von Interesse in das Genom einer eukaryotischen Zelle, umfassend: (a) Einführen einer Transferkassette, die die DNA von Interesse umfasst, in die eukaryotische Zelle, wobei die DNA von Interesse durch eine Targetstelle für eine erste ortsspezifische Rekombinase und eine Targetstelle für eine zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase flankiert wird und das Genom der eukaryotischen Zelle wenigstens eine Integrationsstelle umfasst, die die Targetstellen umfasst, die den Targetstellen entsprechen, welche die DNA von Interesse flankieren; und (b) Bereitstellen in der Zelle der ersten Rekombinase, eines aktiven Derivats der ersten Rekombinase oder eines aktiven Fragments der ersten Rekombinase und der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, eines aktiven Derivats der zweiten Rekom binase oder eines aktiven Fragments der zweiten unterschiedlichen Rekombinase, wobei die erste und zweite Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Pflanzenzelle monokotyl oder dikotyl ist.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die monokotyle Pflanzenzelle aus Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen stammt und die dikotyle Pflanzenzelle aus Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor stammt.
28. Verfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25, wobei die erste Rekombinase Cre, ein aktives Derivat von Cre oder ein aktives Fragment von Cre ist und die zweite Rekombinase FLP, ein aktives Derivat von FLP oder ein aktives Fragment von FLP-Rekombinase ist, wobei die Rekombinase, das aktive Derivat oder das aktive Fragment ein konservatives ortsspezifisches Rekombinationsereignis katalysiert.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase ein aktives Derivat von Cre umfasst.
30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase ein aktives Fragment von Cre umfasst.
31. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase Cre umfasst.
32. Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase ein aktives Derivat von FLP umfasst.
33. Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase ein aktives Fragment von FLP umfasst.
34. Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die zweite ortsspezifische Rekombinase FLP umfasst.
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase Cre umfasst und die zweite ortsspezifische Rekombinase FLP umfasst.
36. Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die FLP-Rekombinase durch FLPm codiert wird.
37. Verfahren nach Anspruch 28, 29, 30 oder 31, wobei die Cre-Rekombinase durch SEQ ID NO: 2 codiert wird.
38. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das rekombinante Protein durch SEQ ID NO: 4, 5, 7 oder 8 codiert wird.
39. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die erste ortsspezifische Rekombinase an den Amino-Terminus der zweiten unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinase fusioniert ist.
40. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die zweite unterschiedliche ortsspezifische Rekombinase an den Amino-Terminus der ersten ortsspezifischen Rekombinase fusioniert ist.
41. Pflanze, die in ihr Genom das Nukleinsäuremolekül, wie es in einem der Ansprüche 5 bis 9 definiert ist, stabil eingebaut hat.
42. Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
43. Pflanze nach Anspruch 42, wobei die Monokotyle Mais, Weizen, Reis, Gerste, Sorghum oder Roggen ist.
44. Pflanze nach Anspruch 41, wobei die Pflanze aus einer Dikotyle ist.
45. Pflanze nach Anspruch 49, wobei die Dikotyle Sojabohne, Brassica, Sonnenblume, Alfalfa oder Saflor ist.
46. Transformierter Samen aus der Pflanze nach einem der Ansprüche 41 bis 45.